專利名稱：通過(guò)抑制針對(duì)重編程因子的天然反義轉(zhuǎn)錄物來(lái)治療重編程因子相關(guān)的疾病的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)要求保護(hù)提交于2009年5月18日的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)61/179，056、提交于2009年8月14日的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/233，996號(hào)和提交于2009年12月16日的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/286，852號(hào)的優(yōu)先權(quán)，所述申請(qǐng)通過(guò)引用以其整體結(jié)合于本文中。本發(fā)明的實(shí)施方案包括調(diào)節(jié)重編程因子(Iteprogramming factor)和相關(guān)分子的表達(dá)和/或功能的寡核苷酸。
背景技術(shù)：
DNA-RNA和RNA-RNA雜交對(duì)于核酸功能的許多方面(包括DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯) 而言為重要的。雜交對(duì)于探測(cè)特定核酸或者改變其表達(dá)的各種技術(shù)而言亦為主要的。反義核苷酸例如通過(guò)與靶RNA雜交來(lái)擾亂基因表達(dá)，從而干擾RNA剪接、轉(zhuǎn)錄、翻譯和復(fù)制。 反義DNA具有附加的特征，該特征為DNA-RNA雜合體充當(dāng)核糖核酸酶H消化的底物，該活性存在于大多數(shù)細(xì)胞類型中?？蓪⒎戳x分子遞送到細(xì)胞中，這與寡脫氧核苷酸(ODN)的情況一樣，或者它們?nèi)鏡NA分子一樣可由內(nèi)源基因表達(dá)。FDA最近批準(zhǔn)了一種反義藥物， VITRAVENE (用于治療巨細(xì)胞病毒視網(wǎng)膜炎)，這反映了反義物具有治療應(yīng)用。發(fā)明概述在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過(guò)使用靶定天然反義轉(zhuǎn)錄物的任何區(qū)域的反義寡核苷酸來(lái)抑制天然反義轉(zhuǎn)錄物的作用，引起相應(yīng)有義基因的增量調(diào)節(jié)的方法。本文也考慮天然反義轉(zhuǎn)錄物的抑制可通過(guò)siRNA、核酶和小分子來(lái)達(dá)到，認(rèn)為所述siRNA、核酶和小分子在本發(fā)明的范圍之內(nèi)?！獋€(gè)實(shí)施方案提供在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中重編程因子多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括用長(zhǎng)度為5-30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸所述細(xì)胞或組織，其中所述寡核苷酸與以下多核苷酸的反向互補(bǔ)序列具有至少50%的序列同一性，所述多核苷酸包含在SEQ ID N0:4的核苷酸1-993、SEQ ID NO :5的核苷酸1-493和SEQ ID NO 6的核苷酸1-418之內(nèi)的5_30個(gè)連續(xù)核苷酸；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中重編程因子多核苷酸的功能和/或表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸靶定重編程因子多核苷酸的天然反義序列，例如 SEQ ID NO :4-6所述的核苷酸，以及其任何變體、等位基因、同源物、突變體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。反義寡核苷酸的實(shí)例如SEQ ID NO :7-17所述。另一個(gè)實(shí)施方案提供在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中重編程因子多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括用長(zhǎng)度為5-30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸所述細(xì)胞或組織，其中所述寡核苷酸與重編程因子多核苷酸的反義物的反向互補(bǔ)序列具有至少 50%的序列同一性；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中重編程因子多核苷酸的功能和/或表達(dá)。另一個(gè)實(shí)施方案提供在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中重編程因子多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括用長(zhǎng)度為5-30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸所述細(xì)胞或組織，其中所述寡核苷酸與重編程因子反義多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少50% 的序列同一性；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中重編程因子多核苷酸的功能和/ 或表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含一種或多種與有義和/或反義重編程因子多核苷酸結(jié)合的反義寡核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述寡核苷酸包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾或取代的核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述寡核苷酸包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的鍵。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述修飾核苷酸包含經(jīng)修飾的堿基，其包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸、2’ -0-甲基、氟-或碳、亞甲基或其他鎖定核酸(LNA)分子。優(yōu)選地，所述修飾核苷酸為鎖定核酸分子，包括a-L-LNA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將所述寡核苷酸經(jīng)皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)給予患者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將所述寡核苷酸在藥物組合物中給予。治療方案包括至少一次向患者給予反義化合物；然而，可將此治療修改成在一段時(shí)間內(nèi)包含多次給藥。所述治療可與一種或多種其它類型的療法組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將所述寡核苷酸封裝到脂質(zhì)體中或附著于載體分子(例如膽固醇、TAT肽)。其它方面描述于下文。附圖
簡(jiǎn)述圖 1圖IA為實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的圖表，顯示相比于對(duì)照，用硫代磷酸寡核苷酸處理H印G2 細(xì)胞后S0X2mRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)偏差，所述硫代磷酸寡核苷酸使用Lipof ectamine 2000 引入。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞中S0X2mRNA的水平在用針對(duì)S0X2反義物AI885646 設(shè)計(jì)的兩種siRNA處理后4 顯著增加。表示為⑶R-0404和⑶R-0406的條分別對(duì)應(yīng)用 SEQ ID NO :7和8處理的樣品。圖IB為實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的圖表，顯示相比于對(duì)照，用硫代磷酸寡核苷酸處理H印G2 細(xì)胞后KLF4mRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)偏差，所述硫代磷酸寡核苷酸使用Lipof ectamine 2000 引入。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示HepG2細(xì)胞中KLF4mRNA的水平在用針對(duì)KLF4反義物設(shè)計(jì)的兩種寡核苷酸處理后48h顯著增加。表示為CUR-0993、CUR-0931、CUR-0930和CUR-0932的條分別對(duì)應(yīng)用SEQ ID NO 9-12處理的樣品。圖IC為實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的圖表，顯示相比于對(duì)照，用硫代磷酸寡核苷酸處理H印G2 細(xì)胞后P0U5FlmRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)偏差，所述硫代磷酸寡核苷酸使用Lipofectamine 2000引入。表示為CUR-1139至CUR-1143的條分別對(duì)應(yīng)用SEQ ID NO :13-17處理的樣品。發(fā)明詳述參考用于說(shuō)明的示例應(yīng)用在下文中描述本發(fā)明的數(shù)個(gè)方面。應(yīng)當(dāng)理解的是，陳述許多具體細(xì)節(jié)、關(guān)系和方法來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的充分理解。然而，在相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將容易地認(rèn)識(shí)到，可在不含一個(gè)或多個(gè)具體細(xì)節(jié)的情況下實(shí)施本發(fā)明或者可用其他方法來(lái)實(shí)施本發(fā)明。本發(fā)明不受行為或事件的排序限制，因?yàn)橐恍┬袨榭梢圆煌捻樞蜻M(jìn)行和/ 或與其他行為或事件同時(shí)進(jìn)行。此外，并非所有說(shuō)明性的行為或事件對(duì)實(shí)施本發(fā)明的方法都為必需的。
