專利名稱：包含表達(dá)增強(qiáng)子的真核宿主細(xì)胞的制作方法
包含表L大j曾強(qiáng)子的真核宿主細(xì)胞，本發(fā)明涉及包含表達(dá)增強(qiáng)子的真核宿主細(xì)胞及其在目的蛋白(protein ofinterest, Ρ0Ι)生產(chǎn)方法中的用途。蛋白的成功分泌已在原核和真核宿主中都有實(shí)現(xiàn)。最顯著的例子是諸如大腸桿菌的細(xì)菌；諸如釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母或者多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)的酵母菌；諸如泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或者瑞氏木霉(Trichoderma reesei)的絲狀真菌；或者諸如CHO細(xì)胞的哺乳動物細(xì)胞。雖然某些蛋白可以很容易地達(dá)到高水平分泌， 許多其他蛋白只能以較低水平分泌(Punt et al.，2002 ；Macauley-Patrick et al.，2005 ； Porro et al. ,2005)。提高重組蛋白的分泌的一種方法是通過隨機(jī)突變(Archer et al. , 1994 ；Lang and L00man，19%)。這種方法的主要缺點(diǎn)是陽性結(jié)果通常不能轉(zhuǎn)化到其他菌株上。真核生物(例如酵母)的分泌途徑-蛋白的折疊和加工是非常復(fù)雜的，有許多相互作用的參與成分。這些蛋白中的一些對諸如二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)的蛋白有催化活性，其他一些通過與蛋白結(jié)合并阻止它們聚集(分子伴侶，例如BiP)或者通過在分泌途徑后面的步驟中刺激蛋白釋放到細(xì)胞外部(SS0蛋白)來發(fā)揮作用。由于這種相互依賴，提高分泌途徑中一個反應(yīng)步驟的速率可能不會自動增加目的蛋白的分泌，而是可能導(dǎo)致隨后一個或多個反應(yīng)步驟被限速，因此不是除去了而只是轉(zhuǎn)移了表達(dá)系統(tǒng)的瓶頸。多個例子表明可以借助過表達(dá)被稱為“輔助因子”的一類蛋白質(zhì)來增強(qiáng)異源蛋白的分泌(Mattanovich et al.，2004)。WO 2008/128701A2描述了用于增加從真核細(xì)胞分泌POI的表達(dá)系統(tǒng)，所述系統(tǒng)采用 了選自 BMH2、BFR2、⑶g6、COYl、CUP5、IMHl、KIN2、SEC31、SSA4 和 SSE1 的分泌輔助因子。 相關(guān)基因從釀酒酵母的cDNA芯片獲得。Gasser等 OVpplied and Environmental MicrobiologH2007)6499-6507)描述了酵母菌中鑒定能夠增強(qiáng)異源蛋白分泌的新因子的基于轉(zhuǎn)錄組的方法。利用DNA芯片雜交試驗發(fā)現(xiàn)了特異的分泌增強(qiáng)蛋白。WO 93/25676中首次建議將編碼POI的基因與編碼異源二硫鍵結(jié)合蛋白的基因共表達(dá)從而作為增加異源蛋白產(chǎn)生的手段。WO 93/25676報道安逖斯塔辛(antistasin)和蜱抗凝血肽蛋白的重組表達(dá)可以通過與PDI共表達(dá)來提高。WO 94/08012提供了通過增加Hsp70伴侶蛋白(即KAR2和BIP或PDI伴侶蛋白)
的表達(dá)來提高酵母菌中蛋白質(zhì)分泌的方法。WO 03/057897提供了通過共表達(dá)至少兩個基因來重組表達(dá)目的蛋白的方法，所述基因編碼選自GroEL、GRoES、DnaK、DnaJ、GRpe，ClpB及其同源分子的伴侶蛋白。WO 2005/0617818和WO 2006/067511提供了通過使用基于2 μ m的表達(dá)質(zhì)粒在酵母菌中生產(chǎn)所需異源蛋白的方法。當(dāng)一或多個伴侶蛋白與異源蛋白的基因在相同質(zhì)粒上被共表達(dá)時，外源蛋白的產(chǎn)量大幅增加。刺激分泌途徑的另一種方法是過表達(dá)未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)活化轉(zhuǎn)錄因子HAC1。 轉(zhuǎn)錄分析顯示，高達(dá)330個基因受到HACl的調(diào)控，其中大部分屬于分泌或分泌細(xì)胞器生物發(fā)生的功能組(例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶(ER-resident chaperones)、折疊酶、易位因子 (Translocon)成分)。WO 01/72783描述了通過誘導(dǎo)提高未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)從而增加真核細(xì)胞分泌外源蛋白的量的方法，其中UPR是通過與選自HAC1、PTC2和IREl的蛋白共表達(dá)而調(diào)整的。雖然這些方法一旦建立起來可以轉(zhuǎn)移到其他菌株，并用于其他蛋白質(zhì)，但它們受限于對支持其他蛋白分泌的這些蛋白的功能的實(shí)際了解?？梢灶A(yù)見的是重組蛋白的高水平分泌，可在多個不同步驟受到限制，如折疊、二硫鍵形成、糖基化、細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸或從細(xì)胞釋放。這些過程中許多還沒有被完全理解。根據(jù)本領(lǐng)域目前的知識無法預(yù)測所述輔助因子功能，即使已經(jīng)有了宿主生物體的完整基因組DNA 序列。Wentz 和 Shusta(Appl. Environ. Microbiol. (2007)73(4) :1189-1198)采用釀酒酵母的酵母菌表面展示基因庫，利用合適的選擇壓來鑒定分泌改善的菌株。提高scTCR展示的酵母菌cDNA是溫度依賴性的CCW12、SEDI、CWP2、RPP0，以及單獨(dú)的20°C增強(qiáng)子(a lone 20 °C enhancer)的 ER01。發(fā)明的一個目的是提供提高真核細(xì)胞，特別是提高畢赤酵母屬的酵母細(xì)胞中分泌蛋白產(chǎn)量的簡單有效的新方法。希望提供新基因用于所述方法中，以便借助過表達(dá)輔助因子來提高分泌蛋白的產(chǎn)量，其中所述輔助因子可能應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)方法。本發(fā)明另一目的是提供性能改進(jìn)的重組宿主細(xì)胞從而增加POI的產(chǎn)量。通過權(quán)利要求所述的發(fā)明主題可以解決發(fā)明目的。具體地，發(fā)明是指包含編碼表達(dá)增強(qiáng)子的重組核苷酸序列的真核宿主細(xì)胞，所述表達(dá)增強(qiáng)子選自cLC52、RPL33、cLC61，包括它們的功能活性變體。本發(fā)明的宿主細(xì)胞優(yōu)選包含來源于巴斯德畢赤酵母的核苷酸序列。本發(fā)明的宿主細(xì)胞優(yōu)選是真菌細(xì)胞，更優(yōu)選是酵母細(xì)胞，或更高等的真核細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動物或植物細(xì)胞。根據(jù)發(fā)明的特定方面，宿主細(xì)胞是畢赤酵母屬的細(xì)胞，特別是巴斯德畢赤酵母菌株的細(xì)胞。本發(fā)明一個方面涉及這樣的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞是用于導(dǎo)入編碼POI的目標(biāo)基因的wildcard宿主細(xì)胞。