專利名稱：用于微生物檢測(cè)的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)包含于食品、生物樣品和環(huán)境樣品如工業(yè)用水和自來水中的微生物的方法和試劑盒。更精確地，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)微生物的方法和試劑盒，所述方法和試劑盒能夠選擇性檢測(cè)包含于食品、生物樣品、抽汲樣品(swab sample)和環(huán)境樣品如工業(yè)用水和自來水中的微生物的活細(xì)胞。
背景技術(shù)：
平板培養(yǎng)法已通常用于食品、生物樣品、抽汲樣品或環(huán)境樣品中的總活菌數(shù)的測(cè)定。然而，平板培養(yǎng)法需要約兩天至一個(gè)月的時(shí)間來獲得結(jié)果。由于滅菌技術(shù)和食品加工技術(shù)的改進(jìn)，甚至在細(xì)胞以極少量存在的情況下，對(duì)于存在于試驗(yàn)樣品中的微生物活體狀態(tài)與微生物死亡狀態(tài)的識(shí)別的需求增加。在食品衛(wèi)生檢查和臨床試驗(yàn)領(lǐng)域中，尤其是作為細(xì)菌快速檢測(cè)法，嘗試通過PCR將對(duì)細(xì)菌特異的基因擴(kuò)增至能夠視覺觀察到基因的量，來測(cè)定細(xì)菌的存在與否或者定量細(xì)菌。然而，如果以細(xì)菌 DNA為靶標(biāo)，則也會(huì)檢測(cè)到試驗(yàn)樣品中原本包含的死細(xì)胞的背景，因而通過PCR獲得的陽性結(jié)果不一定表明活細(xì)菌的存在。因此，食品衛(wèi)生和臨床試驗(yàn)領(lǐng)域的現(xiàn)狀是，盡管PCR是高度敏感和快速的技術(shù)，但并未廣泛應(yīng)用。近來，嘗試通過用作為靶標(biāo)的mRNA的逆轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA并用對(duì)各種細(xì)菌特異的引物進(jìn)行PCR，來只檢測(cè)和定量試驗(yàn)樣品中的微生物的活細(xì)胞。然而，在該方法中，并未抑制死細(xì)胞自身mRNA的逆轉(zhuǎn)錄，并且當(dāng)在試驗(yàn)樣品中包含104Cfu/ml或104cfu/g以上的死細(xì)胞時(shí)，會(huì)檢測(cè)到死細(xì)胞的背景。因此，不能說該方法足以作為測(cè)定活體和死亡狀態(tài)的方法。具體地，作為使用PCR法區(qū)別微生物如細(xì)菌的活體狀態(tài)與死亡狀態(tài)的方法，已公開了專利文獻(xiàn)1和2中記載的方法。然而，使用PCR法區(qū)分微生物如細(xì)菌的活體和死亡狀態(tài)的這些方法存在以下問題。對(duì)公開于專利文獻(xiàn)1中的技術(shù)而言，提及實(shí)施例用于識(shí)別包含于在100°C下進(jìn)行 10至30分鐘的高溫長(zhǎng)時(shí)間滅菌(sterilization)的煮沸食品中的死細(xì)胞和包含于進(jìn)行乙醇滅菌或甲醛滅菌的食品的微生物。然而，特別是后一類型的處理，實(shí)際上并沒有食品進(jìn)行此類巴氏消毒法(pasteurization)處理。并且，并不認(rèn)為存在在目前食品工業(yè)中進(jìn)行主流巴氏消毒法(低溫長(zhǎng)時(shí)間巴氏消毒法(LTLT巴氏消毒法)、高溫短時(shí)間巴氏消毒法(HTST 巴氏消毒法)或超高溫巴氏消毒法(UHT巴氏消毒法))的食品中僅活體微生物的檢測(cè)，和在施用抗生素的傳染病患者的臨床試樣中僅活體特定病原菌的檢測(cè)。另外，在以IO4Cfu/ ml以上的濃度包含死細(xì)胞背景的食品或臨床試樣的試驗(yàn)樣品的情況中，源于死細(xì)胞的最終 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的量超過了專利文獻(xiàn)1的技術(shù)的檢測(cè)極限，因此不可能確定通過PCR獲得的試驗(yàn)樣品的陽性響應(yīng)是源于活細(xì)胞還是源于死細(xì)胞。此夕卜，作為專利文獻(xiàn)2的技術(shù)，公開了通過利用與活細(xì)胞的RNA/DNA的摩爾比相比，死細(xì)胞RNA/DNA的摩爾比的相對(duì)減少來識(shí)別活細(xì)胞與死細(xì)胞的方法。在該方法中，提取總RNA，通過使用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)來制備互補(bǔ)DNA，然后進(jìn)行PCR來計(jì)算其Ct值，通過使用單獨(dú)制備的校準(zhǔn)曲線(calibration curve)來獲得RNA的摩爾濃度。分別地，通過PCR擴(kuò)增與該RNA相對(duì)應(yīng)的染色體DNA的區(qū)域從而獲得其Ct值，基于校準(zhǔn)曲線計(jì)算染色體DNA的摩爾濃度從而獲得RNA/DNA摩爾比。即，上述方法需進(jìn)行復(fù)雜的總RNA提取并使用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR兩步。因此，該技術(shù)在定量性和快速性上次于靶向DNA的一般PCR。此外，在活細(xì)胞中連續(xù)不斷地產(chǎn)生RNA，然而在初期源于死細(xì)胞的RNA隨時(shí)間的流逝而被分解。因此，該技術(shù)缺乏穩(wěn)定性。此外，在以高濃度包含死細(xì)胞的食品或臨床試樣中，可通過該技術(shù)檢測(cè)到僅 1/10該濃度的活細(xì)胞。因此，在需要快速性、高靈敏度和準(zhǔn)確性的食品衛(wèi)生檢查和臨床試驗(yàn)領(lǐng)域中難以應(yīng)用該技術(shù)。專利文獻(xiàn)3中公開了一種通過區(qū)分微生物的活細(xì)胞(有生活力并可培養(yǎng)的細(xì)胞) 和死細(xì)胞或損傷細(xì)胞(有生活力但不可培養(yǎng)的細(xì)胞(VNC細(xì)胞))，從而選擇性檢測(cè)微生物的活細(xì)胞的方法。專利文獻(xiàn)3所公開的方法為包括以下步驟的方法用拓?fù)洚悩?gòu)酶阻害劑 (poison)和/或DNA旋轉(zhuǎn)酶阻害劑處理試驗(yàn)樣品的步驟、從試驗(yàn)樣品中提取DNA和通過 PCR擴(kuò)增所提取DNA的目標(biāo)區(qū)域的步驟以及分析擴(kuò)增產(chǎn)物的步驟，并且例舉了單疊氮乙錠 (ethidium monoazide)作為拓?fù)洚悩?gòu)酶阻害劑或DNA旋轉(zhuǎn)酶阻害劑。非專利文獻(xiàn)1還公開了一種其中使用單疊氮乙錠的方法。該方法為包括以下步驟的檢測(cè)方法向試驗(yàn)樣品添加單疊氮乙錠并用光照射該樣品的步驟、照射后從該樣品中提取DNA的步驟以及使用所提取的DNA作為模板通過PCR擴(kuò)增特定區(qū)域的步驟。此外，在非專利文獻(xiàn)1中公開了一種通過結(jié)合微生物培養(yǎng)和實(shí)時(shí)PCR來定量活細(xì)胞數(shù)的半定量技術(shù)。此外，作為用于更加清楚地區(qū)分微生物的活細(xì)胞和損傷細(xì)胞的方法，公開了專利文獻(xiàn)4中記載的方法。該方法為包括以下步驟的方法向試驗(yàn)樣品添加交聯(lián)劑的步驟，所述交聯(lián)劑通過用具有350nm至700nm波長(zhǎng)的光照射能夠交聯(lián)DNA ；用具有350nm至700nm波長(zhǎng)的光照射添加了交聯(lián)劑的試驗(yàn)樣品的步驟；移除在用光照射的試驗(yàn)樣品中包含的交聯(lián)劑的步驟；向除去交聯(lián)劑的試驗(yàn)樣品中添加培養(yǎng)基并溫育試驗(yàn)樣品的步驟；向溫育的試驗(yàn)樣品再次添加交聯(lián)劑的步驟，所述交聯(lián)劑通過用具有350nm至700nm波長(zhǎng)的光照射能夠交聯(lián) DNA ；用具有350nm至700nm波長(zhǎng)的光照射添加了交聯(lián)劑的試驗(yàn)樣品的步驟；從試驗(yàn)樣品中提取DNA并通過核酸擴(kuò)增法擴(kuò)增所提取DNA的目標(biāo)區(qū)域的步驟以及分析擴(kuò)增產(chǎn)物的步驟。其間，表明存在這樣一種可能性，即在通過PCR擴(kuò)增核酸時(shí)，白蛋白可抑制PCR抑制劑的抑制活性，或促進(jìn)PCR反應(yīng)(非專利文獻(xiàn)2)。此外，還表明鈣抑制PCR反應(yīng)，但通過添加鎂離子可容許鈣對(duì)PCR的抑制(非專利文獻(xiàn)3)。此外，公開了一種使用細(xì)菌DNA作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)的方法，其中在不從細(xì)菌中提取DNA的情況下進(jìn)行PCR反應(yīng)(非專利文獻(xiàn)4、專利文獻(xiàn)幻。在專利文獻(xiàn)5中，公開了在 DNA指紋法中在細(xì)菌中進(jìn)行隨機(jī)PCR，并提及將磷酸鹽和十二烷基硫酸鹽作為核酸合成的緩沖組合物的組分?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1 :PCT申請(qǐng)(Κ0ΗΥ0)的日文譯文的特表2003-530118號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 國際專利公布W02002/052034號(hào)專利文獻(xiàn)3 國際專利公布W02007/094077號(hào)專利文獻(xiàn)4 國際專利公布W02009/022558號(hào)
專利文獻(xiàn)5 國際專利公布W02004/104196號(hào)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1 Rudi, K.等人，Letters in Applied Microbiology, 2005, Vol. 40, pp.301-306非專利文獻(xiàn)2 :Forbes，B. E.等人，Journal of Clinical Microbiology, 1996, 34(9)，pp.2125-2128非專利文獻(xiàn)3 :Bickley，J.等人，Letter in Applied Microbiology, 1996,22, pp.153-158非專利文獻(xiàn)4 =Kimberly, Α.等人，BioiTechniques, 31，2001，pp. 598-607

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題通過前述使用拓?fù)洚悩?gòu)酶阻害劑和/或DNA旋轉(zhuǎn)酶阻害劑或者交聯(lián)劑的方法， 可以高敏感度地選擇性檢測(cè)微生物的活細(xì)胞，特別是克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、檸檬酸桿菌屬(CitrcAacter)、李斯特菌屬(Listeria)和沙門氏菌屬(Salmonella)細(xì)菌等的活細(xì)胞。然而，期望進(jìn)一步改進(jìn)的方法，特別是用于高靈敏或高準(zhǔn)確地檢測(cè)埃希氏菌屬 (Escherichia)或沙門氏菌屬細(xì)菌的活細(xì)胞的方法。本發(fā)明的目的為提供用于同包含于食品或生物樣品中的微生物的死細(xì)胞或損傷細(xì)胞相比，更加有選擇地檢測(cè)所述微生物的活細(xì)胞的新方法以及用于進(jìn)行此方法的試劑
品.ο用于解決問題的方案本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)識(shí)別微生物生存與死亡的方法(可應(yīng)用于各種滅菌法并適用于高檢測(cè)靈敏度的食品衛(wèi)生檢查)以及在醫(yī)院或臨床實(shí)踐中檢測(cè)傳染病患者的特定病原體的方法進(jìn)行了廣泛的研究。結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過以下步驟可以高靈敏度地實(shí)現(xiàn)上述識(shí)別向試驗(yàn)樣品添加通過用具有350nm至700nm波長(zhǎng)的光照射能夠共價(jià)結(jié)合至DNA或RNA 的試劑；用具有350nm至700nm波長(zhǎng)的光照射試驗(yàn)樣品；添加用于抑制核酸擴(kuò)增抑制物作用的試劑(鎂鹽和有機(jī)酸鹽或磷酸鹽)，并通過核酸擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增溢出細(xì)胞的微生物的染色體DNA。由此，完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明提供通過識(shí)別活細(xì)胞與死細(xì)胞或損傷細(xì)胞來檢測(cè)試驗(yàn)樣品中微生物的活細(xì)胞的方法，其包括以下步驟a)向所述試驗(yàn)樣品添加通過用具有350nm至700nm波長(zhǎng)的光照射能夠共價(jià)結(jié)合至 DNA或RNA的試劑；b)用具有350nm至700nm波長(zhǎng)的光照射添加了所述試劑的所述試驗(yàn)樣品；c)在抑制核酸擴(kuò)增抑制物作用的試劑的存在下，通過核酸擴(kuò)增法，在不從所述細(xì)胞中提取核酸的情況下擴(kuò)增包含于所述試驗(yàn)樣品的所述微生物的DNA或RNA的目標(biāo)區(qū)域
