專利名稱：用于生產(chǎn)感興趣的化合物的經(jīng)改進(jìn)的宿主細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)感興趣的化合物的重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)此類宿主細(xì)胞的方法。本發(fā)明還涉及感興趣的化合物的生產(chǎn)。本發(fā)明還涉及經(jīng)分離的多核苷酸和包含所述多核苷酸的載體和宿主細(xì)胞。
_2]
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)感興趣的化合物的重組宿主細(xì)胞。此類宿主細(xì)胞已尤其從W01998/046774和W01998/46772中已知，其中宿主細(xì)胞在所述宿主細(xì)胞染色體的至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域之一中包含感興趣的多核苷酸，并且其中感興趣的多核苷酸的拷貝數(shù)通過基因轉(zhuǎn)變被提高。然而，已經(jīng)證實獲得高拷貝基因轉(zhuǎn)變菌株(例如通過根據(jù)W01998/046774和 W01998/46772中的方法獲得的菌株)通常被認(rèn)為是費力的。因此，如果能夠改進(jìn)所述方法， 從而使得能夠更不費力地構(gòu)建高拷貝基因轉(zhuǎn)變菌株，則是有利的。


圖I描繪了置換型載體pGBDEL的物理圖譜。相對于amdS標(biāo)記物標(biāo)明了用于克隆的側(cè)翼區(qū)的多克隆位點。圖2描繪了用于使Aspergillus niger (A. niger)中的hdfA基因失活的置換型載體pDEL-HDFA的物理圖譜。置換型載體包含hdfA側(cè)翼區(qū)，amdS標(biāo)記物和E. coli DNA。可以在轉(zhuǎn)化A. niger菌株之前，通過用限制性酶AscI和NotI消化，來去除E. coli DNA。圖3描繪了用于從宿主菌株中確實基因或基因片段的策略。使用的DNA構(gòu)建體包含amdS選擇標(biāo)記物，所述amdS選擇標(biāo)記物側(cè)翼是要被缺失的基因的同源區(qū)(5’和3’)(I)。 該構(gòu)建體通過在相應(yīng)基因組基因座(2)處雙重同源重組(X)而整合，并置換基因組基因拷貝(3)。隨后，在同向重復(fù)⑶上的重組去除amdS標(biāo)記物，導(dǎo)致要缺失的基因或基因片段的精確切除⑷。圖4描繪了親本A. niger菌株CBS 124. 903中g(shù)laA(葡糖淀粉酶)基因座的物理圖譜，和重組菌株GBA 300中三個截短的“X-標(biāo)記的” Λ glaA基因座(“X”表示BamHI、 Sail或BglII限制性位點)。圖5描繪了源自A. niger CBS 124. 903的重組菌株GBA 300的glaA DNA擴(kuò)增子中三個AglaA基因座的示意圖，每個基因座用不同的限制性位點(BamHI、Sail或BglII) 標(biāo)記。各個glaA基因座長度差異約20到60bp，從而能夠通過基于PCR的DNA-標(biāo)志測試 (DNA-flag test)使不同的截短的glaA基因座顯影。圖6描繪了用于改造基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域的載體pGBGLA-65的物理圖譜?；旧?，所述載體在兩個PglaA片段之間和3’ glaA與3” glaA區(qū)之間含有amdS選擇標(biāo)記物。 3^1&4與311&4區(qū)被用于靶向和整合進(jìn)Λ glaA基因座的相應(yīng)基因組區(qū)中。兩個PglaA片段被用于通過圖3中所示的反選擇(counterselection)排除amdS選擇標(biāo)記物。一個PglaA 片段是截短的PglaA啟動子片段(丟失PglaA啟動子MluI位點3’的最后600bp)，所述片段在amdS反選擇后保持存在于基因組中。圖7描繪了具有經(jīng)改造的BamHI擴(kuò)增子的菌株中g(shù)laA DNA擴(kuò)增子中的三個 Δ glaA基因座。通過在基因組glaA基因座的同源3’glaA和3”glaA基因座之間引入截短的同源葡糖淀粉酶啟動子片段，改造BamHI擴(kuò)增子。圖8描繪了新穎的乙酰胺酶選擇標(biāo)記物和經(jīng)改造的BamHI擴(kuò)增子靶向載體 PGBAAS-3的物理圖譜。glaA啟動子發(fā)揮靶向區(qū)和amdS基因啟動子的功能。圖9描繪了新穎的乙酰胺酶選擇標(biāo)記物和經(jīng)改造的BamHI擴(kuò)增子靶向載體 PGBAAS-4的物理圖譜。(截短的)glaA啟動子發(fā)揮靶向區(qū)的作用，gpdA啟動子驅(qū)動amdS基因的表達(dá)。圖10描繪了新穎的表達(dá)和經(jīng)改造的BamHI擴(kuò)增子靶向載體pGBT0P_ll的物理圖譜。HinDIII限制性酶可以被用于線性化載體并去除E. coli部分。圖11描繪了新穎的表達(dá)和經(jīng)改造的BamHI擴(kuò)增子靶向載體pGBT0P_12的物理圖譜。NotI限制性酶可以被用于線性化載體并去除E. coli部分。圖12描繪了置換型載體pDEL-AMYBII的物理圖譜。相對于amdS標(biāo)記物標(biāo)明了 5’amyBII側(cè)翼區(qū),3’amyBII側(cè)翼區(qū)。amyBII的3’-序列的序列重疊至少數(shù)百個bp。在轉(zhuǎn)化宿主菌株之前，可以通過用限制性酶NotI消化來去除E. coli DNA。圖13描繪了置換型載體PGBDEL-FUM3的物理圖譜。相對于amdS標(biāo)記物標(biāo)明了帶有部分fumB編碼序列的5’ fumB區(qū),和3’ fumB側(cè)翼區(qū)。fumB的5’ -序列的序列至少重疊數(shù)百bp。在轉(zhuǎn)化宿主菌株之前，可以通過用限制性酶AscI和NotI消化來去除E. coli DNA0圖14描繪了置換型載體pGBDEL-0CH2的物理圖譜。標(biāo)明了 Anl5g07860基因序列的部分，和Anl5g07930基因序列的部分，作為相對于amdS標(biāo)記物的側(cè)翼區(qū)。Anl5g07930基因的序列至少重疊數(shù)百bp，從而允許通過同源重組進(jìn)行反選擇。在轉(zhuǎn)化宿主菌株之前，可以通過用限制性酶AscI和NotI消化來去除E. coli DNA。圖15描繪了置換型載體PGBDEL-PRT2的物理圖譜。相對于amdS標(biāo)記物標(biāo)明了 5’prtT側(cè)翼區(qū)，3’prtT側(cè)翼區(qū)。prtT 3’序列的序列重疊至少數(shù)百bp。在轉(zhuǎn)化宿主菌株之前，可以通過用限制性酶BstBI和XmaI消化來去除E. coli DNA。圖16描繪了置換型載體pGBDEL_Sec6f的物理圖譜。標(biāo)明了 Sec61*突變體基因和相對于amdS標(biāo)記物的3’ Sec6f突變體基因片段。在轉(zhuǎn)化宿主菌株之前，可以通過用限制性酶AscI和NotI消化來去除E. coli DNA。圖17描繪了 PLA2表達(dá)載體pGBT0PPLA_2a的物理圖譜。標(biāo)明了相對于glaA啟動子的glaA側(cè)翼區(qū)，截短的glaA基因和pix)-pla2編碼序列。在轉(zhuǎn)化宿主菌株之前，可以通過用限制性酶NotI消化來去除E. coli DNA。圖18描繪了 PLA2表達(dá)載體pGBT0PPLA_2b的物理圖譜。標(biāo)明了 glaA啟動子，截短的glaA基因，pro-pla2編碼序列和3’ glaA側(cè)翼序列。在轉(zhuǎn)化宿主菌株之前,可以通過用限制性酶NotI消化來去除E. coli DNA。圖19描繪了表達(dá)載體pGBFINFUA-2的物理圖譜。標(biāo)明了相對于glaA啟動子的 glaA側(cè)翼區(qū)和A. niger amyB經(jīng)密碼子優(yōu)化的序列。在轉(zhuǎn)化宿主菌株之前,可以通過用限制性酶NotI消化來去除E. coli DNA。圖20描繪了 FUA表達(dá)載體pGBT0PFUA_3的物理圖譜。標(biāo)明了 glaA啟動子，截短的glaA基因,A. niger amyB經(jīng)密碼子優(yōu)化的序列和3’glaA側(cè)翼序列。在轉(zhuǎn)化宿主菌株之前，可以通過用限制性酶NotI消化來去除E. coli DNA。圖21描繪了在具有經(jīng)改造的BamHI擴(kuò)增子的菌株(例如實施例中基于GBA 303 的菌株)中，通過單一同源重組整合的示意圖。表達(dá)載體包含具有特異性靶向序列的可選擇的amdS標(biāo)記物和感興趣的基因。靶向序列允許以最高的基因轉(zhuǎn)變頻率特異性地基因組革巴向至經(jīng)改造的擴(kuò)增子(“智能整合策略”(“Smart integration strategy”))。發(fā)明詳沭令人驚訝地，分析揭示，(例如W01998/046774和W01998/46772中所述的)宿主細(xì)胞包含至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域，所述DNA結(jié)構(gòu)域的基因轉(zhuǎn)變頻率不必須相等。這些DNA結(jié)構(gòu)域中的一些顯示具有比其它基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域顯著更低的基因轉(zhuǎn)變頻率。 在這種情況下，如果將感興趣的多核苷酸整合進(jìn)具有低基因轉(zhuǎn)變頻率的DNA結(jié)構(gòu)域中而不是具有高基因轉(zhuǎn)變頻率的DNA結(jié)構(gòu)域中，則是不利的。具有更高基因轉(zhuǎn)變頻率的DNA結(jié)構(gòu)域?qū)⒃诤艽蟪潭壬细偁幊^(out-compete)具有更低基因轉(zhuǎn)變頻率的DNA結(jié)構(gòu)域。因此， 從感興趣的多肽被整合進(jìn)具有更低基因轉(zhuǎn)變頻率的DNA結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞中獲得拷貝基因轉(zhuǎn)變宿主細(xì)胞會更加費力。因此，如果感興趣的多核苷酸能夠被包含在具有顯著更高基因轉(zhuǎn)變頻率的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域中則是有利的，因為這會使得能夠更不費力地構(gòu)建包含多拷貝感興趣的多核苷酸的宿主菌株(高拷貝基因轉(zhuǎn)變菌株)。因此，存在對下述宿主細(xì)胞的需要，其中感興趣的多核苷酸優(yōu)先整合進(jìn)具有顯著更高的基因轉(zhuǎn)變頻率的同源DNA結(jié)構(gòu)域中。因此本發(fā)明的一個目的是提供此類宿主細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)感興趣的化合物的重組宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含適用于整合一個或多個拷貝的感興趣的多核苷酸的、至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域， 其中所述至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域中的至少一個被改造為與其來源的基本同源的 DNA結(jié)構(gòu)域相比對感興趣的多核苷酸具有增強的整合偏好。所述重組宿主細(xì)胞在本文中被稱作根據(jù)本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)感興趣的化合物的重組宿主細(xì)胞的生產(chǎn)方法，所述宿主細(xì)胞包含適用于整合一個或多個拷貝的感興趣的多核苷酸的、至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域，所述方法包括改造與另一基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域相比具有更高的基因轉(zhuǎn)變頻率的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域，使其與其來源的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域相比對感興趣的多核苷酸具有增強的整合偏好。本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)感興趣的化合物的方法，包括a.在有助于生產(chǎn)所述化合物的條件下培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞；和b.從培養(yǎng)基中回收感興趣的化合物。本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)感興趣的化合物的方法，包括a.在有助于生產(chǎn)所述化合物的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含適用于整合一個或多個拷貝的感興趣的多核苷酸的、至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域，其中所述至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域中的至少一個被改造為與其來源的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域相比對感興趣的多核苷酸具有增強的整合偏好，并且其中至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域整合了至少一個拷貝感興趣的多核苷酸；和
b.從培養(yǎng)基中回收感興趣的化合物。因此，根據(jù)本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞包含適用于整合一個或多個拷貝的感興趣的多核苷酸的、至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域，其中所述至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域中的至少一個被改造為與其來源的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域相比對感興趣的多核苷酸具有增強的整合偏好。適用于整合一個或多個拷貝感興趣的多核苷酸的所述基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地基本是彼此的復(fù)本(duplicate);更優(yōu)選地所述DNA結(jié)構(gòu)域是擴(kuò)增子。在本發(fā)明的上下文中，“重組(recombinant) ”是指不排外地涉及天然存在的過程的任何遺傳修飾和/或通過對宿主細(xì)胞進(jìn)行隨機(jī)誘變以及例如基因打斷和/或缺失和/或特異性誘變而誘導(dǎo)的遺傳修飾。因此，重組和天然存在的過程和/或通過對宿主細(xì)胞進(jìn)行隨機(jī)誘變誘導(dǎo)的遺傳修飾的組合被認(rèn)為是重組。根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞在其基因組中包含適用于整合一個或多個拷貝感興趣的多核苷酸的至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域。在野生型菌株中，這些DNA結(jié)構(gòu)域可在所述細(xì)胞的基因組中單拷貝存在或多拷貝存在。天然存在的多拷貝DNA結(jié)構(gòu)域的例子是rDNA結(jié)構(gòu)域。因此，在本發(fā)明中可優(yōu)選地使用或不使用rDNA結(jié)構(gòu)域。(如本發(fā)明所提供的)含有多拷貝這些基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域的菌株可例如通過經(jīng)典的菌株改進(jìn)得自包含單拷貝DNA結(jié)構(gòu)域的菌株，所述經(jīng)典的菌株改進(jìn)通過選擇具有改進(jìn)的由所述DNA結(jié)構(gòu)域中的基因編碼的基因產(chǎn)物生產(chǎn)的菌株進(jìn)行。通常，此類生產(chǎn)改進(jìn)是所選擇的菌株中DNA結(jié)構(gòu)域擴(kuò)增的結(jié)果。 此類經(jīng)擴(kuò)增的DNA結(jié)構(gòu)域在下文中也被稱作復(fù)制子。包含此類復(fù)制子的宿主細(xì)胞的例子例如描述于 van Dijck et al, 2003, Regulatory Toxicology and Pharmacology 28 ;27_35 : On the safety of a new generation of DSM Aspergillus niger enzyme production strains中。咋van Dijck et al中描述了包含7個經(jīng)擴(kuò)增的葡糖淀粉酶基因基因座(即轉(zhuǎn)座子)的Aspergillus niger菌株。盡管本發(fā)明優(yōu)選地使用此類擴(kuò)增子作為用于整合重組DNA分子的DNA結(jié)構(gòu)域，但是本發(fā)明不以任何方式僅限于此。事實上，宿主細(xì)胞基因組中存在兩個或更多基本同源版本的任何DNA結(jié)構(gòu)域都可以使用，只要滿足兩個功能標(biāo)準(zhǔn)1) DNA結(jié)構(gòu)域應(yīng)當(dāng)適用于接受感興趣的多核苷酸的整合；2)DNA結(jié)構(gòu)域應(yīng)當(dāng)能夠與真菌基因組中DNA結(jié)構(gòu)域的其它基本同源的版本重組，從而通過基因轉(zhuǎn)變實現(xiàn)被整合的重組DNA分子的倍增。為了滿足第一個標(biāo)準(zhǔn)，DNA結(jié)構(gòu)域必須具有足夠的長度，從而允許感興趣的多核苷酸通過同源重組靶向進(jìn)DNA結(jié)構(gòu)域中。為此目的，DNA結(jié)構(gòu)域應(yīng)當(dāng)包含至少lOObp，優(yōu)選地至少500bp,更優(yōu)選地至少Ikb和更優(yōu)選地至少2kb。優(yōu)選地，DNA結(jié)構(gòu)域用于在其中整合感興趣的多核苷酸的適合性(suitability)還由下述要求決定進(jìn)入DNA結(jié)構(gòu)域的整合不應(yīng)破壞對所討論的宿主細(xì)胞生存力而言至關(guān)重要的功能。第二個功能標(biāo)準(zhǔn)(即與宿主細(xì)胞基因組中DNA結(jié)構(gòu)域的其它基本同源的版本重組的能力)是允許不同版本DNA結(jié)構(gòu)域之間基因轉(zhuǎn)變所必需的。針對這一目的的最小要求是每個版本的DNA結(jié)構(gòu)域在DNA結(jié)構(gòu)域任一端的側(cè)翼是與另一版本DNA結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)側(cè)翼序列足夠同源的DNA序列，從而允許在側(cè)翼序列之間同源重組。所述同源重組的結(jié)果是基因轉(zhuǎn)變其中DNA結(jié)構(gòu)域版本之一被置換為復(fù)制出的含有整合的重組DNA分子的另一 DNA結(jié)構(gòu)域版本。關(guān)于仍然允許基因轉(zhuǎn)變的側(cè)翼序列長度和同源性程度的最小要求可根據(jù)所討論的生物而變化?？赡芫哂兄辽?0%總體同源性的IOObp的最小長度仍然允許基因轉(zhuǎn)變。顯然，基因轉(zhuǎn)變的頻率會隨著遞增的側(cè)翼序列長度和同源性而提高。優(yōu)選地，不同的DNA結(jié)構(gòu)域包含共享至少80%同源性的至少Ikb的側(cè)翼序列。進(jìn)一步更優(yōu)選地，不同的DNA結(jié)構(gòu)域包含共享至少95%同源性的至少5kb的側(cè)翼序列。在一個更優(yōu)選的實施方案中，不同的DNA 結(jié)構(gòu)域包含共享至少99%同源性的至少IOkb的側(cè)翼序列。在一個最優(yōu)選的實施方案中，不同的DNA結(jié)構(gòu)域包含共享至少99%同源性的至少50kb的側(cè)翼序列。(在本文中被稱作基本復(fù)本(substantial duplicates))并非彼此的完美拷貝的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域的例子是等位基因變體、基因家族和/或編碼同工酶(iso-enzyme)的基因。