本文公開(kāi)的所有基因、基因名稱和基因產(chǎn)物意圖對(duì)應(yīng)來(lái)自任何物種的同源物，對(duì)該物種而言本文公開(kāi)的組合物和方法為適用的。因此，該術(shù)語(yǔ)包括但不限于來(lái)自人和小鼠的基因和基因產(chǎn)物。理解的是，當(dāng)公開(kāi)來(lái)自具體物種的基因或基因產(chǎn)物時(shí)，意圖此公開(kāi)僅為示范性的，并且除非其出現(xiàn)的文段中明確指示，否則不應(yīng)理解為限制。因此，例如，對(duì)于本文公開(kāi)的在一些實(shí)施方案中有關(guān)哺乳動(dòng)物核酸和氨基酸序列的基因而言，意圖包括來(lái)自其他動(dòng)物(包括但不限于其他哺乳動(dòng)物、魚(yú)類、兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物和鳥(niǎo)類)的同源和/或直向同源基因和基因產(chǎn)物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述基因或核酸序列為人的。定義本文所用的術(shù)語(yǔ)僅以描述具體的實(shí)施方案為目的而不意圖限制本發(fā)明。除非文段另有明確指示，否則本文所用的單數(shù)形式“一”、“一個(gè)”和“所述”也意圖包括復(fù)數(shù)形式。此外，就術(shù)語(yǔ)“包括的”、“包括”、“具有的”、“具有”、“含有”或其變型在詳述和/或權(quán)利要求中所用的程度而言，這類術(shù)語(yǔ)意圖以類似于術(shù)語(yǔ)“包含”的方式是包括在內(nèi)的。術(shù)語(yǔ)“約”或“大約”意為在由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所確定的具體值的可接受誤差范圍之內(nèi)，這部分取決于該值是如何測(cè)定或確定的，即，測(cè)量系統(tǒng)的限制。例如，按照本領(lǐng)域的實(shí)踐，“約”可意為在1之內(nèi)或大于1的標(biāo)準(zhǔn)偏差。或者，“約”可意為高達(dá)給定值的20%， 優(yōu)選10%，更優(yōu)選5%，和還更優(yōu)選1 %的范圍。或者，具體地關(guān)于生物系統(tǒng)或過(guò)程，該術(shù)語(yǔ)可意為在值的數(shù)量級(jí)之內(nèi)，優(yōu)選在值的5倍之內(nèi)，更優(yōu)選在2倍之內(nèi)。當(dāng)本申請(qǐng)和權(quán)利要求描述具體值時(shí)，除非另作說(shuō)明，否則應(yīng)假設(shè)術(shù)語(yǔ)“約”意為在具體值的可接受誤差范圍之內(nèi)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“mRNA”意為目前已知的靶定基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物，以及任何可闡明的其它轉(zhuǎn)錄物。 “反義寡核苷酸”或“反義化合物”意為與另一個(gè)RNA或DNA (靶RNA、DNA)結(jié)合的 RNA或DNA分子。例如，如果其為RNA寡核苷酸，則其通過(guò)RNA-RNA相互作用結(jié)合另一個(gè)RNA 靶標(biāo)并改變靶RNA的活性(Eguchi等，(1991) Ann. Rev. Biochem. 60，631-652)。反義寡核苷酸可增量調(diào)節(jié)或減量調(diào)節(jié)特定多核苷酸的表達(dá)和/或功能。該定義意在包括從治療、診斷或其他觀點(diǎn)來(lái)看有用的任何外源RNA或DNA分子。這類分子包括例如反義RNA或DNA分子、 干擾RNA(RNAi)、微小RNA、誘餌RNA分子、siRNA、酶促RNA、治療用編輯RNA(therapeutic editing RNA)以及激動(dòng)劑和拮抗劑RNA、反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部指導(dǎo)序列 (EGS)寡核苷酸、可變剪接物(alternate splicer)、引物、探針以及其他與靶核酸的至少一部分雜交的寡聚化合物。因此，可將這些化合物以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環(huán)狀寡聚化合物的形式引入。在本發(fā)明的文段中，術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA) 或其模擬物的寡聚物或聚合物。術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”，也包括天然和/或經(jīng)修飾單體或鍵 (linkage)的線性或環(huán)狀寡聚體，包括脫氧核糖核苷、核糖核苷、其取代和α-異頭物形式、 肽核酸(PNA)、鎖定核酸(LNA)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等。寡核苷酸能夠通過(guò)單體與單體相互作用的規(guī)律模式(例如沃森-克里克(Watson-Crick)型堿基配對(duì)、Hoijgsteen或反 Ho0gsteen型堿基配對(duì)等)特異地結(jié)合靶多核苷酸。寡核苷酸可為“嵌合的”，即，由不同的區(qū)組成。在本發(fā)明的文段中，“嵌合的”化合物為寡核苷酸，其包含兩個(gè)或更多個(gè)化學(xué)區(qū)，例如，DNA區(qū)、RNA區(qū)、PNA區(qū)等。每個(gè)化學(xué)區(qū)由至少一個(gè)單體單元(即，在寡核苷酸化合物的情況下為核苷酸)組成。這些寡核苷酸典型地包含至少一個(gè)區(qū)，其中所述寡核苷酸為經(jīng)修飾的以表現(xiàn)出一種或多種所需特性。寡核苷酸的所需特性包括但不限于，例如增強(qiáng)的對(duì)核酸酶降解的抗性、增強(qiáng)的細(xì)胞攝取和/或增強(qiáng)的對(duì)靶核酸的結(jié)合親和力。因此寡核苷酸的不同區(qū)可具有不同的特性。本發(fā)明的嵌合寡核苷酸可形成為兩種或更多種如上所述的寡核苷酸、修飾寡核苷酸、寡聚核苷和/或寡核苷酸類似物的混合結(jié)構(gòu)。寡核苷酸可由可“全符合狀態(tài)”(in "register")地連接或通過(guò)間隔物連接的區(qū)組成，所述“全符合狀態(tài)”地連接即此時(shí)單體像在天然DNA —樣連續(xù)地連接。所述間隔物意在構(gòu)成區(qū)之間的共價(jià)“橋”，并在優(yōu)選的情況下具有不超過(guò)約100個(gè)碳原子的長(zhǎng)度。所述間隔物可攜帶不同的功能性，例如具有正或負(fù)電荷的、具有特殊的核酸結(jié)合特性(嵌入劑、溝黏合劑、毒素、熒光團(tuán)等)、為親脂的、誘導(dǎo)特殊的二級(jí)結(jié)構(gòu)如例如誘導(dǎo)α -螺旋的含丙氨酸的肽。本文所用的“重編程因子”包括所有家族成員、突變體、等位基因、片段、種類 (species)、編碼和非編碼序列、有義和反義多核苷酸鏈等。本文所用的措詞S0X2、Sox-2、AN0P3、MC0PS3、MGC2413和轉(zhuǎn)錄因子S0X-2，在本申請(qǐng)中可交換地使用。本文所用的措詞KLF4、Kruppel樣因子4(腸)、上皮鋅指蛋白EZF、EZF、GKLF、腸富集kru印pel樣因子、Kru印pel樣因子4，在本申請(qǐng)中可交換地使用。本文所用的措詞P0U5F1、0ct_3、Oct-3/4、0ct_4、八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子3、八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4、0TF3、0TF4、‘P0U結(jié)構(gòu)域類別5、轉(zhuǎn)錄因子1，、P0U5F1、POU類別5同源框 U DADB-104B20. 2和MGC2M87，在文獻(xiàn)中被認(rèn)為是相同的且在本申請(qǐng)中可交換地使用。本文所用的術(shù)語(yǔ)“對(duì)......特異的寡核苷酸”或“靶定......的寡核苷酸”是指具
有以下序列的寡核苷酸，該序列(i)能夠與靶定基因的一部分形成穩(wěn)定的復(fù)合體，或(ii) 能夠與靶定基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的一部分形成穩(wěn)定的雙鏈體。復(fù)合體和雙鏈體的穩(wěn)定性可通過(guò)理論計(jì)算和/或體外測(cè)定來(lái)確定。用于確定雜交復(fù)合體和雙鏈體的穩(wěn)定性的示例性測(cè)定法描述于下文實(shí)施例中。本文所用的術(shù)語(yǔ)“靶核酸”包括DNA、從這類DNA轉(zhuǎn)錄的RNA (包括前mRNA和mRNA)， 以及從這類RNA衍生的cDNA、編碼序列、非編碼序列、有義或反義多核苷酸。寡聚化合物與其靶核酸的特異性雜交干擾核酸的正常功能。這種通過(guò)特異地與靶核酸雜交的化合物對(duì)該靶核酸功能的調(diào)節(jié)，一般稱為“反義”。待干擾的DNA功能包括例如復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。待干擾的 RNA功能，包括所有的生活機(jī)能，例如，RNA向蛋白質(zhì)翻譯位點(diǎn)的易位、蛋白質(zhì)自RNA的翻譯、 產(chǎn)生一種或多種mRNA種類的RNA剪接，以及可由RNA參與或促進(jìn)的催化活性。對(duì)靶核酸功能的這類干擾的整體效果為對(duì)編碼產(chǎn)物或寡核苷酸表達(dá)的調(diào)節(jié)。 RNA干擾“RNAi ”由雙鏈RNA (dsRNA)分子介導(dǎo)，該分子具有與其“靶”核酸序列的序列特異性同源性(Caplen，N. J.等，(2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 :9742-9747)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，介體為5-25個(gè)核苷酸的“小干擾” RNA雙鏈體(siRNA)。siRNA通過(guò)稱為切酶的 RNA 酶對(duì) dsRNA 的加工得到(Bernstein，E.等，(2001) Nature409 :363-366)。 siRNA雙鏈體產(chǎn)物募集到叫做RISC(RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體)的多蛋白siRNA復(fù)合體中。不希望受任何具體理論所約束，認(rèn)為隨后RISC被引向靶核酸(適當(dāng)?shù)貫閙RNA)，在此處siRNA 雙鏈體以序列特異性的方式相互作用來(lái)介導(dǎo)催化方式的切割(Bernstein，Ε.等，Q001)Nature 409 :363-366 ；Boutla，A.等，(2001)Curr. Biol. 11 :1776-1780)?？梢勒毡景l(fā)明使用的小干擾RNA，可根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知和普通技術(shù)人員熟悉的程序來(lái)合成和使用。用于本發(fā)明的方法中的小干擾RNA適當(dāng)?shù)匕s1-約50個(gè)核苷酸(nt)。在非限制性實(shí)施方案的實(shí)例中，siRNA可包含約5-約40nt、約5-約30nt、約10-約30nt、約15-約25nt、或約 20-25個(gè)核苷酸。適當(dāng)寡核苷酸的挑選通過(guò)使用電腦程序來(lái)促進(jìn)，該程序自動(dòng)比對(duì)核酸序列并指出具有同一性或同源性的區(qū)。將這類程序用于比較例如通過(guò)搜索諸如GenBank等的數(shù)據(jù)庫(kù)或通過(guò)測(cè)序PCR產(chǎn)物而獲得的核酸序列。對(duì)來(lái)自一系列物種的核酸序列的比較，允許選擇在物種之間顯示適度同一性的核酸序列。在未測(cè)序基因的情況下，進(jìn)行DNA印跡來(lái)確定在靶物種和其他物種的基因之間的同一性程度。如本領(lǐng)域眾所周知的，通過(guò)在不同的嚴(yán)格程度下進(jìn)行DNA印跡，可能獲得同一性的近似衡量。這些程序允許選擇以下寡核苷酸，其對(duì)待控制的受試者中的靶核酸序列表現(xiàn)出高度的互補(bǔ)性，并且對(duì)其他物種中的相應(yīng)核酸序列表現(xiàn)出較低程度的互補(bǔ)性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，在挑選用于本發(fā)明的適當(dāng)?shù)幕騾^(qū)方面具有相當(dāng)大的自由?！懊复?RNA"意為具有酶活性的 RNA 分子(Cech，(1988) J. American. Med. Assoc. 260,3030-3035).酶促核酸(核酶)通過(guò)首先結(jié)合靶RNA來(lái)起作用。這類結(jié)合通過(guò)酶促核酸的靶結(jié)合部分進(jìn)行，所述靶結(jié)合部分保持緊密靠近進(jìn)行切割靶RNA的分子的酶部分。因此，酶促核酸首先識(shí)別而后通過(guò)堿基配對(duì)結(jié)合靶RNA，且一旦結(jié)合到正確的位點(diǎn)，即進(jìn)行酶促切割靶RNA?！罢T餌RNA”意為模擬配體的天然結(jié)合域的RNA分子。