專利名稱：用作輪狀病毒疫苗的組合物及其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有能夠顯示更高的滴度值、改善的穩(wěn)定性特性的輪狀病毒的疫苗制齊U。該制劑可以以液體或凍干形式存在并顯示增加的儲(chǔ)存期限同時(shí)保持其治療效果。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)這類(lèi)病毒的方法和制備這類(lèi)制劑的方法。本發(fā)明還涉及使用它們的預(yù)防方法和治療方法。
背景技術(shù)：
目前有許多的人用抗病毒疫苗在使用著。這些人用抗病毒疫苗包括甲型肝炎病毒疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、流感病毒疫苗、日本乙型腦炎病毒疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、 風(fēng)疹(MMR)病毒疫苗、脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、狂犬病毒疫苗、天花疫苗、水痘-帶狀皰疹疫苗、黃熱病毒疫苗。除了數(shù)目不斷增加的疫苗產(chǎn)品之外，有關(guān)于給定疫苗的不同的組合物或制劑在使用著或正在被開(kāi)發(fā)?；畈《疽呙绲某晒κ褂貌粌H依賴于該病毒的正確選擇和遞送，而且還依賴于保持免疫應(yīng)答所需要的足夠的滴度或效力?；畈《镜墓逃械牟环€(wěn)定性在制造、儲(chǔ)存和施用期間穩(wěn)定和保持疫苗生存力方面呈現(xiàn)特別的制劑難題。有許多用于輪狀病毒疫苗的制劑在本領(lǐng)域是已知的，但遇到關(guān)于儲(chǔ)存期間的穩(wěn)定性的或這或那的問(wèn)題。輪狀病毒是呼腸孤病毒科(Reoviridae)中的一個(gè)雙鏈RNA病毒屬且通過(guò)糞-口途徑傳播。它感染小腸內(nèi)側(cè)的細(xì)胞并產(chǎn)生腸毒素，這引起胃腸炎，導(dǎo)致嚴(yán)重的腹瀉且有時(shí)導(dǎo)致通過(guò)脫水的死亡。輪狀病毒感染是在嬰兒和幼兒中與腹瀉相關(guān)的死亡的最大原因。每一年，輪狀病毒胃腸炎導(dǎo)致全世界310，000-590, 000的嬰兒和幼兒死亡。目前開(kāi)發(fā)的所有輪狀病毒疫苗是基于已從人或動(dòng)物中分離并體外重配、適應(yīng) (adapted to)于細(xì)胞培養(yǎng)物、并隨后配制用于口服遞送的活輪狀病毒毒株。單價(jià)和多價(jià)的基于動(dòng)物的毒株兩者已被證實(shí)作為候選疫苗的有效性。人輪狀病毒毒株116E (—種天然的人-牛重配株并天然減毒)是一種人G9毒株， 與P[ll]基因區(qū)段同源的單個(gè)牛VP4基因(VP=病毒蛋白)被天然地引入到其中。1321毒株，也被命名為G10P[11]，主要由?；蚪M成且只具有兩個(gè)人源的基因區(qū)段VP5和VP7。這兩個(gè)輪狀病毒疫苗毒株已在印度單獨(dú)地作為單價(jià)的口服輪狀病毒疫苗液體制劑的試制批制備用于將要進(jìn)行的臨床試驗(yàn)。Bharat Biotech International Ltd. (BBIL)根據(jù)與美國(guó)Bethesda的國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)的國(guó)立變態(tài)反應(yīng)與感染性疾病研究所(NIAID)的材料轉(zhuǎn)讓協(xié)議，從OTH獲得了人輪狀病毒毒株116E和1321。初始的116E(G9[P11])和1321 (G10P[11])通過(guò)在原代非洲綠猴腎(AGMK)細(xì)胞中的傳代，然后在MA104細(xì)胞基底(cell substrate)中傳代以及隨后在連續(xù)傳代的AGMK (SPAGMK)中傳代而適應(yīng)在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長(zhǎng)。MA104和SPAGMK細(xì)胞基底未被國(guó)家管理局(NRA)批準(zhǔn)用于商品化疫苗生產(chǎn)。因此，優(yōu)選使116E和1321及其它輪狀病毒疫苗毒株適應(yīng)被批準(zhǔn)的、有證明書(shū)的、有許可證的且完全表征的細(xì)胞基底如Vero細(xì)胞基底和/或人二倍體細(xì)胞如MRC-5。申請(qǐng)人:已知的現(xiàn)有技術(shù)包括WO 02/11M0A1，其描述了輪狀病毒疫苗制劑，該輪狀病毒疫苗制劑包括適于口服施用輪狀病毒疫苗的緩沖劑。W002/11540A1中公開(kāi)的制劑還包括針對(duì)效力損失穩(wěn)定疫苗組合物的化合物。更具體地，WO 02/11540中公開(kāi)的組合物需要糖、磷酸鹽和至少一種羧酸鹽，至少一種人血清白蛋白或選自谷氨酸、谷氨酰胺和精氨酸的氨基酸。然而，所獲得的穩(wěn)定性變化很大，特別是在20°C以上的溫度下似乎顯示W(wǎng)O 02/11540A1的制劑在效力上的大量損失。WO 99/62500( ‘500)、W0 2005/058356( ‘356) A2 禾口 TO 2001/012797( ‘197)公開(kāi)
了使用疫苗穩(wěn)定劑用于制備疫苗制劑和凍干疫苗、儲(chǔ)存穩(wěn)定的病毒組合物，分離輪狀病毒變體和減毒的活輪狀病毒液體疫苗的方法?！?00公開(kāi)了利用由水解明膠、山梨醇、磷酸鹽、 氯化鈉、蔗糖、碳酸氫鹽、葡萄糖、人血清白蛋白和檸檬酸鹽組成的穩(wěn)定劑制備的麻疹-腮腺炎-風(fēng)疹凍干疫苗。該發(fā)明指望在6. 0和7. 0之間的pH下的增加量的二糖和多元醇的雙重存在用于熱穩(wěn)定性。盡管需要許多成分使得該發(fā)明成本昂貴，卻不能在環(huán)境溫度下獲得穩(wěn)定性。這進(jìn)而增加對(duì)用于儲(chǔ)存疫苗的特殊的基礎(chǔ)設(shè)施的需求，使得該發(fā)明成本更高。然而，這些制劑的大部分提供有限的儲(chǔ)存穩(wěn)定性并因此不是商業(yè)上可行的。PCT/IN07/00190 題目為"A Composition Useful as a Vaccine (用作疫苗的組合物)”公開(kāi)了穩(wěn)定的疫苗。該發(fā)明的本質(zhì)是以第一蛋白即人血清白蛋白、至少部分水解的第二蛋白和三種不同的糖的組合的聯(lián)合作用為中心。另外，該發(fā)明還依賴于在病毒的適應(yīng)期間在培養(yǎng)基中包含胰蛋白酶。所要求保護(hù)的疫苗在37°C下穩(wěn)定3周、在25°C下穩(wěn)定六個(gè)月、且在2 V -8 °C下穩(wěn)定一年。從前述描述中很明顯盡管在疫苗制劑領(lǐng)域中的這些進(jìn)步，仍留有對(duì)具有改善的熱穩(wěn)定性和儲(chǔ)存期限的商業(yè)上可行的活病毒疫苗的明確的需求。本發(fā)明通過(guò)提供無(wú)論是以來(lái)自同一批的病毒的三次單次收獲的合并的原液 (bulk)的形式、還是以液體或凍干制劑的形式，都顯示出更好的和改善的穩(wěn)定性特性的活病毒或減毒的活病毒實(shí)現(xiàn)了此需求。本文中與病毒(例如，輪狀病毒或輪狀病毒疫苗)相關(guān)的穩(wěn)定性應(yīng)指在從培養(yǎng)細(xì)胞收獲的時(shí)間開(kāi)始經(jīng)過(guò)原液階段到所配制的疫苗的給定時(shí)間點(diǎn)處的病毒滴度。發(fā)明人在長(zhǎng)時(shí)期的研究后開(kāi)發(fā)了用作疫苗的本發(fā)明的組合物，該組合物顯示原液和制劑特別是在環(huán)境溫度下的增強(qiáng)的穩(wěn)定性。從統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著方面來(lái)說(shuō)，改善的穩(wěn)定性可以通過(guò)使用在細(xì)胞培養(yǎng)中的病毒生長(zhǎng)和繁殖階段期間已與人血清白蛋白接觸或暴露于人血清白蛋白的病毒來(lái)獲得。為了本發(fā)明的目的，當(dāng)病毒感染的宿主細(xì)胞在用人血清白蛋白補(bǔ)充的細(xì)胞培養(yǎng)基/生長(zhǎng)培養(yǎng)基中繁殖時(shí)，認(rèn)為病毒與人血清白蛋白接觸或暴露于人血清白蛋白。已經(jīng)這樣暴露于人血清白蛋白的病毒或病毒群體被稱為“預(yù)處理的”病毒。尚未這樣暴露于人血清白蛋白的病毒在本文被稱為“典型的病毒”。預(yù)處理的病毒無(wú)論是在原液階段還是以制劑即疫苗/配制的疫苗的形式，都顯示比典型的病毒更好的穩(wěn)定性(從統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著方面來(lái)說(shuō))。