d)分析擴(kuò)增產(chǎn)物。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增在微生物細(xì)胞中進(jìn)行。在前述方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，在前述步驟C)中，在選自表面活性劑、鎂鹽和有機(jī)酸鹽或磷酸鹽中的一種或多種的存在下進(jìn)行所述目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增。在前述方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，在所述步驟C)之前，重復(fù)進(jìn)行所述步驟a)和b)。在前述方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，在所述步驟a)之前，進(jìn)行以下步驟e)e)用存在于所述試驗(yàn)樣品中的具有分解除微生物細(xì)胞以外的細(xì)胞、蛋白質(zhì)膠粒 (colloidal particle)、脂質(zhì)或糖類的活性的酶處理所述試驗(yàn)樣品。在前述方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述酶選自蛋白酶、脂質(zhì)降解酶和糖類降解酶。在前述方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試驗(yàn)樣品為食品、生物樣品、飲用水、工業(yè)用水、環(huán)境用水、廢水、土壤和抽汲樣品之一。在前述方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述微生物為細(xì)菌或病毒。在前述方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)菌為革蘭氏陰性菌。在前述方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，其中通過用具有350nm至700nm波長(zhǎng)的光照射能夠共價(jià)結(jié)合至DNA或RNA的試劑選自單疊氮乙錠、雙疊氮乙錠(ethidium diazide)、單疊氮丙錠(propidium monoazide)、補(bǔ)骨脂素、4，5‘，8-三甲基補(bǔ)骨脂素和8-甲氧基補(bǔ)骨脂素。在前述方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，用于抑制核酸擴(kuò)增抑制物作用的試劑由以下組成選自白蛋白、葡聚糖、T4噬菌體基因32編碼蛋白(T4 gene 32 protein)、乙酰胺、甜菜堿、二甲基亞砜、甲酰胺、甘油、聚乙二醇、大豆胰蛋白酶抑制劑、α 2-巨球蛋白、四甲基氯化銨、溶菌酶、磷酸化酶和乳酸脫氫酶中的一種或多種。在前述方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸鹽選自乙酸鹽、丙酸鹽和檸檬酸鹽。在前述方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述磷酸鹽為焦磷酸鹽。在前述方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述目標(biāo)區(qū)域?yàn)?0至5，000個(gè)核苷酸的目標(biāo)區(qū)域。在前述方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述目標(biāo)區(qū)域?yàn)橄鄳?yīng)于選自所述試驗(yàn)樣品的DNA 的5S rRNA基因、16S rRNA基因、23SrRNA基因和tRNA基因中的基因的目標(biāo)區(qū)域。在前述方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸擴(kuò)增法為PCR、LAMP、SDA、LCR、TMA, TRC、 HC或微陣列法。在前述方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，PCR作為實(shí)時(shí)PCR來進(jìn)行，從而同時(shí)進(jìn)行PCR和所述擴(kuò)增產(chǎn)物的分析。在前述方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，通過使用標(biāo)準(zhǔn)曲線來進(jìn)行所述擴(kuò)增產(chǎn)物的分析， 所述標(biāo)準(zhǔn)曲線表示所述微生物的量與所述擴(kuò)增產(chǎn)物之間的關(guān)系，并通過使用所述微生物的標(biāo)準(zhǔn)樣品來建立。作為本發(fā)明的試劑盒，提供一種用于檢測(cè)試驗(yàn)樣品中微生物的活細(xì)胞的試劑盒， 其通過核酸擴(kuò)增法來識(shí)別所述活細(xì)胞與死細(xì)胞或損傷細(xì)胞，所述試劑盒包括以下組分1)通過用具有350nm至700nm波長(zhǎng)的光照射能夠共價(jià)結(jié)合至DNA或RNA的試劑；2)用于抑制核酸擴(kuò)增抑制物作用的試劑；和3) 一種或多種通過核酸擴(kuò)增法擴(kuò)增將要檢測(cè)的微生物的DNA或RNA目標(biāo)區(qū)域的引物。在前述試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包括選自表面活性劑、鎂鹽和有機(jī)酸鹽或磷酸鹽的一種或多種。在前述試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包括具有分解存在于所述試驗(yàn)樣品中的除微生物細(xì)胞以外的細(xì)胞、蛋白質(zhì)膠粒、脂質(zhì)或糖類的活性的酶。在前述試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸擴(kuò)增法為PCR、RT-PCR、LAMP、SDA、LCR、 TMA, TRC, HC或微陣列法。在前述試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方案中，通過用具有350nm至700nm波長(zhǎng)的光照射能夠共價(jià)結(jié)合至DNA或RNA的試劑選自單疊氮乙錠、雙疊氮乙錠、單疊氮丙錠、補(bǔ)骨脂素、4，5'， 8-三甲基補(bǔ)骨脂素和8-甲氧基補(bǔ)骨脂素。在前述試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方案中，用于抑制核酸擴(kuò)增抑制物作用的試劑由以下組成選自白蛋白、葡聚糖、T4噬菌體基因32編碼蛋白、乙酰胺、甜菜堿、二甲基亞砜、甲酰胺、 甘油、聚乙二醇、大豆胰蛋白酶抑制劑、α 2-巨球蛋白、四甲基氯化銨、溶菌酶、磷酸化酶和乳酸脫氫酶中的一種或多種。在前述試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述有機(jī)酸鹽選自乙酸鹽、丙酸鹽和檸檬酸鹽。在前述試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述磷酸鹽為焦磷酸鹽。在前述試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述酶選自蛋白酶、脂質(zhì)降解酶和糖類降解酶。


[圖1]在本發(fā)明的方法中獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳照片，“活”表示活細(xì)胞，“損傷”表示損傷細(xì)胞[圖2]顯示通過本發(fā)明的方法進(jìn)行的微生物活細(xì)胞檢測(cè)的結(jié)果的電泳照片[圖3]顯示通過常規(guī)方法進(jìn)行的微生物活細(xì)胞檢測(cè)的結(jié)果的電泳照片，“活”表示活細(xì)胞，“損傷”表示損傷細(xì)胞[圖4]阪崎腸桿菌(Enterobactersakazakii)細(xì)菌的未加熱生理鹽水懸浮液的熒光顯微照片和立體顯微照片[圖5]阪崎腸桿菌細(xì)菌的未加熱生理鹽水懸浮液的上清液的熒光顯微照片和立體顯微照片[圖6]重復(fù)熱循環(huán)后阪崎腸桿菌細(xì)菌的生理鹽水懸浮液的熒光顯微照片和立體顯微照片[圖7]重復(fù)熱循環(huán)后阪崎腸桿菌細(xì)菌的生理鹽水懸浮液的上清液的熒光顯微照片和立體顯微照片[圖8]懸浮于未加熱預(yù)處理劑溶液的阪崎腸桿菌細(xì)菌的熒光顯微照片和立體顯微照片[圖9]懸浮于未加熱預(yù)處理劑溶液的阪崎腸桿菌細(xì)菌的上清液的熒光顯微照片和立體顯微照片[圖10]重復(fù)熱循環(huán)后懸浮于預(yù)處理劑溶液的阪崎腸桿菌細(xì)菌的熒光顯微照片和立體顯微照片[圖11]重復(fù)熱循環(huán)后懸浮于預(yù)處理劑溶液的阪崎腸桿菌細(xì)菌的上清液的熒光顯微照片和立體顯微照片[圖12]顯示在未加熱狀態(tài)或重復(fù)熱循環(huán)后阪崎腸桿菌細(xì)菌的生理鹽水懸浮液或其上清液的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果的圖[圖13]顯示在未加熱狀態(tài)或重復(fù)熱循環(huán)后懸浮于預(yù)處理劑溶液的阪崎腸桿菌細(xì)菌或其上清液的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果的圖[圖14]16S_23SrRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳照片，在本發(fā)明的方法中該擴(kuò)增產(chǎn)物是使用各種固定液處理的阪崎腸桿菌細(xì)菌獲得的。Ct值用平均值和SD表示，SD在括號(hào)內(nèi)示出L IOObp DNA 梯帶(DNA ladder)Α:固定液AB:固定液BC:固定液CS 未固定[圖15]ompA基因擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳照片，在本發(fā)明的方法中該擴(kuò)增產(chǎn)物是使用各種固定液處理的阪崎腸桿菌細(xì)菌獲得的。Ct值用平均值和SD表示，SD在括號(hào)內(nèi)示出A 固定液AB:固定液BL IOObp DNA 梯帶[圖16]通過使用阪崎腸桿菌細(xì)菌的PCR(16S_23SrRNA基因擴(kuò)增反應(yīng))前后獲得的電泳照片泳道2和3 =PCR反應(yīng)混合物的上清液泳道5和6 =PCR反應(yīng)后從通過離心洗滌兩次的沉淀物(pellet)中提取的DNA
泳道7和8 直接從細(xì)胞提取的DNA泳道9和10 臨PCR前從實(shí)際用于試驗(yàn)的細(xì)胞中提取的DNA泳道13和14 從添加PCR產(chǎn)物后洗滌的細(xì)胞中提取的DNAL IOObp DNA 梯帶B:固定液BS 未固定[圖17]在生理鹽水或預(yù)處理劑的存在下進(jìn)行熱處理的阪崎腸桿菌細(xì)菌的懸浮液及其離心的上清液的電泳照片L IOObp DNA 梯帶