最優(yōu)選的是下述基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域，它們是彼此的精確拷貝，至多差異在于存在被整合的感興趣的多核苷酸。 此類相同的DNA結(jié)構(gòu)域的例子是擴(kuò)增子。或者，可以使用DNA合成和/或重組DNA技術(shù)創(chuàng)建人工DNA結(jié)構(gòu)域，此類人工DNA結(jié)構(gòu)域可隨后被引入想要的真菌中并在其中擴(kuò)增。因此， 在本發(fā)明中可優(yōu)選地使用或不使用此類人工DNA結(jié)構(gòu)域?；就吹腄NA結(jié)構(gòu)域的總長度(即包括側(cè)翼序列)可從少于Ikb變化至數(shù)百kb，例如先前已證實DNA結(jié)構(gòu)域的長度范圍從A. oryzae BECh2中被失活的(公開于 W00039322中)、Aspergillus oryzae親本菌株IF04177中存在的三個TAKA淀粉酶基因(在 W09812300 和 U. S. Pat. No. 5，766，912 中作為 A1560 公開)的每個單位幾 kb 到 Penicillium chrysogenum中經(jīng)擴(kuò)增的青霉素簇的每個單位約57kb,和Aspergillus niger的經(jīng)擴(kuò)增的 glaA基因座的每個單位多于80kb (見W09846772)?？梢酝ㄟ^鑒定下述宿主細(xì)胞來監(jiān)測基因轉(zhuǎn)變，其中包含感興趣的多核苷酸的DNA 結(jié)構(gòu)域被倍增。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法，例如簡單地篩選下述宿主細(xì)胞， 其具有感興趣的多核苷酸所編碼的產(chǎn)物的更高生產(chǎn)水平。還可以使用用于測定DNA拷貝數(shù)的定量方法，例如通過例如下文所述的“DNA-標(biāo)志(flag) ”測試分析宿主細(xì)胞的基因型，定量PCR，Southern分析或比較基因組雜交，或用于測定RNA水平的定量方法，例如RT-PCR、 Northern分析或GeneChip或微陣列分析。根據(jù)本發(fā)明，絲狀真菌中每個版本的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地與另一版本的DNA結(jié)構(gòu)域區(qū)別在于用于鑒定目的的獨特的序列標(biāo)簽。此類序列標(biāo)簽允許檢測和監(jiān)測不同DNA結(jié)構(gòu)域之間的基因轉(zhuǎn)變，從而有助于具有想要的基因型的基因轉(zhuǎn)變體(gene convertants)的篩選和/或選擇?？梢允褂萌魏涡问降男蛄袠?biāo)簽，只要它們允許檢測不同版本的DNA結(jié)構(gòu)域即可例如范圍從在Southern印跡上檢測的限制性位點到提供容易的可檢測表型的完整可選擇標(biāo)記物基因。一種尤其有用的序列標(biāo)簽方法描述于W09846772、 W09846774和van Dijck et al，上文中。所述方法允許在單一 PCR中使用一對寡核苷酸 PCR引物檢測各個DNA結(jié)構(gòu)域。DNA結(jié)構(gòu)域以下述方式被修飾在PCR中每個版本的DNA結(jié)構(gòu)域生產(chǎn)具有特有長度的PCR片段。獲得的PCR片段的長度和強度分別指示了每個DNA結(jié)構(gòu)域的存在和拷貝數(shù)。被稱作“DNA標(biāo)志”的這種形式的序列標(biāo)簽允許快速分析大量轉(zhuǎn)變體菌落的基因型，從而獲得具有想要的基因型的轉(zhuǎn)變體。根據(jù)本發(fā)明，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞的至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域之一被改造為與其來源的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域相比對感興趣的多核苷酸具有增強的整合偏好。優(yōu)選地,宿主細(xì)胞的至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域之一的靶向DNA結(jié)構(gòu)域被改造為允許重組DNA分子/感興趣的多核苷酸通過同源重組更特異地靶向進(jìn)入被改造的靶向DNA結(jié)構(gòu)域中。如果靶向DNA序列或DNA結(jié)構(gòu)域在宿主細(xì)胞中出現(xiàn)多于一次，則發(fā)現(xiàn)感興趣的多核苷
8酸與宿主細(xì)胞的多個靶向DNA結(jié)構(gòu)域同源重組?？赡芨脑煲粋€基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域中的靶向DNA結(jié)構(gòu)域，以支持對所述經(jīng)改造的靶向DNA結(jié)構(gòu)域的更特異的靶向，而不影響與宿主細(xì)胞中其它基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域版本的重組。對于最適靶向偏好而言，用于靶向的DNA 序列的改造在重組DNA分子/感興趣的多核苷酸中和宿主中完成。藉此，獲得一組匹配的宿主和整合載體。優(yōu)選地，通過向基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域中引入具有增強的整合偏好的序列，進(jìn)行靶向DNA的改造。優(yōu)選地，通過基因置換引入具有增強的整合偏好的所述序列。因此，本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)感興趣的化合物的重組宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含適用于整合一個或多個拷貝的感興趣的多核苷酸的、至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域，其中所述至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域中的至少一個被改造為與其來源的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域相比對感興趣的多核苷酸具有增強的整合偏好，其中經(jīng)改造的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域包含靶向DNA 結(jié)構(gòu)域，其中所述靶向DNA結(jié)構(gòu)域包含具有增強的整合偏好的序列。更優(yōu)選地，根據(jù)本文的實施例進(jìn)行靶向結(jié)構(gòu)域的改造。根據(jù)本發(fā)明，用于靶向的經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域的靶向序列被優(yōu)選地改造為在宿主的基因組中是獨特的。優(yōu)選地，被改造為在宿主基因組內(nèi)獨特的靶向序列包含選自下組的序列異源DNA多核苷酸序列、先前從宿主中去除并再引入的DNA多核苷酸序列，與宿主中野生型情況相比以不同順序裝配的同源DNA多核苷酸片段，和人工DNA多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，用于靶向至經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域的感興趣的多核苷酸的一個或兩個側(cè)翼序列優(yōu)選地在宿主基因組內(nèi)是獨特的。優(yōu)選地，用于靶向至經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域的感興趣的多核苷酸的一條或兩條側(cè)翼序列包含選自下組的序列異源DNA多核苷酸序列、先前從宿主中去除并再引入的DNA多核苷酸序列，與宿主中野生型情況相比以不同順序裝配的同源DNA多核苷酸片段，和人工DNA多核苷酸。優(yōu)選地，經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域的靶向序列被改造為在宿主基因組內(nèi)是獨特的，并且用于靶向至經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域的感興趣的多核苷酸的一條或兩條側(cè)翼序列在宿主基因組內(nèi)是獨特的。根據(jù)本發(fā)明，用于靶向至經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域的序列優(yōu)選地是用于引入和/或表達(dá)感興趣的多核苷酸的遺傳元件(genetic element)。遺傳元件的例子是基因、啟動子、終止子、cDNA、內(nèi)含子、基因間區(qū)域、或其部分和/或組合。更優(yōu)選地，用于靶向至經(jīng)改造的DNA 結(jié)構(gòu)域的序列包含用于引入和/或表達(dá)感興趣的多核苷酸的一個或多個異源遺傳元件。進(jìn)一步更優(yōu)選地，用于靶向至經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域的感興趣的多核苷酸的一條或兩條側(cè)翼序列包含用于引入和/或表達(dá)感興趣的多核苷酸的一個或多個異源遺傳元件。進(jìn)一步更優(yōu)選地，用于靶向至經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域的序列包含用于引入和/或表達(dá)感興趣的多核苷酸的一個或多個A. niger遺傳元件。進(jìn)一步更優(yōu)選地，用于祀向至經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域的感興趣的多核苷酸的一條或兩條側(cè)翼序列包含用于引入和/或表達(dá)感興趣的多核苷酸的一個或多個A. niger遺傳元件。進(jìn)一步更優(yōu)選地，用于祀向至經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域的序列包含用于引入和/或表達(dá)感興趣的多核苷酸的A. niger glaA葡糖淀粉酶遺傳元件和/或側(cè)翼區(qū)。進(jìn)一步更優(yōu)選地，用于靶向至經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域的感興趣的多核苷酸的一條或兩條側(cè)翼序列包含用于引入和/或表達(dá)感興趣的多核苷酸的A. niger glaA葡糖淀粉酶遺傳元件和/或側(cè)翼區(qū)。進(jìn)一步更優(yōu)選地，用于靶向至經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域的序列包含用于引入和/或表達(dá)感興趣的多核苷酸的A. niger glaA葡糖淀粉酶啟動子和/或葡糖淀粉酶終止子區(qū)。進(jìn)一步更優(yōu)選地，用于靶向至經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域的感興趣的多核苷酸的一條或兩條側(cè)翼序列包含用于引入和/或表達(dá)感興趣的多核苷酸的A. niger glaA葡糖淀粉酶啟動子和/或葡糖淀粉酶終止子區(qū)。進(jìn)一步更優(yōu)選地，用于靶向至經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域的序列包含用于引入和/或表達(dá)感興趣的多核苷酸的、與野生型情況相比處于逆序的A. niger glaA葡糖淀粉酶終止子區(qū)和glaA葡糖淀粉酶啟動子。進(jìn)一步更優(yōu)選地，用于靶向至經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域的感興趣的多核苷酸的一條或兩條側(cè)翼序列包含用于引入和/或表達(dá)感興趣的多核苷酸的、與野生型情況相比處于逆序的A. niger glaA葡糖淀粉酶終止子區(qū)和glaA 葡糖淀粉酶啟動子。進(jìn)一步更優(yōu)選地，用于靶向至經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域的序列包含用于引入和表達(dá)感興趣的多核苷酸的、如SEQ ID NO :2中所鑒定的A. niger glaA葡糖淀粉酶終止子區(qū)和glaA葡糖淀粉酶啟動子。進(jìn)一步更優(yōu)選地，用于靶向至經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域的感興趣的多核苷酸的一條或兩條側(cè)翼序列包含用于引入和表達(dá)感興趣的多核苷酸的、如SEQ ID NO 2中所鑒定的A. niger glaA葡糖淀粉酶終止子區(qū)和glaA葡糖淀粉酶啟動子。最優(yōu)選地，用于靶向至經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域的序列和用于靶向至經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域的感興趣的多核苷酸的兩條側(cè)翼序列是相同的，并且包含用于引入和表達(dá)感興趣的多核苷酸的、如SEQ ID NO 2中所鑒定的A. niger glaA葡糖淀粉酶終止子區(qū)和glaA葡糖淀粉酶啟動子。因此，本發(fā)明提供了包含根據(jù)SEQ ID NO :2的多核苷酸或其功能片段的多核苷酸， 和包含下述多核苷酸的宿主細(xì)胞，所述多核苷酸包含根據(jù)SEQ ID NO :2的多核苷酸或其功能片段。功能在本文中應(yīng)解釋為具有啟動子活性，并且是具有增強的整合偏好的靶向序列。 優(yōu)選地，根據(jù)SEQ ID NO 2的多核苷酸的功能片段包含至少lOObp，更優(yōu)選地至少200bp， 更優(yōu)選地至少300bp,更優(yōu)選地至少500bp,更優(yōu)選地至少600bp,更優(yōu)選地至少700bp,更優(yōu)選地至少800bp,更優(yōu)選地至少900bp,更優(yōu)選地至少IOOObp,更優(yōu)選地至少1200bp,更優(yōu)選地至少1500bp,更優(yōu)選地至少2000bp,更優(yōu)選地至少3000bp,進(jìn)一步更優(yōu)選地至少4000bp。 優(yōu)選地，功能片段具有的匹配百分比(即位置同一性)至少約50%，更優(yōu)選地至少約60%， 進(jìn)一步更優(yōu)選地至少約70%，進(jìn)一步更優(yōu)選地至少約80%，進(jìn)一步更優(yōu)選地至少約85%， 進(jìn)一步更優(yōu)選地至少約90%，進(jìn)一步更優(yōu)選地至少約95%，進(jìn)一步更優(yōu)選地至少約97%， 進(jìn)一步更優(yōu)選地至少約98%，進(jìn)一步更優(yōu)選地至少約99%的同一性，進(jìn)一步優(yōu)選地，匹配百分比即同一性等于100%。最優(yōu)選地，包含根據(jù)SEQ ID NO 2的多核苷酸的多核苷酸包含SEQ ID NO 3或其功能片段。功能在本文中被解釋為具有啟動子活性，并且是具有增強的整合偏好的靶向序列。因此，本發(fā)明提供了包含根據(jù)SEQ ID NO :3的多核苷酸或其功能片段的多核苷酸， 和包含下述多核苷酸的載體和宿主細(xì)胞，所述多核苷酸包含根據(jù)SEQ ID NO :3的多核苷酸或其功能片段。優(yōu)選地，SEQ ID NO 3的功能片段包含至少lOObp，更優(yōu)選地至少200bp，更優(yōu)選地至少300bp,更優(yōu)選地至少500bp,更優(yōu)選地至少600bp,更優(yōu)選地至少700bp,更優(yōu)選地至少800bp,更優(yōu)選地至少900bp,更優(yōu)選地至少IOOObp,更優(yōu)選地至少1200bp,更優(yōu)選地至少1300bp，進(jìn)一步更優(yōu)選地至少1400bp。優(yōu)選地，功能片段的匹配百分比(即位置同一性)為至少約50 %，更優(yōu)選地至少約60 %，進(jìn)一步更優(yōu)選地至少約70 %，進(jìn)一步更優(yōu)選地至少約80 %，進(jìn)一步更優(yōu)選地至少約85 %，進(jìn)一步更優(yōu)選地至少約90 %，進(jìn)一步更優(yōu)選地至少約95 %，進(jìn)一步更優(yōu)選地至少約97 %，進(jìn)一步更優(yōu)選地至少約98 %，進(jìn)一步更優(yōu)選地至少約99%同一性，最優(yōu)選的，匹配百分比即同一性等于100%。多核苷酸的例子是(但不限于)單鏈或雙鏈的核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸 (DNA)分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本文要求保護(hù)的多核苷酸的互補體和反向互補體旨在落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，用于靶向至經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域的序列優(yōu)選地是用于引入和/或表達(dá)感興趣的多核苷酸的遺傳元件，其中所述遺傳元件在經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域中的功能性在構(gòu)建體的整合后被打斷。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，用于靶向至經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域的序列優(yōu)選地是用于引入和/或表達(dá)感興趣的多核苷酸的遺傳元件，其中所述遺傳元件在經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域中的功能性在構(gòu)建體的整合后被恢復(fù)。先前已經(jīng)證實，基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域能夠通過基因轉(zhuǎn)變和/或通過基因擴(kuò)增而倍增。盡管并不相同，但是在本文中使用時，基因轉(zhuǎn)變和基因擴(kuò)增兩種術(shù)語可互換使用。不同的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域顯示具有不同的倍增頻率(frequencies of multiplication), 即基因轉(zhuǎn)變頻率。改造具有最高基因轉(zhuǎn)變頻率的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域的靶向DNA結(jié)構(gòu)域的優(yōu)點之一是，通過基因轉(zhuǎn)變和/或擴(kuò)增篩選和選擇具有提高拷貝數(shù)的感興趣的多核苷酸的宿主更加高效。因此，經(jīng)改造的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域所來源的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域具有比至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域中另一個至少高出10%的基因轉(zhuǎn)變頻率。更優(yōu)選地，基因轉(zhuǎn)變頻率高至少15%，進(jìn)一步更優(yōu)選地高至少20%，進(jìn)一步更優(yōu)選地高至少30%，進(jìn)一步更優(yōu)選地高至少40 %,進(jìn)一步更優(yōu)選地高至少50 %,進(jìn)一步更優(yōu)選地高至少60 %,進(jìn)一步更優(yōu)選地高至少70 %,進(jìn)一步更優(yōu)選地高至少80 %,進(jìn)一步更優(yōu)選地高至少90 %,進(jìn)一步更優(yōu)選地高至少100%，進(jìn)一步更優(yōu)選地高至少150%,進(jìn)一步更優(yōu)選地高至少200%,進(jìn)一步更優(yōu)選地高至少300 %,進(jìn)一步更優(yōu)選地高至少400 %,進(jìn)一步更優(yōu)選地高至少500 %,進(jìn)一步更優(yōu)選地高至少1000%。根據(jù)本發(fā)明，可以通過測定宿主細(xì)胞的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域的基因轉(zhuǎn)變頻率， 來鑒定具有更高基因轉(zhuǎn)變頻率的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何手段測定基因轉(zhuǎn)變頻率。一種優(yōu)選的方法是實施例3. I中描述的方法。