本發(fā)明還公開(kāi)了病毒(無(wú)論其是預(yù)處理的病毒還是典型的病毒)在制劑中的穩(wěn)定性還可以進(jìn)一步改善或至少被保持，即穩(wěn)定性可以通過(guò)實(shí)施系統(tǒng)(i)和系統(tǒng)(ii)在儲(chǔ)存期間被保持或在最低限度上延遲逐漸達(dá)到無(wú)穩(wěn)定性或零穩(wěn)定性根據(jù)系統(tǒng)(i)，為了實(shí)現(xiàn)改善的或持久的穩(wěn)定性，用非病毒蛋白或其蛋白水解物或者植物蛋白或諸如人血清白蛋白的類(lèi)似蛋白配制病毒。水解物可被示例但不限于乳白蛋白水解物、酵母水解物、蛋白胨、明膠水解物和卵蛋白水解物。植物蛋白包括但不限于谷物蛋白(corn protein)、小麥蛋白、鷹嘴豆蛋白(garbanzo bean protein)、四季豆蛋白(kidney bean protein)、扁豆蛋白(lentilprotein)、禾Ij馬豆蛋白(lima bean protein)、白豆蛋白(navy bean protein)、大豆蛋白 (soybean protein)、裂莢豌豆蛋白(split pea protein)。人血清白蛋白是天然來(lái)源或重組來(lái)源的。僅僅通過(guò)用非病毒蛋白或其蛋白水解物補(bǔ)充用于制造疫苗的制劑，用非病毒蛋白或其蛋白水解物配制病毒。應(yīng)理解，此系統(tǒng)(i)意指單組分系統(tǒng)。根據(jù)系統(tǒng)(ii)，通過(guò)用蛋白或蛋白水解物和1-2種二糖補(bǔ)充用于制造疫苗的制劑，病毒與如在單組分系統(tǒng)中的非病毒蛋白或其蛋白水解物、以及1-2種二糖接觸。應(yīng)理解，依據(jù)含有病毒的制劑是用單種二糖(兩組分系統(tǒng))還是用兩種不同的二糖的組合(三組分系統(tǒng))來(lái)補(bǔ)充，此系統(tǒng)(ii)意指兩組分系統(tǒng)或三組分系統(tǒng)。通過(guò)實(shí)施系統(tǒng)(ii)，單組分系統(tǒng)中所觀察到的穩(wěn)定性水平被進(jìn)一步改善。因此，在一個(gè)通常的方面，本發(fā)明公開(kāi)了顯示改善的和/或持久的穩(wěn)定性的含有預(yù)處理的病毒或典型的病毒的組合物。本發(fā)明的新穎性在于在繁殖病毒時(shí)用人血清白蛋白補(bǔ)充培養(yǎng)基以獲得即使沒(méi)有補(bǔ)充穩(wěn)定劑也具有增加的滴度值、儲(chǔ)存期限和熱穩(wěn)定性的病毒抗原和疫苗制劑。儲(chǔ)存期限可以通過(guò)添加如本文之前所公開(kāi)的穩(wěn)定劑來(lái)進(jìn)一步增加。這導(dǎo)致采用簡(jiǎn)單的有成本效益的商業(yè)上可行的方法的治療上更好的疫苗。除了技術(shù)進(jìn)步之外，本發(fā)明還符合具有經(jīng)濟(jì)意義的決定性考驗(yàn)的要求。發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是提供消除了有關(guān)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷的、具有增加的儲(chǔ)存期限的用作輪狀病毒疫苗的組合物。另一個(gè)目的是提供能夠在環(huán)境溫度下顯示更高的滴度值、改善的穩(wěn)定性特性的含有減毒的活輪狀病毒的疫苗制劑。該制劑可以是液體或凍干形式并顯示增加的儲(chǔ)存期限同時(shí)保持其治療效果/效力。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)這類(lèi)病毒的方法和制備這類(lèi)制劑的方法。本發(fā)明還涉及用于向患有這類(lèi)感染的受治療者施用疫苗制劑來(lái)控制輪狀病毒感染的預(yù)防方法和治療方法。附圖簡(jiǎn)述圖中提到的病毒滴度對(duì)應(yīng)于每0.5ml輪狀病毒116E收獲物或半成品(final bulk)和配制的疫苗的病灶形成單位(Focus-Forming Unit, FFU)。在本文的各個(gè)圖中，提及生物過(guò)程1表示所使用的起始材料是典型的病毒而提及生物過(guò)程2表示所使用的起始材料是預(yù)處理的病毒。除非另外說(shuō)明，圖中的數(shù)據(jù)表示預(yù)處理的病毒的穩(wěn)定性。

圖1-12H顯示液體制劑的數(shù)據(jù)(Liq=液體)，而圖13A-17C顯示凍干制劑的數(shù)據(jù)(Ly0=凍干的)。以百分比表示的數(shù)字表示按制劑(組合物)重量計(jì)的值。例如，80%蔗糖應(yīng)理解為意指按制劑重量計(jì)的80%蔗糖(w/v)。所有時(shí)間點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)誤差在士0. 40到士0. 45的范圍內(nèi)。圖1顯示在五次實(shí)驗(yàn)中從生物過(guò)程1 (典型的病毒)的收獲物和生物過(guò)程2 (預(yù)處理的病毒)的收獲物獲得的平均滴度。圖2顯示病毒收獲物，即典型的病毒(生物過(guò)程1)和預(yù)處理的病毒(生物過(guò)程2)， 各自在不存在(圖2A)或存在(圖2B)穩(wěn)定劑即5% LAH、80%蔗糖和0. 5%海藻糖時(shí)在液體制劑中在37°C下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。
圖3 (Liq)顯示四種不同制劑中的預(yù)處理的病毒在2_8 V (3A)、25 V (3B)和 370C (3C)下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。在每種情況下系列1是指含有2. 5%乳白蛋白水解物的制劑； 系列2是指含有10%乳白蛋白水解物和0. 5%海藻糖的制劑；系列3是指含有20%乳白蛋白水解物的制劑；且系列4是指含有2. 5%乳白蛋白水解物、0. 5%淀粉和0. 5%海藻糖的組合的制劑。圖4(Liq)顯示含有和不含5%乳白蛋白水解物+80%蔗糖+0. 5%海藻糖的制劑中的輪狀病毒在2-8°C (4A)、25°C (4B)和37°C (4C)下保存時(shí)的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。圖5 (Liq)顯示四種不同制劑中的輪狀病毒在2_8°C (5A)、25°C (5B)和37°C (5C) 下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。在每種情況下系列1是指含有20%乳白蛋白水解物和0. 5%海藻糖的組合的制劑；系列2是指含有10%乳白蛋白水解物、1. 0%乳糖的組合的制劑；系列3是指含有5%乳白蛋白水解物、80%蔗糖的組合的制劑；且系列4是指含有10%乳白蛋白水解物和50%麥芽糖的組合的制劑。圖6 (Liq)顯示四種不同的制劑中的輪狀病毒在2_8 °C (6A)、25 V (6B)和 370C (6C)下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。在每種情況下系列1是指含有0.5%乳白蛋白水解物、10% 大豆蛋白和1. 0%海藻糖的組合的制劑；系列2是指含有0. 5%乳白蛋白水解物、10%大豆蛋白和1. 0%乳糖的組合的制劑；系列3是指含有5%乳白蛋白水解物、2. 5%大豆蛋白和 80%蔗糖的組合的制劑；且系列4是指含有5%乳白蛋白水解物、2. 5%大豆蛋白和50%麥芽糖的組合的制劑。圖7(Liq)顯示四種不同的制劑中的輪狀病毒在2_8°C (7A)、25°C (7B)和 37°C (7C)下的高的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。在每種情況下系列1是指含有10%乳白蛋白水解物、 10%蔗糖和1. 0%海藻糖的組合的制劑；系列2是指含有10%乳白蛋白水解物、5%麥芽糖和1. 0%海藻糖的組合的制劑；系列3是指含有2. 5%乳白蛋白水解物、80%蔗糖和海藻糖的組合的制劑；且系列4是指含有2. 5%乳白蛋白水解物、50%麥芽糖和海藻糖的組合的制劑。圖8 (Liq)顯示四種不同的制劑中的輪狀病毒在2_8 °C (8A)、25 V (8B)和 370C (8C)下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。在每種情況下系列1是指含有典型的病毒、5%乳白蛋白水解物、80%蔗糖和0.5%海藻糖的組合的制劑；系列2是指含有預(yù)處理的病毒、5%乳白蛋白水解物、80%蔗糖和0.5%海藻糖的組合的制劑；系列3是指含有典型的病毒、0. 重組人血清白蛋白(rHSA)和80%蔗糖、以及0.5%海藻糖的組合的制劑；系列4是指具有預(yù)處理的病毒、0. rHSA、80%蔗糖和0. 5%海藻糖的組合的制劑；系列5是指含有典型的病毒、80%蔗糖和0. 5%海藻糖的組合的制劑；且系列6是指含有預(yù)處理的病毒、80%蔗糖和 0.5%海藻糖的組合的制劑。圖9(Liq)顯示五種不同的制劑中的輪狀病毒在37°C下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。圖10 (Liq)顯示五種不同的制劑中的低滴度輪狀病毒在2_8 °C (IOA)和 370C (IOB)下的穩(wěn)定性。圖IlA(Liq)顯示含有20%水解蛋白胨的預(yù)處理的輪狀病毒制劑在2_8°C、25°C和 37 °C下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。圖IlB(Liq)顯示含有20%水解蛋白胨、1 %海藻糖和0. 02%巖藻糖的組合的預(yù)處理的輪狀病毒制劑在2-8°C、25°C和37°C下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。