具體實(shí)施例方式在下文中，將詳細(xì)描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。然而，本發(fā)明不限于以下優(yōu)選實(shí)施方案，并可在本發(fā)明的范圍內(nèi)自由變化。除非特別說明，本說明書的百分比表示為質(zhì)量百分比。通過本發(fā)明的方法而待檢測(cè)的靶標(biāo)包括所有種類的核酸，具體地，包括單鏈DNA、 雙鏈DNA、單鏈RNA和雙鏈RNA，只要靶標(biāo)能夠被最終擴(kuò)增即可。其中，檢測(cè)靶標(biāo)優(yōu)選DNA、特別優(yōu)選雙鏈DNA。<1>本發(fā)明的方法本發(fā)明的方法為通過識(shí)別活細(xì)胞與死細(xì)胞或損傷細(xì)胞來檢測(cè)試驗(yàn)樣品中微生物的活細(xì)胞的方法，其包括以下步驟a)向所述試驗(yàn)樣品添加通過用具有350nm至700nm波長(zhǎng)的光照射能夠共價(jià)結(jié)合至DNA或RNA的試劑；b)用具有350nm至700nm波長(zhǎng)的光照射添加了所述試劑的試驗(yàn)樣品；c)在抑制核酸擴(kuò)增抑制物作用的試劑的存在下，通過核酸擴(kuò)增法，在不從所述細(xì)胞中提取核酸的情況下擴(kuò)增包含于所述試驗(yàn)樣品的所述微生物的DNA或RNA的目標(biāo)區(qū)域； 禾口d)分析擴(kuò)增產(chǎn)物。在本發(fā)明的說明書中，術(shù)語“試驗(yàn)樣品”是指包含待檢測(cè)微生物的活細(xì)胞的對(duì)象物。試驗(yàn)樣品不特別限定，只要可通過核酸擴(kuò)增法對(duì)染色體DNA或RNA的特定區(qū)域擴(kuò)增來檢測(cè)微生物的存在即可。優(yōu)選的實(shí)例包括食品、生物樣品、飲用水、工業(yè)用水、環(huán)境用水、廢水、土壤和抽汲樣品等。特別地，食品的優(yōu)選實(shí)例包括飲品如軟飲料、碳酸軟飲料、營(yíng)養(yǎng)飲料(supplement drink)、果汁飲料和乳酸菌飲料(包括這些飲料的濃縮物和粉末)；冰糖果類產(chǎn)品如冰淇淋、冰凍果子露(ice sherbets)和刨冰；乳制品如加工乳、乳飲料、發(fā)酵乳和黃油；腸內(nèi)食品(enteral food)、流體飲食、嬰兒用乳、運(yùn)動(dòng)飲料；以及功能性食品如特定保健用途的食品和健康輔助食品(dietary supplements)等。生物樣品的實(shí)例包括血樣、尿樣、腦脊液樣品、滑液樣品、胸膜滲液(pleural effusion)樣品、痰樣品、糞便樣品、鼻腔粘膜樣品、喉部粘膜樣品、洗胃溶液樣品、膿汁樣品、皮膚粘膜樣品、口腔粘膜樣品、呼吸器官粘膜樣品、消化器官粘膜樣品、眼結(jié)膜樣品、胎盤樣品、生殖細(xì)胞樣品、產(chǎn)道樣品、母乳樣品、唾液樣品、嘔吐物和水皰內(nèi)容物等。環(huán)境用水的實(shí)例包括自來水、地下水、江河水和雨水等。在本發(fā)明中，試驗(yàn)樣品可為任何如上所述的食品、生物樣品、飲用水、工業(yè)用水、環(huán)境用水、廢水、土壤和抽汲樣品等本身，或可為任何其稀釋或濃縮產(chǎn)物，或通過除本發(fā)明的方法以外的預(yù)處理所獲得的任何產(chǎn)物。預(yù)處理的實(shí)例包括熱處理、過濾和離心等。進(jìn)一步，異物如試驗(yàn)樣品中除微生物以外的細(xì)胞、蛋白質(zhì)膠粒、脂質(zhì)和糖類等可通過用具有降解它們的活性的酶處理等來除去或減少。在試驗(yàn)樣品為任何乳、乳制品和由乳或乳制品生產(chǎn)的食品的情況下，試驗(yàn)樣品中除微生物以外的細(xì)胞的實(shí)例包括牛白細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞等。同時(shí)，在試驗(yàn)樣品為任何生物樣品如血樣、尿樣、腦脊液樣品、滑液樣品和胸膜滲液樣品的情況下，所述細(xì)胞的實(shí)例包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞(如粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)和血小板等。所述酶不特別限定，只要其可降解異物并不損害待檢測(cè)微生物的活細(xì)胞即可，其實(shí)例包括，例如，脂質(zhì)降解酶、蛋白質(zhì)降解酶和糖類降解酶。其中，可使用一種酶或兩種以上酶，但優(yōu)選使用脂質(zhì)降解酶和蛋白質(zhì)降解酶二者，或脂質(zhì)降解酶、蛋白質(zhì)降解酶和糖類降解酶全部。脂質(zhì)降解酶的實(shí)例包括脂肪酶和磷酸酶等，蛋白質(zhì)降解酶的實(shí)例包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、蛋白酶K和鏈霉蛋白酶等，以及糖類降解酶的實(shí)例包括淀粉酶和纖維素酶等。所述“微生物”是將要通過本發(fā)明的方法檢測(cè)的對(duì)象物，并不特別限定，只要其可通過核酸擴(kuò)增法檢測(cè)，并且用具有350nm至700nm波長(zhǎng)的光照射能夠共價(jià)結(jié)合至DNA 或RNA的試劑以不同于在微生物的死細(xì)胞或損傷細(xì)胞的方式對(duì)所述微生物的活細(xì)胞起作用即可。優(yōu)選的實(shí)例包括細(xì)菌、真菌、酵母和病毒等。細(xì)菌包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌二者。革蘭氏陽性菌的實(shí)例包括葡萄球菌屬Staphylococcus)細(xì)菌如表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、鏈球菌屬(Streptococcus)細(xì)菌如月市炎鏈球菌 (Streptococcus pneumoniae)、李斯特菌屬(Listeria)細(xì)菌如單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、芽孢桿菌屬(Bacillus)細(xì)菌如蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)禾口炭痕芽胞桿菌(Bacillus anthracis)、分支桿菌屬(Mycobacterium)細(xì)菌如結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分支桿菌(Mycobacterium bovis)禾口鳥結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium avium)和梭菌屬(Clostridium)細(xì)菌如肉毒梭狀芽孢桿菌(Clostridium botulinum)禾口產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿菌(Clostridium perfringens) 等。革蘭氏陰性菌的實(shí)例包括腸細(xì)菌，其典型實(shí)例為埃希氏菌屬Escherichia)細(xì)菌如大腸桿菌(Escherichia coli)、腸桿菌屬(Enterobacter)細(xì)菌如阪崎腸桿菌、檸檬酸桿菌屬細(xì)菌如克氏檸檬酸桿菌(CitrcAacter koseri)和克雷伯氏菌屬細(xì)菌如產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)以及沙門氏菌屬細(xì)菌、弧菌屬(Vibrio)細(xì)菌、假單胞菌屬(I^eudomonas)細(xì)菌和軍團(tuán)菌屬(Legionella)細(xì)菌等。病毒的實(shí)例包括具有包膜的病毒如流感病毒和不具有包膜而僅具有核殼體(nuleocapsids)的病毒如諾如病毒 (noroviruses)、輪狀病毒(rotaviruses)禾口腺病毒(adenoviruses)。對(duì)于病毒而言，已知存在測(cè)量水中病毒的活化和失活的方法，其中使光反應(yīng)性核酸交聯(lián)劑(EMA)作用于試驗(yàn)樣品，然后通過RT-PCR僅測(cè)定活化的病毒(http:// www.recwet.t.u-tokyo. ac. jp/furumailab/j/sotsuron/H21/H21 sotsuron.html, Development of ethidium monoazide(EMA)-RT-PCR for selective detection of enteric viruses，關(guān)于健康相關(guān)的水微生物(water microbiology)的第15次國際研討會(huì) (2009年5月31日-6月05日，tosulines會(huì)議中心，Naxos，希臘))。S卩，表明EMA不滲入活化的病毒，但僅滲入具有嚴(yán)重物理損傷的核殼體的失活病毒，因此，活化病毒(活)和失活病毒(死)可由EMA區(qū)別。因此，認(rèn)為本發(fā)明不僅可應(yīng)用于細(xì)菌、絲狀真菌和酵母，還可應(yīng)用于病毒。在本發(fā)明中，“活細(xì)胞”是指當(dāng)在通常優(yōu)選的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)時(shí)，處于細(xì)胞可增殖并顯示微生物的代謝活性的狀態(tài)(有生活力并可培養(yǎng)的狀態(tài))的細(xì)胞，并且基本上無細(xì)胞壁損傷的細(xì)胞。如上所述的代謝活性，可例舉ATP活性、酯酶活性等。在本發(fā)明中，為了方便起見，病毒顆粒也稱為“細(xì)胞”。對(duì)于病毒而言，“活細(xì)胞”是指處于可感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞并增殖的狀態(tài)的病毒?！八兰?xì)胞”為處于即使其在最優(yōu)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)也不能增殖、也不顯示代謝活性的狀態(tài)(死亡狀態(tài))的細(xì)胞。此外，“死細(xì)胞”處于以下狀態(tài)盡管保持了細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，但細(xì)胞壁自身高度損傷，顯示弱滲透性的核染色劑如碘化丙錠可滲入或透過細(xì)胞壁。對(duì)于病毒而言，“死細(xì)胞”是指處于不能感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的狀態(tài)的病毒?！皳p傷細(xì)胞”(損傷細(xì)胞或有生活力但非可培養(yǎng)細(xì)胞)為處于以下狀態(tài)的細(xì)胞由于因人工壓力或環(huán)境壓力而損傷，即使當(dāng)細(xì)胞在通常優(yōu)選的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)也難以增殖， 其與活細(xì)胞相比顯示較低水平的代謝活性，但與死亡細(xì)胞相比顯示顯著水平的代謝活性。 對(duì)于病毒而言，“損傷細(xì)胞”是指處于即使感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞也不能在細(xì)胞內(nèi)增殖的狀態(tài)的病毒。
在本說明書中，除非特別說明，“活細(xì)胞”、“死細(xì)胞”和“損傷細(xì)胞”分別意指微生物的活細(xì)胞、死細(xì)胞和損傷細(xì)胞。特別地，在食品衛(wèi)生檢查和臨床試驗(yàn)領(lǐng)域中，由于溫?zé)崽幚砘蚴┯每股囟@示損傷細(xì)胞狀態(tài)的細(xì)菌的檢測(cè)引起了注意，本發(fā)明提供用于檢測(cè)微生物的方法，所述方法不僅能夠檢測(cè)活細(xì)胞，而且還能夠識(shí)別活細(xì)胞與死細(xì)胞或損傷細(xì)胞。對(duì)于所有活細(xì)胞、損傷細(xì)胞和死亡細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)的單位通常為細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞)/ml。 在本說明書中，細(xì)胞數(shù)用對(duì)數(shù)表示，"Iog10細(xì)胞/ml”意指IOa個(gè)細(xì)胞/ml?；罴?xì)胞數(shù)可用形成菌落數(shù)(cfu/ml(菌落形成單元/ml))估算，形成菌落數(shù)通過在適當(dāng)?shù)钠桨迮囵B(yǎng)基中在最優(yōu)條件下培養(yǎng)獲得。可通過例如將活細(xì)胞懸浮液進(jìn)行熱處理(例如沸水中的熱處理)來制備微生物的損傷細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)樣品。在此樣品中的損傷細(xì)胞數(shù)可用熱處理前活細(xì)胞懸浮液中的cfu/ml估算。盡管用于制備損傷細(xì)胞的在沸水中熱處理的時(shí)間依據(jù)微生物的類型而變化，但是在實(shí)施例中所述細(xì)菌的損傷細(xì)胞例如可通過約50秒的熱處理來制備。此外，微生物的損傷細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)樣品還可通過用抗生素處理來制備。