專利名稱：作為前列腺癌標志物的磷酸二酯酶4d7的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用作前列腺癌標志物的磷酸二酯酶4D7(PDE4D7)，以及PDE4D7作為用于診斷、檢測、監(jiān)測或預測前列腺癌或前列腺癌的進展的標志物的應用。本發(fā)明也涉及用于診斷、檢測、監(jiān)測或預測前列腺癌或前列腺癌的進展的組合物，對應的方法和免疫測定，用于相對于激素-敏感的前列腺癌而診斷、監(jiān)測或預測激素-抗性的前列腺癌的方法，對應的免疫測定，數(shù)據(jù)獲取方法，用于診斷、檢測、監(jiān)測或預測前列腺癌或前列腺癌的進展的免疫測定，鑒別個體對于前列腺癌治療的適合性(eligibility)的方法，用于分級 (stratify)具有前列腺癌疾病的一個個體或一群個體的免疫測定，用于分級具有前列腺癌的個體的免疫測定，以及藥物組合物，所述藥物組合物包含直接地刺激或調(diào)節(jié)PDE4D7的活性的化合物、間接地刺激或調(diào)節(jié)PDE4D7的活性的化合物、PDE4D7蛋白或其生物活性等效物、編碼和表達PDE4D7的核酸、對PDE4D7 miRNA特異性的miRNA抑制劑、脫甲基化劑和/ 或磷酸二酯酶置換因子。
背景技術：
癌癥是一類疾病，其中一群細胞表現(xiàn)出失控的生長、侵入，并有時表現(xiàn)出轉(zhuǎn)移。癌癥的這3種惡性性質(zhì)將它們與良性腫瘤區(qū)別開，所述良性腫瘤是自我限制的，不會侵入或轉(zhuǎn)移。在發(fā)達國家，在男性中，3種最常診斷出的癌癥是前列腺癌、肺癌和結(jié)直腸癌。具體地，在歐洲男性中，前列腺癌是最常見的惡性腫瘤。在2002年，在歐洲，據(jù)估計有225，000 位男性被新診斷出前列腺癌，約83，000人死于該病。已經(jīng)將某些磷酸二酯酶與癌癥發(fā)展相關聯(lián)。例如，已經(jīng)證實，磷酸二酯酶PDE7與慢性淋巴細胞白血病有關(Zhang L等人，PNAS，2008，105 09) :19532-7)。然而，對于許多癌癥類型或癌癥進展形式，沒有可利用的適當標志物分子。例如，傳統(tǒng)上通過前列腺-特異性的抗原(PSA)的血清水平，診斷前列腺癌。但是， PSA不是前列腺癌-特異性的，且可以在其它情況下升高，導致大量假陽性(在接受活組織檢查的、具有升高的PSA水平的男性中，約70%沒有發(fā)現(xiàn)癌癥)。此外，存在不可預測數(shù)目的假陰性，他們以后在有“正?！盤SA檢驗存在下發(fā)展成前列腺癌。因此，需要提供新的且有效的、替代性的診斷前景，其用于檢測、監(jiān)測和預測前列腺癌。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明滿足了該需要，并提供了裝置和方法，它們允許診斷和檢測前列腺癌。上述目的通過用作前列腺癌標志物的磷酸二酯酶4D7 (PDE4D7)來實現(xiàn)。發(fā)明人證實，磷酸二酯酶4D7在前列腺癌細胞系和患者衍生出的前列腺組織中被向下調(diào)節(jié)。因而，PDE4D7被視作前列腺癌預測的生物標志物，和用于分級某些癌癥監(jiān)督方案以及預測和監(jiān)測前列腺癌進展的判斷工具。具體地，發(fā)明人證實，PDE4D7在激素-抗性的人-衍生的前列腺細胞系以及對應的人組織樣品中被向下調(diào)節(jié)。因而，基于用作前列腺癌標志物的PDE4D7的診斷方法和應用可以有利地用于(i)檢測和診斷危及生命的前列腺癌形式，(ii)預測危及生命的前列腺癌形式，(iii)監(jiān)測癌癥向危及生命的前列腺癌形式的進展，和(iv)區(qū)分無痛的和危及生命的癌癥形式。在另一個方面，本發(fā)明涉及用于診斷、檢測、監(jiān)測或預測前列腺癌或前列腺癌的進展的組合物，所述組合物包含PDE4D7表達產(chǎn)物或蛋白的核酸親和配體和/或肽親和配體。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述組合物包含被修飾成起造影劑(contrast agent)作用的核酸親和配體或肽親和配體。 在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，所述組合物包含對PDE4D7表達產(chǎn)物特異性的寡核苷酸集合、對PDE4D7表達產(chǎn)物特異性的探針、對PDE4D7表達產(chǎn)物或蛋白特異性的適體、對PDE4D7蛋白特異性的抗體和/或?qū)DE4D7蛋白特異性的抗體變體。在另一個方面，本發(fā)明涉及PDE4D7作為用于診斷、檢測、監(jiān)測或預測前列腺癌或前列腺癌的進展的標志物的應用。在另一個方面，本發(fā)明涉及用于檢測、診斷、監(jiān)測或預測前列腺癌或前列腺癌的進展的方法，所述方法包括測定PDE4D7的水平的步驟。在另一個方面，本發(fā)明涉及用于診斷、監(jiān)測或預測激素-抗性的前列腺癌或向激素-抗性的前列腺癌的進展的方法，其中所述方法會辨別激素-敏感的和激素-抗性的前列腺癌，所述方法包括下述步驟(a)測定樣品中PDE4D7的水平；(b)測定樣品中參照基因的表達水平；(c)將測得的PDE4D7表達水平標準化成參照基因的表達；和對比標準化的表達水平和選擇用于排除激素-敏感的前列腺癌的預定截止值，其中低于截止值的標準化的表達水平指示著激素-抗性的前列腺癌，其中所述截止值是在約 1至7之間，優(yōu)選約5。在另一個方面，本發(fā)明涉及數(shù)據(jù)獲取方法，其至少包括下述步驟(a)測試個體中PDE4D7的表達；和(b)將在步驟(a)中測定的表達與對照水平相對比。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，所述診斷、檢測、監(jiān)測、預測或數(shù)據(jù)獲取是在從個體獲得的樣品上進行。在另一個方面，本發(fā)明涉及用于檢測、診斷、監(jiān)測或預測前列腺癌或前列腺癌的進展的免疫測定，其至少包括下述步驟(a)測試樣品中PDE4D7的表達，(b)測試對照樣品中PDE4D7的表達，(c)測定步驟(a)和(b)中PDE4D7的表達的差異；和(d)基于在步驟(C)中得到的結(jié)果，確定前列腺癌的存在或階段或前列腺癌的進展，其中所述測試步驟是基于特異性地結(jié)合PDE4D7的抗體的應用。在另一個方面，本發(fā)明涉及用于辨別激素-敏感的和激素-抗性的前列腺癌的免疫測定，所述免疫測定包括下述步驟(a)測定樣品中PDE4D7的水平；
(b)測定樣品中參照基因的表達水平；(c)將測得的PDE4D7表達水平標準化成參照基因的表達水平；和(d)對比標準化的表達水平和選擇用于排除激素-敏感的前列腺癌的預定截止值，其中低于截止值的標準化的表達水平指示著激素-抗性的前列腺癌，其中所述截止值是在約1至7之間，優(yōu)選約5。在另一個方面，本發(fā)明涉及鑒別個體對于前列腺癌治療的適合性的方法，所述方法包括(a)測試從個體獲得的樣品中PDE4D7的表達；(b)測試所述樣品中參照基因的表達，和/或測試對照樣品中PDE4D7的表達；(c)相對于步驟(b)中對照樣品中PDE4D7的水平，分類步驟(a)的表達水平；和(d)在個體的樣品被分類為具有降低的PDE4D7表達水平的情況下，將該個體鑒別為適合接受前列腺癌治療。在另一個方面，本發(fā)明涉及用于分級具有前列腺癌疾病的一個個體或一群個體的免疫測定，其包括(a)測試從個體獲得的樣品中PDE4D7的表達；(b)測試所述樣品中參照基因的表達，和/或測試對照樣品中PDE4D7的表達；(c)測定步驟(a)中PDE4D7的表達與步驟(b)中PDE4D7和/或參照基因的表達的差異；和(d)在個體的樣品具有降低的PDE4D7表達水平的情況下，基于在步驟(c)中得到的結(jié)果，將一個個體或一群個體分級給前列腺癌治療。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，通過測量核酸或蛋白水平，或通過測定 PDE4D7或參照基因的生物活性，完成所述表達的測試或測定，或另外完成。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，所述方法或免疫測定包括下述額外步驟將測得的核酸或蛋白水平或測得的生物活性與對照水平相對比。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，所述參照基因是持家基因，特別優(yōu)選GAPDH 或PB⑶，或不同的磷酸二酯酶，特別優(yōu)選PDE4D5。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，所述方法或免疫測定包括下述額外步驟測定前列腺特異性的抗原(PSA)的水平。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，如上所述的樣品是組織樣品、尿樣品、尿沉積物樣品、血液樣品、唾液樣品、精液樣品、包含循環(huán)腫瘤細胞的樣品、或包含前列腺分泌的外核體的樣品。在另一個方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含至少一種選自下述的組分(a)直接地刺激或調(diào)節(jié)PDE4D7的活性的化合物，優(yōu)選PDE4D7酶活性的變構(gòu)激動劑；(b)間接地刺激或調(diào)節(jié)PDE4D7的活性的化合物；(c)PDE4D7蛋白或其生物活性等效物；(d)編碼和表達PDE4D7的核酸；(e)對 PDE4D7miRNA 特異性的 miRNA 抑制劑；(f)脫甲基化劑；和
(g)磷酸二酯酶置換因子。由于磷酸二酯酶4D7在疾病-相關的細胞系中被向下調(diào)節(jié)，PDE4D7本身和調(diào)節(jié) PDE4D7、調(diào)節(jié)PDE4D7表達或調(diào)節(jié)PDE4D7相互作用的試劑，可以有利地用作藥物。因而，通過抵消觀察到的向下調(diào)節(jié)過程，PDE4D7和/或PDE4D7調(diào)節(jié)劑可以用作藥物，例如用作抵消與低PDE4D7表達或它的向下調(diào)節(jié)有關的所有或某些作用的藥物。在另一個方面，本發(fā)明涉及用于治療或預防前列腺癌的藥物組合物，其包含至少一種選自下述的組分(a)直接地刺激或調(diào)節(jié)PDE4D7的活性的化合物，優(yōu)選PDE4D7酶活性的變構(gòu)激動劑；(b)間接地刺激或調(diào)節(jié)PDE4D7的活性的化合物；(c)PDE4D7蛋白或其生物活性等效物；(d)編碼和表達PDE4D7的核酸；(e)對 PDE4D7miRNA 特異性的 miRNA 抑制劑；(f)脫甲基化劑；和(g)磷酸二酯酶置換因子。由于磷酸二酯酶4D7在癌細胞系中被向下調(diào)節(jié)，PDE4D7本身和調(diào)節(jié)PDE4D7或調(diào)節(jié) PDE4D7表達或調(diào)節(jié)PDE4D7相互作用的試劑，可以有利地用作藥物，用于治療癌癥，尤其是用于治療前列腺癌。因而，通過抵消觀察到的向下調(diào)節(jié)過程，PDE4D7和/或PDE4D7調(diào)節(jié)劑可以用作藥物，其抵消癌性細胞中、尤其是前列腺癌細胞中的低PDE4D7表達和/或PDE4D7 向下調(diào)節(jié)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，上文所述的前列腺癌治療包括施用上文定義的藥物組合物，或與其它癌癥療法(優(yōu)選放射療法或化學療法)組合地施用上文定義的藥物組合物。在另一個方面，本發(fā)明涉及治療或預防癌癥、尤其是前列腺癌的方法，所述方法包括給個體施用(a)直接地刺激或調(diào)節(jié)PDE4D7的活性的化合物，優(yōu)選PDE4D7酶活性的變構(gòu)激動劑；(b)間接地刺激或調(diào)節(jié)PDE4D7的活性的化合物；(c)PDE4D7蛋白或其生物活性等效物；(d)編碼和表達PDE4D7的核酸；(e)對 PDE4D7miRNA 特異性的 miRNA 抑制劑；(f)脫甲基化劑；和/或(g)磷酸二酯酶置換因子。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，如上所述的磷酸二酯酶置換因子是肽、肽擬似物、小分子、抗體或適體。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，所述前列腺癌是激素-抗性的前列腺癌。從下面的詳細描述，結(jié)合附圖和實施例，會明白本發(fā)明的這些和其它特性、特征和目的，所述附圖和實施例作為例證，證實了本發(fā)明的原理。描述僅僅為了舉例而給出，不是限制本發(fā)明的范圍。


圖1給出了測試的樣品的表達水平的概要。AD是指“依賴于雄激素的”，AS表示 “雄激素敏感的”，且AI是指“獨立于雄激素的”。樣品“PC346P異種移植物”至“346Flu2” 是細胞系，樣品吁以95”至“PC374”是異種移植物。圖2描述了與LNCaP相比，標準化成GAPDH的幾種前列腺癌細胞系和異種移植物中的相對PDE4D7mRNA表達。該圖提供了所有研究的樣品(包括細胞系和異種移植物材料) 的概要。圖3描述了與LNCaP相比，標準化成GAPDH的前列腺癌細胞系中的相對 PDE4D7mRNA 表達。圖4描述了與LNCaP相比，標準化成GAPDH的前列腺癌異種移植物中的相對 PDE4D7mRNA 表達。圖5顯示了表示為前列腺癌細胞系和異種移植物中的總PDE4DmRNA的百分比的 PDE4D7含量。該圖提供了所有研究的樣品(包括細胞系和異種移植物材料)的概要。圖6顯示了表示為前列腺癌細胞系中的總PDE4D mRNA的百分比的PDE4D7含量。圖7顯示了表示為前列腺癌異種移植物中的總PDE4D mRNA的百分比的PDE4D7含量。圖8顯示了人患者組織樣品中人PDE4D7的相對基因表達。信息源自共16個不同的樣品，如表1所示(包括淋巴結(jié)切除的組織)。樣品組“1 =無”被定義為激素-響應性的原發(fā)性前列腺腫瘤，樣品組“2 =有”被定義為激素-抗性的前列腺腫瘤。指出了人前列腺組織的人PDE4D7的單個相對表達值。將結(jié)果標準化為GAPDH和PB⑶的表達。為每個患者組指出了數(shù)據(jù)相對數(shù)據(jù)測量的中位值。圖9顯示了人患者組織樣品中人PDE4D7的相對基因表達。信息源自共16個不同的樣品，如表1所示(包括淋巴結(jié)切除的組織)。樣品組“1”被定義為激素-響應性的原發(fā)性前列腺腫瘤，樣品組“2”被定義為激素-抗性的前列腺腫瘤。將結(jié)果標準化為GAPDH和 PBGD的表達。該圖顯示了人PDE4D7的單個數(shù)據(jù)相對表達測量的框圖，因此該框包括所有測量的75%。中間相對表達值被指示為2個彩色框之間的邊界。圖10顯示了人患者組織樣品中人PDE4D7的相對基因表達。信息源自共12個不同的樣品，如表1所示(不包括淋巴結(jié)切除的組織)。樣品組“1 =無”被定義為激素-響應性的原發(fā)性前列腺腫瘤，樣品組“2 =有”被定義為激素-抗性的前列腺腫瘤。將結(jié)果標準化為GAPDH和PB⑶的表達。顯示了人前列腺組織的人PDE4D7的單個相對表達值。給出了每個患者組的數(shù)據(jù)相對數(shù)據(jù)測量的中位值。圖11顯示了人患者組織樣品中人PDE4D7的相對基因表達。信息源自共12個不同的樣品，如表1所示(不包括淋巴結(jié)切除的組織)。樣品組“1”被定義為激素-響應性的原發(fā)性前列腺腫瘤，樣品組“2”被定義為激素-抗性的前列腺腫瘤。將結(jié)果標準化為GAPDH 和PB⑶的表達。該圖顯示了人PDE4D7的單個數(shù)據(jù)相對表達測量的框圖，因此該框包括所有測量的75%。中間相對表達值被指示為2個彩色框之間的邊界。圖12顯示了人PDE4D7體內(nèi)表達對PC3前列腺癌細胞的增殖的影響。
具體實施例方式發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，PDE4D7在某些前列腺癌-相關的細胞類型和人患者組織中被強烈地向下調(diào)節(jié)，且因此可以用作前列腺癌的生物標志物。PDE4D7以及調(diào)節(jié)PDE4D7或調(diào)節(jié) PDE4D7表達的試劑可以進一步用作藥物，尤其是用于治療前列腺癌。盡管將關于特定實施方案描述本發(fā)明，該描述不應以限制性的意義進行解釋。在詳細描述本發(fā)明的示例性實施方案之前，給出對于理解本發(fā)明而言重要的定義。如在本說明書和所附的權利要求書中所使用的，單數(shù)形式“一個”和“一種”也包括各自的復數(shù)形式，除非上下文另有清楚指示。在本發(fā)明的上下文中，術語“約”和“大約”表示本領域技術人員會理解的準確度區(qū)間，其仍然確保目標特征的技術效果。該術語通常表示，從指示的數(shù)值偏離士20%、優(yōu)選士 15%、更優(yōu)選士 10%、甚至更優(yōu)選士5%。應當理解，術語“包含”不是限制性的。為了本發(fā)明的目的，術語“由......組成”
視作術語“包含......”的一個優(yōu)選實施方案。如果在下文中將一個集合定義為至少包含
特定數(shù)目的實施方案，這是表示，也包括優(yōu)選地僅由這些實施方案組成的集合。此外，術語“第一”、“第二”、“第三”或“ (a) ”、“ (b) ”、“ (C) ”、“ (d) ”等在說明書和權利要求書中用于區(qū)分類似的要素，不一定用于描述先后次序或時間次序。應當理解，這樣使用的術語在適當?shù)那闆r下是可互換的，且本文描述的本發(fā)明的實施方案能夠以不同于本文描述或例證的次序來運行。在術語“第一”、“第二”、“第三”或“(a) ”、“ (b) ”、“(C) ”、“ (d) ”等涉及方法或使用
步驟的情況下，在步驟之間沒有時間或時間間隔相干性，即所述步驟可以同時進行，或在這樣的步驟之間可以存在數(shù)秒、數(shù)分鐘、數(shù)小時、數(shù)天、數(shù)周、數(shù)月或甚至數(shù)年的時間間隔，除非在本文上面或下面闡述的說明書中另有指示。應當理解，本發(fā)明不限于本文描述的特定的方法學、方案、蛋白、細菌、載體、試劑等，因為它們可以變化。還應當理解，本文使用的術語僅用于描述特定實施方案的目的，無意限制僅由所附權利要求書來限定的本發(fā)明的范圍。除非另有定義，在本文中使用的所有技術和科學術語具有與本領域普通技術人員通常理解相同的含義。如上所述，本發(fā)明在一個方面涉及用作前列腺癌標志物的磷酸二酯酶 4D7 (PDE4D7)。術語“磷酸二酯酶4D7”或“PDE4D7”是指人磷酸二酯酶PDE4D的剪接變體 7，即人磷酸二酯酶PDE4D7基因，優(yōu)選在Genbank登錄號AF536976 (版本AF536976. 1,GI 2^01883，截止于2009年3月3日)中定義的序列，更優(yōu)選在SEQ ID NO :1中所述的核苷酸序列(其對應著PDE4D7轉(zhuǎn)錄物的上面指出的Genbank登錄號的序列)，以及在SEQ ID NO 2中所述的對應的氨基酸序列(其對應著由PDE4D7轉(zhuǎn)錄物編碼的PDE4D7多肽的上面指出的Genbank登錄號的序列)。該術語也包括表現(xiàn)出與PDE4D7的高度同源性的核苷酸序列， 例如與在SEQ ID NO :1中所述的序列具有至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核酸序列，或與在SEQ ID NO :2中所述的序列具有至少 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 同一性的氨基酸序列，或這樣的核酸序列，其編碼與在SEQ ID NO :2中所述的序列具有至少 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 同一性的氨基
