專利名稱：改善的人長五聚環(huán)蛋白3表達(dá)系統(tǒng)及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠表達(dá)高水平人五聚環(huán)蛋白3(hPTX;3)的源自人的細(xì)胞系統(tǒng)、所用的方法和材料。
背景技術(shù)：
人長五聚環(huán)蛋白3，PTX3或hPTX3 (GeneBank登錄號BD131701)，是一種由二硫鍵連接的8個(gè)亞基組成的多聚體糖蛋白。本發(fā)明的作者已經(jīng)設(shè)計(jì)了用于在HEK293F人細(xì)胞系中生產(chǎn)PTX3的表達(dá)系統(tǒng)。該系統(tǒng)基于含有新霉素抗性基因的質(zhì)粒，其中PTX3基因在人遍在蛋白C啟動子序列的控制下。 此系統(tǒng)避免了源自非人源細(xì)胞系內(nèi)源產(chǎn)生PTX3的嵌合PTX3的潛在形成。在所獲得的那些生產(chǎn)克隆當(dāng)中選出最佳的生產(chǎn)分離克隆，名為2F12。獲得了約20mg/L PTX3的產(chǎn)量，這對商業(yè)生產(chǎn)需要而言是不夠的。為增加PTX3表達(dá)水平，本發(fā)明的作者已經(jīng)構(gòu)建其中PTX3基因在CMV啟動子控制下的質(zhì)粒。該質(zhì)粒用來再轉(zhuǎn)染表達(dá)PTX3的克隆2F12。在新的分離轉(zhuǎn)染瘤(transfectoma) 中檢測到的生產(chǎn)率水平高于預(yù)期，約80mg/L。發(fā)明描述使用實(shí)驗(yàn)策略獲得表達(dá)高水平人PTX3的人源克隆，所述實(shí)驗(yàn)策略包括以下步驟a)構(gòu)建攜帶在CMV啟動子控制下的人PTX3的質(zhì)粒表達(dá)盒；b)在所述質(zhì)粒中插入潮霉素抗性盒，以選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染瘤，所述轉(zhuǎn)染瘤源自G418 抗性的PTX3表達(dá)克隆的再轉(zhuǎn)染；c)驗(yàn)證表達(dá)的重組蛋白的身份(identity)和水平；d)生物化學(xué)表征重組hPTX3。PCT/EP2009/050937的內(nèi)容因而通過引用的方式并入。本發(fā)明的目的是基本上具有SEQ ID 1的序列的真核表達(dá)載體，其包含在有效啟動子控制下的編碼人長五聚環(huán)蛋白PTX3的核苷酸序列和編碼可選擇標(biāo)記的核苷酸序列。該載體優(yōu)選地用來轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，優(yōu)選地其中宿主細(xì)胞是已經(jīng)能夠表達(dá)人長五聚環(huán)蛋白PTX3的重組人細(xì)胞，更優(yōu)選地其中重組人細(xì)胞是在ECACC以編號08011001保藏的重組^3F/PTX3/2F12克隆。在具體的方面，該載體被線性化。本發(fā)明的另一個(gè)目的是能夠表達(dá)由如上所公開的載體編碼的人長五聚環(huán)蛋白 PTX3的重組細(xì)胞，優(yōu)選地該重組細(xì)胞是重組HEK293F細(xì)胞系，更優(yōu)選地，它是在英國索利茲伯里健康保護(hù)署應(yīng)急準(zhǔn)備和響應(yīng)培養(yǎng)物保藏中心(Health Protection Agency, Culture Collections Centre For Emergency Preparedness and Response Salisbury UK)以編號 09072902保藏的重組MS24PTX克隆。本發(fā)明的另一個(gè)方面是如上文所公開的重組細(xì)胞用于生產(chǎn)人長五聚環(huán)蛋白Ρ Τ3 的用途。本發(fā)明的另一個(gè)目的是用于生產(chǎn)重組人長五聚環(huán)蛋白PTX3的方法，其包括
a)用其中人長五聚環(huán)蛋白基因在CMV啟動子控制下的可選擇質(zhì)粒轉(zhuǎn)染已經(jīng)表達(dá)重組人長五聚環(huán)蛋白PTX3的重組人細(xì)胞；b)選擇并且培育轉(zhuǎn)染的重組人細(xì)胞；c)從轉(zhuǎn)染的重組人細(xì)胞的培養(yǎng)基純化人長五聚環(huán)蛋白PTX3。優(yōu)選地，表達(dá)重組人長五聚環(huán)蛋白PTX3的重組人細(xì)胞是重組HEK293F細(xì)胞系，更優(yōu)選地，它是在ECACC以編號08011001保藏的重組^3F/PTX3/2F12克隆。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，純化步驟包括以下步驟的至少一者陰離子交換層析、羥基磷灰石層析或尺寸排阻層析。本發(fā)明的另一個(gè)目的是用于生產(chǎn)重組人長五聚環(huán)蛋白PTX3的方法，其包括a)用基本上具有SEQ ID 1的序列的第一載體和用基本上具有SEQ ID 2的序列的第二載體同時(shí)或依次地共轉(zhuǎn)染人細(xì)胞；b)選擇并且培育雙重轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；b)從雙重轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的培養(yǎng)基純化人長五聚環(huán)蛋白PTX3。本發(fā)明的另一個(gè)目的是用于生產(chǎn)重組人長五聚環(huán)蛋白PTX3的方法，包括培育重組MSMPTX克隆并且從培養(yǎng)基純化人長五聚環(huán)蛋白PTX3的步驟?，F(xiàn)在將具體參考以下附圖，借助非限制性實(shí)施例說明本發(fā)明。

圖1 :pSASSI_hPTX3圖譜和主要特征。圖2 (A)MS24PTX克隆和(B) ^3F/PTX3/2F12克隆在轉(zhuǎn)瓶中的生長、存活率和生產(chǎn)率。圖3 通過梯度4-15%的SDS-PAGE (A)和尺寸排阻層析法(B)表征從MS24PTX克隆純化的重組人PTX3。 圖 4 :hPTX3 克隆 ^3F/PTX3/2F12 和 hPTX3 克隆 MS24PTX 的 FGF2 結(jié)合能力。圖5 :pSCl-hPTX3圖譜和主要特征。
實(shí)施例實(shí)施例1 克隆 ^3F/PTX3/2F12質(zhì)粒PSC1-PTX3的構(gòu)建1. pSG/Ub 的構(gòu)建1. 1人遍在蛋白C啟動子序列的制備通過用PCR擴(kuò)增，從pUB/Bsd質(zhì)粒Qnvtrogen,目錄號V512-20)取得人遍在蛋白 C啟動子。作為克隆策略的一部分，在兩個(gè)末端引入限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列。在上游擴(kuò)增引物中構(gòu)造BsaAI位點(diǎn)并且在下游引物中構(gòu)造EcoRI位點(diǎn)。擴(kuò)增的區(qū)域?qū)?yīng)于pUB/ Bsd序列中的第1941至3161位核苷酸。寡核苷酸設(shè)計(jì)如下5，ρ UbC 長度26 聚物(SEQ ID 3)ATATCACGTG ATC TGG CCTCCG CGC C3，ρ UbC 長度23 聚物(SEQ ID 4)GGAATTC GGT CCG GTC TAACAA A擴(kuò)增的方案如下:lng/y1 質(zhì)粒 DNA，2mM MgC12，0. 2mMdNTP，400nM 每種引物，1 X 供應(yīng)的緩沖液和0. 04u/ml的Taq DNA聚合酶(Sigma Genosys)；溫度曲線(temperature profile) 3 分鐘 94°C，30 次(30 秒 94°C，30 秒 46°C，2 分鐘 72°C )，5 分鐘 72°C，在 4°C冷卻直至進(jìn)一步使用。擴(kuò)增產(chǎn)物(123^3ρ)通過二氧化硅膜離心柱(NucIeoSpin，Machery-Nagel GmbH&Co.)純化，在pGEM-T-Easy載體(Promega目錄號A1360)中連接，并且轉(zhuǎn)化至大腸桿菌宿主菌株HB2151 (Pharmacia Biotech)中。通過在補(bǔ)充有50mg/l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上培育選擇轉(zhuǎn)化體。通過用^uI加Mel酶的限制性分析檢查從氨芐青霉素抗性菌落分離的質(zhì)粒 DNA (預(yù)期 3650和600bp片段)。顯示正確限制圖譜的質(zhì)粒通過完整插入物的序列分析進(jìn)一步檢查并且隨后用 EcoRI (Sigma-Genosys)和 BsaAI (New England Biolabs)限制酶消化。