在所述放阿飛中，用感興趣的多核苷酸轉(zhuǎn)化包含基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域的宿主細(xì)胞。選擇了三種轉(zhuǎn)化體， 每種在單個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域中包含單個拷貝的感興趣的多核苷酸，每種轉(zhuǎn)化體在不同的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域中整合了多核苷酸。將轉(zhuǎn)化體傳播進(jìn)后代克隆中厚，通過用于鑒定目的的獨特的序列(即使用上文所述的“標(biāo)志DNA”分析)鑒定后代克隆的基因型。接著通過用包含所述基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)化體的基因轉(zhuǎn)變體的數(shù)量除以所述特異性轉(zhuǎn)化體的克隆總數(shù)，來計算基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域的基因轉(zhuǎn)變頻率。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞是下述細(xì)胞，其中至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域各自整合了至少一個拷貝的感興趣的多核苷酸。更優(yōu)選地，每個所述結(jié)構(gòu)域整合了至少兩個拷貝、進(jìn)一步更優(yōu)選地至少三個拷貝、進(jìn)一步更優(yōu)選地四個拷貝、進(jìn)一步更優(yōu)選地四到六個拷貝的感興趣的多核苷酸。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞的每個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域整合了相同數(shù)量的感興趣的多核苷酸?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲得的任何方法測定感興趣的多核苷酸的拷貝數(shù)，例如通過Southern分析或(半)定量PCR分析基因型,通過Northern分析、GeneChip或微陣列分析或(半)定量RT-PCR進(jìn)行表達(dá)分析，通過Western印跡、ELISA、酶活性測定法分析感興趣的多核苷酸編碼的產(chǎn)物。測定感興趣的多核苷酸拷貝數(shù)的方法詳盡描述于 W09846772中，并且是根據(jù)本發(fā)明用于測定感興趣的多核苷酸拷貝數(shù)的優(yōu)選的方法。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞包含至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域，它們被改造為與其來源的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域相比對感興趣的多核苷酸具有增強的整合偏好，進(jìn)一步優(yōu)選地具有三個經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步更優(yōu)選地具有四個經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域， 進(jìn)一步更優(yōu)選地具有五個經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步更優(yōu)選地具有六個經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域。最優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的所述宿主細(xì)胞的每個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域都是經(jīng)改造的 DNA結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域整合了至少兩個拷貝、進(jìn)一步更優(yōu)選地至少三個拷貝、進(jìn)一步更優(yōu)選地至少四個拷貝的感興趣的多核苷酸，進(jìn)一步更優(yōu)選地經(jīng)改造的DNA 結(jié)構(gòu)域整合了至少五個拷貝、進(jìn)一步更優(yōu)選地至少六個拷貝、至少七個拷貝、至少八個拷貝、至少九個拷貝、至少十個拷貝的感興趣的多核苷酸。最優(yōu)選地，經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域整合了五個或六個拷貝的感興趣的多核苷酸。優(yōu)選地，每個所述經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域都整合了相同數(shù)量的感興趣的多核苷酸。優(yōu)選地，包含被改造為與其來源的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域相比對感興趣的多核苷酸具有增強的整合偏好的多個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域的所述宿主細(xì)胞源自包含單個經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域的宿主細(xì)胞，所述單個經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域整合了多拷貝的感興趣的多核苷酸；即整合了多拷貝感興趣的多核苷酸的經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域的額外拷貝是通過基因轉(zhuǎn)變產(chǎn)生的。優(yōu)選地，通過操控整合途徑朝向HR，提高多核苷酸靶向整合至根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞基因組中預(yù)定位點的效率。此類操控可以通過提高HR途徑的效率，和/或降低(表示減少)NHR途徑的效率和/或通過提高NHR/HR比例來實現(xiàn)。真核細(xì)胞具有至少兩種獨立的途徑(一種通過同源重組(HR)，一種通過非同源重組(NHR))，藉此能夠?qū)⒍嗪塑账嵴线M(jìn)宿主基因組中。在本發(fā)明的上下文中，HR途徑被定義為涉及控制多核苷酸靶向真核進(jìn)宿主基因組中的所有基因和元件，所述多核苷酸與其中靶向整合的宿主基因組的某預(yù)定位點具有一定程度的同源性。NHR途徑被定義為涉及控制多核苷酸整合進(jìn)宿主基因組中的所有基因和元件，與所述多核苷酸和宿主基因組序列之間的同源性程度無關(guān)。非同源重組與同源重組的比例(NHR/H)決定了多核苷酸靶向整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中預(yù)定位點的效率。NHR/HR比例高時，定向整合的效率相對低。NHR/HR比例低時，定向整合的效率相對高。NHR/HR比例可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過已知方法，通過評價NHR和HR 的頻率并隨后將各自的頻率相除來測定，所述方法的一個例子是WO 02/052026中描述的方法。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞包含編碼含有修飾的NHR組件的多核苷酸，其中在可比較的條件下培養(yǎng)時所述宿主細(xì)胞與其來源的親本細(xì)胞相比缺乏所述NHR組件的生產(chǎn)。所述修飾導(dǎo)致NHR/HR比例的降低，從而提高多核苷酸靶向整合至宿主細(xì)胞基因組中預(yù)定位點的效率。通過修飾編碼NHR組件的多核苷酸，導(dǎo)致所述NHR組件的缺乏，宿主細(xì)胞的NHR/ HR比例被操控朝向HR，因此會提高靶向整合的效率。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞顯示所述NHR組件的至少5%的缺乏，更優(yōu)選地至少10 %的缺乏，更優(yōu)選地至少20 %的缺乏，更優(yōu)選地至少30 %的缺乏，更優(yōu)選地至少40 % 的缺乏，更優(yōu)選地至少50 %的缺乏，更優(yōu)選地至少60 %的缺乏，更優(yōu)選地至少70 %的缺乏， 更優(yōu)選地至少80 %的缺乏，更優(yōu)選地至少90 %的缺乏，更優(yōu)選地至少95 %的缺乏，更優(yōu)選地至少97%的缺乏，更優(yōu)選地至少99%的缺乏。最優(yōu)選地，宿主細(xì)胞顯示所述NHR組件的 100%的缺乏。要被修飾的NHR組件可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何NHR組件。優(yōu)選的要被修飾的 NHR 組件選自下組KU70，KU80，MRE11，RAD50, RAD51, RAD52, XRS2, SIR4, LIG4，或其同源物。更優(yōu)選的要被修飾的NHR組件是KU70和KU80，hdfA和hdfB或其同源物。最優(yōu)選的要被修飾的NHR組件是KU70或hdfA，或其同源物。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞包含下述多核苷酸，所述多核苷酸編碼含有打斷或缺失的NHR組件，如W02005/095624中所述。獲得此類宿主細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且詳盡描述于W02005/095624中。優(yōu)選地，在相同條件下測定時，根據(jù)本發(fā)明的NHR缺陷宿主細(xì)胞中的NHR/HR比例與非缺陷型親本宿主細(xì)胞相比降低了至少10%，更優(yōu)選地至少20%，更優(yōu)選地至少30%，更優(yōu)選地至少40 %，更優(yōu)選地至少50 %，更優(yōu)選地至少100 %，更優(yōu)選地至少200 %，進(jìn)一步更優(yōu)選地至少 1000% ο或者，或與NHR組件的缺乏相組合，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞中至少一種涉及HR的基因的表達(dá)水平與其來源的細(xì)胞中相同基因的表達(dá)水平相比被上調(diào)。這可以通過提高編碼涉及HR的組件的基因的表達(dá)水平，和/或通過提高涉及HR的組件的表達(dá)水平，和/或通過 (暫時)提高涉及HR的組件的活性來實現(xiàn)?；蛘?，或與上文所述的NHR/HR比例調(diào)控相組合，可以使用W02007/115886和 W02007/115887中所述方法來正向選擇(positively select)其中通過同源重組整合了感興趣的多核苷酸的宿主細(xì)胞，和/或去選擇(de-select)其中通過非同源重組發(fā)生整合的細(xì)胞。W02007/115886和W02007/115887描述了用于此類選擇或去選擇的(額外的)選擇標(biāo)記物的用途。此類選擇的一個例子是通過白喉毒素A (diphtheria toxin A)選擇性殺死其中通過非同源重組發(fā)生整合的細(xì)胞(W02007/115887)。多核苷酸的修飾在本文中被定義為導(dǎo)致多核苷酸序列改變的任何事件。修飾被理解為一種或多種修飾。修飾可以通過核苷酸序列或多核苷酸的轉(zhuǎn)錄或翻譯必需的調(diào)節(jié)元件中一個或多個核苷酸的引入(插入)、取代或去除(缺失)來實現(xiàn)。例如，可以插入或去除核苷酸，從而導(dǎo)致終止密碼子的引入，起始密碼子的去除或多核苷酸開放讀碼框的改變或移碼。序列或其調(diào)節(jié)元件的修飾可以通過本領(lǐng)域已知的方法，通過定點或隨機(jī)的誘變，DNA改組方法，DNA再組裝方法(DNA reassembly methods),基因合成(見例如 Young and Dong, (2004)， Nucleic Acids Research 32， (7)electronic access http:// nar. oupjournals. org/cgi/reprint/32/7/e59 or Gupta et al. (1968), Proc. Natl. Acad. Sci USA,60 1338-1344 ；Scarpulla et al. (1982), Anal.Biochem. 121 :356-365 ； Stemmer et al. (1995), Gene 164 :49-53),或PCR產(chǎn)生的誘變來實現(xiàn)。隨機(jī)誘變程序的例子是本領(lǐng)域公知的，例如化學(xué)(例如NTG)誘變或物理(例如UV)誘變。定向誘變程序的例子是 QuickChange 定點誘變試劑盒(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), the ‘The Altered Sites II 體外誘變系統(tǒng)’ (Promega Corporation)或使用如 Gene. 1989 Apr 15 ；77 (I) :51-9. (Ho SN, Hunt HD, Horton RM,Pullen JK, Pease LR “Site-directedmutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction，，)中所述 PCR 或使用如 Molecular Biology Current Innovations and Future Trends. (Eds.
A.M. Griffin and H. G. Griffin. ISBN 1-898486-01-8 ; 1995 Horizon Scientific Press, PO Box I, ffymondham, Norfolk, U. K.)中所述 PCR 的重疊延伸。用于修飾的優(yōu)選方法基于基因置換、基因缺失或基因打斷的技術(shù)。例如，在基因打斷方法中，對應(yīng)于內(nèi)源多核苷酸的多核苷酸被體外誘變，以生產(chǎn)缺陷型多核苷酸，所述缺陷型多核苷酸隨后被轉(zhuǎn)化進(jìn)親本細(xì)胞中，生產(chǎn)缺陷型多核苷酸。通過同源重組，缺陷型多核苷酸置換內(nèi)源多核苷酸?？赡芷谕毕菪投嗪塑账徇€編碼標(biāo)記物，所述標(biāo)記物可被用于選擇其中核酸序列被修飾的轉(zhuǎn)化體。在內(nèi)源多核苷酸缺失或置換的情況下，適當(dāng)?shù)腄NA序列必須被引入要被缺失或置換的靶基因座。適當(dāng)?shù)腄NA序列優(yōu)選地存在于克隆載體上。優(yōu)選的整合型克隆載體包含于要缺失或置換的多核苷酸同源的DNA片段，用于將克隆載體整合至該預(yù)定的基因座。為了促進(jìn)靶向整合，在轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞之前優(yōu)選地將克隆載體線性化。優(yōu)選地進(jìn)行線性化，使得克隆載體的一端、優(yōu)選地任一端的側(cè)翼是與要缺失或置換的DNA序列同源的序列?；蛘撸蚺c其它所述技術(shù)相組合，可以使用基于E. coli中粘粒體內(nèi)重組的技術(shù)， 如 A rapid method for efficient gene replacement in the filamentous fungus Aspergillus nidulans(2000)Chaveroche, M-K. , Ghico, J-M. and d’Enfert C；Nucleic acids Research, vol 28, no 22 中所述。或者，可以使用與多核苷酸的核酸序列互補的核苷酸序列，通過已確立的反義技術(shù)，進(jìn)行其中所述宿主細(xì)胞的多核苷酸生產(chǎn)缺陷的修飾。更特定地，可以通過引入與多核苷酸的核酸序列互補的核苷酸序列，來降低或消除宿主細(xì)胞對多核苷酸的表達(dá)，所述互補的核苷酸序列可在細(xì)胞中被轉(zhuǎn)錄，并且能夠與細(xì)胞中生產(chǎn)的mRNA雜交。在允許互補的反義核苷酸序列與mRNA雜交的條件下，藉此降低或消除了所翻譯的蛋白質(zhì)的量。表達(dá)反義-RNA的一個例子展不于Appl Environ Microbiol. 2000 Feb ；66 (2) :775-82 中(Characterization of a foldase, protein disulfide isomerase A, in the protein secretory pathway of Aspergillus niger. Ngiam C, Jeenes DJ, Punt PJ, Van Den Hondel CA, Archer DB) 或(Zrenner R, Willmitzer L, Sonnewald U. Analysis of the expression of potato uridinediphosphate-glucose pyrophosphorylase and its inhibition by antisense RNA. Planta. (1993) ；190(2) :247-52.)。另外，可以通過RNA 干擾(RNAi)技術(shù)(FEMS Microb. Lett. 237(2004) :317-324) 獲得基因的修飾、下調(diào)或失活。在所述方法中，要影響其表達(dá)的核苷酸序列的相同有義和反義部分被克隆在彼此之后，中間具有核苷酸間隔區(qū)(spacer)，并被插入表達(dá)載體中。轉(zhuǎn)錄此類分子后，小核苷酸片段的形成會導(dǎo)致要被影響的mRNA的靶向降解。特異性mRNA的消除可以達(dá)到多種程度?？梢允褂?TO2008/053019、TO2005/05672Al、TO2005/026356Al、01iveira et al. , “Efficient cloning system for construction of gene silencing vectors in Aspergillus niger，， (2008)Appl Microbiol and Biotechnol 80(5) 917-924and/or Barnes et al.,“siRNA as a molecular tool for use in Aspergillus niger” (2008) Biotechnology Letters 30(5) :885-890中描述的RNA干擾技術(shù)進(jìn)行基因的下調(diào)、修飾或失活。