10酸序列，或這樣的氨基酸序列，其由與在SEQ ID N0:1中所述的序列具有至少75%、80%、 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 同一性的核酸序列編碼。本文使用的術語“人磷酸二酯酶PDE4D7基因”、“PDE4D7基因”或“PDE4D7標記基因”是指編碼磷酸二酯酶4D的基因。優(yōu)選地，該術語是指表達磷酸二酯酶4D為剪接變體7 的基因，例如在Genbank登錄號AF536976 (版本AF536976. 1,GI :2四01883，截止于2009年 3月3日)中所定義的或在SEQ ID NO 1中所述的特定外顯子組合。該術語還表示這樣的 DNA分子，其源自編碼磷酸二酯酶4D剪接變體7的mRNA轉(zhuǎn)錄物，優(yōu)選cDNA分子。本文使用的術語“標志物”或“PDE4D7標志物”是指上文定義的基因、遺傳單位或序列(核苷酸序列或氨基酸或蛋白序列)，與對照水平或狀態(tài)相比，其在癌性細胞中或在癌性組織中或在包含癌性細胞或癌性組織或其部分或片段的任意類型的樣品中的表達水平被改變，優(yōu)選地降低。該術語也表示所述遺傳單位或序列的任意表達產(chǎn)物，尤其是PDE4D7mRNA 轉(zhuǎn)錄物，由PDE4D7轉(zhuǎn)錄物或其變體或片段編碼的多肽，以及上文所述的其同源衍生物。本文使用的術語“表達水平”表示從確定量的細胞或確定的組織部分可衍生出的PDE4D7轉(zhuǎn)錄物和/或PDE4D7蛋白的量，優(yōu)選地表示在標準的核酸(例如RNA)或蛋白提取方法中可得到的PDE4D7轉(zhuǎn)錄物和/或PDE4D7蛋白的量。合適的提取方法是本領域技術人員已知的。本文使用的術語“對照水平”(或“對照狀態(tài)”)是指，使用以前從一位或多位已知其疾病狀態(tài)(例如非癌性的)的受試者收集并儲存的樣品，與實驗樣品同時和/或在類似的或相當?shù)臈l件下可以測得的表達水平。術語“疾病狀態(tài)”或“癌性疾病狀態(tài)”是指在非癌性的細胞狀態(tài)和(包括)末期癌細胞狀態(tài)之間的細胞或分子狀況的任意狀態(tài)或類型。優(yōu)選地，該術語包括在(且不包括)非癌性的細胞狀態(tài)和(包括)末期癌細胞狀態(tài)之間的生物體的不同的癌性增殖/發(fā)展階段或腫瘤發(fā)展水平。這樣的發(fā)展階段可以包括按照Uicc的定義進行的惡性腫瘤的TNM(腫瘤、結(jié)節(jié)、轉(zhuǎn)移)分類系統(tǒng)的所有階段，例如0期和I-IV期。 該術語也包括在 M 0期之前的階段，例如發(fā)展階段，其中本領域技術人員已知的癌癥生物標志物表現(xiàn)出改變的表達或表達模式。如上所述的表達水平可以優(yōu)選地是上文定義的PDE4D7的表達水平。替換地或額外地，所述表達水平也可以是在細胞中表達的任意其它合適的基因或遺傳元件的表達水平，優(yōu)選地在PDE4D7的背景下，例如另一種磷酸二酯酶的表達水平，持家基因(例如GAPDH 或PB⑶)的表達水平。在本發(fā)明的上下文中，術語“癌性的”是指上文定義的癌性的疾病狀態(tài)。在癌性對照的上下文中，優(yōu)選的對照水平是惡性的、激素-敏感的腫瘤中的PDE4D7的表達。在本發(fā)明的上下文中，術語“非癌性的”是指其中良性和惡性增殖都不可檢測出的病癥。適合所述檢測的裝置是本領域已知的。在非癌性對照的上下文中，優(yōu)選的對照水平是正常的(即健康的或非癌性的)組織中PDE4D7的表達，或良性前列腺腫瘤組織中PDE4D7 的表達。本文使用的術語“良性前列腺腫瘤”表示這樣的前列腺腫瘤其缺少癌癥的所有3 種惡性性質(zhì)，即不會以不受限制的、侵入性的方式生長，不會侵入周邊組織，和不會轉(zhuǎn)移。通常，良性前列腺腫瘤是指溫和的且非漸進性的前列腺瘤形成或腫脹疾病，其缺少癌癥的侵入性質(zhì)。此外，良性前列腺腫瘤通常是被包裹的，因而它們的以惡性形式發(fā)展的能力受到抑制。通過本領域技術人員已知的任意合適的、獨立的分子的、組織學或生理學方法，可以確定良性腫瘤或健康狀況。
或者，基于分析以前測定的本發(fā)明的PDE4D7標記基因在已知其疾病狀態(tài)的受試者的樣品中的表達水平所得到的結(jié)果，通過統(tǒng)計方法，可以確定對照水平。此外，對照水平可以源自來自以前測試的受試者或細胞的表達模式的數(shù)據(jù)庫。此外，本發(fā)明的標記基因在要測試的生物樣品中的表達水平可以與多個對照水平相對比，所述對照水平從多個參照樣品測得。優(yōu)選地，使用從這樣的參照樣品測得的對照水平其源自與患者-衍生的生物樣品類似的組織類型。特別優(yōu)選地，使用源自一位或多位受試者的樣品，所述受試者的疾病狀態(tài)是上文定義的非癌性的，即其呈現(xiàn)其中良性和惡性增殖都不可檢測出的健康狀態(tài)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，可以從這樣的參照樣品測定對照水平其源自已經(jīng)診斷出遭受前列腺癌(例如激素-不依賴的或激素-抗性的前列腺癌)的受試者?；蛘?，參照樣品可以包含源自細胞系(例如永生化癌細胞系)的物質(zhì)，或可以源自組織異種移植物。優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的參照樣品中，可以包含源自前列腺癌細胞系的物質(zhì)，或源自具有人前列腺組織(尤其是良性和腫瘤-衍生的人前列腺組織)的組織異種移植物的物質(zhì)。優(yōu)選的癌細胞系的實例包括細胞系PC346P、PC346B、LNCaP, VCaP, DuCaP, PC346C、PC3、DU145、PC346CDD、PC346Flul、PC346Flu2。優(yōu)選的異種移植物的實例包括 PC295、PC310、PC-EW、PC82、PC133、PCi;35、PC324 和 PC374。優(yōu)選地，可以使用細胞系和異種移植物的整個集合，例如人PC346集合。進一步優(yōu)選的是在Marques等人，2006，Eur. Urol.， 49(2) :245-57中所述的細胞系和異種移植物。在另一個優(yōu)選的替代方案中，參照樣品可以源自在臨床環(huán)境中得到的患者組織或組織集合或組織群體。所述樣品可以，例如，從接受手術的男性患者得到。所述樣品可以源自任意合適的組織類型，例如源自前列腺組織或淋巴結(jié)?；颊呓M織群體的優(yōu)選實例來自前列腺外科手術(例如，前列腺切除術)。此外，優(yōu)選地，使用本發(fā)明的PDE4D7標志物在具有已知疾病狀態(tài)的人群中的表達水平的標準值。通過本領域已知的任意方法，可以得到標準值。例如，平均值士2SD(標準差)或平均值士3SD的范圍，可以用作標準值。此外，使用以前從一位或多位已知其疾病狀態(tài)是癌性的受試者(即其已經(jīng)獨立地被診斷出遭受某些癌癥類型，例如前列腺癌、尤其是激素-依賴性的、激素-敏感的或激素-抗性的前列腺癌)收集并儲存的樣品，與實驗樣品同時和/或在類似的或相當?shù)臈l件下，也可以測定對照水平。在本發(fā)明的上下文中，從已知不是癌性的生物樣品測得的對照水平，被稱作“正常的對照水平”。如果從癌性的生物樣品(例如來自獨立地診斷出前列腺癌、尤其是激素-依賴性的、激素-敏感的或激素-抗性的癌癥的受試者的樣品)測定對照水平，它可以命名為 “癌性的對照水平”。術語“前列腺癌”是指男性生殖系統(tǒng)中的前列腺的癌癥，當前列腺的細胞突變并開始失控地繁殖時，發(fā)生該癌癥。通常，前列腺癌與升高的前列腺-特異性的抗原(PSA)水平有關。在本發(fā)明的一個實施方案中，術語“前列腺癌”是指表現(xiàn)出大于4. 0的PSA水平的癌癥。在另一個實施方案中，該術語是指表現(xiàn)出大于2.0的PSA水平的癌癥。術語“PSA水平” 表示血液中前列腺特異性的抗原(PSA)的濃度(ng/ml)。術語“激素-依賴性的前列腺癌”是指，前列腺癌或前列腺癌細胞系的生長和/或增殖依賴于男性性激素刺激。CN 102549167 A
術語“激素-敏感的前列腺癌”是指，前列腺癌或前列腺癌細胞系的生長和增殖對男性性激素刺激是敏感的。術語“敏感的”是指這樣的情況在有男性性激素存在下，前列腺癌或前列腺癌細胞系顯示出生化或細胞反應模式，但是其生長和/或增殖確實需要男性性激素。術語“激素-抗性的前列腺癌”是指，前列腺癌或前列腺癌細胞系的生長和增殖對男性性激素刺激是抗性的。該術語還表示不再順從抗-激素(優(yōu)選上文定義的抗-雄激素)給藥的晚期前列腺癌發(fā)展階段。本文使用的術語“男性性激素”表示雄激素、優(yōu)選睪酮、雄烯二酮、二氫睪酮、脫氫表雄酮、雄烯二醇或雄酮。在另一個方面，本發(fā)明涉及PDE4D7作為用于診斷、檢測、監(jiān)測或預測前列腺癌或前列腺癌的進展的標志物的應用。本文使用的術語“診斷前列腺癌”是指，與上文定義的對照水平相比，優(yōu)選地與上文定義的正常的對照水平相比，當本發(fā)明的PDE4D7標志物的表達水平被改變、優(yōu)選地被降低或向下調(diào)節(jié)時，可以認為受試者或個體遭受前列腺癌。術語“診斷”也表示通過該對比過程得出的結(jié)論。在本發(fā)明的上下文中，術語“調(diào)節(jié)”或“調(diào)節(jié)的表達水平”因而表示表達水平的變化。當PDE4D7基因表達(例如在要分析的樣品中)與對照水平相差了例如5^^6^^7%, 8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%或超過50%時，或與對照水平相差了至少 0. 1倍、至少0. 2倍、至少1倍、至少2倍、至少5倍或至少10倍或更多時，認為表達水平是 “變化的”。所述對照水平可以是上文定義的正常的對照水平或癌性的對照水平。如果與癌性的對照水平進行對比，與正常的對照水平的額外對比是優(yōu)選的。這樣的額外對比允許測定調(diào)節(jié)的趨勢，即觀察表達水平的升高或降低。術語“調(diào)節(jié)”優(yōu)選地是指，實驗樣品與對照水平相比，PDE4D7標志物的表達水平的降低或向下調(diào)節(jié)，或PDE4D7標志物表達的完全抑制。所述對照水平可以是上文定義的正常的對照水平或癌性的對照水平。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述對照水平是癌性的對照水平，其源自激素-依賴性的前列腺腫瘤或組織或與其相關，更優(yōu)選地源自激素-敏感的前列腺腫瘤或組織或與其相關。在本發(fā)明的上下文中，術語“降低的表達水平”或“向下調(diào)節(jié)的表達水平”或“表達水平的降低”(它們可以同義地使用)因而表示，要分析的情形(例如可從患者的樣品衍生出的情形)相對于參考點的PDE4D7表達水平的降低，所述參考點可以是正常的對照水平，或可從本領域技術人員已知的任意合適的癌癥階段(優(yōu)選激素-依賴性的、更優(yōu)選激素-敏感的前列腺腫瘤階段)衍生出的癌性的對照水平。當PDE4D7 基因表達與對照水平相比降低了例如5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、 40%、50%或超過50%時，或與對照水平相比降低了至少0. 1倍、至少0. 2倍、至少1倍、至少2倍、至少5倍或至少10倍或更多時，優(yōu)選地與激素-依賴性的或激素-敏感的前列腺腫瘤對照相比，認為表達水平是“降低的”或“向下調(diào)節(jié)的”。在另一個實施方案中，從受試者和上文定義的癌性參照物得到的樣品之間的總基因表達模式的額外相似性指示，所述受試者正在遭受癌癥。在本發(fā)明的另一個實施方案中， 該診斷可以與其它癌癥生物標志物表達水平的闡明相結(jié)合。例如，可以測試諸如PSA等生物標志物的表達。
當與上文定義的對照水平(例如上文定義的正常的對照水平)相比，本發(fā)明的 PDE4D7標志物的表達水平被改變、優(yōu)選地被降低或向下調(diào)節(jié)時，可以認為診斷出癌癥、尤其是前列腺癌。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，如果與對照水平相比，優(yōu)選地與源自激素-依賴性的腫瘤對照或激素-敏感的前列腺腫瘤對照的對照表達水平相比，實驗樣品中上文定義的PDE4D7表達水平降低了 20 %至80 %的值，優(yōu)選30 %、40 %、50 %、60 %或70 %的值，可以認為診斷出前列腺癌。在另一個優(yōu)選的實施方案中，如果與對照水平相比，實驗樣品中上文定義的PDE4D7表達水平降低了 20 %至90 %的值，優(yōu)選30 %、40 %、50 %、60 %、70 %或80 % 的值，可以認為診斷出激素-抗性的前列腺癌。所述對照水平可以是正常的對照水平或癌性的對照水平，優(yōu)選地可源自激素-依賴性的或激素-敏感的前列腺癌。本文使用的術語“檢測前列腺癌”是指，可以測定癌性疾病或障礙在生物體中的存在，或在生物體中可以鑒別出癌性疾病或障礙。通過對比本發(fā)明的PDE4D7標志物的表達水平和上文定義的正常的對照水平，可以測定或鑒別癌性疾病或障礙。當PDE4D7標志物的表達水平與上文定義的癌性的對照水平類似時，可以檢測出癌癥、尤其是前列腺癌。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，如果PDE4D7標志物的表達水平與建立的前列腺癌細胞或細胞系 (例如上文提及的前列腺癌細胞系)的癌生的對照水平類似，可以檢測出前列腺癌。本文使用的術語“監(jiān)測前列腺癌”是指，診斷的或檢測的癌性疾病或障礙的伴隨物 (accompaniment)，例如在治療過程中，或在特定時間段內(nèi)，通常在2個月、3個月、4個月、6 個月、1年、2年、3年、5年、10年期間，或任意其它時間段。術語“伴隨物”是指上文定義的疾病的狀態(tài)，具體地，通過在任意類型的周期時間段中，例如每周、每2周、每月、每2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11或12個月、每1. 5年、每2、3、4、5、6、7、8、9或10年，在任意時間段內(nèi)，例如分別在 2 周、3 周、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 個月、1. 5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15 或 20年內(nèi)，將本發(fā)明的PDE4D7標志物在樣品中的表達水平與上文定義的正常的或癌性的對照水平(優(yōu)選源自激素-依賴性的腫瘤對照或激素-敏感的前列腺腫瘤對照的對照表達水平)進行對比，可以檢測出這些疾病狀態(tài)的變化。癌性的對照水平可以源自與不同的癌癥發(fā)展階段(例如 M分類系統(tǒng)的0期和I-IV期)相對應的樣品。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，該術語是指診斷的前列腺癌(更優(yōu)選激素-依賴性的和激素-敏感的前列腺癌) 的伴隨物。在另一個實施方案中，監(jiān)測也可以用于激素-抗性的前列腺癌的伴隨物，例如在治療過程中。監(jiān)測還可以包括檢測額外的基因或遺傳元件的表達，例如持家基因如GAPDH 或PB⑶，或其它磷酸二酯酶、優(yōu)選PDE4D5。本文使用的術語“預測前列腺癌”表示，預測診斷的或檢測的癌性疾病的進程或結(jié)果，例如在特定時間段內(nèi)、在治療期間或在治療以后。該術語也表示測定從疾病存活或恢復的機會，以及預測受試者的預期存活時間。具體地，預測可以包括，確定受試者在到將來的時間段內(nèi)存活的可能性，諸如6個月、1年、2年、3年、5年、10年或任意其它時間段。本文使用的術語“前列腺癌的進展”是指，在不同的前列腺癌發(fā)展階段之間轉(zhuǎn)換， 例如 Μ分類的0期和I-IV期，或任意其它階段或子階段，從健康狀況開始直到終末癌癥情況。通常，這樣的轉(zhuǎn)換伴有與來自相同個體的以前的實驗樣品相比，例如與源自激素-依賴性的前列腺腫瘤或腫瘤對照或激素-敏感的前列腺腫瘤或腫瘤對照的樣品相比， 實驗樣品中PDE4D7的表達水平的改變，優(yōu)選降低。如果與來自相同個體的以前的實驗樣品相比，實驗樣品中上文定義的PDE4D7表達水平降低了 3% -50%的值、優(yōu)選10%、15%、 20%或25%的值，可以認為檢測出或診斷出前列腺癌的進展。在任意時間段內(nèi)，優(yōu)選地在 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 個月、1. 5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15 或 20 年內(nèi)，可以檢測出所述改變，即通過對比在第一個時間點時和在上面指出的時間段以后的第二個時間點時的 PDE4D7的表達水平，可以計算出上面指出的值。在一個具體的實施方案中，所述進展可以是向激素-抗性的前列腺癌的進展。在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案中，術語“前列腺癌的進展”是指從激素-依賴性的或激素-敏感的前列腺癌狀態(tài)轉(zhuǎn)換為激素-抗性的前列腺癌狀態(tài)。如果與來自相同個體(其已經(jīng)被診斷為遭受激素-敏感的或激素-依賴性的前列腺癌)的以前的實驗樣品相比，實驗樣品中上文定義的PDE4D7表達水平降低了 3% -50% 的值、優(yōu)選10^^15^^20%或25%的值，可以認為檢測出或診斷出從激素-依賴性的或激素-敏感的前列腺癌狀態(tài)向激素-抗性的前列腺癌狀態(tài)的進展。如果與來自其它個體的實驗樣品、來自組織群體的實驗樣品、來自數(shù)據(jù)庫的值等進行對比，也可以認為檢測出進展。在任意時間段內(nèi)，優(yōu)選地在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 個月、1. 5、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、15或20年內(nèi)，可以檢測出所述改變，即通過對比在第一個時間點時和在上面指出的時間段以后的第二個時間點時的PDE4D7的表達水平，可以計算出上面指出的值。