借助瓊脂糖凝膠分離和在二氧化硅膜離心柱上洗脫來純化人遍在蛋白C啟動子。1.2載體片段pSG5的制備質(zhì)粒pSG5 (4076bp, Stratagene)用限制酶 EcoRI (Sigma-Genosys)和 BsaAI (New England Biolabs)切割；所得的片段長1432和2644bp。將含有pSG5的主鏈的2644bp片段制備并且借助瓊脂糖凝膠電泳加二氧化硅膜離心柱純化。1. 3pSG/Ub 的制備使用T4DNA連接酶(ftOmega)，將步驟1. 1和1. 2中制備的DNA片段連接并且轉(zhuǎn)化于HB2151大腸桿菌細(xì)胞中。通過在補(bǔ)充有50mg/l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上培育選擇轉(zhuǎn)化體。通過用EcoRI加^cII酶的限制性分析檢查從氨芐青霉素抗性菌落分離的質(zhì)粒 DNA(預(yù)期J670和1192bp片段)。具有預(yù)期限制圖譜的質(zhì)粒DNA命名為pSG/W3。2.pSCl 的構(gòu)建2. 1新霉素抗性盒(NeoR)的制備通過PCR擴(kuò)增從pcDNA3質(zhì)粒(5446bp，Invitrogen)取得新霉素抗性盒(NeoR)。 作為克隆策略的一部分，在兩個(gè)末端引入限制性核酸內(nèi)切酶AflIII的識別序列。擴(kuò)增的區(qū)域?qū)?yīng)于pcDNA3序列中的第1788至3252位核苷酸并且包括SV40啟動子和復(fù)制起點(diǎn)、新霉素抗性O(shè)RFjn SV40多腺苷酸化信號。寡核苷酸設(shè)計(jì)如下5， NeoR(SEQ ID 5)ATATACATG TCC CCA GGC AGG CAG AA3， NeoR(SEQ ID 6)ATATACAT GTAT ACA GAC ATG ATA AG擴(kuò)增的方案如下:lng/y1 質(zhì)粒 DNA，2mM MgC12，0. 2mMdNTP，400nM 每種引物，1 X 供應(yīng)的緩沖液和0. (Mu/μ 1的Taq DNA聚合酶(Sigma Genosys)；溫度曲線3分鐘94°C, 30次(30秒94°C，30秒46°C，2分鐘72°C )，5分鐘72°C，在4°C冷卻直至進(jìn)一步使用。擴(kuò)增產(chǎn)物(1484bp)通過二氧化硅膜離心柱純化，在pGEM-T-Easy載體(Promega 目錄號A1360)中連接，并且轉(zhuǎn)化至大腸桿菌宿主菌株HB2151中。通過在補(bǔ)充有50mg/l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上培育選擇轉(zhuǎn)化體。通過用SmaI加^cI酶的限制性分析檢查從氨芐青霉素抗性菌落分離的質(zhì)粒 DNA (預(yù)期 1200和3300bp片段)。顯示正確限制圖譜的質(zhì)粒通過完整插入物的序列分析進(jìn)一步檢查并且隨后用 AflIlKNew England Biolabs)限制酶消化。
借助瓊脂糖凝膠分離和在二氧化硅膜離心柱上洗脫來純化NeoR盒(1471bp)。2. 2載體片段pSG/Ub的制備在步驟1. 3中制備的質(zhì)粒pSG/Wd通過AflIII消化作用線性化并且在二氧化硅膜離心柱上純化。2. 3pSCl 的制備使用T4DNA連接酶(ftOmega)，將步驟2. 1和2. 2中制備的DNA片段連接并且轉(zhuǎn)化于M109大腸桿菌菌株(New England Biolabs)中。通過在補(bǔ)充有50mg/l氨芐青霉素的 LB培養(yǎng)基上培育選擇轉(zhuǎn)化體。如先前所述，通過采用5’ NeoR和3’ NeoR寡核苷酸的PCR擴(kuò)增初步分析抗生素抗性菌落，通過限制性分析檢查純化的質(zhì)粒。為此目的，使用SmaI (NeoR序列內(nèi)部的第602 位)和SacII (UbC序列內(nèi)部的第4142位)酶。具有預(yù)期限制圖譜(3540和1793bp片段) 的質(zhì)粒DNA命名為pSCl。3. pSCl-PTX3 的構(gòu)建3. lhPTX3編碼序列的制備通過BamHI (Roche Applied Science)消化從 pSG5_PTX3 (W099/32516 “含有長 S^ifSS PTX3(Pharmaceutical compositions containing the long pentraxin PTX3) ”)取得hPTX3 (GeneBank登錄號BD 131701)序列。通過瓊脂糖凝膠電泳和二氧化硅膜離心柱純化人PTX3片段(146;3bp)。3. 2載體片段pSCl的制備pSCl載體通過BamHI消化作用線性化并且在二氧化硅膜離心柱上純化。3. 3pSCl-PTX3的構(gòu)建和驗(yàn)證使用T4DNA連接酶(Roche Applied Science)，將步驟3. 2和3. 3中制備的DNA片段連接并且轉(zhuǎn)化于JM109大腸桿菌菌株中。轉(zhuǎn)化體通過在補(bǔ)充有50mg/l氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基上培育進(jìn)行選擇，并且通過PCR用兩條與PTX3序列互補(bǔ)的寡核苷酸初步進(jìn)行篩選。所述寡核苷酸序列是5，PTX(SEQ ID 7) GTGAGAACTCGGATGATTATGAT3， PTX(SEQ ID 8)TGAAACATACTGAGCTCCTCCAT在10 μ 1終體積中，用于擴(kuò)增的試劑是1 μ 1煮沸的菌落(50ml水中的1個(gè)菌落)， 2mM MgC12，0. 2mM dNTP，320nM每種引物，0. 06%甲酰胺，IX供應(yīng)的緩沖液和0. 08u/μ 1的 Taq DNA 聚合酶(SigmaGenosys)；溫度曲線3 分鐘 96°C，30 次(30 秒 94°C，30 秒 58°C，2 分鐘72°C )，5分鐘72°C，在4°C冷卻直至進(jìn)一步使用。從PCR篩選為陽性的菌落中純化的質(zhì)粒用Mil限制酶(Roche Applied Science) 消化以檢查hPTX3插入物的方向。對具有預(yù)期限制圖譜(6619和177bp)的質(zhì)粒在編碼WdC 啟動子、NeoR盒、和hPTX3的區(qū)域中測序，并且將所述質(zhì)粒確定為pSCl_PTX3。新質(zhì)粒(pSCl-PTX3)隨后與在遍在蛋白啟動子控制下的PTX3cDNA序列和在SV40 啟動子控制下的新霉素抗性基因構(gòu)建在一起；圖1中描述了全部其他特征和質(zhì)粒圖譜。pSCl-PTX3的完整序列如下(SEQ ID 2)。pSCl_hPTX3序列從第一個(gè)EcoRI位點(diǎn)表述(圖5)。下劃線標(biāo)出源自含有PTX3cDNA的pSG5的序列。起始密碼子(ATG)和終止密碼子以粗體表示。
pSCl-PTX3(SEQ ID 2)AATTCGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCCGGCTCAAACTCAGCTCACTTGAGAGTCTCCTCCCGCCAG CTGTGGAA
AGAACTTTGCGTCTCTCCAGCAATQCATCTCCTTGCGATTCTGTTTTGTGCTCTCTGGTCTGCAGTGTTGGCCGAGAACTCGGATGATTATGATCTCATGTATGTGAATTTGGACAACGAAATAGACAATGGACTCCATCCCACTG AGGACCCCACGCCGTGCGACTGCGGTCAGGAGCACTCGGAATGGGACAAGCTCTTCATCATGCTGGAGAACTCGCAG ATGAGAGAGCGCATGCTGCTGCAAGCCACGGACGACGTCCTGCGGGGCGAGCTGCAGAGGCTGCGGGAGGAGCTGGG CCGGCTCGCGGAAAGCCTGGCGAGGCCGTGCGCGCCGGGGGCTCCCGCAGAGGCCAGGCTGACCAGTGCTCTGGACG AGCTGCTGCAGGCGACCCGCGACGCGGGCCGCAGGCTGGCGCGTATGGAGGGCGCGGAGGCGCAGCGCCCAGAGGAG GCGGGGCGCGCCCTGGCCGCGGTGCTAGAGGAGCTGCGGCAGACGCGAGCCGACCTGCACGCGGTGCAGGGCTGGGC TGCCCGGAGCTGGCTGCCGGCAGGTTGTGAAACAGCTATTTTATTCCCAATGCGTTCCAAGAAGATTTTTGGAAGCG TGCATCCAGTGAGACCAATGAGGCTTGAGTCTTTTAGTGCCTGCATTTGGGTCAAAGCCACAGATGTATTAAACAAA ACCATCCTGTTTTCCTATGGCACAAAGAGGAATCCATATGAAATCCAGCTGTATCTCAGCTACCAATCCATAGTGTT TGTGGTGGGTGGAGAGGAGAACAAACTGGTTGCTGAAGCCATGGTTTCCCTGGGAAGGTGGACCCACCTGTGCGGCA CCTGGAATTCAGAGGAAGGGCTCACATCCTTGTGGGTAAATGGTGAACTGGCGGCTACCACTGTTGAGATGGCCACA GGTCACATTGTTCCTGAGGGAGGAATCCTGCAGATTGGCCAAGAAAAGAATGGCTGCTGTGTGGGTGGTGGCTTTGA TGAAACATTAGCCTTCTCTGGGAGACTCACAGGCTTCAATATCTGGGATAGTGTTCTTAGCAATGAAGAGATAAGAG AGACCGGAGGAGCAGAGTCTTGTCACATCCGGGGGAATATTGTTGGGTGGGGAGTCACAGAGATCCAGCCACATGGA GGAGCTCA