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圖IlC(Liq)顯示含有20%卵蛋白水解物的預(yù)處理的輪狀病毒制劑在2_8°C、25°C 和37 °C下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。圖IlD(Liq)顯示含有20%卵蛋白水解物、0. 5%海藻糖、1 % D-山梨糖醇和0. 5% 甘露糖的組合的預(yù)處理的輪狀病毒制劑在2-8°C、25°C和37°C下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。圖IlE(Liq)顯示含有20%乳白蛋白水解物的預(yù)處理的輪狀病毒制劑在2_8°C、 25°C和37 °C下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。圖IlF(Liq)顯示含有20%乳白蛋白水解物、0. 5%海藻糖的組合的預(yù)處理的輪狀病毒制劑在2-8°C、25°C和37 °C下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。圖IlG(Liq)顯示含有20%酵母水解物的預(yù)處理的輪狀病毒制劑在2_8°C、25°C和 37 °C下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。圖IlH(Liq)顯示含有20%酵母水解物、5%麥芽糖和0. 5%乳糖的組合的預(yù)處理的輪狀病毒制劑在2-8°C、25°C和37 °C下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。圖12A(Liq)顯示含有20%水解蛋白胨的典型的輪狀病毒制劑在2_8°C、25°C和 37 °C下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。圖12B (Liq)顯示含有20%水解蛋白胨、1 %海藻糖和0. 02%巖藻糖的組合的典型的輪狀病毒制劑在2-8°C、25°C和37 °C下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。圖12C (Liq)顯示含有20%卵蛋白水解物的典型的輪狀病毒制劑在2_8°C、25°C和 37 °C下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。圖12D (Liq)顯示含有20%卵蛋白水解物、0. 5%海藻糖、1 % D-山梨糖醇和0. 5% 甘露糖的組合的典型的輪狀病毒制劑在2-8°C、25°C和37°C下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。圖12E(Liq)顯示含有20%乳白蛋白水解物的典型的輪狀病毒制劑在2_8°C、25°C 和37 °C下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。圖12F(Liq)顯示含有20%乳白蛋白水解物、0. 5%海藻糖的組合的典型的輪狀病毒制劑在2-8°C、25°C和37 °C下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。圖12G (Liq)顯示含有20 %酵母水解物的典型的輪狀病毒制劑在2_8°C、25°C和 37 °C下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。圖12H(Liq)顯示含有20%酵母水解物、5%麥芽糖和0. 5%乳糖的組合的典型的輪狀病毒制劑在2-8°C、25°C和37 °C下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。圖13 (Lyo)顯示四種不同的凍干制劑中的輪狀病毒在2_8°C (13A)、25°C (13B)和 37°C (13C)下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。在每種情況下系列1是指含有0. 5%人血清白蛋白和12% 蔗糖的制劑；系列2是指含有0. 5%乳白蛋白水解物、0. 5%海藻糖的制劑；系列3是指含有 0. 5%大豆蛋白和0. 5%海藻糖的制劑；且系列4是指0. 25%聚乙烯吡咯烷酮、0. 5%海藻糖。圖H(Lyo)顯示四種不同的凍干制劑中的輪狀病毒在2_8°C (14A)、25°C (14B)和 37°C (14C)下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。在每種情況下系列1是指含有0.5%人血清白蛋白、12%蔗糖和0. 淀粉的制劑；系列2是指含有0.5%乳白蛋白水解物、0.5%海藻糖和0. 淀粉的制劑；系列3是指含有0. 5%大豆蛋白、0. 5%海藻糖和0. 淀粉的制劑；且系列4是指 0. 25%聚乙烯吡咯烷酮、0. 5%海藻糖和0. 淀粉。圖15 (Lyo)顯示四種不同的凍干制劑中的輪狀病毒在2_8°C (15A)、25°C (15B)和37°C (15C)下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。在每種情況下系列1是指含有0.5%人血清白蛋白、12%蔗糖、0. 淀粉和304mM碳酸氫鹽的制劑；系列2是指含有0. 5%乳白蛋白水解物、0. 5%海藻糖、0. 淀粉和304mM碳酸氫鹽的制劑；系列3是指含有0. 5%大豆蛋白、0. 5%海藻糖、 0. 淀粉和304mM碳酸氫鹽的制劑；系列4是指0. 25%聚乙烯吡咯烷酮、0. 5%海藻糖、 0. 淀粉和304mM碳酸氫鹽。圖16 (Lyo)顯示四種不同的凍干制劑中的輪狀病毒在2_8°C (16A)、25°C (16B)和 37°C (16C)下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。在每種情況下系列1是指含有0.5%人血清白蛋白、12% 蔗糖和0. 阿拉伯樹(shù)膠(gum acacia)的制劑；系列2是指含有0. 5%乳白蛋白水解物、 0. 5%海藻糖和0. 阿拉伯樹(shù)膠的制劑；系列3是指含有0. 5%大豆蛋白、0. 5%海藻糖和 0. 阿拉伯樹(shù)膠的制劑；且系列4是指0. 25%聚乙烯吡咯烷酮、0. 5%海藻糖和0. 阿拉伯樹(shù)膠。圖17 (Lyo)顯示四種不同的凍干制劑中的輪狀病毒在2_8°C (17A)、25°C (17B) 和37°C (17C)下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。在每種情況下系列1是指含有0. 5%乳白蛋白水解物、 0. 25%聚乙烯吡咯烷酮的制劑；系列2是指含有0. 5%乳白蛋白水解物和0. 阿拉伯樹(shù)膠的制劑；系列3是指含有0.5%乳白蛋白水解物和0.1%鹽酸吡多醇(pyridoxine HCL)的制劑；且系列4是指0.5%乳白蛋白水解物和0. 淀粉。發(fā)明_既述相應(yīng)地本發(fā)明提供了一種組合物，包括(a)病毒抗原即減毒的活輪狀病毒，以及，(b)藥學(xué)上可接受的生理pH的緩沖劑，其中，組合物關(guān)于病毒滴度的穩(wěn)定性增加，因?yàn)樵诖嬖谌搜灏椎鞍椎那闆r下繁殖病毒對(duì)穩(wěn)定性的作用大于在不存在人血清白蛋白的情況下繁殖病毒對(duì)穩(wěn)定性的作用。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，該組合物還可包括至少一種穩(wěn)定劑，該穩(wěn)定劑包括非病毒蛋白或其至少部分水解的蛋白水解物或者單種二糖或2種二糖的組合。非病毒蛋白或蛋白水解物可以是例如乳白蛋白水解物、酵母水解物、明膠水解物、 卵蛋白水解物、水解蛋白胨或選自谷物蛋白、小麥蛋白、鷹嘴豆蛋白、四季豆蛋白、扁豆蛋白、利馬豆蛋白、白豆蛋白、大豆蛋白、裂莢豌豆蛋白的植物蛋白或由人血清白蛋白示例的類(lèi)似蛋白，優(yōu)選乳白蛋白水解物或水解大豆蛋白，更優(yōu)選乳白蛋白水解物。根據(jù)另外的實(shí)施方案，所利用的二糖可以是例如海藻糖或2種二糖包括蔗糖和海藻糖的組合。因此，本發(fā)明的組合物可包括(a)病毒抗原即減毒的活輪狀病毒、(b)藥學(xué)上可接受的生理PH的緩沖劑、以及(c)非病毒蛋白或蛋白水解物。本文上面所公開(kāi)的組合物可包括⑴以103FFU/0. 5ml到108 5FFU/0. 5ml的范圍的滴度的、如本文前面所公開(kāi)的病
