專利名稱：生產(chǎn)1,4-丁二醇的微生物和相關(guān)方法
生產(chǎn)1，4_ 丁二醇的微生物和相關(guān)方法
背景技術(shù)：
本申請(qǐng)要求2009年6月4日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/184，311的優(yōu)先權(quán)，所述全部?jī)?nèi)容在此通過(guò)引用引入。本發(fā)明總體上涉及生物體的計(jì)算機(jī)(in silico)設(shè)計(jì)和生物體的工程改造，更具體而言，涉及具有1，4_ 丁二醇生物合成能力的生物體?；衔?-羥基丁酸G-HB)是4-碳羧酸，其具有作為各種日用品和特種化學(xué)品的構(gòu)造單元的工業(yè)潛力。具體而言，4-HB具有充當(dāng)進(jìn)入1，4_丁二醇家族化學(xué)品的新切入點(diǎn)的潛力，所述1，4_ 丁二醇家族化學(xué)品包括溶劑、樹(shù)脂、聚合物前體和特種化學(xué)品。1，4_ 丁二醇 (BDO)是聚合物中間體和工業(yè)溶劑，全球每年銷售約30億磅。BDO目前從石油化學(xué)前體、初級(jí)乙炔(primarily acetylene)、馬來(lái)酸酐和環(huán)氧丙烷生產(chǎn)。例如，乙炔與2分子甲醛以R印pe合成反應(yīng)進(jìn)行反應(yīng)(Krosctiwitz和Grant， Encyclopedia of Chem. Tech. , John Wiley and Sons, Inc. , New York(1999)),然后通過(guò)催化氫化形成1，4-丁二醇。據(jù)估計(jì)美國(guó)生產(chǎn)的90%的乙炔被消耗用于丁二醇生產(chǎn)?？蛇x地，其可以通過(guò)源自丁烷的馬來(lái)酸酐的酯化和催化氫化形成。在下游，丁二醇可以通過(guò)例如氧化進(jìn)一步被轉(zhuǎn)化成Y - 丁內(nèi)酯一其可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成吡咯烷酮和N-甲基-吡咯烷酮， 或通過(guò)例如氫解進(jìn)一步被轉(zhuǎn)化成四氫呋喃。這些化合物作為聚合物中間體、溶劑和添加劑具有各種用途以及具有每年約20億磅的組合銷路。期望通過(guò)可選的手段開(kāi)發(fā)生產(chǎn)這些化學(xué)品的方法，該手段不僅用可再生物代替石油基原料，而且使用較少的能源和資金集約型工藝。能源部已經(jīng)提議1，4_ 二酸，以及特別是琥珀酸，作為關(guān)鍵的生物學(xué)生產(chǎn)的中間體，用于生產(chǎn)丁二醇家族產(chǎn)物(DOE Report, "Top Value-Added Chemicals from Biomass”，2004)。然而，琥珀酸的分離和純化昂貴并且催化還原成丁二醇要求高溫和高壓。因此，對(duì)有效生產(chǎn)商業(yè)數(shù)量的1，4_ 丁二醇和其化學(xué)前體的可選方法存在需求。本發(fā)明滿足了這種需求并且還提供相關(guān)的優(yōu)勢(shì)。發(fā)明概述本發(fā)明提供包含1，4_ 丁二醇(BDO)途徑的非天然存在的微生物體，該途徑包含編碼BDO途徑酶的至少一種外源核酸，所述核酸以足以產(chǎn)生BDO的量表達(dá)，并且為BDO的表達(dá)被進(jìn)一步優(yōu)化。本發(fā)明還提供利用所述微生物體生產(chǎn)BDO的方法。附圖簡(jiǎn)述

圖1是顯示4-羥基丁酸G-HB)和1，4_ 丁二醇生產(chǎn)的生物化學(xué)途徑的示意圖。 前5個(gè)步驟對(duì)于大腸桿菌是內(nèi)源性的，而其余步驟可以異源表達(dá)。催化生物合成反應(yīng)的酶是(1)琥珀酰-CoA合成酶；(2) CoA-非依賴性琥珀酸半醛脫氫酶；(3) α -酮戊二酸脫氫酶；(4)谷氨酸琥珀酸半醛轉(zhuǎn)氨酶；( 谷氨酸脫羧酶；(6) CoA-依賴性琥珀酸半醛脫氫酶；(7) 4-羥基丁酸脫氫酶；(8) α -酮戊二酸脫羧酶；(9) 4-羥基丁酰CoA 乙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶；(10) 丁酸激酶；(11)磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶；(1 醛脫氫酶；(1 醇脫氫酶。圖2是顯示在大腸桿菌(E. coli)中高絲氨酸生物合成的示意圖。
圖3顯示使用含有表達(dá)各種組合的4-HB途徑基因質(zhì)粒的大腸桿菌菌株在葡萄糖基本培養(yǎng)基中生產(chǎn)4-HB。(a)在培養(yǎng)液中的4-HB濃度；(b)在培養(yǎng)液中的琥珀酸濃度；(c)在600nm處測(cè)量的培養(yǎng)物0D。條形圖組表示M小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)(如果測(cè)量)時(shí)間點(diǎn)。沿X軸的編碼表示使用的菌株/質(zhì)粒組合。第一個(gè)標(biāo)記指宿主菌株1， MG16551acIQ ;2，MG1655 AgabD IacIQ ;3，MG1655 Δ gabD Δ aldA IacIQ0 第二個(gè)標(biāo)記指使用的質(zhì)粒組合1，PZE13-0004-0035 和 pZA33_0036 ；2，pZE13-0004-0035 和 pZA33_0010n ；3， PZE13-0004-0008 和 pZA33_0036 ；4，pZE13-0004_0008 和 pZA33_0010n ；5，對(duì)照載體 pZE13 禾口 pZA330圖4顯示在表達(dá)來(lái)自結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的α -酮戊二酸脫羧酶的大腸桿菌菌株中從葡萄糖生產(chǎn)4-ΗΒ。菌株1-3包含ρΖΕ13-0032和ρΖΑ33_0036。 菌株4僅表達(dá)空載體和ρΖΑ33。宿主菌株如下1和4，MG16551acIQ ；2，MG1655 Δ gabD IacIQ ；3, MG1655 Δ gabD Δ aldA IacIQ0條形圖指在M和48小時(shí)時(shí)的濃度。圖5顯示在重組大腸桿菌菌株中從10mM4-HB生產(chǎn)BD0。編號(hào)的位置與實(shí)驗(yàn)對(duì)應(yīng)， 其中MG16551acIQ包含pZA33-0024，表達(dá)來(lái)自牙齦卟啉單胞菌(P. gingivalis)的cat2，以及下列基因在 PZE13 上表達(dá)1，沒(méi)有(對(duì)照)；2,0002 ；3,0003 ；4,0003η ；5,0011 ；6,0013 ； 7,0023 ；8,0025 ；9,0008η ；10,0035ο基因編號(hào)在表6中定義。對(duì)于每個(gè)位置，條形圖分別指需氧條件、微需氧條件和厭氧條件。微需氧條件通過(guò)密封培養(yǎng)管但不排空它們來(lái)建立。圖 6 顯示由 MG1655 IacIQ ρΖΕ13-0004-0035_0002 ρΖΑ33-0034_0036 產(chǎn)生的 4-ΗΒ 和 BDO 的質(zhì)譜，MG16551acIQ pZE13-0004-0035-0002pZA33-0034-0036 生長(zhǎng)在補(bǔ)充有 4g/L 未標(biāo)記的葡萄糖(a、c、e和g)、均勻標(biāo)記的13C-葡萄糖(b、d、f和h)的M9基本培養(yǎng)基中。 (a)和(b)，衍生BDO的質(zhì)量116特征碎片，包含2個(gè)碳原子；(c)和(d)，衍生BDO的質(zhì)量 177特征碎片，包含1個(gè)碳原子；(e)和(f)，衍生4-HB的質(zhì)量117特征碎片，包含2個(gè)碳原子；(g)和(h)，衍生4-HB的質(zhì)量233特征碎片，包含4個(gè)碳原子。圖7是生產(chǎn)Y-丁內(nèi)酯的生物過(guò)程的示意性工藝流程圖。圖(a)圖解了伴隨分批分離的補(bǔ)料分批發(fā)酵，圖(b)圖解了伴隨連續(xù)分離的補(bǔ)料分批發(fā)酵。圖8A和8B顯示示例性的1，4_ 丁二醇(BDO)途徑。圖8A顯示來(lái)自琥珀酰-CoA 的BDO途徑。圖8B顯示來(lái)自α-酮戊二酸的BDO途徑。圖9A-9C顯示示例性的BDO途徑。圖9Α和9Β顯示來(lái)自4_氨基丁酸的途徑。圖 9C顯示來(lái)自乙酰-CoA至4-氨基丁酸的途徑。圖10顯示示例性的來(lái)自α -酮戊二酸的BDO途徑。圖11顯示示例性的來(lái)自谷氨酸的BDO途徑。圖12顯示示例性的來(lái)自乙酰-CoA的BDO途徑。圖13顯示示例性的來(lái)自高絲氨酸的BDO途徑。圖14顯示大腸桿菌琥珀酰-CoA合成酶的核苷酸和氨基酸序列。圖14Α顯示大腸桿菌 sucCD 操縱子的核苷酸序列(SEQ ID NO )。圖 14B(SEQ ID NO )和 14C(SEQ ID NO ) 顯示由sue⑶操縱子編碼的珀酰-CoA合成酶亞單位的氨基酸序列。圖15顯示牛分枝桿菌α -酮戊二酸脫羧酶的核苷酸和氨基酸序列。圖15Α顯示牛分枝桿菌sucA基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:)。圖15B顯示牛分支桿菌α -酮戊二酸脫羧酶的氨基酸序列(SEQ ID NO )。
圖16顯示大腸桿菌中厭氧(微需氧)條件下4-羥基丁酸從基本培養(yǎng)基中的葡萄糖經(jīng)過(guò)α-酮戊二酸的生物合成。所述宿主菌株是ECKh-401。所述實(shí)驗(yàn)以質(zhì)粒pZA33 上存在的如下上游途徑基因?yàn)榛A(chǔ)進(jìn)行標(biāo)記l)4hbd-sucA ； 2)sucCD-sucD-4hbd ;3) sucCD-sucD-4hbd_sucA0圖17顯示大腸桿菌中4-羥基丁酸從基本培養(yǎng)基中的葡萄糖經(jīng)過(guò)琥珀酸和α -酮戊二酸的生物合成。所述宿主菌株是野生型MG1655。所述實(shí)驗(yàn)以質(zhì)粒ρΖΕ13和ρΖΑ33上存在的如下基因?yàn)榛A(chǔ)進(jìn)行標(biāo)記1)空對(duì)照質(zhì)粒；2)空pZE13、pZA33-4hbd ；3)pZE13-sucA, pZA33-4hbcL圖18A顯示來(lái)自牙齦卟啉單胞菌的oA-依賴性琥珀酸半醛脫氫酶(sucD)的核苷酸序列(SEQ ID NO )，圖18B顯示編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO )。圖19A顯示來(lái)自牙齦卟啉單胞菌的4-羥基丁酸脫氫酶GtAd)的核苷酸序列(SEQ ID NO )，圖19B顯示編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO )。圖20A顯示來(lái)自牙齦卟啉單胞菌的4-羥基丁酸CoA移轉(zhuǎn)酶(caU)的核苷酸序列 (SEQ ID NO )，圖20B顯示編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO )。圖21A顯示來(lái)自丙酮丁醇梭菌的磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶(iptb)的核苷酸序列(SEQ ID NO )，圖21B顯示編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO )。圖22A顯示來(lái)自丙酮丁醇梭菌的丁酸激酶(bukl)的核苷酸序列(SEQ ID NO ), 圖22B顯示編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO )。圖23顯示為了相對(duì)于丙酮丁醇梭菌的天然序列具有更多優(yōu)勢(shì)大腸桿菌密碼子而具有改變的密碼子的丙酮丁醇梭菌020(磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶)替代核苷酸序列。