在此情況中，損傷細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)可基于形成菌落數(shù)(cfu/ml)來估算，所述形成菌落數(shù)是當(dāng)細(xì)胞在適當(dāng)?shù)钠桨迮囵B(yǎng)基上在最優(yōu)條件下培養(yǎng)時(shí)所觀察到的形成菌落數(shù)，即，用抗生素處理活細(xì)胞懸浮液，然后除去抗生素，測(cè)量通過懸浮液的可見光(波長(zhǎng)600nm)的透光度，S卩，懸浮液的濁度，測(cè)量的濁度可與已知活細(xì)胞濃度的活細(xì)胞懸浮液相比較，從而計(jì)算用抗生素處理的損傷細(xì)胞數(shù)。對(duì)于病毒而言，細(xì)胞數(shù)的單位用噬斑形成單位(pfu或PFU，plaque-forming unit)表示。本發(fā)明的方法用于微生物的活細(xì)胞的檢測(cè)，并且不同于活細(xì)胞的微生物的細(xì)胞可為損傷細(xì)胞或死細(xì)胞。在本發(fā)明中，“活細(xì)胞的檢測(cè)”包括試驗(yàn)樣品中活細(xì)胞有無的測(cè)定以及試驗(yàn)樣品中活細(xì)胞量的檢測(cè)二者?；罴?xì)胞量不限定至絕對(duì)量，并可為相對(duì)于對(duì)照樣品中活細(xì)胞量的相對(duì)量。而且，“通過識(shí)別活細(xì)胞與死細(xì)胞或損傷細(xì)胞來檢測(cè)活細(xì)胞”意指與死細(xì)胞或損傷細(xì)胞相比更加選擇性地檢測(cè)活細(xì)胞。此外，“識(shí)別活細(xì)胞與死細(xì)胞或損傷細(xì)胞”包括從死細(xì)胞與損傷細(xì)胞二者識(shí)別活細(xì)胞。下文中，將針對(duì)各步驟解釋本發(fā)明的方法。如上所述，本發(fā)明的方法在以下描述的步驟之前可包括用具有分解存在于試驗(yàn)樣品中的除微生物細(xì)胞以外的細(xì)胞、蛋白質(zhì)膠粒、 脂質(zhì)或糖類的活性的酶處理試驗(yàn)樣品的步驟。(1)步驟 a)將通過用具有350nm至700nm波長(zhǎng)的光照射能夠共價(jià)結(jié)合至DNA或RNA的試劑添加到試驗(yàn)樣品中。即，用該試劑處理試驗(yàn)樣品中的微生物。如下文所述，該試劑插入雙鏈DNA或RNA并通過用光照射而共價(jià)結(jié)合至所述DNA 或RNA從而交聯(lián)分子。另外，推定通過用光照射使試劑共價(jià)結(jié)合至單鏈DNA或RNA，從而抑制PCR反應(yīng)。下文中該試劑也可簡(jiǎn)稱為“交聯(lián)劑”。與微生物的損傷或死細(xì)胞以及體細(xì)胞如牛白細(xì)胞、白細(xì)胞或血小板相比，交聯(lián)劑優(yōu)選對(duì)微生物的活細(xì)胞具有不同的作用。更具體地，與微生物的活細(xì)胞的細(xì)胞壁相比，交聯(lián)劑優(yōu)選為可更容易穿過微生物的損傷細(xì)胞或死細(xì)胞的細(xì)胞壁以及體細(xì)胞如牛白細(xì)胞、白細(xì)胞或血小板的細(xì)胞膜的交聯(lián)劑。交聯(lián)劑的實(shí)例包括單疊氮乙錠、雙疊氮乙錠、補(bǔ)骨脂素、4，5'，8-三甲基補(bǔ)骨脂素、8-甲氧基補(bǔ)骨脂素和單疊氮丙錠等?？蓡为?dú)使用這些交聯(lián)劑的一種，或可組合使用其兩種以上。可適當(dāng)?shù)卦O(shè)定用交聯(lián)劑處理的條件。例如，易于識(shí)別微生物的活細(xì)胞與微生物的死或損傷細(xì)胞的條件可通過以下測(cè)定向待檢測(cè)的微生物的活細(xì)胞和微生物的死或損傷細(xì)胞的懸浮液中添加各種濃度的交聯(lián)劑；使懸浮液靜置各種時(shí)間段；通過離心分離細(xì)胞；并通過核酸擴(kuò)增法分析細(xì)胞。此外，易于從各種細(xì)胞中識(shí)別微生物的活細(xì)胞的條件可通過以下測(cè)定向待檢測(cè)的微生物的活細(xì)胞和體細(xì)胞如牛白細(xì)胞或血小板的懸浮液中添加各種濃度的交聯(lián)劑；使懸浮液靜置各種時(shí)間段；通過離心分離所述細(xì)胞和所述各種細(xì)胞；并通過核酸擴(kuò)增法分析細(xì)胞。具體地例舉用單疊氮乙錠處理的條件為4至10°C、1至100 μ g/ml 的終濃度下處理5分鐘至48小時(shí)；用雙疊氮乙錠處理的條件為4至10°C、1至100 μ g/ml 的終濃度下處理5分鐘至48小時(shí)；用單疊氮丙錠處理的條件為在4至10°C、1至100 μ g/ ml的終濃度下處理5分鐘至48小時(shí)；用補(bǔ)骨脂素處理的條件為在25至37°C、1X 10_5至 10 μ g/ml的終濃度下處理5分鐘至48小時(shí)；用4，5'，8-三甲基補(bǔ)骨脂素處理的條件在25 至37°C、1 X 10_5至10 μ g/ml的終濃度下處理5分鐘至48小時(shí)；用8-甲氧基補(bǔ)骨脂素處理的條件為在25至37°C、1 X 10_5至10 μ g/ml的終濃度下處理5分鐘至48小時(shí)。(2)步驟 b)接下來，用具有350nm至700nm波長(zhǎng)的光照射包含交聯(lián)劑的各試驗(yàn)樣品。與微生物的活細(xì)胞的細(xì)胞壁相比，交聯(lián)劑可容易地穿過死細(xì)胞和損傷細(xì)胞的細(xì)胞壁。因此，如果在上述時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行處理，認(rèn)為交聯(lián)劑基本上不穿過微生物的活細(xì)胞的細(xì)胞壁，但穿過微生物的損傷或死細(xì)胞或死亡體細(xì)胞的細(xì)胞壁。結(jié)果，認(rèn)為交聯(lián)劑移入死亡體細(xì)胞、死亡和損傷的微生物細(xì)胞，并隨后與染色體DNA或RNA形成氫鍵，然后用具有 350nm至700nm波長(zhǎng)的光照射的交聯(lián)劑與DNA分子交聯(lián)或與RNA共價(jià)結(jié)合，結(jié)果引發(fā)染色體DNA的變形或RNA被交聯(lián)劑修飾，最終導(dǎo)致染色體DNA破壞(disruption)(片段化 (fragmentation) /切割(cleavage))，或者RNA不行使核酸擴(kuò)增反應(yīng)模板的作用。具有350nm至700nm波長(zhǎng)的光可包括至少具有350nm至700nm波長(zhǎng)的光，光可為單波長(zhǎng)光或多波長(zhǎng)光。此外，所有光組分可在350nm至700nm的范圍內(nèi)，或光可包括具有短于350nm波長(zhǎng)的短波長(zhǎng)光和/或具有長(zhǎng)于700nm波長(zhǎng)的長(zhǎng)波長(zhǎng)光。強(qiáng)度分布中的峰優(yōu)選在 350nm至700nm的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，所述光不包括僅由光照射就達(dá)到切割微生物的染色體 DNA的程度的短波長(zhǎng)組分。當(dāng)損傷或死細(xì)胞的染色體DNA比微生物的活細(xì)胞的染色體DNA更優(yōu)選地破壞時(shí)， 通過核酸擴(kuò)增法擴(kuò)增活細(xì)胞的染色體DNA的目標(biāo)區(qū)域，而損傷或死細(xì)胞的目標(biāo)區(qū)域破壞 (切割)，導(dǎo)致抑制核酸擴(kuò)增反應(yīng)。結(jié)果，能夠比損傷或死細(xì)胞更有選擇性地檢測(cè)微生物的活細(xì)胞。此外，當(dāng)損傷或死細(xì)胞的RNA比微生物活細(xì)胞的RNA更優(yōu)選地被交聯(lián)劑修飾時(shí)，通過核酸擴(kuò)增法擴(kuò)增活細(xì)胞的RNA的目標(biāo)區(qū)域，而損傷或死細(xì)胞的RNA的目標(biāo)區(qū)域被修飾，導(dǎo)致抑制核酸擴(kuò)增反應(yīng)。結(jié)果，能夠比損傷或死細(xì)胞更有選擇性地檢測(cè)微生物的活細(xì)胞。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，交聯(lián)劑為單疊氮乙錠，所述方法包括用具有350nm至700nm波長(zhǎng)的光照射添加了單疊氮乙錠的試驗(yàn)樣品。與微生物活細(xì)胞的細(xì)胞壁相比，單疊氮乙錠(EMA)能夠容易地穿過損傷或死細(xì)胞的細(xì)胞壁。因此，認(rèn)為EMA基本上不穿過微生物的活細(xì)胞的細(xì)胞壁但穿過微生物的損傷或死細(xì)胞的細(xì)胞壁或者死亡體細(xì)胞的細(xì)胞膜。注意，在血液中的白細(xì)胞和血小板為活細(xì)胞的情況下，EMA可更容易地穿過無菌水或低滲鹽溶液中的細(xì)胞的細(xì)胞壁。關(guān)于DNA，特別地，EMA移入死亡體細(xì)胞以及微生物的損傷和死細(xì)胞，并隨機(jī)插入核DNA，插入的EMA通過用具有350nm至700nm波長(zhǎng)的光照射，轉(zhuǎn)換成氮賓(nitrene)并共價(jià)結(jié)合至核DNA從而交聯(lián)DNA分子。然后，推定在多處共價(jià)結(jié)合至染色體DNA的堿基和脫氧核糖的EMA引起染色體DNA的大規(guī)模變形，導(dǎo)致染色體DNA的破壞(片段化)。另外，關(guān)于雙鏈RNA(包括部分雙鏈RNA)，EMA移入死亡體細(xì)胞以及微生物的損傷和死細(xì)胞并隨機(jī)插入RNA，然后插入的EMA通過用具有350nm至700nm波長(zhǎng)的光照射，傳換成氮賓并共價(jià)結(jié)合至RNA從而交聯(lián)RNA分子。然后，推定在多處共價(jià)結(jié)合至RNA的堿基的 EMA弓丨起RNA的大規(guī)模變形，導(dǎo)致RNA的破壞(片段化)。此外，關(guān)于單鏈DNA或RNA，推定EMA移入死亡體細(xì)胞以及微生物的損傷和死細(xì)胞， 然后通過用具有350nm至700nm波長(zhǎng)的光照射，插入的EMA轉(zhuǎn)換成氮賓，共價(jià)結(jié)合至DNA或 RNA。只要與微生物的活細(xì)胞的細(xì)胞壁相比交聯(lián)劑可更容易地穿過損傷或死細(xì)胞的細(xì)胞壁，且交聯(lián)劑通過用具有350nm至700nm波長(zhǎng)的光(長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外光或可見光)照射可交聯(lián)DNA或共價(jià)結(jié)合至RNA從而破壞染色體DNA或修飾RNA，則還可使用除單疊氮乙錠以外的交聯(lián)劑?？蛇m當(dāng)?shù)卦O(shè)定EMA處理的條件。例如，能夠容易地識(shí)別微生物的活細(xì)胞與死細(xì)胞和損傷細(xì)胞的條件可通過以下來設(shè)定向待檢測(cè)微生物的活細(xì)胞以及損傷細(xì)胞或死細(xì)胞的懸浮液添加各種濃度的EMA，靜置各種時(shí)間段，然后用可見光照射它們，如需要通過離心等除去細(xì)胞，并通過核酸擴(kuò)增法進(jìn)行分析。還可通過使用各種照射時(shí)間進(jìn)行如上所述的實(shí)驗(yàn)來適當(dāng)?shù)卦O(shè)定光照射的優(yōu)選條件。光照射條件的具體實(shí)例包括在距離試驗(yàn)樣品10至50cm 處用100至750W和前述波長(zhǎng)的光的照射5分鐘至2小時(shí)。光的照射優(yōu)選在低溫，例如用冰冷卻樣品下進(jìn)行。在前述步驟a)中交聯(lián)劑的添加和步驟b)的光照射處理可重復(fù)2個(gè)以上的循環(huán)。 在此情況下，優(yōu)選使在第一次的步驟a)中交聯(lián)劑的濃度與第二次或以后的步驟a)中的相比更高，并使第二次或以后的步驟a)中交聯(lián)劑的濃度與第一次的步驟a)中的相比更低。例如，如果使EMA在高濃度例如10μ g/ml以上起作用，盡管死細(xì)胞的細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的通透性變得更高，但活細(xì)胞的通透性也變高(Microbiology and Immunology, 2007, 51, pp. 763-775 Journal of Clinical Microbiology, 2008，46，pp. 2305—2313)。另一方面，如果使EMA在低濃度例如低于10 μ g/ml起作用，盡管可避免滲透入活細(xì)胞，但進(jìn)入死細(xì)胞的滲透率也降低，因此，死細(xì)胞也可通過核酸擴(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)。因此，優(yōu)選在第一次的步驟 a)中使用高濃度的交聯(lián)劑，并在第二次和以后的步驟b)中調(diào)低交聯(lián)劑的濃度。具體地，第一次的步驟a)中交聯(lián)劑的終濃度，例如，在單疊氮乙錠的情況下為10 至100 μ g/ml、在雙疊氮乙錠的情況下為10至100 μ g/ml、在單疊氮丙錠的情況下為10至 100 μ g/ml、在補(bǔ)骨脂素的情況下為2X 10_5 M 10 μ g/ml、在4,5'，8-三甲基補(bǔ)骨脂素的情況下為2X 10_5至10 μ g/ml或在8-甲氧基補(bǔ)骨脂素的情況下為2X 10_5至10 μ g/ml。