毒抗原即減毒的活輪狀病毒，(ii)藥學(xué)上可接受的緩沖劑，其是作為稀釋劑/載體的pH 6. 8到8.0的磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖劑(310mM/100mM)，(iii)蛋白水解物，其是在20-30% w/v范圍的乳白蛋白水解物，以及(iv)為約0. 5% w/v的海藻糖或約80% w/v的蔗糖的二糖和為約0. 5% w/v的海藻糖的另一種二糖。 組合物包括能夠顯示出與在不存在人血清白蛋白的情況下繁殖的減毒的活輪狀病毒相比，在環(huán)境條件下在儲(chǔ)存時(shí)平均滴度增加最小0. 81og/ml到最大1. 1 log/ml的減毒的活輪狀病毒。 此外，所述減毒的活輪狀病毒是在存在0. 1 %重組人血清白蛋白的情況下繁殖的。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用于生產(chǎn)權(quán)利要求1中的減毒的活輪狀病毒的方法，其包括(i)用減毒的活輪狀病毒感染宿主細(xì)胞；(ii)使受感染的細(xì)胞在能夠支持所述細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，其中所述培養(yǎng)基用人血清白蛋白補(bǔ)充，以及收獲能夠顯示更好的穩(wěn)定性的所述輪狀病毒。在本發(fā)明的一個(gè)具體方面，公開(kāi)了一種具有給定的穩(wěn)定性的包含活的且預(yù)處理的病毒(或病毒群體)的組合物，其中病毒的穩(wěn)定性是通過(guò)在含有活的預(yù)處理的病毒的組合物或含有活的典型的病毒的組合物兩者各自于收獲后在37°C下儲(chǔ)存四周時(shí)，與活的典型的病毒(或病毒群體)相比較來(lái)表征的，活的典型的病毒(或病毒群體)不是在存在人血清白蛋白(指定為預(yù)處理)的情況下繁殖的并且顯示大于4. 5FFU/0. 5ml和7. 5FFU/0. 5ml之間的差值的log 4滴度的損失。組合物在制劑中包含藥學(xué)上可接受的緩沖劑，含有或不含諸如蛋白水解物、蛋白胨、植物蛋白或二糖的補(bǔ)充的穩(wěn)定劑。在另一個(gè)具體方面，本發(fā)明公開(kāi)了一種含有能夠顯示與活的典型的病毒相比在環(huán)境條件下在儲(chǔ)存時(shí)平均滴度增加最小 0. 81og/ml到最大1. 1 log/ml的活的且預(yù)處理的病毒(或病毒群體)、以及藥學(xué)上可接受的緩沖劑的組合物，且預(yù)處理的病毒能夠在組合物中不含諸如非病毒蛋白水解物、蛋白胨、植物蛋白和二糖的任何補(bǔ)充的穩(wěn)定劑的情況下顯示滴度。在涉及補(bǔ)充的穩(wěn)定劑的程度的上述方面中的每一個(gè)中，乳白蛋白水解物是最優(yōu)選的補(bǔ)充的穩(wěn)定劑。二糖(例如，海藻糖)或不同二糖(例如，蔗糖和海藻糖)的組合是含有乳白蛋白水解物的組合物中的下一個(gè)優(yōu)選的穩(wěn)定劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物中的乳白蛋白水解物是約5% w/v，蔗糖是約80% w/v且海藻糖是約0. 5% w/Vo組合物可以含有作為另外的補(bǔ)充的穩(wěn)定劑的重組人血清白蛋白(例如，0. w/v)。在一個(gè)實(shí)施方案中，病毒是活輪狀病毒，例如減毒的活輪狀病毒。優(yōu)選地，活病毒是人活病毒，例如人輪狀病毒。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，人輪狀病毒是輪狀病毒毒株 116E或1321。根據(jù)本發(fā)明的組合物是疫苗。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的組合物可以具有滴度在103FFU/0. 5ml到108 5FFU/0. 5ml的范圍的減毒的活輪狀病毒?；钶啝畈《臼穷A(yù)處理的輪狀病毒。在另一個(gè)通常的方面中，提供了一種用于生產(chǎn)減毒的活的預(yù)處理的輪狀病毒的方法。該方法包含以下步驟用減毒的活輪狀病毒感染宿主細(xì)胞，使受感染的細(xì)胞在用人血清白蛋白補(bǔ)充的并能夠支持細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，以及收獲預(yù)處理的輪狀病毒。收獲的預(yù)處理輪狀病毒顯示出與未預(yù)處理的病毒或典型的病毒相比更好的穩(wěn)定性。還在另一個(gè)通常的方面中，本發(fā)明還公開(kāi)了一種使病毒適應(yīng)諸如Vero細(xì)胞的合適的細(xì)胞基底，通過(guò)合適的培養(yǎng)基連續(xù)傳代，在不存在或存在來(lái)源于人的人血清白蛋白或重組人血清白蛋白的培養(yǎng)基中進(jìn)行每次傳代的方法。發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及關(guān)于減毒的活輪狀病毒的組合物和方法。減毒的活輪狀病毒顯示改善的穩(wěn)定性特性并可用于預(yù)防兒童的輪狀病毒感染和/或輪狀病毒胃腸炎。具體地，本發(fā)明公開(kāi)了用于提供顯示出在給定的時(shí)間點(diǎn)處的改善的穩(wěn)定性和經(jīng)儲(chǔ)存期間的時(shí)間段的持久的穩(wěn)定性的輪狀病毒組合物的多種方法和系統(tǒng)。一種方法是使用預(yù)處理的病毒作為本發(fā)明的組合物中的起始材料。另一種方法是在所使用的病毒是預(yù)處理的病毒時(shí)，使用各種穩(wěn)定劑來(lái)獲得改善的穩(wěn)定性。如上所定義的，從在含有人血清白蛋白的培養(yǎng)基中繁殖的細(xì)胞培養(yǎng)物收獲的病毒或病毒群體被稱為“預(yù)處理的”病毒或病毒群體。相反地，從不含人血清白蛋白的培養(yǎng)基中的細(xì)胞培養(yǎng)物收獲的病毒或病毒群體被稱為“典型的”病毒或病毒群體。減毒的活輪狀病毒在本文中有時(shí)稱為病毒抗原或疫苗抗原。如本文所公開(kāi)的，預(yù)處理的病毒顯示與典型的病毒相比改善的穩(wěn)定性特性。與沒(méi)有補(bǔ)充物的制劑相比，預(yù)處理的病毒和典型的病毒中的每一種顯示在用一種或多種穩(wěn)定劑補(bǔ)充的制劑中的在儲(chǔ)存期間的持久的穩(wěn)定性。在無(wú)論用作制劑的起始材料的病毒在收獲后是否被預(yù)處理的情況下，用來(lái)保持穩(wěn)定性的穩(wěn)定劑應(yīng)理解為寬泛地落入三種不同組分系統(tǒng)中。單組分系統(tǒng)含有作為制劑的一部分的非病毒蛋白或其蛋白水解物。非病毒蛋白或蛋白水解物用作穩(wěn)定劑。兩組分系統(tǒng)除了非病毒蛋白或其蛋白水解物之外含有二糖。在兩組分系統(tǒng)中，二糖和蛋白或其水解物都用作穩(wěn)定劑。三組分系統(tǒng)類(lèi)似于兩組分系統(tǒng)，但具有不同于兩組分系統(tǒng)中的二糖的另外的二糖。在我們同時(shí)待審的申請(qǐng)第842/CHE/2006號(hào)中，我們已公開(kāi)了一種組合物，其包括病毒抗原；選自人血清白蛋白或重組人白蛋白的第一蛋白和至少部分水解并選自乳白蛋白水解物、酵母水解物、蛋白胨和卵蛋白水解物的第二蛋白且優(yōu)選地以及三種不同的二糖的組合，其中所使用的病毒在存在HSA的情況下不繁殖。液體組合物顯示在37°C下3-4周、在 25°C下六個(gè)月、且在2°C -8 °C下一年的穩(wěn)定性，而凍干組合物顯示在2 °C -8°C、25°C、37°C下超過(guò)50周的穩(wěn)定性。本發(fā)明的液體組合物在37°C下穩(wěn)定6周、在25°C下穩(wěn)定6個(gè)月且在2_8°C下穩(wěn)定 M個(gè)月。本發(fā)明的凍干組合物在37°C下穩(wěn)定16周、在25°C下穩(wěn)定6個(gè)月且在2_8°C下穩(wěn)定 M個(gè)月。組合物可以是液體組合物或是凍干的(干型)。