圖23A-23D(分別為020A-020D，SEQ ID NOS )包含具有大量稀有大腸桿菌密碼子由更多優(yōu)勢(shì)密碼子(A < B < C < D)替代的序列。圖M顯示為了相對(duì)于丙酮丁醇梭菌的天然序列具有更多優(yōu)勢(shì)大腸桿菌密碼子而具有改變的密碼子的丙酮丁醇梭菌021( 丁酸激酶)替代核苷酸序列。圖24A-24D(分別為021A-021B，SEQ ID NOS:)包含具有大量稀有大腸桿菌密碼子由更多優(yōu)勢(shì)密碼子(A < B <C<D)替代的序列。圖25顯示具有用于大腸桿菌中表達(dá)的優(yōu)化密碼子的丁酸激酶(BK)和磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶(PTB)的提高表達(dá)。圖25A顯示蛋白質(zhì)用考馬斯藍(lán)染色的十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)；泳道1，無(wú)插入物的對(duì)照質(zhì)粒；泳道2，大腸桿菌中丙酮丁醇梭菌天然序列的表達(dá)；泳道3，020B-021B密碼子優(yōu)化的PTB-BK的表達(dá)；泳道4，020C-021C密碼子優(yōu)化的PTB-BK的表達(dá)。顯示BK和PTB的位置。圖25B顯示相比于密碼子優(yōu)化的 020B-021B(2021B)和 020C-021C Q021C)，天然丙酮丁醇梭菌序列(2021η)的 BK 和 PTB 活性。圖洸顯示表達(dá)BDO產(chǎn)生酶Cat2 (034) ；2021η ;2021B ;2021C的不同菌株中BDO和 Y-丁內(nèi)酯(GBL)和生產(chǎn)。圖27A顯示天然拜氏梭菌Ald基因(025η)的核苷酸序列(SEQ ID NO )，圖27Β顯示編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO )。圖^A-28D顯示拜氏梭菌Aid基因(分別為025A-025D，SEQ ID NOS )的替代基因序列，其中增加的稀有密碼子量由更多的優(yōu)勢(shì)密碼子替代(A<B<C<D)。
圖四顯示天然的拜氏梭菌Ald基因和密碼子優(yōu)化的變體的表達(dá)；無(wú)插入物(對(duì)照無(wú)插入物)、025n、025A、025B、025C、02OT。圖30顯示不同的菌株中BDO或BDO和乙醇的產(chǎn)生。圖30顯示包含天然拜氏梭菌 Ald基因(025η)或具有用于大腸桿菌中表達(dá)的優(yōu)化密碼子的變體(025A-025D)的菌株中 BDO的產(chǎn)生。圖30Β顯示相比密碼子優(yōu)化的變體025Β，表達(dá)丙酮丁醇梭菌AdhE2酶(002C) 的菌株中乙醇和BDO的產(chǎn)生。第三組顯示牙齦卟啉單胞菌sucD (035)的表達(dá)。所有情況下均表達(dá)牙齦卟啉單胞菌Cat2 (034)。圖31A顯示來(lái)自熱葡糖苷酶地芽孢桿菌(Geobacillus thermoglucosidasius) 的adhl基因核苷酸序列SEQ ID NO )，圖31B顯示編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO )。圖32A顯示大腸桿菌中熱葡糖苷酶地芽孢桿菌adhl基因的表達(dá)。通過(guò)SDS-PAGE 且考馬斯藍(lán)染色分析無(wú)插入物的質(zhì)粒、具有083插入物(頭狀地霉N-芐基-3-吡咯烷醇脫氫酶)的質(zhì)粒和具有084插入物(熱葡糖苷酶地芽孢桿菌adhl)的質(zhì)粒的全部細(xì)胞溶解產(chǎn)物或上清液。圖32B顯示丁醛(菱形)或4-羥基丁醛(正方形)作為底物的084的活性。圖33顯示各種菌株中BDO的生產(chǎn)無(wú)插入物的質(zhì)粒；025B，025B-026n ； 025B-026A ；025B-026B ；025B-026C ；025B-050 ；025B-052 ；025B-053 ；025B-055 ；025B-057 ； 025B-058 ；025B-071 ；025B-083 ；025B-084 ；PTSlac0-025B ；PTSlac0-025B_026n。圖；34顯示載體pREl 19-V2的質(zhì)粒圖。圖35顯示包含aceF和IpdA基因的ECKh_138區(qū)域的序列。肺炎克雷伯菌IpdA 基因?yàn)橄聞澗€的，Glu354Lys突變體中改變的密碼子為陰影的。圖36顯示天然大腸桿菌IpdA和突變體肺炎克雷伯菌IpdA的蛋白質(zhì)序列對(duì)比。圖37顯示菌株AB3，MG1655AldhA和ECKh_138中4-羥基丁酸(左條形圖)和 BDO(右條形圖)的產(chǎn)生。所有菌株表達(dá)中拷貝質(zhì)粒PZA33上的大腸桿菌sucCD，牙齦卟啉單胞菌sucD，牙齦卟啉單胞菌4hbd，以及高拷貝質(zhì)粒pZE13上的牙齦卟啉單胞菌Cat2，丙酮丁醇梭菌AdhE2。圖38顯示融合至pflB_p6啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)的aceE基因5，末端的核苷酸序列。5’斜體序列顯示aroP基因的起始點(diǎn)，其與pdh操縱子相反的方向轉(zhuǎn)錄。 3’斜體序列顯示aceE基因的起始點(diǎn)。大寫(xiě)體pflB RBS0下劃線FNR結(jié)合位點(diǎn)。粗體 pflB-p6啟動(dòng)子序列。圖39顯示菌株ECKh-456中aceF-lpdA區(qū)域的核苷酸序列(SEQ ID NO )。圖40顯示各個(gè)菌株ECKh-439，ECKh-455和ECKh_4564_羥基丁酸，BDO和內(nèi)酮酸鹽的產(chǎn)生(分別為從左至右的條形圖)。圖41A顯示用于缺失mdh基因的重組位點(diǎn)的圖解。圖41B顯示來(lái)自質(zhì)粒pKD3的 FRT位點(diǎn)和mdh基因同源區(qū)側(cè)翼的抗氯霉素基因(CAT)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列。圖42顯示菌株ECKh-401中arc A缺失區(qū)域的序列。圖43顯示包含菌株ECKh-422突變gltA基因的區(qū)域的序列。圖44顯示野生型gltA基因產(chǎn)物和R163L突變體的檸檬酸合成酶活性。在無(wú)(菱形)或存在0. 4mMNADH(正方形)時(shí)進(jìn)行測(cè)定。圖45顯示菌株ECKh-401和ECKh-422中4-羥基丁酸(左條形圖)和BDO (右條形圖)的產(chǎn)生，兩者均表達(dá)質(zhì)粒上用于完成BDO途徑的基因。
圖46顯示來(lái)自代謝標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的中心代謝量和相關(guān)的95%置信區(qū)間。數(shù)值為標(biāo)準(zhǔn)化至ImMol/h葡萄糖攝入率的摩爾量。結(jié)果表明碳量通過(guò)檸檬酸合成酶進(jìn)入氧化方向并且大部分碳進(jìn)入BDO途徑而不是完成三羧酸循環(huán)。圖47顯示菌株ECKh-138和ECKh_422的胞外產(chǎn)物形成，兩者均表達(dá)質(zhì)粒上的完整 BDO途徑。所測(cè)定的產(chǎn)物為乙酸鹽(Ace)，內(nèi)酮酸鹽(Pyr)，4_羥基丁酸0ΗΒ)，1，4_ 丁二醇 (BD0)，乙醇(EtOH)和其他產(chǎn)物，其包括Y-丁內(nèi)酯(GBL)，琥珀酸和乳酸鹽。圖48顯示通過(guò)流感嗜血桿菌磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(ρ印ck)替換PEP羧化酶 (PPC)后區(qū)域的序列。P印Ck編碼區(qū)為下劃線的。圖49顯示在含有50mMNaHC03的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)的發(fā)展ρ印CK菌株的生長(zhǎng)。圖50顯示表達(dá)質(zhì)粒pZS*13上的牙齦卟啉單胞菌Cat2和拜氏梭菌Ald的菌株 ECKh-453中產(chǎn)物的形成。所測(cè)定的產(chǎn)物為1，4_ 丁二醇(BD0)，內(nèi)酮酸鹽，4-羥基丁酸 (4!ffi)，乙酸鹽，Y-丁內(nèi)酯(GBL)和乙醇。圖51顯示兩種菌株ECKh-453和ECKh_432的BDO生產(chǎn)。兩者均包含表達(dá)牙齦卟啉單胞菌Cat2和拜氏梭菌Aid的質(zhì)粒pZS*13。如所顯示的，培養(yǎng)物在用27或18號(hào)規(guī)格的針穿孔的容器中微需氧條件下培養(yǎng)。圖52顯示在包含啟動(dòng)子，sue⑶基因，sucD基因，4hbd基因和終止子序列的多順?lè)醋覦NA片斷插入?yún)^(qū)域的菌株ECKh-似6基因組DNA的核苷酸序列。圖53顯示在包含啟動(dòng)子，sucA基因，克氏梭菌4hbd基因和終止子序列的多順?lè)醋有蛄胁迦雲(yún)^(qū)域的菌株ECKh-432染色體區(qū)域的核苷酸序列。圖M顯示具有整合入染色體的上游BDO途徑編碼基因并且包含含有下游BDO途徑基因的ECKh-432菌株在基本培養(yǎng)基中從葡萄糖合成BDO。圖55顯示包含與rrnC區(qū)域同源的區(qū)域側(cè)翼的非-磷酸轉(zhuǎn)移酶(非_PTS)蔗糖利用基因的PCR產(chǎn)物。圖56顯示rrnC操縱子中整合位點(diǎn)的示意圖。圖57顯示菌株ECKh-432在葡萄糖上培養(yǎng)以及菌株ECKh_463在蔗糖上培養(yǎng)生長(zhǎng) 48小時(shí)后，標(biāo)準(zhǔn)化至培養(yǎng)物0D600的平均產(chǎn)物濃縮。兩者均含有表達(dá)牙齦卟啉單胞菌Cat2 和拜氏梭菌Aid的質(zhì)粒pZS*13。所述數(shù)據(jù)為每種菌株的6次重復(fù)培養(yǎng)物。所測(cè)定的產(chǎn)物為 1，4_ 丁二醇(BDO)，4-羥基丁酸(4HB), Y-丁內(nèi)酯(GBL)，內(nèi)酮酸鹽(PYR)和乙酸鹽(ACE) (分別為從左至右的條形圖)。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及設(shè)計(jì)和生產(chǎn)具有4-羥基丁酸G-HB)、γ -丁內(nèi)酯和1，4_ 丁二醇生物合成生產(chǎn)能力的細(xì)胞和生物體。本發(fā)明尤其涉及通過(guò)導(dǎo)入編碼BDO途徑酶的一種或多種核酸能夠生產(chǎn)BDO的微生物體的設(shè)計(jì)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明利用大腸桿菌新陳代謝的計(jì)算機(jī)化學(xué)計(jì)算模型，該模型鑒定生物合成生產(chǎn)4-羥基丁酸G-HB)和1，4_ 丁二醇(BDO)的代謝設(shè)計(jì)。本文所述的結(jié)果表明，在大腸桿菌和其它細(xì)胞或生物體中可以設(shè)計(jì)和重組改造代謝途徑，以實(shí)現(xiàn)4-HB 和下游產(chǎn)物諸如1，4_丁二醇的生物合成。4-HB的生物合成生產(chǎn)，例如，對(duì)于計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)，可以通過(guò)構(gòu)建具有已設(shè)計(jì)的代謝基因型的菌株確認(rèn)。這些代謝改造的細(xì)胞或生物體也可以經(jīng)歷適應(yīng)進(jìn)化以進(jìn)一步增加4-HB生物合成，包括在一些條件下接近理論最大生長(zhǎng)。