另夕卜，在第二次和以后的步驟a)中的交聯(lián)劑的終濃度，例如，在單疊氮乙錠的情況下為1至 10 μ g/ml、在雙疊氮乙錠的情況下為1至10 μ g/ml、在單疊氮丙錠的情況下為1至10 μ g/ ml、在補(bǔ)骨脂素的情況下為1X10—5至9yg/ml、在4，5'，8-三甲基補(bǔ)骨脂素的情況下為 1 X 10_5至9 μ g/ml或在8-甲氧基補(bǔ)骨脂素的情況下為1 X 10_5至9 μ g/ml。另外，優(yōu)選使第一次的步驟a)的處理時(shí)間短于第二次和以后的步驟a)的處理時(shí)間。具體地，第一次的步驟a)的處理時(shí)間為，例如，在單疊氮乙錠的情況下為5分鐘至1小時(shí)、在雙疊氮乙錠的情況下為5分鐘至1小時(shí)、在單疊氮丙錠的情況下為5分鐘至1小時(shí)、 在補(bǔ)骨脂素的情況下為5分鐘至1小時(shí)、在4，5'，8-三甲基補(bǔ)骨脂素的情況下為5分鐘至 1小時(shí)或在8-甲氧基補(bǔ)骨脂素的情況下為5分鐘至1小時(shí)。在第二次和以后的步驟a)的處理時(shí)間，例如，在單疊氮乙錠的情況下為6分鐘至48小時(shí)、在雙疊氮乙錠的情況下為6分鐘至48小時(shí)、在單疊氮丙錠的情況下為6分鐘至48小時(shí)、在補(bǔ)骨脂素的情況下為6分鐘至 48小時(shí)、在4，5 ‘，8-三甲基補(bǔ)骨脂素的情況下為6分鐘至48小時(shí)或在8-甲氧基補(bǔ)骨脂素的情況下為6分鐘至48小時(shí)。在前一循環(huán)的步驟b)和后一循環(huán)的步驟a)之間，可加入除去未反應(yīng)的交聯(lián)劑的步驟。此外，在步驟b)和以下描述的步驟c)之間，可添加除去交聯(lián)劑的步驟。步驟a)中未反應(yīng)的交聯(lián)劑在步驟b)中通常基本上失活。因此，作為除去交聯(lián)劑的方法，提及離心試驗(yàn)樣品以便將包含微生物的沉淀與包含交聯(lián)劑的上清液分離并除去上清液的方法。在該情況下，除去交聯(lián)劑后，可任選地添加用洗滌劑洗滌微生物的步驟。⑶步驟C)然后，在用于抑制核酸擴(kuò)增抑制物作用的試劑的存在下，在不從細(xì)胞中提取核酸的情況下，通過核酸擴(kuò)增法來擴(kuò)增在光照射處理后包含于試驗(yàn)樣品中的微生物的DNA或 RNA的目標(biāo)區(qū)域。具體地，向包含試驗(yàn)樣品的核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液中添加用于抑制核酸擴(kuò)增抑制物作用的試劑，并進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)。此外，除了用于抑制核酸擴(kuò)增抑制物作用的試劑以外，可向擴(kuò)增反應(yīng)溶液中添加表面活性劑、鎂鹽或有機(jī)酸鹽或磷酸鹽。這些物質(zhì)可獨(dú)立使用或這些的任意兩種以上作為組合物來使用。特別優(yōu)選添加所有這些物質(zhì)。不限定用于抑制核酸擴(kuò)增抑制物作用的試劑、 表面活性劑、鎂鹽和有機(jī)酸鹽或磷酸鹽的添加順序，并且它們可同時(shí)添加。核酸擴(kuò)增抑制物是抑制核酸擴(kuò)增反應(yīng)或核酸延伸反應(yīng)(extension reaction)的物質(zhì)，其實(shí)例包括吸附到核酸(DNA或RNA)模板的正電性抑制物和吸附到核酸生物合成酶 (DNA聚合酶等)的負(fù)電性抑制物等。正電性抑制物的實(shí)例包括鈣離子、多胺和血紅素等。 負(fù)電性抑制物的實(shí)例包括苯酚、苯酚類化合物、肝素和具有外膜的革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁等。 據(jù)說此類抑制核酸擴(kuò)增反應(yīng)的物質(zhì)大量地存在于食品或臨床試驗(yàn)樣品中。上述用于抑制核酸擴(kuò)增抑制物作用的試劑的實(shí)例包括選自白蛋白、葡聚糖、T4噬菌體基因32編碼蛋白、乙酰胺、甜菜堿、二甲基亞砜、甲酰胺、甘油、聚乙二醇、大豆胰蛋白酶抑制劑、α 2-巨球蛋白、四甲基氯化銨、溶菌酶、磷酸化酶和乳酸脫氫酶中的一種或多種。 聚乙二醇的實(shí)例包括聚乙二醇400和聚乙二醇4000。甜菜堿的實(shí)例包括三甲基甘氨酸及其衍生物等。磷酸化酶和乳糖脫氫酶的實(shí)例包括兔肌糖原磷酸化酶和乳糖脫氫酶。作為糖原磷酸化酶，優(yōu)選糖原磷酸化酶b。特別優(yōu)選使用白蛋白、葡聚糖、T4噬菌體基因32編碼蛋白或溶菌酶。作為降低包含于試驗(yàn)樣品(假設(shè)為血液、糞便和肉類)中的核酸擴(kuò)增抑制物的抑制作用的嘗試，評(píng)價(jià)通過向PCR反應(yīng)混合物中添加如上所述的物質(zhì)的抑制作用的降低(Abu Al-Soud, W.等人，Journal of Clinical Microbiology, 38 :4463-4470,2000) 教導(dǎo)存在以下可能典型實(shí)例為BSA (牛血清白蛋白)的白蛋白可通過結(jié)合至核酸擴(kuò)增抑制物如血紅素來降低核酸擴(kuò)增的抑制(如上所述的Abu Al-Soud等人)。此外，認(rèn)為存在兩種可能性，即，T4噬菌體基因32編碼蛋白為單鏈DNA結(jié)合蛋白，其在核酸擴(kuò)增過程中預(yù)先與充當(dāng)模板的單鏈DNA結(jié)合以避免核酸酶對(duì)模板的降解，并且不抑制而是促進(jìn)核酸擴(kuò)增反應(yīng)，或者其與核酸擴(kuò)增抑制物如BSA結(jié)合從而不抑制而是促進(jìn)核酸擴(kuò)增反應(yīng)(如上所述的Abu Al-Soud等人)。此外，進(jìn)一步教導(dǎo)以下可能性BSA、T4噬菌體基因32編碼蛋白和蛋白酶抑制劑與蛋白酶結(jié)合以減少蛋白水解活性，從而最大程度地顯示核酸生物合成酶的作用。事實(shí)上，蛋白酶可保留在牛的乳或血液中，還報(bào)道了一個(gè)實(shí)例，在此情況下，通過添加 BSA或蛋白酶抑制劑(如，大豆胰蛋白酶抑制劑和α 2-巨球蛋白)避免了核酸生物合成酶的分解，核酸擴(kuò)增反應(yīng)有利地進(jìn)行(如上所述的Abu Al-Soud等人)。此外，葡聚糖通常為使用葡萄糖作為原料通過乳酸菌合成的多糖，也有報(bào)道稱類似的多糖和稱為粘蛋白的肽的復(fù)合體粘附至1J腸粘膜上(Ruas-Madiedo, P. , Applied and Environmental Microbiology, 74 :1936-1940,2008)。因此，可估計(jì)葡聚糖預(yù)先吸附到負(fù)電性抑制物(吸附到核酸生物合成酶)或正電性抑制物(吸附到核酸)，然后與這些抑制物結(jié)合。此外，估計(jì)溶菌酶吸附到被認(rèn)為在牛乳中大量存在的核酸擴(kuò)增抑制物(如上所述的 Abu Al-Soud 等人)。綜上所述，如上所述以白蛋白、T4噬菌體基因32編碼蛋白、葡聚糖和溶菌酶為代表的此類物質(zhì)為用于抑制核酸擴(kuò)增抑制物作用的試劑。白蛋白的實(shí)例包括牛血清白蛋白、卵清蛋白、乳清蛋白和人血清白蛋白等。其中， 優(yōu)選牛血清白蛋白。白蛋白可為純化產(chǎn)物，除非降低本發(fā)明的作用，否則白蛋白可包含其他組分如球蛋白。此外，白蛋白還可為分級(jí)產(chǎn)物(fractionation product)。試驗(yàn)樣品(核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液)中白蛋白的濃度，例如，通常為0.0001至1質(zhì)量％，優(yōu)選0.01至1質(zhì)量％， 更優(yōu)選0.2至0.6質(zhì)量％。葡聚糖的實(shí)例包括葡聚糖40和葡聚糖500等。其中，優(yōu)選葡聚糖40。試驗(yàn)樣品 (核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液)中葡聚糖的濃度，例如，通常為1至8%，優(yōu)選1至6%，更優(yōu)選1至 4%。試驗(yàn)樣品(核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液)中T4噬菌體基因32編碼蛋白(如，由Roch A.G.生產(chǎn)的T4噬菌體基因32編碼蛋白，也稱為gp32)的濃度通常為0. 01至1 %，優(yōu)選0. 01 至0. 1%,更優(yōu)選0.01至0. 02%。溶菌酶的實(shí)例包括源于蛋清的溶菌酶。試驗(yàn)樣品(核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液)中溶菌酶的濃度，例如，通常為1至20 μ g/ml，優(yōu)選6至15 μ g/ml，更優(yōu)選9至13 μ g/ml。表面活性劑的實(shí)例包括非離子表面活性劑如曲拉通(Triton，Union Carbide注冊(cè)商標(biāo))、諾乃(Nonidet, Shell)、吐溫(Tween, ICI的注冊(cè)商標(biāo))和玻雷吉(Brij, ICI的注冊(cè)商標(biāo))系列的那些，陰離子表面活性劑如SDS(十二烷基磺酸鈉)，以及陽離子表面活性劑如十八烷基二甲基芐基氯化銨。曲拉通系列表面活性劑的實(shí)例包括曲拉通X-100等，諾乃系列表面活性劑的實(shí)例包括諾乃P-40等，吐溫系列表面活性劑的實(shí)例包括吐溫20、吐溫 40、吐溫60、吐溫80等，玻雷吉系列表面活性劑的實(shí)例包括Bri j56等。核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液中表面活性劑的類型和濃度不特別限定，只要促進(jìn)PCR試劑滲入微生物細(xì)胞并且基本上不抑制核酸擴(kuò)增反應(yīng)即可。具體地，SDS的濃度，例如，通常為0. 0005至0. 01 %、優(yōu)選0. 001至0. 01 %、更優(yōu)選0. 001至0. 005 %，還更優(yōu)選0. 001至 0. 002%。對(duì)于其他表面活性劑，例如，在諾乃P-40的情況下，濃度通常為0. 001至1. 5%、優(yōu)選0. 002至1. 2 %、更優(yōu)選0. 9至1. 1 %。在吐溫20的情況下，濃度通常為0. 001至1. 5 %、 優(yōu)選0.002至1.2%、更優(yōu)選0.9至1. 1%。在Bri j56的情況下，濃度通常為0. 1至1.5%、 優(yōu)選0.4至1.2%、更優(yōu)選0.7至1. 1%。當(dāng)表面活性劑包含在用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的酶溶液中時(shí)，表面活性劑可僅由源于酶溶液的表面活性劑組成，或可進(jìn)一步添加相同類型或不同類型的表面活性劑。鎂鹽的實(shí)例包括氯化鎂、硫酸鎂和碳酸鎂等。試驗(yàn)樣品(核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液)中鎂鹽的濃度，例如，通常為1至10mM、優(yōu)選2至6mM、更優(yōu)選2至5mM。有機(jī)酸鹽的實(shí)例包括檸檬酸、酒石酸、丙酸和丁酸等的鹽。鹽的種類的實(shí)例包括鈉鹽和鉀鹽等。此外，磷酸鹽的實(shí)例包括焦磷酸等的鹽。這些可獨(dú)立使用或其兩種或三種以上作為混合物使用。試驗(yàn)樣品(核酸擴(kuò)增反應(yīng)溶液)中有機(jī)酸鹽或磷酸鹽的濃度，例如，依據(jù)總量通常為0. 1至20mM、優(yōu)選1至10mM、更優(yōu)選1至5mM。常規(guī)方法中，在核酸擴(kuò)增反應(yīng)前進(jìn)行從細(xì)胞的核酸提取，而在本發(fā)明中不進(jìn)行此類核酸提取。從細(xì)胞的核酸提取意指，例如，從由酶學(xué)或物理方法破壞或溶解的細(xì)胞中收集或純化核酸。在本發(fā)明中，不進(jìn)行從細(xì)胞提取核酸的此類處理，例如，通過酶學(xué)或物理方法破壞或溶解細(xì)胞來收集或純化核酸的處理。在用于抑制核酸擴(kuò)增抑制物作用的試劑以及如果需要的其他組分的存在下，通過核酸擴(kuò)增法擴(kuò)增已存在于細(xì)胞中的DNA或RNA的目標(biāo)區(qū)域。作為用于核酸擴(kuò)增的模板，使用微生物細(xì)胞懸浮液或用蛋白質(zhì)降解酶、脂質(zhì)降解酶、糖類降解酶等處理的微生物細(xì)胞懸浮液，不進(jìn)行用于制備模板的核酸的提取。核酸擴(kuò)增法優(yōu)選包括在高溫例如90至95°C、優(yōu)選93至95°C、更優(yōu)選94至95°C下熱變性核酸的步驟。優(yōu)選在微生物細(xì)胞中進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增。在本發(fā)明中，如實(shí)施例所示，在微生物細(xì)胞中極有可能獲得擴(kuò)增。即，推定在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中通過高溫處理來維持細(xì)胞形態(tài)，并且在優(yōu)選的實(shí)施方案中，前述組分的作用，從而染色體DNA保留在細(xì)胞內(nèi)，但由于在微生物的細(xì)胞膜或細(xì)胞壁中形成孔或空隙，因此核酸擴(kuò)增等所需的引物、酶流入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，然后取決于擴(kuò)增產(chǎn)物的基因長(zhǎng)度，一部分?jǐn)U增產(chǎn)物保留在細(xì)胞中或流出細(xì)胞外。 然而，也不能否認(rèn)染色體DNA或RNA的極小部分通過細(xì)胞膜或細(xì)胞壁的孔或空隙流出細(xì)胞外的可能性。在任何情況下，在基本上無細(xì)胞的破壞或溶解的情況下，核酸擴(kuò)增所需的組分如引物流入細(xì)胞、一部分?jǐn)U增產(chǎn)物保留在細(xì)胞中或從細(xì)胞流出，以及染色體DNA或RNA從細(xì)胞流出不包括在“核酸提取”中。此外，盡管不能否定除上述以外的機(jī)制的存在，但是即使在此情況下，所述方法也遵守“不進(jìn)行核酸提取”的定義，只要不進(jìn)行通過例如酶學(xué)或物理方法破壞或溶解細(xì)胞收集或純化核酸的處理即可。