本發(fā)明公開(kāi)了在2_8°C或環(huán)境條件下儲(chǔ)存延長(zhǎng)的時(shí)間段時(shí)顯示更好的和改善的穩(wěn)定性的減毒的活輪狀病毒及其組合物。環(huán)境條件可以是在一個(gè)地方普遍和典型的大氣狀況(例如，25°C )但不超過(guò)約37°C的那些環(huán)境條件。本發(fā)明的組合物能夠在制備期間和在商品化疫苗的儲(chǔ)存期限所需的持續(xù)期間保持其免疫能力(即組合物是穩(wěn)定的)。因此，由于與外部添加的病毒相比，在存在人血清白蛋白的情況下的病毒的繁殖， 本發(fā)明的組合物顯示更長(zhǎng)時(shí)期的穩(wěn)定性。在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明的組合物包括病毒抗原(預(yù)處理的病毒或典型的病毒)、非病毒蛋白或不同于病毒抗原的蛋白。術(shù)語(yǔ)“非病毒蛋白”意指乳白蛋白、酵母蛋白水解物、 明膠、卵蛋白或?yàn)楣任锏鞍?、小麥蛋白、鷹嘴豆蛋白、四季豆蛋白、扁豆蛋白、利馬豆蛋白、白豆蛋白、大豆蛋白、裂莢豌豆蛋白的植物蛋白以及人血清白蛋白中的任一種，全部是天然來(lái)源或重組來(lái)源的。優(yōu)選地，蛋白是至少部分水解的。換句話說(shuō)，這些蛋白的水解物或蛋白胨可用于本發(fā)明的組合物。如本文所使用的，短語(yǔ)“蛋白是至少部分水解的”意味著是指其中水解蛋白已經(jīng)至少部分地?cái)嗔殉善湎鄳?yīng)的氨基酸結(jié)構(gòu)單元的情景。因此，此短語(yǔ)還意指包括其中蛋白不再作為完整分子存在，而只是作為其片段的集合存在的情景。此短語(yǔ)還意指包括其中蛋白被完全水解的情景。所有這些情景還意指由短語(yǔ)“蛋白水解物”(其可包括完全水解的蛋白) 所包括，即蛋白斷裂成其相應(yīng)的氨基酸、或蛋白部分地?cái)嗔?，使得存在肽和氨基酸的集合。因此，蛋白或至少部分水解形式可以是乳白蛋白水解物、酵母水解物、蛋白胨、明膠水解物和卵蛋白水解物、或來(lái)自植物來(lái)源的蛋白或人同源蛋白，植物來(lái)源諸如谷物、小麥、鷹嘴豆、四季豆、扁豆、利馬豆、白豆、大豆、裂莢豌豆，人同源蛋白諸如是人來(lái)源或重組來(lái)源的人血清白蛋白。這些蛋白和蛋白水解物可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員例如通過(guò)酸解容易地制備，或可以由商業(yè)上獲得。本文已顯示在低濃度的輪狀病毒下，特別是在制劑中輪狀病毒濃度(滴度)是103FFU/0. 5ml時(shí)，當(dāng)與非病毒蛋白-人血清白蛋白或牛血清白蛋白相比時(shí)， 諸如乳白蛋白水解物或大豆蛋白的非病毒蛋白有助于更好的和改善的穩(wěn)定性。乳白蛋白水解物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的且是商業(yè)上可獲得的。認(rèn)為乳白蛋白水解物為輪狀病毒蛋白 (rota protein)提供在液體形式和在凍干形式中極好的均化作用，并甚至當(dāng)病毒蛋白以低濃度存在時(shí)保持病毒蛋白的部分。替代乳白蛋白水解物或除了乳白蛋白水解物之外，還可以使用諸如酵母水解物、蛋白胨、明膠水解物和卵蛋白水解物的其它物質(zhì)。組合物還包括二糖或兩種二糖的組合以及藥學(xué)上可接受的緩沖劑。二糖可以是蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、 纖維二糖、龍膽二糖、蜜二糖、松二糖和巖藻糖中的任一種。三組分系統(tǒng)除了非病毒蛋白或其蛋白水解物之外含有兩種不同類(lèi)型的二糖的組合。本文此段中的那些蛋白或蛋白水解物和二糖被稱為“穩(wěn)定劑”。穩(wěn)定劑可被添加到在病毒的藥物制劑中常規(guī)使用的賦形劑、稀釋劑或載體(例如，藥學(xué)上可接受的緩沖劑)。這樣的賦形劑或載體在本領(lǐng)域是眾所周知的。具體地，合適的稀釋劑或藥學(xué)上可接受的緩沖劑用一種或多種上面提到的穩(wěn)定劑補(bǔ)充。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，向含有輪狀病毒的樣品首先添加LAH，隨后添加蔗糖。如果添加第二種二糖，那么海藻糖是接下來(lái)下一個(gè)優(yōu)選的。不含穩(wěn)定劑的組合物實(shí)質(zhì)上是載體溶液或藥學(xué)上可接受的緩沖劑。除了指定的穩(wěn)定劑之外，組合物可以含有顏料、調(diào)味品、增甜劑、吸附劑和/或流動(dòng)性促進(jìn)劑。優(yōu)選地，這些組合物在適當(dāng)?shù)腜H下被緩沖，適當(dāng)?shù)膒H通常在6和8之間、優(yōu)選在6. 8和8. 0之間。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的組合物可以在DME培養(yǎng)基 (Dulbecco' sModified Eagles medium)中配制。在一個(gè)方面中，本發(fā)明公開(kāi)了一種制劑，其含有減毒和預(yù)處理的活輪狀病毒群體。 預(yù)處理的輪狀病毒在組合物中在沒(méi)有任何補(bǔ)充的穩(wěn)定劑的藥學(xué)上可接受的賦形劑中顯示一定程度的穩(wěn)定性。與沒(méi)有如此預(yù)處理的活的減毒的典型的輪狀病毒群體相比時(shí)，預(yù)處理的輪狀病毒群體的穩(wěn)定性更好。當(dāng)收獲后在37°C下儲(chǔ)存四周時(shí)，典型的輪狀病毒群體在其穩(wěn)定性特性方面顯示log 4滴度的損失，而預(yù)處理的病毒顯示明顯小于log 4滴度損失的損失。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明公開(kāi)了一種組合物，其含有活的減毒的預(yù)處理的輪狀病毒，能夠顯示當(dāng)組合物中沒(méi)有任何補(bǔ)充的穩(wěn)定劑地在環(huán)境條件下儲(chǔ)存時(shí)，與活的減毒的典型的輪狀病毒相比，滴度增加最小0. 81og/ml到最大1. 1 log/ml 0兩種情況中，如果將諸如乳白蛋白水解物、酵母水解物、明膠水解物和卵蛋白水解物、蛋白胨、植物蛋白和人血清白蛋白的至少一種穩(wěn)定劑添加到組合物，可以改善預(yù)處理的病毒的穩(wěn)定性。改善的穩(wěn)定性可以通過(guò)將二糖或不同二糖的組合添加到組合物進(jìn)一步改善。因此，在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物含有病毒抗原即預(yù)處理輪狀病毒、至少部分水解的不同于所述病毒抗原的蛋白以及二糖或兩種二糖的組合，所述蛋白諸如例如乳白蛋白、酵母蛋白、蛋白胨、明膠和卵蛋白、谷物蛋白、小麥蛋白、鷹嘴豆、四季豆、扁豆、利馬豆、 白豆、大豆、裂莢豌豆或從人中分離的人血清白蛋白或重組人血清白蛋白。當(dāng)穩(wěn)定劑存在于組合物中時(shí)，具有典型的病毒的組合物也是優(yōu)選的，因?yàn)榕c沒(méi)有這些穩(wěn)定劑的組合物中的典型的病毒相比，在這樣的組合物中可以獲得典型的病毒的更好的穩(wěn)定性。單獨(dú)的或以兩種蛋白的組合形式的蛋白可以在0.01% (w/v)到80% (w/v)的范圍、優(yōu)選在0. 05%到50%的范圍存在。優(yōu)選地，用作穩(wěn)定劑的蛋白是乳白蛋白水解物、人血清白蛋白和大豆蛋白中的任一種。乳白蛋白水解物可以以約0. 01 %到70%、優(yōu)選0. 1 %到 30 %在組合物中存在。大豆蛋白可以以約0. 01 %到70 %、優(yōu)選0. 05 %到20 %在組合物中存在。人血清白蛋白優(yōu)選為重組來(lái)源的且可以以約0. 01 %到20 %、優(yōu)選0. 1 %到0. 5 %在組合物中存在。優(yōu)選地，用作穩(wěn)定劑的二糖可以是海藻糖、乳糖和蔗糖中的任一種。優(yōu)選的海藻糖濃度是在約0. 01%到70%、最優(yōu)選0. 5%到20%。兩種不同二糖的組合可以是蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、纖維二糖、龍膽二糖、蜜二糖和松二糖中的任兩種。例如，兩種二糖的組合可以是蔗糖和麥芽糖、蔗糖和乳糖、蔗糖和海藻糖、麥芽糖和海藻糖、或海藻糖和乳糖中的任一種。優(yōu)選的二糖的組合是蔗糖和海藻糖。優(yōu)選地，蔗糖以約1-10%和70% (w/v) 到85% (w/v)、更優(yōu)選以5%到10%和80%到85% (w/v)存在而海藻糖以約0. 01 % (w/ ν)到50.0% (w/v)、優(yōu)選0.5%到20% (w/v)存在。組合的二糖或單種二糖的濃度可以是約1-10%或約20%-85% (w/v) 0在一個(gè)實(shí)施方案中，二糖的濃度可以是如下值蔗糖約 1-10% 和 70% 到 85% (w/v)、優(yōu)選 5 到 10% 或 80% 到 85% (w/v)，乳糖約 0. 