在某些實(shí)施方式中，設(shè)計(jì)菌株的4-HB生物合成特征使得它們是遺傳穩(wěn)定的并且在連續(xù)的生物過(guò)程中特別有用。單獨(dú)菌株設(shè)計(jì)策略通過(guò)如下鑒定將不同的非自然的或異源的反應(yīng)能力摻入大腸桿菌中，以導(dǎo)致從CoA-非依賴性琥珀酸半醛脫氫酶、琥珀酰-CoA合成酶和CoA-依賴性琥珀酸半醛脫氫酶或谷氨酸琥珀酸半醛轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)生4-HB和1，4_ 丁二醇的代謝途徑。鑒定計(jì)算機(jī)代謝設(shè)計(jì)，其在大腸桿菌和酵母種中從這些代謝途徑的每一種導(dǎo)致4-HB的生物合成。1，4_ 丁二醇中間體Y-丁內(nèi)酯可在pH< 7.5的條件下通過(guò)自發(fā)環(huán)化在培養(yǎng)物中產(chǎn)生，特別是在酸性條件下，諸如PH 5. 5以下，例如，pH < 7、pH < 6. 5、pH < 6以及特別是pH < 5. 5或更低。經(jīng)由平臺(tái)的計(jì)算組分鑒定的菌株可通過(guò)基因改造任意預(yù)測(cè)的代謝變化而被投入實(shí)際生產(chǎn)中，該代謝變化導(dǎo)致4-HB、l，4_ 丁二醇或其它中間體和/或下游產(chǎn)物的生物合成生產(chǎn)。在另一進(jìn)一步的實(shí)施方式中，顯示出這些化合物的生物合成生產(chǎn)的菌株可進(jìn)一步經(jīng)受適應(yīng)進(jìn)化，以進(jìn)一步增加產(chǎn)物的生物合成。適應(yīng)進(jìn)化后產(chǎn)物生物合成產(chǎn)率的水平也可以通過(guò)系統(tǒng)的計(jì)算組分預(yù)測(cè)。在其它具體實(shí)施方式
中，微生物體被構(gòu)建以表達(dá)4-HB生物合成途徑，該途徑編碼從琥珀酸至4-HB以及至4-HB-CoA的酶促步驟。琥珀酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶、CoA-依賴性琥珀酸半醛脫氫酶、NAD-依賴性4-羥基丁酸脫氫酶和4-羥基丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶在宿主微生物體中的共表達(dá)，與缺乏4-HB生物合成途徑的宿主微生物體相比，導(dǎo)致顯著的4-HB產(chǎn)生。在進(jìn)一步的具體實(shí)施方式
中，產(chǎn)生4-HB的微生物體被生產(chǎn)，通過(guò)引入編碼α-酮戊二酸脫羧酶和NAD-依賴性4-羥基丁酸脫氫酶的核酸，該微生物體利用α -酮戊二酸作為底物。在另一具體實(shí)施方式
中，包含1，4_ 丁二醇(BDO)生物合成途徑的微生物體被構(gòu)建，當(dāng)該微生物體在4-ΗΒ存在的情況下培養(yǎng)時(shí)其生物合成BDO。BDO生物合成途徑由編碼多功能醛/醇脫氫酶的核酸或編碼醛脫氫酶(dehydrogenawse)和醇脫氫酶的核酸組成。 為了維持在4-HB底物上生長(zhǎng)，這些產(chǎn)生BDO的微生物體也表達(dá)4-羥基丁酸CoA轉(zhuǎn)移酶或 4- 丁酸激酶以及磷酸轉(zhuǎn)羥基丁酰酶。在另一進(jìn)一步的具體實(shí)施方式
中，微生物體被生產(chǎn)，其通過(guò)編碼功能性4-HB生物合成途徑和功能性BDO生物合成途徑的核酸的外源表達(dá)來(lái)合成 BDO0 4-HB生物合成途徑由琥珀酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶、CoA-依賴性琥珀酸半醛脫氫酶、NAD-依賴性4-羥基丁酸脫氫酶和4-羥基丁酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶組成。BDO途徑由多功能的醛/醇脫氫酶組成。此處進(jìn)一步的描述為生產(chǎn)BDO的另外的途徑(參見(jiàn)圖8-13)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“非自然存在的”，當(dāng)用于指本發(fā)明的微生物體或微生物時(shí)，意欲指該微生物體具有至少一個(gè)在所述物種的自然存在的菌株中通常未發(fā)現(xiàn)的遺傳變化，包括所述物種的野生型菌株。遺傳變化包括，例如，弓I入編碼代謝多肽的可表達(dá)核酸的修飾、其它核酸加成、核酸缺失和/或微生物遺傳物質(zhì)的其它功能破壞。這些修飾包括，例如，所述物種的異源多肽、同源多肽或異源和同源多肽的編碼區(qū)和其功能片段。另外的修飾包括，例如，非編碼調(diào)控區(qū)，其中修飾改變基因或操縱子的表達(dá)。示例性的代謝多肽包括在4-HB生物合成途徑中的酶和在BDO化合物家族的生物合成途徑中的酶。代謝修飾是指從其自然存在的狀態(tài)被改變的生物化學(xué)反應(yīng)。因此，非自然存在的微生物具有對(duì)編碼代謝多肽或其功能片段的核酸的遺傳修飾。針對(duì)大腸桿菌和酵母菌微生物體，示例性的代謝修飾將在下面進(jìn)一步描述。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“分離的”，當(dāng)用于指微生物體時(shí)，意欲指基本上不含至少一種當(dāng)所述微生物體在自然界中發(fā)現(xiàn)時(shí)的組分的生物體。該術(shù)語(yǔ)包括從在其自然環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)時(shí)的一些或全部組分中移出的微生物體。該術(shù)語(yǔ)還包括從微生物體在其非自然存在環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)時(shí)的一些或全部組分中移出的微生物體。因此，分離的微生物體部分或完全與其在自然界中發(fā)現(xiàn)時(shí)或其在非自然存在的環(huán)境中生長(zhǎng)、保藏、生存時(shí)的其它物質(zhì)分離。分離的微生物體的具體實(shí)例包括部分純的微生物、基本上純的微生物和在非自然存在的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的微生物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“微生物的(microbial)”、“微生物體(microbial organism)” 或“微生物(microorganism) ”意欲指是作為微觀細(xì)胞存在的任意生物，其包括在古細(xì)菌、細(xì)菌或真核生物的范圍內(nèi)。因此，該術(shù)語(yǔ)意欲包括原核或真核細(xì)胞或具有微觀大小的生物以及包括所有物種的細(xì)菌、古細(xì)菌和真細(xì)菌以及真核微生物諸如酵母和真菌。該術(shù)語(yǔ)還包括任意物種的細(xì)胞培養(yǎng)物，所述物種可培養(yǎng)用于生產(chǎn)生物化學(xué)物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“4-羥基丁酸”意欲指是丁酸的4-羥基衍生物，其具有化學(xué)式C4H8O3和104. llg/mol (其鈉鹽為126. 09g/mol)的分子量?；衔?4-羥基丁酸G-hydroxybutanoic acid)在本領(lǐng)域中也被稱為4_HB、4_羥基丁酸 (4-hydroxybutyrate), 羥基丁酸或GHB。本文使用的術(shù)語(yǔ)擬包括該化合物的各種鹽形式的任一個(gè)并且包括，例如，4-羥基丁酸鹽G-hydroxybutanoate)和4_羥基丁酸酯 (4-hydroxybutyrate)。4-HB鹽形式的具體實(shí)例包括4-HB鈉和4-HB鉀。因此，術(shù)語(yǔ)4-羥基丁酸、4-HB、4-羥基丁酸鹽、4-羥基丁酸酯、Y -羥基丁酸和GHB以及其它的本領(lǐng)域公認(rèn)的名稱在本文中同義使用。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“單體的”，當(dāng)用于指4-HB時(shí)，意欲指是非聚合或非衍生形式的 4-HB。聚合4-HB的具體實(shí)例包括聚-4-羥基丁酸和例如4-HB和3-HB的共聚物。4-HB的衍生形式的具體實(shí)例是4-HB-CoA。其它聚合4-HB形式和其它4-HB衍生形式在本領(lǐng)域也是已知的。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“ Y-丁內(nèi)酯”意欲指是具有化學(xué)式C4H602和分子量為86. 089g/ mol的內(nèi)酯。化合物Y-丁內(nèi)酯在本領(lǐng)域也被稱為GBL、丁內(nèi)酯、1，4-內(nèi)酯、4-丁內(nèi)酯、4-羥基丁酸內(nèi)酯和Y-羥基丁酸內(nèi)酯。本文使用的術(shù)語(yǔ)擬包括該化合物的各種鹽形式的任一種。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“ 1，4- 丁二醇”意欲指是鏈烷丁烷的醇衍生物，其帶有兩個(gè)羥基， 具有化學(xué)式C4H1002和90. 12g/mol的分子量。化合物1，4_ 丁二醇在本領(lǐng)域也稱為BDO并且是本文中被稱為BDO化合物家族的化合物家族的化學(xué)中間體或前體。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“四氫呋喃”意欲指與芳香化合物呋喃的完全氫化類似物對(duì)應(yīng)的雜環(huán)有機(jī)化合物，其具有化學(xué)式C4H80和72. llg/mol的分子量?；衔锼臍溥秽诒绢I(lǐng)域也被稱為T(mén)HF、四氫呋喃、1，4-環(huán)氧丁烷、環(huán)氧丁烷、環(huán)四氫呋喃(cyclotetramethylene oxide)、噁環(huán)戊烷、二亞乙基氧、四氫呋喃(oxolane)、呋喃烷、氫化呋喃、四亞甲基氧 (tetramethylene oxide) 0本文使用的術(shù)語(yǔ)擬包括該化合物的各種鹽形式的任一種。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“CoA”或“輔酶A”意欲指有機(jī)輔助因子或輔基(酶的非蛋白質(zhì)部分)，其存在是許多酶(脫輔基酶蛋白)的活性所必需的，以形成活性酶系統(tǒng)。輔酶A在某些縮合酶中起作用，在乙?；蚱渌；D(zhuǎn)移以及在脂肪酸合成和氧化、丙酮酸氧化以及在其它乙酰化中產(chǎn)生影響。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基本上厭氧的”，當(dāng)用于指培養(yǎng)物或生長(zhǎng)條件時(shí)，意欲指對(duì)于在液體培養(yǎng)基中的溶解氧而言氧的量小于飽和狀態(tài)的約10%。該術(shù)語(yǔ)還擬包括液體或固體培養(yǎng)基的密封室被保持在小于約氧的空氣下。本發(fā)明的非自然存在的微生物可包含穩(wěn)定的遺傳變化，其指可被培養(yǎng)成五代以上而不失去所述變化的微生物。一般而言，穩(wěn)定的遺傳變化包括持續(xù)10代以上的修飾，特別穩(wěn)定的修飾將持續(xù)約25代以上，以及更特別穩(wěn)定的遺傳修飾將是50代以上，包括無(wú)限地。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，包括本文示例的代謝修飾在內(nèi)的遺傳變化是參考大腸桿菌和酵母基因以及它們相應(yīng)的代謝反應(yīng)進(jìn)行描述的。然而，假定許多生物的基因組測(cè)序完整以及基因組學(xué)領(lǐng)域的技能水平高，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地將本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)應(yīng)用于基本上所有的其它生物。例如，本文示例的大腸桿菌代謝變化可通過(guò)摻入來(lái)自除所述物種之外的物種的相同或相似的編碼核酸而容易地應(yīng)用于其它物種。這些遺傳變化一般而言包括例如物種同源物的遺傳變化，以及具體而言，直向同源物、種內(nèi)同源物或非直向同源基因置換。直向同源物通過(guò)垂直傳遞(vertical descent)相關(guān)并且在不同生物中負(fù)責(zé)基本上相同或同一功能的一個(gè)基因或多個(gè)基因。