此外，即使當(dāng)從細(xì)胞流出的染色體DNA或RNA充當(dāng)模板，并且在細(xì)胞外發(fā)生核酸擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，如果主要的擴(kuò)增產(chǎn)物形成于細(xì)胞內(nèi)，則可以說核酸擴(kuò)增反應(yīng)“在微生物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行”。具體地，例如，如果80%以上、優(yōu)選90%以上、更優(yōu)選99%以上的擴(kuò)增產(chǎn)物形成于微生物細(xì)胞內(nèi)，可判斷核酸擴(kuò)增反應(yīng)在微生物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。核酸擴(kuò)增法的實(shí)例包括PCR法(White, T. J.等人，Trends Genet.，5，185(1989))、 LAMP 法(環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-Mediated Isothermal Amplification) =Principal and application of novel gene amplification method(LAMP method), Tsugunori Notomi, Toru Nagatani, BIO INDUSTRY, Vol. 18，No. 2，15-23，2001)、SDA 法(鏈置換擴(kuò)增(Strand Displacement Amplification) Edward L.Chan 等 Α Arch. Pathol. Lab. Med.，124 :1649-1652,2000)、LCR 法(連接酶鏈反應(yīng)(Ligase Chain Reaction) =Barany, F.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88，p. 189-193，1991)、TMA 法(轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(T ranscription-Mediated-Amplification) :Sarrazin C.等人’ J. Clin. Microbiol., vol. 39 :pp. 2850-2855(2001)), TRC 法(轉(zhuǎn)錄-反轉(zhuǎn)錄協(xié)同法(Transcription-Reverse Transcription-Concerted method) :Nakaguchi Y. et al. , J.Clin. Microbiol. , vol.42 pp. 4248-4292 (2004)) > HC ^ (雜交捕獲法(Hybrid Capture) =Nazarenko I.，Kobayashi L. et al. ,J. Virol. Methods, vol. 154 :pp. 76-81，2008)和微陣列法(Richard P. Spence 等人，J. Clin. Microbiol.，Vol. 46，No. 5，pp. 1620-1627，2008)等。在本發(fā)明中，盡管 PCR 法是特別優(yōu)選使用的，但核酸擴(kuò)增法不限定于此。在本發(fā)明中，“目標(biāo)區(qū)域”不特別限定，只要選擇可通過使用本發(fā)明的引物的PCR來擴(kuò)增并使待檢測(cè)的微生物能夠檢測(cè)的染色體DNA或RNA的區(qū)域即可，其可取決于目的而適當(dāng)?shù)剡x擇。例如，當(dāng)不同于待檢測(cè)微生物細(xì)胞的類型的細(xì)胞包含于試驗(yàn)樣品中時(shí)，目標(biāo)區(qū)域優(yōu)選包含對(duì)待檢測(cè)微生物特異的序列。進(jìn)一步，取決于目的，目標(biāo)區(qū)域可為包含多種微生物的共有序列的一種目標(biāo)區(qū)域。此外，目標(biāo)區(qū)域可由單一區(qū)域或兩個(gè)以上區(qū)域組成。如果使用適于特異于待檢測(cè)微生物的目標(biāo)區(qū)域的引物對(duì)(primer set)和適于眾多種微生物的染色體DNA的引物對(duì)，則可同時(shí)測(cè)量作為監(jiān)測(cè)對(duì)象的微生物的活細(xì)胞量和眾多種微生物的活細(xì)胞量。目標(biāo)區(qū)域的長(zhǎng)度，例如，通常為50至5000個(gè)核苷酸。用于核酸擴(kuò)增的引物可基于各種核酸擴(kuò)增法的原理來選擇，并不特別限定，只要該引物可特異性擴(kuò)增上述目標(biāo)區(qū)域即可。目標(biāo)區(qū)域的優(yōu)選實(shí)例包括各種特異性基因如5S rRNA基因、16S rRNA基因、23S rRNA基因、tRNA基因和致病基因?？梢詫⑦@些基因的任一或這些基因的任一的一部分作為靶標(biāo)，或可以將延伸至兩種以上基因的區(qū)域作為靶標(biāo)。例如，對(duì)于大腸菌(coliform bacteria)和腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的細(xì)菌而言，可通過使用SEQ ID NOS :1和 2所示的引物對(duì)來擴(kuò)增16SrRNA基因的一部分。進(jìn)一步，可通過使用SEQ ID NOS :3和4所示的引物對(duì)來擴(kuò)增延伸至16S rRNA基因的一部分、tRNA基因和23S rRNA基因的一部分的區(qū)域。在檢測(cè)的目標(biāo)微生物為病原菌時(shí)，目標(biāo)區(qū)域可以是致病基因。致病基因的實(shí)例包括李斯特菌屬細(xì)菌的李斯特菌素0(hlyA)基因；沙門氏菌屬細(xì)菌的腸毒素基因和侵襲基因(invA)；病原性大腸桿菌0-157、046、0-111等的vero細(xì)胞毒素基因；腸桿菌屬細(xì)菌的外膜蛋白A(ompA)基因(阪崎腸桿菌)和大分子合成(MMS)操縱子(阪崎腸桿菌)；軍團(tuán)菌屬細(xì)菌的巨噬-侵入蛋白(mip)基因；副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的耐熱溶血素基因和耐熱類溶血素毒素基因；痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)和腸侵襲性大腸桿菌的ipa基因(invasion plasmid antigen gene，侵襲質(zhì)粒抗原基因)和invE 基因(侵襲基因)；金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)的腸毒素基因；蠟狀芽孢桿菌的嘔吐毒素(cereulide)基因和腸毒素基因和肉毒梭狀芽孢桿菌的各種毒素基因等。此夕卜，致病基因的引物的實(shí)例包括，例如，對(duì)于李斯特菌屬細(xì)菌的hlyA基因?yàn)镾EQ ID NOS 5 和6所示的引物對(duì)；對(duì)于阪崎腸桿菌的ompA基因?yàn)镾EQ ID NOS 7和8所示的引物對(duì)；以及對(duì)于阪崎腸桿菌的匪S操縱子為SEQ ID NOS 9和10所示的引物對(duì)。此外，在具有包膜的流感病毒的情況下，目標(biāo)區(qū)域的實(shí)例包括血凝素(H蛋白)基因和神經(jīng)氨酸酶(N蛋白)基因，杯狀病毒(Calicivirus)科病毒(其典型實(shí)例包括諾如病毒(noroviruses))的RNA聚合酶基因，和編碼各種衣殼蛋白的基因區(qū)域等。作為食物中毒病毒，除了諾如病毒以外，還有輪狀病毒和腺病毒，在諾如病毒的情況下，作為目的基因，其 RNA聚合酶基因和編碼各種衣殼蛋白的基因區(qū)域可用作目標(biāo)區(qū)域。如果使用適于兩種以上微生物的引物，可檢測(cè)試驗(yàn)樣品中兩種以上微生物的活細(xì)胞。此外，如果使用特異于特定細(xì)菌的一種引物或多種引物，可檢測(cè)試驗(yàn)樣品中特定細(xì)菌的活細(xì)胞。核酸擴(kuò)增反應(yīng)的條件不特別限定，只要基于各種核酸擴(kuò)增法(如PCR、LAMP、SDA、 LCR、TMA、TRC、HC、微陣列法等)的原理可特異性地?cái)U(kuò)增核酸即可，并且條件可適當(dāng)?shù)卦O(shè)置。(4)步驟 d)隨后，分析通過核酸擴(kuò)增法所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物的分析在步驟C)后進(jìn)行，或與步驟c)同時(shí)進(jìn)行，取決于步驟c)中所采用的核酸擴(kuò)增法。例如，在使用實(shí)時(shí)PCR 的情況下，步驟d)可與步驟c)同時(shí)進(jìn)行。分析方法不特別限定，只要該方法可檢測(cè)或定量核酸擴(kuò)增產(chǎn)物即可，其實(shí)例包括電泳。注意，對(duì)于核酸擴(kuò)增法在使用PCR法的情況下，可使用實(shí)時(shí)PCR法(ogva等人， Appl. Environ. Microbiol. , vol. 66, 2000, pp. 4266-4271 ；Nogva 等人’ Appl. Environ. Microbiol.，vol. 66，2000，pp.4029—4036)。電泳能夠評(píng)價(jià)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的量和大小。此外，實(shí)時(shí)PCR能夠快速定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。在采用實(shí)時(shí)PCR的情況下，如果擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)在1至10的范圍內(nèi)，則熒光強(qiáng)度的變化通常為噪音級(jí)(noise level)并在零左右。因此，所述強(qiáng)度被認(rèn)為是不包含擴(kuò)增產(chǎn)物的空白樣品。計(jì)算變化的標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，通過將SD值乘以10所獲得的值定義為閾值。將第一次實(shí)現(xiàn)大于閾值的值的PCR循環(huán)數(shù)稱為“循環(huán)閾值(Ct值)”。因此，在PCR反應(yīng)液中DNA 模板的起始量越大，Ct值越小，而模板DNA的量越小，Ct值越大。即使模板DNA的量相等， 在對(duì)于該區(qū)域的PCR反應(yīng)中，PCR的目標(biāo)區(qū)域已切割的模板比例越高，Ct值越大。此外，擴(kuò)增產(chǎn)物的有無還可通過分析擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度(TM)譜(melting temperature pattern) : 石角胃。