GTATGTTTCATAAATGTTGTGAAACTCCACTTGAAGCCAAAGAAAGAAACTCACACTTAAAACACATGCCAGTTGGGAAGGTCTGAAAACTCAGTGCATAATAGGAACACTTGAGACTAATGAAAGAGAGAGTTGAGACCAATCTT TATTTGTACTGGCCAAATACTGAATAAACAGTTGAAGGAAAGACATTGGAAAAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCG AGGGGGGG
CCCGGGGATCCAGATCTTATTAAAGCAGAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAA TAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTAT CTTATCATGTCTGGTCGACTCTAGACTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGG CGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTC CCCAGGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCA GCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCC CCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCG CCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGA GCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCA CGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATG CCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAA CTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCAC TGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCG AGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAA GCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCA TCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCC ATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGT GTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCG CTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCT GAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATG CTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTT CACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTA TACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCG CCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGG CGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTC CCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCT GGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGG TAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACA GAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGT TACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCA AGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGG AACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAA ATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCAC CTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAG GGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAA CCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCC GGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCA CGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTG CAAAAAAG
CGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTA TGGCAGCA CTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAG TCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAG CAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGAT CCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCA AAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCTTTTT TCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAAC AAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACC TATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC AGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGT GTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGA AATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGAAATTGTAAACGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTT AAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGA CCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGG CGkkkkkCCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGATCTGGCCTCCGCGCCGGGTTTTGGCGCCCCCCGCGGGCG CCCCCCTCCTCACGGCGAGCGCTGCCACGTCAGACGAAGGGCGCAGCGAGCGTCCTGATCCTTCCGCCCGGACGCTC AGGACAGCGGCCCGCTGCTCATAAGACTCGGCCTTAGAACCCCAGTATCAGCAGAAGGACATTTTAGGACGGGACTT GGGTGACTCTAGGGCACTGGTTTTCTTTCCAGAGAGCGGAACAGGCGAGGAAAAGTAGTCCCTTCTCGGCGATTCTG CGGAGGGATCTCCGTGGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCG CAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCGCTGTGATCGTCACTTGGTGAGTAGCGGGCTGCTGGGCTGGCCGGGGCTTTCGTGGCCGCCGGGCCGCTCGGTGGGACGGAAGCGTGTGGAGAGACCGCCAAGGGCTGTAGTCTGGG TCCGCGAGCAAGGTTGCCCTGAACTGGGGGTTGGGGGGAGCGCAGCAAAATGGCGGCTGTTCCCGAGTCTTGAATGG AAGACGCTTGTGAGGCGGGCTGTGAGGTCGTTGAAACAAGGTGGGGGGCATGGTGGGCGGCAAGAACCCAAGGTCTT GAGGCCTTCGCTAATGCGGGAAAGCTCTTATTCGGGTGAGATGGGCTGGGGCACCATCTGGGGACCCTGACGTGAAG TTTGTCACTGACTGGAGAACTCGGTTTGTCGTCTGTTGCGGGGGCGGCAGTTATGGCGGTGCCGTTGGGCAGTGCAC CCGTACCTTTGGGAGCGCGCGCCCTCGTCGTGTCGTGACGTCACCCGTTCTGTTGGCTTATAATGCAGGGTGGGGCC ACCTGCCGGTAGGTGTGCGGTAGGCTTTTCTCCGTCGCAGGACGCAGGGTTCGGGCCTAGGGTAGGCTCTCCTGAAT CGACAGGCGCCGGACCTCTGGTGAGGGGAGGGATAAGTGAGGCGTCAGTTTCTTTGGTCGGTTTTATGTACCTATCT TCTTAAGTAGCTGAAGCTCCGGTTTTGAACTATGCGCTCGGGGTTGGCGAGTGTGTTTTGTGAAGTTTTTTAGGCAC CTTTTGAAATGTAATCATTTGGGTCAATATGTAATTTTCAGTGTTAGACTAGTAAATTGTCCGCTAAATTCTGGCCG TTTTTGGCTTTTTTGTTAGACCGGACCG人細(xì)胞系(HEK293F)已經(jīng)因其以懸浮方式并在無血清和蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中生長的能力而選擇(Florian M ^irm “在培育的哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生重組蛋白治療藥(Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells) "Nature Biotechnology22 (11) : 1393-1398，2004，Yan SC 等人，“表征和新穎純化來自3種哺乳動物細(xì)胞系的重組人蛋白C(Characterization and novel purification of recombinant human protein C from three mammalian cell lines) '^Biotechnology (N. Y. ) 1990年7月，8 (7) :655-61. “細(xì)胞系用于產(chǎn)生流感病毒疫苗的用途對技術(shù)、制造、和管理動因的評價(jià)”疫苗研究倡議("Use of cell lines for the production of influenza virus vaccines -.an appraisal of technical, manufacturing, and regulatory considerations" Initiative for Vaccine Research)，世界衛(wèi)生組織，瑞士日內(nèi)瓦(2007 年4月10日)。為轉(zhuǎn)染HEK293F，pSCl_PTX3質(zhì)粒以(PvuI消化的)線性形式或以環(huán)狀形式使用。用線性化的質(zhì)粒獲得最佳轉(zhuǎn)染率；基于生產(chǎn)率和生長能力進(jìn)行克隆選擇。在幾輪亞克隆后，選出2F12克隆。表達(dá)hPTX3的人克隆2F1已經(jīng)根據(jù)布達(dá)佩斯條約在2008年1月10日以保藏號08011001保藏在ECACC(歐洲細(xì)胞培養(yǎng)保藏中心(European Collection of Cell Cultures)，英國健康保護(hù)署，PortonDown，威爾特郡SP40JG，英國)。下文描述實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)。3. 4從pSCl-PTX3產(chǎn)生的重組細(xì)胞
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轉(zhuǎn)染和亞克隆在轉(zhuǎn)染當(dāng)日，將IO6個(gè)細(xì)胞/ml ^3F(Invitrogen目錄號R790-07)以^ml的 Freestyle培養(yǎng)基終體積接種在125ml轉(zhuǎn)瓶中。隨后允許pSCl/PTX3質(zhì)粒根據(jù)制造商的方案吸附于 ^3fectin 試劑(GIBCO/Invitrogen)。簡而言之，在兩個(gè)獨(dú)立的管中，將30μ g環(huán)狀或PvuI線性化的pSCl-PTX3稀釋于 Iml 的 Optimem(GIBCO/Invitrogen，Carlsbad, CA, USA)中，并且將 40 μ 1 的 293fectin (Invitrogen)用Optimem稀釋至1ml。兩種溶液在室溫孵育5分鐘，隨后混合 (終體積aiil)并且在相同條件孵育30分鐘。將DNA/脂質(zhì)混合物添加至細(xì)胞并且在攪拌 (120轉(zhuǎn)/分鐘)下于37°C，5%C02孵育。在培育36小時(shí)后，將培養(yǎng)基更換成選擇培養(yǎng)基 (200ml Freestyle培養(yǎng)基+500 μ g/ml的G418)，并且將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以200 μ 1/孔鋪種于10 塊96孔平板中。在15日后，通過ELISA確定最高生產(chǎn)細(xì)胞匯集物，并且將它們在M孔、6 孔和Τ25瓶中擴(kuò)增。獲得的重組細(xì)胞匯集物以每孔1個(gè)細(xì)胞在96孔平板中，于50%新鮮培養(yǎng)基和 50%條件培養(yǎng)基內(nèi)亞克隆。實(shí)施例2 克隆MS24PTX質(zhì)粒 pSASSI_hPTX3 的構(gòu)津LpCEPlightA 的構(gòu)建其中事先克隆了抗體輕鏈且丟失一部分多克隆位點(diǎn)和BamHI限制位點(diǎn)的pCEP4質(zhì)粒(Invitrogen 目錄號 V044-50 用限制酶 EcoRV 和 ClaI (Roche Applied Science)切割； 所述消化導(dǎo)致獲得不存在允許染色體外復(fù)制的Epstein-Barr病毒復(fù)制起點(diǎn)(oriP)和核抗原(由EBNA-I基因編碼)的質(zhì)粒。所得的片段長6910bp和4281bp。將含有pCEP的主鏈的6910bp片段借助瓊脂糖凝膠電泳加二氧化硅膜離心柱純化。由于ClaI產(chǎn)生粘末端，因此使用iMDNA聚合酶(Roche Applied Science)按以下方案補(bǔ)平所述片段150ng的Clal/ EcoRV純化的片段(38 μ 1)，5 μ 1的IOx T4DNA聚合酶緩沖液，4 μ 1的dNTP混合物2. 5mM, 3 μ 1的T4DNA聚合酶(1U/ μ 1)。