因此誘餌RNA與天然結(jié)合靶標(biāo)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合特異性配體。例如，已顯示HIV反式激活應(yīng)答(TAR)RNA的過(guò)表達(dá)可充當(dāng)“誘餌” 并有效地結(jié)合HIV tat蛋白，從而阻止其結(jié)合到在HIV RNA中編碼的TAR序列(Sullenger 等，(1990)Cell，63，601-608)。這意指特定的實(shí)例。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，這只是一個(gè)實(shí)例，而其他的實(shí)施方案可使用本領(lǐng)域一般已知的技術(shù)容易地產(chǎn)生。本文所用的術(shù)語(yǔ)“單體”通常指以下單體，其通過(guò)磷酸二酯鍵或其類似物連接以形成大小范圍從少量單體單元(例如從約3-4)到約數(shù)百個(gè)單體單元的寡核苷酸。磷酸二酯鍵的類似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯、氨基磷酸酯等，如下文更充分地描述。術(shù)語(yǔ)“核苷酸”涵蓋天然存在的核苷酸和非天然存在的核苷酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)清楚的是，先前認(rèn)為“非天然存在”的多種核苷酸后來(lái)已在自然中發(fā)現(xiàn)。因此，“核苷酸”不僅包括已知的含嘌呤和嘧啶雜環(huán)的分子，而且還包括其雜環(huán)類似物和互變異構(gòu)體。其他類型的核苷酸的說(shuō)明性實(shí)例為以下分子，其含有腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黃嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脫氮雜黃嘌呤、7-脫氮雜鳥(niǎo)嘌呤、N4，N4-橋亞乙基胞嘧啶(ethanocytosin)、N6，N6-橋亞乙基-2，6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假異胞嘧啶、2-羥基-5-甲基-4-三唑并吡啶、異胞嘧啶、異鳥(niǎo)嘌呤、肌苷和在Bermer等美國(guó)專利第5，432，272號(hào)中描述的“非天然存在的”核苷酸。術(shù)語(yǔ)“核苷酸”意在涵蓋這些實(shí)例以及其類似物和互變異構(gòu)體中的每一個(gè)和全部。尤其令人關(guān)注的核苷酸為含腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶的核苷酸，其被認(rèn)為是有關(guān)人中的治療和診斷應(yīng)用的天然存在核苷酸。核苷酸包括天然2，-脫氧和2，-羥基糖，例如，如Kornberg和Baker，DNA復(fù)制(DNA R印lication)，第2 版(Freeman，San Francisco, 1992)中所述的以及其類似物。提及核苷酸的“類似物”包括具有經(jīng)修飾的堿基部分和/或經(jīng)修飾的糖部分的合成核苷酸(參見(jiàn)例如，由Scheit，核苷酸類似物(Nucleotide Analogs), John Wiley, New York，1980 ;Freier 禾口 Altmann， (1997)Nucl. Acid. Res. ,25(22), 4429-4443, Toulme, J. J. , (2001)Nature Biotechnologyl9 :17-18 ；Manoharan Μ. , (1999)Biochemica et Biophysica Actal489 :117-139 ；Freier S.Μ., (1997)Nucleic Acid Research,25 4429-4443, UhIman, E. ， (2000)Drug Discovery&Development, 3 :203-213, Herdewin P.， (2000)Antisense&Nucleic Acid Drug Dev.，10 :297-310 —般描述的)；2，-0，3，-0連接的[3.2.0] 二環(huán)阿糖核苷(參加例如 N. KChristiensen.等，(1998) J.Am. Chem. Soc., 120 :5458-5463 ；Prakash TP, Bhat B. (2007) Curr Top Med Chem. 7 (7) :641-9 ；Cho EJ 等， (2009) Annual Review of Analytical Chemistry，2，24H64)。這類類似物包括設(shè)計(jì)以增強(qiáng)結(jié)合特性的合成核苷酸，所述結(jié)合特性為例如雙鏈體或三鏈體穩(wěn)定性、特異性等。本文所用的“雜交”意為寡聚化合物的基本上互補(bǔ)鏈的配對(duì)。一種配對(duì)的機(jī)理涉及寡聚化合物的鏈的互補(bǔ)核苷或核苷酸堿基(核苷酸)之間的氫鍵合，其可為沃森-克里克、HoGgsteen或反HoGgsteen氫鍵合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶為互補(bǔ)的核苷酸，其通過(guò)形成氫鍵配對(duì)。雜交可在各種環(huán)境下發(fā)生。反義化合物為“可特異地雜交的”，如果所述化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能而導(dǎo)致功能和/或活性的調(diào)節(jié)，并且在需要特異性結(jié)合的條件下存在足夠程度的互補(bǔ)性來(lái)避免所述反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結(jié)合，所述條件即在體內(nèi)測(cè)定或治療性處理情況中的生理?xiàng)l件下，以及在體外測(cè)定情況中進(jìn)行測(cè)定的條件下。本文所用的短語(yǔ)“嚴(yán)格雜交條件”或“嚴(yán)格條件”是指以下條件，在該條件下本發(fā)明的化合物與其靶序列雜交，但與最少數(shù)量的其他序列雜交。嚴(yán)格條件為序列依賴的且在不同環(huán)境下將不同，在本發(fā)明的文段中，在其下寡聚化合物與靶序列雜交的“嚴(yán)格條件”由寡聚化合物的性質(zhì)和組成以及正在其中研究它們的試驗(yàn)來(lái)確定。一般而言，嚴(yán)格雜交條件包括低濃度(< 0. 15M)的含有諸如Na++或K++等無(wú)機(jī)陽(yáng)離子的鹽(即，低離子強(qiáng)度)、溫度高于20°C _25°C、低于寡聚化合物靶序列復(fù)合體的Tm，以及存在變性劑，例如甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜，或去污劑十二烷基硫酸鈉(SDS)。例如，雜交率對(duì)于每甲酰胺減少1. 1%。高嚴(yán)格雜交條件的實(shí)例為0. IX氯化鈉-檸檬酸鈉緩沖液(SSC)/0. 1% (w/v) SDS、60°C下達(dá)30分鐘。本文所用的“互補(bǔ)的”是指在一條或兩條寡聚鏈上兩個(gè)核苷酸之間精確配對(duì)的能力。例如，如果在反義化合物的某個(gè)位置上的核堿基能夠與在靶核酸的某個(gè)位置上的核堿基氫鍵合，所述靶核酸為DNA、RNA或寡核苷酸分子，則認(rèn)為所述寡核苷酸和所述靶核酸之間氫鍵合的位置為互補(bǔ)位置。當(dāng)可彼此氫鍵合的核苷酸占據(jù)了每個(gè)分子中足夠數(shù)量的互補(bǔ)位置時(shí)，寡聚化合物和另外的DNA、RNA或寡核苷酸分子為彼此互補(bǔ)的。因此，“可特異性雜交的”和“互補(bǔ)的”為以下術(shù)語(yǔ)，其用于表示在足夠數(shù)量的核苷酸上有足夠程度的精確配對(duì)或互補(bǔ)性，使得穩(wěn)定和特異的結(jié)合發(fā)生在寡聚化合物和靶核酸之間。據(jù)本領(lǐng)域了解，寡聚化合物的序列不需要與其可特異雜交的靶核酸的序列100% 互補(bǔ)。此外，寡核苷酸可在一個(gè)或多個(gè)區(qū)段上雜交，使得間插或鄰近的區(qū)段不涉及雜交事件(例如，環(huán)結(jié)構(gòu)、錯(cuò)配或發(fā)夾結(jié)構(gòu))。本發(fā)明的寡聚化合物包含與其靶定的靶核酸序列內(nèi)的靶區(qū)至少約70%、或至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約 95%、或至少約99%的序列互補(bǔ)性。例如，其中反義化合物的20個(gè)核苷酸中有18個(gè)與靶區(qū)互補(bǔ)且因而會(huì)特異地雜交的反義化合物，表示90%互補(bǔ)性。在此實(shí)例中，余下的非互補(bǔ)核苷酸可與互補(bǔ)核苷酸是聚簇或散布的且不需要彼此鄰接或鄰接互補(bǔ)核苷酸。因此，長(zhǎng)度為 18個(gè)核苷酸的反義化合物具有4 (四)個(gè)非互補(bǔ)核苷酸，該非互補(bǔ)核苷酸位于與靶核酸完全互補(bǔ)的兩個(gè)區(qū)的側(cè)翼，所述反義化合物會(huì)具有與靶核酸77. 8%的總互補(bǔ)性，因此落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。反義化合物與靶核酸區(qū)的互補(bǔ)性百分比可使用本領(lǐng)域已知的BLAST程序(基本局部比對(duì)搜索工具)和PowerBLAST程序常規(guī)地確定(Altschul等，(1990) J. Mol. Biol.， 215,403-410 ；Zhang 和 Madden，(1997)GenomeRes. ,7,649-656) 同源性、序列同一性或互補(bǔ)性百分比可通過(guò)例如Gap程序(Wisconsin序列分析包，Unix操作系統(tǒng)版本8，Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.)使用默認(rèn)設(shè)置來(lái)石角定，該禾呈序使用 Smith 和 Waterman 的算法(Adv. Appl. Math.，(1981)2,482-489)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“解鏈溫度(Tm) ”是指以下溫度，在限定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下，在該溫度下平衡時(shí)50%與靶序列互補(bǔ)的寡核苷酸與靶序列雜交。典型地，對(duì)于短寡核苷酸(例如，10-50個(gè)核苷酸)而言嚴(yán)格條件為以下條件，其中鹽濃度至少為約0.01-1. OM Na離子濃度(或其他鹽)，pH 7. 0-8. 3且溫度至少為約30°C。嚴(yán)格條件也可通過(guò)外加諸如甲酰胺等去穩(wěn)定劑來(lái)達(dá)到。本文所用的“調(diào)節(jié)”意為在基因表達(dá)方面的增加(刺激)或減少(抑制)。術(shù)語(yǔ)“變體”，當(dāng)用于多核苷酸序列的情況下時(shí)，可包括有關(guān)野生型基因的多核苷酸序列。此定義也可包括，例如，“等位基因的”、“剪接”、“物種”或“多態(tài)的”變體。剪接變體可具有與參比分子顯著的同一性，但因?yàn)樵趍RNA加工期間外顯子的可變剪接而通常具有更多或更少數(shù)量的多核苷酸。對(duì)應(yīng)的多肽可具有附加的功能域或不存在域。物種變體為在不同物種之間不同的多核苷酸序列。本發(fā)明中尤其實(shí)用的是野生型基因產(chǎn)物的變體。變體可由核酸序列中的至少一個(gè)突變產(chǎn)生并可導(dǎo)致產(chǎn)生改變的mRNA或者其結(jié)構(gòu)或功能可能改變或不變的多肽。任何給定的天然或重組基因可不具有、具有一個(gè)或許多等位基因形式。 產(chǎn)生變體的常見(jiàn)突變變化一般歸因于核苷酸的自然缺失、添加或取代。這些變化類型中的每一個(gè)可單獨(dú)或與其他類型聯(lián)合發(fā)生，在給定序列中發(fā)生一次或多次。產(chǎn)生的多肽一般將具有相對(duì)于彼此的顯著的氨基酸同一性。多態(tài)變體為在給定物種的個(gè)體之間特定基因的多核苷酸序列的變化。