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及發(fā)展前列腺癌、更優(yōu)選激素-抗性的前列腺癌的傾向的診斷和檢測。在本發(fā)明的上下文中，“發(fā)展前列腺癌的傾向”和具體地“發(fā)展激素-抗性的前列腺癌的傾向”是發(fā)展前列腺癌、尤其是激素-抗性的前列腺癌的風險的狀態(tài)。優(yōu)選地，在上文定義的PDE4D7表達水平低于上文定義的癌性的對照水平(例如源自明顯地遭受激素-敏感的前列腺癌的受試者的組織或樣品的參照表達水平)的情況下，可能存在發(fā)展激素-抗性的前列腺癌的傾向。本文使用的術語“低于”是指，與癌性的對照水平相比，PDE4D7的表達水平降低了約40% -80 %，優(yōu)選地降低了約50%?；蛘撸谙率銮闆r下，可能存在在本發(fā)明的上下文中的發(fā)展癌癥的傾向其中給出了上文定義的PDE4D7表達水平，且其中另外的、替代性的癌癥標志物(例如PSA)沒有表現(xiàn)出表達水平或表達模式的改變。合適的其它的癌癥標志物是本領域技術人員已知的。因而，如果觀察到上述情形之一，可以認為診斷出或檢測出向前列腺癌、尤其是激素-抗性的前列腺癌的傾向?？梢詫嶒炆飿悠返谋磉_水平和對照水平之間的差異標準化為其它對照核酸的表達水平，所述其它對照核酸例如，已知其表達水平不隨細胞的癌性或非癌性狀態(tài)而變化的持家基因。除了別的以外，示例性的對照基因包括肌動蛋白、甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、膽色素原脫氨酶(PBGD)和核糖體蛋白Ρ1。還可以使用其它的磷酸二酯酶，優(yōu)選地使用在不同的腫瘤階段表現(xiàn)出不變的表達模式的人磷酸二酯酶，進行標準化。優(yōu)選的磷酸二酯酶是PDE4D5或PDE4D家族的任意其它同種型，例如PDE4D1、PDE4D2、PDE4D3、PDE4D4、 PDE4D6、PDE4D8 或 PDE4D9。在本發(fā)明的上下文中，術語“診斷”和“預測”還意在包括預測和可能性分析。用作標志物的PDE4D7因此可以在臨床上用于做出關于治療模態(tài)的決定，包括治療性干預或診斷標準，諸如疾病的監(jiān)督。根據(jù)本發(fā)明，可以提供用于檢查受試者的狀態(tài)的中間結(jié)果。這樣的中間結(jié)果可以與其它信息相組合，以輔助醫(yī)生、護士、或其它從業(yè)人員診斷受試者遭受該疾病。或者，本發(fā)明可以用于檢測受試者-衍生的組織中的癌性細胞，并給醫(yī)生提供有用的信息，以診斷受試者遭受該疾病。根據(jù)本發(fā)明要診斷、監(jiān)測的受試者或個體，或要在其中檢測或預測前列腺癌、前列腺癌的進展、或向前列腺癌的傾向的受試者或個體，是動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人類。特別優(yōu)選的是，在使用PDE4D7作為診斷、檢測、監(jiān)測或預測前列腺癌或前列腺癌的進展的標志物的背景下，使用本領域技術人員已知的分子成像工具，例如磁共振成像 (MRI)和/或磁光子共振成像(MPI)技術。例如，在允許在線檢測人受試者內(nèi)的診斷標志物的方案(如MRI或MPI)中，PDE4D7可以用作用于診斷、檢測、監(jiān)測或預測前列腺癌或前列腺癌的進展的標志物。在另一個方面，本發(fā)明涉及一種組合物，其用于診斷、檢測、監(jiān)測或預測個體中前列腺癌或前列腺癌的進展或向前列腺癌的傾向。根據(jù)本發(fā)明的組合物可以包含PDE4D7表達產(chǎn)物或蛋白的核酸親和配體或肽親和配體。本文使用的術語“PDE4D7表達產(chǎn)物的核酸親和配體”表示，能夠特異性地結(jié)合源自PDE4D的剪接變體7的PDE4D7轉(zhuǎn)錄物或DNA分子的核酸分子，甚至更優(yōu)選在SEQ ID NO 1中描述的DNA序列，或在SEQ ID NO 1中描述的序列的互補DNA序列或?qū)腞NA分子。所述核酸親和配體還可以能夠特異性地結(jié)合這樣的DNA序列其與在SEQ ID N0:1中所述的序列具有至少 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%同一性，或編碼與在SEQ ID NO :2中所述的序列具有至少75%、80%、85%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的DNA序列，或所述序列的任意片段。本文使用的術語“PDE4D7蛋白的肽親和配體”表示能夠特異性地結(jié)合PDE4D7蛋白的肽分子。所述肽分子可以優(yōu)選地能夠特異性地結(jié)合這樣的蛋白或多肽其包含在SEQ ID NO :2中所述的氨基酸序列。所述肽親和配體還可以能夠特異性地結(jié)合這樣的蛋白或多肽其包含由與在SEQ ID NO :1中所述的序列具有至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的DNA序列編碼的氨基酸序列，或包含與在 SEQ ID NO :2 中所述的序列具有至少 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95196197198%或99%同一性的氨基酸序列的蛋白或多肽，或所述序列的任意片段。 術語“肽”表示包含超過2個氨基酸的任意類型的氨基酸序列，例如多肽結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)或其功能衍生物。此外，所述肽可以與其它化學部分或官能團相組合。本文使用的術語“表達產(chǎn)物”表示通過PDE4D基因的表達所產(chǎn)生的PDE4D7轉(zhuǎn)錄物或mRNA分子。更優(yōu)選地，該術語是指上文定義的加工過的PDE4D轉(zhuǎn)錄物，例如通過在SEQ ID NO 1中所述的序列。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的組合物包含選自下述的核酸親和配體和肽親和配體對PDE4D7表達產(chǎn)物特異性的寡核苷酸集合、對PDE4D7表達產(chǎn)物特異性的探針、對PDE4D7表達產(chǎn)物或?qū)DE4D7蛋白特異性的適體、對PDE4D7蛋白特異性的抗體和對 PDE4D7蛋白特異性的抗體變體。例如，本發(fā)明的組合物可以包含對PDE4D7表達產(chǎn)物特異性的寡核苷酸集合和/ 或?qū)DE4D7表達產(chǎn)物特異性的探針。本文使用的術語“對PDE4D7表達產(chǎn)物特異性的寡核苷酸”表示與PDE4D的剪接變體7的有義鏈或反義鏈互補的核苷酸序列。優(yōu)選地，所述寡核苷酸與在SEQ ID NO 1中描述的DNA序列互補，或與在SEQ ID NO 1中描述的序列的互補DNA序列互補。所述寡核苷酸序列還可以與下述DNA序列互補其與在SEQ ID NO :1中所述的序列具有至少 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%同一性，或編碼與在SEQ ID NO :2中所述的序列具有至少75%、80%、85%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 同一性的氨基酸序列。所述寡核苷酸可以具有本領域技術人員已知的任意合適的長度和序列，其可以從 SEQ ID NO :1的序列或它的互補序列衍生出。通常，所述寡核苷酸可以具有8至60個核苷酸、優(yōu)選 10 至；35 個核苷酸的長度，更優(yōu)選 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、沈、27、觀、29、30、31、32或33個核苷酸的長度。在本領域技術人員已知的軟件工具的幫助下，可以定義對PDE4D7表達產(chǎn)物特異性的寡核苷酸序列。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述寡核苷酸序列可以與位于PDE4D7基因的外顯子1或外顯子2中的序列互補，與位于PDE4D7基因的外顯子1和外顯子2之間的邊界中的序列互補，或與僅位于PDE4D7基因的外顯子2中的序列互補，優(yōu)選地與PDE4D7的271 個獨特核苷酸(即42個在外顯子1的3’末端處的核苷酸，和2 個PDE4D的外顯子2的 5’_端核苷酸)區(qū)段互補。例如，可用作正向引物的寡核苷酸可以位于PDE4D7基因的外顯子1和外顯子2之間的邊界處，可用作反向引物的寡核苷酸可以位于PDE4D7基因的外顯子 2中。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，寡核苷酸集合具有在SEQ ID NO :3和SEQ ID NO 4中所述的序列。進一步優(yōu)選的是，具有或包含在SEQ ID NO :7和/或SEQ ID NO 8中所述的序列的寡核苷酸。本文使用的術語“對PDE4D7表達產(chǎn)物特異性的探針”是指，與PDE4D的剪接變體7的有義鏈或反義鏈互補的核苷酸序列。優(yōu)選地，所述探針與在SEQ ID NO :1中描述的 DNA序列互補，或與在SEQ ID NO :1中描述的序列的互補DNA序列互補。所述探針還可以與下述DNA序列互補其與在SEQ ID NO :1中所述的序列具有至少75%、80%、85%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 同一性，或編碼與在 SEQ ID NO :2 中所述的序列具有至少 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%同一性的氨基酸序列。所述探針可以具有本領域技術人員已知的任意合適的長度和序列，其可以從SEQ ID NO :1的序列或它的互補序列衍生出。通常，所述探針可以具有6至300個核苷酸、優(yōu)選 15 至 60 個核苷酸的長度，更優(yōu)選 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個核苷酸的長度。在本領域技術人員已知的軟件工具的幫助下，可以定義對PDE4D7表達產(chǎn)物特異性的探針序列。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述探針序列可以與位于PDE4D7基因的外顯子1 或外顯子2中的序列互補，優(yōu)選地與PDE4D7的271個獨特核苷酸(即42個在外顯子1的 3’末端處的核苷酸，和2 個PDE4D的外顯子2的5’-端核苷酸)區(qū)段互補。如果所述探針要用于定量PCR反應，例如實時PCR，可以將所述探針設計成，使它位于正向和反向引物的結(jié)合位置之間的位置。優(yōu)選地，可以將所述探針設計成，使它位于引物寡核苷酸之一附近。更優(yōu)選地，它可以位于正向引物附近。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述探針具有在SEQ ID NO :5或SEQ ID NO 9中所述的序列。本發(fā)明的組合物可以額外地或替換地包含對PDE4D7表達產(chǎn)物或蛋白特異性的適體。本文使用的術語“對PDE4D7表達產(chǎn)物特異性的適體”表示能夠特異性地結(jié)合PDE4D的剪接變體7的短的核酸分子，例如RNA、DNA、PNA、CNA、HNA、LNA或ANA或本領域技術人員已知的任意其它合適的核酸形式，優(yōu)選源自PDE4D的剪接變體7的DNA分子。更優(yōu)選地，所述核酸適體分子可以特異性地結(jié)合在SEQ ID NO :1中描述的DNA序列或其雙鏈衍生物。根據(jù)本發(fā)明的核酸適體還可以結(jié)合與PDE4D7轉(zhuǎn)錄物相對應的RNA分子，優(yōu)選與SEQ ID N0:1所述的DNA序列相對應的RNA分子。所述核酸適體另外可以能夠特異性地結(jié)合這樣的DNA序列其與在SEQ ID NO 1 中所述的序列具有至少 75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%, 98%或99%同一性，或編碼與在SEQ ID NO :2中所述的序列具有至少75%、80 %、85 %、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 同一性的氨基酸序列，或與這些序列相對應的RNA分子。通過特異性地結(jié)合僅存在于所述剪接變體中的序列，例如外顯子2，或在PDE4D的外顯子1和外顯子2之間的外顯子邊界，可以賦予核酸適體對PDE4D的剪接變體7的特異性。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，通過特異性地結(jié)合位于PDE4D7的271個獨特核苷酸 (即42個在外顯子1的3’末端處的核苷酸，和2 個PDE4D的外顯子2的5’-端核苷酸) 區(qū)段內(nèi)的序列，可以賦予核酸適體對PDE4D的剪接變體7的特異性。根據(jù)本領域技術人員已知的任意合適的方法，例如通過體外選擇或SELEX方法，可以制備核酸適體。優(yōu)選地，根據(jù)在Ellington和&ostak，1990，Nature, 346 :818-822中提供的指南，可以制備和/或設計核酸適體。根據(jù)本發(fā)明的核酸適體另外可以與其它部分(例如相互作用部分如生物素或酶官能團如核酶元件)相組合。本文使用的術語“對PDE4D7蛋白特異性的適體”表示能夠特異性地結(jié)合PDE4D7蛋白并與其相互作用的短肽。所述肽適體可以優(yōu)選地能夠特異性地結(jié)合這樣的蛋白或多肽 其包含在SEQ ID NO :2中所述的氨基酸序列。所述肽適體還可以能夠特異性地結(jié)合這樣的蛋白或多肽其包含由與在SEQ ID而1中所述的序列具有至少75%、80%、85%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的DNA序列編碼的氨基酸序列，或其包含與在SEQ ID NO :2中所述的序列具有至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。通常，肽適體是可變的肽環(huán)，其包含例如10-20個氨基酸。在本發(fā)明的背景下，所述肽適體可以優(yōu)選地在一端或兩端連接到支架結(jié)構(gòu)上。所述支架結(jié)構(gòu)可以是具有良好溶解度性質(zhì)的任意分子，優(yōu)選蛋白。合適的支架分子是本領域技術人員已知的。要用在本發(fā)明的背景下的一種優(yōu)選的支架分子是細菌蛋白硫氧還蛋白-A。所述適體肽環(huán)可以優(yōu)選地插入支架分子的還原活性部位內(nèi)?；蛘?，葡萄球菌蛋白A及其結(jié)構(gòu)域和這些結(jié)構(gòu)域的衍生物，諸如蛋白Z或脂質(zhì)運載蛋白可以用作在本發(fā)明的上下文中的支架結(jié)構(gòu)。根據(jù)本領域技術人員已知的任意合適的方法，例如通過酵母雙雜種方案，可以制備肽適體。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，所述組合物可以包含或可以額外地包含對 PDE4D7蛋白特異性的抗體，優(yōu)選單克隆或多克隆抗體。也優(yōu)選的是，抗體變體或片段，如單鏈抗體、雙特異抗體、微體(minibody)、單鏈Fv片段(sc (Fv))、sc (Fv) 2抗體、基于單克隆 PDE4D7特異性的抗體的Fab片段或F(ab，)2片段、小模塊免疫藥物(SMIP)、結(jié)合域免疫球蛋白融合蛋白、駱駝源化的抗體(camelized antibodies)、含有Vhh的抗體等。所述抗體可以是單價的、二價的、三價的或多價的。所述抗體可以來自任意來源，例如鼠、人、或嵌合的或人源化的鼠抗體。在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，可商業(yè)得到的抗-PDE4D7抗體如 NB300-652 (Novus Biologicals, Inc.)或 GTX14629 (GeneTex，Inc.)可以包含在所述組合物中，或可以診斷地使用。根據(jù)本領域技術人員已知的任意合適的方法，可以生產(chǎn)抗體。通過用選擇的抗原免疫動物，可以生產(chǎn)多克隆抗體，而使用例如K0hler和Milstein開發(fā)的雜交瘤技術 ( KohleriP Milstein, 1976, Eur. J. Immunol.，6 :511-519)，可以生產(chǎn)具有確定的特異性的單克隆抗體?？梢杂貌煌臉酥疚飿擞浫缟衔乃龅挠H和配體，或可以通過用不同標志物標記的第二親和配體來檢測，以允許檢測、顯影和/或定量。這可以使用任意合適的標記來實現(xiàn)，使用本領域技術人員已知的任意合適的技術或方法，可以將所述標記綴合到能夠與 PDE4D7表達產(chǎn)物或PDE4D7蛋白相互作用的親和配體上，或綴合到任意第二親和配體上。術語“第二親和配體”表示能夠結(jié)合上文定義的親和配體(如果用于具有2個相互作用親和配體的系統(tǒng)的背景下，即“第一親和配體”)的分子。結(jié)合相互作用優(yōu)選地是特異性的結(jié)合。可以綴合到第一和/或第二親和配體上的標記的實例包括熒光染料或金屬(例如熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、熒光胺)、發(fā)色染料(例如視紫質(zhì))、化學發(fā)光的化合物(例如魯米諾、咪唑)和生物發(fā)光的蛋白(例如螢光素、螢光素酶)、半抗原(例如生物素)。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，可以用熒光標記(如6-FAM、HEX、ΤΕΤ、ROX、Cy3、 Cy5、德克薩斯紅或羅丹明)和/或同時用猝滅標記(如TAMRA、Dabcyl、黑洞猝滅劑、BHQ-I 或BHQ-幻來標記要用作探針(尤其是上文定義的對PDE4D7表達產(chǎn)物特異性的探針)的親和配體。多種其它有用的熒光劑和生色團描述在Stryer，1968，Science，162 :5沈_533。 還可以用酶(例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β -內(nèi)酰胺酶)、放射性同位素(例如咕、 ^、^、^、^、^、 、^、 、呷^⑶^⑶嚴^^^他、^^或18ρ)或顆粒(例如金)，標記親和配體。使用不同的化學反應，例如胺反應或硫醇反應，可以將不同類型的標記綴合到親和配體上。但是，也可以使用除了胺和硫醇以外的其它反應基團，例如醛、羧酸和谷氨酰胺。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的核酸親和配體或肽親和配體可以被修飾成起造影劑作用。本文使用的術語“造影劑”表示這樣的分子化合物，其能夠與PDE4D7標志物特異性地相互作用，且其可以通過放在人或動物體外的儀器檢測到。優(yōu)選地，這樣的造影劑適用