本發(fā)明另一個方面涉及這樣的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞是包含編碼POI的重組核苷酸序列的生產(chǎn)細(xì)胞，其能夠產(chǎn)生POI。發(fā)明優(yōu)選提供了巴斯德畢赤酵母宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含-編碼表達(dá)增強(qiáng)子的重組核苷酸序列，所述表達(dá)增強(qiáng)子選自cLC52、RPL33和 cLC61，和-編碼POI的目的基因。編碼選自cLC52、RPL33、cLC61的蛋白及其功能活性變體的核苷酸序列優(yōu)選按照本發(fā)明作為表達(dá)增強(qiáng)子來提高POI在真核宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。本發(fā)明還提供了制備生產(chǎn)宿主細(xì)胞的方法，包括-提供發(fā)明所述wildcard宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含編碼選自cLC52、RPL33、 cLC61及其功能活性變體的蛋白的重組核苷酸序列，和
-導(dǎo)入編碼POI的核苷酸序列。根據(jù)替代的實(shí)施方案，制備生產(chǎn)宿主細(xì)胞的方法包括步驟-提供真核宿主細(xì)胞，-導(dǎo)入編碼cLC52、RPL33、cLC61及其功能活性變體中至少一個的核苷酸序列，以及-導(dǎo)入編碼POI的核苷酸序列。因此，發(fā)明提供了在真核細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)POI的方法，所述方法包括步驟-提供發(fā)明所述生產(chǎn)宿主細(xì)胞，-在細(xì)胞培養(yǎng)物中共表達(dá)POI和表達(dá)增強(qiáng)子，以及-從細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得POI。在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，POI是多肽，優(yōu)選是真核生物多肽，選自諸如免疫球蛋白或血清白蛋白的血清蛋白、酶、激素、信號分子、基質(zhì)蛋白或者它們的片段或衍生物。在另一優(yōu)選方法中，POI介導(dǎo)宿主細(xì)胞代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，優(yōu)選POI是底物、酶或輔因子，而代謝產(chǎn)物由該宿主產(chǎn)生以獲得足夠量的代謝產(chǎn)物。優(yōu)選地，編碼POI的重組核苷酸序列是在質(zhì)粒上提供的，所述質(zhì)粒適合整合到宿主細(xì)胞的基因組或者在宿主細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制。進(jìn)一步優(yōu)選質(zhì)粒是真核表達(dá)載體，優(yōu)選是包含分泌引導(dǎo)序列和/或啟動子序列的酵母表達(dá)載體，所述分泌引導(dǎo)序列能夠有效地引起POI從宿主細(xì)胞的分泌，所述啟動子序列能夠有效地引起POI在宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。本發(fā)明一方面涉及用于本發(fā)明方法的共同過表達(dá)質(zhì)粒 (co-overexpressionplasmid)，所述質(zhì)粒包含-編碼POI的重組核苷酸序列，和-編碼選自cLC52、RPL33、cLC61及其功能活性變體的核苷酸序列。發(fā)明詳述蛋白質(zhì)的“生物活性片段”或“功能活性片段”意味著與全長蛋白發(fā)揮類似或相當(dāng)?shù)纳镄?yīng)的蛋白質(zhì)片段。表達(dá)增強(qiáng)子的功能活性片段特征在于來源于SEQ ID NO 1-4 的表達(dá)增強(qiáng)子通過一或多個缺失得到的多肽或核苷酸序列，包含至少50%的序列、優(yōu)選至少70 %、更優(yōu)選至少80 %、更優(yōu)選至少90 %、再更優(yōu)選至少95 %，最優(yōu)選至少97 %、98 %、 99%。序列同一性可以如下所述進(jìn)行確定。這類片段可以通過例如氨基和羧基端缺失以及內(nèi)部缺失來產(chǎn)生。優(yōu)選片段是通過1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個缺失；更優(yōu)選1、2、3、4或5 個；更優(yōu)選1、2或3個；再更優(yōu)選1或2個；最優(yōu)選1個缺失獲得的。名詞“衍生物”涵蓋一或多個化合物(例如多肽或蛋白質(zhì))的任何組合，和/或融合化合物，其中化合物的任何部分可以在任何位置與一或多個其他多肽融合。衍生物也可以借助各種化學(xué)技術(shù)，比如共價偶聯(lián)、靜電相互作用、二硫鍵合等，通過與其他物質(zhì)的關(guān)聯(lián)或結(jié)合來獲得。與所述化合物結(jié)合的其他物質(zhì)可以是脂質(zhì)、碳水化合物、核酸、有機(jī)和無機(jī)分子或者它們的任何組合(例如PEG、前藥或藥物)。名詞“衍生物”還包括變體，后者可能含有非天然的或者化學(xué)修飾的氨基酸，和化合物的片段。應(yīng)當(dāng)明白名詞cLC52、RPL33或 cLC61也指它們的衍生物，所述衍生物可能是功能等同體或者功能活性變體，和/或具有類似或改進(jìn)的功能。
此處使用的“表達(dá)載體”被定義為克隆的重組核苷酸序列(即重組基因)在合適宿主生物體中的轉(zhuǎn)錄以及它們的mRNA的翻譯所需要的DNA序列。這種表達(dá)載體通常包含用于在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制原點(diǎn)、選擇性標(biāo)記(例如氨基酸合成基因或賦予對抗生素(比如博萊霉素、卡那霉素、G418或潮霉素)抗性的基因)、多個限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)、 合適的啟動子序列和轉(zhuǎn)錄終止子，這些成分可操縱地連在一起。名詞“真核宿主”是指任何可以被培養(yǎng)來表達(dá)POI的真核細(xì)胞或生物體。共識這一名詞不包括人類。用于本文，名詞多肽或核苷酸序列的“功能等同變體”或“功能活性變體”是指對序列內(nèi)部或者序列的一個或兩個遠(yuǎn)端的一或多個氨基酸或核苷酸進(jìn)行插入、刪除或替換等修飾得到的序列，并且所述修飾不影響(特別是損害)這個序列的活性。在優(yōu)選實(shí)施方案中，功能活性變體a)是多肽或核苷酸序列的生物活性片段，功能活性片段包含多肽或核苷酸序列的至少50 %的序列，優(yōu)選至少70 %、更優(yōu)選至少80 %、更優(yōu)選至少90 %、再更優(yōu)選至少95%、最優(yōu)選至少97%、98%或99% ；b)來源于多肽或核苷酸序列經(jīng)過至少一個氨基酸取代、添加和/或缺失，其中所述功能活性變體與多肽或核苷酸序列或者a)中定義的功能活性片段的序列同一性是至少40 %，優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少90 %，再更優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少97%、98%或99% ；和/或c)由多肽或核苷酸序列或其功能活性變體以及額外的對于所述多肽或核苷酸序列是外源的至少一個氨基酸或核苷酸組成， 優(yōu)選其中所述功能活性變體來源于SEQ ID NO :1、2、3或4中任一序列的任何天然變體或者與其相同。