多態(tài)變體也可包括“單核苷酸多態(tài)性”(SNP)或單堿基突變，其中多核苷酸序列因一個(gè)堿基而不同。SNP的存在可指示例如具有疾病狀態(tài)傾向(即與抗性相對(duì)的易感性)的某個(gè)群體。衍生多核苷酸包括經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的核酸，例如用烷基、?；虬被脫Q氫。衍生物 (例如，衍生寡核苷酸)可包含非天然存在的部分，例如改變的糖部分或糖間鍵。這些中示例性的是硫代磷酸酯及本領(lǐng)域已知的其他含硫的種類。衍生核酸也可含有標(biāo)記，包括放射性核苷酸、酶、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、顯色劑、底物、輔因子、抑制劑、磁性顆粒，等等?！把苌摹倍嚯幕螂臑榻?jīng)修飾的多肽或肽，例如，通過(guò)糖基化、聚乙二醇化、磷酸化作用、硫酸鹽化作用、還原/烷基化、?；?、化學(xué)偶聯(lián)或溫性福爾馬林處理。也可將衍生物修飾以含有可檢測(cè)標(biāo)記(直接地或間接地)，包括但不限于放射性同位素、熒光和酶標(biāo)記。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物”或“患者”意在包括例如人、棉羊、麋鹿、鹿、長(zhǎng)耳鹿、貂、哺乳動(dòng)物、猴、馬、牛、豬、山羊、狗、貓、大鼠、小鼠、鳥(niǎo)、雞、爬行動(dòng)物、魚(yú)、昆蟲(chóng)和蜘蛛類?！安溉閯?dòng)物”涵蓋通常在醫(yī)療護(hù)理下的溫血哺乳動(dòng)物(例如，人和馴養(yǎng)動(dòng)物)。實(shí)例包括貓科動(dòng)物、犬、馬、?？苿?dòng)物和人，以及僅僅人?！疤幚怼被颉爸委煛焙w對(duì)哺乳動(dòng)物中疾病狀態(tài)的治療，并包括(a)防止疾病狀態(tài)出現(xiàn)于哺乳動(dòng)物中，特別是當(dāng)這類哺乳動(dòng)物傾向于疾病狀態(tài)但尚未診斷為患有該疾病狀態(tài)時(shí)；(b)抑制疾病狀態(tài)，例如，阻止其發(fā)展；和/或(c)減輕疾病狀態(tài)，例如，引起疾病狀態(tài)的退行直到達(dá)到所需的終末點(diǎn)。治療也包括改善疾病的癥狀(例如，減少疼痛或不適)，其中這類改善可直接或可非直接地影響疾病(例如，原因、傳遞、表達(dá)等)。本文所用的“癌癥”是指在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的所有類型的癌癥或新生物或惡性腫瘤，包括但不限于白血病、淋巴瘤、黑素瘤、癌和肉瘤。癌癥自身表現(xiàn)為包含癌癥惡性細(xì)胞的“腫瘤”或組織。腫瘤的實(shí)例包括肉瘤和癌，例如但不限于纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤(Ewing' s tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝細(xì)胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌、維爾姆斯氏腫瘤(Wilms' tumor)、子宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、 上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽(tīng)神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、黑素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤?？赏ㄟ^(guò)依照本發(fā)明的公開(kāi)組合物治療的其它癌癥，包括但不限于，例如，何杰金病(Hodgkin' s Disease)、非何杰金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、橫紋肌肉瘤、原發(fā)性血小板增多癥、原發(fā)性巨球蛋白血癥、小細(xì)胞肺腫瘤、原發(fā)性腦腫瘤、胃癌、結(jié)腸癌、惡性胰腺胰島素瘤(insulanoma)、惡性類癌、膀胱癌、惡化前皮膚病損、睪丸癌、淋巴瘤、 甲狀腺癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、食管癌、生殖泌尿道癌、惡性高鈣血癥、子宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、腎上腺皮質(zhì)癌和前列腺癌?！吧窠?jīng)疾病或病癥”是指神經(jīng)系統(tǒng)和/或視覺(jué)系統(tǒng)的任何疾病或病癥。“神經(jīng)疾病或病癥”包括涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(腦、腦干和小腦)、周圍神經(jīng)系統(tǒng)(包括腦神經(jīng))和自主神經(jīng)系統(tǒng)(其部分位于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)二者中)的疾病或病癥。神經(jīng)病癥的實(shí)例包括但不限于，頭痛、木僵和昏迷、癡呆、發(fā)作、睡眠障礙、創(chuàng)傷、感染、新生物、神經(jīng)眼科學(xué)、運(yùn)動(dòng)障礙、脫髓鞘病、脊髓病癥、以及周圍神經(jīng)、肌肉和神經(jīng)肌肉接點(diǎn)的病癥。成癮和精神病也包含在神經(jīng)病癥的定義中，包括但不限于，雙相性精神障礙和精神分裂癥。以下為可使用依照本發(fā)明的組合物和方法治療的數(shù)種神經(jīng)病癥、癥狀、體征和綜合征的清單獲得性癲癇樣失語(yǔ)癥；急性播散性腦脊髓炎；腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良；年齡相關(guān)性黃斑變性；胼胝體發(fā)育不全；失認(rèn)癥；艾卡迪綜合征；亞歷山大?。话栫晁共?Alpers’ disease)；交叉性偏癱；血管性癡呆；肌萎縮側(cè)索硬化；無(wú)腦畸形；Angelma綜合征；血管瘤??；缺氧；失語(yǔ)癥；失用癥；蛛網(wǎng)膜囊腫；蛛網(wǎng)膜炎；阿-基氏腦畸形(Anronl-Chiari malformation)；動(dòng)靜脈畸形；阿斯佩各綜合征；共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(ataxia telegiectasia)；注意不集中的過(guò)度反應(yīng)癥；孤獨(dú)癥；自主神經(jīng)功能障礙；背痛；巴滕??；貝切特??；貝爾氏麻痹；良性自發(fā)性瞼痙攣；良性灶；肌萎縮；良性顱內(nèi)高血壓；賓斯旺格?。徊€痙攣；Bloch Sulzberger綜合征；臂叢損傷；腦膿腫；腦損傷；腦腫瘤(包括多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)；脊髓腫瘤；布朗-塞卡爾綜合征；卡納萬(wàn)?。煌蠊芫C合征；灼痛；中樞性疼痛綜合征；腦橋中央髓鞘溶解； 頭部病癥(cephalic disorder)；腦動(dòng)脈瘤；腦動(dòng)脈硬化；腦萎縮；大腦性巨人癥；大腦性癱瘓；夏-馬-圖病；化學(xué)療法誘導(dǎo)的神經(jīng)病和神經(jīng)性疼痛；Chiari畸形；舞蹈癥；慢性炎性脫髓鞘性多神經(jīng)?。宦酝?；慢性區(qū)域性疼痛綜合征；科-勒綜合征；昏迷，包括持續(xù)性植物狀態(tài)；先天性面癱；皮質(zhì)基底節(jié)變性；顱動(dòng)脈炎；顱縫早閉；克雅?。焕鄯e性創(chuàng)傷障礙 (cumulative trauma disorder)；庫(kù)興綜合征(Cushing' s syndrome)；巨細(xì)胞包涵體??； 巨細(xì)胞病毒感染；舞蹈眼-舞蹈腳綜合征；丹-沃(DandyWalker)綜合征；Dawson?。坏履ξ靼＞C合征；Dejerine-Klumke麻痹；癡呆；皮肌炎；糖尿病神經(jīng)病變；彌漫性硬化；自主神經(jīng)功能異常；書(shū)寫(xiě)困難；誦讀困難；張力失常；早期幼兒癲癇性腦??；空蝶鞍綜合征；腦炎； 腦膨出；腦三叉神經(jīng)血管瘤??；癲癇；歐勃麻痹；特發(fā)性震顫；法布里??；法爾綜合征；昏厥；家族性痙攣性癱瘓；熱性癲癇發(fā)作；費(fèi)希爾綜合征；弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)；額顳癡呆和其它“tau蛋白病變(tauopathies)，，；高歇?。桓袼固芈C合征；巨細(xì)胞動(dòng)脈炎；巨細(xì)胞性包涵體??；細(xì)胞性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良；格-巴綜合征；HTLV-I相關(guān)性脊髓??；哈-斯病；顱腦損傷；頭痛；偏側(cè)面肌痙攣；遺傳性痙攣性截癱；多神經(jīng)炎型遺傳性共濟(jì)失調(diào)；耳部帶狀皰疹；帶狀皰疹；Hirayama綜合征；HIV相關(guān)性癡呆和神經(jīng)病(還是AIDS的神經(jīng)表現(xiàn))；前腦無(wú)裂畸形；亨廷頓舞蹈病和其它聚谷氨酰胺重復(fù)疾病(polyglutamine repeat disease)； 積水性無(wú)腦畸形；腦積水；皮質(zhì)醇增多癥；缺氧；免疫介導(dǎo)的腦脊髓炎；包涵體肌炎；色素失調(diào)癥；嬰兒植烷酸貯積??；嬰兒雷夫敘姆??；嬰兒性痙攣；炎性肌??；顱內(nèi)囊腫；顱內(nèi)高血壓Joubert綜合征；基-塞(Keams-^iyre)綜合征；肯尼迪病Kinsboum綜合征；克-費(fèi) (Klippel Feil)綜合征；克拉伯?。粠?kù)-韋??；庫(kù)魯??；拉福拉??；朗-愛(ài)(Lambert-Eaton) 肌無(wú)力綜合征；Landau-Kleffner綜合征；側(cè)髓(瓦倫伯格)綜合征；學(xué)習(xí)無(wú)能；利氏?。?Lermox-Gustaut綜合征；累-奈綜合征；腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良；路易(Lewy)體癡呆；無(wú)腦回； 閉鎖綜合征；Lou Gehrig病(即，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病或肌萎縮側(cè)索硬化)；椎間盤(pán)疾病；萊姆病-神經(jīng)后遺癥；馬-約?。痪弈X(macrenc印haly)；巨腦(megalenc印haly)；梅-羅綜合征；美尼爾癥；腦膜炎；門克斯?。划惾拘阅X白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良；小頭畸形；偏頭痛；米勒費(fèi)希爾綜合征；小中風(fēng)(mini-stroke)；線粒體肌??；默比厄斯綜合征；單肢肌萎縮；運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病；腦底異常血管網(wǎng)病；粘多糖癥；多發(fā)性梗塞性癡呆(milti-infarct dementia)；多病灶運(yùn)動(dòng)神經(jīng)??；多發(fā)性硬化和其它脫髓鞘病癥；多系統(tǒng)萎縮伴隨直立性低血壓；P肌肉萎縮癥；重癥肌無(wú)力；髓鞘脫失(myelinoclastic)彌漫性硬化；嬰兒肌陣攣性腦病；肌陣攣； 肌??；先天性肌強(qiáng)直；發(fā)作性睡病；神經(jīng)纖維瘤?。簧窠?jīng)阻滯劑惡性綜合征；AIDS的神經(jīng)表現(xiàn)；狼瘡的神經(jīng)后遺癥；神經(jīng)性肌強(qiáng)直；神經(jīng)元臘樣脂褐質(zhì)癥；神經(jīng)元遷移障礙；尼曼-皮克??；O’ Sullivan-McLeod綜合征；枕神經(jīng)痛；隱性脊柱神經(jīng)管閉合不全序列征；大田原 (Ohtahara)綜合征；橄欖體腦橋小腦萎縮；視性眼肌陣痙攣；視神經(jīng)炎；直立性低血壓；過(guò)度使用綜合征；感覺(jué)異常；神經(jīng)變性疾病或病癥(帕金森病、亨廷頓舞蹈病、阿爾茨海默氏病、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、癡呆、多發(fā)性硬化以及其它和神經(jīng)元細(xì)胞死亡有關(guān)的疾病和病癥)；先天性副肌強(qiáng)直；類腫瘤性疾?。