于磁共振成像(MRI)或磁光子成像(MPI)。術語“與......特異性地相互作用”表示分子化
合物的下述性質(zhì)其與存在于人或動物體內(nèi)的細胞的細胞表面上的PDE4D7標志物的相互作用優(yōu)先于由這樣的細胞表達的其它蛋白。也可以命名為造影劑組合物的優(yōu)選造影劑能夠特異性地檢測具有SEQ ID NO 1的核苷酸序列或SEQ ID NO 2的氨基酸序列的分子，或上文定義的其衍生物或同源變體。優(yōu)選的造影劑是上文定義的對PDE4D7表達產(chǎn)物或PDE4D7蛋白特異性的適體以及上文定義的對PDE4D7蛋白特異性的抗體。除了它們的能夠特異性地識別PDE4D7標志物的性質(zhì)以外，造影劑通常另外包含
通過使用的特定檢測技術可以檢測到的另一種分子。本文使用的術語“修飾成起......的
作用”因而表示本領域技術人員已知的任意合適的修飾，其可能是必要的，以便允許將所述造影劑用于分子成像方法中，尤其是用于MRI或MPI中。例如，如果將熒光光譜法用作檢測方法，這樣的分子可以包含熒光團作為可檢測的標志物分子，其可以在特定波長激發(fā)。或者，可以采用放射性標記，例如如上文所述的放射性同位素。關于適合MRI的根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選造影劑，所述造影劑(諸如上述的抗體)可以包含可通過MRI檢測到的標志物分子。這樣的可檢測的標記包括例如USPIOS和19Fluor。在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，組合物可以另外包含助劑如PCR緩沖劑、 dNTPs、聚合酶、離子(如二價陽離子或單價陽離子)、雜交溶液、第二親和配體(如例如第二抗體)、檢測染料和基于上文定義的任意親和配體或造影劑進行檢測必需的任意其它合適的化合物或液體，這是本領域技術人員已知的。在另一個方面，本發(fā)明涉及上文定義的PDE4D7表達產(chǎn)物或蛋白的核酸親和配體或肽親和配體用于制備組合物的應用，所述組合物如上文所述用于診斷、檢測、監(jiān)測或預測個體中的前列腺癌或前列腺癌的進展或向前列腺癌的傾向。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及上文定義的對PDE4D7表達產(chǎn)物特異性的寡核苷酸集合和/或?qū)DE4D7表達產(chǎn)物特異性的探針用于制備組合物的應用，所述組合物如上文所述用于診斷、檢測、監(jiān)測或預測個體中的前列腺癌或前列腺癌的進展或向前列腺癌的傾向。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及上文定義的對PDE4D7表達產(chǎn)物或蛋白特異性的適體用于制備組合物的應用，所述組合物如上文所述用于診斷、檢測、監(jiān)測或預測個體中的前列腺癌或前列腺癌的進展或向前列腺癌的傾向。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及上文定義的對PDE4D7蛋白特異性的抗體或?qū)DE4D7蛋白特異性的抗體變體用于制備組合物的應用，所述組合物如上文所述用于診斷、檢測、監(jiān)測或預測個體中的前列腺癌或前列腺癌的進展或向前列腺癌的傾向。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，上文定義的組合物是診斷組合物。在另一個方面，本發(fā)明涉及用于檢測、診斷、監(jiān)測或預測前列腺癌或前列腺癌的進展或向前列腺癌的傾向的診斷試劑盒，其包含對PDE4D7表達產(chǎn)物特異性的寡核苷酸集合、對PDE4D7表達產(chǎn)物特異性的探針和/或?qū)DE4D7表達產(chǎn)物或蛋白特異性的適體和/ 或?qū)DE4D7蛋白特異性的抗體和對PDE4D7蛋白特異性的抗體變體。通常，本發(fā)明的診斷試劑盒包含一種或多種藥物，所述藥物允許上文定義的 PDE4D7的特異性檢測。根據(jù)本發(fā)明，診斷試劑盒的藥物或成分可以包含在一個或多個容器或單獨的實體中。所述藥物的性質(zhì)由試劑盒的目標檢測方法決定。在預期在PDE4D7mRNA 表達水平進行檢測(即通過PDE4D7表達產(chǎn)物)的情況下，要包含的藥物可以是上文定義的對PDE4D7表達產(chǎn)物特異性的寡核苷酸集合和/或?qū)DE4D7表達產(chǎn)物特異性的探針，它們可以任選地根據(jù)本領域已知的方法進行標記，例如使用上文所述的標記。額外地或替換地， 可以包含對PDE4D7表達生產(chǎn)特異性的適體。在預期在PDE4D7蛋白水平進行檢測的情況下，要包含的藥物可以是抗體或化合物，其含有如上文所述的對PDE4D7蛋白特異性的抗體或抗體變體的抗原結(jié)合片段。額外地或替換地，可以包含對PDE4D7蛋白特異性的適體?；蛘撸\斷試劑盒可以包含上文定義的造影劑。使用與PDE4D7特異性地相互作用的其它化合物，例如特異性的底物或配體，也可以檢測特異性蛋白的存在。優(yōu)選地，本發(fā)明的診斷試劑盒含有PDE4D7表達產(chǎn)物或PDE4D7蛋白的檢測劑。這樣的檢測劑包括例如，緩沖液、標記物或洗滌液等。此外，所述試劑盒可以包含一定量的已知的核酸分子或蛋白，其可以用于試劑盒的校準，或用作內(nèi)部對照。通常，用于檢測PDE4D7 表達產(chǎn)物的診斷試劑盒可以包含助劑如PCR緩沖劑、dNTPs、聚合酶、離子(如二價陽離子或單價陽離子)、雜交溶液等。用于檢測PDE4D7蛋白的診斷試劑盒也可以包含助劑如第二親和配體(例如第二抗體)、檢測染料和本領域技術人員已知的進行蛋白檢測必需的任意其它合適的化合物或液體。這樣的成分是本領域技術人員已知的，且可以隨進行的檢測方法而變化。另外，所述試劑盒可以包含說明書活頁，和/或可以提供關于得到的結(jié)果的關聯(lián)性的信息。在另一個方面，本發(fā)明涉及用于檢測、診斷、監(jiān)測或預測個體中前列腺癌或前列腺癌的進展的方法，所述方法至少包括下述步驟測定樣品中PDE4D7的水平。術語“測定 PDE4D7的水平”表示測定PDE4D7表達產(chǎn)物(例如PDE4D7轉(zhuǎn)錄物)的存在或量，和/或測定PDE4D7蛋白的存在和/或量。術語“PDE4D7的水平”因而表示PDE4D7表達產(chǎn)物(例如 PDE4D7轉(zhuǎn)錄物)的存在或量，和/或PDE4D7蛋白的存在或量的測定。通過本領域已知的任意方式，可以完成PDE4D7表達產(chǎn)物(例如PDE4D7轉(zhuǎn)錄物)或PDE4D7蛋白的存在或量的測定。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，通過測量核酸或蛋白水平，或通過測定PDE4D7 的生物活性，完成PDE4D7表達產(chǎn)物(例如PDE4D7轉(zhuǎn)錄物)和/或PDE4D7蛋白的存在或量的測定。因而，通過包含下述內(nèi)容的方法，可以測定PDE4D7表達水平檢測由PDE4D7基因編碼的mRNA，檢測由PDE4D7轉(zhuǎn)錄物編碼的PDE4D7蛋白，和/或檢測PDE4D7蛋白的生物活性。例如，可以如下評價PDE4D7表達的核酸水平的測量通過在瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠中分離從樣品得到的核酸分子(例如RNA或cDNA)，隨后與上文定義的PDE4D7特異性的寡核苷酸探針雜交?；蛘?，可以如下測定表達水平標記從樣品得到的核酸，隨后在測序凝膠上分離。可以將核酸樣品放在凝膠上，使得患者和對照或標準核酸處于相鄰的泳道中。 可以通過目檢或借助于光密度計，對比表達水平。用于檢測mRNA或表達產(chǎn)物的方法是本領域技術人員已知的。通常，RNA印跡分析可以用于這樣的目的?；蛘?，可以在DNA陣列或微陣列方案中，檢測PDE4D7表達的核酸水平。通常，優(yōu)選地使用熒光標記處理和標記源自要測試的受試者的樣品核酸。隨后，這樣的核酸分子可以用于雜交方案中，所述雜交方案使用固定化的與本發(fā)明的PDE4D7標記基因相對應的捕獲探針，或已知的生物標志物或癌標記基因。適合進行微陣列分析的方法是本領域技術人員已知的。在一個標準設置中，DNA陣列或微陣列包含固定化的高密度探針，以檢測多個基因。在陣列上的探針與標記基因序列的一個或多個部分互補，或與標記基因的整個編碼區(qū)互補。在本發(fā)明中，可以將任意類型的PDE4D7相關的多核苷酸用作DNA陣列的探針，只要所述多核苷酸允許在PDE4D7表達和其它基因表達之間的特異性區(qū)分。通常，cDNA、PCR產(chǎn)
21物和寡核苷酸可以用作探針。優(yōu)選地，包含PDE4D的剪接變體7的特定部分的探針可以用作探針。除了 PDE4D7表達的測定以外，還可以進行其它基因(例如其它生物標志物或癌標記基因)表達的測定。基于DNA陣列或微陣列的檢測方法通常包括下述步驟(1)從樣品分離mRNA，并任選地將mRNA轉(zhuǎn)化成cDNA，隨后標記該RNA或cDNA。在微陣列技術手冊中，描述了用于分離 RNA、將它轉(zhuǎn)化成cDNA的方法和用于標記核酸的方法。(2)使來自步驟1的核酸與標記基因的探針雜交?？梢杂弥T如熒光染料Cy3(紅)或Cy5(藍)等染料，標記來自樣品的核酸。 通常，用不同的染料來標記對照樣品。(3)檢測來自樣品的核酸與探針的雜交，并至少定性地、更特別地定量地測定樣品中PDE4D7和/或研究的其它標記基因的mRNA的量?；谛盘枏姸鹊牟町悾梢怨罍y樣品和對照之間表達水平的差異。通過適當?shù)能浖?，例如，但不限于由例如Affymetrix提供的軟件，可以測量和分析它們。與使用的標記基因相對應的、印跡在DNA陣列上的探針的數(shù)目沒有限制。另外，標記基因可以由2個或更多個探針來表示，所述探針與基因的不同部分雜交。為每個選擇的標記基因，設計探針。這樣的探針通常是包含5-50個核苷酸殘基的寡核苷酸。通過PCR或化學方法，可以合成更長的DNA。用于合成這樣的寡核苷酸并將它們應用在基底上的方法是微陣列領域眾所周知的。除了標記基因以外的基因也可以印跡在DNA陣列上。例如，可以將其表達水平不顯著改變的基因的探針印跡在DNA陣列上，以標準化試驗結(jié)果，或?qū)Ρ榷鄠€陣列或不同試驗的試驗結(jié)果?；蛘?，可以在定量RT-PCR方案中，優(yōu)選地在反轉(zhuǎn)錄PDE4D7mRNA轉(zhuǎn)錄物以后的實時 PCR方案中，檢測PDE4D7表達的核酸水平。通常，作為第一步，根據(jù)本領域技術人員已知的任意合適的方法，將轉(zhuǎn)錄物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA分子。隨后可以基于如上所述得到的第一個DNA 鏈，進行定量或?qū)崟rPCR方案。優(yōu)選地，Taqman或分子信標探針(作為這類主要基于FRET的探針)可以用于定量PCR檢測。在兩種情況下，所述探針、優(yōu)選上文定義的PDE4D7探針用作內(nèi)部探針，它們與側(cè)接目標區(qū)域的一對相對引物(優(yōu)選上文定義的PDE4D7寡核苷酸集合)一起使用。在擴增目標區(qū)段以后，所述探針可以選擇性地結(jié)合在引物位點之間的鑒別序列處的產(chǎn)物，從而造成FRET信號傳遞的增加(與靶物頻率的增加有關)。優(yōu)選地，要用于根據(jù)本發(fā)明的定量PCR方案中的Taqman探針可以包含約22_30 個堿基的上面定義的PDE4D7寡核苷酸，其在兩端用FRET對進行標記。通常，5'末端具有更短波長的熒光團諸如熒光素(例如FAM)，3'末端通常用更長波長的熒光猝滅劑(例如 TAMRA)或無熒光的猝滅劑化合物(例如黑洞猝滅劑)進行標記。優(yōu)選地，要用于定量PCR 的探針(尤其是上文定義的PDE4D7探針)在與報道分子染料鄰近的5'末端處不具有鳥嘌呤(G)，以便避免所述探針在被降解以后報道分子熒光的猝滅。要用于根據(jù)本發(fā)明的定量PCR方案中的分子信標探針優(yōu)選地使用FRET相互作用來檢測和定量PCR產(chǎn)物，每個探針具有5'熒光標記的末端和3'猝滅劑-標記的末端。 所述探針結(jié)構(gòu)的該發(fā)夾或莖-環(huán)構(gòu)型優(yōu)選地包含具有2個短自結(jié)合末端的莖，和具有約 20-30個堿基的長內(nèi)靶-特異性區(qū)域的環(huán)。也可以用于本發(fā)明背景下的替代性的檢測機理涉及僅由環(huán)結(jié)構(gòu)制成的探針，其沒有短的互補莖區(qū)域。也可以用于本發(fā)明背景下的定量PCR的一個替代性的基于FRET的方案是基于結(jié)合靶物上的相鄰部位的2個雜交探針的使用，其中第一個探針具有在3’末端處的熒光供體標記，第二個探針具有在其5’末端處的熒光受體標記。通過本領域已知的任意合適的檢測技術，可以測量PDE4D7蛋白或其任意片段、同源物或源于其的衍生物的蛋白水平。優(yōu)選地，可以免疫學地測定PDE4D7和其衍生物的蛋白水平，例如通過使用對PDE4D7蛋白特異性的抗體，優(yōu)選上文定義的抗體?；蛘撸梢允褂蒙衔亩x的抗體變體或片段。本發(fā)明也預見到使用肽親和配體，如上文定義的對PDE4D7蛋白特異性的適體。可以測定PDE4D7蛋白的蛋白水平，例如，通過在聚丙烯酰胺凝膠上從樣品分離蛋白，隨后在蛋白印跡分析中使用特異性地結(jié)合抗體，鑒別PDE4D7蛋白?；蛘?，通過二維凝膠電泳系統(tǒng)，可以分離蛋白。二維凝膠電泳是本領域眾所周知的，且通常包含沿著第一維的等電聚焦，繼之以沿著第二維的SDS-PAGE電泳。2維SDS-PAGE凝膠的分析，可以通過測定凝膠上的蛋白印跡的強度來進行，或可以使用免疫檢測來進行。在其它實施方案中，通過質(zhì)譜法，分析蛋白樣品。在本發(fā)明的背景下，可以將PDE4D7特異性的抗體放在支持物上，并固定化。隨后可以將源自要分析的樣品或組織的蛋白與抗體相混合。然后可以進行檢測反應，例如使用上文定義的第二親和配體，優(yōu)選使用特異性的抗體?？梢栽诒景l(fā)明的背景下使用(尤其是用于本發(fā)明的診斷目的)的免疫試驗包括，例如，使用諸如蛋白印跡等技術的競爭性的和非競爭性的試驗系統(tǒng)，放射免疫測定如 RIA(放射相關的免疫測定)、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、“夾心”免疫測定、免疫沉淀測定、 沉淀素反應、凝膠擴散沉淀素反應、免疫擴散測定、凝集測定(例如膠乳凝集反應)、補體結(jié)合測定、免疫放射分析、熒光免疫測定例如FIA(熒光-相關的免疫測定)、化學發(fā)光免疫測定、電化學發(fā)光免疫測定(ECLIA)和蛋白A免疫測定。這樣的測定是常規(guī)的，且是本領域技術人員眾所周知的。此外，通過競爭性的結(jié)合測定，可以測定抗體與抗原的結(jié)合親和力和抗體-抗原相互作用的解離速率(off-rate)。競爭性的結(jié)合測定的一個實例是放射免疫測定，其包括 在有遞增量的未標記的抗原存在下，用合適的抗體溫育標記的抗原(例如，咕或125I)，并檢測與標記的抗原結(jié)合的抗體。通過任意合適的分析方案，例如通過斯卡恰特作圖分析，可以從數(shù)據(jù)測定目標抗體對特定抗原的親和力和結(jié)合解離速率。使用放射免疫測定，也可以測定與第二抗體的競爭。在該情況下，可以在有遞增量的未標記的第二抗體存在下，用綴合到標記的化合物(例如，咕或1251)上的合適的抗體溫育抗原。另外，對PDE4D7蛋白特異性的適體(優(yōu)選地如上文所定義)可以用于檢測PDE4D7 蛋白的方法中?？梢詢?yōu)選地標記這樣的適體，以便允許檢測蛋白-配體相互作用。通過采用對PDE4D7的對應的一種或多種功能特異性的分子或酶測定，可以測定 PDE4D7的生物活性。優(yōu)選地，可以使用基于磷酸二酯酶對cAMP的轉(zhuǎn)化的讀出系統(tǒng)。合適的技術是本領域技術人員已知的。在另一個優(yōu)選的實施方案中，可以與抑制其它PDE4D剪接變體、其它PDE4同種型和/或其它PDE(優(yōu)選能夠進行cAMP的轉(zhuǎn)化的其它PDE)的活性相組合地，進行測定PDE4D7的生物活性的試驗。通過本領域技術人員已知的任意合適的方式，優(yōu)選地通過使用合適的反義核苷酸、siRNA分子或miRNA分子，更優(yōu)選地通過特異性地雜交反義核苷酸、特異性的siRNA或miRNA分子，可以進行這樣的活性抑制。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，可以在特異性的PDE4D7抑制劑輔助下，測試PDE4D7 的生物活性?？梢耘c例如基于cAMP底物的轉(zhuǎn)化的讀出系統(tǒng)相組合地，使用這樣的抑制劑。 要使用的典型的PDE4D7抑制劑包括反義分子、siRNA分子或miRNA分子。還可以在包含組織學的或細胞生物學的操作的方法中，檢測PDE4D7的水平。通常，可以使用視覺技術(諸如光學顯微術或免疫熒光顯微術)以及流式細胞術或發(fā)光測定法。例如，通過從上文定義的樣品中取出要測試的細胞，可以檢測或測定PDE4D7蛋白在細胞中的存在。組織切片或活組織檢查樣品也可以用于這些方法中。隨后，可以應用PDE4D7 的親和配體，優(yōu)選抗體或適體。通常，這樣的親和配體被標記，優(yōu)選被上文定義的熒光標記所標記。這樣的操作允許檢測PDE4D7，進行它的定量，且另外，允許測定其分布和相對表達水平。這樣的操作包括使用顯影方法。合適的顯影方法是本領域技術人員已知的。要使用的典型方法包括熒光測定、發(fā)光測定技術和/或酶技術。通常如下檢測和/或定量熒光 通過將熒光標記暴露于特定波長的光，然后檢測和/或定量發(fā)射的特定波長的光。通過在化學反應過程中形成的發(fā)光，可以檢測和/或定量發(fā)光地標記的親和配體的存在。酶反應的檢測是由于從化學反應產(chǎn)生的樣品中的顏色漂移(color shift)。在一個更優(yōu)選的實施方案中，通過合適的分子成像技術，例如磁共振成像(MRI) 或磁光子成像(MPI)，和/或通過使用合適的造影劑，例如上文定義的造影劑，可以測定 PDE4D7的水平。在一個更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的用于檢測、診斷、監(jiān)測或預測前列腺癌或前列腺癌的進展的方法包括下述額外步驟將測得的核酸或蛋白水平或測得的生物活性與對照水平相對比。本文使用的術語“對照水平”表示，PDE4D7標志物或其它合適的標志物在上文定義的癌性對照或非癌性對照中的表達。根據(jù)必要性，可以調(diào)節(jié)對照水平的狀態(tài)、性質(zhì)、 量和條件。優(yōu)選地，可以使用非癌性的對照水平。本文使用的術語“對比”表示評估、計算、 評價或處理數(shù)據(jù)的任意合適的方法。在另一個實施方案中，作為另一個額外的步驟，可以基于對比步驟的結(jié)果，確定前列腺癌的存在或階段或前列腺癌的進展。在PDE4D7作為前列腺癌標志物的背景下，在根據(jù)上文提供的對應定義的所述方法中，可以診斷或預測前列腺癌，或可以診斷或預測前列腺