修飾多核苷酸后，針對多核苷酸編碼的產(chǎn)物的缺乏，篩選獲得的菌株?？梢匀缦卤O(jiān)測多核苷酸表達(dá)水平的下調(diào)和/或上調(diào)例如通過Northern分析(Sambrook and Russell(2001)" Molecular Cloning A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.)定量細(xì)胞中存在的相應(yīng)mRNA的量，和/或例如通過western印跡或ELISA定量細(xì)胞中存在的相應(yīng)蛋白質(zhì)的量。也可以通過 DNA 陣列分析(Eisen, M. B. and Brown, P. 0. DNA arrays for analysis of gene expression. Methods EnzymoI. 1999 :303 179-205)定量 mRNA 量的差異。宿主細(xì)胞的缺陷在本文中定義為下述表型特征，其中與包含未經(jīng)修飾的多核苷酸的親本細(xì)胞相比，細(xì)胞生產(chǎn)更少的由經(jīng)修飾的多核苷酸編碼的產(chǎn)物，和/或具有降低的經(jīng)修飾的多核苷酸的表達(dá)水平(即降低的mRNA水平)，和/或具有降低的由經(jīng)修飾的多核苷酸編碼的產(chǎn)物的(蛋白質(zhì))比活性，和這些可能性的組合。根據(jù)本發(fā)明，基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域是在其天然狀態(tài)下包含能夠高水平表達(dá)的內(nèi)源基因的DNA結(jié)構(gòu)域或基因座(術(shù)語在本文中可互換使用)。術(shù)語“內(nèi)源”基因在本文中定義為所考慮的生物基因組中天然存在的基因拷貝。通常已知被整合的重組基因的表達(dá)水平可根據(jù)基因被整合的基因組基因座而大幅變化。使用高度表達(dá)的DNA結(jié)構(gòu)域來整合要表達(dá)的重組基因的優(yōu)點是，這些DNA結(jié)構(gòu)域至少能夠支持內(nèi)源基因的高水平表達(dá)。因此，很可能此類DNA結(jié)構(gòu)域還會支持北整合的重組基因的高水平表達(dá)。先前已經(jīng)確定，A. niger的glaA基因座中的整合和P. chrysogenum 的青霉素簇中的整合與一些其它基因組基因座中的整合相比提供了每個基因拷貝更高的表達(dá)水平(見W09846772)。在本文上下文中，應(yīng)當(dāng)理解能夠高水平表達(dá)的基因被定義為下述基因，所述基因以最大水平表達(dá)時生產(chǎn)的mRNA組成總mRNA種群的至少O. 1%、優(yōu)選地總 mRNA的至少O. 5%、最優(yōu)選地總mRNA的至少1%。此類可高度表達(dá)的內(nèi)源基因(含有它們的DNA結(jié)構(gòu)域特別適合作為根據(jù)本發(fā)明的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域)的例子是編碼糖酵解酶、淀粉分解酶、纖維素分解酶和/或抗生素生物合成酶的基因。進(jìn)一步更優(yōu)選的是下述基因座，所述基因座包含涉及工業(yè)方法并且已知以高水平表達(dá)的基因，例如葡糖淀粉酶基因、 TAKA淀粉酶基因、纖維二糖水解酶基因和青霉素生物合成基因。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞的至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域是glaA基因座或amyA基因座或amyB基因座或這些基因座的片段或同源物。更優(yōu)選的基因座是 Aspergillus的glaA、amyA和amyB基因座。進(jìn)一步更優(yōu)選的基因座是Aspergillus的glaA 和amyB基因座。進(jìn)一步更優(yōu)選的基因座是Aspergillus niger CBS 513. 88的glaA、amyBI 和amyBII基因座(基因命名如W02005/095624)。進(jìn)一步更優(yōu)選的基因座是glaA、amyBI 和amyBII基因座(glaA基因(An03g06550)的核苷酸序列及其基因組背景，a. ο.可源自 http://www. ncbi. nlm. nih. rov/ ;出處同 amyBI 基因序列(Anl2g06930)和 amyBII 基因序列(An05g02100))，或這些基因座的片段或同源物。就本發(fā)明的目的而言，術(shù)語“同源性”和“同一性”可互換使用。兩條核酸序列之間的同源性(同一性)程度在本文中優(yōu)選地通過BLAST程序測定。公眾可通過National Center for Biotechnology Information (http: //www. ncbi. nlm. nih. rov/)獲得用于進(jìn)行BLAST分析的軟件。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定了比對的靈敏度和速度。BLAST程序使用 11 的詞長(W)、BL0SUM62 評分矩陣(見 Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 89 :10915(1989))、50的排列(B)UO的預(yù)期(E)、M = 5、N = -4和兩條鏈均比較作為
默認(rèn)值。根據(jù)本發(fā)明，在不需要內(nèi)源基因表達(dá)的情況下，高度表達(dá)的內(nèi)源基因優(yōu)選地在根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞的每個拷貝的DNA結(jié)構(gòu)域中被失活。在此類情況下，內(nèi)源基因高水平表達(dá)的失活釋放能量和資源，所述能量和資源可被進(jìn)一步用于感興趣的多核苷酸的表達(dá)。 另外，在要通過感興趣的多核苷酸的整合生產(chǎn)想要的化合物并且內(nèi)源基因編碼的酶是分泌型酶的情況下，內(nèi)源酶的失活會導(dǎo)致想要的酶的更純制劑。優(yōu)選地，通過內(nèi)源基因的至少部分的不可逆缺失使內(nèi)源基因失活，從而排除失活的逆轉(zhuǎn)。更優(yōu)選地，內(nèi)源基因的失活受到不可逆缺失的影響，所述不可逆的缺失包含啟動子和上游活化序列的至少部分。在編碼(要通過重組DNA分子的整合來生產(chǎn)的)酶的想要的基因的表達(dá)由源自內(nèi)源基因的啟動子驅(qū)動的情況下這是特別有利的，因為這會消除對想要的基因表達(dá)所需的潛在限制性轉(zhuǎn)錄因子的競爭。感興趣的多核苷酸可以是任何多核苷酸。感興趣的多核苷酸可得自任何原核、真核或其它來源。優(yōu)選地，感興趣的多核苷酸和與之相關(guān)的啟動子對宿主細(xì)胞而言是同源的， 得到自我克隆的重組宿主細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，感興趣的多核苷酸可以是變體，包含經(jīng)優(yōu)化的終止子序列的經(jīng)優(yōu)化的多核苷酸，如例如W02006077258中所述。感興趣的多核苷酸可以是部分合成的多核苷酸，或是完全合成的核酸序列。感興趣的多核苷酸可以在其密碼子使用方面被優(yōu)化，優(yōu)選地根據(jù)W02006/077258和/或W02008/000632中所述的方法被優(yōu)化，所述參考文獻(xiàn)通過引用并入本文。W02008/000632著力于密碼子對優(yōu)化。密碼子對優(yōu)化是一種方法，其中編碼多肽的核苷酸序列在其密碼子使用、尤其是使用的密碼子對方面被修飾，以獲得編碼多肽的核苷酸序列經(jīng)改進(jìn)的表達(dá)和/或所編碼的多肽經(jīng)改進(jìn)的生產(chǎn)。密碼子對被定義為編碼序列中一組兩個連續(xù)的三聯(lián)體(密碼子)。因此，根據(jù)本發(fā)明，感興趣的多核苷酸優(yōu)選地是經(jīng)密碼子優(yōu)化的多核苷酸。多核苷酸優(yōu)選地包含編碼序列，并可包含在還包含啟動子和控制序列的核酸構(gòu)建體和/或載體中，以便于克隆、轉(zhuǎn)化、表達(dá)和/或生產(chǎn)由感興趣的多核苷酸編碼的化合物。“核酸構(gòu)建體”在本文中被定義為單鏈或雙鏈的核酸分子，其與天然存在的基因分離，或者已被修飾為含有下述核酸區(qū)段，所述核酸區(qū)段以天然不會存在的方式組合和并置。 當(dāng)核酸構(gòu)建體含有表達(dá)編碼序列所需的所有控制序列時，術(shù)語“核酸構(gòu)建體”與術(shù)語“表達(dá)盒”同義。術(shù)語“編碼序列”在本文中被定義為下述序列，所述序列被轉(zhuǎn)錄成mRNA并翻譯成多肽。編碼序列的界限通常由mRNA 5’-端的ATG起始密碼子和mRNA 3'-端終止開放讀碼框的翻譯終止密碼子序列決定。編碼序列可包括但不限于DNA、cDNA和重組核酸序列。術(shù)語“控制序列”在本文中被定義為包括對多肽的表達(dá)而言必需的或有利的所有組件。每種控制序列對編碼多肽的核酸序列而言可以是內(nèi)源的或外源的。此類控制序列可包括，但不限于前導(dǎo)序列、最適翻譯起始序列(如Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266 19867-19870中所述)、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、前肽原序列、啟動子、信號序列和轉(zhuǎn)錄終止子?？刂菩蛄兄辽侔▎幼右约稗D(zhuǎn)錄和翻譯終止信號?？梢詾榱艘胩囟ǖ南拗菩晕稽c而對控制序列提供連接子，所述特定的限制性位點有助于將控制序列與編碼多肽的核酸序列的編碼區(qū)連接。術(shù)語“可操作地連接”在本文
16中被定義為一種構(gòu)型，其中控制序列相對于DNA序列的編碼序列被置于適當(dāng)?shù)奈恢蒙?，使得控制序列指?dǎo)多肽的生產(chǎn)?？刂菩蛄锌梢允呛线m的啟動子序列，啟動子序列是被宿主細(xì)胞識別用于表達(dá)核酸序列的核酸序列。啟動子序列含有介導(dǎo)多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列。啟動子可以是在細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核酸序列，包括突變、截短和雜種的啟動子，并且可得自編碼對宿主細(xì)胞而言同源或異源的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因。啟動子也可以被理解為用于在轉(zhuǎn)錄成mRNA后翻譯的5'非編碼區(qū)(在啟動子和翻譯起點之間)，順式作用控制元件例如增強子，和能夠與轉(zhuǎn)錄因子相互作用的其它核苷酸序列。啟動子可以是與要表達(dá)的編碼序列天然相關(guān)的啟動子。啟動子也可以是對要表達(dá)的編碼序列而言外來的組成型或誘導(dǎo)型啟動子。在哺乳動物細(xì)胞中使用的合適啟動子的例子例如描述于上文Sambrook and Russell中。在酵母中使用的合適啟動子的例子包括例如糖酵解啟動子?？梢允褂玫膬?yōu)選的誘導(dǎo)型啟動子的例子是淀粉誘導(dǎo)型、銅誘導(dǎo)型、油酸誘導(dǎo)型啟動子。優(yōu)選地，啟動子選自下組，所述組包括但不限于得自編碼以下的基因的啟動子 A. oryzae TAKA淀粉酶，Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶，A. niger中性α -淀粉酶， A. niger酸穩(wěn)定α -淀粉酶，A. niger或A. awamori葡糖淀粉酶(glaA)，R. miehei脂肪酶， A. oryzae堿性蛋白酶，A. oryzae磷酸丙糖異構(gòu)酶，A. nidulans乙酰胺酶，NA2_tpi啟動子 (來自編碼A. niger中性α -淀粉酶和A. oryzae磷酸丙糖異構(gòu)酶的基因啟動子的雜種， W003/008575)，其突變體、截短的和雜種的啟動子。在絲狀真菌細(xì)胞中使用的特別優(yōu)選的啟動子是來自蛋白酶基因的啟動子或其功能部分；例如來自F. oxysporum胰蛋白酶樣蛋白酶基因(U. S. 4, 288, 627) ,K. oryzae 喊性蛋白酶基因(alp) ,K. niger pacA 基因，A. oryzae 喊性蛋白酶基因，A. oryzae中性金屬蛋白酶基因,A. niger曲霉胃蛋白酶(aspergillopepsin protease) pepA基因，或F. venenatum胰蛋白酶基因，A. niger天冬氨酸蛋白酶pepB基因。單個合適的啟動子序列可以被用作用于表達(dá)感興趣的多核苷酸的控制序列，或多個不同的啟動子序列可以被用作用于表達(dá)感興趣的多核苷酸的控制序列。如果使用多個不同的啟動子序列，則優(yōu)選地至少兩個不同的啟動子序列各自與感興趣的多核苷酸可操作地連接，見 W02008/098933?？刂菩蛄幸部梢允呛线m的轉(zhuǎn)錄終止子序列，這是被絲狀真菌細(xì)胞識別為終止轉(zhuǎn)錄的序列。終止子序列與編碼多肽的核酸序列的3'-端可操作地連接。本發(fā)明中可以使用在細(xì)胞中發(fā)揮功能的任何終止子。對絲狀真菌細(xì)胞而言優(yōu)選的終止子得自編碼以下的基因A. oryzae TAKA淀粉酶、 A. niger葡糖淀粉酶(glaA)、A. nidulans鄰氨基苯甲酸合酶、A. niger α -葡糖苷酶、trpC 基因和Fusarium oxysporum膜蛋白酶樣蛋白酶?？刂菩蛄幸部梢允呛线m的前導(dǎo)序列，對絲狀真菌細(xì)胞翻譯而言重要的mRNA的非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列與編碼多肽的核酸序列的5'端可操作地連接。本發(fā)明中可以使用在細(xì)胞中有功能的任何前導(dǎo)序列。用于絲狀真菌細(xì)胞的優(yōu)選的前導(dǎo)序列得自編碼A. oryzae TAKA淀粉酶和A. nidulans磷酸丙糖異構(gòu)酶和A. niger glaA的基因。其它控制序列可分離自Penicillium IPNS基因，或pcbC基因看，β微管蛋白基因。WO 01/21779中引用的所有控制序列被考慮用于本發(fā)明中。控制序列也可以是多聚腺苷酸化序列，這是與核酸序列3'-端可操作地連接的序列，其轉(zhuǎn)錄后被絲狀真菌細(xì)胞識別為對所轉(zhuǎn)錄的mRNA添加多聚腺苷殘基的信號。本發(fā)明中可以使用在細(xì)胞中有功能的任何多聚腺苷酸化序列。對絲狀真菌細(xì)胞而言優(yōu)選的多聚腺苷酸化序列得自編碼以下的基因A. oryzae TAKA淀粉酶、A. niger葡糖淀粉酶、A. nidulans鄰氨基苯甲酸合酶、Fusarium oxysporum膜蛋白酶樣蛋白酶和A. niger α -葡糖苷酶。優(yōu)選地，DNA構(gòu)建體包含編碼感興趣的化合物的感興趣的多核苷酸，如上文所述的啟動子DNA序列，和優(yōu)選的控制序列例如-一個選自以下序列列表的由5’朝向3’方向的翻譯終止序列TAAG、TAGA和 TAAA，優(yōu)選地TAAA，和/或-一個選自以下序列列表的由5’朝向3’方向的翻譯起始子編碼序列GCTACCCCC ； GCTACCTCC ；GCTACCCTC ；GCTACCTTC ；GCTCCCCCC ；GCTCCCTCC ；GCTCCCCTC ；GCTCCCTTC ； GCTGCCCCC ；GCTGCCTCC ；GCTGCCCTC ；GCTGCCTTC ；GCTTCCCCC ；GCTTCCTCC ；GCTTCCCTC ；和 GCTTCCTTC,優(yōu)選地 GCT TCC TTC，和 / 或-選自以下序列列表的翻譯起始子序列5’-mwChkyCAAA-3’ ；5’ -mwChkyCACA_3’ 或 5’ -mwChkyCAAG-3’，使用核苷酸的模糊編碼m(A/C) ；w(A/T) ；y(C/T) ；k(G/T) ；h(A/C/ T)，優(yōu)選地 5’ -CACCGTCAAA-3’ 或 5’ -CGCAGTCAAG-3 ’。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“翻譯起始子編碼序列”被定義為DNA編碼序列開放讀碼框起始子或起始密碼子緊下游的9個核苷酸。起始子或起始密碼子編碼AA甲硫氨酸。起始密碼子典型地為ATG，但是也可以是任何功能性起始密碼子如GTG。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“翻譯終止序列”被定義為從開放讀碼框或核苷酸編碼序列3’端的翻譯終止密碼子開始并按5’到3’方向的四個核苷酸。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“翻譯起始子序列”被定義為編碼多肽的DNA序列開放讀碼框的起始子或起始密碼子緊上游的十個核苷酸。起始子或起始密碼子編碼AA甲硫氨酸。起始密碼子典型地為ATG，但是也可以是任何功能性起始密碼子如GTG。本領(lǐng)域公知在 RNA中尿嘧啶U代替脫氧核苷酸胸腺嘧啶T。編碼感興趣的化合物的感興趣的多核苷酸，或包含感興趣的多核苷酸和上文所述控制序列的DNA構(gòu)建體可結(jié)合在一起，以生產(chǎn)下述重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體可包含一個或多個便利的限制性位點，以允許插入或取代任選的多核苷酸序列?；蛘撸梢酝ㄟ^將包含感興趣的多核苷酸的序列或核酸構(gòu)建體插入用于表達(dá)的適當(dāng)載體中，來表達(dá)感興趣的多核苷酸。創(chuàng)建表達(dá)載體時，編碼序列位于載體中，使得編碼序列與用于表達(dá)的適當(dāng)控制序列可操作地連接，并可能分泌。重組表達(dá)載體可以是任何載體(例如質(zhì)粒或病毒)，可對其便利地進(jìn)行重組DNA程序，并且可導(dǎo)致感興趣的多核苷酸的表達(dá)。載體的選擇典型地應(yīng)取決于載體與引入所述載體的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線性或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體，即作為染色體外實體存在的載體，其復(fù)制獨立于染色體復(fù)制，例如質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體、或人工染色體。自主維持的克隆載體可包含AMAl-序列(見例如Aleksenko and Clutterbuck(1997)，F(xiàn)ungal Genet. Biol. 21 :373-397)?；蛘?，載體可以是在引入宿主細(xì)胞后被整合進(jìn)基因組中并與整合了所述載體的染色體一起復(fù)制的載體。優(yōu)選地，整合型克隆載體包含與宿主細(xì)胞基因組中預(yù)定的靶基因座中的DNA序列同源的DNA片段，從而將克隆載體整合至該預(yù)定的基因座。為了促進(jìn)定向整合，在轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞之前優(yōu)選地將克隆載體線性化。優(yōu)選地以下述方式進(jìn)行線性化，所述方式使得克隆載體的至少一端，優(yōu)選地任一端的側(cè)翼是與靶基因座同源的序列。靶基因座側(cè)翼的同源序列的長度優(yōu)選地至少為30bp，優(yōu)選地至少為50bp，優(yōu)選地至少為O. lkb，進(jìn)一步優(yōu)選地至少為O. 2kb,更優(yōu)選地至少為O. 5kb,進(jìn)一步更優(yōu)選地至少為Ikb,最優(yōu)選地至少 2kb。載體系統(tǒng)可以是單個載體或質(zhì)粒，或兩個或更多的載體或質(zhì)粒，它們一起含有要被引入絲狀真菌細(xì)胞基因組中的總DNA，或是轉(zhuǎn)座子。載體優(yōu)選地含有一個或多個可選擇標(biāo)記物，所述可選擇標(biāo)記物允許容易地選擇被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。使用共轉(zhuǎn)化(co-transformation)方法時,一種載體可含有可選擇標(biāo)記物,而另一種載體可含有感興趣的多核苷酸或感興趣的核酸構(gòu)建體；載體被同時用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞具有共轉(zhuǎn)化效率非常高、高達(dá)100%的能力(見實施例12. 2)?？蛇x擇標(biāo)記物是這樣的基因，其產(chǎn)物提供殺生物性或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的自養(yǎng)型等等。絲狀真菌宿主細(xì)胞中使用的可選擇標(biāo)記物可選自下組， 所述組包括但不限于amdS(乙酰胺酶)，argB(鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶)，bar(膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶)，bleA(腐草霉素結(jié)合)，hygB (潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)，niaD (硝酸還原酶)， PyrG (乳清酸核苷-5 '-磷酸脫羧酶)，sC (硫酸腺嘌呤基轉(zhuǎn)移酶)和trpC (鄰氨基苯甲酸合酶)，以及來自其它物種的等同物。優(yōu)選用于Aspergillus和Penicillium細(xì)胞中的是 A. nidulans 或 A. oryzae 的 amdS(EP 635574B1, WO 97/06261)和 pyrG 基因，和 Streptomyces hygroscopicus的bar基因。更優(yōu)選地使用amdS基因，進(jìn)一步更優(yōu)選地使用來自A. nidulans或A. niger的amdS基因。最優(yōu)選的選擇標(biāo)記物基因是與A. nidulans gpdA啟動子融合的A. nidulans amdS編碼序列(見EP 635574B1)。也可以使用來自其它絲狀真菌的AmdS基因(W0 97/06261)。用于連接上文所述元件從而構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的程序是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(見例如 Sambrook and Russell, supra ；and Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, Wiley InterScience, NY,1995)。