话l(fā)作性發(fā)作(paroxysmal attacks)；帕-羅(Parry Romberg)綜合征；佩-梅??；周期性癱瘓；周圍神經(jīng)病；疼痛性神經(jīng)病和神經(jīng)性疼痛；持續(xù)性植物狀態(tài)；全身性發(fā)育遲緩；感光性噴嚏反射；植烷酸貯積??；皮克?。簧窠?jīng)挾捏；垂體瘤；多肌炎；腦穿通畸形；小兒麻痹癥后期綜合征；皰疹后神經(jīng)痛；感染后腦脊髓炎；直立性低血壓；普-韋(ft~ader-Willi)綜合征；原發(fā)性側(cè)索硬化；朊病毒?。贿M(jìn)行性一側(cè)面萎縮；進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦??；進(jìn)行性硬化性灰質(zhì)萎縮；進(jìn)行性核上性麻痹；腦假瘤；拉姆齊·亨特綜合征(I型和11型)；拉斯馬森(Rasmussen)腦炎；反射性交感神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)不良綜合征；雷夫敘姆?。环磸?fù)性運(yùn)動(dòng)障礙；反復(fù)性應(yīng)激損傷；腿多動(dòng)綜合征；反轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)性脊髓?。焕滋鼐C合征；雷耶綜合征；舞蹈??；桑德霍夫病；謝耳德病；腦裂；視隔發(fā)育不全 (s印to-optic dysplasia)；驚嚇?gòu)雰壕C合征；帶狀皰疹；希-德綜合征；斯耶格倫綜合征； 睡眠性呼吸暫停；索托斯綜合征(Soto' s syndrome)；痙攣狀態(tài)；脊柱裂；脊髓損傷；脊髓瘤；脊髓性肌萎縮；僵人綜合征(Stiff-Person syndrome)；中風(fēng)；斯-韋綜合征；亞急性硬化性全腦炎；皮層下動(dòng)脈硬化性腦??；西德納姆舞蹈??；暈厥；脊髓空洞癥；遲發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙；泰-薩克斯?。伙D動(dòng)脈炎；脊髓栓系綜合征(tethered spinal cord syndrome)；肌強(qiáng)直性白內(nèi)障；胸廓出口綜合征；三叉神經(jīng)痛；Todd麻痹；圖雷特綜合癥；短暫性腦缺血發(fā)作；傳染性海綿狀腦??；橫貫性脊髓炎；外傷性腦損傷；震顫；三叉神經(jīng)痛；熱帶痙攣性輕截癱；結(jié)節(jié)性硬化癥；血管性癡呆(多發(fā)梗塞性癡呆)；血管炎，包括顳動(dòng)脈炎；希-林(Von Hippel-Lindau)?。煌邆惒窬C合征；韋-霍(Werdnig-HofTman)?。豁f斯特綜合征；急性頸部扭傷(whiplash)；威廉斯綜合征；Wildon??；以及澤爾韋格綜合征?！把装Y”是指全身性炎性病況以及局部地與單核細(xì)胞、白細(xì)胞和/或中性粒細(xì)胞的遷移和吸引有關(guān)的病況。炎癥的實(shí)例包括但不限于，因以下引發(fā)的炎癥感染致病生物(包括革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、病毒、真菌、以及寄生物，例如原生動(dòng)物和蠕蟲(chóng))、移植排斥 (包括實(shí)質(zhì)器官的排斥，例如腎、肝、心、肺或角膜，以及骨髓移植的排斥，包括移植物抗宿主病(GVHD))或者局限性慢性或急性自身免疫反應(yīng)或變態(tài)反應(yīng)。自身免疫性疾病包括急性腎小球腎炎；類風(fēng)濕性或反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎；慢性腎小球腎炎；炎性腸病，例如克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎和壞死性小腸結(jié)腸炎；與粒細(xì)胞輸注有關(guān)的綜合征；炎性皮膚病，例如接觸性皮炎、特應(yīng)性皮炎、銀屑?。幌到y(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)；自身免疫性甲狀腺炎、多發(fā)性硬化、以及糖尿病的某些形式、或任何其它自體免疫狀態(tài)(其中受試者自身免疫系統(tǒng)的攻擊導(dǎo)致病理性組織破壞)。變態(tài)反應(yīng)包括變應(yīng)性哮喘、慢性支氣管炎、急性和遲發(fā)型超敏反應(yīng)。全身性炎性疾病狀態(tài)包括與創(chuàng)傷、燒傷、缺血事件(例如在心、腦、腸或外周脈管系統(tǒng)中的血栓形成事件，包括心肌梗死和中風(fēng))后的再灌注、膿毒癥、ARDS或多器官功能障礙綜合征相關(guān)的炎癥。炎性細(xì)胞募集也在粥樣硬化斑塊中發(fā)生。炎癥包括但不限于，非何杰金淋巴瘤、韋格納肉芽腫病、橋本甲狀腺炎、肝細(xì)胞癌、胸腺萎縮、慢性胰腺炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性淋巴樣增生、骨關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、乳頭狀癌、克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、急性膽囊炎、慢性膽囊炎、肝硬化、慢性涎腺炎、腹膜炎、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、慢性胃炎、子宮肌腺病、 子宮內(nèi)膜異位、急性子宮頸炎、慢性子宮頸炎、淋巴樣增生、多發(fā)性硬化、繼發(fā)于特發(fā)性血小板減少性紫癜的肥大、原發(fā)性IgA腎病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、肺氣腫、慢性腎盂腎炎、 以及慢性膀胱炎。心血管疾病或病癥包括可引起缺血或者由心臟的再灌注引發(fā)的那些病癥。實(shí)例包括但不限于，動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈疾病、肉芽腫性心肌炎、慢性心肌炎(非肉芽腫性)、 原發(fā)性肥大性心肌病、外周動(dòng)脈病(PAD)、中風(fēng)、心絞痛、心肌梗死、由心搏停止引發(fā)的心血管組織損傷、由心臟分流引發(fā)的心血管組織損傷、心源性休克，以及相關(guān)的病況，所述病況會(huì)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，或涉及心臟或脈管系統(tǒng)的機(jī)能障礙或組織損傷，特別是但不限于，與重編程因子激活有關(guān)的組織損傷。CVS疾病包括但不限于，動(dòng)脈粥樣硬化、肉芽腫性心肌炎、心肌梗死、繼發(fā)于瓣膜性心臟病的心肌纖維化、無(wú)梗死形成的心肌纖維化、原發(fā)性肥大性心肌病、以及慢性心肌炎(非肉芽腫性)?！按x疾病或病癥”是指大范圍的內(nèi)分泌系統(tǒng)的疾病和病癥，包括例如胰島素抵抗、糖尿病、肥胖癥、葡萄糖耐量降低、高膽固醇血癥、高血糖癥、高胰島素血癥、血脂障礙 (dyslipidemia)和高脂血癥。多核苷酸和寡核苷酸組合物和分子靶標(biāo)在一個(gè)實(shí)施方案中，靶標(biāo)包括重編程因子的核酸序列，包括但不限于與重編程因子有關(guān)的有義和/或反義非編碼和/或編碼序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶標(biāo)包括S0X2的核酸序列，包括但不限于與S0X2基因有關(guān)的有義和/或反義非編碼和/或編碼序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶標(biāo)包括KLF4的核酸序列，包括但不限于與KLF4基因有關(guān)的有義和/或反義非編碼和/或編碼序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶標(biāo)包括P0U5F1的核酸序列，包括但不限于與P0U5F1基因有關(guān)的有義和/或反義非編碼和/或編碼序列。SRY (性別決定區(qū)Y)-框2，也稱為S0X2，是維持未分化胚胎干細(xì)胞自我更新所必需的轉(zhuǎn)錄因子。此無(wú)內(nèi)含子基因編碼轉(zhuǎn)錄因子的SRY相關(guān)HMG-框(SOX)家族的成員，所述轉(zhuǎn)錄因子涉及胚胎發(fā)育的調(diào)節(jié)和細(xì)胞命運(yùn)的決定。在與其它蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)復(fù)合體之后， 編碼的蛋白質(zhì)可充當(dāng)轉(zhuǎn)錄激活劑。此基因中的突變與雙側(cè)無(wú)眼(結(jié)構(gòu)性眼畸形的嚴(yán)重形式)有關(guān)。此基因位于另一個(gè)叫做S0X2重疊轉(zhuǎn)錄物(S0X20T)的基因的內(nèi)含子之內(nèi)。S0X2 的異位表達(dá)也可與結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的異常分化有關(guān)。Sox2為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞所需的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一。干細(xì)胞為相對(duì)未分化的細(xì)胞，其可被誘導(dǎo)增殖并可產(chǎn)生以下子代，其隨后分化成一種或多種成熟細(xì)胞類型，但也保留一種或多種具有親代發(fā)育潛能的細(xì)胞。在許多生物學(xué)情形中，干細(xì)胞也為多能的，因?yàn)樗鼈兛僧a(chǎn)生多于一種不同細(xì)胞類型的子代。自我更新為干細(xì)胞定義的另一個(gè)典型部分，并且如在此文件中使用的，其為必需的。理論上，自我更新可通過(guò)兩種主要機(jī)制的任何一種發(fā)生。干細(xì)胞可不對(duì)稱分裂，一個(gè)子代保留干細(xì)胞狀態(tài)而另一個(gè)子代表達(dá)某些不同的其它特定功能和表型。或者，群體中的某些干細(xì)胞可對(duì)稱地分裂成兩個(gè)干細(xì)胞，由此總體上在群體中維持一些干細(xì)胞，而群體中的其它細(xì)胞僅產(chǎn)生分化的子代。形式上，有可能的是，作為干細(xì)胞開(kāi)始的細(xì)胞可以朝著分化的表型行進(jìn)，但隨后“逆轉(zhuǎn)”并重新表達(dá)干細(xì)胞表型。祖細(xì)胞具有更原始(即，在發(fā)育途徑或進(jìn)展上，處在比完全分化細(xì)胞更早的步驟) 的細(xì)胞表型。常常，祖細(xì)胞也具有顯著的或非常高的增殖潛能。祖細(xì)胞可產(chǎn)生多種不同的分化細(xì)胞類型或單一的分化細(xì)胞類型，這取決于發(fā)育途徑以及細(xì)胞發(fā)育和分化所處的環(huán)境。 與干細(xì)胞類似，有可能的是，作為祖細(xì)胞開(kāi)始的細(xì)胞可以朝著分化的表型行進(jìn)，但隨后“逆轉(zhuǎn)”并重新表達(dá)祖細(xì)胞表型。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，一種或多種反義寡核苷酸與SOX家族的一個(gè)或多個(gè)成員的有義和/或反義多核苷酸結(jié)合。SOX (SRY有關(guān)的HMG框)家族的實(shí)例包括，例如Sox-I、Sox_2、Sox_3、Sox_4、Sox6、Sox7、Sox8、Sox9、Soxl Soxll、Sox_13、SoxI4、SoxI5、SoxI8、 Sox20、Sox21、Sox30、Sox32 或非洲瓜蛙(Xenopus laevis)的因子 Sox-ll-D、或其功能片段，優(yōu)選的實(shí)例包括Sox2。Knippel樣因子4(KLF4)為含鋅指轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)富集于腸上皮的有絲分裂后細(xì)胞中。