在37°C，15分鐘后，將該反應(yīng)在70°C持續(xù)5分鐘終止，隨后置于冰上。將片段在二氧化硅膜離心柱上純化，并且使用T4DNA連接酶(Promega)，在室溫自身連接過夜。T0P10感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen)用連接混合物轉(zhuǎn)化，并且通過在補(bǔ)充有 100mg/L氨芐青霉素的LB平板上培育而選擇轉(zhuǎn)化體。從氨芐青霉素抗性菌落分離的質(zhì)粒DNA命名為pCEPlight Δ。2.制備含有潮霉素抗性和CMV啟動子的載體片段通過PCR擴(kuò)增pCEPlight Δ從該質(zhì)粒中取得潮霉素抗性盒連同細(xì)胞巨化病毒 (CMV)立即早期增強(qiáng)子/啟動子。作為克隆策略的一部分，在與CMV啟動子3’末端退火的寡核苷酸中引入限制性核酸內(nèi)切酶BamHI的識別序列。約5500bp的擴(kuò)增區(qū)域包括CMV啟動子、在TK啟動子控制下的潮霉素基因，連同TK 多腺苷酸化信號。寡核苷酸設(shè)計(jì)如下寡CMV (SEQ ID 9) 5' GAGAACTGTAACGTTGGATCCAGCTGG3 ‘寡H (SEQ ID 10) 5，GTGTACAAAGGATCCAGACATGATAAG 3，擴(kuò)增的方案如下2ng的pCEPlightΔ，200nM每種引物，0.2mMdNTP，lX供應(yīng)的緩沖液，1.5μ1 DMS0,0. 5μ 1 Taq DNA聚合酶(Phusion)，終體積50 μ 1 ；溫度曲線1分鐘 980C，35次(10秒98°C，30秒55°C，3分鐘72°C )，10分鐘72°C，在4°C冷卻直至進(jìn)一步使用。通過瓊脂糖凝膠電泳加二氧化硅膜離心柱純化擴(kuò)增產(chǎn)物( 5500bp)。使純化的片段自身連接并且用來轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen)。通過限制性分析和序列分析檢查從氨芐青霉素抗性菌落分離的質(zhì)粒DNA，并且命名為pCEP Δ Bam。3. hPTX3基因的制備通過BamHI (Roche Applied kience)消化作用從如上所示的pSCl_PTX3中取得 hPTX3 (GeneBank登錄號BD 131701)序列。通過瓊脂糖凝膠電泳和二氧化硅膜離心柱純化人 PTX3 片段(1463bp)。4. pCEP Δ Bam_hPTX3 的制備pCEP Δ Bam載體通過BamHI消化作用線性化并且在二氧化硅膜離心柱上純化。使用T4DNA連接酶(Roche Applied Science)，將線性化的pCEP Δ Bam和步驟3中制備的與 hPTX3基因相對應(yīng)的DNA片段連接并且用來轉(zhuǎn)化T0P10大腸桿菌菌株。轉(zhuǎn)化體通過在補(bǔ)充有100mg/l氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上培育進(jìn)行選擇，并且通過限制性分析初步篩選以評定 PTX3片段的方向。5. SV40多腺苷酸化信號的制備通過PCR擴(kuò)增pCEPlight Δ質(zhì)粒從該質(zhì)粒中取得SV40多腺苷酸化信號。作為克隆策略的一部分，在兩個(gè)末端分別引入限制性核酸內(nèi)切酶HindIII和B10I的識別序列。寡核苷酸設(shè)計(jì)如下PCEPSVH (SEQ ID 11) 5，AAGCTTAGACATGATAAGATACATTG 3，PCEPSVX (SEQ ID 12)5' CTCGAGAGTCGACCGGTCATGGCTGC3 ‘?dāng)U增的方案如下lng的pCEPlightΔ，200nM每種引物，0.2mMdNTP，lX供應(yīng)的緩沖液，2 μ 1 MgC1250mM,0. 5μ 1 TaqDNA 聚合酶(Invitrogen)，終體積 50 μ 1 ；溫度曲線1 分鐘94°C，30次(30秒94°C，1分鐘55°C，1分鐘72°C )，15分鐘72°C，在4°C冷卻直至進(jìn)一步使用。通過瓊脂糖凝膠電泳加二氧化硅膜離心柱純化擴(kuò)增產(chǎn)物( 420bp)。6. pSASSI-hPTX3 的制備與SV40多腺苷酸化信號相對應(yīng)的純化片段和pCEP Δ Bam_hPTX3用HindIIlAhoI 限制酶消化并且使用iMDNA連接酶(ftOmega)連接。連接混合物用來轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen)，并且通過在含有100mg/L氨芐青霉素的LB平板上培育而選擇轉(zhuǎn)化體。通過限制性分析和序列分析檢查從氨芐青霉素抗性菌落分離的質(zhì)粒DNA，并且將質(zhì)粒命名為pSASSI-hPTX3。pSASSI-HPTX3 的完整序列如下(SEQ ID 1)。pSASSI_hPTX3 序列從 BamHI 位點(diǎn)開始表述(圖1)。hPTX3的序列以小寫字母表示。起始密碼子(atg)和終止密碼子(taa)以粗體表示。pSASSI-HPTX3(SEQ ID 1).GGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCCGGCTCAAACTCAGCTCACTTGAGAGTCTCCTCCCG60CCAGCTGTGGAAAGAACTTTGCGTCTCTCCAGCAATGCATCTCCTTGCGATTCTGTTTTG120TGCTCTCTGGTCTGCAGTGTTGGCCGAGAACTCGGATGATTATGATCTCATGTATGTGAA180TTTGGACAACGAAATAGACAATGGACTCCATCCCACTGAGGACCCCACGCCGTGCGACTG240CGGTCAGGAGCACTCGGAATGGGACAAGCTCTTCATCATGCTGGAGAACTCGCAGATGAG300AGAGCGCATGCTGCTGCAAGCCACGGACGACGTCCTGCGGGGCGAGCTGCAGAGGCTGCG360GGAGGAGCTGGGCCGGCTCGCGGAAAGCCTGGCGAGGCCGTGCGCGCCGGGGGCTCCCGC420AGAGGCCAGGCTGACCAGTGCTCTGGACGAGCTGCTGCAGGCGACCCGCGACGCGGGCCG480CAGGCTGGCGCGTATGGAGGGCGCGGAGGCGCAGCGCCCAGAGGAGGCGGGGCGCGCCCT540GGCCGCGGTGCTAGAGGAGCTGCGGCAGACGCGAGCCGACCTGCACGCGGTGCAGGGCTG600GGCTGCCCGGAGCTGGCTGCCGGCAGGTTGTGAAACAGCTATTTTATTCCCAATGCGTTC660CAAGAAGATTTTTGGAAGCGTGCATCCAGTGAGACCAATGAGGCTTGAGTCTTTTAGTGC720CTGCATTTGGGTCAAAGCCACAGATGTATTAAACAAAACCATCCTGTTTTCCTATGGCAC780AAAGAGGAATCCATATGAAATCCAGCTGTATCTCAGCTACCAATCCATAGTGTTTGTGGT840GGGTGGAGAGGAGAACAAACTGGTTGCTGAAGCCATGGTTTCCCTGGGAAGGTGGACCCA900CCTGTGCGGCACCTGGAATTCAGAGGAAGGGCTCACATCCTTGTGGGTAAATGGTGAACT960GGCGGCTACCACTGTTGAGATGGCCACAGGTCACATTGTTCCTGAGGGAGGAATCCTGCA1020GATTGGCCAAGAAAAGAATGGCTGCTGTGTGGGTGGTGGCTTTGATGAAACATTAGCCTT1080CTCTGGGAGACTCACAGGCTTCAATATCTGGGATAGTGTTCTTAGCAATGAAGAGATAAG1140AGAGACCGGAGGAGCAGAGTCTTGTCACATCCGGGGGAATATTGTTGGGTGGGGAGTCAC1200AGAGATCCAGCCACATGGAGGAGCTCAGTATGTTTCATAAATGTTGTGAAACTCCACTTG1260AAGCCAAAGAAAGAAACTCACACTTAAAACACATGCCAGTTGGGAAGGTCTGAAAACTCA1320GTGCATAATAGGAACACTTGAGACTAATGAAAGAGAGAGTTGAGACCAATCTTTATTTGT1380ACTGGCCAAATACTGAATAAACAGTTGAAGGAAAGACATTGGAAAAAGCTTAGACATGAT1440AAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTAT1500TTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGT1560TAACAA.CAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTT1620TTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCCGGCTGCCTCGCG1680CGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCT1740TGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGC1800GGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCGGTCGACTCTCGAGGGGGGGCCCGGGGATCCAACGTI860TACAGTTCTCCAGTGCATGTAATCCCTTCAGTTGGTTGGTACAACTTGCCAACTGGGCCC1920TGTTCCACATGTGACACGGGGGGGGACCAAACACAAAGGGGTTCTCTGACTGTAGTTGAC1980ATCCTTATAAATGGATGTGCACATTTGCCAACACTGAGTGGCTTTCATCCTGGAGCAGAC2040
TTTGCAGTCTGTGGACTGCAACACAACATTGCCTTTATGTGTAACTCTTGGCTGAAGCTC2100TTACACCAATGCTGGGGGACATGTACCTCCCAGGGGCCCAGGAAGACTACGGGAGGCTAC2160ACCAACGTCAATCAGAGGGGCCTGTGTAGCTACCGATAAGCGGACCCTCAAGAGGGCATT2220AGCAA.TAGTGTTTATAAGGCCCCCTTGTTAACCCTAAACGGGTAGCATATGCTTCCCGGG2280TAGTAGTATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAATAGCATATGTTACCCAACGGGAAG2340CATATGCTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTAAGGAACAGCGATCGATGATAAGC2400TGTCAAACATGAGAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGT2460TAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCG2520CGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACA2580ATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTT2640CCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGA2700AACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGA2760ACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAAT2820GATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCA2880AGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGT2940CACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAAC3000CATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCT3060AACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGA3120GCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAAC3180AACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAAT3240AGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGG3300CTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGC3360ACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGC3420AACTATGGATGAA.CGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTG3480GTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTA3540ATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACG3600TGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGA3660TCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGT3720GGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAG3780AGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAA3840CTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAG3900TGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCA3960GCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACAC4020CGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAA4080GGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCC4140AGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCG4200TCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGC4260CTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGCGCCGCGTGCGGCTGCTGGAGATGGCGGACGCG4320ATGGATATGTTCTGCCAAGGGTTGGTTTGCGCATTCACAGTTCTCCGCAAGAATTGATTG4380GCTCCAATTCTTGGAGTGGTGAATCCGTTAGCGAGGTGCCGCCGGCTTCCATTCAGGTCG4440AGGTGGCCCGGCTCCATGCACCGCGACGCAACGCGGGGAGGCAGACAA.GGTATAGGGCGG4500CGCCTACAATCCATGCCAACCCGTTCCATGTGCTCGCCGAGGCGGCATAAATCGCCGTGA4560CGATCAGCGGTCCAGTGATCGAAGTTAGGCTGGTAAGAGCCGCGAGCGATCCTTGAAGCT4620GTCCCTGATGGTCGTCATCTACCTGCCTGGACAGCATGGCCTGCAACGCGGGCATCCCGA4680TGCCGCCGGAAGCGAGAAGAATCATAATGGGGAAGGCCATCCAGCCTCGCGTCGCGAACG4740GCGAACGCCAGCAAGACGTAGCCCAGCGCGTCGGCCGCCATGCCCTGCTTCATCCCCGTG4800GCCCGTTGCTCGCGTTTGCTGGCGGTGTCCCCGGAAGAAATATATTTGCATGTCTTTAGT4860TCTATGATGACACAAACCCCGCCCAGCGTCTTGTCATTGGCGAATTCGAACACGCAGATG4920CAGTCGGGGCGGCGCGGTCCCAGGTCCACTTCGCATATTAAGGTGACGCGTGTGGCCTCG4980AACACCGAGCGAGCCTGCAGCGACCCGCTTAACAGCGTCAACAGCGTGCCGCAGATCCCG5040GGCAATGAGATATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCG5100AAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTT5160TCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTT5220TCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAG5280TGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGG5340GTGTCACGTTGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGG5400AGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCG5460GACCGCAAGGAA.TCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATC5520CCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGG5580CTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACG5640CGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACT5700GGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGC5760CGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTG5820CAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGA5880GCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCG5940TCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCT6000GGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTC6060CGAGGGCAAAGGAATAGGGGAGATGGGGGAGGCTAACTGAAACACGGAAGGAGACAATAC6120CGGAAGGAACCCGCGCTATGACGGCAATAAAAAGACAGAATAAAACGCACGGGTGTTGGG6180TCGTTTGTTCATAAACGCGGGGTTCGGTCCCAGGGCTGGCACTCTGTCGATACCCCACCG6240AGACCCCATTGGGGCCAATACGCCCGCGTTTCTTCCTTTTCCCCACCCCACCCCCCAAGT6300TCGGGTGAAGGCCCAGGGCTCGCAGCCAACGTCGGGGCGGCAGGCCCTGCCATAGCCACT6360GGCCCCGTGGGTTAGGGACGGGGTCCCCCATGGGGAATGGTTTATGGTTCGTGGGGGTTA6420TTATTTTGGGCGTTGCGTGGGGTCTGGTCCACGACTGGACTGAGCAGACAGACCCATGGT6480TTTTGGATGGCCTGGGCATGGACCGCATGTACTGGCGCGACACGAACACCGGGCGTCTGT6540GGCTGCCAAACACCCCCGACCCCCAAAAACCACCGCGCGGATTTCTGGCGTGCCAAGCTA6600GTCGACCAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGCAGATCCGGGCAACGTTGTTGCCAT6660TGCTGCAGGCGCAGAACTGGTAGGTATGGAAGATCTATACATTGAATCAATATTGGCAAT6720TAGCCATATTAGTCATTGGTTATATAGCATAAATCAAXATTGGCTATTGGCCATTGCATA6780CGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAATATGACCGCCAT6840GTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATA6900GCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGC6960CCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAG7020GGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTAC7080ATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCG7140CCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACG7200TATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGAT7260AGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGT7320TTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGC7380AAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACC7440GTCAGATCTCTAGAAGCTGGGTACCAGCT7469實(shí)施例3通過pSASSI_hPTX3轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的重組MS24PTX克隆1.轉(zhuǎn)染和亞克隆在轉(zhuǎn)染當(dāng)日，將IO6個(gè)細(xì)胞/ml ^3F/PTX3/2F12以^ml的Freestyle培養(yǎng)基終體積接種在125ml轉(zhuǎn)瓶中。隨后允許pSASSI-hPTX3質(zhì)粒根據(jù)制造商的方案吸附于^3fectin 試劑(GIBCO/Invitrogen)。簡而言之，將30μ g 的NruI 線性化的pSASSI-hPT)(3稀釋于 Iml 的 Optimem (GIBCO/ Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中，并且將 40μ 1 的 ^3fectin(Invitrogen)用 Optimem 稀釋至1ml。兩種溶液在室溫孵育5分鐘，隨后混合(終體積aiil)并且在相同條件孵育30 分鐘。將DNA/脂質(zhì)混合物添加至細(xì)胞并且在攪拌(120轉(zhuǎn)/分鐘)下于37°C ,5% CO2孵育。 在培育36小時(shí)后，將培養(yǎng)基更換成選擇培養(yǎng)基QOOmlFreestyle培養(yǎng)基+200 μ g/ml的潮霉素)，并且將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以200 μ 1/孔鋪種于10塊96孔平板中。在15日后，通過ELISA 確定最高生產(chǎn)細(xì)胞匯集物，并且將它們在M孔、6孔和Τ25瓶中擴(kuò)增。獲得的重組細(xì)胞匯集物以每孔1個(gè)細(xì)胞在96孔平板中，于50%新鮮培養(yǎng)基和 50%條件培養(yǎng)基內(nèi)亞克隆。2.重組 hPTX3 的 ELISA 檢測使用夾心ELISA滴定純化的PTX3或分泌于培養(yǎng)上清液中的PTX3。為檢測PTX3， 將96-孔Nunc Maxisorb微量滴定平板(Nunc，Roskilde，丹麥)用15mM碳酸鈉緩沖液，pH 9· 6 中的 700ng/ml 大鼠單克隆抗體MNB4抗人PTX3(Alexis Biochemicals，Lausen，瑞士) 在4°C包被過夜。孔用PBS加0. 05% Tween-20 (PBS-Tw洗滌液)洗滌并且用300 μ 1的含有5%脫脂乳的PBS-Tw在室溫封閉2小時(shí)。將稀釋于洗滌液加BSA中的細(xì)胞上清液或純化的重組人ΡΤΧ3添加至諸孔。產(chǎn)生用于定量的量程0至lOOng/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線用來自CHO細(xì)胞的純化的重組人PTX3產(chǎn)生。