優(yōu)選地，除了經(jīng)改造的DNA結(jié)構(gòu)域和任選地提高的靶向整合效率以外，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞包含選自下組的多核苷酸glaA、amyA、amyBI、amyBII、oahA、毒素相關(guān)的多核苷酸(toxin associated polynucleotide)和prtT,所述多核苷酸包含修飾,其中在可比較的條件下培養(yǎng)時，與其來源的親本細(xì)胞相比，宿主細(xì)胞缺乏包含修飾的多核苷酸所編碼的產(chǎn)物。修飾如前文所定義。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞額外地包含Sec61的修飾。宿主細(xì)胞的缺陷型 (Deficiency)在本文中如前文被定義為表型特征，其中細(xì)胞與包含未經(jīng)修飾的多核苷酸的親本細(xì)胞相比，生產(chǎn)更少的經(jīng)修飾的多核苷酸所編碼的產(chǎn)物和/或具有降低的經(jīng)修飾的多核苷酸的表達(dá)水平(即降低的mRNA水平)和/或具有降低的經(jīng)修飾的多核苷酸所編碼的產(chǎn)物的(蛋白質(zhì))比活性，或這些特征的組合。優(yōu)選地,根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞顯示glaA、amyA、amyBI、amyBI I > oahA、毒素相關(guān)多核苷酸或prtT中至少一種的至少5%的缺乏,更優(yōu)選地至少10%的缺乏,更優(yōu)選地至少 20%的缺乏，更優(yōu)選地至少30%的缺乏，更優(yōu)選地至少40%的缺乏，更優(yōu)選地至少50%的缺乏，更優(yōu)選地至少60 %的缺乏，更優(yōu)選地至少70 %的缺乏，更優(yōu)選地至少80 %的缺乏，更優(yōu)選地至少90%的缺乏，更優(yōu)選地至少95%的缺乏，更優(yōu)選地至少97%的缺乏，更優(yōu)選地至少99%的缺乏。更優(yōu)選地，宿主細(xì)胞顯不glaA、amyA、amyBI、amyBI I > oahA、毒素相關(guān)多核苷酸或prtT中至少一種的100%的缺乏。在感興趣的化合物的生產(chǎn)中缺乏選自葡糖淀粉酶(glaA)、酸穩(wěn)定α-淀粉酶 (amyA)、中性α -淀粉酶(amyBI和amyBII)和草酸水解酶(oahA)組的一種或多種多肽的優(yōu)點是，這些副產(chǎn)物不利用能量和資源。所述能量和資源可以被用于感興趣的多核苷酸所編碼的化合物的生產(chǎn)。另外，因為存在更少的副產(chǎn)物，所以感興趣的化合物的下游加工被簡化。草酸水解酶(oahA)是許多宿主細(xì)胞中合成途徑的組件。oahA缺陷型宿主細(xì)胞會缺乏草酸。草酸是許多應(yīng)用例如食物應(yīng)用中不想要的副產(chǎn)物。另外，草酸降低生產(chǎn)所述組件的宿主細(xì)胞培養(yǎng)基的pH，導(dǎo)致被降低的產(chǎn)量；即在缺乏草酸的宿主細(xì)胞中產(chǎn)率被提高。因此，如果根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞缺乏oahA則是有利的。OahA缺陷型宿主細(xì)胞和生產(chǎn)所述細(xì)胞的優(yōu)選方法詳盡描述于WO 2000/50576和W02004/070022中。生產(chǎn)oahA缺陷型宿主細(xì)胞的一種優(yōu)選的方法是WO 2000/50576中描述的打斷的重組方法。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞缺乏oahA。優(yōu)選地，oahA是真菌oahA。更優(yōu)選地，oahA是來自Aspergillus的 oahA。進(jìn)一步更優(yōu)選地，oahA是來自Aspergillus niger的oahA。進(jìn)一步更優(yōu)選地，oahA 是來自 Aspergillus niger CBS 513. 88 的 oahA。最優(yōu)選地，oahA 包含 Anl0g00820 的序列。prtT是真核細(xì)胞中蛋白酶的轉(zhuǎn)錄激活因子(transcriptional activator)。若干真菌蛋白酶轉(zhuǎn)錄激活因子最近描述于WO 00/20596、WO 01/68864、WO 2006/040312和WO 2007/062936 中。這些轉(zhuǎn)錄激活因子分離自 Aspergillus niger (A. niger) > Aspergillus fumigatus (A. fumigatus)、Penicillium chrysogenum (P. chrysogenum)和 Aspergillus oryzae (A. oryzae)。這些蛋白酶基因轉(zhuǎn)錄激活因子可被用于改進(jìn)在真菌細(xì)胞中生產(chǎn)多肽的方法，其中所述多肽對蛋白酶降解敏感。宿主細(xì)胞缺乏PrtT時，宿主細(xì)胞會生產(chǎn)更少的處于prtT轉(zhuǎn)錄控制下的蛋白酶。因此，當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞缺乏prtT時是有利的。prtT 缺陷型宿主和生產(chǎn)這些宿主的優(yōu)選的方法詳盡描述于WO 01/68864、WO 2006/040312中。 WO 01/68864和WO 2006/040312描述了打斷prtT編碼序列的重組方法和經(jīng)典方法。W 2007/062936描述了打斷蛋白酶啟動子中的prtT結(jié)合位點。結(jié)合位點的打斷阻斷了 prtT 與結(jié)合位點的結(jié)合。結(jié)果，蛋白酶的轉(zhuǎn)錄不被PrtT激活，并且生產(chǎn)更少蛋白酶。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞包含編碼prtT的多核苷酸，所述多核苷酸包含修飾，其中在可比較的條件下培養(yǎng)時，所述宿主細(xì)胞與其來源的親本細(xì)胞相比缺乏PrtT生產(chǎn)。優(yōu)選地，prtT是真菌prtT。更優(yōu)選地,prtT是來自Aspergillus的prtT。進(jìn)一步更優(yōu)選地,prtT是來自Aspergillus niger的prtT。進(jìn)一步更優(yōu)選地,prtT是來自Aspergillus niger CBS 513. 88 的 prtT。最優(yōu)選地，prtT 包含 An04g06940 的序列。
術(shù)語“葡糖淀粉酶”(glaA)與術(shù)語“淀粉葡萄糖苷酶(amyloglucosidas) ”相同， 并且在本文中被定義為具有糊精6-a-D-葡聚糖水解酶活性的酶，其催化1，4_連接的 a -D-葡萄糖殘基和末端1，4-連接的0 -D-葡萄糖殘基鏈中分支點處I，6-a -D-葡糖苷鍵的內(nèi)切水解?？梢酝ㄟ^測定來自底物對-硝基苯基-a-D-卩比喃葡萄糖苷(Sigma)的對硝基苯酚釋放，來測量以AGIU/ml為單位的葡糖淀粉酶活性。這產(chǎn)生黃色，其吸光度可使用分光光度計在405nm處測量。IAGIU是酶的量，其在pH 4. 3和60°C下每分種從可溶的淀粉底物生產(chǎn)Iymole的葡萄糖。在W098/46772中可以找到測定法的其它細(xì)節(jié)。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞包含編碼glaA的多核苷酸，所述多核苷酸包含修飾，其中在可比較的條件下培養(yǎng)時，所述宿主細(xì)胞與其來源的親本細(xì)胞相比缺乏glaA生產(chǎn)。優(yōu)選地，glaA是真菌glaA。更優(yōu)選地,glaA是來自Aspergillus的glaA。進(jìn)一步更優(yōu)選地，glaA是來自Aspergillus niger的glaA。進(jìn)一步更優(yōu)選地,prtT是來自Aspergillus niger CBS 513. 88 的 glaA。最優(yōu)選地，glaA 包含 An03g06550 的序列。術(shù)語“ α -淀粉酶”在本文中被定義為1，4-α -D-葡聚糖葡聚糖水解酶活性，其在存在水時催化具有三個或更多個α-1，4-連接的葡萄糖單元的多糖內(nèi)切水解成麥芽寡糖 (malto-oligosaccharides)。為了測定(中性)α -淀粉酶活性,根據(jù)供應(yīng)商的流程使用 Megazyme谷物α -淀粉酶試劑盒(Megazyme, CERALPHA α -淀粉酶測定試劑盒，產(chǎn)品目錄號K-CERA，2000-2001年)。所測量的活性以pH 7. O下存在過量葡糖淀粉酶和α -葡糖苷酶時非還原性端基封閉的對硝基苯基麥芽庚糖苷(maltoheptaoside)的水解為基礎(chǔ)。形成的對硝基苯酚的量是樣品中存在的α-淀粉酶活性的度量。術(shù)語“酸穩(wěn)定的α -淀粉酶”(amyA)在本文中被定義為在酸性pH范圍內(nèi)具有最適活性的具有α-淀粉酶活性的酶。為了測定酸穩(wěn)定的α-淀粉酶活性，也根據(jù)制造商的流程使用Megazyme谷物α -淀粉酶試劑盒(Megazyme, CERALPHA α -淀粉酶測定試劑盒,產(chǎn)品目錄號K-CERA，2000-2001年)，但是在酸性pH下進(jìn)行。所測量的活性以pH 4. 5下存在過量葡糖淀粉酶和α-葡糖苷酶時非還原性端基封閉的對硝基苯基麥芽庚糖苷的水解為基礎(chǔ)。形成的對硝基苯酚的量是樣品中存在的酸穩(wěn)定α-淀粉酶活性的度量。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞包含編碼AmyA的多核苷酸，所述多核苷酸包含修飾，其中在可比較的條件下培養(yǎng)時，所述宿主細(xì)胞與其來源的親本細(xì)胞相比缺乏amyA。優(yōu)選地，amyA是真菌amyA。更優(yōu)選地，amyA是來自Aspergillus的amyA。進(jìn)一步更優(yōu)選地, amyA是來自 Aspergillus niger 的 amyA。進(jìn)一步更優(yōu)選地，amyA是來自 Aspergillus niger CBS 513. 88的amyA ο最優(yōu)選地，amyA包含Anllg03340的序列。術(shù)語“中性α-淀粉酶活性”(amy)在本文中被定義為在中性pH范圍內(nèi)具有最適活性的、具有α-淀粉酶活性的酶。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞包含編碼AmyB的多核苷酸，所述多核苷酸包含修飾，其中在可比較的條件下培養(yǎng)時，所述宿主細(xì)胞與其來源的親本細(xì)胞相比缺乏amyBI和/ 或amyBII。更優(yōu)選地,宿主細(xì)胞缺乏amyBI和amy BII。優(yōu)選地,amyB是真菌amyB。更優(yōu)選地，amyB 是來自 Aspergillus 的 amyB。進(jìn)一步更優(yōu)選地，amyB 是來自 Aspergillus niger 的 amyBI。進(jìn)一步更優(yōu)選地,amyB 是來自 Aspergillus niger CBS 513. 88 的 amyBI。最優(yōu)選地，amyBI包含Anl2g06930的序列。進(jìn)一步更優(yōu)選地，amyB是來自Aspergillus niger 的 amyBII。進(jìn)一步更優(yōu)選地,amyB 是來自 Aspergillus niger CBS 513. 88 的 amyBII。最優(yōu)選地，amyBII包含An05g02100的序列。術(shù)語毒素相關(guān)的多核苷酸在本文中定義為下述基因簇、基因群、基因或其部分，其編碼負(fù)責(zé)至少一種毒素或毒素中間產(chǎn)物化合物的生物合成或分泌的化合物或生物化學(xué)途徑。所述化合物可例如是多肽，所述多肽可以是酶。在感興趣的多肽生產(chǎn)中被用作宿主細(xì)胞的多種宿主細(xì)胞，尤其是真菌，具有編碼涉及多種毒素生物合成的酶的基因。例如，環(huán)并偶氮酸(cyclopiazonic acid)、曲酸、 3-硝基丙酸和黃曲霉毒素是已知的毒素,它們在例如Aspergillus flavus中形成。類似地，單端抱霉烯(trichothecenes)在大量真菌例如 Fusarium sp.如 Fusarium venenatum 和Trichoderma中形成，赫曲霉毒素(ochratoxin)可由Aspergillus生產(chǎn)。最近，工業(yè) Aspergillus niger宿主菌株基因組的測序揭示了煙曲霉毒素(fumonisin)基因簇(Pel et al·, “Genome sequencing and analysis of the versatile cell factory Aspergillus niger CBS 513. 88”. Nat Biotechnol. 2007 Feb ；25(2) :221-231)。感興趣的化合物發(fā)酵期間此類毒素的形成是高度不想要的，因為這些毒素可代表對操作者、消費者和環(huán)境的健康危害(health hazard)。因此，缺乏毒素的宿主細(xì)胞使得能夠無毒素地生產(chǎn)感興趣的化合物。無毒素的化合物更容易生產(chǎn)，因為不用從產(chǎn)物中去除毒素。另外，化合物的監(jiān)管批準(zhǔn) (regulatory approval)更容易。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞包含編碼化合物(其可例如是多肽，所述多肽可以是酶)或生物化學(xué)途徑的毒素相關(guān)多核苷酸，所述毒素相關(guān)多核苷酸包含修飾，其中在可比較的條件下培養(yǎng)時，所述宿主細(xì)胞與其來源的親本細(xì)胞相比缺乏所述毒素或毒素中間產(chǎn)物化合物的生產(chǎn)。優(yōu)選地，毒素或毒素中間產(chǎn)物化合物是真菌毒素或毒素中間產(chǎn)物化合物。更優(yōu)選地，毒素或毒素中間產(chǎn)物化合物是來自Aspergillus的毒素或毒素中間產(chǎn)物化合物。進(jìn)一步更優(yōu)選地，毒素或毒素中間產(chǎn)物化合物是來自Aspergillus niger的毒素或毒素中間產(chǎn)物化合物。進(jìn)一步更優(yōu)選地，毒素或毒素中間產(chǎn)物化合物是來自Aspergillus niger CBS 513. 88的毒素或毒素中間產(chǎn)物化合物。進(jìn)一步更優(yōu)選地，毒素或毒素中間產(chǎn)物化合物是煙曲霉毒素或煙曲霉毒素中間產(chǎn)物化合物。進(jìn)一步更優(yōu)選地，毒素或毒素中間產(chǎn)物化合物是赭曲霉毒素或赭曲霉毒素中間產(chǎn)物化合物。最優(yōu)選地，毒素或毒素中間產(chǎn)物化合物是赭曲霉毒素或煙曲霉毒素或赭曲霉毒素或煙曲霉毒素中間產(chǎn)物化合物。優(yōu)選地，毒素相關(guān)多核苷酸編碼涉及真菌毒素或毒素中間產(chǎn)物化合物生產(chǎn)的化合物(其可以例如是多肽，所述多肽可以是酶)或生物化學(xué)途徑。更優(yōu)選地，毒素或毒素中間產(chǎn)物化合物來自Aspergillus。進(jìn)一步更優(yōu)選地，毒素或毒素中間產(chǎn)物化合物來自Aspergillus niger。進(jìn)一步更優(yōu)選地,毒素或毒素中間產(chǎn)物化合物來自Aspergillus niger CBS 513.88。進(jìn)一步更優(yōu)選地，煙曲霉毒素或煙曲霉毒素中間產(chǎn)物化合物。進(jìn)一步更優(yōu)選地，煙曲霉毒素-B或煙曲霉毒素-B中間產(chǎn)物化合物。進(jìn)一步更優(yōu)選地，煙曲霉毒素-B2或煙曲霉毒素-B2中間產(chǎn)物化合物。進(jìn)一步更優(yōu)選地，毒素相關(guān)多核苷酸包含來自An01g06820到An01g06930的煙曲霉毒素簇的序列。最優(yōu)選地，毒素相關(guān)多核苷酸包含 An01g06930 的序列。在另一個優(yōu)選的實施方案中，毒素相關(guān)多核苷酸編碼涉及赭曲霉毒素或赭曲霉毒素中間產(chǎn)物化合物的化合物(其可以是例如多肽，所述多肽可以是酶)或生物化學(xué)途徑。更優(yōu)選地，赭曲霉毒素A或赭曲霉毒素A中間產(chǎn)物化合物。最優(yōu)選地，毒素相關(guān)多核苷酸包含來自Anl5g07880到Anl5g07930的簇的序列。最優(yōu)選地，毒素相關(guān)多核苷酸包含Anl5g07910 的序列和/或Anl5g07920的序列。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞包含至少一種編碼化合物(其可以是例如多肽， 所述多肽可以是酶)或生物化學(xué)途徑的毒素相關(guān)多核苷酸，所述毒素相關(guān)多核苷酸包含至少一種修飾，其中在可比較的條件下培養(yǎng)時，所述宿主細(xì)胞與其來源的親本細(xì)胞相比缺乏毒素或毒素中間產(chǎn)物化合物的生產(chǎn)。更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞包含兩種毒素相關(guān)多核苷酸，所述兩種毒素相關(guān)多核苷酸各自包含至少一種修飾，其中在可比較的條件下培養(yǎng)時，所述宿主細(xì)胞與其來源的親本細(xì)胞相比優(yōu)選地缺乏煙曲霉毒素和赭曲霉毒素的生產(chǎn)。進(jìn)一步更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞包含三種或更多毒素相關(guān)多核苷酸，所述三種或更多毒素相關(guān)多核苷酸各自包含至少一種修飾，其中在可比較的條件下培養(yǎng)時， 所述宿主細(xì)胞與其來源的親本細(xì)胞相比優(yōu)選地缺乏煙曲霉毒素、赭曲霉毒素和至少一種額外的毒素或毒素中間產(chǎn)物化合物的生產(chǎn)。優(yōu)選地,根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞缺乏glaA和至少一種選自amyA、amyBI > amyBI I > oahA、毒素相關(guān)化合物和prtT的組件，所述缺乏通過在編碼glaA和所述組件的多核苷酸中具有修飾來實現(xiàn)。更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞缺乏glaA、oahA和至少一種選自amyA、 amyBI> amyBII、毒素相關(guān)化合物和prtT的組件。進(jìn)一步更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞缺乏glaA、oahA、毒素相關(guān)化合物和至少一種選自amyA、amyB I、amyB II和prtT的組件。進(jìn)一步更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞缺乏glaA、oahA、amyA、amyBI、amyBII和至少一種選自毒素相關(guān)化合物和prtT的組件。進(jìn)一步更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞缺乏glaA、oahA、 amyA、amyBI、amyBII、prtT和毒素相關(guān)化合物。最優(yōu)選地,根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞(其包含適用于整合一個或多個拷貝感興趣的多核苷酸的至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域，其中所述至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域中的至少一個被改造為與其來源的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域相比對感興趣的多核苷酸具有增強的整合偏好)缺乏glaA、oahA、amyA、amyBI、amyBII、 prtT和毒素相關(guān)化合物，并且還缺乏NHR組件，優(yōu)選地ku70或其同源物。除了上述組件的缺乏或修飾以外，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞可缺乏其它組件，例如主要蛋白酶如pepA。優(yōu)選地，pepA是真菌pepA。更優(yōu)選地，pepA是來自Aspergillus的 pepA。進(jìn)一步更優(yōu)選地，pepA是來自Aspergillus niger的pepA。進(jìn)一步更優(yōu)選地，pepA 是來自 Aspergillus niger CBS 513. 88 的 pepA。最優(yōu)選地,pepA包含 Anl4g04710 的序列。 優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞顯示至少5%的P印A缺乏，更優(yōu)選地至少10%的缺乏，更優(yōu)選地至少20 %的缺乏，更優(yōu)選地至少30 %的缺乏，更優(yōu)選地至少40 %的缺乏，更優(yōu)選地至少50 %的缺乏，更優(yōu)選地至少60 %的缺乏，更優(yōu)選地至少70 %的缺乏，更優(yōu)選地至少80 % 的缺乏，更優(yōu)選地至少90 %的缺乏，更優(yōu)選地至少95 %的缺乏，更優(yōu)選地至少97 %的缺乏， 更優(yōu)選地至少99%的缺乏。最優(yōu)選地，宿主細(xì)胞顯示100%的pepA缺乏。或者，或與上文所述的缺乏組合，宿主細(xì)胞包含與野生型細(xì)胞相比提高的解折疊蛋白應(yīng)答(UPR)，以增強感興趣的多肽的生產(chǎn)能力?？梢酝ㄟ^US2004/0186070A1和/或 US2001/0034045A1 和 / 或 W001/72783A2 和 / 或 W02005/123763 中描述的技術(shù)提高 UPR。 更特定地，為了獲得具有提高的UPR的宿主細(xì)胞，調(diào)控了 HACl和/或IREl和/或PTC2的蛋白質(zhì)水平，和/或改造了 SEC61蛋白質(zhì)。一種優(yōu)選的SEC61修飾是導(dǎo)致SEC61單向突變