功能活性變體可以如上所述通過對序列進(jìn)行改變來獲得，其特征在于具有與變體所來源的SEQ ID NO :1-4中相應(yīng)序列所展示的類似的生物活性，包括能夠增強(qiáng)POI在重組細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)的能力。當(dāng)用于本發(fā)明時，功能活性變體可以通過多肽或核苷酸序列中的序列變化來獲得，所述序列變化保留了未被改變的多肽或核苷酸序列的功能。所述序列變化包括，但不僅限于(保守性)取代、添加、缺失、突變和插入。多肽或核苷酸序列的變體是本發(fā)明語境中的“功能活性的”，如果本發(fā)明的組合物 (包括變體，但不是原來的多肽或核苷酸序列)的活性達(dá)到發(fā)明所述表達(dá)增強(qiáng)子的活性的至少10 %，優(yōu)選至少25 %，更優(yōu)選至少50 %，更優(yōu)選至少70 %，再更優(yōu)選至少80 %，特別是至少90%，特別是至少95%，最優(yōu)選至少99%，其中所述表達(dá)增強(qiáng)子包括不含序列變化的多肽或核苷酸序列，即原來的多肽或核苷酸序列。在發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽的功能活性變體與SEQ IDNO :1_4的多肽或核苷酸序列基本相同，但分別與多肽或核苷酸序列的區(qū)別在于它來源于不同菌株或不同物種的同源序列。這些被稱為天然變體。然而，名詞“功能活性變體”包括天然等位基因變體，以及突變體或任何其他非天然存在的變體。本領(lǐng)域已知，等位基因變體是(多)肽的另一種形式，其特征在于含有基本不改變多肽的生物功能的一或多個氨基酸取代、缺失或添加?！吧锕δ堋笔侵付嚯幕蚝塑账嵝蛄性谒烊淮嬖诘募?xì)胞內(nèi)的功能，即使該功能不是細(xì)胞生長或存活所必需的。在優(yōu)選實(shí)施方案中，如上定義通過氨基酸交換、缺失或插入來源于多肽或核苷酸序列的功能活性變體也可能保持，或更優(yōu)選提高了活性。
保守性取代發(fā)生在側(cè)鏈和化學(xué)屬性相關(guān)的一個氨基酸家族內(nèi)。這類家族的例子是帶有基本側(cè)鏈、酸性側(cè)鏈、非極性脂肪族側(cè)鏈、非極性芳香族側(cè)鏈、不帶電荷的極性側(cè)鏈、小側(cè)鏈、大型側(cè)鏈等的氨基酸。 在發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，如上定義的多肽或核苷酸序列可以通過各種化學(xué)技術(shù)進(jìn)行改動來產(chǎn)生衍生物，所述衍生物與改動過的多肽或核苷酸序列具有基本相同的活性 (如同以上給片段和變體的定義中)，任選還具有其他希望的特性。名詞“基因產(chǎn)物(‘gene product，或‘product of a gene，)”是生化物質(zhì)，由基因(比如cLC52、RPL33或cLC61基因)的表達(dá)所產(chǎn)生的RNA或蛋白質(zhì)。用于本文，多肽的“同源物”或“功能同源物”意味著多肽在其一級、二級和三級結(jié)構(gòu)中相應(yīng)位點(diǎn)上有相同或保守的殘基。名詞還延伸到編碼同源多肽的兩個或多個核苷酸序列。具體來說，同源化合物相對全長天然序列或其任何片段通常具有至少大約50%的氨基酸序列同一性。優(yōu)選地，同源化合物與天然化合物或全長化合物的任何其他特別限定的片段具有至少大約的氨基酸序列特異性，更優(yōu)選至少大約60%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約65%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約70%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約75%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約80%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約85%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約90%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少大約95%的氨基酸序列同一性。當(dāng)這樣的同源物被證明具有輔助因子功能時，同源物被稱為“功能同源物”。用于本文，名詞“同源核苷酸序列”是指這樣的核苷酸序列，其與被考慮的核苷酸序列在核苷酸序列上相關(guān)但不相同，執(zhí)行基本相同的功能。這也意味著涵蓋核苷酸組成上的變化，包括由于遺傳密碼簡并性帶來的變化，核苷酸序列由此執(zhí)行基本相同的功能。名詞“宿主細(xì)胞”或“宿主細(xì)胞系”是指用于重組基因表達(dá)產(chǎn)生多肽或由所述多肽介導(dǎo)的代謝物的微生物。被培養(yǎng)宿主細(xì)胞經(jīng)過增殖的宿主細(xì)胞克隆通常被認(rèn)為是宿主細(xì)胞系。生產(chǎn)宿主細(xì)胞系通常理解是隨時可用于生產(chǎn)方法中在生物反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)來獲得基因產(chǎn)物的細(xì)胞系。用于本文，名詞“可操縱地連接”是指單一核酸分子(例如載體)上核苷酸序列的連接，其連接方式使得一或多個核苷酸序列的功能受到所述核酸分子上存在的至少一個其他核苷酸序列的影響。例如當(dāng)啟動子能夠影響重組基因的編碼序列的表達(dá)時，啟動子是可操縱地連接編碼序列。就本文指出的多肽序列而言的“氨基酸序列同一性百分比(％ ) ”定義為將序列排列對位并按需要引入空位以達(dá)到最大的序列同一性百分比后，候選序列中與特定多肽序列的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比，并且不把任何保守取代認(rèn)為是序列同一性的一部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定用于測量比對的合適參數(shù)，包括被比較的序列在全長達(dá)到最佳比對所需的任何算法。用于本文，名詞“質(zhì)粒”和“載體”包括自主復(fù)制的核苷酸序列和基因組整合核苷酸序列。名詞“多肽”是指含有兩個或更多個氨基酸的蛋白或肽，一般是含有至少3個，優(yōu)選至少20個，更優(yōu)選至少30個，更優(yōu)選至少50個氨基酸。該名詞還指較高分子量的多肽， 比如蛋白質(zhì)。下文中名詞“多肽”和“蛋白質(zhì)”可以互換使用。