例如，小鼠環(huán)氧化物水解酶和人環(huán)氧化物水解酶對(duì)于環(huán)氧化物的水解生物學(xué)功能而言可被認(rèn)為是直向同源物。例如，當(dāng)基因共享數(shù)量足以表明它們是同源的序列相似性時(shí)，所述基因通過(guò)垂直傳遞相關(guān)，或基因通過(guò)從共同的祖先進(jìn)化而相關(guān)。如果基因共享三維結(jié)構(gòu)，但不一定共享足以表明它們從共同的祖先進(jìn)化而來(lái)的量一其程度為一級(jí)序列相似性不可鑒定一的序列相似性，則所述基因也可以被認(rèn)為直向同源物。為直向同源的基因可以編碼具有約25%序列相似性至100%氨基酸序列同源性的蛋白質(zhì)。編碼共享小于25%的氨基酸相似性的蛋白質(zhì)的基因，如果它們的三維結(jié)構(gòu)也顯示相似性，也可以被認(rèn)為通過(guò)垂直傳遞產(chǎn)生。酶的絲氨酸蛋白酶家族成員一包括組織纖溶酶原激活物和彈性蛋白酶，被認(rèn)為從共同的祖先通過(guò)垂直傳遞產(chǎn)生。直向同源物包括基因或它們編碼的基因產(chǎn)物，其通過(guò)例如進(jìn)化在結(jié)構(gòu)或總體活性方面已經(jīng)偏離。例如，在一種物種編碼顯示兩種功能的基因產(chǎn)物并且這些功能在第二種物種中已經(jīng)被分成不同的基因的情況下，三個(gè)基因和它們的相應(yīng)的產(chǎn)物被認(rèn)為是直向同源物。對(duì)于生物化學(xué)產(chǎn)物的生長(zhǎng)相關(guān)的生產(chǎn)(growth-coupled production)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，包埋待被破壞的代謝活性的直向同源基因要進(jìn)行選擇用以構(gòu)建非自然存在的微生物。顯示可分離活性的直向同源物的實(shí)例是其中不同的活性已經(jīng)在兩種或更多種物種之間或在單一物種內(nèi)被分成不同的基因產(chǎn)物的情況。具體實(shí)例是將彈性蛋白酶蛋白酶解和纖維蛋白溶酶原蛋白酶解一兩種類型的絲氨酸蛋白酶活性一作為纖溶酶原激活物和彈性蛋白酶分成不同的分子。第二個(gè)實(shí)例是支原體5’-3’外切核酸酶和果蠅DNA聚合酶III 活性的分離。來(lái)自第一物種的DNA聚合酶可以被認(rèn)為是來(lái)自第二物種的外切核酸酶或聚合酶中任一種或兩者的直向同源物，反之亦然。相反，種內(nèi)同源基因是通過(guò)例如進(jìn)化趨異所伴隨的復(fù)制相關(guān)的同源物，并且其具有類似或共同的但不是同樣的功能。種內(nèi)同源基因可以起源或源自例如相同的物種或不同的物種。例如，微粒體環(huán)氧化物水解酶(環(huán)氧化物水解酶I)和可溶性環(huán)氧化物水解酶(環(huán)氧化物水解酶II)可以被認(rèn)為是種內(nèi)同源基因，這是因?yàn)樗鼈兇韮煞N不同的酶--其從共同的祖先共同進(jìn)化而來(lái)，所述酶催化不同的反應(yīng)并且在相同的物種中具有不同的功能。種內(nèi)同源基因是來(lái)自相同物種的、彼此具有明顯的序列相似性的蛋白質(zhì)，這表明它們是同源的或通過(guò)從共同的祖先共同進(jìn)化而相關(guān)。種內(nèi)同源蛋白質(zhì)家族群包括Hip A同源物、熒光素酶基因、肽酶以及其它。非直向同源基因置換是來(lái)自一種物種的非直向同源基因，其可以取代不同物種中的相關(guān)基因功能。取代包括，例如，與不同物種的相關(guān)功能相比，能夠在起源的物種中完成基本上相同或類似的功能。盡管一般而言，非直向同源基因置換可以鑒定為結(jié)構(gòu)上與編碼相關(guān)功能的已知基因有關(guān)，但是結(jié)構(gòu)上較不相關(guān)但功能上類似的基因和它們相應(yīng)的基因產(chǎn)物，仍將落入本文所使用的術(shù)語(yǔ)的含義中。功能相似性要求，例如，與編碼要求取代的功能的基因相比，在非直向同源基因的活性部位或結(jié)合區(qū)域上至少有一些結(jié)構(gòu)相似性。因此，非直向同源基因包括例如種內(nèi)同源基因(paralog)或不相關(guān)的基因。因此，在鑒定和構(gòu)建具有4-HB、GBL和/或BDO生物合成能力的本發(fā)明的非自然存在的微生物體中，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，通過(guò)將本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)應(yīng)用到具體的物種，代謝修飾的鑒定可以包括直向同源物的鑒定以及引入或失活。就種內(nèi)同源基因和 /或非直向同源基因置換存在于編碼催化相似或基本上相似的代謝反應(yīng)的酶的相關(guān)微生物中的程度，本領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以利用這些進(jìn)化相關(guān)的基因。直向同源物、種內(nèi)同源基因和非直向同源基因置換可以通過(guò)本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法確定。例如，檢查兩種多肽的核酸或氨基酸序列將揭示在所比較的序列之間的序列同源性和相似性?；谶@些相似性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定相似性是否足夠高，以表明蛋白質(zhì)通過(guò)從共同的祖先進(jìn)化而相關(guān)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的算法，諸如AligruBLAST、 Clustal W以及其它算法，比較和測(cè)定未處理的序列相似性或同源性，并且還測(cè)定序列中空位(gap)的存在和顯著性，所述空位可以被標(biāo)記重量或分?jǐn)?shù)。這些算法在本領(lǐng)域也是已知的并且可類似地應(yīng)用于確定核苷酸序列相似性或同源性。確定相關(guān)性的足夠相似性的參數(shù)基于熟知的方法計(jì)算，所述方法用于計(jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)的相似性或在隨機(jī)多肽中發(fā)現(xiàn)相似匹配的機(jī)會(huì)和所確定的匹配的顯著性。如果期望，兩個(gè)或更多個(gè)序列的計(jì)算機(jī)比較也可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行視覺(jué)優(yōu)化。相關(guān)的基因產(chǎn)物或蛋白質(zhì)可以期望具有高度相似性，例如，25% 至100%序列同源性。如果細(xì)察足夠大小的數(shù)據(jù)庫(kù)(約5%)，不相關(guān)的蛋自質(zhì)可以具有一定同源性，所述同源性與期望偶然出現(xiàn)的基本相同。在5%和對(duì)％之間的序列可以或不可以代表足夠的同源性，以推斷所比較的序列是相關(guān)的。根據(jù)數(shù)據(jù)集的大小，可以實(shí)施確定這些匹配的顯著性的另外的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以確定這些序列的相關(guān)性。使用BLAST算法確定兩個(gè)或更多個(gè)序列的相關(guān)性的示例性參數(shù)例如可以是如下所示。簡(jiǎn)言之，氨基酸序列比對(duì)可以使用BLASTP2. 0. 8版(1999年1月5日)和如下參數(shù)完成:Matrix :0BL0SUM62 ；gap open :11 ；gap extension :1 ；x_dropoff :50 ；expect :10. 0 ； wordsize :3 ；filter :on。核酸序列比對(duì)可以使用BLASTN 2. 0. 6版(1998年9月16曰)禾口如下參數(shù)完成:Match 1 ；mismatch _2 ；gap open :5 ；gap extension :2 ；x_dropoff :50 ； expect :10. 0 ；wordsize :11 ；filter :off。本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解對(duì)上述參數(shù)可以進(jìn)行何種修改以增加或減少例如比較的嚴(yán)格性和測(cè)定兩個(gè)或更多個(gè)序列的相關(guān)性。本發(fā)明提供非自然存在的微生物生物催化劑，其包括具有4-羥基丁酸G-HB)生物合成途徑的微生物體，所述生物合成途徑包含至少一種外源核酸，該外源核酸編碼4-羥基丁酸脫氫酶、CoA-非依賴性琥珀酸半醛脫氫酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依賴性琥珀酸半醛脫氫酶、谷氨酸琥珀酸半醛轉(zhuǎn)氨酶、α-酮戊二酸脫羧酶或谷氨酸脫羧酶，其中外源核酸以足夠產(chǎn)生單體4-羥基丁酸G-HB)的量表達(dá)。4-羥基丁酸脫氫酶也稱為4-羥基丁酸脫氫酶或4-ΗΒ脫氫酶。琥珀酰-CoA合成酶也稱為琥珀酰-CoA合成酶或琥珀酰-CoA連接酶。也提供非自然存在的微生物生物催化劑，其包括具有4-羥基丁酸G-HB)生物合成途徑的微生物體，所述途徑具有至少一種外源核酸，該外源核酸編碼4-羥基丁酸脫氫酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依賴性琥珀酸半醛脫氫酶或α-酮戊二酸脫羧酶，其中外源核酸以足夠產(chǎn)生單體4-羥基丁酸G-HB)的量表達(dá)。本發(fā)明的非自然存在的微生物生物催化劑包括微生物體，其采用代謝反應(yīng)的組合以生物合成生產(chǎn)本發(fā)明化合物。生物合成的化合物可以胞內(nèi)產(chǎn)生和/或分泌到培養(yǎng)基中。 由非自然存在的微生物產(chǎn)生的示例性化合物包括，例如，4-羥基丁酸、1，4- 丁二醇和Y - 丁內(nèi)酯。在一個(gè)實(shí)施方式中，非自然存在的微生物體被基因工程改造以產(chǎn)生4-ΗΒ。該化合物是一個(gè)進(jìn)入1，4_ 丁二醇化合物家族的有用切入點(diǎn)。從琥珀酸、通過(guò)琥珀酰-CoA從琥珀酸或從α -酮戊二酸形成4-ΗΒ的生物化學(xué)反應(yīng)在圖1的步驟1-8中示出。當(dāng)然只要能實(shí)現(xiàn)起始成分轉(zhuǎn)變?yōu)锽DO產(chǎn)物，可以利用BDO途徑酶的任何合適的組合。因此，可以理解的是可以利用本文公開(kāi)的任何代謝途徑，且本領(lǐng)域技術(shù)人員很清楚為了實(shí)現(xiàn)本文公開(kāi)的所需途徑如何選擇合適的酶。在另一實(shí)施方案中，本文公開(kāi)了非天然存在的微生物體，包括具有1，4_ 丁二醇 (BDO)途徑的微生物體，該途徑包括編碼以足夠量表達(dá)而生產(chǎn)BDO的BDO途徑酶的至少一種外源核酸，所述BDO途徑包括4-氨基丁酸CoA移轉(zhuǎn)酶，4-氨基丁酰-CoA水解酶，4-氨基丁酸-CoA連接酶，4-氨基丁酰-CoA氧化還原酶(去氨基)，4氨基丁酰-CoA氨基轉(zhuǎn)移酶或 4- β -羥丁酰CoA消旋酶(參見(jiàn)實(shí)施例VII表17)。所述BDO途徑可進(jìn)一步包括4-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成)，4-羥基丁酰-CoA還原酶或1，4- 丁二醇脫氫酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉可利用本文公開(kāi)的各種途徑的組合。例如，在非天然發(fā)生的微生物體中，核酸可編碼4-氨基丁酸CoA移轉(zhuǎn)酶，4-氨基丁酰-CoA水解酶或4-氨基丁酸-CoA連接酶；4-氨基丁酰-CoA氧化還原酶(去氨基)或4-氨基丁酰-CoA氨基轉(zhuǎn)移酶； 以及4-β-羥丁酰CoA消旋酶。