在37°C孵育1小時(shí)后，使用生物素綴合的多克隆兔抗PTX3抗體，隨后與綴合至辣根過氧化物酶的鏈霉抗生物素蛋白(Sigma-Aldrich，USA) 一起孵育，檢測結(jié)合的 PTX3。最后，添加2. 2’-聯(lián)氮基-雙3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(Sigma Chemical Co. USA) 用于顯色，并且使用3550EIA型微量平板讀板儀(Bio-Rad，Hercules, CA, USA)評定405nm 處的光密度。實(shí)施例4比較克隆^3F/PTX3/2F12和MS24PTX的生長、存活率和牛產(chǎn)率源自這兩種克隆的細(xì)胞以1，000, 000個(gè)細(xì)胞/ml (存活率彡90% )的密度接種于1升轉(zhuǎn)瓶中的500ml FreeStyle 293培養(yǎng)基中。監(jiān)測生長、存活率和生產(chǎn)率約1周直至細(xì)胞開始死亡。圖2顯示MSMPTX (圖板A)和^3F/PTX3/2F12 (圖板B)克隆在相同接種和培育條件下的生長、存活率和生產(chǎn)率。如圖中所示，用其中PTX3在CMV啟動子控制下的新質(zhì)粒再轉(zhuǎn)染表達(dá)PTX3的克隆^3F/PTX3/2F12 (MS24PTX克隆)時(shí)，我們能夠獲得PTX3生產(chǎn)率提高約4倍。實(shí)施例5純化來自MS24PTX克降的重組人PTX3把來自轉(zhuǎn)瓶中所培育的MSMPTX克隆中的培養(yǎng)上清液加載到Q-kpharoseTM Fast Flow(GE Healthcare,UK)裝填柱上。使用非線性梯度洗脫留下的物質(zhì)。將含有PTX3的級分直接施加至陶瓷羥基磷灰石(BioRad，Hercules，CA，USA)裝填柱。以非線性方式通過增加磷酸鹽濃度洗脫留下的物質(zhì)。將含有PTX3的級分濃縮并且在超濾膜(Pellicon-Biomax 100，Millipore)上進(jìn)行緩沖液交換，隨后通過Bios印SECS4000 (Phenomenex)上的尺寸排阻層析法和SDS-PAGE (圖3)表征。實(shí)施例6h~PTX3 與 FGF2 的結(jié)合在ELISA系統(tǒng)中評定純化的重組hPTX3與FGF2的結(jié)合。96-孔平板O^alcon 3912)用PBS中的2 μ g/ml FGF2 (Calbiochem)包被并且在4°C孵育過夜。孔用PBS加0. 1% Triton X-IOO (PBS-Tr,洗滌液)洗滌并且用200 μ 1的含有3% BSA的PBS-Tr (PBS-B封閉和稀釋液)在室溫封閉2小時(shí)。在洗滌后，添加在PBS-B中以0至120ng/ml的PTX3濃度稀釋的100 μ 1樣品，并且將平板在37°C孵育1小時(shí)，進(jìn)行結(jié)合。在洗滌后，平板與100 μ 1/ 孔的lOOng/ml兔抗PTX3多克隆抗體(在37°C，1小時(shí))一起孵育，再次洗滌并且與100 μ 1 的辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(PBS-B中1 1000 ；37°C下1小時(shí))一起孵育。在洗滌后，添加100 μ 1的生色底物3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(TMB) (sigma-Aldrich)，并且在10-15分鐘后，添加100 μ 1的HCl IM終止該反應(yīng)，并且使用3550ΕΙΑ型微量平板讀數(shù)儀 (Bio-Rad，Hercules, CA, USA)測定吸光度(圖 4)。PCT 打印(以電子表格的原始形式)(本表不是也不認(rèn)為是國際申請的一部分)
權(quán)利要求
1.一種基本上具有SEQ ID 1的序列的真核表達(dá)載體，所述載體包含在有效啟動子控制下的編碼人長五聚環(huán)蛋白PTX3的核苷酸序列和編碼可選擇標(biāo)記的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的用途。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體的用途，其中所述宿主細(xì)胞是已經(jīng)能夠表達(dá)人長五聚環(huán)蛋白PTX3的重組人細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體的用途，其中所述重組人細(xì)胞是在ECACC以編號 08011001 保藏的重組 ^3F/PTX3/2F12 克隆。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的載體的用途，其中所述載體被線性化。
6.一種重組細(xì)胞，其能夠表達(dá)由根據(jù)前述權(quán)利要求1中任一項(xiàng)所述的載體編碼的人長五聚環(huán)蛋白PTX3。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組細(xì)胞，其是重組HEK293F細(xì)胞系。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組細(xì)胞，其是重組MSMPTX克隆。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一項(xiàng)所述的重組細(xì)胞用于生產(chǎn)人長五聚環(huán)蛋白PTX3的用途。
10.一種用于生產(chǎn)人長五聚環(huán)蛋白PTX3的方法，所述方法包括a.用其中人長五聚環(huán)蛋白基因在CMV啟動子控制下的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染已經(jīng)表達(dá)重組人長五聚環(huán)蛋白PTX3的重組人細(xì)胞；b.選擇并且培育轉(zhuǎn)染的重組人細(xì)胞；c.從所述轉(zhuǎn)染的重組人細(xì)胞的培養(yǎng)基純化所述人長五聚環(huán)蛋白PTX3。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述表達(dá)重組人長五聚環(huán)蛋白PTX3的重組人細(xì)胞是重組HEK293F細(xì)胞系。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述表達(dá)重組人長五聚環(huán)蛋白PTX3的重組 HEK293F細(xì)胞系是在ECACC以編號08011001保藏的重組^3F/PTX3/2F12克隆。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)染的重組人細(xì)胞是MSMPTX克隆。
14.根據(jù)權(quán)利要求10至13所述的方法，其中純化步驟包括以下步驟中的至少一者陰離子交換層析、羥基磷灰石層析或尺寸排阻層析。
15.一種用于生產(chǎn)重組人長五聚環(huán)蛋白PTX3的方法，所述方法包括a)用基本上具有SEQID 1的序列的第一載體和基本上具有SEQ ID 2的序列的第二載體同時(shí)或依次地共轉(zhuǎn)染人細(xì)胞；b)選擇并且培育雙重轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；b)從雙重轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的培養(yǎng)基純化所述人長五聚環(huán)蛋白PTX3。
16.一種用于生產(chǎn)重組人長五聚環(huán)蛋白PTX3的方法，所述方法包括培育重組MSMPTX 克隆并且從培養(yǎng)基純化所述人長五聚環(huán)蛋白PTX3的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含在有效啟動子控制下的編碼人長五聚環(huán)蛋白PTX3的核苷酸序列和編碼可選擇標(biāo)記的核苷酸序列的真核表達(dá)載體、能夠提供由該載體編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)的重組人細(xì)胞和用于生產(chǎn)人長五聚環(huán)蛋白PTX3的方法。
文檔編號C12N15/79GK102549160SQ201080034030
公開日2012年7月4日 申請日期2010年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月29日
發(fā)明者A·埃斯普斯托, G·卡薩尼, M·薩薩諾, V·瑞維希奧 申請人:泰克諾根股份公司