癌的進展。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于檢測、診斷、監(jiān)測或預測前列腺癌或前列腺癌的進展的方法，所述方法至少包括下述步驟(a)在從至少一個疑似遭受前列腺癌的個體得到的至少一個樣品中，測試PDE4D7 表達產(chǎn)物或PDE4D7蛋白的表達；(b)在從至少一個沒有遭受癌癥的個體得到的至少一個對照樣品中，測試PDE4D7 表達產(chǎn)物或PDE4D7蛋白的表達；(c)測定步驟(a)和(b)的表達的差異；和(d)基于在步驟(C)中得到的結(jié)果，確定前列腺癌的存在或階段或前列腺癌的進展。在一個實施方案中，該診斷方法的步驟a)、b)、C)和/或d)可以在人或動物體外進行，例如在從患者或個體得到的樣品中進行。
在另一個方面，本發(fā)明涉及用于診斷、監(jiān)測或預測激素抗性前列腺癌或向激素抗性前列腺癌的進展的方法，其中所述方法會辨別激素-敏感的和激素-抗性的前列腺癌，所述方法包括下述步驟(a)測定樣品中PDE4D7的水平；(b)測定樣品中參照基因的表達水平；(c)將測得的PDE4D7表達水平標準化成參照基因的表達水平；和(d)對比標準化的表達水平和選擇用于排除激素-敏感的前列腺癌的預定截止值，其中低于截止值的標準化的表達水平指示著激素-抗性的前列腺癌。其中所述截止值是在約1至7之間，優(yōu)選約5?；谌缟衔乃龅暮怂?、蛋白或活性水平，可以測定PDE4D7的水平。優(yōu)選的是，測定PDE4D7轉(zhuǎn)錄物和/或蛋白的量。另外，可以測定樣品中參照基因的水平。本文使用的術語“參照基因”表示選擇的生物體中的任意合適的基因，例如任意穩(wěn)定表達的和可連續(xù)檢測的基因、基因產(chǎn)物、表達產(chǎn)物、蛋白或蛋白變體。該術語也包括基因產(chǎn)物諸如表達的蛋白、 肽、多肽以及它們的修飾變體。本發(fā)明因此也包括源自參照基因的參照蛋白。也包括從參照基因可衍生出的所有種類的轉(zhuǎn)錄物以及其修飾或與其相關的二級參數(shù)。替換地或額外地， 其它參照參數(shù)也可以用于參照目的，例如代謝濃度、細胞大小等。優(yōu)選地，可以在相同樣品中進行表達，即在相同樣品中測定PDE4D7和參照基因的水平。如果在相同樣品中進行測試，可以進行本文所述的單個檢測或多路檢測方案。優(yōu)選地，對于多路檢測，可以使用具有SEQ ID NO :7、8和9的序列的寡核苷酸和探針。為了進行多路檢測，可以調(diào)整引物和/或探針寡核苷酸的濃度。此外，可以調(diào)整(例如，與生產(chǎn)商的指示相比，增加或減少)其它成分(如緩沖劑、離子等)的濃度和存在。在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，可以測定超過一個參照基因或穩(wěn)定表達的基因的表達。例如，可以測定2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、30或更多個參照基因的表達。 這樣的測量的結(jié)果可以單獨地計算，或可以組合以便得到平均表達指數(shù)。此外，可以測定參照基因表達模式，和/或用作后續(xù)步驟的基礎。這樣的模式可以是基于已知的基因在特定癌癥(尤其是前列腺癌階段或狀態(tài))中的表達行為。此外，可以將表達結(jié)果與來自參照情況或數(shù)據(jù)庫的已知結(jié)果相對比。該對比可以額外地包括標準化步驟，以便提供結(jié)果的統(tǒng)計關聯(lián)性。在本發(fā)明的一個替代實施方案中，作為測定樣品中參照基因的表達水平的替代方案，可以測定另一種癌癥標志物或非穩(wěn)定表達的基因的表達。例如，可以測定下述基因的表達已知其在激素抗性前列腺癌過程中減少，或已知其在激素-敏感的前列腺癌過程中增加。在另一個實施方案中，還可以進行兩種表達測定，即測定參照基因和另一種癌癥或生物標記基因的表達。根據(jù)本領域技術人員已知的任意合適的方法，例如根據(jù)標準化統(tǒng)計方法如標準分數(shù)、Student氏T-檢驗、Student化的殘余檢驗、標準化的矩檢驗或系數(shù)變動檢驗，可以標準化表達結(jié)果。通常，這樣的檢驗或?qū)墓?它們是本領域技術人員已知的)可以用于標準化表達數(shù)據(jù)，以區(qū)分基因表達水平的真實變動和由測量過程引起的變動?；谠诓襟E(a)和(b)中得到的表達結(jié)果和/或在步驟(C)中得到的標準化結(jié)CN 102549167 A果，可以對比PDE4D7表達的截止值。截止值(低于它的PDE4D7表達水平指示著激素-抗性的前列腺癌，從而排除激素-敏感的前列腺癌或腫瘤形式)是在下述范圍內(nèi)約0. 75至
8.0.75 至 7. 5,0. 75 至 7,0. 75 至 6. 5,0. 75 至 6,0. 75 至 6,0. 75 至 5. 5,0. 75 至 5. 5、1. 0 至
8.1.25 至 8、1. 5 至 8,1. 75 至 8、2 至 8,2. 25 至 8,2. 5 至 8,2. 75 至 8、3 至 8,3. 25 至 8,3. 5 至8、3. 75至8、4至8、4. 25至8、4. 5至8、4. 75至8、或5至8。更優(yōu)選的是約5的截止值， 例如 4. 9,4. 8,4. 7,4. 6,4. 5,4. 4,4. 3,4. 2,4. 1 或 5. 9,5. 8,5. 7,5. 6,5. 5,5. 4,5. 3,5. 2 或 5.1。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述截止值與作為參照基因的持家基因一起使用。甚至更優(yōu)選地，所述截止值與作為參照基因的GAPDH和/或PB⑶一起使用。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述截止值是血液樣品(例如血清或血漿樣品)、尿樣品或尿沉積物樣品中PDE4D7的截止值。在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案中， 所述截止值是尿樣品中PDE4D7蛋白或多肽或上文定義的其任意衍生物的截止值。在本發(fā)明的另一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述截止值是尿包含的細胞中PDE4D7蛋白或多肽或上文定義的其任意衍生物的截止值，或從尿包含的細胞分泌出的外核體的截止值。在本發(fā)明的一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，所述截止值是尿沉積物樣品中上文定義的PDE4D7蛋白或多肽或其任意衍生物的截止值，和尿沉積物樣品中含有的細胞的的截止值，或尿沉積物樣品中含有的細胞所分泌的外核體的截止值。如果測量的和/或標準化的PDE4D7表達高于指示的截止值，這可以視作下述指征所述個體沒有遭受激素-抗性的前列腺癌。所述值可以額外地指示，所述個體遭受除了激素-抗性的前列腺癌以外的前列腺癌，尤其是激素-依賴性的前列腺癌或激素-敏感的前列腺癌。在另一個方面，本發(fā)明涉及一種數(shù)據(jù)獲取方法，該方法至少包括下述步驟(a)測試個體中PDE4D7的表達；和(b)將在步驟(a)中測定的表達與對照水平相對比。根據(jù)上文定義的步驟，可以測試PDE4D7的表達。優(yōu)選地，作為測量PDE4D7的核酸或蛋白水平，或通過測定PDE4D7的生物活性，更優(yōu)選地根據(jù)上文所述的這樣的測量的選項，可以進行測試?？梢栽趥€體內(nèi)(即在體內(nèi))或在個體外(即離體或在體外)進行測試。在數(shù)據(jù)獲取方法的上下文中使用的術語“對照水平”表示，在上文定義的癌性對照或非癌性對照中PDE4D7標志物或其它合適的標志物的表達。根據(jù)必要性，可以調(diào)節(jié)對照水平的狀態(tài)、 性質(zhì)、量和條件。優(yōu)選地，可以使用非癌性的對照水平。更優(yōu)選地，可以使用源自激素-敏感的前列腺癌階段的對照水平。根據(jù)任意合適的評估、計算、評價或處理數(shù)據(jù)的方法，可以進行表達與對照水平的對比，具體地，目的在于檢測2個數(shù)據(jù)集之間的差異。另外可以進行差異顯著性的統(tǒng)計評價。合適的統(tǒng)計方法是本領域技術人員已知的。通過本領域技術人員已知的合適的信息學或計算機方法或工具，可以儲存、積累或處理得到的數(shù)據(jù)和信息，和/ 或以適當方式呈現(xiàn)，以便允許從業(yè)人員使用數(shù)據(jù)進行一個或多個后續(xù)推論或結(jié)論步驟。在另一個方面，本發(fā)明涉及用于檢測、診斷、監(jiān)測或預測前列腺癌或前列腺癌的進展的免疫測定，其至少包括下述步驟(a)測試從個體獲得的樣品中PDE4D7的表達，(b)測試對照樣品中PDE4D7的表達，(c)測定步驟(a)和(b)中PDE4D7的表達的差異；和
(d)基于在步驟(C)中得到的結(jié)果，確定前列腺癌的存在或階段或前列腺癌的進展。所述免疫測定優(yōu)選地是基于使用特異性地結(jié)合PDE4D7的抗體，例如一種或多種本文提及的PDE4D7抗體?；蛘?，可以使用任意其它合適的試劑，或與任意其它合適的試劑組合地，進行所述免疫測定。例如，所述測定可以與核酸的檢測或本文所述的酶測試方法相組合。在另一個方面，本發(fā)明涉及用于辨別激素-敏感的和激素-抗性的前列腺癌的免疫測定，所述方法包括下述步驟(a)測定樣品中PDE4D7的水平；(b)測定樣品中參照基因的表達水平；(c)將測得的PDE4D7表達水平標準化成參照基因的表達；和(d)對比標準化的表達水平和選擇用于排除激素-敏感的前列腺癌的預定截止值，其中低于截止值的標準化的表達水平指示著激素-抗性的前列腺癌，其中所述截止值是約1至7。優(yōu)選地，截止值是約5。優(yōu)選地，基于如上文所述的蛋白或活性水平，可以測定PDE4D7的水平。優(yōu)選的是， 在PDE4D7特異性的抗體(例如一種或多種本文所述的PDE4D7抗體)的幫助下，測定PDE4D7 蛋白的量?；蛘撸梢杂萌我馄渌线m的試劑，或與其它實體的測定組合地，進行免疫測定。 例如，所述測定可以與核酸的存在或量的檢測或本文所述的酶測試方法相組合。另外，可以測定樣品中上文定義的參照基因的水平。關于參照基因的檢測，可以測定基因的表達產(chǎn)物(即蛋白)的量，優(yōu)選地，在本領域技術人員已知的一種或多種合適的抗體幫助下?；蛘?，使用任意其它合適的試劑，或與核酸的存在或量的檢測或本文所述的酶測試方法組合地，進行參照基因的測定?；谠诓襟E(a)和(b)中得到的表達結(jié)果和/或在步驟(C)中得到的標準化結(jié)果，可以對比PDE4D7表達的截止值。截止值(在免疫測定中低于它的PDE4D7表達水平指示著激素-抗性的前列腺癌，從而排除激素-敏感的前列腺癌或腫瘤形式)是在下述范圍內(nèi)約 0. 75 至 8,0. 75 至 7. 5,0. 75 至 7,0. 75 至 6. 5,0. 75 至 6,0. 75 至 6,0. 75 至 5. 5,0. 75 至 5. 5、1.0 至 8、1. 25 至 8、1. 5 至 8、1. 75 至 8、2 至 8、2. 25 至 8、2. 5 至 8、2. 75 至 8、3 至 8、 3. 25至8、3. 5至8、3. 75至8、4至8、4. 25至8、4. 5至8、4. 75至8、或5至8。更優(yōu)選地，截止值是約 5，例如 4. 9,4. 8,4. 7,4. 6,4. 5,4. 4,4. 3,4. 2,4. 1 或 5. 9,5. 8,5. 7,5. 6,5. 5,5. 4、 5. 3、5· 2 或 5. 1。所述截止值可以是下文所述的血液樣品(例如血清或血漿樣品)、尿樣品或尿沉積物樣品等中的PDE4D7的截止值。如果測量的和/或標準化的PDE4D7表達高于指示的截止值，這可以視作下述指征所述個體沒有遭受激素-抗性的前列腺癌。所述值可以另外指示，所述個體遭受除了激素-抗性的前列腺癌以外的前列腺癌，尤其是激素-依賴性的前列腺癌或激素-敏感的前列腺癌。在另一個方面，本發(fā)明涉及鑒別個體對于前列腺癌治療的適合性的方法，所述方法包括(a)測試從個體獲得的樣品中PDE4D7的表達；
(b)測試所述樣品中參照基因的表達，和/或測試對照樣品中PDE4D7的表達；(c)相對于步驟(b)中的水平，分類步驟(a)的表達水平；和(d)在個體的樣品被分類為具有降低的PDE4D7表達水平的情況下，將該個體鑒別為適合接受前列腺癌治療。PDE4D7的水平可以取決于如上文所述的核酸、蛋白或活性水平。優(yōu)選的是，測定 PDE4D7轉(zhuǎn)錄物和/或蛋白的量。另外，可以測定樣品中上文所述的參照基因的水平?？梢栽谟糜跍y定PDE4D7的相同樣品中進行參照基因表達的測試。如果在相同樣品中進行測試， 可以進行單個檢測或多路檢測方案。優(yōu)選地，對于多路檢測，可以使用具有SEQ ID NO 7,8 和9的序列的寡核苷酸和探針。為了進行多路檢測，可以調(diào)整引物和/或探針寡核苷酸的濃度。此外，可以調(diào)整(例如，與生產(chǎn)商的指示相比，增加或減少)其它成分(如緩沖劑、離子等)的濃度和存在?；蛘?，可以在不同的樣品(優(yōu)選上文定義的對照樣品)中測試參照基因的表達。優(yōu)選地，這樣的對照樣品可以是來自與實驗樣品相同的個體的對照樣品，或源自不同來源或個體的對照樣品。對照樣品另外可以是源自相同組織(優(yōu)選前列腺組織)的樣品，或源自不同組織類型的樣品。優(yōu)選的替代性的組織類型的實例是間質(zhì)前列腺組織、膀胱上皮組織和尿道上皮組織。此外，可以將實驗樣品的參照基因表達測試和對照樣品的PDE4D7表達測試相組
口 O在另一個實施方案中，也可以測定對照樣品中參照基因的表達。在測試超過一個樣品中參照基因的表達的情況下，可以根據(jù)本領域技術人員已知的任意合適的統(tǒng)計方法， 對比和/或平均或標準化得到的表達結(jié)果。本文使用的術語“相對于步驟(b)中的水平，分類步驟(a)的表達水平”是指，對比實驗樣品中PDE4D7的表達和對照樣品中PDE4D7的表達，例如在相對于合適的標準化參照物進行標準化以后。根據(jù)對比的結(jié)果，將實驗樣品指示為提供與對照樣品類似的表達， 與對照樣品相比增加的表達，或與對照樣品相比減少的表達。該術語另外表示，對比實驗樣品中PDE4D7的表達和相同實驗樣品中參照基因的表達，例如在相對于作為標準化參照物的另一個基因進行標準化以后。根據(jù)對比的結(jié)果，將實驗樣品指示為提供與參照基因類似的表達，與參照基因相比增加的表達，或與參照基因相比減少的表達。根據(jù)表達結(jié)果的分類，當PDE4D7表達水平降低時，可以將個體視作適合前列腺癌治療。在下述情況下，認為表達水平“降低”當實驗樣品中的PDE4D7基因表達比對照樣品中的 PDE4D7 表達降低了例如 5%,6%,7%,8%,9%,10% ,15%,20%,25%,30%,40%,50% 或超過50%時，或比對照樣品中的PDE4D7表達降低了至少0. 1倍、至少0. 2倍、至少1倍、 至少2倍、至少5倍、或至少10倍或更多時；或當PDE4D7基因表達比對照樣品中的參照基因表達降低了例如 5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%或超過 50%時，或比參照基因的表達降低了至少0. 1倍、至少0. 2倍、至少1倍、至少2倍、至少5 倍或至少10倍或更多時。在一個具體的實施方案中，還可以根據(jù)其它基因或標志物(例如持家基因)的表達，標準化或調(diào)節(jié)參照基因的表達。在另一個方面，本發(fā)明涉及用于分級具有前列腺癌疾病的一個個體或一群個體的免疫測定，其包括(a)測試從個體獲得的樣品中PDE4D7的表達；
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(b)測試所述樣品中參照基因的表達，和/或測試對照樣品中PDE4D7的表達；(c)測定步驟(a)中PDE4D7的表達與步驟(b)中PDE4D7和/或參照基因的表達的差異；和(d)在個體的樣品具有降低的PDE4D7表達水平的情況下，基于在步驟(c)中得到的結(jié)果，將一個個體或一群個體分級給前列腺癌治療?？梢詢?yōu)選地通過如上文所述測定PDE4D7蛋白的量或測定PDE4D7活性水平，測試 PDE4D7的表達。優(yōu)選的是，在PDE4D7特異性的抗體(例如一種或多種本文所述的PDE4D7抗體)的幫助下，測定PDE4D7蛋白的量?；蛘撸梢杂萌我馄渌线m的試劑，或與其它實體的測定組合地，進行免疫測定。例如，所述測定可以與核酸的存在或量的檢測或本文所述的酶測試方法相組合。另外，可以測定樣品中上文所述的參照基因的水平。在用于測定PDE4D7 的相同樣品中，可以測試參照基因的表達。如果在相同樣品中進行測試，可以進行單個檢測或平行的或多路的檢測方案。優(yōu)選地，對于平行的或多路的檢測，可以使用差別地標記的第一抗體或第二抗體。或者，可以在不同的樣品(優(yōu)選上文定義的對照樣品)中測試參照基因的表達。優(yōu)選地，這樣的對照樣品可以是來自與實驗樣品相同的個體的對照樣品，或源自不同來源或個體的對照樣品。對照樣品另外可以是源自相同組織(優(yōu)選前列腺組織)的樣品，或源自不同組織類型的樣品。優(yōu)選的替代性的組織類型的實例是間質(zhì)前列腺組織、膀胱上皮組織和尿道上皮組織。此外，可以將實驗樣品的參照基因表達測試和對照樣品的PDE4D7表達測試相組合。在另一個實施方案中，也可以測定對照樣品中參照基因的表達。在測試超過一個樣品中參照基因的表達的情況下，可以根據(jù)本領域技術人員已知的任意合適的統(tǒng)計方法， 對比和/或平均或標準化得到的表達結(jié)果。本文使用的術語“測定步驟(a)中PDE4D7的表達與步驟(b)中PDE4D7和/或參照基因的表達的差異”是指，對比實驗樣品中PDE4D7的表達和對照樣品中PDE4D7的表達，例如在相對于合適的標準化參照物進行標準化以后。根據(jù)對比的結(jié)果，將實驗樣品指示為提供與對照樣品類似的表達，與對照樣品相比增加的表達，或與對照樣品相比減少的表達。 該術語另外表示，替換地或額外地，對比實驗樣品中PDE4D7的表達和相同實驗樣品中參照基因的表達，例如在相對于作為標準化參照物的另一個基因進行標準化以后。根據(jù)對比的結(jié)果，將實驗樣品指示為提供與參照基因類似的表達，或表達的差異。所述差異可以是，與參照基因相比增加的表達，或與參照基因相比減少的表達。本文使用的術語“將一個個體或一群個體分級給前列腺癌治療”是指，根據(jù)上文所述的表達實驗的結(jié)果，尤其是根據(jù)遇到的PDE4D7表達水平和參照基因或不同樣品中 PDE4D7表達水平的差異，將個體鑒別為屬于一組類似的個體，所述個體的最佳治療形式是前列腺癌治療，優(yōu)選針對激素抗性前列腺癌的治療。根據(jù)表達差異的測定，當PDE4D7表達水平降低時，可以將個體鑒別為屬于一組類似的個體，所述個體的最佳治療形式是前列腺癌治療。