23體(one-way mutant)的修飾；即其中從頭合成的蛋白質(zhì)可以通過SEC61進(jìn)入ER但是蛋白質(zhì)不能通過SEC61離開ER的突變體。此類修飾詳盡描述于W02005/123763中。最優(yōu)選地， SEC61修飾是S376W突變，其中絲氨酸376被置換為色氨酸。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選的宿主細(xì)胞是用于生產(chǎn)感興趣的化合物的重組 Aspergillus niger重組宿主細(xì)胞,所述宿主細(xì)胞包含適用于整合一個或多個拷貝感興趣的多核苷酸的至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域，其中所述至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域中的至少一個被改造為與其來源的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域相比對感興趣的多核苷酸具有增強的整合偏好，并且其中所述經(jīng)改造的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域所來源的基本同源的DNA 結(jié)構(gòu)域具有比所述至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域中的另一個至少高出10%的基因轉(zhuǎn)變頻率，其中經(jīng)改造的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域與其它版本的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域通過獨特的序列標(biāo)簽區(qū)分，其中經(jīng)改造的基本同源的DNA包含靶向DNA結(jié)構(gòu)域，其中所述靶向DNA結(jié)構(gòu)域包含具有增強的整合偏好的序列，并且所述宿主細(xì)胞缺乏glaA、pepA、hdfA、amyBII、 amyBI、amyA、oahA、fumB、och。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞具有sec61 S376W突變，即其中S376W 突變中絲氨酸376被置換為色氨酸。更優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞額外地缺乏prtT。此類宿主細(xì)胞描述于實施例9、10和11中。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞是無選擇標(biāo)記物的宿主細(xì)胞。這種情況可以通過針對雙向顯性選擇標(biāo)記物(bidirectional dominant selection marker)例如來自Aspergillus nidulans的乙酸胺酶基因(amdS)進(jìn)行反選擇 (counter-selection)來獲得。所述標(biāo)記物可被用于通過使用乙酰胺作為惟一碳源和/或氮源進(jìn)行選擇來選擇轉(zhuǎn)化體，而反選擇(在下文保留用于選擇標(biāo)記物基因不存在的術(shù)語) 可以例如使用氟乙酰胺進(jìn)行。在特定的宿主細(xì)胞中可以使用的其它雙向顯性選擇標(biāo)記物可以通過類似方式使用。通過將側(cè)翼是直接重復(fù)的基因插入進(jìn)入質(zhì)粒中，簡化了雙向標(biāo)記物基因的重組排除(out-recombination)。如歐洲專利EP0635574B1中所公開的，amdS雙向標(biāo)記物在兩個方向上均是顯性的，表示可以針對標(biāo)記物的存在(使用乙酰胺作為惟一碳源和/或惟一氮源)選擇具有任何遺傳背景的經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。其它雙向標(biāo)記物是URA3、LYS2、pyrG、facA等等。無標(biāo)記物的細(xì)胞的使用更容易被監(jiān)管機(jī)構(gòu)接受，同時在工業(yè)發(fā)酵條件下對酵母的能量平衡給予更少的負(fù)擔(dān)。根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是任何宿主細(xì)胞。對根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞中生產(chǎn)的化合物的特定用途而言，可以根據(jù)此類用途進(jìn)行宿主細(xì)胞的選擇。例如在根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞中生產(chǎn)的化合物要在食品應(yīng)用中使用時，可從食品級生物例如Saccharomyces cerevisiae中選擇宿主細(xì)胞。特定的用途包括，但不限于食物，(動物)飼料，藥物，農(nóng)業(yè)如作物保護(hù)，和/或個人護(hù)理應(yīng)用。根據(jù)一個實施方案，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞是真核宿主細(xì)胞。優(yōu)選地,真核細(xì)胞是哺乳動物、昆蟲、植物、真菌或藻類細(xì)胞。優(yōu)選的哺乳動物細(xì)胞包括例如中國倉鼠卵巢(CHO) 細(xì)胞、COS細(xì)胞、293細(xì)胞、PerC6細(xì)胞和雜交瘤。優(yōu)選的昆蟲細(xì)胞包括例如Sf9和Sf21細(xì)胞及其衍生物。更優(yōu)選地，真核細(xì)胞是真菌細(xì)胞，即酵母細(xì)胞，例如Candida、Hansenula、 Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、Schizosaccharomyces 或 Yarrowia 菌株。 更優(yōu)選的來自 Kluyveromyces lactis、S. cerevisiae> Hansenula polymorpha、YarrowiaIipolytica和Pichia pastoris，或絲狀真菌細(xì)胞。最優(yōu)選地，真核細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞?！敖z狀真菌”包括(如 Hawksworth et al.，In，Ainsworth and Bisby 丨 s Dictionary of The Fungi,8th edition，1995，CAB International, University Press, Cambridge, UK所定義的)Eumycota和Oomycota亞門的所有絲狀形式。絲狀真菌的特征是由甲殼質(zhì)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖和其它復(fù)合多糖組成的菌絲壁。營養(yǎng)生長通過菌絲伸長進(jìn)行，并且碳代謝是專性需氧的。絲狀真菌菌株包括但不限于 Acremonium、Agaricus、Aspergillus、Aureobasidium、Chrysosporium、Coprinus、 Cryptococcus、Fi Iibasidium、Fusarium、Humicola、Magnaporthe、Mucor、MyceIiophthora、 Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Piromyces、Panerochaete、 Pleurotus、Schizophyllum、Talaromyces、Thermoascus、Thielavia、Tolypocladium 和 Trichoderma 的菌株。優(yōu)選的絲狀真菌細(xì)胞屬于Aspergillus、Chrysosporium、Penicillium、 Talaromyces、Fusarium 或 Trichoderma 屬的種，最優(yōu)選地屬于 Aspergillus niger、 Aspergillus awamori、Aspergillus foetidus、Aspergillus sojae、Aspergillus fumigatus、Talaromyces emersonii、Aspergillus oryzae、Chrysosporium lucknowense、 Fusarium oxysporum、Trichoderma reesei、或Penicillium chrysogenum 的種。一種更優(yōu)選的宿主細(xì)胞是Aspergillus niger□當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞是Aspergillus niger宿主細(xì)胞時，宿主細(xì)胞優(yōu)選地是CBS 513.88、CBS124.903或其衍生物。最優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞是如本文實施例中所述的宿主細(xì)胞，優(yōu)選地是實施例4_11中的宿主細(xì)胞。絲狀真菌的若干菌株是公眾能夠容易地從大量培養(yǎng)物保藏機(jī)構(gòu)例如American Type Culture ColIection (ATCC)、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)、Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS)和 Agricultural Research Service Patent Culture Collection， Northern Regional Research Center (NRRL)獲得的，Aspergillus niger CBS 513.88、CBS124.903、 Aspergillus oryzae ATCC 20423、IFO 4177、ATCC 1011、CBS205. 89、ATCC 9576、 ATCC14488-14491、ATCC 11601、ATCC12892，P. chrysogenum CBS 455. 95，Penicillium citrinum ATCC 38065， Penicillium chrysogenum P2， Talaromyces emersonii CBS 124.902,Acremonium chrysogenum ATCC 36225或ATCC 48272,Trichoderma reesei ATCC 26921 或 ATCC 56765 或 ATCC 26921， Aspergillus sojae ATCC 11906, Chrysosporium lucknowense ATCC44006 及其衍生物。根據(jù)另一個實施方案，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。優(yōu)選地，原核宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。術(shù)語“細(xì)菌細(xì)胞”包括革蘭氏陰性和革蘭氏陽性微生物。合適的細(xì)菌可選自例如 Escherichia、Anabaena、Caulobactert、GluconobacterΛ Rhodobacterλ PseudomonasΛ Paracoccus、Bacillus、BrevibacteriumΛ CorynebacteriumΛ Rhizobium(Sinorhizobium)、 Flavobacterium、 Klebsiella、 Enterobacter、 LactobaciIIusλLactococcusλΜθthyIobactθΓ υπ ΛStaphylococcus 或 Streptomyces0 優(yōu)選地，細(xì)菌細(xì)胞選自由以下組成的組:B. subtil is、B. amyloliquefaciens、B. licheniformis、
B.puntis、B. megaterium、B. halodurans、B. pumilus、G. oxydans、Caulobactert crescentus CB 15、Methylobacterium extorquens、Rhodobacter sphaeroides、Pseudomonas zeaxanthinifaciens、Paracoccus denitrificans、E. coli、C. glutamicum、 Staphylococcus carnosus、 Streptomyces Iividans、 Sinorhizobium melioti 和 Rhizobium radiobacter。根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞可便利地被用于多種目的，例如感興趣的化合物的生產(chǎn)， 和用于表達(dá)克隆，例如W01999/032617和W02008/138835中所述。這些專利申請描述了使用絲狀真菌細(xì)胞作為宿主細(xì)胞的表達(dá)克隆的便利性。本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)感興趣的化合物的重組宿主細(xì)胞的生產(chǎn)方法，所述宿主細(xì)胞包含適用于整合一個或多個拷貝感興趣的多核苷酸的至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域，所述方法包括改造與另一基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域相比具有更高的基因轉(zhuǎn)變比例的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域，使其與其來源的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域相比述感興趣的多核苷酸具有增強的整合偏好，優(yōu)選地通過為具有更高基因轉(zhuǎn)變頻率的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域提供靶向 DNA結(jié)構(gòu)域，其中所述靶向DNA結(jié)構(gòu)域包含具有增強的整合偏好的序列?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何手段進(jìn)行下述改造改造與另一基本同源的 DNA結(jié)構(gòu)域相比具有更高基因轉(zhuǎn)變比例的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域，使其與其來源的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域相比對感興趣的多核苷酸具有增強的整合偏好。優(yōu)選地，經(jīng)改造的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域在宿主基因組內(nèi)是部分或完全獨特的。如實施例3中所示，使用之前從基因組中去除的葡糖淀粉酶啟動子序列改造A. niger中的擴(kuò)增子。這得到具有獨特的靶向序列的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域。感興趣的多核苷酸的啟動子和終止子部分在轉(zhuǎn)化后發(fā)揮適用于在經(jīng)改造的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域中整合的DNA序列的功能，如實施例11中所示。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，用于進(jìn)行這些實驗的所有手段在本文和上文Sambrook and Russel中描述。優(yōu)選地，用于生產(chǎn)感興趣的化合物的重組宿主細(xì)胞的生產(chǎn)方法還包括步驟a.用感興趣的多核苷酸轉(zhuǎn)化獲得的細(xì)胞，所述細(xì)胞具有經(jīng)改造的基本同源的DNA 結(jié)構(gòu)域，所述DNA結(jié)構(gòu)域具有更高的基因轉(zhuǎn)變比例，b.選擇或篩選向至少一個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域中整合了至少一個拷貝感興趣的多核苷酸的細(xì)胞，c.繁殖在(b)中獲得的細(xì)胞，并選擇或篩選在額外拷貝的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域中整合了至少一個拷貝所述感興趣的多核苷酸的細(xì)胞。更優(yōu)選地，用于生產(chǎn)感興趣的化合物的重組宿主細(xì)胞的生產(chǎn)方法是如本文實施例中描述的方法。用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。任何此類方法可被用于本發(fā)明的目的。轉(zhuǎn)化可涉及由以下組成的方法以本身已知的方式形成原生質(zhì)體、轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體和再生細(xì)胞壁。用于轉(zhuǎn)化Aspergillus細(xì)胞的合適程序描述于EP 238 023和Yelton et al.,1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81:1470-1474 中。 使用Agrobacterium tumefaciens轉(zhuǎn)化Aspergillus和其它絲狀真菌宿主細(xì)胞的合適步驟描述于例如 Nat Biotechnol. 1998 Sep ；16 (9) :839-42. Erratum in Nat Biotechnol 1998 Nov ； 16 (11) :1074. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi, de Groot MJ,Bundock P, Hooykaas PJ,Beijersbergen AG. Unilever Research Laboratory Vlaardingen, The Netherlands 中。轉(zhuǎn)化 Fusarium物種的合適方法由Malardier et al.，1989，Gene 78 :147156描述或描述于WO 96/00787 中。可以應(yīng)用其它方法，例如使用如描述于Biolistic transformation of the obligate plant pathogenic fungus, Erysiphe graminis f. sp. hordei. Christiansen SK, Knudsen S, Giese H. Curr Genet. 1995Dec ；29 (I) :100-2 中的生物射彈轉(zhuǎn)化?？梢允褂?Becker and Guarente, In Abelson, J. N. and Simon, Μ. I. , editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182—187, Academic Press, Inc. , New York ;Ito et al. ,1983, Journal of Bacteriology 153 :163 ;和 Hinnen et al.,1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75 :1920 中描述的步驟轉(zhuǎn)化酵母。