用于本文，“啟動子”是指能夠控制編碼序列或功能性RNA的表達(dá)的DNA序列。啟動子活性是通過它的轉(zhuǎn)錄效率來評價的。這可以通過例如Northern印跡測量從啟動子開始的mRNA轉(zhuǎn)錄量來直接確定，也可以通過測量從該啟動子表達(dá)的基因產(chǎn)物的量來間接確定。用于本文，名詞“目的蛋白(POI)，，是指通過重組技術(shù)手段在宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。更具體地說，蛋白可以是宿主細(xì)胞中不天然存在的多肽，即異源蛋白；或者是宿主細(xì)胞天然有的，即對宿主細(xì)胞是同源的，但是其產(chǎn)生是通過例如與含有編碼POI的核酸序列的自復(fù)制載體一起轉(zhuǎn)化，或者編碼POI的一或多個拷貝的核酸序列通過重組技術(shù)整合到宿主細(xì)胞的基因組中，或者通過對控制編碼POI的基因的表達(dá)的一或多個調(diào)控序列(例如啟動子序列)進(jìn)行重組修飾。名詞“cLC52”是指與轉(zhuǎn)錄調(diào)控子有同源性的巴斯德畢赤酵母的多肽。在釀酒酵母中，與cLC52有最高同源性的蛋白質(zhì)是介導(dǎo)葡萄糖阻遏的轉(zhuǎn)錄抑制因子Nrgl和Nrg2。各自的 External ID 是SGD YDR043C, SGD YBR066C. Gene annotation PIPA03435。名詞“RPL33”是指rRNA編碼的與釀酒酵母RPL33A和RPL3!3B (大(60 核糖體亞基的核糖體蛋白L37)有同源性的巴斯德畢赤酵母的多肽。各自的External ID是S⑶ YPL143W 和 YDR234C?；驑?biāo)注 PIPA05837。名詞“cLC61”是指與肽酶同源的基因編碼的巴斯德畢赤酵母的多肽?；驑?biāo)注 PIPA02482o用于本文，名詞“cLC52、RPL33或cLC61 ”對基因和基因產(chǎn)物可互換使用。以下提供了這些多肽的序列信息。為了本發(fā)明，這些因子也被稱為輔助因子或表達(dá)增強(qiáng)子。名詞涵蓋全長蛋白或者其功能活性變體(包括生物活性片段和功能同源物)。獲得這樣可用于蛋白表達(dá)和/或分泌的基因和基因產(chǎn)物是令人驚奇的，這些基因和基因產(chǎn)物迄今還未被定性為功能性輔助因子。發(fā)現(xiàn)這方面相關(guān)基因是cLC52、RPL33和 cLC61，它們在共表達(dá)時能夠提高蛋白的產(chǎn)量。這些基因具有的功能不會估計與POI表達(dá)和 /或分泌有關(guān)。為了證明相關(guān)基因的輔助因子功能，將來源于生長在各種培養(yǎng)條件下的不同巴斯德畢赤酵母菌株的cDNA文庫在巴斯德畢赤酵母菌株中共同過表達(dá)，所述酵母菌在細(xì)胞表面展示單克隆抗體的Fab片段。熒光染色后的熒光信號提高的菌株借助高通量熒光活化細(xì)胞分揀術(shù)進(jìn)行富集。經(jīng)過幾輪培養(yǎng)和分揀后，優(yōu)選經(jīng)過幾輪嚴(yán)緊度增加的分揀(例如以非常嚴(yán)緊的單細(xì)胞模式)富集后，可以鑒定到基因RPL33、cLC52和cLC61對表面展示的Fab 片段的量有正效應(yīng)，這些基因以前沒有被與分泌途徑聯(lián)系起來。以前利用常規(guī)的DNA芯片技術(shù)沒有鑒定到這些輔助因子。一或多個基因的共表達(dá)對POI表達(dá)有正面影響，使得即使生物量累計下降，產(chǎn)物濃度仍有提高。因此可以得到更高的特定產(chǎn)物產(chǎn)量。實(shí)施例1中有更詳細(xì)的試驗過程描述。鑒定到的基因從巴斯德畢赤酵母cDNA經(jīng) PCR擴(kuò)增，克隆到巴斯德畢赤酵母的表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化入預(yù)先挑選的巴斯德畢赤酵母菌株中用于各種不同POI經(jīng)表面展示或分泌的高水平產(chǎn)生。為了估計共表達(dá)基因?qū)Ρ砻嬲故净蚍置诘闹亟MPOI的影響，可以將按照發(fā)明得到的巴斯德畢赤酵母菌株在搖瓶試驗和分批補(bǔ)料或恒化發(fā)酵中培養(yǎng)，與只表達(dá)POI的菌株比較。共同過表達(dá)研究中，三個基因都導(dǎo)致細(xì)胞表面信號增加。特別是共同過表達(dá)的cLC52顯著增加了分泌的POI的量。根據(jù)發(fā)明的優(yōu)選模式，重組核苷酸序列包含cLC52基因(kq. ID No. 1)或其功能活性變體。根據(jù)發(fā)明的另一個優(yōu)選模式，重組核苷酸序列包含RPL33基因(分別是kq. ID No. 2和幻或其功能活性變體。根據(jù)發(fā)明的另一個優(yōu)選模式，重組核苷酸序列包含cLC61基因(kq. IDNo. 4)或其功能活性變體。借助本發(fā)明的輔助因子，發(fā)明所述方法不僅通過表達(dá)增強(qiáng)而提高了產(chǎn)量，而且使 POI在真核細(xì)胞中的分泌增加。在有或沒有共表達(dá)所述能夠增加蛋白分泌的蛋白的情況下， 比較POI的分泌產(chǎn)量，在此基礎(chǔ)上確定POI分泌增加。POI可以是任何真核或原核多肽?？梢允翘烊坏姆置诘鞍谆虬麅?nèi)蛋白(即天然不分泌的蛋白)。本發(fā)明還提供了天然分泌蛋白或非天然分泌蛋白的功能同源物、功能活性變體、衍生物和生物活性片段的重組制備。功能同源物優(yōu)選與序列相同或者對應(yīng)該序列并具有序列的功能特性。本文提到的分泌POI可以，但不限于，是適合作為生物醫(yī)藥物質(zhì)的蛋白，比如抗體或抗體片段、生長因子、激素、酶、疫苗或可以用在工業(yè)用途上的蛋白質(zhì)，例如酶。優(yōu)選POI是異源重組多肽或蛋白，在真核細(xì)胞，優(yōu)選是酵母細(xì)胞中以分泌蛋白產(chǎn)生是有益的。優(yōu)選產(chǎn)生的蛋白的例子是免疫球蛋白、抑肽酶、組織因子通道抑制劑或其他蛋白酶抑制劑，以及胰島素或胰島素前體、胰島素類似物、生長激素、白介素、組織纖溶酶原激活劑、轉(zhuǎn)化生長因子a或b、胰升糖素、胰升糖素樣肽1 (GLP-I)、胰升糖素樣肽2 (GLP-2)、 GRPP、因子VII、因子VIII、因子XIII、血小板源性生長因子1、血清白蛋白、諸如酯酶或蛋白酶的酶、或者這些蛋白任一種的功能類似物。在本文語境中，名詞“功能類似物”是指具有類似于天然蛋白的功能的多肽。多肽可能與天然蛋白結(jié)構(gòu)類似，可能由天然蛋白通過在天然蛋白的C或N末端或者側(cè)鏈添加一或多個氨基酸；在天然氨基酸序列中一或多個不同位點(diǎn)取代一或多個氨基酸；在天然蛋白的任一端或兩端或者氨基酸序列中的幾個位點(diǎn)缺失一或多個氨基酸；或者在天然氨基酸序列中的一或多個位點(diǎn)插入一或多個氨基酸得到的。這類改動對以上提及的多個蛋白是已知的。另一個實(shí)施方案中，POI是真核蛋白或其生物活性片段，優(yōu)選是免疫球蛋白或免疫球蛋白片段，比如Fc片段或Fab片段。最優(yōu)選地，POI是單克隆抗HIVl抗體2F5的Fab片段。POI還可以選自供給宿主細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)的底物、酶、抑制劑或輔因子，目的在于獲得所述生化反應(yīng)或者幾個反應(yīng)級聯(lián)的產(chǎn)物(例如宿主細(xì)胞的代謝物)。示范性的產(chǎn)物可以是諸如核黃素的維生素、有機(jī)酸和醇，按照本發(fā)明表達(dá)P0I，可以獲得產(chǎn)量提高的這些產(chǎn)物。一般來說，從那里分泌蛋白的宿主細(xì)胞可以是任何適合重組表達(dá)POI的真核細(xì)胞。優(yōu)選的作為本發(fā)明宿主細(xì)胞的酵母細(xì)胞例子包括，但不限于酵母屬(例如釀酒酵母)、畢赤酵母屬(例如巴斯德畢赤酵母或嗜甲醇畢赤酵母hKomagataella屬 (K. pastoris、K. pseudopastoris或K. phaffii)、多形漢遜酵母或乳酸克魯維酵母。