KLF4為腫瘤抑制基因腺瘤性結(jié)腸息肉病(APe)的靶基因。Knippel樣因子4 (KLF4) 在人的多種組織中表達(dá)，包括腸和皮膚，并且在許多不同的生理過(guò)程中重要，包括發(fā)育、分化和維持正常的組織穩(wěn)態(tài)。KLF4為雙功能轉(zhuǎn)錄因子，其可激活或阻抑轉(zhuǎn)錄，取決于靶基因， 且利用不同的機(jī)制。此外，KLF4可作為癌基因或腫瘤抑制基因起作用，這取決于相關(guān)癌癥的類型。與其它三種轉(zhuǎn)錄因子一致，KLF4可以目前為止已測(cè)試的每種可能方式將分化的成纖維細(xì)胞重編程為類似于胚胎干細(xì)胞的狀態(tài)。最近，已發(fā)現(xiàn)KLF4與其它三種轉(zhuǎn)錄因子聯(lián)合的過(guò)表達(dá)，可將小鼠成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成類似于胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)的狀態(tài)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，治療與低水平Knippel樣因子4(KLF4)有關(guān)的疾病或病癥的方法包括給患者施用反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸增加Knippel樣因子4(KLF4)的表達(dá)和/或功能。按照本發(fā)明的實(shí)施方案，將靶核酸分子定向Knippel樣因子4(KLF4)且延伸至 Knippel樣因子4(KLF4)的任何同種型、受體、家族等等。KLF4的異名包括內(nèi)皮Kruppel 樣鋅指蛋白(EZF)；腸富集Kru印pel樣因子(GKLF)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮與本文所述分子有關(guān)的所有方面并包括KLF4 多核苷酸和寡核苷酸序列的所有肽、多肽、衍生物、變體。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括可針對(duì)KLF4分子產(chǎn)生的抗體和適體。八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(以下為“P0U5F1”)屬于結(jié)合八聚體基序(在許多基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件)的轉(zhuǎn)錄因子POU(Pit-Oct-Unc)家族(Ryan AK, 等(1997)Genes Dev ； 11 :1207-1225 ；Ruvkun G，等(1991)Cell 64:475-478)。POU 家族成員的DNA結(jié)合活性由所謂POU結(jié)構(gòu)域(由75-氨基酸POU特異性結(jié)構(gòu)域、連接區(qū)和60-氨基酸POU同源結(jié)構(gòu)域組成的二分DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域)介導(dǎo)(Herr W，等(1995)Genes Dev 9 1679-1693 ；ExPASy 蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)器，可在 http://au. expasy. org/uniprot/Q01860 獲得，2006 年 6 月 7 日接入；Scholer HR，等(1990) Nature 344 :435-9) 已顯示P0U5F1在誘導(dǎo)和維持多能干細(xì)胞狀態(tài)中關(guān)鍵。胚胎干細(xì)胞(ESC)中P0U5F1 表達(dá)的減量調(diào)節(jié)使它們分化并失去其多能性。P0U5F1與其它轉(zhuǎn)錄因子(包括S0X2和 NAN0G)合作誘導(dǎo)和維持多能性，并且還在早期哺乳動(dòng)物發(fā)育中起決定性作用。P0U5F1在某些成體干細(xì)胞群中低水平表達(dá)(Boiani M, (2005)等Nat Rev Mol Cell Biol. 6 :872-84 ； Boyer LA,等(2005)Cell；122 :947-56)。人P0U5F 1基因由5個(gè)外顯子組成且位于主要組織相容性復(fù)合體區(qū)的6號(hào)染色體上。所述基因編碼兩個(gè)同種型，A(P0U5Fl_iA,也稱為0CT-3A)和B(P0U5Fl_iB，也稱為 0CT-3B)(Takeda J，等(1992)Nucleic Acids Res 20:4613-4620)。在一些實(shí)施方案中，P0U5F1反義寡核苷酸促進(jìn)干細(xì)胞增殖。誘導(dǎo)多能干(iPQ細(xì)胞可通過(guò)反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)表達(dá)4種轉(zhuǎn)錄因子(0ct3/4、SoX2、 c-Myc和Klf4)以及隨后選擇 ^χ15表達(dá)，來(lái)自小鼠成纖維細(xì)胞獲得。選擇NANOG表達(dá)而不是!^^15產(chǎn)生具有增加的胚胎干細(xì)胞樣基因表達(dá)和DNA甲基化模式的iPS細(xì)胞。轉(zhuǎn)錄因子 Oct4、sox2、c-Myc和Klf4的表達(dá)將成纖維細(xì)胞的體細(xì)胞基因組重編程為胚胎多能狀態(tài)。Yu 等0CT4、S0X2、NAN0G、LI擬8足以將人體細(xì)胞重編程為多能干細(xì)胞。誘導(dǎo)的多能人干細(xì)胞具有人ES細(xì)胞的正常核型、端粒酶活性、細(xì)胞表面標(biāo)記和典型基因表達(dá)，并且可分化成全部3 個(gè)原胚層的衍生物。在一些實(shí)施方案中，將反義寡核苷酸用于預(yù)防或治療與重編程因子家族成員有關(guān)的疾病或病癥?？捎糜衫梅戳x化合物獲得的干細(xì)胞再生的細(xì)胞/組織治療的示例性重編程因子介導(dǎo)的疾病和病癥包括異常的重編程因子表達(dá)和/或功能、癌癥、腎病、心血管疾病或病癥、炎癥、神經(jīng)疾病或病癥、瘢痕形成、眼科疾病或病癥(例如，小眼、缺損、近視、無(wú)眼/小眼-食管閉鎖綜合征，等等)、視隔發(fā)育不全(S^tooptic dysplasia)、自身免疫性疾病或病癥、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、免疫缺陷病、傳染劑(例如，包括病毒、細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物等)引發(fā)的疾病、遺傳性疾病(例如杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良)、代謝疾病或病癥(例如糖尿病、肥胖癥、代謝綜合征、溶酶體病等)、創(chuàng)傷(例如脊髓損傷、燒傷，等等)、缺血、血管疾病、 肝臟疾病或病癥、銀屑病、疾病、需要移植細(xì)胞、組織和器官的疾病或病癥、需要干細(xì)胞治療的病癥或病況以及先天性疾病或病癥。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過(guò)重編程體細(xì)胞制備誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法， 所述方法包括使上述重編程因子接觸體細(xì)胞的步驟。還提供一種方法，所述方法包括向體細(xì)胞培養(yǎng)物中加入上述重編程因子的步驟； 上述方法，其包括將編碼上述重編程因子的基因引入體細(xì)胞的步驟；上述方法，其包括通過(guò)使用重組載體將所述基因引入體細(xì)胞的步驟，所述重組載體包含至少一種編碼上述重編程因子的基因；以及上述方法，其中將從患者分離的體細(xì)胞用作所述體細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明提供通過(guò)上述方法獲得的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。本發(fā)明也提供通過(guò)誘導(dǎo)分化上述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞得到的體細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步提供用于干細(xì)胞治療的方法，所述方法包括移植體細(xì)胞進(jìn)入患者的步驟，其中所述體細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞獲得，所述誘導(dǎo)多能干細(xì)胞使用從所述患者分離和收集的體細(xì)胞通過(guò)上述方法獲得。從源于健康人的體細(xì)胞中制備的數(shù)種(優(yōu)選約200種)iPS細(xì)胞可儲(chǔ)存在iPS細(xì)胞庫(kù)作為iPS細(xì)胞文庫(kù)，并且可將文庫(kù)中的一種或多種iPS細(xì)胞用于制備不被待經(jīng)受干細(xì)胞治療的患者排斥的體細(xì)胞、組織或器官。本發(fā)明進(jìn)一步提供通過(guò)使用多種細(xì)胞來(lái)評(píng)價(jià)化合物、藥劑、毒物等的生理功能或毒性的方法，所述細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)分化由上述方法獲得的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞獲得。本發(fā)明也提供改善細(xì)胞分化和/或生長(zhǎng)能力的方法，所述方法包括使上述重編程因子接觸所述細(xì)胞的步驟，并進(jìn)一步提供通過(guò)上述方法獲得的細(xì)胞，以及通過(guò)誘導(dǎo)分化由上述方法獲得的細(xì)胞得到的體細(xì)胞。通過(guò)使用由本發(fā)明提供的重編程因子，可方便和高重現(xiàn)性地誘導(dǎo)分化細(xì)胞核的重編程而無(wú)需使用胚胎或ES細(xì)胞，并且可建立作為未分化細(xì)胞的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，所述未分化細(xì)胞具有與ES細(xì)胞類似的分化能力、多能性和生長(zhǎng)能力。例如，具有高生長(zhǎng)能力和分化多能性的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可通過(guò)使用本發(fā)明的重編程因子從患者自身體細(xì)胞中制備?？赏ㄟ^(guò)分化所述細(xì)胞獲得的細(xì)胞(例如，心肌細(xì)胞、產(chǎn)胰島素細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等)非常有用，因?yàn)樗鼈兛捎糜诟鞣N疾病(例如心功能不全、胰島素依賴型糖尿病、帕金森病和脊髓損傷)的干細(xì)胞移植治療，從而可避免關(guān)于使用人胚的倫理問(wèn)題和移植后的排斥。另外，可通過(guò)分化誘導(dǎo)多能干細(xì)胞獲得的各種細(xì)胞(例如，心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞等)作為用于評(píng)價(jià)化合物、藥劑、毒物等效能或毒性的系統(tǒng)非常有用。在一些實(shí)施方案中，將本發(fā)明的反義寡核苷酸與從給定成體組織中誘導(dǎo)多能干細(xì)胞所需的其它轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合使用?？蓪⑦@些細(xì)胞進(jìn)一步引入損傷中并使其在體外或體內(nèi)分化成所需細(xì)胞類型。在一些實(shí)施方案中，給細(xì)胞或患者施用所述反義寡核苷酸以維持多能性和/或自我更新特征，且其適合于任何干細(xì)胞、祖細(xì)胞或任何衍生細(xì)胞。作為一個(gè)示例性實(shí)例，可將任何多能人ESC或各自的細(xì)胞系用于所述方法。本領(lǐng)域已良好建立得到這類細(xì)胞群的方法(參照例如 Thomson，J. Α.等[1998] Science 282，11451147 或 Cowan，C. Α.