其他示例性的組合如下具體描述并且可在圖8-13中找到。 例如，BDO途徑可進(jìn)一步包括4-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成)，4-羥基丁酰-CoA還原酶或1，4-丁二醇脫氫酶。本文另外公開(kāi)的是非天然存在的微生物體，包括具有BDO途徑的微生物體，該途徑包括編碼以足夠量表達(dá)而生產(chǎn)BDO的BDO途徑酶的至少一種外源核酸，所述BDO途徑包括4-氨基丁酸CoA移轉(zhuǎn)酶，4-氨基丁酰-CoA水解酶，4-氨基丁酸-CoA連接酶，4-氨基丁酰-CoA還原酶(醇形成)，4-氨基丁酰-CoA還原酶，4-氨基丁 -1-醇脫氫酶，4-氨基丁 -1-醇氧化還原酶(去氨基)或4-氨基丁 -1-醇氨基轉(zhuǎn)移酶(參見(jiàn)實(shí)施例VII和表 18)，并且可進(jìn)一步包括1，4- 丁二醇脫氫酶。例如，外源核酸可編碼4-氨基丁酸CoA移轉(zhuǎn)酶，4-氨基丁酰-CoA水解酶或4-氨基丁酸-CoA連接酶；4-氨基丁酰-CoA還原酶(醇形成)；以及4-氨基丁-1-醇氧化還原酶(去氨基)或4-氨基丁-1-醇氨基轉(zhuǎn)移酶。另外， 外源核酸可編碼4-氨基丁酸CoA移轉(zhuǎn)酶，4-氨基丁酰-CoA水解酶或4-氨基丁酸-CoA連接酶；4-氨基丁酰-CoA還原酶；4-氨基丁 -1-醇脫氫酶；以及4-氨基丁 -1-醇氧化還原酶(去氨基)或4-氨基丁 -1-醇氨基轉(zhuǎn)移酶。本文還公開(kāi)非天然存在的微生物體，包括具有BDO途徑的微生物體，該途徑包括編碼以足夠量表達(dá)而生產(chǎn)BDO的BDO途徑酶的至少一種外源核酸，所述BDO途徑包括4-氨基丁酸激酶，4-氨基丁醛脫氫酶(磷酸化)，4-氨基丁 -1-醇脫氫酶，4氨基丁 -1-醇氧化還原酶(去氨基)，4-氨基丁 -1-醇氨基轉(zhuǎn)移酶，[(4-氨基丁醇基)氧]膦酸氧化還原酶 (去氨基)，[(4-氨基丁醇基)氧]膦酸氨基轉(zhuǎn)移酶，4-羥基丁酰-磷酸脫氫酶，或4-脫氫酶(磷酸化)(參見(jiàn)實(shí)施例VII和表19)。例如，外源核酸可編碼4-氨基丁酸激酶；4-氨基丁酰-脫氫酶(磷酸化)；4-氨基丁 -1-醇脫氫酶；以及4-氨基丁 -1-醇氧化還原酶(去氨基)或4-氨基丁 -1-醇氨基轉(zhuǎn)移酶。或者，外源核酸可編碼4-氨基丁酸激酶；[(4-氨基丁醇基)氧]膦酸氧化還原酶(去氨基)或[(4-氨基丁醇基)氧]膦酸氨基轉(zhuǎn)移酶；4-羥基丁酰-磷酸脫氫酶；以及4-羥基丁醛脫氫酶(磷酸化)。本文另外公開(kāi)的是非天然存在的微生物體，包括具有BDO途徑的微生物體，該途徑包括編碼以足夠量表達(dá)而生產(chǎn)BDO的BDO途徑酶的至少一種外源核酸，所述BDO途徑包括α -酮戊二酸-激酶，2，5- 二氧代戊酸半醛脫氫酶(磷酸化)，2，5- 二氧代戊酸脫氫酶， α -酮戊二酸基-CoA還原酶(醇形成)，5-羥基-2-氧代戊酸脫羧酶或5-羥基_2_氧代戊酸脫氫酶(脫羧)(參見(jiàn)實(shí)施例VIII和表20)。所述BDO途徑可進(jìn)一步包括4-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成)，4-羥基丁酰-CoA還原酶或1，4- 丁二醇脫氫酶。例如，所述外源的核酸可編碼α-酮戊二酸-激酶；2，5-二氧代戊酸半醛脫氫酶(磷酸化)；2，5-二氧代戊酸還原酶；以及5-羥基-2-氧代戊酸脫羧酶?；蛘?，外源核酸可編碼α -酮戊二酸-激酶；2，5-二氧代戊酸半醛脫氫酶(磷酸化)；2，5_ 二氧代戊酸還原酶；以及5-羥基-2-氧代戊酸脫氫酶(脫羧)?；蛘撸鐾庠春怂峥删幋aα -酮戊二酸CoA移轉(zhuǎn)酶，α -酮戊二酸基-CoA水解酶，或α -酮戊二酸基-CoA連接酶；α -酮戊二酸基-CoA還原酶，5_羥基_2_氧代戊酸脫氫酶；以及5-羥基-2-氧代戊酸脫羧酶。在另一實(shí)施方案中，所述外源核酸可編碼α -酮戊二酸CoA移轉(zhuǎn)酶，α -酮戊二酸基-CoA水解酶或α -酮戊二酸基-CoA連接酶； α -酮戊二酸基-CoA還原酶，5-羥基-2-氧代戊酸脫氫酶，以及5-羥基_2_氧代戊酸脫氫酶(脫羧)?；蛘?，所述外源核酸可編碼α -酮戊二酸CoA移轉(zhuǎn)酶，α -酮戊二酸基-CoA水解酶或α -酮戊二酸基-CoA連接酶；α -酮戊二酸基-CoA還原酶(醇形成)；以及5_羥基-2-氧代戊酸脫羧酶。又一個(gè)實(shí)施方案中，所述外源核酸可編碼α-酮戊二酸CoA移轉(zhuǎn)酶，α -酮戊二酸基-CoA水解酶或α -酮戊二酸基-CoA連接酶；α -酮戊二酸基-CoA還原酶(醇形成)；以及5-羥基-2-氧代戊酸脫氫酶(脫羧)。本文另外公開(kāi)的是非天然存在的微生物體，包括具有BDO途徑的微生物體，該途徑包括編碼以足夠量表達(dá)而生產(chǎn)BDO的BDO途徑酶的至少一種外源核酸，所述BDO途徑包括谷氨酸CoA移轉(zhuǎn)酶，谷氨?；?CoA水解酶，谷氨?；?CoA連接酶，谷氨酸5-激酶，谷氨酸-5-半醛脫氫酶(磷酸化)，谷氨?；?CoA還原酶，谷氨酸-5-半醛還原酶，谷氨?；?CoA還原酶(醇形成)，2-氨基-5-羥基戊酸氧化還原酶(去氨基)，2-氨基-5-羥基戊酸氨基轉(zhuǎn)移酶，5-羥基-2氧代戊酸脫羧酶，5-羥基-2-氧代戊酸脫氫酶(脫羧)(參見(jiàn)實(shí)施例IX和表21)。例如，所述外源核酸可編碼谷氨酸CoA移轉(zhuǎn)酶，谷氨酰基-CoA水解酶或谷氨?；?CoA連接酶；谷氨酰基-CoA還原酶；谷氨酸-5-半醛還原酶；2-氨基-5-羥基戊酸氧化還原酶(去氨基)或2-氨基-5-羥基戊酸氨基轉(zhuǎn)移酶；和5-羥基-2-氧代戊酸脫羧酶或5-羥基-2-氧代戊酸脫氫酶(脫羧)?；蛘撸鐾庠春怂峥删幋a谷氨酸5-激酶；谷氨酸-5-半醛脫氫酶(磷酸化)；谷氨酸-5-半醛還原酶；2-氨基-5-羥基戊酸氧化還原酶(去氨基)或2-氨基-5-羥基戊酸氨基轉(zhuǎn)移酶；和5-羥基-2-氧代戊酸脫羧酶或 5-羥基-2-氧代戊酸脫氫酶(脫羧)。另外的實(shí)施方案中，所述外源核酸可編碼谷氨酸CoA 移轉(zhuǎn)酶，谷氨酰基-CoA水解酶或谷氨?；?CoA連接酶；谷氨?；?CoA還原酶(醇形成)； 2-氨基-5-羥基戊酸氧化還原酶(去氨基)或2-氨基-5-羥基戊酸氨基轉(zhuǎn)移酶；和5-羥基-2-氧代戊酸脫羧酶或5-羥基-2-氧代戊酸脫氫酶(脫羧)。另一實(shí)施方案中，所述外源核酸可編碼谷氨酸5-激酶；谷氨酸-5-半醛脫氫酶(磷酸化)；2_氨基-5-羥基戊酸氧化還原酶(去氨基)或2-氨基-5-羥基戊酸氨基轉(zhuǎn)移酶；和5-羥基-2-氧代戊酸脫羧酶或5-羥基-2-氧代戊酸脫氫酶(脫羧)。本文還非天然存在的微生物體，包括具有BDO途徑的微生物體，該途徑包括編碼以足夠量表達(dá)而生產(chǎn)BDO的BDO途徑酶的至少一種外源核酸，所述BDO途徑包括3-羥丁酰 CoA消旋酶，3-羥基丁酰-CoA脫水酶，乙烯基乙?；?CoAA-異構(gòu)酶或4-羥基丁酰-CoA脫水酶(參見(jiàn)實(shí)施例X和表22)。例如，外源核酸可編碼3-羥丁酰-CoA消旋酶；3-羥基丁酰-CoA脫水酶；乙烯基乙?；?CoAA-異構(gòu)酶；以及4-羥基丁酰-CoA脫水酶。本文另外公開(kāi)的是非天然存在的微生物體，包括具有BDO途徑的微生物體，該途徑包括編碼以足夠量表達(dá)而生產(chǎn)BDO的BDO途徑酶的至少一種外源核酸，所述BDO途徑包括高絲氨酸脫氨酶，高絲氨酸CoA移轉(zhuǎn)酶，高絲氨酸-CoA水解酶，高絲氨酸-CoA連接酶， 高絲氨酸-CoA脫氨酶，4-羥基丁 -2-烯?；?CoA移轉(zhuǎn)酶，4-羥基丁 -2-烯?；?CoA水解酶，4-羥基丁 -2-烯?；?CoA連接酶，4-羥基丁 -2-烯酸酯還原酶，4-羥基丁酰-CoA 移轉(zhuǎn)酶，4-羥基丁酰-CoA水解酶，4-羥基丁酰-CoA連接酶或4-羥基丁 -2-烯?；?CoA 還原酶(參見(jiàn)實(shí)施例XI和表2 。例如，所述外源核酸可編碼高絲氨酸脫氨酶；4-羥基丁 -2-烯?；?CoA移轉(zhuǎn)酶，4-羥基丁 -2-烯酰基-CoA水解酶，4-羥基丁 -2-烯酰基-CoA 連接酶；4-羥基丁 -2-烯酰基-CoA還原酶?；蛘撸鐾庠春怂峥删幋a高絲氨酸CoA移轉(zhuǎn)酶，高絲氨酸-CoA水解酶，或高絲氨酸-CoA連接酶；高絲氨酸-CoA脫氨酶；以及4-羥基丁-2-烯?；?CoA還原酶。另外的實(shí)施方案中，所述外源核酸可編碼高絲氨酸脫氨酶； 4-羥基丁 -2-烯酸酯還原酶；以及4-羥基丁酰-CoA移轉(zhuǎn)酶，4-羥基丁酰-CoA水解酶或 4-羥基丁酰-CoA連接酶。或者，所述外源核酸可編碼高絲氨酸CoA移轉(zhuǎn)酶，高絲氨酸-CoA 水解酶，或高絲氨酸-CoA連接酶；高絲氨酸-CoA脫氨酶；以及4-羥基丁 -2-烯?；?CoA 還原酶。本文另外公開(kāi)非天然存在的微生物體，包括具有BDO途徑的微生物體，該途徑包括編碼以足夠量表達(dá)而生產(chǎn)BDO的BDO途徑酶的至少一種外源核酸，所述BDO途徑包括琥珀酰-CoA還原酶(醇形成)，4-羥基丁酰-CoA水解酶，4-羥基丁酰-CoA連接酶，4-羥基丁醛脫氫酶(磷酸化)(參見(jiàn)表15)。所述BDO途徑可另外包括琥珀酰-CoA還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-CoA移轉(zhuǎn)酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酰酶，4-羥基丁酰-CoA還原酶，4-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成)或1，4_ 丁二醇脫氫酶。本文另外公開(kāi)了非天然存在的微生物體，包括具有BDO途徑的微生物體，該途徑包括編碼以足夠量表達(dá)而生產(chǎn)BDO的BDO途徑酶的至少一種外源核酸，所述BDO途徑包括谷氨酸脫氫酶，4-氨基丁酸氧化還原酶(去氨基)，4-氨基丁酸氨基轉(zhuǎn)移酶，谷氨酸脫羧酶，4-羥基丁酰-CoA水解酶，4-羥基丁酰-CoA連接酶，4-羥基丁醛脫氫酶(磷酸化)(參見(jiàn)表16)。所述BDO途徑可另外包括α-酮戊二酸脫羧酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-CoA移轉(zhuǎn)酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酰酶，4-羥基丁酰-CoA還原酶，4-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成)或1，4_ 丁二醇脫氫酶。如上所述途徑僅為示例性的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)需要，很容易從本文公開(kāi)的那些選擇合適的途徑以獲得合適的BDO途徑或其他代謝途徑。本發(fā)明提供遺傳修飾的生物體，其允許通過(guò)增加產(chǎn)物或減少不需要的副產(chǎn)品而提高所需產(chǎn)物例如BDO的生產(chǎn)。如本文公開(kāi)的，本發(fā)明提供非天然存在微生物體，包括具有1， 4-丁二醇(BDO)途徑的微生物體，該途徑包含編碼以足夠量表達(dá)以生產(chǎn)BDO的BDO途徑酶的至少一種外源核酸。在一實(shí)施方案中，所述微生物體經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)外源琥珀酰-CoA 合成酶(參見(jiàn)實(shí)施例XII)。例如，所述琥珀酰-CoA合成酶可通過(guò)大腸桿菌sue⑶基因編碼。在另一實(shí)施方案中，所述微生物體經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)外源α-酮戊二酸脫羧酶 (參見(jiàn)實(shí)施例XIII)。例如，α-酮戊二酸脫羧酶可通過(guò)牛分枝桿菌sucA基因編碼。