較新的文獻(xiàn)將巴斯德畢赤酵母分類并重新命名為Komagatael lapastoris、 Komagataella phaffii 禾口 Komagataella pseudopastoris(Kurtzman, 2005)。 本文中巴斯德畢赤酵母作為 Komagataella pastoris、Komagataellaphaffii 禾口 Komagataella pseudopastoris的同義詞使用。根據(jù)發(fā)明優(yōu)選使用的酵母生產(chǎn)生物體可以是任何合適的酵母生物體，在培養(yǎng)時產(chǎn)生大量的目標(biāo)異源蛋白或多肽。合適的酵母生物體的優(yōu)選例子是選自以下酵母種的菌株 酉良氏## (Saccharomyces kluyveri) > ^ ^ (Schizosaccharomyces pombe)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、乳酸克魯維酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母、嗜甲醇畢赤酵母、克魯弗畢赤酵母(Pichia kluyveri)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)、可可假絲酵母(Candida cacaoi)、白地霉(Geotrichum)禾口發(fā)酵白地霉(Geotrichum fermentans)。最優(yōu)選的酵母宿主細(xì)胞來源于甲醇營養(yǎng)型酵母(methylotrophic yeast)，比如來自畢赤酵母或Komagatae 11a，例如巴斯德畢赤酵母或Komoagataellapastoris或 K. phaffii或K. pseudopastoris。宿主的例子包括諸如巴斯德畢赤酵母的酵母菌。巴斯德畢赤酵母菌株的例子包括 CBS 704( = NRRL Y-1603 = DSMZ 70382) ,CBS 2612( = NRRL Y-7556), CBS 7435( = NRRL Y-11430)、CBS9173-9189 和 DSMZ 70877 (German Collection of Microorganisms and CellCultures)；釀酒酵母菌株的例子包括W303、CEN. PK和BY-系列(EUROSCARF collection)。所有上述菌株都曾成功用于制備轉(zhuǎn)化子和表達(dá)異源基因。一般來說，本文中的目的蛋白是通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的重組表達(dá)方法產(chǎn)生的。應(yīng)當(dāng)理解，本文公開的方法還進(jìn)一步包括在允許POI表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述重組宿主細(xì)胞。然后可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)從細(xì)胞培養(yǎng)基中分離分泌出來的重組制備的POI并進(jìn)行純化。編碼提高蛋白分泌的蛋白的核苷酸序列可以從多種來源獲得。重組輔助因子核苷酸序列(又稱為“輔助因子基因”)的來源根據(jù)發(fā)明優(yōu)選來自植物、昆蟲、真菌或細(xì)菌物種， 優(yōu)選來自酵母菌，更優(yōu)選來自與宿主酵母菌株不同的酵母菌株以便獲得重組菌株。根據(jù)發(fā)明優(yōu)選的畢赤酵母宿主細(xì)胞，比如巴斯德畢赤酵母宿主細(xì)胞，含有外源輔助因子基因，所述基因優(yōu)選來源于釀酒酵母菌株或與生產(chǎn)宿主不同的另一個巴斯德畢赤酵母菌株。在另一個特定實(shí)施方案中，發(fā)明所述宿主細(xì)胞包含重組核苷酸序列，其中的輔助因子基因與宿主細(xì)胞來源于相同菌株。根據(jù)發(fā)明的特定實(shí)施方案，輔助因子基因優(yōu)選獲得自和生產(chǎn)宿主細(xì)胞同一屬的源細(xì)胞。例如，編碼發(fā)明所述表達(dá)輔助因子之一的核苷酸序列可以來源于酵母菌，比如釀酒酵母菌株，并用于在酵母菌(比如釀酒酵母生產(chǎn)宿主細(xì)胞系)中與POI共表達(dá)輔助因子。特別優(yōu)選的實(shí)施方案涉及編碼來自巴斯德畢赤酵母的輔助因子的重組核苷酸序列，所述序列用于在巴斯德畢赤酵母生產(chǎn)宿主細(xì)胞系中共表達(dá)輔助因子和POI的方法中。核苷酸序列的同源性來源促進(jìn)它進(jìn)入相同屬的宿主細(xì)胞內(nèi)，因此能夠在工業(yè)生產(chǎn)流程中穩(wěn)定地生產(chǎn)產(chǎn)量可能得到提高的P0I。同樣可以使用來自其他合適的酵母菌或其他真菌或者來自諸如脊椎動物的其他生物體的功能等同核苷酸序列。在發(fā)明另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，使用了分離自釀酒酵母的輔助因子核苷酸序列，特別是作為真核細(xì)胞中POI分泌的增強(qiáng)劑，所述真核細(xì)胞優(yōu)選是酵母細(xì)胞，最優(yōu)選是巴斯德畢赤酵母菌株的細(xì)胞。根據(jù)發(fā)明，也可能提供發(fā)明所述的wildcard宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含輔助因子基因中的至少一個，并且待引入編碼POI的目的基因。因此所述wildcard細(xì)胞系是預(yù)先形成的宿主細(xì)胞系，已確定了它的表達(dá)能力。這遵循了創(chuàng)新的“wildcard”策略，該策略用于利用例如定點(diǎn)重組酶介導(dǎo)的盒式交換來制備生產(chǎn)生物藥物所使用的生產(chǎn)細(xì)胞系(又稱為表達(dá)宿主細(xì)胞系)。這種新宿主細(xì)胞協(xié)助GOI在幾天內(nèi)即可克隆到例如預(yù)先確定的基因組表達(dá)熱點(diǎn)，從而得到可以繁殖的高效生產(chǎn)細(xì)胞系。根據(jù)發(fā)明，優(yōu)選提供巴斯德畢赤酵母宿主，所述宿主包含的輔助因子基因可操縱地連接編碼POI的核苷酸序列。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，發(fā)明的方法應(yīng)用了編碼POI的重組核苷酸序列，所述重組核苷酸序列是以每細(xì)胞單一拷貝或多拷貝在適合整合到宿主細(xì)胞基因組的質(zhì)粒上提供的。編碼POI的重組核苷酸序列還可以以每細(xì)胞單一拷貝或多拷貝在自主復(fù)制質(zhì)粒上提供。替代地，編碼POI的重組核苷酸序列和編碼能夠提高蛋白分泌的蛋白的核苷酸序列以每細(xì)胞單一拷貝或多拷貝存在于同一質(zhì)粒上。發(fā)明的優(yōu)選方法采用了質(zhì)粒，所述質(zhì)粒是真核表達(dá)載體，優(yōu)選是酵母表達(dá)載體。表達(dá)載體可以包括但不限于克隆載體、改動的克隆載體和特別設(shè)計的質(zhì)粒。用于發(fā)明的優(yōu)選表達(dá)載體可以是適合在宿主細(xì)胞中表達(dá)重組基因的任何表達(dá)載體，根據(jù)宿主生物體進(jìn)行選擇。重組表達(dá)載體可以是能夠在宿主生物體內(nèi)復(fù)制或者整合到其基因組內(nèi)的任何載體，又稱為宿主載體，比如酵母載體，其攜帶本發(fā)明的DNA構(gòu)建體。優(yōu)選的酵母表達(dá)載體是用于在選自以漢遜酵母、畢赤酵母、假絲酵母和球擬酵母(Torulopsis)屬為代表的甲醇營養(yǎng)型酵母酵母菌中進(jìn)行表達(dá)的載體。本發(fā)明中，優(yōu)選使用pPICZ、pGAPZ、pPIC9、pPICZalfa、pGAPZalfa、pPIC9K、pGAPHis 或來源于PPraZLE的質(zhì)粒作為載體。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，重組輔助因子基因、POI基因或重組宿主細(xì)胞是通過將相關(guān)基因連接到載體中并構(gòu)建攜帶基因的單一載體或者分別攜帶輔助因子基因和POI 基因的獨(dú)立載體而得到的。通過用所述載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，這些基因可以穩(wěn)定地整合到宿主細(xì)胞基因組中。