技術(shù)人員可獲得大量常規(guī)技術(shù)用于測定何種獲得的轉(zhuǎn)化體在其DNA結(jié)構(gòu)域之一中整合了重組DNA分子。在又一個步驟中，繁殖所選擇的轉(zhuǎn)化體并從其后代中選擇下述菌株，其中至少兩個DNA包含被整合的感興趣的多核苷酸。這表示選擇了下述菌株，其中包含所整合的感興趣的多核苷酸的DNA結(jié)構(gòu)域被倍增，所述倍增通過與“空” DNA結(jié)構(gòu)域的基因轉(zhuǎn)變或通過擴(kuò)增實現(xiàn)。此類基因轉(zhuǎn)變和/或擴(kuò)增時間以低頻率自發(fā)地發(fā)生。這些事件發(fā)生的精確頻率可取決于大量變量，包括所考慮的宿主細(xì)胞，和DNA結(jié)構(gòu)域的數(shù)量、長度和同源性程度。然而， 這些頻率足夠高，使得能夠使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的分析技術(shù)篩選和選擇其中發(fā)生了這些事件的菌株。例如可以通過簡單地篩選具有更高生產(chǎn)水平的感興趣的多核苷酸編碼的產(chǎn)物的菌株，或者通過例如上文所述的“DNA標(biāo)志”測試分析它們的基因型，來鑒定下述菌株， 其中包含被整合的感興趣的多核苷酸的DNA結(jié)構(gòu)域被倍增。用于生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞的方法可包括額外的步驟，其中繁殖下述菌株，并從其后代菌株中選擇其中額外拷貝的DNA結(jié)構(gòu)域包含被整合的感興趣的多核苷酸， 所述菌株中發(fā)生了包含被整合的感興趣的多核苷酸的DNA結(jié)構(gòu)域的倍增。然后可對這些菌株再次進(jìn)行所述程序，直至獲得下述菌株，其中各個DNA結(jié)構(gòu)域包含被整合的感興趣的多核苷酸。優(yōu)選地，重復(fù)上述方法的步驟(C)，直至至少三個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域整合了至少一個拷貝的感興趣的多核苷酸。更優(yōu)選地，重復(fù)步驟(c)直至至少四個基本同源的DNA 結(jié)構(gòu)域整合了至少一個拷貝的感興趣的多核苷酸。進(jìn)一步更優(yōu)選地，重復(fù)步驟(c)直至至少五個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域整合了至少一個拷貝的感興趣的多核苷酸。最優(yōu)選地，重復(fù)步驟(c)直至每個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域整合了至少一個拷貝的感興趣的多核苷酸。本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)感興趣的化合物的方法，包括a.在有助于生產(chǎn)所述化合物的條件下培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞；和b.從培養(yǎng)基中回收感興趣的化合物。本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)感興趣的化合物的方法，包括a.在有助于生產(chǎn)所述化合物的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含適用于整合一個或多個拷貝感興趣的多核苷酸的至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域，其中所述至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域中的至少一個被改造為與其來源的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域相比對感興趣的多核苷酸具有增強的整合偏好，并且其中所述至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域整合了至少一個拷貝感興趣的多核苷酸；和
b.從培養(yǎng)基中回收感興趣的化合物。在根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，使用本領(lǐng)域已知的方法，在適合生產(chǎn)感興趣的化合物(例如多肽或代謝產(chǎn)物)的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞。不解釋為限制本發(fā)明的培養(yǎng)方法的例子是深層發(fā)酵(submerged fermentation)、在固體狀態(tài)上的表層發(fā)酵(surface fermentation)和在液體底物上的表層發(fā)酵。例如，可以通過搖瓶培養(yǎng)，在合適培養(yǎng)基中和允許編碼序列表達(dá)和/或多肽分離的條件下進(jìn)行的、實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、進(jìn)料分批或固體狀態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)使用本領(lǐng)域中已知的程序，發(fā)生在包含碳源和氮源和無機(jī)鹽的合適營養(yǎng)培養(yǎng)基中。合適的培養(yǎng)基可得自商業(yè)供應(yīng)商，或可根據(jù)(例如American Type Culture Collection的產(chǎn)品目錄中)公開的組合物制備。如果多肽或代謝產(chǎn)物被分泌進(jìn)營養(yǎng)培養(yǎng)基中，則可從培養(yǎng)基中直接回收多肽或代謝產(chǎn)物。如果多肽或代謝產(chǎn)物不是分泌型的，則可從細(xì)胞裂解物中回收?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的對多肽特異性的方法檢測多肽。這些檢測方法可包括使用特異性抗體，形成酶產(chǎn)物，或酶底物的消失。得到的感興趣的化合物(例如多肽或代謝產(chǎn)物)可以通過本領(lǐng)域已知的方法回收。例如，多肽或代謝產(chǎn)物可通過常規(guī)程序從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)程序包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。多肽可以通過大量本領(lǐng)域已知的程序來純化，所述程序包括但不限于色譜(例如離子交換、親合、疏水、色譜聚焦和尺寸排除)、電泳程序(例如制備型等電位聚焦 (preparative isoelectric focusing))、差異溶解度(例如硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE 或萃取(見例如 Protein Purification, J. -C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York,1989) 優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法中的宿主細(xì)胞是如前文所述的無選擇標(biāo)記物的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法中的宿主細(xì)胞是如前文所述的真菌宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法中的宿主細(xì)胞是如前文所述的絲狀真菌宿主細(xì)胞。 本發(fā)明的感興趣的化合物可以是任何生物化合物。生物化合物可以是任何生物聚合物或代謝產(chǎn)物。生物化合物可由單個多核苷酸或組成生物合成或代謝途徑的一系列多核苷酸編碼，或者可以是單個多核苷酸產(chǎn)物或一系列多核苷酸產(chǎn)物的直接結(jié)果。生物化合物對宿主細(xì)胞而言可以是天然的或異源的。術(shù)語“異源的生物化合物”在本文中被定義為對細(xì)胞而言并非天然的生物化合物； 或其中進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾以改變天然生物化合物的天然生物化合物。術(shù)語“生物聚合物”在本文中被定義為相同、相似或不相似的亞基(單體)的鏈 (或聚合物)。生物聚合物可以是任何生物聚合物。生物聚合物可例如是，但不限于核酸、 聚胺、多元醇、多肽(或聚酰胺)或多糖。生物聚合物可以是多肽。多肽可以是具有感興趣的生物活性的任何多肽。術(shù)語 “多肽”在本文中不旨在表示特定長度的編碼產(chǎn)物，并因此包括太、寡肽和蛋白質(zhì)。多肽還包括上述多肽的天然存在的等位基因變體和經(jīng)改造的變體，和雜種多肽。多肽對宿主細(xì)胞而言可以是天然的或可以是異源的。多肽可以是膠原或明膠，或其變體或雜種(hybrid)。 多肽可以是任何抗體或其部分，抗原，凝血因子，酶，激素或激素變體，受體或其部分，調(diào)節(jié)蛋白，結(jié)構(gòu)蛋白，報告蛋白，或轉(zhuǎn)運蛋白，涉及分泌過程的蛋白質(zhì)，涉及折疊過程的蛋白質(zhì)， 伴侶蛋白，肽氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白，糖基化因子，轉(zhuǎn)錄因子，合成肽或寡肽，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)可以是酶例如蛋白酶、神經(jīng)酰胺酶、環(huán)氧化物水解酶、氨肽酶、酰基轉(zhuǎn)移酶、醛縮酶、羥化酶、氨肽酶、脂肪酶。多肽可以是細(xì)胞外分泌的酶。此類酶可屬于氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶、連接酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、脫氧核糖核酸酶、聚糖酶、酯酶的組。酶可以是糖酶，例如纖維素酶如內(nèi)切葡聚糖酶，葡聚糖酶， 纖維二糖水解酶或β -葡糖苷酶，半纖維素酶或果膠分解酶如木聚糖酶，木糖苷酶，甘露聚糖酶，半乳聚糖酶，半乳糖苷酶，果膠甲基酯酶，果膠裂合酶，果膠酸裂合酶，內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶，外切多聚半乳糖醛酸酶，鼠李半乳糖醛酸酶，阿拉伯聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶 (arabinofuranosidases),阿拉伯木聚糖水解酶,半乳糖醒酸酶，裂合酶，或淀粉酶；水解酶，異構(gòu)酶，或連接酶，磷酸酶如植酸酶，酯酶如脂肪酶，蛋白水解酶，氧化還原酶如氧化酶， 轉(zhuǎn)移酶，或異構(gòu)酶。酶可以是植酸酶。酶可以是氨肽酶，天冬酰胺酶，淀粉酶，糖酶，羧肽酶， 內(nèi)切蛋白酶，金屬蛋白酶，絲氨酸-蛋白酶接觸酶，幾丁質(zhì)酶，角質(zhì)酶，環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶， 脫氧核糖核酸酶，酯酶，α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，葡萄糖淀粉酶，α-葡糖苷酶， β -葡糖苷酶，鹵素過氧化物酶(haloperoxidase),蛋白脫氨酶,轉(zhuǎn)化酶，漆酶，脂肪酶，甘露糖苷酶，變構(gòu)酶，氧化酶，果膠分解酶，過氧化物酶，磷脂酶，多酚氧化酶，核糖核酸酶，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，或葡萄糖氧化酶，己糖氧化酶，單加氧酶。在本發(fā)明的方法中，多肽也可以是融合的多肽或雜種多肽，另一多肽在所述多肽或其片段的N-端或C-端與之融合。融合的多肽通過將編碼一種多肽的核酸序列與編碼另一多肽的核酸序列(或其部分)融合來生產(chǎn)。用于生產(chǎn)融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且包括連接編碼多肽的編碼序列， 使得它們按照讀碼框融合，并且融合多肽的表達(dá)處于相同啟動子和終止子的控制下。雜種多肽可包含得自至少兩種不同多肽的部分或全部多肽序列的組合，其中所述至少兩種不同多肽中的一種或多種對宿主細(xì)胞而言可以是異源的。生物聚合物可以是多糖。多糖可以是任何多糖，包括但不限于，粘多糖(例如肝素和透明質(zhì)酸)和含氮多糖(例如甲殼質(zhì))。在一個更優(yōu)選的選項中，多糖是透明質(zhì)酸。根據(jù)本發(fā)明的感興趣的多核苷酸可編碼涉及初級或次級代謝產(chǎn)物合成的酶，所述代謝產(chǎn)物例如是有機(jī)酸、類胡蘿卜素、內(nèi)酰胺)抗生素和維生素。此類代謝產(chǎn)物可以被認(rèn)為是根據(jù)本發(fā)明的生物化合物。術(shù)語“代謝產(chǎn)物”包括初級和次級代謝產(chǎn)物；代謝產(chǎn)物可以是任何代謝產(chǎn)物。優(yōu)選的代謝產(chǎn)物是檸檬酸、葡糖酸和琥珀酸。代謝產(chǎn)物可由例如生物合成或代謝途徑中的一個或多個基因編碼。初級代謝產(chǎn)物是細(xì)胞初級或一般代謝的產(chǎn)物，它們與能量代謝、生長和結(jié)構(gòu)相關(guān)。次級代謝產(chǎn)物是次級代謝的產(chǎn)物(見例如 R. B. Herbert,The Biosynthesis of Secondary Metabolites,Chapman and Hall, New York,1981)。初級代謝產(chǎn)物可以是，但不限于氨基酸、脂肪酸、核苷、核苷酸、糖、甘油三酯或維生素。次級代謝產(chǎn)物可以是，但不限于生物堿、香豆素、類黃酮、聚酮化合物、奎寧、類固醇、肽或職。次級代謝產(chǎn)物可以是抗生素、抗飼育劑(antifeedant)、引誘劑(attractant)、殺菌劑、殺真菌劑、激素、殺蟲劑或殺鼠劑(rodenticide)。優(yōu)選的抗生素是頭抱菌素和 β_內(nèi)酰胺。生物化合物也可以是可選擇標(biāo)記物的產(chǎn)物。可選擇標(biāo)記物是感興趣的多核苷酸的產(chǎn)物，所述產(chǎn)物提供殺生物劑抗性或病毒抗性，對重金屬的抗性，對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)型等等?？蛇x擇標(biāo)記物包括但不限于，amdS (乙酰胺酶)，argB (鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)，bar (膦絲菌素乙?；D(zhuǎn)移酶)，hygB (潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)，niaD (硝酸還原酶)，pyrG (乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶)，SC (硫酸腺嘌呤基轉(zhuǎn)移酶)，trpC (鄰氨基苯甲酸合酶)，ble (腐草霉素抗性蛋白質(zhì))，及其等同物。根據(jù)本發(fā)明，根據(jù)本發(fā)明的方法中的感興趣化合物優(yōu)選地是如本文所述的多肽。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法中的多肽是如本文所述的酶。根據(jù)本發(fā)明，根據(jù)本發(fā)明的方法中感興趣的化合物優(yōu)選地是代謝產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，宿主細(xì)胞的至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域的經(jīng)改造的 DNA結(jié)構(gòu)域具有通過基因轉(zhuǎn)變和/或擴(kuò)增的最低倍增頻率。不同的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域顯示具有不同的倍增頻率，即基因轉(zhuǎn)變頻率。改造具有最低倍增頻率的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域的靶向DNA結(jié)構(gòu)域的優(yōu)點是，用基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域中低的重組頻率獲得遺傳上穩(wěn)定的宿主。本文提供的序列信息不應(yīng)被狹窄地理解為要求包括錯誤鑒定的堿基。本文公開的特定序列可容易地被用于從各個宿主細(xì)胞中分離完整的基因，所述完整的基因可隨后被容易地進(jìn)行序列分析，從而鑒定序列錯誤。除非另有說明，本文通過測序DNA分子測定的所有核苷酸序列都使用自動化DNA 測序儀測定，由本文測定的DNA分子編碼的多肽的所有氨基酸序列都通過翻譯如上文測定的核酸序列來預(yù)測。因此，如本領(lǐng)域針對通過該自動化途徑測定的任何DNA序列所已知的， 本文測定的任何核苷酸序列可含有一些錯誤。通過自動化測定的核苷酸序列可典型地與被測序的DNA分子的實際核苷酸序列至少約90 %相同，更典型地至少約95 %到至少約99. 9 % 相同。實際序列可通過其它途徑更精確地測定，包括本領(lǐng)域中公知的手動DNA測序方法。 還如本領(lǐng)域所已知的，與實際序列相比被測定的核苷酸序列中的單個插入或缺失會在核苷酸序列翻譯中引起移碼，使得所預(yù)測的由測定的核苷酸序列編碼的氨基酸序列與被測序的 DNA分子實際編碼的氨基酸序列從此類插入或缺失點開始完全不同。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠鑒定此類被錯誤鑒定的堿基，并且知道如何糾正此類錯誤。本文所描述和要求保護(hù)的發(fā)明在范圍上不受本文公開的特定實施方案的限制，因為這些實施方案旨在闡述本發(fā)明的若干方面。任何等同的實施方案旨在落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。事實上，除了本文所展示和描述的以外，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)前述說明書能夠明白對本發(fā)明的多種修飾。此類修飾也旨在落入附帶的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。在沖突的情況下，采取包括定義在內(nèi)的本公開作為指導(dǎo)。
實施例菌株WT I :該Aspergillus niger菌株被用作野生型菌株。該菌株以保藏號CBS 513. 88 保藏于 CBS Institute。
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WT 2 :該A. niger突變體菌株通過基本上如W098/46772中所述的方法，通過經(jīng)典的菌株改進(jìn)源自A. niger CBS 513. 88。在WT I孢子的NTG-誘變或UV-誘變后，針對搖瓶中突變體菌株改進(jìn)的葡糖淀粉酶生產(chǎn)進(jìn)行選擇。鑒定了若干經(jīng)改進(jìn)的A. niger菌株，其中一個良好的菌株生產(chǎn)提高至3-4倍的葡糖淀粉酶活性水平。所述突變體菌株以保藏號CBS 124. 903被保藏于CBS Institute。從搖瓶和遺傳分析中得出下述結(jié)論由于被擴(kuò)增的glaA 基因座(擴(kuò)增子)，A. niger CBS 124. 903菌株具有提高至3_4倍的葡糖淀粉酶生產(chǎn)，伴隨著提聞的⑶glaA基因拷貝數(shù)。GBA 300 :該A. niger菌株是包含glaA擴(kuò)增子的三個修飾的WT 2菌株。GBA 300 菌株的構(gòu)建根據(jù)W098/46772中所述方法進(jìn)行；在該專利申請中詳盡描述了如何從含有擴(kuò)增子的A. niger基因組中刪除三條glaA特異性DNA序列，得到具有三個截短的glaA擴(kuò)增子的amdS-陰性菌株。所述程序?qū)е聼o標(biāo)記物基因的Δ glaA重組A. niger WT 2菌株,最終完全不具有外來DNA序列。三個截短的glaA擴(kuò)增子被設(shè)計為BamHI截短的擴(kuò)增子，SalI 截短的擴(kuò)增子和BglII截短的擴(kuò)增子。A. niger 搖瓶發(fā)酵如WO 99/32617 的實施例“Aspergillus niger shake flask fermentations，，部分中所述，在20ml預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)A. niger菌株。過夜生長后，將IOml該培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至如W099/32617中所述含有7%葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基I(FMl)中。該FMl每升含有25g 酪蛋白水解產(chǎn)物，12. 5g酵母提取物，Ig KH2P04，2g K2S04，0. 5g MgS04. 7H20,0. 03g ZnC12，