到 20.0% (w/v)、優(yōu)選 0.5%到 10% (w/v)，麥芽糖約 0. (w/v)到 50% (w/v)、優(yōu)選 5%到 50% (w/ ν)，海藻糖約 0.01% (w/v)到 70. 0% (w/v)、優(yōu)選 0. 5%到 20. 0% (w/v)。優(yōu)選地，組合物使用磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖劑來(lái)緩沖。優(yōu)選地，磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖劑是大約310mM磷酸鹽和大約IOOmM檸檬酸鹽。藥學(xué)上可接受的緩沖劑可以具有在 6. 8到8. 0的范圍的pH值。緩沖劑可以是磷酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、Tris、HEPES緩沖劑中的任一種及其組合。磷酸鹽可以具有在IOmM到lOOOmM、優(yōu)選50mM到310mM的范圍的濃度。 碳酸鹽可以具有在IOmM到lOOOmM、優(yōu)選50mM到300mM的范圍的濃度。檸檬酸鹽可以具有在IOmM到400mM、優(yōu)選50mM到IOOmM的范圍的濃度。Tris可以具有在0. ImM到lOOOmM、優(yōu)選5mM到20mM的范圍的濃度。HEPES可以具有在0. ImM到lOOOmM、優(yōu)選IOmM到20mM的范圍的濃度。在一些實(shí)施方案中，淀粉也可以用作穩(wěn)定劑。淀粉的實(shí)例是谷物淀粉(corn starch)、小麥淀粉、玉米淀粉(maize starch)和米淀粉。淀粉可以是可溶性淀粉、不溶性淀粉、部分水解的淀粉或完全水解的淀粉中的任一種。淀粉可以以約0.01%到10%、優(yōu)選0. 到3. 0%存在。組合物可以含有至少一種稀釋劑，所述稀釋劑諸如組織培養(yǎng)基、生理鹽水、磷酸緩沖鹽水或水。優(yōu)選的稀釋劑是DME培養(yǎng)基(DMEM)。組合物還可以含有至少一種化學(xué)品，所述化學(xué)品諸如抗壞血酸、阿拉伯膠(gumarabic)、阿拉伯樹(shù)膠、聚乙烯吡咯烷酮、鹽酸吡多醇 (維生素B6)，且濃度可以為按組合物重量計(jì)約0. 1 %到20 %、優(yōu)選0. 25 %到5 %。組合物優(yōu)選為含減毒的活輪狀病毒的液體制劑。優(yōu)選的液體制劑含有預(yù)處理的輪狀病毒或典型的輪狀病毒和穩(wěn)定劑，即20-30% w/v范圍的乳白蛋白水解物(LAH)和約0. 5% w/v的海藻糖。另一種優(yōu)選的液體制劑含有預(yù)處理的輪狀病毒或典型的輪狀病毒和穩(wěn)定劑，即組合物中約5% w/v的乳白蛋白水解物、約80% w/v的蔗糖和約0. 5% w/v的海藻糖。根據(jù)本發(fā)明的組合物可以用作用于抗病毒感染和與病毒相關(guān)的疾病的接種的疫苗。輪狀病毒毒株 116E(G9P[11])和I321(G10P[11])是天然的人-牛重配株、天然減毒并賦予嬰兒和幼兒中的實(shí)質(zhì)水平的免疫性。雖然人輪狀病毒是優(yōu)選的，可以根據(jù)本發(fā)明配制的其它輪狀病毒是牛輪狀病毒、豬輪狀病毒和人-牛重配株輪狀病毒、羔羊輪狀病毒、綿羊輪狀病毒。鑒于已知在儲(chǔ)存期間使低親代滴度值(parent titer)的穩(wěn)定性保持持久是挑戰(zhàn)性的任務(wù)，需要如本文所公開(kāi)的合適的組合物和制劑使低滴度輪狀病毒即IO3的穩(wěn)定性保持持久。顯示改善的和/或持久的穩(wěn)定性的輪狀病毒疫苗可以用于預(yù)防病毒感染，優(yōu)選全世界兒童的輪狀病毒感染和/或輪狀病毒胃腸炎。優(yōu)選地，治療或預(yù)防包括向嬰兒施用三次口服劑量的有效量的組合物，在第1次劑量的時(shí)候嬰兒年齡在8-20周內(nèi)。下表(表1)給出典型的輪狀病毒的制劑即在不存在人血清白蛋白的情況下(1到 8)和在存在人血清白蛋白的情況下(1A到8A)繁殖的典型的輪狀病毒的制劑之間的比較， 且清楚地顯示出包括在存在人血清白蛋白的情況下繁殖的病毒的制劑顯示更大的穩(wěn)定性。表 1
14樣品號(hào)在37°C下的Log損失時(shí)間點(diǎn)在25°C下的Log損失時(shí)間點(diǎn)
154 周1.1924 周 IA3.7312 周0.9124 周
244 周1.0924 周 2A3.6320 周0.7624 周
34.453 周3.4816 周 3A3.312 周2.2124 周
44.434 周1.920 周 4A3.7212 周1.6124 周
54.964 周1.6624 周 5A3.398 周1.0824 周
64.778 周0.8624 周 6A3.3212 周0.3924 周
75.394 周1.9824 周 7A2.4412 周0.2824 周
84.464 周1.9624 周 8A3.120 周0.3424 周本研究還提供用于使輪狀病毒例如天然的人-牛重配株、天然減毒輪狀病毒毒株 116E(G9P[11])和I321(G10P[11])適應(yīng)合適的細(xì)胞如Vero細(xì)胞的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，適應(yīng)包括連續(xù)傳代，2-20次傳代、優(yōu)選2-5次傳代。優(yōu)選地，每次傳代在M小時(shí)到通常 6天且最大10天的范圍的時(shí)間段內(nèi)發(fā)生。優(yōu)選地，病毒是人輪狀病毒。該方法包括優(yōu)化劑量的胰蛋白酶(0. 1 μ g/ml到30 μ g/ml)和/或氯化鈣(100 μ g/ml到1000 μ g/ml)用于病毒活化和病毒維持培養(yǎng)基，其中高滴度(104FFU/ml到108FFU/ml)的病毒收獲在48小時(shí)到六天內(nèi)。設(shè)想還使用適應(yīng)的毒株用于生產(chǎn)穩(wěn)定的、活的、單價(jià)的液體輪狀病毒疫苗組合物。 本發(fā)明還公開(kāi)了如何生產(chǎn)典型的輪狀病毒和預(yù)處理的輪狀病毒。此外，本發(fā)明提供使用病毒抗原、蛋白、一種或兩種不同的二糖的組合來(lái)制造根據(jù)本發(fā)明的組合物，用于治療或預(yù)防與病毒相關(guān)的疾病、優(yōu)選與輪狀病毒相關(guān)的疾病。操作實(shí)施例提供以下操作實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案，但當(dāng)然不應(yīng)解釋為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。除了另外詳細(xì)描述的之外，下面的實(shí)施例使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知和常規(guī)的常規(guī)技術(shù)來(lái)進(jìn)行。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，實(shí)施例中所公開(kāi)的技術(shù)表示發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的在本發(fā)明的實(shí)踐中起良好作用的技術(shù)，并因此可被認(rèn)為構(gòu)成用于本發(fā)明的實(shí)施的優(yōu)選模式。然而，根據(jù)本公開(kāi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解可以在所公開(kāi)的具體實(shí)施方案中進(jìn)行許多改變并仍獲得相似或類(lèi)似結(jié)果而沒(méi)有背離本發(fā)明的精神和范圍。實(shí)施例1.典型的和預(yù)處理的輪狀病毒群體的大量生產(chǎn)及其穩(wěn)定性特性Bharat Biotech International Ltd(BBIL)按照與美國(guó) Bethesda 的國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)的國(guó)立變態(tài)反應(yīng)與感染性疾病研究所(NIAID)的材料轉(zhuǎn)讓協(xié)議，從OTH獲得人輪狀病毒毒株116E禾口 1321。使原始的116E(G9[Pll])和1321 (G10P[11])通過(guò)在原代非洲綠猴腎(AGMK)細(xì)胞中傳代、然后在MA 104細(xì)胞基底中傳代且隨后在連續(xù)地傳代的 AGMK (SPAGMK)細(xì)胞中傳代來(lái)適應(yīng)在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長(zhǎng)。