等[2004] N. Engl. J. Med. 350，1353-1356)。此外，例如已知存在71種獨(dú)立的人ESC系，其中11種細(xì)胞系可用于研究目的，例如GE01、GE09、BG01、BG02、TE06或WA09。成體干細(xì)胞可例如從產(chǎn)后留下的胎盤(pán)和臍帶的血中或從肌纖維中分離，其作為所謂的“衛(wèi)星細(xì)胞”與肌纖維聯(lián)系。當(dāng)意圖將所述方法用于祖細(xì)胞(即產(chǎn)生成熟體細(xì)胞的細(xì)胞)時(shí)，可在本發(fā)明的這種方法中使用任何祖細(xì)胞。適宜祖細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于，神經(jīng)元祖細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、 紅細(xì)胞祖細(xì)胞、心臟祖細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞、視網(wǎng)膜祖細(xì)胞或造血祖細(xì)胞。例如已發(fā)現(xiàn)祖細(xì)胞例如可從外周血獲得的內(nèi)皮祖細(xì)胞，具有Nanog和0ct_4的高表達(dá)水平。已報(bào)道CNS祖細(xì)胞(例如視網(wǎng)膜祖細(xì)胞)表達(dá)高水平Sox2。如上文所指出，所述反義寡核苷酸調(diào)節(jié)細(xì)胞中基因表達(dá)和/或功能。在一些實(shí)施方案中，內(nèi)源SOX基因功能活躍。在這些實(shí)施方案的某些中，各自的細(xì)胞為干細(xì)胞或祖細(xì)胞。可用于本發(fā)明方法的干細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于，胚胎干細(xì)胞、滋養(yǎng)層干細(xì)胞和胚外干細(xì)胞。因此在本發(fā)明方法的一些實(shí)施方案中，可使用ESC (胚胎干細(xì)胞)，例如人起源的 ESC，即人ESC。在其它實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為祖細(xì)胞。在又其它實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為癌細(xì)胞。癌細(xì)胞的示例性實(shí)例為畸胎瘤癌細(xì)胞，例如F9、NTERA2、C3H、TES_1、1M6(包括 1246-3A)、SuSa (包括 SuSalDXRlO 和 SK0V-3/DXR10)、AT805 (包括 ATDC5)、HTST, HGRT, PC(例如PCC3/A/1)或GCT27。癌細(xì)胞的兩個(gè)另外的示例性實(shí)例為HeLa細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為干細(xì)胞和體細(xì)胞的雜交細(xì)胞。在這些實(shí)施方案的某些中，選出了已建立真核細(xì)胞系的細(xì)胞，例如HEK、COS、CHO、CRE、MT4, DE (鴨胚)、QF (鵪鶉?yán)w維肉瘤)、賂0、8服、5€9、卩(12或圯811 5。一個(gè)示例性實(shí)例為HEK 293T細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，KLF4反義寡核苷酸重編程干細(xì)胞并調(diào)節(jié)自我更新。使干細(xì)胞與一種或多種KLF4反義寡核苷酸接觸。例如，KLF4在ES細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)抑制分化成為紅細(xì)胞祖細(xì)胞，并增強(qiáng)其產(chǎn)生次級(jí)胚狀體的能力。與0ct3/4和Sox2 —致，KLF4激活Lefty] (在ES細(xì)胞中表達(dá)的基因，但在分化過(guò)程中丟失)表達(dá)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，給一種或多種干細(xì)胞施用一種或多種反義KLF4寡核苷酸。所述細(xì)胞可為作為祖細(xì)胞從骨髓中分離的干細(xì)胞，或從任何其它來(lái)源例如ATCC獲得的細(xì)胞?！肮撬柩苌婕?xì)胞”(BMDC)或“骨髓衍生干細(xì)胞”是指具有自我更新組成性活性的機(jī)構(gòu)的原始干細(xì)胞。全能、多能和前體干細(xì)胞包含在此定義中。“前體細(xì)胞”可為在能夠分化成更成熟細(xì)胞的細(xì)胞分化途徑中的任何細(xì)胞。因此，術(shù)語(yǔ)“前體細(xì)胞群”是指能夠發(fā)育成更成熟細(xì)胞的細(xì)胞組。前體細(xì)胞群可包括全能細(xì)胞、多能細(xì)胞和受限的干細(xì)胞譜系細(xì)胞(即能夠發(fā)育成少于全部造血譜系或例如僅發(fā)育成紅細(xì)胞譜系細(xì)胞的細(xì)胞)。本文所用術(shù)語(yǔ)“全能細(xì)胞”是指能夠發(fā)育成細(xì)胞的全部譜系的細(xì)胞。類似地，術(shù)語(yǔ)“全能細(xì)胞群”是指能夠發(fā)育成細(xì)胞的全部譜系的細(xì)胞組合。同樣地，本文所用術(shù)語(yǔ)“多能細(xì)胞”是指能夠發(fā)育成多種 (雖然不是全部)譜系且至少能發(fā)育成全部造血譜系(例如，淋巴、紅細(xì)胞和血小板譜系) 的細(xì)胞。骨髓衍生干細(xì)胞包括兩種良好表征的干細(xì)胞類型。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)通常形成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞。造血干細(xì)胞(HSC)為中胚層來(lái)源的，其通常生成血液系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的細(xì)胞(例如，紅細(xì)胞、粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、巨核細(xì)胞和淋巴譜系)。此外，也已顯示造血干細(xì)胞具有分化成肝(包括肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞)、肺、腎(例如，腎小管上皮細(xì)胞和腎實(shí)質(zhì))、 胃腸道、骨骼肌纖維、eNS的星形膠質(zhì)細(xì)胞、Purkinje神經(jīng)元、心肌(例如，心肌細(xì)胞)、內(nèi)皮和皮膚的細(xì)胞的潛能。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸調(diào)節(jié)患者中KLF4的表達(dá)和/或功能，所述患者經(jīng)受與KLF4有關(guān)的疾病或病癥或處于形成與KLF4有關(guān)的疾病或病癥的風(fēng)險(xiǎn)中。許多疾病或病況可通過(guò)調(diào)節(jié)KLF4治療，包括干細(xì)胞更新和重編程。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物也包括變體，其中在所述化合物的一個(gè)或多個(gè)核苷酸位置上存在不同的堿基。例如，如果第一個(gè)核苷酸為腺苷，則可產(chǎn)生在此位置含有胸苷、鳥(niǎo)苷或胞苷的變體。這可在所述反義化合物的任何位置上完成。然后使用本文所述的方法來(lái)檢測(cè)這些化合物以確定其抑制靶核酸的表達(dá)的能力。調(diào)節(jié)KLF4表達(dá)、活性或任何功能的反義寡核苷酸也會(huì)調(diào)節(jié)與KLF4活性、功能或表達(dá)有關(guān)的細(xì)胞途徑中的因子。由KLF4調(diào)節(jié)的因子的實(shí)例在下表中顯示
因子/條件性激活靶標(biāo)因子/條件性阻遏靶標(biāo)
~1200015N20Rik
A33 抗原CDlld
B2R細(xì)胞周期蛋白Bl
CYPlAl細(xì)胞周期蛋白Dl
細(xì)胞角蛋白4細(xì)胞周期蛋白E
EBVED-L2F^f5
hSMVT組氨酸脫羧酶
~ ΑΡKLF2
iNOS層粘連蛋白al
角蛋白4fei
角蛋白19鳥(niǎo)氨酸脫羧酶
KLF4p5權(quán)利要求
1.一種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中重編程因子多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞或組織與至少一種長(zhǎng)度為5-30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述至少一種寡核苷酸與以下多核苷酸的反向互補(bǔ)序列具有至少50%序列同一性，所述多核苷酸包含在SEQ ID NO 4的核苷酸1-993、SEQ ID NO 5的核苷酸1-493和SEQ ID NO 6的核苷酸1-418之內(nèi)的5-30個(gè)連續(xù)核苷酸；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中重編程因子多核苷酸的功能和/或表達(dá)。
2.一種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中重編程因子多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞或組織與至少一種長(zhǎng)度為5-30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述至少一種寡核苷酸與重編程因子多核苷酸的天然反義物的反向互補(bǔ)序列具有至少50%序列同一性；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中重編程因子多核苷酸的功能和/或表達(dá)。
3.一種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中重編程因子多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞或組織與至少一種長(zhǎng)度為5-30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與重編程因子多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少50%序列同一性；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中重編程因子多核苷酸的功能和/或表達(dá)。
4.一種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中重編程因子多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞或組織與靶定重編程因子多核苷酸的天然反義寡核苷酸的區(qū)的至少一種反義寡核苷酸接觸；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中重編程因子多核苷酸的功能和/或表達(dá)。
5.權(quán)利要求4的方法，其中重編程因子的功能和/或表達(dá)在體內(nèi)或體外相對(duì)于對(duì)照增加。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶定重編程因子多核苷酸的天然反義序列。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶定核酸序列，所述核酸序列包括重編程因子多核苷酸的編碼和/或非編碼核酸序列。
8.權(quán)利要求4的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶定重編程因子多核苷酸的重疊和/或非重疊序列。