0.02g CaC12,0. Olg MnS04. 4H20,0. 3g FeS04. 7H20,IOml Pen-Strep(5000IU/ml Pen_5mg/ ml Str印)，用4N H2S04調(diào)節(jié)至ρΗ5· 6。發(fā)酵在含有IOOml發(fā)酵液的500ml帶擋板燒瓶中， 于34°C和170rpm下進(jìn)行指示的天數(shù)。發(fā)酵培養(yǎng)基2 (FM2)被用于PLA2發(fā)酵，并且每升含有82. 5g Glucose. 1H20, 25g Maldex 15(荷蘭 Boom M 印 pel)，2g 檸檬酸，4. 5g NaH2P04. 1H20，9g KH2P04,15g (NH4) 2S04, 0. 02g ZnC12，0. Ig MnS04. 1H20，0. 015g CuS04. 5H20，0. 015g CoC12. 6H20,Ig MgS04. 7H20, 0. Ig CaC12. 2H20,0. 3g FeS04. 7H20, 30g MES (2-[N_ 嗎啉代]乙磺酸)，pH = 6。用于毒素測量的A. niger瓊脂培養(yǎng)基在以下培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌株，以測試赭曲霉毒素A(OTA)和煙曲霉毒素B2(FB2)的生產(chǎn)=Czapek酵母自溶產(chǎn)物瓊脂(CYA)和酵母提取物蔗糖瓊脂(YES)，基本如Frisvad and Filtenborg,1989(Terverticillate Penicillia chemotaxonomy and mycotoxin production, Mycologia 81:837-861)和 Frisvad and Thrane,1993(Liquid column chromatography of mycotoxinsm InBetina (ed) Chromatography of mycotoxins. Techniques and applications. J. of Chromatography Library 54 253-372Elsevier, Amsterdam)所述。將培養(yǎng)皿在暗中于24°C下孵育7天，之后從單個菌落中取出瓊脂塊(agar plugs)用于提取。提取使用84% CH3CN-水進(jìn)行，并在超聲浴中放置I小時，之后將溶劑濾過 0.45 μ m PTFE 濾器。通過用內(nèi)標(biāo)溶液摻加(spiking)樣品至確定量的FB2和0ΤΑ，進(jìn)行定量。如 Mogensen et al.2010 (Production of fumonism B2 and B4 by Aspergillus niger in raisins and grapes, J of Agricultural and Food Chemistry 58 :954-958)所述和 Nielsen et al. 2009(Review of secondary metabolites and mycotoxins from theAspergillus niger group,Anal Bioanal Chem 395 :1225-1242)所綜述地進(jìn)行LC-MS/MS。實施例I構(gòu)建Aspergillus niger GBA 301 (Δ glaA、Δ pepA)該A. niger菌株是包含編碼主要細(xì)胞外天冬氨酸蛋白酶PepA的pepA基因缺失的 GBA 300菌株。通過使用如EP 0635574中所述的“MARKER-GENE FREE”途徑，構(gòu)建GBA 301 菌株。該專利中描述的方法被用于缺失GBA 300基因組中P印A特異性DNA序列，如van den Hombergh et al. (van den Hombergh JP,Sollewijn Gelpke MD, van de Vondervoort PJ,Buxton FP,Visser J. (1997)-Disruption of three acid proteases in Aspergillus niger—effects on protease spectrum, intracellular proteolysis, and degradation of target proteins-Eur J Biochem. 247 (2) :605-13)所述。所述程序?qū)е聼o標(biāo)記物基因的GBA 301菌株，其中GBA 300菌株背景中的pepA基因被失活。實施例2構(gòu)建Aspergillus niger GBA 302 (Δ glaA、Δ pepA> Δ hdfA)根據(jù)已知原則設(shè)計針對hdfA的基因置換載體，并根據(jù)常規(guī)克隆程序構(gòu)建。實質(zhì)上，這些載體包含hdfA ORF的約l-2kb的側(cè)翼區(qū)，用于在預(yù)定的基因組基因座處同源重組。 另外，它們在直接重復(fù)之間含有A. nidulans雙向amdS選擇標(biāo)記物。缺失載體的一般設(shè)計先前描述于EP635574B和WO 98/46772中，一般克隆載體pGBDEL (圖I)用于構(gòu)建缺失載體的用途描述于W006/040312中。載體pDEL_HDFA(圖2)包含hdfA ORF的約Ikb側(cè)翼區(qū)，用于同源重組。A. niger 基因的所有核苷酸序列及其基因組上下文可例如源自NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. rov/)或 EMBL (http: //www. ebi. ac. uk/embl/)。分離缺失載體 pDEL_HDFA 的線性 DNA,并用于使用先前描述于W005/095624中的方法轉(zhuǎn)化Aspergillus niger GBA 301，從而缺失 hdfA基因。在本文所有實施例中用于基因缺失的方法使用線性DNA，所述線性DNA通過雙交換(CToss-over)整合進(jìn)基因組中側(cè)翼序列的同源基因座處，從而取代要被amdS基因缺失的基因。隨后，通過涂布在氟乙酰胺培養(yǎng)基上去除amdS標(biāo)記物，以選擇無標(biāo)記物基因的菌株?；虼驍嗟囊话愠绦蛘故居趫D3中。菌株GBA 302被選擇作為代表性菌株，其中GBA
301菌株背景中的hdfA基因被失活。實施例3構(gòu)建Aspergillus niger GBA 303 ( Δ glaA、Δ pepA、Δ hdfA、經(jīng)改造的 BamHI 擴(kuò)增子)在該實施例中，將改造具有最高基因轉(zhuǎn)變頻率的AglaA擴(kuò)增子，得到對允許使用智能整合策略的靶向整合而言獨特的基因座。經(jīng)改造的擴(kuò)增子允許側(cè)翼序列(例如該實施例中的葡糖淀粉酶啟動子和終止子)被同樣用作靶向區(qū)。實施例3. I鑒定具有最高基因轉(zhuǎn)變頻率的擴(kuò)增子菌株GBA 301基因組中含有三個經(jīng)改造的Λ glaA基因座。對所有三個基因座而言，缺失了約4.3kb glaA序列(2kb glaA啟動子和整個glaA編碼序列)(如圖4-來自 W098/46772)。因為使用了三種不同的缺失載體，所以每個Λ glaA基因座略微不同，這是可被用于通過PCR測試使每個截短的Λ glaA基因座顯影的特征(圖5-來自W098/46772)。所述摻入的差異也可以被用于跟蹤截短的glaA擴(kuò)增子之間的基因轉(zhuǎn)變事件。三個截短的 glaA擴(kuò)增子被設(shè)計為BamHI截短的擴(kuò)增子，SalI截短的擴(kuò)增子和BglII截短的擴(kuò)增子，它們在所謂的“DNA-標(biāo)志”測試中分別顯示具有240、260和300bp大小的條帶(圖5-來自 W098/46772)。從菌株GBA 301中生產(chǎn)了多種植酸酶生產(chǎn)菌株，所述菌株(通過轉(zhuǎn)化pGBAAS_l和 pGBTOPFYT-Ι)含有多種植酸酶表達(dá)盒，它們均靶向至GBA 301的三個截短的glaA擴(kuò)增子之一(基本如W098/46772-實施例I. 4中所述)。得到的菌株各自在三個截短的glaA擴(kuò)增子之一中具有植酸酶盒，根據(jù)植酸酶盒整合位點被稱作BAM-PHY、SAL-PHY和BGL-PHY。針對三種不同的菌株BAM-PHY、SAL-PHY和BGL-PHY (基本如W098/46772-實施例
I.5中所述)鑒定具有提高的植酸酶盒拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)變體。對具有提高的植酸酶拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)變體而言，使用“DNA-標(biāo)志”測試測定含植酸酶的glaA擴(kuò)增子的特定擴(kuò)增子的頻率和基因型。通過使用“DNA-標(biāo)志”測試分析各自菌株的數(shù)千個體后代，可以通過特定的截短的 glaA擴(kuò)增子(例如Sail)的缺失和與之并行的另一特定的截短的glaA擴(kuò)增子的擴(kuò)增(例如BamHI)來檢測基因轉(zhuǎn)變。針對三種不同菌株的數(shù)百個體后代的PCR-評分和分型的結(jié)果見表I。另外，在單個基因轉(zhuǎn)變事件后接著對一些分離的菌株進(jìn)行類似的途徑，它們含有2個相同類型的擴(kuò)增子。三種類型菌株的數(shù)百個體后代的PCR-評分的這些結(jié)果可見表2。對三種不同的菌株而言，位于BamHI擴(kuò)增子中的植酸酶盒可通過基因轉(zhuǎn)變以(針對第一和第二基因轉(zhuǎn)變事件的)最高頻率被倍增。表I.通過“DNA-標(biāo)志”測試測定時，由于基因轉(zhuǎn)變導(dǎo)致的具有提高的拷貝數(shù)的菌株。
權(quán)利要求
1.用于生產(chǎn)感興趣的化合物的重組宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含適用于整合一個或多個拷貝的感興趣的多核苷酸的、至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域，其中所述至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域中的至少一個被改造為與其來源的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域相比對所述感興趣的多核苷酸具有增強的整合偏好，并且其中所述經(jīng)改造的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域所來源的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域具有比所述至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域中的另一個高至少 10%的基因轉(zhuǎn)變頻率。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的宿主細(xì)胞，其中所述經(jīng)改造的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域與其它版本的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域通過獨特的序列標(biāo)簽區(qū)分。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的宿主細(xì)胞，其中所述經(jīng)改造的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域包含下述靶向DNA結(jié)構(gòu)域，其中所述靶向DNA結(jié)構(gòu)域包含具有增強的整合偏好的序列。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的宿主細(xì)胞，其中所述至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域各自整合了至少一個拷貝的感興趣的多核苷酸。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的宿主細(xì)胞，還包括通過操控朝向HR的整合途徑而提高的多核苷酸整合進(jìn)所述宿主細(xì)胞基因組中預(yù)定位點的靶向整合的效率。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的宿主細(xì)胞，其中所述至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域是glaA基因座或是amyBI或amyBII)基因座。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的宿主細(xì)胞，其中所述感興趣的多核苷酸是經(jīng)密碼子優(yōu)化的多核苷酸。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的宿主細(xì)胞，其還包含選自glaA、amyA、amyBI、 amyBII、oahA、毒素相關(guān)的多核苷酸和prtT的組的多核苷酸，所述多核苷酸包含修飾，其中在可比較的條件下培養(yǎng)時，所述宿主細(xì)胞與其來源的親本細(xì)胞相比缺乏由所述包含修飾的多核苷酸編碼的產(chǎn)物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，其還包含pepA的缺乏。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的宿主細(xì)胞，其還包含SEC61中的修飾。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是沒有選擇標(biāo)記物的宿主細(xì)胞。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的宿主細(xì)胞,其中所述宿主細(xì)胞是真菌宿主細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是絲狀真菌宿主細(xì)胞。
14.用于生產(chǎn)感興趣的化合物的重組宿主細(xì)胞的生產(chǎn)方法，所述宿主細(xì)胞包含適用于整合一個或多個拷貝的感興趣的多核苷酸的、至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域，所述方法包括改造與另一基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域相比具有更高的基因轉(zhuǎn)變頻率的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域，使其與其來源的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域相比對所述感興趣的多核苷酸具有增強的整合偏好，所述改造包括為具有更高基因轉(zhuǎn)變頻率的所述基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域提供靶向 DNA結(jié)構(gòu)域，其中所述靶向DNA結(jié)構(gòu)域包含具有增強的整合偏好的序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其還包括a.用感興趣的多核苷酸轉(zhuǎn)化在權(quán)利要求14中獲得的所述細(xì)胞，b.選擇或篩選向所述基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域中整合了至少一個拷貝的感興趣的多核苷酸的細(xì)胞，c.繁殖在(b)中獲得的所述細(xì)胞，并選擇或篩選在額外拷貝的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域中整合了至少一個拷貝的所述感興趣的多核苷酸的細(xì)胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其還包括下述步驟重復(fù)步驟(C)，直至所述基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域的各個拷貝整合了至少一個拷貝的所述感興趣的多核苷酸為止。
17.用于生產(chǎn)感興趣的化合物的方法，所述方法包括a.在有助于生產(chǎn)所述化合物的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項所述的宿主細(xì)胞；和b.從所述培養(yǎng)基中回收所述感興趣的化合物。
18.用于生產(chǎn)感興趣的化合物的方法，所述方法包括a.在有助于生產(chǎn)所述化合物的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含適用于整合一個或多個拷貝的感興趣的多核苷酸的至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域，其中所述至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域中的至少一個被改造為與其來源的基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域相比對所述感興趣的多核苷酸具有增強的整合偏好，并且其中所述至少兩個基本同源的DNA結(jié)構(gòu)域整合了至少一個拷貝的感興趣的多核苷酸；和b.從所述培養(yǎng)基中回收所述感興趣的化合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是無選擇標(biāo)記物的宿主細(xì)胞。
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.根據(jù)權(quán)利要求17 根據(jù)權(quán)利要求20 根據(jù)權(quán)利要求17 根據(jù)權(quán)利要求22 根據(jù)權(quán)利要求17到19中任一項所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是真菌宿主細(xì)胞。 所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是絲狀真菌宿主細(xì)胞。到21中任一項所述的方法，其中所述感興趣的化合物是多肽。 所述的方法，其中所述多肽是酶。到21中任一項所述的方法，其中所述感興趣的化合物是代謝產(chǎn)包含根據(jù)SEQ 包含根據(jù)SEQID NO 2的多核苷酸或其功能片段的經(jīng)分離的多核苷酸。ID NO 3的多核苷酸或其功能片段的經(jīng)分離的多核苷酸。包含根據(jù)權(quán)利要求25或26的多核苷酸的載體。包含根據(jù)權(quán)利要求25或26的多核苷酸或包含根據(jù)權(quán)利要求27的載體的宿主細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)感興趣的化合物的重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)此類宿主細(xì)胞的方法。本發(fā)明還涉及感興趣的化合物的生產(chǎn)。本發(fā)明還涉及經(jīng)分離的多核苷酸和包含所述多核苷酸的載體和宿主細(xì)胞。
文檔編號C12N15/81GK102597241SQ201080032933
公開日2012年7月18日 申請日期2010年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月22日
發(fā)明者尼爾·尼古拉斯·瑪利亞·伊麗莎白·培杰·范, 艾瑟·蘭格·德, 蒂鮑特·喬斯·維恩策爾, 赫爾曼·揚·佩爾, 阿德里亞娜·瑪麗娜·里門斯 申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司