所有前述方法還可用于優(yōu)化本發(fā)明方法的各種條件。當(dāng)通過本發(fā)明的方法檢測(cè)微生物的活細(xì)胞時(shí)，在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析中確定微生物活細(xì)胞有無及其定量的精度可通過使用標(biāo)準(zhǔn)曲線來增加，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線表示微生物的量和擴(kuò)增產(chǎn)物之間的關(guān)系并通過使用微生物標(biāo)準(zhǔn)樣品(其中微生物已鑒定)來制備。盡管可使用初步制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線，但優(yōu)選對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品與試驗(yàn)樣品同時(shí)通過進(jìn)行本發(fā)明方法的步驟來制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線。此外，如果事先已確定了微生物的量與DNA或RNA的量之間的關(guān)系，則從微生物中分離的DNA或RNA也可用作標(biāo)準(zhǔn)樣品。<2>本發(fā)明的試劑盒本發(fā)明的試劑盒為利用核酸擴(kuò)增法通過識(shí)別活細(xì)胞與死細(xì)胞或損傷細(xì)胞來檢測(cè)試驗(yàn)樣品中微生物的活細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒包括通過用具有350nm至700nm波長(zhǎng)的光照射能夠共價(jià)結(jié)合DNA或RNA的試劑、用于抑制核酸擴(kuò)增抑制物作用的試劑以及通過核酸擴(kuò)增法擴(kuò)增待檢測(cè)微生物的DNA或RNA的目標(biāo)區(qū)域的一種或多種引物。本發(fā)明的試劑盒可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。此外，本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)一步包括選自表面活性劑、鎂鹽和有機(jī)酸鹽或磷酸鹽中的任何一種或多種。此外，本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)一步包括具有分解存在于試驗(yàn)樣品中的除微生物細(xì)胞以外的細(xì)胞、蛋白質(zhì)膠粒、脂質(zhì)或糖類的活性的酶。酶、能夠共價(jià)結(jié)合DNA或RNA的試劑和用于抑制核酸擴(kuò)增抑制物作用的試劑，以及如需要時(shí)的表面活性劑、鎂鹽和有機(jī)酸鹽或磷酸鹽，可為包含所有這些組分的單一組合物的形式，或包含任意組合的組分的兩種或多種溶液或組合物的形式。核酸擴(kuò)增反應(yīng)優(yōu)選PCR、LAMP、SDA、LCR、TMA, TRC、HC或微陣列法。試劑盒中的交聯(lián)劑和培養(yǎng)基與本發(fā)明的方法所述的交聯(lián)劑和培養(yǎng)基相同。在本發(fā)明的試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方案中，能夠共價(jià)結(jié)合DNA或RNA的試劑優(yōu)選選自單疊氮乙錠、雙疊氮乙錠、單疊氮丙錠、補(bǔ)骨脂素、4，5'，8-三甲基補(bǔ)骨脂素和8-甲氧基補(bǔ)骨脂素。特別優(yōu)選使用單疊氮乙錠。此外，用于抑制核酸擴(kuò)增抑制物作用的試劑的實(shí)例包括選自白蛋白、葡聚糖、T4噬菌體基因32編碼蛋白、乙酰胺、甜菜堿、二甲基亞砜、甲酰胺、甘油、聚乙二醇、大豆胰蛋白酶抑制劑、α 2-巨球蛋白、四甲基氯化銨、溶菌酶、磷酸化酶和乳酸脫氫酶中的一種或多種。此外，鎂鹽的實(shí)例包括氯化鎂、硫酸鎂和碳酸鎂等。此外，有機(jī)酸鹽的實(shí)例包括檸檬酸、酒石酸、丙酸和丁酸等的鹽。鹽的種類的實(shí)例包括鈉鹽和鉀鹽等。此外，磷酸鹽的實(shí)例包括焦磷酸的鹽等。這些可獨(dú)立使用或以其兩種或三種以上的混合物使用。此外，所述酶不特別限定，只要其可降解存在于試驗(yàn)樣品中的異物如除微生物以外的細(xì)胞、蛋白質(zhì)膠粒、脂質(zhì)和糖類，并且不損害待檢測(cè)微生物的活細(xì)胞即可，所述酶的實(shí)例包括脂質(zhì)降解酶、蛋白質(zhì)降解酶和糖類降解酶。其中，可使用一種酶或兩種以上酶，但優(yōu)選使用脂質(zhì)降解酶和蛋白質(zhì)降解酶二者，或脂質(zhì)降解酶、蛋白質(zhì)降解酶和糖類降解酶全部。脂質(zhì)降解酶的實(shí)例包括脂肪酶和磷酸酶等，蛋白質(zhì)降解酶的實(shí)例包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、蛋白酶K和鏈霉蛋白酶等，以及糖類降解酶的實(shí)例包括淀粉酶和纖維素酶等。本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)一步包括稀釋液、能夠共價(jià)結(jié)合DNA或RNA的試劑的反應(yīng)用反應(yīng)液、核酸擴(kuò)增用酶和反應(yīng)液以及描述本發(fā)明的方法的說明書等。實(shí)施例
在下文中，參考以下實(shí)施例更具體地描述本發(fā)明。然而，本發(fā)明不受限于這些實(shí)施例。[實(shí)施例1]通過使用阪崎腸桿菌作為大腸菌的典型細(xì)菌，檢測(cè)用于明確識(shí)別活細(xì)胞和死細(xì)胞的條件。1.試驗(yàn)材料和培養(yǎng)方法1-1)使用菌株和培養(yǎng)方法在37°C下通過使用腦心浸液肉湯(Brain Heart Infusion Broth) (BHI肉湯 Eiken Chemical Co. , Ltd. , Tokyo, Japan)培養(yǎng)阪崎腸桿菌 ATCC513^ 16 個(gè)小時(shí)。將 5ml 體禾只培養(yǎng)肉湯(culture broth)放入 15ml falcon 管(Becton Dickinson Labware, NJ) 中，并在4°C和3，000XG下進(jìn)行冷凍離心10分鐘，除去上清液，然后向沉淀物添加5ml生理鹽水從而制備阪崎腸桿菌的活細(xì)胞懸浮液原液(stock) (8. 95士0. 01 Iogltl細(xì)胞/ml，η = 2)。進(jìn)一步，用生理鹽水將該活細(xì)胞懸浮液稀釋10倍從而制備阪崎腸桿菌的活細(xì)胞懸浮液 (7. 95士0. 01 Iog10 細(xì)胞 /ml，η = 2)。進(jìn)一步，將Iml前述活細(xì)胞懸浮液原液放入1. 5ml體積的小離心管(microtube) (Eppendorf，Hamburg, Germany)，將管浸入沸水50秒并急冷(quench)，證實(shí)此后的細(xì)菌在標(biāo)準(zhǔn)瓊脂培養(yǎng)基(Eiken，Tokyo，Japan)上不形成任何菌落，從而制備阪崎腸桿菌的損傷細(xì)胞懸浮液原液。在標(biāo)準(zhǔn)瓊脂培養(yǎng)基上對(duì)活細(xì)胞懸浮液中阪崎腸桿菌的活細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)，同時(shí)通過使用分光光度計(jì)UjSOOA (Hitachi，Japan)在600nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比濁法從而計(jì)算出活細(xì)胞數(shù)與濁度間的關(guān)系。進(jìn)一步，用市售巴氏消毒牛乳將活細(xì)胞懸浮液原液稀釋10倍從而制備阪崎腸桿菌的活細(xì)胞乳懸液(7. 95士0. 01 Iog10細(xì)胞/ml, η = 2)。此外，用市售巴氏消毒牛乳將損傷細(xì)胞懸浮液原液稀釋10倍從而制備阪崎腸桿菌的損傷細(xì)胞乳懸液(7. 95士0. 01 Iog10細(xì)胞/ml, η = 2)。1-2)單疊氮乙錠(EMA)處理和光照處理用無菌水將單疊氮乙錠(EMA, Sigma, St. Louis, MO)溶解為1000yg/ml，并用 0. 20 μ m 的過濾器(Minisart-plus, Sartorius AG, Gottingen, Germany)進(jìn)行過濾滅菌從而制備原液，該原液在-20°C下避光保存。將體積為10 μ 1的EMA溶液(1000 μ g/ml)加入阪崎腸桿菌的活細(xì)胞和損傷細(xì)胞的懸浮液(Iml)中，將懸浮液于4°C下避光靜置10分鐘。然后，懸浮液置于距可見光源(100V PRF 500W Flood eye, Iwasaki Electric Co. ，Ltd. ，Tokyo, Japan) 20cm W^S,
用光照射5分鐘。在4°C和15，000XG下將各EMA處理的樣品進(jìn)行冷凍離心10分鐘，除去上清液，然后加入Iml生理鹽水洗滌沉淀物，向沉淀(細(xì)胞)加入10 μ 1無菌水以在無菌水中懸浮細(xì)胞，使用5μ 1懸浮液作為PCR擴(kuò)增用樣品。通過以下方法使阪崎腸桿菌的活細(xì)胞和損傷細(xì)胞乳懸液(Iml)進(jìn)行EMA處理和光照射處理。首先，在4°C和15，000XG下使各阪崎腸桿菌的活細(xì)胞和損傷細(xì)胞乳懸液(Iml) 進(jìn)行冷凍離心10分鐘，除去上清液，然后加入Iml生理鹽水。添加體積為3μ 1的蛋白酶 (源于芽孢桿菌屬細(xì)菌，Sigma)從而在37°C下用蛋白酶處理細(xì)胞1小時(shí)，然后使懸浮液進(jìn)行冷凍離心G°C，15，000XG, 10分鐘)，除去上清液，添加Iml生理鹽水，然后避光添加10 μ IEMA溶液(ΙΟΟΟμ g/ml)。此后所使用的方法與前述“阪崎腸桿菌的活細(xì)胞和損傷細(xì)胞懸浮液(1ml)”所描述的方法相同。1-3) PCR 擴(kuò)增向5 μ 1 PCR擴(kuò)增用樣品中添加包括二水合檸檬酸三鈉(TSC，Kanto，Kagaku)和六水氯化鎂(Nakarai-Tesque)的試劑和進(jìn)一步包含選自牛血清白蛋白(BSA，Sigma)、葡聚糖 (低分子，M. W. :50,000 至 70，000, Nakarai-Tesque)、T4 噬菌體基因 32 編碼蛋白(gp32, Nippon Gene)、十二烷基硫酸鈉(SDS, Nakarai-Tesque), Bri j56 (Sigma)和蛋清溶菌酶 (Wako pure chemical Industries)中的一種或多種的試劑。添加到PCR擴(kuò)增用樣品并具有各組成的各試劑還可稱為預(yù)處理劑。以下示出預(yù)處理劑的組成。組成1 2% BSA :5μ 150mM TSC 1 μ 1IOOmM MgCl2 :1· 5μ 10. 05% SDS :1 μ 1組成2 2% BSA :5 μ 150mM TSC 1 μ 1IOOmM MgCl2 :1· 5μ 1組成3:20%葡聚糖2. 5μ150mM TSC 1 μ 1IOOmM MgCl2 :1· 5μ 1組成4 0. 1% gp32 :5 μ 150mM TSC 1 μ 1IOOmM MgCl2 :1· 5μ 1組成5 2% BSA 5 μ 150mM TSC 1 μ 1IOOmM MgCl2 :1· 5μ 14% Brij56 :12. 6μ 1組成6 2% BSA :5μ 150mM TSC 1 μ 1IOOmM MgCl2 :1· 5μ 1500 μ g/ml 蛋清溶菌酶1. 0 μ 1組成7 2% BSA :5μ 150mM TSC 1 μ 1