還另外的實(shí)施方案中，所述微生物體經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)外源琥珀酸半醛脫氫酶和4-羥基丁酸脫氫酶并且任選地表達(dá)4-羥基丁酰-CoA/乙酰-CoA移轉(zhuǎn)酶(參見(jiàn)實(shí)施例XIII)。例如，所述琥珀酸半醛脫氫酶(CoA-依賴的)，4-羥基丁酸脫氫酶和4-羥基丁酰-CoA/乙酰-CoA移轉(zhuǎn)酶可通過(guò)牙齦卟啉單胞菌W83基因編碼。另外的實(shí)施方案中，所述微生物體經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)外源丁酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶(參見(jiàn)實(shí)施例XIII)。例如，所述丁酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶可通過(guò)丙酮丁醇梭菌bukl和ptb基因編碼。另一實(shí)施方案中，所述微生物體經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)外源4-羥基丁酰-CoA還原酶 (參見(jiàn)實(shí)施例XIII)。例如，所述4-羥基丁酰-CoA還原酶可通過(guò)拜氏梭菌Ald基因編碼。 另外，本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述微生物體經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)外源4-羥基丁醛還原酶(參見(jiàn)實(shí)施例XIII)。例如，所述4-羥基丁醛還原酶可通過(guò)熱葡糖苷酶地芽孢桿菌adhl基因編碼。在另一實(shí)施方案中，所述微生物體經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)外源丙酮酸脫氫酶亞基(參見(jiàn)實(shí)施例XIV)。例如，所述外源丙酮酸脫氫酶可以是NADH不敏感的。所述丙酮酸脫氫酶亞單位可以通過(guò)克雷伯氏肺炎桿菌IpdA基因編碼。具體的實(shí)施方案中，所述微生物體的丙酮酸脫氫酶亞單位基因可受丙酮酸甲酸鹽裂解酶啟動(dòng)子調(diào)控。另外的實(shí)施方案中，所述微生物體經(jīng)遺傳修飾以破壞編碼需氧呼吸控制調(diào)節(jié)系統(tǒng)的基因(參見(jiàn)實(shí)施例XV)。例如，可以破壞arcA基因。所述生物體可進(jìn)一步包含編碼蘋(píng)果酸脫氫酶的基因的破壞。另外的實(shí)施方案中，所述微生物體經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)外源NADH 不敏感的檸檬酸合成酶(參見(jiàn)實(shí)施例XV)。例如，所述NADH不敏感的檸檬酸合成酶可通過(guò) gltA，例如gltA的R163L突變體編碼。在另一實(shí)施方案中，所述微生物體經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)外源磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(參見(jiàn)實(shí)施例XVI)。例如，所述磷酸烯醇丙酮酸羧激酶可通過(guò)流感嗜血桿菌磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因編碼。可以理解的是如本文公開(kāi)的任何數(shù)目的遺傳修飾可單獨(dú)使用或以一種或多種本文公開(kāi)的所述遺傳修飾的不同組合使用以提高產(chǎn)BDO的微生物體中BDO的生產(chǎn)。具體的實(shí)施方案中，所述微生物體可經(jīng)遺傳修飾以引入任何且至所有遺傳修飾以提高BDO的生產(chǎn)。具體的實(shí)施方案中，包含BDO途徑的微生物體可經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)外源琥珀酰-CoA合成酶；表達(dá)外源α -酮戊二酸脫羧酶；表達(dá)外源琥珀酸半醛脫氫酶和4-羥基丁酸脫氫酶以及選擇性地4-羥基丁酰-CoA/乙酰-CoA移轉(zhuǎn)酶；表達(dá)外源丁酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶；表達(dá)外源4-羥基丁酰-CoA還原酶；并且表達(dá)外源4-羥基丁醛還原酶；表達(dá)外源丙酮酸脫氫酶； 破壞編碼需氧呼吸控制調(diào)節(jié)系統(tǒng)的基因；表達(dá)外源NADH不敏感的檸檬酸合成酶；以及表達(dá)外源磷酸烯醇丙酮酸羧激酶。用于提高生產(chǎn)的所述菌株在實(shí)施例XII-XIX中描述。因此可理解的是除了如上所述的修飾，所述菌株可另外包括本文公開(kāi)的其他修飾。所述修飾包括， 但不限于內(nèi)源乳酸脫氫酶(IdhA)，醇脫氫酶(adhE)和/或丙酮酸甲酸鹽裂解酶(pflB)的缺失(參見(jiàn)實(shí)施例XII-XIX和表28)。另外提供一種微生物體，其中編碼外源表達(dá)酶的一種或多種基因整合入宿主生物體的fimD基因座(參見(jiàn)實(shí)施例XVII)。例如，編碼BDO途徑酶的一種或多種基因可整合入用于提高BDO生產(chǎn)的fimD基因座。另外提供表達(dá)提高BDO生產(chǎn)的非-磷酸轉(zhuǎn)移酶蔗糖攝取系統(tǒng)的微生物體。雖然本文公開(kāi)的遺傳修飾的微生物體以含有特定BDO途徑酶的微生物體舉例說(shuō)明，可以理解的是所述修飾可以整合入具有在所述遺傳修飾存在時(shí)提高生產(chǎn)的BDO途徑的任何微生物體。本發(fā)明的微生物體可因此具有本文公開(kāi)的任何BDO途徑。例如，所述BDO途徑可包含4-羥基丁酸脫氫酶，琥珀酰-CoA合成酶，CoA-依賴的琥珀酸半醛脫氫酶，4-羥基丁酸=CoA移轉(zhuǎn)酶，4- 丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶，α -酮戊二酸脫羧酶，醛脫氫酶，醇脫氫酶或醛/醇脫氫酶(參見(jiàn)圖1)。或者，所述BDO途徑可包含4-氨基丁酸CoA移轉(zhuǎn)酶，4-氨基丁酰-CoA水解酶，4-氨基丁酸-CoA連接酶，4-氨基丁酰-CoA氧化還原酶(去氨基)，4-氨基丁酰-CoA氨基轉(zhuǎn)移酶或4-羥基丁酰-CoA脫氫酶(參見(jiàn)表17)。所述BDO途徑可進(jìn)一步包括4-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成)，4-羥基丁酰-CoA還原酶或1，4- 丁二醇脫氫酶。另外，所述BDO途徑可包含4-氨基丁酸CoA移轉(zhuǎn)酶，4_氨基丁酰-CoA水解酶， 4-氨基丁酸-CoA連接酶；4-氨基丁酰-CoA還原酶(醇形成)，4-氨基丁酰-CoA還原酶， 4-氨基丁 -1-醇脫氫酶，4-氨基丁 -1-醇氧化還原酶(去氨基)或4-氨基丁 -1-醇氨基轉(zhuǎn)移酶(參見(jiàn)表18)。此外，所述BDO途徑可包含4-氨基丁酸激酶，4-氨基丁醛脫氫酶(磷酸化)，4-氨基丁 -1-醇脫氫酶，4-氨基丁 -1-醇氧化還原酶(去氨基)，4-氨基丁 -1-醇氨基轉(zhuǎn)移酶，[(4-氨基丁醇基)氧]膦酸氧化還原酶(去氨基)，[(4-氨基丁醇基)氧] 膦酸氨基轉(zhuǎn)移酶，4-羥基丁酰-磷酸脫氫酶或4-羥基丁醛脫氫酶(磷酸化)(參見(jiàn)表19)。 所述途徑可進(jìn)一步包含1，4_ 丁二醇脫氫酶。所述BDO途徑還可以包含α-酮戊二酸5-激酶，2，5-二氧代戊酸半醛脫氫酶(磷酸化)，2，5- 二氧代戊酸還原酶，α -酮戊二酸CoA移轉(zhuǎn)酶，α -酮戊二酸基-CoA水解酶， α -酮戊二酸基-CoA連接酶，α -酮戊二酸基-CoA還原酶，5_羥基_2_氧代戊酸脫氫酶， α -酮戊二酸基-CoA還原酶(醇形成)，5-羥基-2-氧代戊酸脫羧酶，或5-羥基_2_氧代戊酸脫氫酶(脫羧)(參見(jiàn)表20)。所述BDO途徑可進(jìn)一步包括4-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成)，4-羥基丁酰-CoA還原酶或1，4- 丁二醇脫氫酶。另外，所述BDO途徑可包含谷氨酸 CoA移轉(zhuǎn)酶，谷氨酰基-CoA水解酶，谷氨?；?CoA連接酶，谷氨酸5-激酶，谷氨酸-5-半醛脫氫酶(磷酸化)，谷氨酰基-CoA還原酶，谷氨酸-5-半醛還原酶，谷氨酰基-CoA還原酶(醇形成)，2-氨基-5-羥基戊酸氧化還原酶(去氨基)，2-氨基-5-羥基戊酸氨基轉(zhuǎn)移酶，5-羥基-2氧代戊酸脫羧酶，5-羥基-2-氧代戊酸脫氫酶(脫羧)(參見(jiàn)表21)。所述 BDO途徑可進(jìn)一步包括4-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成)，4-羥基丁酰-CoA還原酶或1， 4-丁二醇脫氫酶。另外，所述BDO途徑可包含3-羥基丁酰-CoA脫氫酶，3羥基丁酰-CoA脫水酶，乙烯基乙酰基-CoAA-異構(gòu)酶或4羥基丁酰-CoA脫水酶(參見(jiàn)表22)。此外，所述BDO途徑可包括高絲氨酸脫氨酶，高絲氨酸CoA移轉(zhuǎn)酶，高絲氨酸-CoA水解酶，高絲氨酸-CoA連接酶，高絲氨酸-CoA脫氨酶，4-羥基丁 -2-烯?；?CoA移轉(zhuǎn)酶，4-羥基丁 -2-烯?；?CoA水解酶，4-羥基丁 -2-烯?；?CoA連接酶，4-羥基丁 -2-烯酸酯還原酶，4-羥基丁酰-CoA移轉(zhuǎn)酶，4-羥基丁酰-CoA水解酶，4-羥基丁酰-CoA連接酶或4-羥基丁 -2-烯?；?CoA還原酶(參見(jiàn)表2 。所述BDO途徑可進(jìn)一步包括4-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成)，4-羥基丁酰-CoA還原酶或1，4_ 丁二醇脫氫酶。所述BDO途徑可另外包括琥珀酰-CoA還原酶(醇形成)，4_羥基丁酰-CoA水解酶，4-羥基丁酰-CoA連接酶或4-羥基丁醛脫氫酶(磷酸化)(參見(jiàn)表1 。所述BDO途徑可進(jìn)一步包括琥珀酰-CoA還原酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-CoA移轉(zhuǎn)酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酰酶，4-羥基丁酰-CoA還原酶，4-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成)或1，4_ 丁二醇脫氫酶。此外，所述BDO途徑可包括谷氨酸脫氫酶，4-氨基丁酸氧化還原酶(去氨基)，4-氨基丁酸氨基轉(zhuǎn)移酶，谷氨酸脫羧酶，4-羥基丁酰-CoA水解酶，4-羥基丁酰-CoA連接酶或4-羥基丁醛脫氫酶(磷酸化)(參見(jiàn)表16)。所述BDO途徑可進(jìn)一步包括α -酮戊二酸脫羧酶，4-羥基丁酸脫氫酶，4-羥基丁酰-CoA移轉(zhuǎn)酶，4-羥基丁酸激酶，磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酰酶，4-羥基丁酰-CoA還原酶，4-羥基丁酰-CoA還原酶(醇形成) 或1，4_ 丁二醇脫氫酶。本文一般參考代謝反應(yīng)、反應(yīng)物或其產(chǎn)物，或具體參考一個(gè)或更多個(gè)核酸或基因?qū)Ρ景l(fā)明進(jìn)行描述，所述核酸或基因編碼與所述代謝反應(yīng)、反應(yīng)物或產(chǎn)物相關(guān)或催化所述代謝反應(yīng)、反應(yīng)物或產(chǎn)物的酶。除非本文另外明確說(shuō)明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，描述反應(yīng)也等同于描述反應(yīng)物和反應(yīng)產(chǎn)物。