在下述情況下，認為表達水平“降低”當實驗樣品中的PDE4D7基因表達比對照樣品中的 PDE4D7 表達降低了例如 5%,6%,7%,8%,9%,10%,15%,20%,25%,30%,40%, 50%或超過50%時，或比對照樣品中的PDE4D7表達降低了至少0. 1倍、至少0. 2倍、至少1 倍、至少2倍、至少5倍、或至少10倍或更多時；或當PDE4D7基因表達比對照樣品中的參照基因表達降低了例如 5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%，或超過50%時，或比參照基因的表達降低了至少0. 1倍、至少0. 2倍、至少1倍、至少2倍、至少 5倍或至少10倍或更多時。在一個具體的實施方案中，還可以根據(jù)其它基因或標志物(例如持家基因)的表達，標準化或調(diào)節(jié)參照基因的表達。認為適合前列腺癌治療或被分級給上文所述的前列腺癌治療的個體，可以接受本領域技術人員已知的任意合適的治療性前列腺癌處理。通常，由于降低的PDE4D7表達而被認為適合前列腺癌治療或被分級給對應的治療組的個體，可以視作遭受激素-抗性的前列腺癌或易于在將來(例如在將來的I-M個月)發(fā)展激素-抗性的前列腺癌?？梢杂酶鶕?jù)本發(fā)明的藥物組合物(例如如下文定義的)治療對應地鑒別的或分級的個體。在另一個實施方案中，可以與其它癌癥療法組合地，用根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物治療對應地鑒別的個體。 術語“其它癌癥療法”表示本領域技術人員已知的任意類型的癌癥療法。優(yōu)選的是關于激素-抗性的前列腺癌已知的癌癥治療形式。該術語包括，例如，化學療法、放射療法、外科手術、抗體治療等所有合適的形式?；蛘撸梢詥为毜赜靡环N或多種癌癥療法(諸如化學療法、放射療法、外科手術、 抗體治療等)，治療對應地鑒別的或分級的個體。優(yōu)選的是通常用于前列腺癌的癌癥療法， 更優(yōu)選用于激素-抗性的前列腺癌的癌癥療法。在本發(fā)明的另一個實施方案中，如上文所述的適合性的分類方法或分級的免疫測定也可以用于監(jiān)測個體的治療，例如被分類為遭受激素-抗性的前列腺癌的個體?？梢噪S著表達測定，在延長的時間段內(nèi)進行所述監(jiān)測方法，例如在治療期間中或在治療期間以后， 進行 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 周、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 個月或 1、2、3 或更多年?？梢砸院线m的間隔，例如每周、每2周、每3周、每月、每2個月、每3個月、每6個月、每12個月等，進行測定步驟。在本發(fā)明的另一個實施方案中，根據(jù)監(jiān)測過程的結(jié)果，可以以任意合適的方式，調(diào)節(jié)(例如加強或減弱)或改變上文所述的任意治療方案。根據(jù)上文定義的步驟，可以測試PDE4D7的表達。優(yōu)選地，作為測量PDE4D7蛋白水平，更優(yōu)選地根據(jù)上文所述的這樣的測量的選項，可以進行測試?？梢允褂蒙衔亩x的對照，作為對照或?qū)φ諛悠贰Ｔ谝粋€特別優(yōu)選的實施方案中，所述測試步驟可以基于使用特異性地結(jié)合PDE4D7的抗體，例如可商業(yè)得到的抗-PDE4D7抗體如NB300-652或GTX146^。在 PDE4D7作為癌癥標志物的背景下，根據(jù)上文提供的對應的定義，可以診斷或預測癌癥，或可以在所述免疫測定中診斷或預測癌癥的進展，或可以鑒別個體對前列腺癌的適合性，或可以在免疫測定中分級一個個體或一群個體。因此，通過測量核酸或蛋白水平，或通過測定 PDE4D7的生物活性，可以測試或測定PDE4D7的表達，或可以額外地進行所述測試或測定。 關于參照基因，可以進行類似的測量。在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述參照基因是持家基因或不同的磷酸二酯酶。在人生物體中，“持家基因”的實例包括β -肌動蛋白、甘油醛3-磷酸脫氫酶 (GAPDH)、膽色素原脫氨酶(PBGD)和核糖體蛋白Pl以及其它。除了這些基因以外，任意其它合適的基因可以用作持家基因，只要所述基因在穩(wěn)定的、未修飾的水平顯示出表達或轉(zhuǎn)錄，尤其是在不同的癌癥發(fā)展階段中，更優(yōu)選地在前列腺癌發(fā)展的不同階段，更優(yōu)選地在激素-敏感的前列腺癌向激素抗性的前列腺癌狀態(tài)轉(zhuǎn)變過程中。特別優(yōu)選的是，GAPDH的基因或轉(zhuǎn)錄物或表達產(chǎn)物或蛋白。更特別優(yōu)選的是，PBGD的基因或轉(zhuǎn)錄物或表達產(chǎn)物或蛋白。 持家基因的表達數(shù)據(jù)，可以從相同個體的一個或多個樣品得到，或從更多個個體得到，例如 2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、1000、5. 000、10. 000 或更多個個體。表達數(shù)據(jù)也可以從數(shù)據(jù)庫得到，或從本領域技術人員可利用的數(shù)據(jù)集合得到。本文使用的術語“不同的磷酸二酯酶”表示除了 PDE4D7以外的其它磷酸二酯酶。 這樣的適合作為參照基因的磷酸二酯酶應當是穩(wěn)定表達的，并在選擇的生物體中提供可連續(xù)檢測的基因產(chǎn)物、表達產(chǎn)物、蛋白或蛋白變體。特別優(yōu)選的是，PDE4D家族的磷酸二酯酶， 例如 PDE4D1、PDE4D2、PDE4D3、PDE4D4、PDE4D5、PDE4D6、PDE4D8 和 PDE4D9。更優(yōu)選的是， PDE4D5磷酸二酯酶。因此，使用GAPDH、PB⑶和尤其是PDE4D5的標準化和/或?qū)Ρ?，可以?yōu)選地用于上述的基于截止值的診斷方法和免疫測定、鑒別個體的方法、或用于辨別或分級個體的免疫測定?？梢栽趩为毜姆磻?，或特別優(yōu)選地在多路反應中，進行對應的測定步驟。為了進行多路檢測，可以調(diào)整引物和/或探針寡核苷酸的濃度。此外，可以調(diào)整(例如，與生產(chǎn)商的指示相比，增加或減少)其它成分(如緩沖劑、離子等)的濃度和存在。在本發(fā)明的另一個實施方案中，基于如上文所述的PDE4D7的表達來鑒別個體適合前列腺癌治療的方法，另外可以與基于一種或多種不同生物標志物的表達的一種或多種類似的鑒別方法相組合。優(yōu)選的是，測定前列腺特異性的抗原(PSA)的水平。因而，如果遇到的PSA的水平是10、20、30 或優(yōu)選地高于5. 0，可以認為個體遭受激素-抗性的前列腺癌，或可能在不久的將來(即在將來的1、2、3、4、5、6、12個月內(nèi))發(fā)展激素-抗性的前列腺癌。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，在從個體獲得的樣品上，進行如上所述的診斷、 檢測、監(jiān)測或預測。本文使用的術語“從個體獲得的樣品”是指通過本領域技術人員已知的合適的方法從個體得到的任意生物材料。應當優(yōu)選地以臨床上可接受的方式，更優(yōu)選地以保存核酸(尤其是RNA)或蛋白的方式，收集在本發(fā)明的背景下使用的樣品。所述生物樣品可以包括身體組織和液體，諸如血液、汗液、痰或唾液、精液和尿、以及糞便或大便樣品。此外，所述生物樣品可以含有源自細胞群體的細胞提取物或細胞群體， 所述細胞群體包括上皮細胞，優(yōu)選癌性上皮細胞或源自疑似癌性的組織的上皮細胞。甚至更優(yōu)選地，所述生物樣品可以含有源自腺組織的細胞群體，例如，所述樣品可以源自男性個體的前列腺。另外，如果必要，可以從得到的身體組織和液體純化細胞，然后用作生物樣品?？梢院喜悠罚绕涫窃诔醪教幚硪院?。但是，也可以使用未合并的樣品。在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，也可以對生物樣品的內(nèi)容物進行富集步驟。 例如，可以使樣品接觸對某些細胞類型(例如用磁性顆粒功能化的前列腺細胞)的細胞膜或細胞器特異性的配體。隨后可以將磁性顆粒濃縮的物質(zhì)用于上文或下文所述的檢測和分析步驟。在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，可以得到和/或使用活組織檢查或切除術樣品。這樣的樣品可以包含細胞或細胞裂解物。此外，通過流體或液體樣品(例如血液、尿、汗液等)的過濾過程，可以富集細胞， 例如腫瘤細胞。這樣的過濾過程也可以與上文所述的基于配體特異性的相互作用的富集步驟相組合。在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案中，樣品可以是組織樣品、尿樣品、尿沉積物樣品、血液樣品、唾液樣品、精液樣品、包含循環(huán)腫瘤細胞的樣品、或包含前列腺分泌的外核體的樣品。在另一個方面，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其包含至少一種選自下述的組分 (a)直接地刺激或調(diào)節(jié)PDE4D7的活性的化合物，優(yōu)選PDE4D7酶活性的變構(gòu)激動劑；(b)間接地刺激或調(diào)節(jié)PDE4D7的活性的化合物；(c)PDE4D7蛋白或其生物活性等效物；(d)編碼和表達PDE4D7的核酸；(e)對PDE4D7miRNA特異性的miRNA抑制劑；(f)脫甲基化劑；和(g) 磷酸二酯酶置換因子，優(yōu)選肽、肽擬似物、小分子、抗體或適體。本文使用的術語“直接地刺激或調(diào)節(jié)PDE4D7活性的化合物”表示這樣的化合物 其能夠通過與PDE4D7的直接相互作用，增加PDE4D7活性，以降解cAMP。這樣的化合物可以是PDE4D7的任意直接相互作用物，其對PDE4D7的催化活性具有正面影響。這樣的化合物可以優(yōu)選地是PDE4D7的催化活性的變構(gòu)激動劑，例如同位變構(gòu)調(diào)節(jié)劑。優(yōu)選的PDE4D7變構(gòu)激動劑是cAMP或cAMP類似物。本發(fā)明預見到的其它直接地刺激的化合物是離子，優(yōu)選生物活性的單價和二價陽離子，如Ca2+、Mg2+。本文使用的術語“間接地刺激或調(diào)節(jié)PDE4D7活性的化合物”表示這樣的化合物 其能夠通過與PDE4D7的直接相互作用物的相互作用(“間接相互作用物”)，或通過不涉及與PDE4D7的相互作用的間接工作途徑，增加PDE4D7活性，以降解cAMP。這樣的化合物可以是PDE4D7的相互作用物的任意直接相互作用物。由PDE4D7的相互作用物的直接相互作用物傳遞的效果可以是正面的(如果PDE4D7的相互作用物自身對PDE4D7活性具有正面作用)或負面的(如果PDE4D7的相互作用物對PDE4D7活性具有負面作用)。通常，正面地起作用的間接相互作用物可以刺激直接相互作用物的激動作用，例如通過抑制不是由PDE4D7 賦予的cAMP降解過程，通過增加cAMP生產(chǎn)等，引起變構(gòu)效應地起作用的化合物(如cAMP 或其類似物)的濃度的增加?；蛘?，這樣的正面地起作用的間接相互作用物可以引起直接結(jié)合蛋白的結(jié)合行為的調(diào)整，導致增加的PDE4D7活性。通常，起負面作用的間接相互作用物可能對PDE4D7的抑制劑具有抑制作用。這樣的相互作用物的實例是降解PDE4D7抑制劑的酶活性，或能夠結(jié)合和猝滅PDE4D7抑制劑的蛋白?；蛘?，這樣的相互作用物可以抑制導致PDE4D7降解的活性， 例如蛋白水解酶抑制劑。其它實例和它們的實現(xiàn)是本領域技術人員已知的?；蛘撸梢杂苫罨?、保護或維持內(nèi)源PDE4D7基因的表達的化合物，傳遞對PDE4D7 活性的間接刺激。這樣的化合物的實例是PDE4D7特異性的轉(zhuǎn)錄因子、PDE4D7特異性的mRNA 穩(wěn)定化活性或PDE4D7剪接因子。其它實例和它們的實現(xiàn)是本領域技術人員已知的。在藥物組合物中包含的“PDE4D7蛋白”可以是上文定義的PDE4D7蛋白。具體地，它可以是由人磷酸二酯酶PDE4D的剪接變體7編碼的蛋白，更優(yōu)選地，它可以具有在Genbank 登錄號AF536976(版本AF536976. 1,GI :2四01883，截止于2009年3月3日)中定義的氨基酸序列，甚至更優(yōu)選地，它可以具有在SEQ ID NO :2中所述的氨基酸序列。在該背景下使用的“PDE4D7蛋白”也包括這樣的氨基酸序列其與在SEQ ID NO :2中所述的序列具有至少 60%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 同一性，或由與在SEQ ID NO :1中所述的序列具有至少60%、70%、75%、80%、85%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 同一性的核苷酸序列編碼。PDE4D7 的同源變體，尤其是上述的那些，優(yōu)選地具有PDE4D7功能性，即能夠降解cAMP。在本發(fā)明的另一個實施方案中，PDE4D的同源變體在細胞內(nèi)或在組織類型內(nèi)可以額外地或替換地具有與 PDE4D7類似或相同的定位模式。在另一個優(yōu)選的實施方案中，PDE4D7的同源變體和PDE4D7之間的區(qū)域或同源性可以局限于蛋白的C-端部分。例如，所述同源變體可以包含存在于PDE4D7中的N-端結(jié)構(gòu)域，且蛋白的剩余部分與PDE4D7具有上文指出的同源性程度。同源變體的N-端部分可以包含源自 PDE4D7 的氨基酸 1-120、1-110、1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-40、1-30、 1-20 或 1-10。本文使用的術語“PDE4D7的生物活性等效物”表示能夠執(zhí)行所有或大部分PDE4D7 功能的PDE4D7蛋白。優(yōu)選地，它是指能夠降解cAMP的蛋白。在本發(fā)明的另一個實施方案中， PDE4D7的生物活性等效物在細胞內(nèi)或在組織類型內(nèi)可以額外地或替換地具有與PDE4D7類似或相同的定位模式。PDE4D7的生物活性等效物還可以包含上文定義的PDE4D7變體。通過本領域技術人員已知的任意合適的方法，可以重組地生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的 PDE4D7或PDE4D7的生物活性等效物。因而，本發(fā)明也包括用于生產(chǎn)PDE4D7或PDE4D7的生物活性等效物的方法。因此，本發(fā)明預見到含有編碼PDE4D7或上文定義的PDE4D7的生物活性等效物的多核苷酸的載體，宿主細胞，和通過重組技術生產(chǎn)PDE4D7或PDE4D7的生物活性等效物。合適的載體可以是，例如，噬菌體、質(zhì)粒、病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以是復制活性的或復制缺陷的。在后一種情況下，通常僅在互補的宿主細胞中進行病毒繁殖?？梢詫⒕幋aPDE4D7或PDE4D7的生物活性等效物的多核苷酸連接到含有選擇標記 (用于在宿主中繁殖)的載體上?？梢詫亩嗪塑账岵迦胛锟刹僮鞯剡B接到適當?shù)膯幼由希鰡幼又T如噬菌體λ PL啟動子、大腸桿菌laC、trp、phoA和tac啟動子、SV40 早期和晚期啟動子以及逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs的啟動子或PSA啟動子。其它合適的啟動子是本領域技術人員已知的。表達構(gòu)建體另外可以含有轉(zhuǎn)錄起始位點、終止位點、和在轉(zhuǎn)錄的區(qū)域中的用于翻譯的核糖體結(jié)合部位。由所述構(gòu)建體表達的轉(zhuǎn)錄物的編碼部分優(yōu)選地包括在起始和終止密碼子處的翻譯起始密碼子(UAA、UGA或UAG)，其適當?shù)匚挥谝g的多肽的末端。所述多肽或蛋白可以是糖基化的，或可以是未-糖基化的，或可以以其它方式進行修飾。另外，多肽或蛋白還可以包括最初的修飾的甲硫氨酸殘基，在有些情況下，作為宿主介導的過程的結(jié)果。此外，可以如下修飾所述多肽、蛋白或肽乙?；?、聚乙二醇化、 hesylation、甲酰化、磷酸化、酰胺化、用已知的的保護基/阻斷基衍生化、特異性的化學裂解、蛋白水解性裂解、連接到細胞配體或其它蛋白上、或hapylati0n(即與富含甘氨酸的高氨基酸聚合物(HAP)融合)等。通過本領域技術人員已知的適當技術，可以進行這樣的修飾。另外，所述多肽、肽或變體可以含有一種或多種非經(jīng)典的氨基酸。另外，使用本領域已知的技術，例如通過使用肽合成儀，可以化學地合成本發(fā)明的 PDE4D7或PDE4D7的生物活性等效物。在上文定義的藥物組合物中包含的“編碼和表達PDE4D7的核酸”表示，包含可表達的PDE4D7基因任意合適的載體元件，例如如上文所述的。優(yōu)選地，這樣的載體元件可以包括在 Genbank 登錄號AF536976 (版本 AF536976. 1，GI :2四01883，截止于 2009 年 3 月 3 日)中定義的序列，更優(yōu)選在SEQ ID NO 1中所述的核苷酸序列。這樣的載體元件還可以包括表現(xiàn)出與PDE4D7的高度同源性的核苷酸序列，例如與在SEQ ID NO 1中所述的序列具有至少 60%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98% 或99%同一性的核酸序列，或編碼與在SEQ ID N0:2中所述的序列具有至少60^^70%, 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 同一性的氨基酸序列的核酸序列?；蛘?，所述載體可以包含PDE4D的基因組序列，優(yōu)選在ENSEMBL數(shù)據(jù)庫入口 ENSG00000113448(版本 ENSG00000113448. 8，Ensembl release 53-March 2009)中定義的序列，其對應著SEQ ID NO :6，或可從Genbank登記號AC008934(版本AC008934. 5，GI 17386235，截止于 2009 年 3 月 24 日)與 Genbank 登記號 AC034234 (版本 AC034234. 4，GI 18390182，截止于2009年3月M日)的組合衍生出的序列，或可從Wang等人，2003，Cell Signal. ,15(9) :883-91衍生出的序列。更優(yōu)選地，所述載體可以包含在SEQ ID NO :6中定義的PDE4D的基因組序列。此外，在本發(fā)明的載體中可以包含上文定義的PDE4D7的生物活性等效物。編碼PDE4D7的多核苷酸可以優(yōu)選地連接到載體上，所述載體含有用于在人細胞中繁殖的選擇標記。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述多核苷酸插入物可以可操作地連接到 PSA啟動子上。在本發(fā)明的一個實施方案中，上文定義的編碼和表達PDE4D7的核酸可以由活的治療劑來提供。術語“活的治療劑”是指，在任意合適的活載體中表達上文定義的PDE4D7 或PDE4D7的生物活性等效物。因此，本發(fā)明涉及對應的多核苷酸，其適合在活的細胞中表達。本發(fā)明也涉及含有這樣的多核苷酸的載體、適當?shù)乃拗骷毎?、和通過重組技術在所述宿主細胞中生產(chǎn)多肽。術語“活載體”是指本領域技術人員已知的任意適當?shù)幕畹乃拗骷毎虿《?。適當?shù)乃拗鞯拇硇缘膶嵗?、但不限于細菌細胞諸如大腸桿菌或乳桿菌屬、真菌細胞諸如酵母細胞、原生動物、昆蟲細胞或動物細胞。優(yōu)選地，該術語是指減毒的細菌、減毒的真菌細胞或減毒的原生動物。適當?shù)牟《镜拇硇缘膶嵗ㄏ俨《?、反轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒群體中的病毒，優(yōu)選腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒群體中的減毒病毒。在一個優(yōu)選的實施方案中，可以使用益生的細菌細胞，尤其是益生的大腸桿菌或乳桿菌屬細胞。更優(yōu)選地，可以使用大腸桿菌Nissle 1973的細胞，甚至更優(yōu)選干酪乳桿菌(LactcAacillus casei)或 Lactobacillus zeae 393 的細胞。在上文定義的藥物組合物中包含的“對PDE4D7miRNA特異性的miRNA抑制劑”表示這樣的核酸分子其編碼與PDE4D7miRNA或微RNA分子互補的核酸序列。本文使用的術語“互補”表示miRNA抑制劑核酸(有義分子)和miRNA(反義分子)之間完全互補，沒有任何錯配，以及下述情況其中所述核酸與miRNA分子相比含有任意堿基錯配和/或額外的或缺少的核苷酸。在其它實施方案中，所述2個分子包含一個或多個堿基錯配，或它們的核苷酸總數(shù)存在差異(由于添加或刪除)。在其它實施方案中，所述“互補的”miRNA抑制劑核酸分子包含至少10個連續(xù)核苷酸，所述核苷酸顯示出與在miRNA分子中包含的序列的完全互補性。通常，miRNA抑制劑核酸分子是天然存在的DNA-或RNA分子或合成的核酸分子， 其在序列中包含一個或多個修飾的核苷酸，所述核苷酸可以屬于相同類型或一個或多個不同類型。