MA 104和SPAGMK細(xì)胞基底未被國(guó)家管理局(NRA)批準(zhǔn)用于在商品化疫苗生產(chǎn)中使用。因此使這兩種人輪狀病毒疫苗毒株 (116E和1321)適應(yīng)Vero細(xì)胞，在這些細(xì)胞中單獨(dú)生長(zhǎng)以產(chǎn)生大量病毒群體(viral bulk population)并單獨(dú)制備為單價(jià)的、活的、減毒的、口服輪狀病毒疫苗液體制劑的試制批用于人的臨床試驗(yàn)。人輪狀病毒毒株116E(—種天然人-牛重配株且天然減毒的)是一種人G9毒株，與P[ll]基因區(qū)段同源的單個(gè)牛VP4基因(VP=病毒蛋白)被天然地引入到其中。1321毒株，被命名為G10P[11]，主要由?；蚪M成且只具有兩個(gè)人源的基因區(qū)段VP5 和VP7。本文的具體實(shí)例是關(guān)于活的且減毒的毒株116E描述的。一般說(shuō)來(lái)，生產(chǎn)過(guò)程是如下所述使用Vero細(xì)胞的工作細(xì)胞庫(kù)(Working Cell Bank)來(lái)培養(yǎng)輪狀病毒。在含有5-10%胎牛血清的DME培養(yǎng)基(DMEM) (Sigma , M0，USA) 中繁殖Vero細(xì)胞。輪狀病毒需要在氯化鈣的存在下胰蛋白酶裂解兩個(gè)主要的外殼蛋白 (outer coat protein)之一 VP4以便在體外有效感染Vero細(xì)胞。將輪狀病毒毒株制成主病毒庫(kù)(Master Virus Bank)和工作病毒庫(kù)(Working Virus Bank)的種子批系統(tǒng)(seed lot system)。用選擇的毒株感染無(wú)血清培養(yǎng)基中的Vero細(xì)胞且每48小時(shí)后進(jìn)行單次收獲，持續(xù)144小時(shí)的時(shí)間。將三次單次收獲物集中作為一份原液并添加蔗糖磷酸鹽谷氨酸穩(wěn)定劑。將如此集中的原液在_70°C或2-8°C下儲(chǔ)存。隨后進(jìn)行兩種制造的生物過(guò)程的方法來(lái)生產(chǎn)大量的減毒的活病毒群體。典型的病毒的生產(chǎn)使用儲(chǔ)存在液氮中的Vero細(xì)胞的工作細(xì)胞庫(kù)用于生產(chǎn)過(guò)程的單層Vero細(xì)胞的復(fù)蘇和生長(zhǎng)。將工作細(xì)胞庫(kù)的兩個(gè)冷凍管從液氮儲(chǔ)存容器中小心地取出解凍，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到兩個(gè)T-150聚苯乙烯無(wú)菌培養(yǎng)瓶中用于復(fù)蘇并用含有5%胎牛血清的DMEM補(bǔ)充。將培養(yǎng)瓶在37°C下孵育M小時(shí)。在孵育期后，從培養(yǎng)物中傾析培養(yǎng)基并用含有5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基補(bǔ)充以促進(jìn)匯合的單層的形成。在顯微鏡下觀察培養(yǎng)瓶，觀察它們形態(tài)和在所使用的培養(yǎng)基中擴(kuò)增的能力。將細(xì)胞進(jìn)一步繁殖為兩個(gè)更多傳代以獲得若干容器的細(xì)胞來(lái)用于用輪狀病毒116E或1321感
^fe ο輪狀病毒116E或1321選自種子批系統(tǒng)的工作病毒庫(kù)并且被胰蛋白酶-活化和接種以感染細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞群進(jìn)行感染復(fù)數(shù)的計(jì)算。細(xì)胞被感染并在37°C下保持一小時(shí)用于吸附。在吸附時(shí)間之后，用不含血清的DMEM裝滿細(xì)胞培養(yǎng)物。將感染的細(xì)胞培養(yǎng)物保持在 35°C下，并每48小時(shí)后收集單次收獲物，持續(xù)144小時(shí)的時(shí)間。在每次單次收獲后用不含血清的DMEM補(bǔ)充細(xì)胞培養(yǎng)物。在第三次單次收獲后終止細(xì)胞培養(yǎng)物。將經(jīng)過(guò)濾的單次收獲物收集到無(wú)菌容器中并儲(chǔ)存在2-8°C下。將單次收獲物合并以形成合并的原液并保持在 2-8°C下。進(jìn)行取樣以測(cè)試每次單次收獲物和合并的原液的病毒含量、無(wú)菌性(sterility)。 合并的原液在SPG穩(wěn)定劑(蔗糖7. 46%、磷酸二氫鉀0. 0515%、磷酸氫二鉀0. 1 %和谷氨酸0. 101%)中在-70°C或2-8°C下儲(chǔ)存。還從不含穩(wěn)定劑的單次收獲物取出樣品的等份用于獲得不同溫度下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。預(yù)處理的病毒的生產(chǎn)使用儲(chǔ)存在液氮中的Vero細(xì)胞的工作細(xì)胞庫(kù)用于生產(chǎn)過(guò)程的單層Vero細(xì)胞的復(fù)蘇和生長(zhǎng)。將工作細(xì)胞庫(kù)的兩個(gè)冷凍管從液氮儲(chǔ)存容器中小心地取出解凍，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到兩個(gè)T-150聚苯乙烯無(wú)菌培養(yǎng)瓶中用于復(fù)蘇并用含有5%胎牛血清和0. 人血清白蛋白的DMEM補(bǔ)充。將培養(yǎng)瓶在37°C下孵育M小時(shí)。在孵育期后，從培養(yǎng)瓶?jī)A析培養(yǎng)基并用含有5 %胎牛血清和0. 1 %人血清白蛋白的DMEM補(bǔ)充以促進(jìn)匯合的單層的形成。第二組細(xì)胞培養(yǎng)物設(shè)置為每個(gè)在DMEM中含有0. 1%,0. 2%,0. 3%,0. 5%或人血清白蛋白(人來(lái)源的)連同5%胎牛血清。第三組細(xì)胞培養(yǎng)物也設(shè)置為每個(gè)在DMEM中含有0. 1%,0. 2%,0. 3%,0. 5%或人血清白蛋白(重組來(lái)源)連同5%胎牛血清。輪狀病毒116E或1321冷凍管選自種子批系統(tǒng)的工作病毒庫(kù)，并且制備接種物以感染Vero細(xì)胞培養(yǎng)物。根據(jù)細(xì)胞群進(jìn)行感染復(fù)數(shù)的確定。將細(xì)胞培養(yǎng)物用pH 7. 4到7. 6 的磷酸緩沖鹽水洗滌兩次。細(xì)胞培養(yǎng)物被感染并在37°C下保持一小時(shí)用于病毒的吸附。在吸附時(shí)間之后，用含有0. 人血清白蛋白的DMEM裝滿細(xì)胞培養(yǎng)物。將人來(lái)源的人血清白蛋白或重組人血清白蛋白添加到細(xì)胞培養(yǎng)物。將感染的細(xì)胞培養(yǎng)物保持在37°C下，并每48 小時(shí)后收集多次收獲物且用它們各自的含有人血清白蛋白(人來(lái)源的人血清白蛋白和重組人血清白蛋白)的培養(yǎng)基補(bǔ)充培養(yǎng)物。將收獲物收集在無(wú)菌容器中。在2-8°C下儲(chǔ)存收獲物。將感染的培養(yǎng)物保持在37°C下用于病毒增殖并維持細(xì)胞直到第三次收獲，在它們第三次收獲后終止培養(yǎng)物。合并來(lái)自每組的三次收獲以形成合并的原液并保持在2-8°C下。 進(jìn)行取樣以測(cè)試每次單次收獲合并的原液的病毒含量和無(wú)菌性。合并的原液在SPG穩(wěn)定劑 (蔗糖7. 46%、磷酸二氫鉀0. 0515%、磷酸氫二鉀0. 1 %和谷氨酸0. 101% )中在_70°C 或2-8°C下儲(chǔ)存。從不含穩(wěn)定劑的單次收獲物收集等份用于獲得不同溫度下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。圖1中顯示的是在五次實(shí)驗(yàn)中從典型的病毒和預(yù)處理的病毒獲得的平均滴度數(shù)據(jù)。所有五次實(shí)驗(yàn)使用相同的參數(shù)來(lái)進(jìn)行以證明在輪狀病毒在Vero細(xì)胞基底上增殖期間， 培養(yǎng)基中存在HSA比不含HSA確實(shí)導(dǎo)致更高的滴度。收集感染后的第2天、第4天和第6 天的三次單次收獲物并合并；滴度是2-8°C下3次收獲物的平均值。預(yù)處理的病毒顯示出更高的滴度收率。平均滴度顯示最小滴度差為0. 81og/ml和最大為1. 1 log/ml0實(shí)施例2.液體和凍干形式的典型的輪狀病毒和預(yù)處理的輪狀病毒的制劑以及每種制劑對(duì)穩(wěn)定性特性的影響將在2-8°C或_70°C下儲(chǔ)存的合并的原液基于103FFU/0. 5mL到108_5FFU/0. 