類似地，除非本文另外明確說(shuō)明，描述反應(yīng)物或產(chǎn)物也涉及反應(yīng)，以及描述任意的這些代謝成分也涉及編碼催化所指代的反應(yīng)、反應(yīng)物或產(chǎn)物的酶的一個(gè)基因或多個(gè)基因。同樣地，假定熟知的代謝生物化學(xué)、酶學(xué)和基因組學(xué)領(lǐng)域，本文對(duì)基因或編碼核酸的討論也等同于對(duì)對(duì)應(yīng)的編碼酶和其催化的反應(yīng)以及該反應(yīng)的反應(yīng)物和產(chǎn)物的討論。使用本發(fā)明的微生物體通過(guò)生物合成方式生產(chǎn)4-ΗΒ是特別有用的，這是因?yàn)樗苌a(chǎn)單體4-ΗΒ。本發(fā)明的非天然存在的微生物體和它們的4-ΗΒ和BDO家族化合物的生物合成也是特別有用的，這是因?yàn)?-ΗΒ產(chǎn)物(1)被分泌；( 可以沒(méi)有任何衍生化諸如輔酶A ； (3)避免生物合成期間的熱力學(xué)改變；(4)允許直接生物合成BD0，以及(5)在酸性pH 培養(yǎng)基中允許自發(fā)地將4-HB化學(xué)轉(zhuǎn)化為Y-丁內(nèi)酯(GBL)。后面的特性例如對(duì)于有效地化學(xué)合成或生物合成BDO家族化合物諸如1，4_ 丁二醇和/或四氫呋喃(THF)也是特別有用的。微生物體一般缺乏合成4-HB的能力，因此，本文公開(kāi)的任意化合物已知在1，4_丁二醇家族化合物內(nèi)，或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知是在1，4- 丁二醇家族化合物內(nèi)此外，已知具有所有必要的代謝酶能力的生物不從所述的酶和本文所示例的生物化學(xué)途徑產(chǎn)生4-HB。更確切地，可能不包括下面進(jìn)一步描述的少數(shù)厭氧微生物，具有酶能力的微生物使用4-HB作為底物以生產(chǎn)例如琥珀酸。相反，本發(fā)明的非自然存在的微生物體產(chǎn)生4-HB或BDO作為產(chǎn)物。如上所述，以其單體形式生物合成4-HB不僅在化學(xué)合成BDO家族化合物中特別有用， 而且它還允許進(jìn)一步生物合成BDO家族化合物并且完全避免化學(xué)合成步驟。本發(fā)明的可以生產(chǎn)4-HB的非天然存在的微生物體通過(guò)確保宿主微生物體包括完全地生物化學(xué)合成至少一種本發(fā)明的4-HB生物合成途徑的功能能力而產(chǎn)生。確保至少一種必要的4-HB或BDO生物合成途徑將4-HB生物合成能力賦予宿主微生物體。為了圖1的說(shuō)明，五種必要的4-HB生物合成途徑在本文中被示例和顯示。另外的 4-HB和BDO途徑在圖8-13中描述。一種4-HB生物合成途徑包括從琥珀酸生物合成4-HB (琥珀酸途徑)。參與該4-HB途徑的酶包括CoA-非依賴性琥珀酸半醛脫氫酶和4-羥基丁酸脫氫酶。在該途徑中，CoA-非依賴性琥珀酸半醛脫氫酶催化與圖1顯示的箭頭相反的反應(yīng)。 另一4-HB生物合成途徑包括通過(guò)琥珀酰-CoA從琥珀酸進(jìn)行生物合成(琥珀酰-CoA途徑)。 參與該4-HB途徑的酶包括琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依賴性琥珀酸半醛脫氫酶和4-羥基丁酸脫氫酶。三種其它4-HB生物合成途徑包括從α -酮戊二酸生物合成4-ΗΒ ( α -酮戊二酸途徑)。因此，第三種4-ΗΒ生物合成途徑是通過(guò)谷氨酸琥珀酸半醛轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸脫羧酶和4-羥基丁酸脫氫酶生物合成琥珀酸半醛。第四種4-ΗΒ生物合成途徑還包括從α-酮戊二酸生物合成4-ΗΒ，但利用α-酮戊二酸脫羧酶催化琥珀酸半醛合成。4-羥基丁酸脫氫酶催化琥珀酸半醛向4-ΗΒ的轉(zhuǎn)化。第五種4-ΗΒ生物合成途徑包括通過(guò)琥珀酰-CoA從α-酮戊二酸進(jìn)行的生物合成并且利用α -酮戊二酸脫氫酶產(chǎn)生琥珀酰-CoA，其進(jìn)入上述的琥珀酰-CoA途徑。這些4-HB生物合成途徑的每一種、它們的底物、反應(yīng)物和產(chǎn)物在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步描述。如本文所述，4-HB可進(jìn)一步通過(guò)包含適于生產(chǎn)BDO的酶而生物合成轉(zhuǎn)變成BDO(參見(jiàn)實(shí)施例)。因此，可以理解的是4-HB途徑可與用于將4-HB轉(zhuǎn)變?yōu)锽DO以生成 BDO途徑的酶一起使用。本發(fā)明的非自然存在的微生物體可以通過(guò)引入可表達(dá)的核酸產(chǎn)生，該核酸編碼一種或更多種參與一種或多種4-HB或BDO生物合成途徑的酶。根據(jù)選擇用于生物合成的宿主微生物體，可以表達(dá)用于一些或所有特定的4-HB或BDO生物合成途徑的核酸。例如，如果選擇的宿主缺乏琥珀酸至4-HB途徑中的一種或多種酶并且該途徑被選擇用于4-HB生物合成，則例如在該實(shí)施例中將CoA-非依賴性琥珀酸半醛脫氫酶和4-羥基丁酸脫氫酶的可表達(dá)核酸引入宿主中，用于隨后的外源性表達(dá)?？蛇x地，如果選擇的宿主表現(xiàn)出一些途徑酶的內(nèi)源表達(dá)，但是缺乏其它的途徑酶，則需要所述有缺陷的酶的編碼核酸以實(shí)現(xiàn)4-HB或 BDO生物合成。例如，如果所選的宿主表現(xiàn)出內(nèi)源CoA-非依賴性琥珀酸半醛脫氫酶，但是缺乏4-羥基丁酸脫氫酶，則需要該酶的編碼核酸以實(shí)現(xiàn)4-HB生物合成。因此，本發(fā)明非天然存在的微生物體可通過(guò)引入外源酶或蛋白質(zhì)活性以獲得所需的生物合成途徑而產(chǎn)生或可通過(guò)將一種或多種外源酶或蛋白質(zhì)活性與一種或多種內(nèi)源酶或蛋白質(zhì)一起引入獲得所需的生物合成途徑，生產(chǎn)所需的產(chǎn)物例如4-HB或BD0。以同樣的方式，在4-HB生物合成被選擇通過(guò)琥珀酸至琥珀酰-CoA途徑(琥珀酰-CoA途徑)發(fā)生的情況中，對(duì)于缺乏下述酶的宿主琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依賴性琥珀酸半醛脫氫酶和/或4-羥基丁酸脫氫酶，編碼核酸將在受體宿主中外源表達(dá)。
選擇通過(guò)α -酮戊二酸至琥珀酸半醛途徑(α -酮戊二酸途徑)的4_ΗΒ生物合成，對(duì)于缺乏一種或更多種下述酶的宿主而言可以利用外源表達(dá)谷氨酸琥珀酸半醛轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸脫羧酶和/或4-羥基丁酸脫氫酶或α -酮戊二酸脫羧酶和4-羥基丁酸脫氫酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員可很容易確定用于生產(chǎn)4-ΗΒ或BDO的，如本文公開(kāi)的途徑酶。根據(jù)已選擇的宿主微生物體的4-ΗΒ或BDO生物合成途徑的組成，本發(fā)明的非自然存在的微生物體包括至少一種外源表達(dá)的4-ΗΒ或BDO途徑的編碼核酸和針對(duì)一個(gè)或更多個(gè)4-ΗΒ或BDO生物合成途徑的多達(dá)所有的編碼核酸。例如，通過(guò)相應(yīng)編碼核酸的外源表達(dá)， 在缺乏途徑酶或蛋白質(zhì)的宿主中，可以建立4-ΗΒ或BDO生物合成。在缺乏4-ΗΒ或BDO途徑所有酶或蛋白質(zhì)的宿主中，可包括所述途徑中所有酶或蛋白質(zhì)的外源表達(dá)，雖然可以理解即使所述宿主包含至少一種途徑酶或蛋白質(zhì)，也可以表達(dá)該途徑的所有酶或蛋白質(zhì)。例如，通過(guò)4-羥基丁酸脫氫酶編碼核酸的外源表達(dá)，在缺乏4-羥基丁酸脫氫酶的宿主中，可以從所有五個(gè)途徑建立4-ΗΒ生物合成。相反，通過(guò)所有八種下述酶的外源表達(dá)，在缺乏所有八種酶的宿主中，可以從所有五個(gè)途徑建立4-ΗΒ生物合成CoA-非依賴性琥珀酸半醛脫氫酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依賴性琥珀酸半醛脫氫酶、谷氨酸琥珀酸半醛轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸脫羧酶、α -酮戊二酸脫羧酶、α -酮戊二酸脫氫酶和4-羥基丁酸脫氫酶。在本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，以可表達(dá)方式引入的編碼核酸的數(shù)量至少與已選擇的宿主微生物體的4-ΗΒ或BDO途徑缺乏相對(duì)應(yīng)。因此，本發(fā)明的非天然存在的微生物體可以具有一個(gè)、二個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)或八個(gè)核酸，其編碼組成一個(gè)或多個(gè)4-ΗΒ或BDO生物合成途徑的上述酶。在一些實(shí)施方式中，非天然存在的微生物體還可以包括其它遺傳修飾，其促進(jìn)或優(yōu)化4-ΗΒ或BDO生物合成或?qū)λ拗魑⑸矬w賦予其它有用的功能。一種這樣的其它功能可以包括，例如，增加一個(gè)或多個(gè)4-ΗΒ途徑前體的合成，諸如琥珀酸、琥珀酰-CoA，α -酮戊二酸，4-氨基丁酸，谷氨酸，乙酰-CoA和/ 或高絲氨酸。一般，選擇宿主微生物體使得其生產(chǎn)4-ΗΒ或BDO途徑的前體，或者作為提供所需前體從頭產(chǎn)生或提高通過(guò)宿主微生物體自然產(chǎn)生的前體產(chǎn)量的自然產(chǎn)生分子或基因工程改造產(chǎn)物。例如宿主生物體例如大腸桿菌中自然產(chǎn)生琥珀酰-CoA，α-酮戊二酸，4-氨基丁酸，谷氨酸，乙酰-CoA和高絲氨酸。如本文公開(kāi)的宿主生物體可經(jīng)改造以提高前體產(chǎn)量。 另外，已經(jīng)改造生產(chǎn)所需前體的微生物體可用作宿主生物體并且進(jìn)一步改造以表達(dá)4-ΗΒ 或BDO途徑的酶或蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的非天然存在的微生物體從包含合成4-ΗΒ或BDO的酶能力的宿主產(chǎn)生。在該具體的實(shí)施方式中，增加4-ΗΒ或BDO途徑產(chǎn)物的合成或累積可以是有用的，以便例如向著4-ΗΒ或BDO生產(chǎn)方向推動(dòng)4-ΗΒ或BDO途徑反應(yīng)。增加的合成或累積可通過(guò)例如編碼一種或更多種上述4-ΗΒ或BDO途徑酶的核酸的過(guò)量表達(dá)完成。4-ΗΒ或 BDO途徑一種酶或多種酶的過(guò)量表達(dá)可以通過(guò)例如一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源基因的外源表達(dá)發(fā)生， 或通過(guò)一個(gè)或多個(gè)異源基因的外源表達(dá)發(fā)生。因此，自然存在的生物通過(guò)一種，兩種，三種， 四種，五種，六種等直至所有編碼4-ΗΒ或BDO生物合成途徑酶的核酸的過(guò)量表達(dá)可以容易地產(chǎn)生而成為本發(fā)明的非自然的產(chǎn)生4-ΗΒ或BDO的微生物體。另外，非自然存在的生物可以通過(guò)內(nèi)源基因的突變產(chǎn)生，所述突變引起4-ΗΒ或BDO生物合成途徑中的酶活性增加。在特別有用的實(shí)施方式中，采用編碼核酸的外源表達(dá)。外源表達(dá)賦予宿主定制表達(dá)和/或調(diào)控元件的能力和實(shí)現(xiàn)由使用者控制的期望的表達(dá)水平的應(yīng)用。然而，在其它實(shí)施方式中，也可以利用內(nèi)源表達(dá)，諸如當(dāng)連接到誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或其它調(diào)控元件時(shí)，通過(guò)除去負(fù)調(diào)控效應(yīng)物或誘導(dǎo)基因的啟動(dòng)子。