制備這些基因所編碼的多肽可以利用重組宿主細(xì)胞系通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子， 從而在合適的培養(yǎng)基中獲得多肽，從培養(yǎng)基中分離表達(dá)的Ρ0Ι，并通過適合表達(dá)產(chǎn)物的方法對它進(jìn)行純化，特別是將POI與共表達(dá)的輔助因子分開。可以根據(jù)發(fā)明對相關(guān)基因進(jìn)行改動從而在宿主細(xì)胞內(nèi)高度表達(dá)。基因的改動可以通過對基因序列的優(yōu)化使之對應(yīng)宿主中最常用的密碼子。例如，可以根據(jù)宿主中高度表達(dá)的基因所使用的密碼子來優(yōu)化基因序列。幾種不同的真核宿主細(xì)胞中POI表達(dá)和分泌方法是優(yōu)選的。蛋白的表達(dá)、加工和分泌通過用攜帶編碼所需蛋白和信號肽的DNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化真核生物體，準(zhǔn)備被轉(zhuǎn)化生物體的培養(yǎng)物，生長培養(yǎng)物和從培養(yǎng)基中回收蛋白。信號肽可以是所需蛋白自己的信號肽、 異源信號肽，或者天然和異源信號肽的雜交體。在本文語境中，名詞“信號肽”是指酵母中表達(dá)的胞外蛋白的前體形式中以N-末端序列存在的前序列。信號肽的功能是使異源蛋白能被分泌進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。信號肽通常在這個過程中被切除。信號肽對產(chǎn)生蛋白的宿主生物體可以是異源的或同源的。本發(fā)明優(yōu)選的方面涉及這樣的方法，所述方法中表達(dá)載體包含能夠有效導(dǎo)致POI 從宿主細(xì)胞分泌出來的分泌前導(dǎo)序列。當(dāng)意圖重組表達(dá)和分泌的POI不是天然分泌蛋白， 因此缺少天然分泌前導(dǎo)序列時，或者POI的核苷酸序列克隆時沒有包含它的天然分泌前導(dǎo)序列時，需要表達(dá)載體中有這種分泌前導(dǎo)序列。分泌前導(dǎo)序列可以來源于酵母來源，例如來自酵母α -因子(比如釀酒酵母的MFd )或者酵母磷酸酶；來源于哺乳動物或植物來源；或者其他。挑選合適的分泌前導(dǎo)序列對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。替代地，分泌前導(dǎo)序列可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)克隆技術(shù)融合至編碼要重組表達(dá)的POI的核苷酸序列上。在優(yōu)選實(shí)施方案中，POI的核苷酸序列融合了分泌信號，即將蛋白靶向到分泌途徑(在這里，信號肽被切割，蛋白釋放到培養(yǎng)基中)的肽，例如 α -因子、PHO 或 AGA-2。合適的表達(dá)載體包含調(diào)控序列，所述調(diào)控序列適用于編碼異源多肽或蛋白的DNA 在真核宿主細(xì)胞中的表達(dá)。調(diào)控序列的例子包括啟動子、操縱子和增強(qiáng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)，以及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯啟始和終止的序列。調(diào)控序列可以可操縱地連接待表達(dá)的DNA序列。例如，如果啟動子序列控制著編碼序列的轉(zhuǎn)錄，所述啟動子被稱為可操縱地連接編碼序列。啟動子可以是在宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，可以來源于對宿主同源或異源的蛋白的編碼基因。啟動子優(yōu)選來源于宿主細(xì)胞同源蛋白的編碼基因。本發(fā)明再一方面涉及這樣的方法，所述方法中表達(dá)載體包含能有效導(dǎo)致POI在宿主細(xì)胞中的表達(dá)的啟動子序列。為了在宿主細(xì)胞中表達(dá)重組核苷酸序列，表達(dá)載體可以給重組核苷酸序列在編碼序列的5’端提供功能性啟動子。這樣轉(zhuǎn)錄受到該啟動子序列的調(diào)控和啟動。適用于哺乳動物宿主細(xì)胞的啟動子序列可以包括但不限于從病毒基因組獲得的啟動子、異源哺乳動物啟動子，例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子以及熱震驚蛋白啟動子。其他適用于酵母宿主細(xì)胞的啟動子序列可以包括但不限于從編碼代謝酶的基因獲得的啟動子，所述酶已知在細(xì)胞中以高濃度存在，例如糖酵解酶，比如磷酸丙糖異構(gòu)酶 (TPI)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、乙醇氧化酶(AOX)、乳糖酶 (LAC)和半乳糖苷酶(GAL)。合適的啟動子的優(yōu)選例子是酵母啟動子，所述啟動子含有作為酵母細(xì)胞中基因表達(dá)的啟動子的DNA序列。優(yōu)選的例子是釀酒酵母Mal、TPI、CUP、ADH或PGK啟動子；或者巴斯德畢赤酵母葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶啟動子(PPGI)、3_磷酸甘油酸激酶啟動子(PPGK)或甘油醛磷酸脫氫酶啟動子(PGAP)、乙醇氧化酶啟動子(PAOX)、甲醛脫氫酶啟動子(PFLD)、 異檸檬酸裂解酶啟動子(PICL)、翻譯延伸因子啟動子(PTEF)；以及巴斯德畢赤酵母烯醇酶 1 (PENOl)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(PTPI)、α-酮異己酸脫羧酶(PTHI)、核糖體亞基蛋白(PRPS2、 PRPS7、PRPS31、PRPL1)、熱震驚蛋白家族成員(PSSA1、PHSP90、PKAR2)、6_磷酸葡萄糖酸脫氫酶(PGNDl)、磷酸甘油酸變位酶(PGPMl)、轉(zhuǎn)酮醇酶(PTKLl)、磷脂酰肌醇合酶(PPISl)、 鐵-02-氧化還原酶(PFET3)、高親和鐵透性酶(PFTRl)、可抑制性堿性磷酸酶(ΡΡΗ08)、 N-肉豆蔻?；D(zhuǎn)移酶(PNMTl)、信息素反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子(PMCMl)、泛素(PUBI4)、單鏈DNA內(nèi)切核酸酶(PRAD2)的啟動子；和線粒體內(nèi)膜主要ADP/ATP載體的啟動子(PPET9)。在優(yōu)選表達(dá)系統(tǒng)中，啟動子是誘導(dǎo)型或組成型啟動子。啟動子可以是宿主細(xì)胞的內(nèi)源或外源啟動子。編碼輔助因子和/或POI的DNA序列還可以可操縱地連接合適的終止子序列，例如AOXl (乙醇氧化酶)終止子、CYCl (細(xì)胞色素c)終止子、TEF(翻譯延伸因子)終止子。表達(dá)載體可以包含一或多個表現(xiàn)型選擇標(biāo)記(例如編碼賦予抗生素抗性的蛋白或者提供營養(yǎng)需求的蛋白的基因)和預(yù)期宿主細(xì)胞能夠識別的復(fù)制原點(diǎn)以保證在宿主內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增。酵母載體常常含有來自酵母質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)、自主復(fù)制序列(ARS)，或者替代地， 用于整合到宿主基因組的序列、啟動子區(qū)、多聚腺苷酸化序列、轉(zhuǎn)錄終止序列和選擇標(biāo)記。用于連接DNA序列，例如分別編碼輔助因子和/或Ρ0Ι、啟動子和終止子的DNA序列的過程，和將它們插入含有整合或宿主復(fù)制所需信息的合適載體的過程是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，例如J. Sambrook et al. ,“ MolecularCloning 2nd ed. “ ,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)中有描述。