例如，本發(fā)明預見到，這樣的miRNA抑制劑核酸分子包含至少一個核糖核苷酸主鏈單位和至少一個脫氧核糖核苷酸主鏈單位。此外，miRNA抑制劑核酸分子可以含有RNA 主鏈的一種或多種修飾，成為2' -0-甲基或2' -0-甲氧基乙基(也稱作“2' -0-甲基化”)，其阻止在培養(yǎng)基中的核酸酶降解，且重要的是，也阻止RNA-誘導的沉默復合物核酸酶的內(nèi)切核酸水解性裂解(endonucleolytic cleavage)，導致miRNA的不可逆抑制。另一種可能的修飾(其在功能上等同于2' -0-甲基化)包括鎖定的核酸(LNA)，其代表上文定義的含有一個或多個LNA核苷酸單體的核酸類似物。要在本發(fā)明的背景下使用的另一類miRNA表達沉默劑包括稱作“antagomirs”的化學地工程化的寡核苷酸，其代表綴合到膽固醇上的單鏈RNA分子。所述分子可以包含19 至25個核苷酸。優(yōu)選地，所述分子包含20、21、22、23或?qū)€核苷酸。更優(yōu)選地，所述分子包含23個核苷酸(其它細節(jié)可以參見Krutzfeldt等人，2005，Nature, 438 :685-689)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，可以以要導入組織或細胞中的表達載體的形式， 提供上文定義的miRNA抑制劑?；蛘?，這樣的載體也可以導入上文定義的活的治療劑中。通常，可以從以轉(zhuǎn)染或瞬時表達載體的形式提供的轉(zhuǎn)基因，生產(chǎn)RNA。例如，競爭性的miRNA抑制劑可以作為從強啟動子表達的轉(zhuǎn)錄物來提供，其含有超過一個、優(yōu)選多個與目標微RNA的串聯(lián)結(jié)合部位。在m^ert等人，2007，Nat. Methods, 4 =721-726中描述的“微 RNA海綿”是該技術的一個例證性的、非限制性實例。在上文定義的藥物組合物中包含的“脫甲基化劑”表示這樣的藥物其能夠脫甲基化染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，優(yōu)選啟動子區(qū)域、更優(yōu)選PDE4D7啟動子。要用在本發(fā)明的背景下的脫甲基化劑的實例是5-氮雜-2'-脫氧胞苷和5-氮雜胞苷，其會重新活化被結(jié)構(gòu)性染色質(zhì)變化 (其涉及DNA甲基化)不適當?shù)爻聊幕?，且其可以逆轉(zhuǎn)這些變化，并因此恢復基本的細胞途徑。這通常會導致基因再表達和轉(zhuǎn)化的狀態(tài)的某些方面的逆轉(zhuǎn)。5-氮雜胞苷和5-氮雜-2'-脫氧胞苷通常會如下滅活DNA胞嘧啶C5-甲基轉(zhuǎn)移酶當結(jié)合到該甲基轉(zhuǎn)移酶上時，在DNA中的5-氮雜-2'-脫氧胞苷殘基和酶之間形成穩(wěn)定的復合物，從而模仿穩(wěn)定的過渡狀態(tài)中間體。在根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中可以包含的另一種藥物(單獨地，或與5-氮雜-2'-脫氧胞苷和/或5-氮雜胞苷組合地)是曲古抑菌素A(TSA)。在上文定義的藥物組合物中包含的“磷酸二酯酶置換因子”表示這樣的化合物其能夠干擾或破壞磷酸二酯酶(尤其是PDE4D7)與相互作用配偶體或相互作用物的相互作用。這樣的過程可能最終導致，在PDE重分布之前和之后，PDE(尤其是PDE4D7)結(jié)合不同的相互作用配偶體。這樣的新的相互作用配偶體可以分離PDE (尤其是PDE4D7)，并相應地調(diào)節(jié)細胞行為，例如引起對受體結(jié)合或其它下游活性的影響。在這樣的置換反應中可能涉及的、和/或能夠分離PDE(尤其是PDE4D7)的蛋白配偶體的實例是錨定蛋白如AKAP、支架蛋白如DISCI、β -抑制蛋白或RACKl、調(diào)節(jié)蛋白如XAP2/AIP/ARA9、cAMP結(jié)合蛋白如PKA-R 亞基或EPAC或受體如β 1-腎上腺素受體、以及酶如ERK。優(yōu)選的磷酸二酯酶置換因子是肽、肽擬似物、小分子、抗體和適體。在磷酸二酯酶置換因子的背景下，“肽”表示存在于磷酸二酯酶分子(尤其是 PDE4D7)中或代表該分子的氨基酸區(qū)段，或上文定義的相互作用蛋白或分離蛋白。在肽中包含的氨基酸區(qū)段可以具有5-100個氨基酸、優(yōu)選10-50個氨基酸、更優(yōu)選20-30個氨基酸的長度。所述區(qū)段可以與PDE或相互作用物蛋白或其一部分完全相同，或可以包含序列變化。 例如，所述肽序列可以包含在所有位置的最多25%處的修飾的氨基酸殘基，優(yōu)選不會改變分子的結(jié)構(gòu)性質(zhì)或結(jié)合性質(zhì)的修飾。在肽中存在的氨基酸序列或者可以代表PDE或相互作用物蛋白的空間結(jié)構(gòu)域，并相應包含在分子的一級序列中不鄰近的氨基酸區(qū)段的并排。
在磷酸二酯酶置換因子的背景下，“肽擬似物”是指設計成模仿肽的小蛋白-樣鏈。 這樣的肽擬似物可以源自現(xiàn)有肽(例如上文定義的肽)的修飾，以便改變分子的性質(zhì)。肽擬似物可以源自改變分子的穩(wěn)定性或結(jié)合能力的修飾。這些修飾通常包括對非天然存在的肽的改變。例如，根據(jù)本發(fā)明的肽擬似物可以具有改變的肽主鏈，或可以包含非天然的氨基酸。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的肽擬似物可以表示磷酸二酯酶分子，尤其是PDE4D7，或上文定義的相互作用蛋白或分離蛋白。
在本發(fā)明的一個實施方案中，肽擬似物可以阻斷PDE (尤其是PDE4D7)和它的相互作用物之間的相互作用。在本發(fā)明的另一個實施方案中，肽擬似物可以增強PDE(尤其是 PDE4D7)和它的相互作用物之間的相互作用。
用于制備肽擬似物的方法和技術以及用于測試肽擬似物的試驗，是本領域技術人員已知的。
在磷酸二酯酶置換因子的背景下，“小分子”表示這樣的小有機化合物其優(yōu)選地生物活性的，即生物分子，但是優(yōu)選地不是聚合物。這樣的有機化合物可以具有任意合適的形式或化學性質(zhì)。所述化合物可以是天然化合物，例如次級代謝物，或已經(jīng)設計并從新制備的人工化合物。在本發(fā)明的一個實施方案中，小分子能夠阻斷PDE(尤其是PDE4D7)和它的相互作用物之間的相互作用。在本發(fā)明的另一個實施方案中，小分子可以增強PDE(尤其是 PDE4D7)和它的相互作用物之間的相互作用。用于鑒別和制備小分子的方法和技術以及用于測試小分子的試驗，是本領域技術人員已知的。
在磷酸二酯酶置換因子的背景下，“抗體”或“適體”表示上文定義的PDE4D7特異性的抗體或抗體變體或片段，或上文定義的PDE4D7特異性的適體，其具有干擾或破壞PDE (尤其是PDE4D7)和它的一種或多種相互作用物之間的相互作用的能力?；蛘撸撔g語也可以表示這樣的抗體或適體其結(jié)合如上文所述的PDE4D7相互作用物中的任意一種或多種，同樣具有干擾或破壞PDE(尤其是PDE4D7)和它的一種或多種相互作用物之間的相互作用的能力。用于生產(chǎn)或測試抗體或適體的方法已經(jīng)在上文中描述，和/或是本領域技術人員已知的。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述藥物組合物可以另外包含對癌細胞有活性的額外化合物，例如本領域技術人員已知的細胞毒性的化合物或其它化療或放療化合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明也預見到篩選程序和方法，其用于鑒別上文定義的對PDE4D7表達產(chǎn)物或蛋白特異性的適體、直接地刺激或調(diào)節(jié)PDE4D7的活性的化合物、PDE4D7酶活性的變構(gòu)激動劑、對PDE4D7miRNA特異性的miRNA抑制劑、antagomir、PDE4D7特異性的脫甲基化劑、PDE4D7特異性的磷酸二酯酶置換因子、PDE4D7特異性的肽擬似物和PDE4D7特異性的小分子或藥物。這樣的篩選程序可以包括下述步驟(a)生產(chǎn)細胞，所述細胞表達PDE4D7作為多肽，所述多肽作為分泌型蛋白或在細胞膜上，或作為細胞內(nèi)組分，(b)使在步驟(a)中生產(chǎn)的多肽接觸實驗樣品，所述實驗樣品可能含有相互作用分子，例如對PDE4D7蛋白特異性的適體、直接地刺激或調(diào)節(jié)PDE4D7的活性的化合物、直接地刺激或調(diào)節(jié)PDE4D7的活性的化合物、PDE4D7酶活性的變構(gòu)激動劑、PDE4D7特異性的磷酸二酯酶置換因子、PDE4D7特異性的肽擬似物或PDE4D7特異性的小分子或藥物；和(c)通過觀察PDE4D7的結(jié)合和/或活性的抑制或調(diào)節(jié)，鑒別相互作用分子。
或者，這樣的篩選程序可以包括下述步驟(a)使實驗樣品接觸一個或多個表達 PDE4D7作為轉(zhuǎn)錄物的細胞，所述實驗樣品可能含有直接地或間接地相互作用的分子，例如對PDE4D7轉(zhuǎn)錄物特異性的適體、對PDE4D7miRNA特異性的miRNA抑制劑、antagomir、 PDE4D7特異性的脫甲基化劑、PDE4D7特異性的磷酸二酯酶置換因子、PDE4D7特異性的肽擬似物或PDE4D7特異性的小分子或藥物，(b)檢測所述序列的表達水平；和(c)通過觀察 PDE4D7的結(jié)合或表達水平的調(diào)節(jié)或降低，鑒別相互作用分子。
本發(fā)明也包括通過上文所述的篩選程序或方法可得到的或已經(jīng)得到的對 PDE4D7表達產(chǎn)物或蛋白特異性的適體、直接地刺激或調(diào)節(jié)PDE4D7的活性的化合物、PDE4D7 酶活性的變構(gòu)激動劑、對PDE4D7miRNA特異性的miRNA抑制劑、antagomir、PDE4D7特異性的脫甲基化劑、PDE4D7特異性的磷酸二酯酶置換因子、PDE4D7特異性的肽擬似物和PDE4D7 特異性的小分子或藥物。
在另一個方面，本發(fā)明涉及上文定義的藥物組合物，其用于治療或預防癌癥，尤其是用于治療前列腺癌，優(yōu)選地用于治療激素-抗性的前列腺癌。
此外，在另一個方面，本發(fā)明涉及下述物質(zhì)用于制備藥物組合物的應用，所述藥物組合物用于治療或預防癌癥、尤其是前列腺癌，優(yōu)選地用于治療激素-抗性的前列腺癌 (a)直接地刺激或調(diào)節(jié)PDE4D7的活性的化合物，優(yōu)選PDE4D7酶活性的變構(gòu)激動劑；(b)間接地刺激或調(diào)節(jié)PDE4D7的活性的化合物；(c)PDE4D7蛋白或其生物活性等效物；(d)編碼和表達PDE4D7的核酸；(e)對PDE4D7miRNA特異性的miRNA抑制劑；(f)脫甲基化劑；和/ 或(g)磷酸二酯酶置換因子，優(yōu)選肽、肽擬似物、小分子、抗體或適體。
在另一個方面，本發(fā)明涉及治療或預防癌癥、尤其是前列腺癌、優(yōu)選地治療激素-抗性的前列腺癌的方法，所述方法包括給個體施用，具體地給遭受癌癥或預測會發(fā)展癌癥的個體施用(a)直接地刺激或調(diào)節(jié)PDE4D7的活性的化合物，優(yōu)選PDE4D7酶活性的變構(gòu)激動劑；(b)間接地刺激或調(diào)節(jié)PDE4D7的活性的化合物；(c)PDE4D7蛋白或其生物活性等效物；(d)編碼和表達PDE4D7的核酸；(e)對PDE4D7miRNA特異性的miRNA抑制劑；(f) 脫甲基化劑；和/或(g)磷酸二酯酶置換因子，優(yōu)選肽、肽擬似物、小分子、抗體或適體。
在本領域技術人員已知的不同的遞送系統(tǒng)的幫助下，例如，通過包囊在脂質(zhì)體中、 微粒、微膠囊、能夠表達所述化合物的重組細胞、受體-介導的胞吞作用、將核酸構(gòu)建為逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體的一部分等，可以將根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物施用給患者、受試者或個體。導入方法可以是局部的、腸內(nèi)的或腸胃外的，且可以包括真皮內(nèi)的、肌肉內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、靜脈內(nèi)的、皮下的、鼻內(nèi)的、吸入的、硬膜外的和口服的途徑。通過任意方便的途徑，例如通過輸注或快速濃注，通過經(jīng)上皮內(nèi)襯或粘膜皮膚內(nèi)襯(例如，口腔粘膜、直腸粘膜和腸粘膜等)的吸收，或通過吸入，可以施用所述組合物，且可以與其它生物活性劑一起施用。給藥可以是全身的或局部的。一種優(yōu)選的局部給藥方法是通過直接注射。
在另一個實施方案中，可以將藥物組合物直接地遞送給內(nèi)臟器官、體腔等，其中使用成像裝置來直接引導注射針到達目標部位。還可以在外科手術的同時，將藥物組合物施用給患病部位。在另一個實施方案中，可以在控釋系統(tǒng)中遞送所述組合物。
優(yōu)選地，所述藥物組合物是適合口服、局部或全身給藥的形式。在一個優(yōu)選的實施方案中，局部地、口服地或全身地施用所述藥物組合物。
在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，可以在分級個體的免疫測定以后，或在已經(jīng)進行如上文所述的鑒別個體的前列腺癌適合性的方法以后，尤其是在分類個體為具有降低的PDE4D7水平以后，施用藥物組合物。
在另一個實施方案中，所述藥物組合物包含治療有效量的上文定義的本發(fā)明的藥物組合物的成分和藥學上可接受的載體。術語“藥學上可接受的”是指，被管理機構(gòu)或其它通常公認的用于動物(更具體地，人)的藥典批準。術語“載體”表示與治療劑一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或介質(zhì)。這樣的載體是藥學上可接受的，即在采用的劑量和濃度，對受體是無毒的。
通常，所述成分單獨供給，或在單位劑型中混合在一起，例如，作為干燥的低壓凍干粉末或無水濃縮物，其在密封的容器(諸如指示活性劑的量的安瓿或藥囊)中。
本發(fā)明的藥物組合物可以配制成中性形式或鹽形式。
優(yōu)選地，所述藥物組合物可以直接施用，或與本領域技術人員已知的任意合適的佐劑組合地施用。本發(fā)明的組合物可以施用給動物，優(yōu)選哺乳動物。本文使用的“哺乳動物”意在具有與本領域普通技術人員的通常理解相同的含義。具體地，“哺乳動物”包括人類。
術語“施用”是指治療上有效劑量的前述組合物的給藥?！爸委熡行Я俊笔侵府a(chǎn)生預期效果的劑量，優(yōu)選地，該效果是PDE4D7的誘導和增強。精確劑量取決于治療目的，且可由本領域技術人員使用已知的技術來確定。如本領域已知的和上面描述的，針對全身或局部遞送、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、給藥時間、藥物相互作用和病癥的嚴重性進行調(diào)整，可能是必要的，且可以由本領域技術人員通過例行試驗來確定。
可以根據(jù)預期的劑量方案、預期的使用持續(xù)時間、組合物的所有成分的精確量和比例、和本領域技術人員已知的其它因素和參數(shù)，進一步調(diào)節(jié)根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中的活性成分或化合物的濃度。
根據(jù)本發(fā)明的活性劑或化合物可以單獨施用，或與其它治療聯(lián)合施用。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可以與抗-激素治療(例如抗-雄激素治療)聯(lián)合施用。
本發(fā)明的藥物組合物還可以包含本領域技術人員已知的任意合適的防腐劑。
此外，根據(jù)本發(fā)明的制劑還可以包含具有下述作用的化合物抗氧化作用、自由基清除劑、抗紅斑作用、抗炎作用或抗變應性作用，以便補充或增強它們的作用。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，可以將上文定義的藥物組合物的活性組分融合到合適的載體蛋白上，例如融合到Ig Fc受體蛋白或聚合的Ig受體上。優(yōu)選地，可以提供上文定義的PDE4D7或其生物活性等效物，作為融合蛋白。所述融合配偶體可以提供在 N-或C-端。
如果要以活細胞或上文定義的活的治療劑的形式施用根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物， 可以以本領域技術人員已知的任意合適的形式，將轉(zhuǎn)化的和制備的細胞施用給患者。優(yōu)選地，可以以包含微生物(例如如上所述的乳桿菌屬，量為IO2-IO12細胞，優(yōu)選IO3-IO8細胞) 的組合物的形式，施用活的治療劑。38