9.權(quán)利要求4的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸包含一種或多種選自以下的修飾至少一種經(jīng)修飾的糖部分、至少一種經(jīng)修飾的核苷間鍵、至少一種經(jīng)修飾的核苷酸及其組合。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述一種或多種修飾包括至少一種選自以下的經(jīng)修飾糖部分2’ -0-甲氧基乙基修飾的糖部分、2’ -甲氧基修飾的糖部分、2’ -0-烷基修飾的糖部分、二環(huán)糖部分及其組合。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述一種或多種修飾包括至少一種選自以下的經(jīng)修飾核苷間鍵硫代磷酸酯、2’ -0-甲氧基乙基(MOE)、2’ -氟、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯及其組合。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述一種或多種修飾包括至少一種選自以下的經(jīng)修飾核苷酸肽核酸(PNA)、鎖定核酸(LNA)、阿糖核酸(FANA)、其類似物、衍生物及組合。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種寡核苷酸包含至少一個(gè)如SEQID NO :7-17 所述的寡核苷酸序列。
14.一種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中重編程因子的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞或組織與至少一種長(zhǎng)度為5-30個(gè)核苷酸的短干擾RNA (siRNA)寡核苷酸接觸，所述至少一種siRNA寡核苷酸對(duì)重編程因子多核苷酸的反義多核苷酸有特異性，其中所述至少一種siRNA寡核苷酸與重編程因子多核苷酸的反義和/或有義核酸分子的至少約五個(gè)連續(xù)核酸的互補(bǔ)序列具有至少50%序列同一性；和，在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中重編程因子的功能和/或表達(dá)。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述寡核苷酸與至少約五個(gè)連續(xù)核酸的序列具有至少 80%序列同一性，所述序列與重編程因子多核苷酸的反義和/或有義核酸分子互補(bǔ)。
16.一種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中重編程因子的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞或組織與至少一種長(zhǎng)度為約5-30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸，所述反義寡核苷酸對(duì)重編程因子多核苷酸的有義和/或天然反義鏈的非編碼和/或編碼序列特異，其中所述至少一種反義寡核苷酸與至少一個(gè)如SEQ ID NO :1-3和4-6所述的核酸序列具有至少50%序列同一性；和，在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中重編程因子的功能和/或表達(dá)。
17.一種合成的、經(jīng)修飾的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含至少一種修飾，其中所述至少一種修飾選自至少一種經(jīng)修飾的糖部分；至少一種經(jīng)修飾的核苷酸間鍵；至少一種經(jīng)修飾的核苷酸及其組合；其中所述寡核苷酸為與正常對(duì)照相比在體內(nèi)或體外與重編程因子雜交并調(diào)節(jié)重編程因子的功能和/或表達(dá)的反義化合物。
18.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述至少一種修飾包括選自以下的核苷酸間鍵硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、 磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯及其組合。
19.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一種硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
20.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸間鍵的骨架。
21.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一種經(jīng)修飾的核苷酸，所述經(jīng)修飾的核苷酸選自肽核酸、鎖定核酸(LNA)、其類似物、衍生物及組合。
22.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多種修飾，其中所述修飾包括選自以下的經(jīng)修飾的核苷酸硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯及其組合。
23.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多種修飾，其中所述修飾包括選自以下的經(jīng)修飾的核苷酸肽核酸、鎖定核酸(LNA)、其類似物、衍生物及組合。
24.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一種選自以下的經(jīng)修飾的糖部分2’ -0-甲氧基乙基修飾的糖部分、2’ -甲氧基修飾的糖部分、2’ -0-烷基修飾的糖部分、二環(huán)糖部分及其組合。
25.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多種修飾，其中所述修飾包括選自以下的經(jīng)修飾的糖部分2’ -0-甲氧基乙基修飾的糖部分、2’ -甲氧基修飾的糖部分、 2’ -0-烷基修飾的糖部分、二環(huán)糖部分及其組合。
26.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸長(zhǎng)度為至少約5-30個(gè)核苷酸且與重編程因子多核苷酸的反義和/或有義鏈雜交，其中所述寡核苷酸與重編程因子多核苷酸的反義和/或有義編碼和/或非編碼核酸序列的至少約五個(gè)連續(xù)核酸的互補(bǔ)序列，具有至少約 20%序列同一性。
27.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與重編程因子多核苷酸的反義和/或有義編碼和/或非編碼核酸序列的至少約五個(gè)連續(xù)核酸的互補(bǔ)序列具有至少約80%序列同一性。
28.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中與正常對(duì)照相比，所述寡核苷酸在體內(nèi)或體外與至少一種重編程因子多核苷酸雜交并調(diào)節(jié)所述多核苷酸的表達(dá)和/或功能。
29.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含如SEQID NO :7_17所述的序列。
30.一種組合物，所述組合物包含對(duì)一種或多種重編程因子多核苷酸特異的一種或多種寡核苷酸，所述多核苷酸包括反義序列、互補(bǔ)序列、等位基因、同源物、同種型、變體、衍生物、突變體、片段或其組合。
31.權(quán)利要求30的組合物，其中所述寡核苷酸與如SEQID NO :7_17所述核苷酸序列中的任何一個(gè)相比，具有至少約40 %序列同一性。
32.權(quán)利要求30的組合物，其中所述寡核苷酸包含如SEQID NO :7_17所述的核苷酸序列。
33.權(quán)利要求32的組合物，其中如SEQID NO :7_17所述的寡核苷酸包含一種或多種修飾或取代。
34.權(quán)利要求33的組合物，其中所述一種或多種修飾選自硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、 肽核酸、鎖定核酸(LNA)分子及其組合。
35.一種預(yù)防或治療與至少一種重編程因子多核苷酸和/或至少一種其編碼產(chǎn)物有關(guān)的疾病的方法，所述方法包括給患者施用治療有效劑量的至少一種反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸與所述至少一種重編程因子多核苷酸的天然反義序列結(jié)合，并調(diào)節(jié)所述至少一種重編程因子多核苷酸的表達(dá)；從而預(yù)防或治療與至少一種重編程因子多核苷酸和/或至少一種其編碼產(chǎn)物有關(guān)的疾病。
36.權(quán)利要求35的方法，其中與至少一種重編程因子多核苷酸有關(guān)的疾病選自異常的重編程因子表達(dá)和/或功能、癌癥、腎病、心血管疾病或病癥、炎癥、神經(jīng)疾病或病癥、瘢痕形成、眼科疾病或病癥(例如，小眼、缺損、近視、無(wú)眼/小眼-食管閉鎖綜合征，等等)、視隔發(fā)育不全、自身免疫性疾病或病癥、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、免疫缺陷病、傳染劑(例如， 包括病毒、細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物等)引發(fā)的疾病、遺傳性疾病(例如杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良)、代謝疾病或病癥(例如糖尿病、肥胖癥、代謝綜合征、溶酶體病等)、創(chuàng)傷(例如脊髓損傷、燒傷， 等等)、缺血、血管疾病、肝臟疾病或病癥、銀屑病、疾病、需要移植細(xì)胞、組織和器官的疾病或病癥、需要干細(xì)胞治療的病癥或病況以及先天性疾病或病癥。
37.一種鑒定和選擇用于體內(nèi)施用的至少一種寡核苷酸的方法，所述方法包括選擇與疾病狀態(tài)有關(guān)的靶多核苷酸；鑒定包含至少五個(gè)連續(xù)核苷酸的至少一種寡核苷酸，所述連續(xù)核苷酸與所選的靶多核苷酸或與所選靶多核苷酸的反義多核苷酸互補(bǔ)；在嚴(yán)格雜交條件下，測(cè)定反義寡核苷酸與所述靶多核苷酸或所選靶多核苷酸的反義多核苷酸的雜合體的熱解鏈溫度；以及基于獲得的信息選擇用于體內(nèi)施用的至少一種寡核苷酸。
38.一種通過(guò)體細(xì)胞的核重編程制備誘導(dǎo)多能干(iPQ細(xì)胞的方法，所述方法包括 使所述體細(xì)胞與至少一種長(zhǎng)度為5-30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述至少一種寡核苷酸與以下多核苷酸的反向互補(bǔ)序列具有至少50%序列同一性，所述多核苷酸包含在SEQ ID NO 4的核苷酸1-401、SEQ ID NO 5的核苷酸1-493和SEQ ID NO 6的核苷酸 1-418之內(nèi)的5-30個(gè)連續(xù)核苷酸。
39.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種寡核苷酸包含至少一個(gè)如SEQID NO :7-17 所述的寡核苷酸序列。
40.一種通過(guò)權(quán)利要求1的方法獲得的誘導(dǎo)多能干(iPS)細(xì)胞。
41.一種用于干細(xì)胞治療的方法，所述方法包括根據(jù)權(quán)利要求1的方法獲得誘導(dǎo)多能干(iPQ細(xì)胞，誘導(dǎo)分化所述iPS細(xì)胞以獲得分化的iPS細(xì)胞，以及移植所述分化的iPS細(xì)胞至患者中。
全文摘要
本發(fā)明涉及反義寡核苷酸，具體而言，其通過(guò)靶定重編程因子的天然反義多核苷酸，來(lái)調(diào)節(jié)重編程因子的表達(dá)和/或功能。本發(fā)明還涉及這些反義寡核苷酸的鑒定及其在治療與重編程因子表達(dá)有關(guān)的疾病和病癥中的用途。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102575251SQ201080033673
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月18日
發(fā)明者J·科拉德, O·霍爾科瓦謝爾曼 申請(qǐng)人:歐科庫(kù)爾納有限責(zé)任公司