應(yīng)當(dāng)理解，將輔助因子基因和/或POI作為整合目標(biāo)的載體可以這樣構(gòu)建首先制備含有編碼輔助因子和/或POI的完整DNA序列的DNA構(gòu)建體，然后將這個片段插入合適的表達(dá)載體或者通過將含有各個元件(比如信號、前導(dǎo)或異源蛋白)的遺傳信息的DNA片段順序插入，之后進(jìn)行連接。根據(jù)發(fā)明也可以使用多克隆載體，即含有多個克隆位點(diǎn)的載體，其中所需異源基因可以引入多克隆位點(diǎn)來提供表達(dá)載體。表達(dá)載體是攜帶異源基因，用于表達(dá)該基因所編碼的異源化合物的載體。在表達(dá)載體中，啟動子被放置在異源化合物基因的上游并調(diào)控該基因的表達(dá)。對于多克隆載體的情況，因為異源化合物的基因被引入多克隆位點(diǎn)，啟動子被放置在多克隆位點(diǎn)的上游。根據(jù)發(fā)明提供的用于獲得重組宿主細(xì)胞的DNA構(gòu)建體可以通過成熟的標(biāo)準(zhǔn)方法來制備，例如亞磷酰胺法。DNA構(gòu)建體還可以是基因組或cDNA來源的，例如通過制備基因組或 cDNA 文庫，并按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Sambrook etal.，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor, 1989)利用合成的寡核苷酸探針經(jīng)雜交篩選編碼發(fā)明所述多肽的全部或部分的DNA序列而獲得。最后，DNA構(gòu)建體可以是混合了合成和基因組、混合了合成和cDNA、或混合了基因組和cDNA來源，是按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過將對應(yīng)整個DNA構(gòu)建體各個部分的合成、基因組或cDNA來源的片段按需要退火而制備的。本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)化子可以通過將這類載體DNA，例如質(zhì)粒DNA導(dǎo)入宿主并挑選在有輔助因子的情況下過表達(dá)POI的轉(zhuǎn)化子來獲得。通過常規(guī)用于轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞的方法處理宿主細(xì)胞，使之能夠接受外來DNA，所述方法是比如電脈沖方法、原生質(zhì)體方法、醋酸鋰方法以及它們的改進(jìn)方法。巴斯德畢赤酵母優(yōu)選通過電穿孔進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，酵母表達(dá)載體能夠通過例如同源重組穩(wěn)定地整合到酵母基因組中。通過用輔助因子和/或POI基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞獲得的發(fā)明所述轉(zhuǎn)化子宿主細(xì)胞優(yōu)選首先在這樣的條件下培養(yǎng)，所述條件允許宿主細(xì)胞在沒有表達(dá)異源蛋白的負(fù)擔(dān)下生長至較大細(xì)胞數(shù)量。當(dāng)細(xì)胞系準(zhǔn)備進(jìn)行POI表達(dá)時，選擇培養(yǎng)技術(shù)以便產(chǎn)生表達(dá)產(chǎn)物。當(dāng)轉(zhuǎn)化子在有誘導(dǎo)刺激的情況下生長時，啟動子可能被激活引導(dǎo)基因在它的控制下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，POI得以表達(dá)。在有誘導(dǎo)刺激的生長條件下，通常比正常條件下生長得慢，但因為已經(jīng)在前一階段生長至大的細(xì)胞數(shù)量，整個培養(yǎng)系統(tǒng)能夠產(chǎn)生大量的異源蛋白。誘導(dǎo)刺激優(yōu)選是熱、或者添加的鎘、銅、滲透壓增長劑、過氧化氫、乙醇、甲醇、甲胺等。優(yōu)選將發(fā)明所述宿主細(xì)胞系在生物反應(yīng)器中生長條件下培養(yǎng)以獲得至少lg/L、更優(yōu)選至少10g/L細(xì)胞干重、優(yōu)選至少50g/L細(xì)胞干重的細(xì)胞密度。對于中試或工業(yè)規(guī)模，提供這樣的生物分子生產(chǎn)產(chǎn)量是有益的。優(yōu)選POI表達(dá)所采用的條件產(chǎn)生至少lmg/L，優(yōu)選至少10mg/L，優(yōu)選至少100mg/L， 最優(yōu)選至少lg/L的產(chǎn)量。根據(jù)本發(fā)明，令人驚訝的是能夠在即使生物量保持較低的情況下，輔助因子和POI 以高產(chǎn)量有效地共表達(dá)。因此，在中試和工業(yè)規(guī)模達(dá)到高單位產(chǎn)量是可行的，其中單位產(chǎn)量 Wmg POI/g干生物量衡量，在2-200的范圍，優(yōu)選100-200，最高500。與沒有輔助因子時產(chǎn)物的表達(dá)相比，發(fā)明所述生產(chǎn)宿主的單位生產(chǎn)率優(yōu)選提供至少1. 1倍，更優(yōu)選至少1. 5倍， 至少1.2或至少1.3倍的提高，某些情況中，可以實(shí)現(xiàn)2倍以上的提高。本發(fā)明的宿主細(xì)胞優(yōu)選通過以下檢測來測試其表達(dá)能力或產(chǎn)量ELISA、活性檢驗、HPLC或其他合適的檢測。優(yōu)選的發(fā)酵技術(shù)是分批式、分批補(bǔ)料式或連續(xù)培養(yǎng)。優(yōu)選酵母被培養(yǎng)在含有合適碳源的礦物質(zhì)培養(yǎng)基中，避免維生素混合液，這樣能夠極大地簡化分離過程。優(yōu)選的礦物質(zhì)培養(yǎng)基的例子是含有可利用碳源(例如葡萄糖、甘油或甲醇)、含有常量元素的鹽(鉀、鎂、鈣、銨、氯、硫酸鹽、磷酸鹽)和痕量元素(銅、碘、 錳、鉬酸鹽、鈷、鋅和鐵鹽以及硼酸)的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)化細(xì)胞被培養(yǎng)在適合所需重組化合物表達(dá)的條件下，根據(jù)表達(dá)系統(tǒng)和被表達(dá)蛋白的屬性，例如蛋白是否融合了信號肽還有蛋白是否可溶或者膜結(jié)合的，可以從細(xì)胞或培養(yǎng)基中純化重組化合物。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的，根據(jù)多種因素，包括宿主細(xì)胞類型和具體采用的表達(dá)載體，培養(yǎng)條件可能不同。如果所需化合物是從細(xì)胞分泌出來的，可以利用現(xiàn)有技術(shù)從培養(yǎng)基中分離并純化它。重組表達(dá)產(chǎn)物從酵母細(xì)胞分泌出來通常是有益的，原因包括有助于純化過程，因為這樣可以從培養(yǎng)物上清液回收產(chǎn)物，而不是從當(dāng)酵母細(xì)胞被破壞以便釋放胞內(nèi)蛋白時產(chǎn)生的復(fù)雜蛋白混合液中回收。分泌蛋白通常首先表達(dá)為帶有N端信號或前導(dǎo)肽的前體。信號肽一般含有帶正電的N末端，之后是疏水核心，然后是被稱為信號肽酶的酶的識別位點(diǎn)。該酶在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中將信號肽從蛋白上切除。蛋白被從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體，然后根據(jù)蛋白的特性進(jìn)入分泌通道的多種途徑之一。