5mL的目標(biāo)滴度配制成半成品并作為疫苗填充?；诤喜⒌脑旱牡味龋〕鲇?jì)算的體積的合并的原液并添加到預(yù)定體積的含有穩(wěn)定劑、抗生素和緩沖劑的半成品中。配制的半成品作為疫苗填充到小瓶中。在制劑中以不同組合和濃度使用的各種穩(wěn)定劑是乳白蛋白水解物 (LAH)、海藻糖、蔗糖、淀粉、乳糖、麥芽糖、大豆蛋白、rHSA(不包括可能已與從預(yù)處理的病毒生產(chǎn)過(guò)程收獲的預(yù)處理的病毒一起被帶出的任何殘留的rHSA)。將含有病毒的制劑的 0. 5ml等份無(wú)菌地轉(zhuǎn)移至2. Oml小瓶中并在2_8°C、25°C和37°C下儲(chǔ)存。以定期的時(shí)間間隔測(cè)試穩(wěn)定性參數(shù)以證明用各種穩(wěn)定劑(見(jiàn)表幻配制后的典型的病毒和預(yù)處理的病毒的穩(wěn)定性。液體制劑1- 的制備在無(wú)菌條件下通過(guò)計(jì)算穩(wěn)定劑、緩沖劑的體積和病毒抗原的體積以及目標(biāo)滴度來(lái)制備各種制劑。無(wú)菌地進(jìn)行從每種制劑取樣并單獨(dú)地標(biāo)記以指示樣品號(hào)、制備日期以及打算用于特定溫度儲(chǔ)存的樣品。樣品瓶在2-8°C、25°C和37°C下儲(chǔ)存。 樣品號(hào)被編碼并按照穩(wěn)定性研究計(jì)劃定期地測(cè)試它們的滴度。結(jié)果在圖1至圖12的圖中表不。
凍干制劑26-45的制備在無(wú)菌條件下通過(guò)計(jì)算穩(wěn)定劑、緩沖劑的體積和病毒抗原的體積以及目標(biāo)滴度來(lái)制備各種制劑。將配制的半成品無(wú)菌地填充到冷凍干燥瓶中并使它們經(jīng)歷42小時(shí)到48小時(shí)冷凍干燥過(guò)程。冷凍干燥過(guò)程通常有三部分預(yù)冷、初次干燥和二次干燥。冷凍干燥周期被設(shè)置為有利于不同制劑中所使用的各種穩(wěn)定劑的共熔點(diǎn)。完成冷凍干燥后，將小瓶在真空下適當(dāng)?shù)孛芊?。無(wú)菌地進(jìn)行從每種制劑取樣并單獨(dú)地標(biāo)記以指示樣品號(hào)、制備日期以及打算用于特定溫度儲(chǔ)存的樣品。樣品瓶在2-8°C、25°C和37°C下儲(chǔ)存。按照穩(wěn)定性研究計(jì)劃定期地測(cè)試樣品的滴度。凍干瓶使用WFI重構(gòu)。表權(quán)利要求
1.一種組合物，所述組合物包括(a)病毒抗原即減毒的活輪狀病毒，以及(b)藥學(xué)上可接受的生理pH的緩沖劑，其中，所述組合物關(guān)于病毒滴度的穩(wěn)定性被增強(qiáng)，因?yàn)樵诖嬖谌搜灏椎鞍椎那闆r下繁殖病毒對(duì)穩(wěn)定性的作用大于在不存在人血清白蛋白的情況下繁殖病毒對(duì)穩(wěn)定性的作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，所述組合物還包括至少一種穩(wěn)定劑，所述穩(wěn)定劑包括非病毒蛋白或其至少部分水解的蛋白水解物、或者單種二糖或2種二糖的組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述非病毒蛋白或蛋白水解物包括以下物質(zhì)中的至少一種乳白蛋白水解物、酵母水解物、明膠水解物、卵蛋白水解物、蛋白胨或植物蛋白或由人血清白蛋白示例的類(lèi)似蛋白，所述植物蛋白選自谷物蛋白、小麥蛋白、鷹嘴豆蛋白、 四季豆蛋白、扁豆蛋白、利馬豆蛋白、白豆蛋白、大豆蛋白、裂莢豌豆蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述蛋白水解物是乳白蛋白水解物。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述二糖是海藻糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述2種二糖的組合包括蔗糖和海藻糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，所述組合物包括(a)病毒抗原即減毒的活輪狀病毒，(b)藥學(xué)上可接受的生理pH的緩沖劑，以及(c)非病毒蛋白或蛋白水解物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，所述組合物包括(a)病毒抗原即減毒的活輪狀病毒，和(b)藥學(xué)上可接受的生理pH的緩沖劑，(c)非病毒蛋白或蛋白水解物，以及(d)二糖。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，所述組合物包括(a)病毒抗原即減毒的活輪狀病毒，和(b)藥學(xué)上可接受的生理pH的緩沖劑，(c)非病毒蛋白或蛋白水解物，以及(d)2種二糖的組合。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，所述組合物包括a.以103FFU/0.5ml至108 5FFU/0. 5ml的范圍的滴度的如權(quán)利要求1中所要求保護(hù)的病毒抗原即減毒的活輪狀病毒，b.藥學(xué)上可接受的緩沖劑，其是作為稀釋劑/載體的pH6. 8到8.0的磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖劑(磷酸鹽3IOmM和檸檬酸鹽IOOmM)，c.蛋白水解物，其是在20-30%w/v范圍的乳白蛋白水解物，以及d.二糖，其是約0. 5% w/v的海藻糖。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，所述組合物包括a.以103FFU/0.5ml到108 5FFU/0. 5ml的范圍的滴度的如權(quán)利要求1中所要求保護(hù)的病毒抗原即減毒的活輪狀病毒，b.藥學(xué)上可接受的緩沖劑，其是作為稀釋劑/載體的pH6. 8到8.0的磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖劑(磷酸鹽3IOmM和檸檬酸鹽IOOmM)，c.蛋白水解物，其是約5%w/v的乳白蛋白水解物，d.為約80%w/v的蔗糖的一種二糖和為約0. 5% w/v的海藻糖的另一種二糖。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述減毒的活輪狀病毒能夠顯示出與在不存在人血清白蛋白的情況下繁殖的減毒的活輪狀病毒相比較，在環(huán)境條件下儲(chǔ)存時(shí)平均滴度增加最小0. 81og/ml到最大1. 1 log/ml。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述減毒的活輪狀病毒是在存在0.人血清白蛋白的情況下繁殖的。
14.根據(jù)任何前述權(quán)利要求中所述的組合物，所述組合物是液體組合物或凍干組合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的液體組合物，所述液體組合物在37°C下穩(wěn)定6周、在25°C 下穩(wěn)定6個(gè)月且在2-8 °C下穩(wěn)定M個(gè)月。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的凍干組合物，所述凍干組合物在37°C下穩(wěn)定16周、在25°C 下穩(wěn)定6個(gè)月且在2-8 °C下穩(wěn)定M個(gè)月。
17.如前述權(quán)利要求中所要求保護(hù)的組合物，所述組合物用作用于治療患有輪狀病毒感染的受治療者的疫苗。
18.一種用于生產(chǎn)權(quán)利要求1中的減毒的活輪狀病毒的方法，所述方法包括 (i)用減毒的活輪狀病毒感染宿主細(xì)胞；( )使受感染的細(xì)胞在能夠支持所述細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，其中所述培養(yǎng)基用人血清白蛋白來(lái)補(bǔ)充；收獲能夠顯示更好的穩(wěn)定性的所述輪狀病毒。
全文摘要
公開(kāi)了涉及諸如輪狀病毒的活的或活的減毒的預(yù)處理的病毒和典型的病毒的組合物和方法。減毒的活輪狀病毒顯示更好的穩(wěn)定性特性且可用于預(yù)防兒童的輪狀病毒感染和/或輪狀病毒胃腸炎。
文檔編號(hào)C12N7/00GK102470170SQ201080031261
公開(kāi)日2012年5月23日 申請(qǐng)日期2010年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月13日
發(fā)明者克里什納·莫漢·瓦德雷夫, 塞爾維·維爾拉巴德蘭, 薩伊·德瓦拉居魯·普拉薩德 申請(qǐng)人:巴拉特生物技術(shù)國(guó)際有限公司