IOOmM MgCl2 :1. 5μ 10. 05% SDS :1 μ 14% Brij56 :12. 6μ 1500 μ g/ml 蛋清溶菌酶1. 0 μ 1組成8 2% BSA :5μ 150mM TSC 1 μ 1IOOmM MgCl2 :1. 5μ 14% Brij56 :12. 6μ 1500yg/ml 蛋清溶菌酶1.0μ 1組成9 2% BSA :5μ 1組成10 僅由下述組分a)至g)組成的PCR緩沖液，不包含組成1至9的組分對(duì)于PCR擴(kuò)增，使用引物F 用于16S rRNA基因檢測(cè)的正向引物 16S_10F(5' -AGTTTGATCCTGGCTC-3 ‘，SEQ ID NO 1)和引物 R 用于 16S rRNA 基因檢測(cè)的反向引物 16S_1500R(5' -GGCTACCTTGTTACGA-3‘，SEQ ID NO 2)作為 PCR 引物。進(jìn)一步，為了在實(shí)時(shí)PCR后的擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈分析(melt analysis)中使取決于溫度的熒光物質(zhì)量的變化最大化(引物微分峰)從而進(jìn)行高靈敏度檢測(cè)，制備了由以下組分 a)至g)組成的PCR緩沖液，并通過向PCR擴(kuò)增用樣品和預(yù)處理劑的混合物中添加該P(yáng)CR緩沖液來進(jìn)行PCR擴(kuò)增。前述引物的靶標(biāo)為包括16S rRNA基因的第10至第1500位核苷酸的長(zhǎng) DNA(1491bp)。a)弓I物 F(10pmol/y 1) :4μ 1b)引物 R(10pmol/y 1) :4μ 1 c) Ex-Taq (5U/ μ 1, Takara-Bio) 0. 5 μ 1(包含0·5%吐溫20、0· 5%諾乃Ρ-40和50%甘油)d) 10 X Ex-iTaq 緩沖液(Takara-Bio) :5 μ 1e)dNTP 混合物(Takara-Bio) :4 μ 1f) 10 X SYBR Green I (BMA) :8 μ 1g)無菌水為獲得包括PCR擴(kuò)增用樣品5 μ 1和預(yù)處理劑的55 μ 1總體積所需的體積通過使用實(shí)時(shí)PCR 裝置(iCycler iQ，Bio-feid，Hercules，CA)根據(jù)以下 PCR 熱循環(huán)條件進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。1)4°C 3分鐘(1個(gè)循環(huán))2) 94 "C 30 秒(1 個(gè)循環(huán))3) 94"C 20 秒；55°C 30 秒；72°C 1 分鐘 30 秒(50 個(gè)循環(huán))4) 95 0C 3 分鐘(1 個(gè)循環(huán))然后，根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈分析方案(每隔0. 1°C從60°C升高溫度，各溫度維持8秒并重復(fù)該過程總計(jì)350次，至最終溫度95°C度)，測(cè)定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度。作為陽性對(duì)照，使用阪崎腸桿菌的8 Iogltl細(xì)胞/ml活細(xì)胞懸浮液。進(jìn)一步，作為空白樣品，將無任何添加的PCR緩沖液本身用于PCR。2.結(jié)果實(shí)時(shí)PCR的結(jié)果示于表1。表1中使用的符號(hào)a)至f)表示以下內(nèi)容。此外，用于預(yù)處理劑的“Lyso”意指蛋清溶菌酶。a)阪崎腸桿菌的活細(xì)胞數(shù)和損傷細(xì)胞數(shù)7. 95士0. 01 Iogltl細(xì)胞/ml (生理鹽水和市售巴氏消毒牛乳中)b)通過將活細(xì)胞浸入沸水50秒制備的損傷細(xì)胞c)意指無EMA處理d)EMA處理(10 μ g/mlUO分鐘、4°C避光)+可見光照射(5分鐘)e)用平均值士SD(n = 2)表示的實(shí)時(shí)PCR的Ct值f)nd意指通過實(shí)時(shí)PCR未獲得目標(biāo)基因的擴(kuò)增表 權(quán)利要求
1.一種通過識(shí)別活細(xì)胞與死細(xì)胞或損傷細(xì)胞來檢測(cè)試驗(yàn)樣品中微生物的活細(xì)胞的方法，其包括以下步驟a)向所述試驗(yàn)樣品添加通過用具有350nm至700nm波長(zhǎng)的光照射能夠共價(jià)結(jié)合至DNA 或RNA的試劑；b)用具有350nm至700nm波長(zhǎng)的光照射添加了所述試劑的所述試驗(yàn)樣品；c)在用于抑制核酸擴(kuò)增抑制物作用的試劑的存在下，通過核酸擴(kuò)增法，在不從所述細(xì)胞提取核酸的情況下擴(kuò)增包含于所述試驗(yàn)樣品的所述微生物的DNA或RNA的目標(biāo)區(qū)域；和d)分析擴(kuò)增產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在微生物細(xì)胞中進(jìn)行所述目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，在步驟c)中，在選自表面活性劑、鎂鹽和有機(jī)酸鹽或磷酸鹽中的一種或多種的存在下進(jìn)行所述目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的方法，其中，在步驟c)之前，重復(fù)進(jìn)行步驟a)和b)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的方法，其中，在步驟a)之前，進(jìn)行以下步驟e)e)用存在于所述試驗(yàn)樣品中的具有分解除微生物細(xì)胞以外的細(xì)胞、蛋白質(zhì)膠粒、脂質(zhì)或糖類的活性的酶處理所述試驗(yàn)樣品。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述酶選自蛋白質(zhì)降解酶、脂質(zhì)降解酶和糖類降解酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的方法，其中所述試驗(yàn)樣品為食品、生物樣品、飲用水、工業(yè)用水、環(huán)境用水、廢水、土壤和抽汲樣品的任一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的方法，其中所述微生物為細(xì)菌或病毒。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述細(xì)菌為革蘭氏陰性菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)所述的方法，其中通過用具有350nm至700nm波長(zhǎng)的光照射能夠共價(jià)結(jié)合至DNA或RNA的所述試劑選自單疊氮乙錠、雙疊氮乙錠、單疊氮丙錠、補(bǔ)骨脂素、4，5'，8-三甲基補(bǔ)骨脂素和8-甲氧基補(bǔ)骨脂素。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)所述的方法，其中用于抑制核酸擴(kuò)增抑制物作用的所述試劑為選自白蛋白、葡聚糖、T4噬菌體基因32編碼蛋白、乙酰胺、甜菜堿、二甲基亞砜、甲酰胺、甘油、聚乙二醇、大豆胰蛋白酶抑制劑、α 2-巨球蛋白、四甲基氯化銨、溶菌酶、磷酸化酶和乳酸脫氫酶中的一種或多種。
12.根據(jù)權(quán)利要求2至11任一項(xiàng)所述的方法，其中所述有機(jī)酸鹽選自乙酸鹽、丙酸鹽和檸檬酸鹽。
13.根據(jù)權(quán)利要求2至12任一項(xiàng)所述的方法，其中所述磷酸鹽為焦磷酸鹽。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13任一項(xiàng)所述的方法，其中所述目標(biāo)區(qū)域?yàn)?0至5，000個(gè)核苷酸的目標(biāo)區(qū)域。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述目標(biāo)區(qū)域?yàn)橄鄳?yīng)于選自所述試驗(yàn)樣品的 DNA的5S rRNA基因、16S rRNA基因、23S rRNA基因和tRNA基因中的基因的目標(biāo)區(qū)域。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至15任一項(xiàng)所述的方法，其中所述核酸擴(kuò)增法為PCR、RT-PCR、 LAMP、SDA、LCR、TMA, TRC、HC 或微陣列法。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述PCR作為實(shí)時(shí)PCR來進(jìn)行，從而同時(shí)進(jìn)行PCR和所述擴(kuò)增產(chǎn)物的分析。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至17任一項(xiàng)所述的方法，其中通過使用表示所述微生物的量和所述擴(kuò)增產(chǎn)物之間的關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線來進(jìn)行所述擴(kuò)增產(chǎn)物的分析，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線通過使用所述微生物的標(biāo)準(zhǔn)樣品建立。
19.一種用于通過核酸擴(kuò)增法識(shí)別所述活細(xì)胞與死細(xì)胞或損傷細(xì)胞來檢測(cè)試驗(yàn)樣品中微生物的活細(xì)胞的試劑盒，其包括以下組分1)通過用具有350nm至700nm波長(zhǎng)的光照射能夠共價(jià)結(jié)合至DNA或RNA的試劑；2)用于抑制核酸擴(kuò)增抑制物作用的試劑；和3)一種或多種用于通過核酸擴(kuò)增法擴(kuò)增待檢測(cè)的微生物的DNA或RNA的目標(biāo)區(qū)域的引物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括選自表面活性劑、鎂鹽和有機(jī)酸鹽或磷酸鹽的一種或多種。
21.根據(jù)權(quán)利要求19或20所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括具有分解存在于所述試驗(yàn)樣品中的除微生物細(xì)胞以外的細(xì)胞、蛋白質(zhì)膠粒、脂質(zhì)或糖類的活性的酶。
22.根據(jù)權(quán)利要求19至21任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述核酸擴(kuò)增法為PCR、RT-PCR、 LAMP、SDA, LCR、TMA, TRC, HC 或微陣列法。
23.根據(jù)權(quán)利要求19至22任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中通過用具有350nm至700nm波長(zhǎng)的光照射能夠共價(jià)結(jié)合至DNA或RNA的所述試劑選自單疊氮乙錠、雙疊氮乙錠、單疊氮丙錠、補(bǔ)骨脂素、4，5'，8-三甲基補(bǔ)骨脂素和8-甲氧基補(bǔ)骨脂素。
24.根據(jù)權(quán)利要求19至23任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中用于抑制核酸擴(kuò)增抑制物作用的所述試劑為選自白蛋白、葡聚糖、T4噬菌體基因32編碼蛋白、乙酰胺、甜菜堿、二甲基亞砜、 甲酰胺、甘油、聚乙二醇、大豆胰蛋白酶抑制劑、α 2-巨球蛋白、四甲基氯化銨、溶菌酶、磷酸化酶和乳酸脫氫酶中的一種或多種。
25.根據(jù)權(quán)利要求20至M任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述有機(jī)酸鹽選自乙酸鹽、丙酸鹽和檸檬酸鹽。
26.根據(jù)權(quán)利要求20至25任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述磷酸鹽為焦磷酸鹽。
27.根據(jù)權(quán)利要求21至26任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述酶選自蛋白質(zhì)降解酶、脂質(zhì)降解酶和糖類降解酶。
全文摘要
將試驗(yàn)樣品中微生物的活細(xì)胞與死細(xì)胞或損傷細(xì)胞相區(qū)別并借助以下步驟來檢測(cè)步驟(a)其中向所述試驗(yàn)樣品中添加藥物學(xué)制劑，當(dāng)用具有波長(zhǎng)50至700nm的光照射時(shí)所述藥物學(xué)制劑與DNA或RNA共價(jià)結(jié)合；步驟(b)其中用具有波長(zhǎng)350至700nm的光照射添加有交聯(lián)劑的所述試驗(yàn)樣品；步驟(c)其中在抑制核酸擴(kuò)增抑制劑作用的藥物學(xué)制劑的存在下，通過使用核酸擴(kuò)增方法，在不從所述細(xì)胞中提取核酸的情況下擴(kuò)增所述試驗(yàn)樣品中的所述微生物的DNA或RNA的目標(biāo)區(qū)域；以及步驟(d)其中分析由此獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物。
文檔編號(hào)C12N15/09GK102471768SQ20108003315
公開日2012年5月23日 申請(qǐng)日期2010年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月24日
發(fā)明者副島隆志, 弗蘭克·施利特-迪特里希 申請(qǐng)人:森永乳業(yè)株式會(huì)社