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)技術人員的知識，可以適當?shù)卣{(diào)節(jié)藥物組合物或藥物中2種或更多種成分之間的比例。
可以任選地采用合適的試驗，以輔助鑒別本發(fā)明的藥物組合物的成分的最佳比例和/或劑量范圍。要在制劑中采用的上文定義的藥物組合物的成分的精確劑量和成分之間的比例取決于給藥途徑、疾病或障礙的確切類型、以及其它因素，且應當根據(jù)從業(yè)人員的判斷和每位患者的情況來決定。從源自體外或(動物)模型實驗系統(tǒng)的劑量-響應曲線，可以推知有效劑量或成分比例。
典型的劑量可以例如在0. 001-1000 μ g范圍內(nèi)；但是，預見到低于或高于該示例性范圍的劑量，特別是考慮到前述因素。
在另一個方面，本發(fā)明涉及藥物試劑盒，其用于治療或預防癌癥、尤其是前列腺癌，所述藥物試劑盒包含至少一種選自下述的組分(a)直接地刺激或調(diào)節(jié)PDE4D7的活性的化合物，優(yōu)選PDE4D7酶活性的變構(gòu)激動劑；(b)間接地刺激或調(diào)節(jié)PDE4D7的活性的化合物；(c)PDE4D7蛋白或其生物活性等效物；(d)編碼和表達PDE4D7的核酸；(e)對 PDE4D7miRNA特異性的miRNA抑制劑；(f)脫甲基化劑；和(g)磷酸二酯酶置換因子。
可以在施用上文定義的藥物組合物的背景下，使用藥物試劑盒。具體地，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒可以用于治療或預防癌癥、尤其是前列腺癌。
根據(jù)本發(fā)明，藥物試劑盒的成分可以包含在一個或多個容器或單獨的實體中。它們可以優(yōu)選地配制成藥物組合物或藥物，更優(yōu)選地，可以如在上文中在本發(fā)明的藥物組合物的上下文中已經(jīng)描述的，配制它們，例如它們可以包含合適的藥用載體等。特別優(yōu)選的是，上文在本發(fā)明的藥物組合物的上下文中所述的局部給藥用制劑。根據(jù)本發(fā)明的藥物試劑盒還可以任選地包含文件，其指示使用或采用藥物試劑盒和它的組分。優(yōu)選地，在本發(fā)明的藥物試劑盒中包含的說明書可以含有推薦的治療選項、劑量方案等。所述藥物試劑盒還可以包含說明書活頁，和/或可以提供關于用途、劑量等的額外信息。
根據(jù)本領域技術人員已知的任意合適的劑量方案，可以將本發(fā)明的藥物試劑盒施用給患者。藥物試劑盒或試劑盒組分可以優(yōu)選地每周施用1次，更優(yōu)選地每周施用2次、3 次、4次、5次、或6次，最優(yōu)選地每天1次或每天2次或更頻繁，除非另外指出。在治療過程中，可以以遠遠更長的時間間隔施用劑量，且在需要時，可以以遠遠更短的時間間隔施用， 例如，每天幾次。在一個優(yōu)選的情況下，使用本文所述的方法和本領域技術人員已知的其它方法，可以監(jiān)測對治療的響應，且因此可以優(yōu)化劑量，例如，在時間、量和/或組成方面進行優(yōu)化。通過定期評估，可以監(jiān)測發(fā)展。還預見到，在共同治療方案中采用藥物試劑盒，即與其它藥劑或藥物共同施用，所述其它藥劑或藥物例如抗生素、抗病毒藥或IgG或IgA免疫球蛋白、抗癌藥，優(yōu)選抗-激素藥，更優(yōu)選上文提及的抗-雄激素。
在另一個具體的方面，本發(fā)明涉及一種試劑盒，其包含上文定義的用于測定 PDE4D7的表達的成分以及上文定義的用于治療前列腺癌(尤其是激素-抗性的前列腺癌) 的藥物試劑盒的成分。
在本發(fā)明的另一個特別優(yōu)選的實施方案中，要診斷、檢測、監(jiān)測或預測的癌癥，或要診斷、檢測、監(jiān)測或預測其進展的癌癥，或要用上述的藥物組合物治療的癌癥，或通過根據(jù)本發(fā)明的治療方法治療的癌癥，是前列腺癌。
在本發(fā)明的另一個特別優(yōu)選的實施方案中，要診斷、檢測、監(jiān)測或預測的癌癥，或要診斷、檢測、監(jiān)測或預測其進展的癌癥，或要用上述的藥物組合物治療的癌癥，或通過根據(jù)本發(fā)明的治療方法治療的癌癥，是激素-抗性的前列腺癌。術語“激素-抗性的前列腺癌”是指，前列腺癌或前列腺癌細胞系的生長和增殖對男性性激素刺激是抗性的。該術語也表示不再順從抗-激素(優(yōu)選上文定義的抗-雄激素)給藥的晚期前列腺癌發(fā)展階段。
通常，前列腺癌進展伴有從內(nèi)分泌控制向旁分泌控制和最終的自分泌控制的依賴性轉(zhuǎn)移，且認為該復雜的過程是在細胞控制的分子水平發(fā)生的變化的結(jié)果。由于在該階段的腫瘤的轉(zhuǎn)移傳播的可能性，激素-抗性的前列腺癌是根據(jù)本發(fā)明(具體地根據(jù)上面提供的實施方案)的診斷和治療的主要靶標。
為了例證目的，提供了下面的實施例和圖。因而應當理解，所述實施例和圖不應解釋為限制性的。本領域的技術人員能夠清楚地預見到本文所述原理的其它修飾。
實施例
t施仿I丨1-定量RT-PCR測丨定人細胞,系禾口人會目織異禾中移棺物
從圖1所示的細胞系和人組織異種移植物(關于其它細節(jié)，也參見Marques等人， 2006，Eur. Urol. ,49(2) J45-57)，分離出RNA，并通過標準程序轉(zhuǎn)錄成cDNA。針對PDE4D7的表達水平，測試樣品“PC346P異種移植物”至“346Flu2”(它們是細胞系)以及樣品“P(^95” 至“PC374” (它們是異種移植物)的制備的cDNA。
qRT-PCR.材料和方法
用DNA酶處理RNA樣品，以確保沒有DNA污染。在cDNA合成之前，用DNA酶I ( Vitrogen)在37°C處理RNA樣品30min。然后按照生產(chǎn)商的指導，用Superscript Vilo(In Vitrogen)處理1 μ g RNA樣品，以合成第一鏈DNA用于qPCR分析。然后用RNA酶Hl在 37°C 處理 DNA 樣品 30min。
將得到的DNA稀釋至終濃度50-60ng/l·! 1，將其中的5μ 1加入96-孔光學反應板的每個反應孔中。
使用ABI Prism 7300機器，以15 μ 1的反應體積，根據(jù)下述方法，進行定量PCR反應
7. 5μ 1 Platinum qPCR SuperMix-UDG，含有 ROX(InVitrogen)
2. 2μ1無核酸酶的水
0. 1 μ 1 1 OOpmo 1/ μ 1 探針
0. 1 μ 1 lOOpmol/μ 1 正向弓 I 物
0. 1 μ 1 lOOpmol/μ 1 反向弓 I 物
每個反應孔中的總體積是15 μ 1，包括cDNA。
在下述方案下，PCR自身運行40個循環(huán)
階段重復溫度(°c)時間1 1502秒2 1952秒3 409515秒601分鐘40CN 102549167 A
qRT-PCR 引物和探針(TAQMAN)
使用下面的寡核苷酸引物和探針，進行PDE4D7的RT-PCR
正向引物5，-TGCCTCTGAGGAAACACTAC-3，(SEQ ID NO 3)，反向引物 5，-GCTGAATA TTGCGACATGAAAG-3，(SEQ ID NO :4)，產(chǎn)生長度 101 的產(chǎn)物。
使用序列5，-CCAGTAATGAAGAGGAAGACCCTTTCCGC-3，(SEQ ID NO :5)，作為探針。
將探針集合設計成靶向PDE同種型的獨特N-端區(qū)域。將擴增子設計成在Taqman 測定(ABI Prism技術)的最佳范圍內(nèi)。一式四份地進行所有試驗，以使數(shù)據(jù)完整性最大化。 還包括GAPDH參照探針，用于對比所有連續(xù)數(shù)據(jù)。
qRT-PCR 數(shù)據(jù)分析
進行-ddCt方案，以便標準化和對比不同的RT-PCR實驗。通過手工域觀察(manual threshold observation)，得到Ct值，其中每個探針集合以相當?shù)男手笖?shù)地放大。具體地，進行下述步驟
1.)計算參照物和目標基因之間的循環(huán)數(shù)目(Ct)的差異(從目標基因減去 GAPDH)，得到實驗樣品(ES) dCt。
2.)選擇一個樣品作為標準品以針對(LNCaP) (C)進行對比，并計算它的dCt。
3.)通過dCt (ES) -dCt (C) = ddCt，可以導出循環(huán)數(shù)目差異的變化。
4.)通過2-ddCt，可以導出最終的可比較的表達值，以便考慮在每個循環(huán)之后的 DNA倍增，從而顯示mRNA的量與LNCaP的對比。
該操作產(chǎn)生相對于LNCaP (其具有1的值)的值，即認為> 1的任意值是表達的增加，認為< 1的值是表達的降低。
因此假定，所有PCR反應的延伸效率是在特定范圍內(nèi)，產(chǎn)生1的值。
用于標準化和對比不同的RT-PCR實驗的百分比方案
對于每個探針集合，得到Ct (循環(huán)數(shù)目)值。這如下產(chǎn)生找到與它們的指數(shù)期中的擴增曲線相交的基線。根據(jù)在每個實驗中得到的曲線，動態(tài)地產(chǎn)生該基線。然后從GAPDH 標準品的Ct值中減去GOI的Ct (相交或循環(huán)(cycle))值。
根據(jù)式Ct (GAPDH) -Ct (GOI) = dCt (假定GOI Ct值總是大于參照基因)，dCt值產(chǎn)生負數(shù)，即-dCt值。基于每個循環(huán)的倍增效應，根據(jù)比較表達值=2-dCt，確定絕對值。
由于從該計算得到非常小的值，為了處理目的，將值乘以1000。
通過該方案得到的PDE4D7的表達水平如圖2_7所示。具體地，圖2_4涵蓋了根據(jù)-ddCt方案標準化的不同的人前列腺癌細胞系和異種移植物(參見圖1)中的PDE4D7CDNA的相對表達，而圖5_7涵蓋了與單個細胞系或異種移植物組織材料中的總PDE4D表達相比，標準化的不同的人前列腺癌細胞系和異種移植物(參見圖1)中的 PDE4D7cDNA的相對表達。
從圖2-7可以看出，大多數(shù)雄激素-依賴性的或雄激素-敏感的相對于雄激素-不依賴的細胞系(圖3和6)或人異種移植物(圖4和7)之間，PDE4D7的表達(或轉(zhuǎn)錄)水平是顯著不同的。圖2和5顯示了細胞系和異種移植物的組合的結(jié)果。
根據(jù)圖2-7所示的結(jié)果，人前列腺癌細胞系和組織中PDE4D7的轉(zhuǎn)錄依賴于給定的細胞類型中雄激素受體活性的狀態(tài)。在存在AR和細胞對雄激素/激素刺激的敏感性的情況下，可以觀察到顯著的PDE4D7轉(zhuǎn)錄，而在沒有活性AR存在下，PDE4D7轉(zhuǎn)錄是非常少的，即基本上不存在。
實施例2-使用人組織樣品的定量RT-PCR測定
與激素-耐受性的/閹割-抗性的患者相比，在源自激素-敏感的/響應性的患者的前列腺癌組織中，評價了人PDE4D7的相對基因表達。
材料和方法
在下面的表1中，給出了在PDE基因表達實驗的qPCR測量中使用的樣品的細節(jié)
表1 在實驗中使用的患者信息
權利要求
1.用作前列腺癌標志物的磷酸二酯酶4D7(PDE4D7)。
2.一種用于診斷、檢測、監(jiān)測或預測癌癥或前列腺癌的進展的組合物，其包含PDE4D7 表達產(chǎn)物或蛋白的核酸親和配體和/或肽親和配體。
3.如權利要求2所述的組合物，其中所述核酸親和配體或肽親和配體被修飾成起造影劑作用。
4.如權利要求2所述的組合物，其中所述親和配體是對PDE4D7表達產(chǎn)物特異性的寡核苷酸集合、對PDE4D7表達產(chǎn)物特異性的探針、對PDE4D7表達產(chǎn)物或?qū)DE4D7蛋白特異性的適體、對PDE4D7蛋白特異性的抗體和/或?qū)DE4D7蛋白特異性的抗體變體。
5.PDE4D7作為標志物的應用，所述標志物用于診斷、檢測、監(jiān)測或預測前列腺癌或前列腺癌的進展。
6.一種用于檢測、診斷、監(jiān)測或預測前列腺癌或前列腺癌的進展的方法，所述方法至少包括下述步驟測定樣品中PDE4D7的水平。
7.一種用于診斷、監(jiān)測或預測激素-抗性的前列腺癌或向激素-抗性的前列腺癌的進展的方法，其中所述方法辨別激素-敏感的和激素-抗性的前列腺癌，所述方法包括下述步驟(a)測定樣品中PDE4D7的水平；(b)測定樣品中參照基因的表達水平；(c)將測得的PDE4D7表達水平標準化成參照基因的表達；和(d)對比標準化的表達水平和選擇用于排除激素-敏感的前列腺癌的預定截止值，其中低于截止值的標準化的表達水平指示著激素-抗性的前列腺癌，其中所述截止值是在約 1至7之間，優(yōu)選約5。
8.一種數(shù)據(jù)獲取方法，其至少包括下述步驟(a)測試個體中PDE4D7的表達；和(b)將在步驟(a)中測定的表達與對照水平相對比。
9.一種用于檢測、診斷、監(jiān)測或預測前列腺癌或前列腺癌的進展的免疫測定，其至少包括下述步驟(a)測試樣品中PDE4D7的表達，(b)測試對照樣品中PDE4D7的表達，(c)測定步驟(a)和(b)中PDE4D7的表達的差異；和(d)基于在步驟(c)中得到的結(jié)果，確定前列腺癌的存在或階段或前列腺癌的進展，其中所述測試步驟是基于特異性地結(jié)合PDE4D7的抗體的應用。
10.一種用于辨別激素-敏感的和激素-抗性的前列腺癌的免疫測定，其包括下述步驟(a)測定樣品中PDE4D7的水平；(b)測定樣品中參照基因的表達水平；(c)將測得的PDE4D7表達水平標準化成參照基因的表達水平；和(d)對比標準化的表達水平和選擇用于排除激素-敏感的前列腺癌的預定截止值，其中低于截止值的標準化的表達水平指示著激素-抗性的前列腺癌，其中所述截止值是在約 1至7之間，優(yōu)選約5。
11.一種鑒別個體對于前列腺癌治療的適合性的方法，所述方法包括(a)測試從個體獲得的樣品中PDE4D7的表達；(b)測試所述樣品中參照基因的表達，和/或測試對照樣品中PDE4D7的表達；(c)相對于步驟(b)中的水平，分類步驟(a)的表達水平；和(d)在個體的樣品被分類為具有降低的PDE4D7表達水平的情況下，將該個體鑒別為適合接受前列腺癌治療。
12.一種用于分級具有前列腺癌疾病的一個個體或一群個體的免疫測定，其包括(a)測試從個體獲得的樣品中PDE4D7的表達；(b)測試所述樣品中參照基因的表達，和/或測試對照樣品中PDE4D7的表達；(c)測定步驟(a)中PDE4D7的表達與步驟(b)中PDE4D7和/或參照基因的表達的差異；禾口(d)在個體的樣品具有降低的PDE4D7表達水平的情況下，基于在步驟(c)中得到的結(jié)果，將一個個體或一群個體分級給前列腺癌治療。
13.如權利要求6-8或11中任一項所述的方法、或如權利要求9、10或12所述的免疫測定，其中通過測量核酸或蛋白水平，或通過測定PDE4D7或參照基因的生物活性，完成所述表達的測試或測定，或額外完成所述表達的測試或測定。
14.如權利要求13所述的方法或免疫測定，其中所述方法或免疫測定包括下述額外步驟將測得的核酸或蛋白水平或測得的生物活性與對照水平相對比。
15.如權利要求7、11、13或14中任一項所述的方法、或如權利要求10或12-14中任一項所述的免疫測定，其中所述參照基因是持家基因，優(yōu)選GAPDH或PBGD，或不同的磷酸二酯酶，優(yōu)選PDE4D5。
16.如權利要求7、11、13、14或15中任一項所述的方法、或如權利要求10、12、13、14或 15中任一項所述的免疫測定，其中所述方法或免疫測定包括下述額外步驟測定前列腺特異性的抗原(PSA)的水平。
17.如權利要求6、7、11、13、14或15中任一項所述的方法、或如權利要求9、10、12、13、 14或15中任一項所述的免疫測定，其中所述樣品是組織樣品、尿樣品、尿沉積物樣品、血液樣品、唾液樣品、精液樣品、包含循環(huán)腫瘤細胞的樣品、或包含前列腺分泌的外核體的樣品。
18.一種藥物組合物，其包含至少一種選自下述的組分(a)直接地刺激或調(diào)節(jié)PDE4D7的活性的化合物，優(yōu)選PDE4D7酶活性的變構(gòu)激動劑；(b)間接地刺激或調(diào)節(jié)PDE4D7的活性的化合物；(c)PDE4D7蛋白或其生物活性等效物；(d)編碼和表達PDE4D7的核酸；(e)對PDE4D7miRNA特異性的miRNA抑制劑；(f)脫甲基化劑；和(g)磷酸二酯酶置換因子，優(yōu)選肽、肽擬似物、小分子、抗體或適體。
19.一種用于治療或預防前列腺癌的藥物組合物，其包含至少一種選自下述的組分(a)直接地刺激或調(diào)節(jié)PDE4D7的活性的化合物，優(yōu)選PDE4D7酶活性的變構(gòu)激動劑；(b)間接地刺激或調(diào)節(jié)PDE4D7的活性的化合物；(c)PDE4D7蛋白或其生物活性等效物；CN 102549167 A(d)編碼和表達PDE4D7的核酸；(e)對PDE4D7miRNA特異性的miRNA抑制劑；(f)脫甲基化劑；和(g)磷酸二酯酶置換因子，優(yōu)選肽、肽擬似物、小分子、抗體或適體。
20.如權利要求11或13-16中任一項所述的方法、或如權利要求12-16中任一項所述的免疫測定，其中所述前列腺癌治療包括施用如權利要求16所述的藥物組合物，或與其它癌癥療法、優(yōu)選放射療法或化學療法相組合地施用如權利要求16所述的藥物組合物。
21.如權利要求1所述的磷酸二酯酶，如權利要求2-4中任一項所述的組合物，如權利要求5所述的應用，如權利要求6、11、13-17或20中任一項所述的方法，如權利要求9、 12-17或20中任一項所述的免疫測定，或如權利要求19所述的藥物組合物，其中所述前列腺癌是激素-抗性的前列腺癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及用作前列腺癌標志物的磷酸二酯酶4D7(PDE4D7)，以及PDE4D7作為用于診斷、檢測、監(jiān)測或預測前列腺癌或前列腺癌的進展的標志物的應用。本發(fā)明也涉及用于診斷、檢測、監(jiān)測或預測前列腺癌或前列腺癌的進展的組合物，對應的方法和免疫測定，用于相對于激素-敏感的前列腺癌而診斷、監(jiān)測或預測激素-抗性的前列腺癌的方法，對應的免疫測定，數(shù)據(jù)獲取方法，用于診斷、檢測、監(jiān)測或預測前列腺癌或前列腺癌的進展的免疫測定，鑒別個體對于前列腺癌治療的適合性的方法，用于分級具有前列腺癌疾病的一個個體或一群個體的免疫測定，用于分級具有前列腺癌的個體的免疫測定，以及藥物組合物，所述藥物組合物包含直接地刺激或調(diào)節(jié)PDE4D7的活性的化合物、間接地刺激或調(diào)節(jié)PDE4D7的活性的化合物、PDE4D7蛋白或其生物活性等效物、編碼和表達PDE4D7的核酸、對PDE4D7miRNA特異性的miRNA抑制劑、脫甲基化劑和/或磷酸二酯酶置換因子。
文檔編號C12N9/16GK102549167SQ201080033823
公開日2012年7月4日 申請日期2010年5月11日 優(yōu)先權日2009年5月12日
發(fā)明者D·J·P·亨德森, M·D·豪斯利, R·霍夫曼 申請人:格拉斯哥大學校董會, 皇家飛利浦電子股份有限公司