例如蛋白可能被分泌到培養(yǎng)基中或者保留在細(xì)胞表面。包含胞外、跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的某些受體是保留在細(xì)胞膜上只有胞外結(jié)構(gòu)域位于細(xì)胞之外的蛋白的例子。培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞也可以通過超聲波或機(jī)械法、酶法或化學(xué)法來破裂以便得到含有所需POI的細(xì)胞提取物，從中可以分離和純化到Ρ0Ι。對于獲得重組多肽或蛋白產(chǎn)物的分離和純化方法，可以使用諸如利用溶解度差異的方法，比如鹽析和溶劑沉淀；利用分子量差異的方法，比如超濾和凝膠電泳；利用電荷差異的方法，比如離子交換層析；利用特異親和性的方法，比如親和層析；利用疏水性差異的方法，比如反相高效液相層析；以及利用等電點(diǎn)差異的方法，比如等電點(diǎn)聚集。優(yōu)選采用特異的純化步驟來分開共表達(dá)的并會對POI制品造成污染的任何輔助因子。分離和純化過的POI可以通過常規(guī)方法，比如Western印跡或?qū)ζ浠钚缘臋z驗來鑒定。純化化合物的結(jié)構(gòu)可以通過氨基酸分析、氨末端分析、一級結(jié)構(gòu)分析等來限定。優(yōu)選可以大量和高純度水平地獲得化合物，這樣即可滿足作為藥物組合物中活性成分的必要要求。根據(jù)發(fā)明，優(yōu)選的宿主細(xì)胞系保持了輔助因子和POI基因的完整性，并且維持高表達(dá)水平，例如甚至培養(yǎng)大約20代，優(yōu)選至少30代，更優(yōu)選至少40代，最優(yōu)選至少50代后， 表達(dá)水平保持在至少μ g的水平。重組宿主細(xì)胞驚人的穩(wěn)定，對于工業(yè)規(guī)模的蛋白生產(chǎn)這是一個極大的優(yōu)勢。以下實(shí)施例更詳細(xì)地描述了本發(fā)明，所述實(shí)施例無論如何都不對權(quán)利要求所構(gòu)成的發(fā)明范圍造成限制。
實(shí)施例實(shí)施例1 a)構(gòu)建表面展示Fab 2F5的巴斯德畢赤酵母菌株為了制備Fab 2F5表達(dá)盒，整個輕鏈基因(vL和cL)以及重鏈基因的vH和cHl區(qū)經(jīng)PCR從含有人源化IgGlmAb的pRC/RSV(Kunert et al.，1998，2000)擴(kuò)增。利用寡核苷酸引物加入無模板編碼的限制性酶切位點(diǎn)(表1)。表1 用于PCR擴(kuò)增Fab 2F5重鏈和輕鏈的寡核苷酸引物
權(quán)利要求
1.真核宿主細(xì)胞，其包含編碼表達(dá)增強(qiáng)子的重組核苷酸序列，其中所述表達(dá)增強(qiáng)子選自 cLC52、RPL33 和 cLC61。
2.權(quán)利要求1所述的宿主細(xì)胞，其中所述核苷酸序列來源于巴斯德畢赤酵母。
3.權(quán)利要求1或2所述的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞，優(yōu)選酵母細(xì)胞，或高等真核細(xì)胞，優(yōu)選是哺乳動物細(xì)胞或植物細(xì)胞。
4.權(quán)利要求3所述的宿主細(xì)胞，其中所述酵母細(xì)胞是畢赤酵母屬的細(xì)胞，尤其是巴斯德畢赤酵母菌株的細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1-4中任一項所述的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞是用于導(dǎo)入編碼目的蛋白 (POI)的目的基因的wildcard宿主細(xì)胞。
6.權(quán)利要求1-4中任一項所述的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞是包含編碼POI的重組核苷酸序列的生產(chǎn)細(xì)胞，能夠產(chǎn)生該P(yáng)OI。
7.巴斯德畢赤酵母宿主細(xì)胞，其包含-編碼表達(dá)增強(qiáng)子的重組核苷酸序列，其中所述表達(dá)增強(qiáng)子選自cLC52、RPL33和 cLC61，和-編碼POI的目的基因。
8.編碼選自cLC52、RPL33和cLC61的蛋白的核苷酸序列作為表達(dá)增強(qiáng)子以提高POI在真核宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)的用途。
9.制備權(quán)利要求6所述宿主細(xì)胞的方法，其包括 -提供權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，和-導(dǎo)入編碼POI的核苷酸序列。
10.制備權(quán)利要求6所述宿主細(xì)胞的方法，其包括 -提供真核宿主細(xì)胞，-導(dǎo)入編碼cLC52、RPL33和cLC61中至少一個的核苷酸序列，和 -導(dǎo)入編碼POI的核苷酸序列。
11.在真核細(xì)胞中產(chǎn)生POI的方法，其包括 -提供權(quán)利要求6所述的生產(chǎn)宿主細(xì)胞，-在細(xì)胞培養(yǎng)物中共表達(dá)POI和表達(dá)增強(qiáng)子，和 -從細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得POI。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述POI是選自諸如免疫球蛋白或血清白蛋白的血清蛋白、酶、激素、信號分子、基質(zhì)蛋白、或者它們的片段或衍生物的多肽。
13.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述POI介導(dǎo)宿主細(xì)胞代謝物的產(chǎn)生。
14.權(quán)利要求11或12所述的方法，其中所述編碼POI的重組核苷酸序列是在質(zhì)粒上提供的，所述質(zhì)粒適合整合到宿主細(xì)胞的基因組或者在宿主細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制。
15.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述質(zhì)粒是真核表達(dá)載體，優(yōu)選是酵母表達(dá)載體，所述載體包含能夠有效導(dǎo)致POI從宿主細(xì)胞分泌出來的分泌前導(dǎo)序列和/或能夠有效導(dǎo)致 POI在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的啟動子序列。
16.用于權(quán)利要求10-14中任一項方法的共同過表達(dá)質(zhì)粒，其包含 -編碼POI的重組核苷酸序列，和-編碼選自cLC52、RPL33和cLC61的蛋白的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含編碼表達(dá)增強(qiáng)子的重組核苷酸序列的真核宿主細(xì)胞，其中所述表達(dá)增強(qiáng)子選自cLC52、RPL33和cLC61；以及它在目的蛋白(POI)生產(chǎn)方法中的用途。
文檔編號C12N15/81GK102459609SQ201080033024
公開日2012年5月16日 申請日期2010年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月20日
發(fā)明者D.馬塔諾維奇, G.斯塔德爾邁爾, M.索爾 申請人:維也納南城高等專業(yè)學(xué)院