因此，具有自然存在的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的內(nèi)源基因通過(guò)提供適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)劑可以增量調(diào)節(jié)，或內(nèi)源基因的調(diào)控區(qū)可以進(jìn)行基因工程以摻入誘導(dǎo)型調(diào)控元件，從而允許在期望的時(shí)間調(diào)控內(nèi)源基因的增加的表達(dá)。類似地，對(duì)于引入非自然存在的微生物體中的外源基因，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以作為調(diào)控元件被包括(參見(jiàn)實(shí)施例)。本文所使用的“外源的”意欲指是相關(guān)分子或相關(guān)活性被引入宿主微生物體中。所述分子可例如通過(guò)諸如整合進(jìn)入宿主染色體中或作為非染色體遺傳物質(zhì)諸如質(zhì)粒而將編碼核酸引入宿主遺傳物質(zhì)中。因此，當(dāng)用于指編碼核酸的表達(dá)時(shí)，該術(shù)語(yǔ)指將編碼核酸以可表達(dá)的形式引入微生物體中。當(dāng)用于指生物合成活性時(shí)，該術(shù)語(yǔ)指被引入至宿主相關(guān)生物中的活性。來(lái)源可以是例如同源的或異源的編碼核酸，其引入至宿主微生物體后表達(dá)相關(guān)的活性。因此，術(shù)語(yǔ)“內(nèi)源的”指在宿主中存在的相關(guān)分子或活性。類似地，當(dāng)用于指編碼核酸的表達(dá)時(shí)，該術(shù)語(yǔ)指在微生物體中含有的編碼核酸的表達(dá)。術(shù)語(yǔ)“異源的”指源自相關(guān)物種之外的來(lái)源的分子或活性，而“同源的”指源自宿主微生物體的分子或活性。因此， 本發(fā)明編碼核酸的外源表達(dá)可以利用異源的或同源的編碼核酸中的任一種或兩者。4-HB或BDO途徑酶的編碼核酸的來(lái)源可以包括，例如，其中編碼的基因產(chǎn)物能夠催化相關(guān)反應(yīng)的任意物種。這些物種包括原核和真核生物，包括但不限于，細(xì)菌一包括古細(xì)菌和真細(xì)菌，以及真核細(xì)胞一包括酵母、植物、昆蟲(chóng)、動(dòng)物和包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物。這些來(lái)源的示例性物種包括，例如，大腸桿菌、釀酒酵母菌、克氏酵母、克氏梭狀芽胞桿菌、丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、糖多丁醇乙酸梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、艱難梭菌、肉毒梭菌、酪丁酸梭菌、破傷風(fēng)形梭狀芽胞桿菌、破傷風(fēng)桿菌、丙酸梭菌、氨基丁酸梭菌、近端梭菌、斯氏梭菌、真氧產(chǎn)堿桿菌、牛分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌、牙齦卟啉單胞菌、擬南芥、嗜熱棲熱菌、假單胞菌屬，包括綠膿桿菌、惡臭假單胞菌、施氏假單胞菌、熒光假單胞菌，人類、兔、球形紅細(xì)菌、布氏熱厭氧桿菌、勤奮金屬球菌、明串珠菌、橙色綠屈撓菌、卡氏玫瑰彎菌、赤細(xì)菌屬、加州希蒙得木、不動(dòng)桿菌屬，包括醋酸鈣不動(dòng)桿菌和鮑氏不動(dòng)桿菌、牙齦卟啉單胞菌、超嗜熱古菌硫化葉菌、硫磺礦硫化葉菌、嗜酸熱硫化葉菌、枯草桿菌、蠟樣芽胞桿菌、巨大桿狀菌、短芽孢桿菌、短小芽胞桿菌、褐鼠、肺炎克雷伯氏菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、纖細(xì)裸藻、齒垢密螺旋體、 熱醋穆?tīng)柺暇?、海棲熱袍菌、鹽沼鹽桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、敏捷氣熱菌、野豬、秀麗隱桿線蟲(chóng)、谷氨酸棒桿菌、發(fā)酵氨基酸球菌、乳酸乳球菌、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌、產(chǎn)氣腸桿菌、 假絲酵母、土曲霉、戊糖片球菌、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌、巴氏醋桿菌、乳酸克盧費(fèi)氏酵母、巴氏真細(xì)菌、多毛擬桿菌、Anaerotruncus colihominis、Natranaerobius thermophilusm、空腸彎曲桿菌、流感嗜血桿菌、靈桿菌、無(wú)丙二酸檸檬酸桿菌、黃色粘球菌、具核梭桿菌、產(chǎn)黃青霉、 海洋Y蛋白菌、產(chǎn)丁酸細(xì)菌，及其他本文公開(kāi)的(參見(jiàn)實(shí)施例)。例如，具有4-HB或BDO生物合成產(chǎn)生的微生物體在本文參考大腸桿菌和酵母宿主進(jìn)行示例。然而，由于目前可獲得 550個(gè)物種以上的全基因組序列(這些中一半以上可在公共數(shù)據(jù)庫(kù)上獲得，諸如NCBI)，包括395種微生物基因組以及多種酵母、真菌、植物和哺乳動(dòng)物基因組，對(duì)于在相關(guān)或遠(yuǎn)緣物種中一個(gè)或更多個(gè)基因，包括例如已知基因的同源染色體、直向同源物、種內(nèi)同源基因和非直向同源基因置換，以及生物間遺傳變化的互換，對(duì)編碼必要的4-HB或BDO生物合成活性的基因的鑒定，在本領(lǐng)域中是常規(guī)的和熟知的。因此，本文參考具體生物諸如大腸桿菌或酵母描述的能夠生物合成本發(fā)明的4-HB或BDO和其它化合物的代謝變化可以容易地應(yīng)用于其它微生物，包括原核和真核生物等。在本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)下，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道在一種生物中示例的代謝變化可以同樣應(yīng)用于其它生物。在某些情況中，諸如當(dāng)可選的4-HB或BDO生物合成途徑存在于不相關(guān)的物種中時(shí)，4-HB或BDO生物合成可以通過(guò)例如外源表達(dá)來(lái)自不相關(guān)物種的一個(gè)或多個(gè)種內(nèi)同源基因而被賦予給宿主物種，所述外源表達(dá)催化類似的但不相同的代謝反應(yīng)，以替換相關(guān)的反應(yīng)。因?yàn)椴煌纳镩g存在某些代謝網(wǎng)絡(luò)之間的差異，所以本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不同的生物之間實(shí)際的基因應(yīng)用可以不同。然而，在本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員也應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的教導(dǎo)和方法可以使用與本文示例的那些的關(guān)聯(lián)代謝變化而被應(yīng)用于所有微生物體，以在感興趣物種中構(gòu)建合成4-HB諸如單體4-HB或BDO的微生物體。宿主微生物體可以選自例如細(xì)菌、酵母、真菌或可用于發(fā)酵過(guò)程的多種其它微生物的任一種，并且非自然存在的微生物體在它們中產(chǎn)生。示例性細(xì)菌包括選自以下的物種大腸桿菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌、琥珀酸放線桿菌、Marmheimia succiniciproducens、豆根瘤菌、枯草桿菌、谷氨酸棒桿菌、結(jié)核分支桿菌、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌、乳酸乳球菌、植物乳桿菌、天藍(lán)色鏈霉菌、丙酮丁醇梭菌、熒光假單胞菌和惡臭假單胞菌。示例性酵母或真菌包括選自以下的物種釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克魯維斯酵母、 馬克斯克魯維酵母、土曲霉、黑曲霉和畢赤酵母。由于其為適于遺傳工程的很好表征的微生物體，大腸桿菌為特別有用的宿主生物體。其他特別有用的宿主生物體包括酵母諸如釀酒酵母。構(gòu)建和檢測(cè)非自然存在的產(chǎn)生4-HB或BDO的宿主的表達(dá)水平的方法可以通過(guò)例如本領(lǐng)域中熟知的重組和檢測(cè)方法完成?？梢园l(fā)現(xiàn)這些方法描述在例如Sambrook等， Molecular Cloning :A Laboratory Manual,Third Ed. ,Cold Spring Harbor Laboratory, New York(2001) ；Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD(1999)中。4-HB 和 GBL 可以通過(guò)例如使用 Spherisorb 50DS1 柱以及70% IOmM磷酸鹽緩沖液(pH = 7)和30%甲醇的流動(dòng)相的HPLC分離，并使用UV檢測(cè)器在 215nm 處檢測(cè)(Hennessy 等 2004，J. Forensic Sci. 46(6) :1_9)。通過(guò)氣相色譜或通過(guò)HPLC和折光率檢測(cè)器檢測(cè)BD0，其使用Aminex HPX-87H柱和0. 5mM硫酸的流動(dòng)相 (Gonzalez-Pajuelo 等，Met. Eng. 7 :329-336 (2005))。參與產(chǎn)生4-HB或BDO的途徑的外源核酸序列可利用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)穩(wěn)定或瞬時(shí)導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，所述技術(shù)包括但不限于，接合，電穿孔，化學(xué)轉(zhuǎn)變，轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)染和超聲轉(zhuǎn)變。對(duì)于大腸桿菌或其他原核細(xì)胞中的外源表達(dá)，如果需要，一些基因中的核酸序列或真核核酸的cDNA可編碼靶信號(hào)諸如N-末端線粒體或其他的靶信號(hào)，其可在轉(zhuǎn)入原核宿主細(xì)胞之前除去。例如，線粒體前導(dǎo)序列的除去導(dǎo)致大腸桿菌中表達(dá)提高(Hoffmeister等， J. Biol. Chem. 280 =4329-4338 (2005) ) 0對(duì)于酵母或其他真核細(xì)胞中的外源表達(dá)，基因可在不添加前導(dǎo)序列時(shí)在胞液中表達(dá)，或可通過(guò)添加合適的靶序列諸如適于宿主細(xì)胞的線粒體靶向或分泌信號(hào)而靶向至線粒體或其他的細(xì)胞器官，或靶向分泌。因此，可以理解的是對(duì)核酸序列的合適的修飾以除去或包含靶序列可引入外源核酸序列中以賦予其合乎需要的特性。此外，基因可用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)進(jìn)行密碼子優(yōu)化以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的優(yōu)化表達(dá)?？梢詷?gòu)建一個(gè)或多個(gè)表達(dá)載體，以含有本文所示例的一種或多種4-HB生物合成途徑和/或一種或多種BDO生物合成編碼核酸，其被有效連接到在宿主生物中起作用的表達(dá)調(diào)控序列。適用于本發(fā)明的宿主微生物體的表達(dá)載體包括例如質(zhì)粒、噬菌體載體、病毒載體、附加體和人造染色體，包括可操作穩(wěn)定整合進(jìn)入宿主染色體中的載體和選擇序列或標(biāo)記。另外，所述表達(dá)載體可包含一種或多種篩選標(biāo)記基因和合適的表達(dá)調(diào)控序列?？蛇x擇的標(biāo)記基因也可以被包括，其例如提供抗生素或毒素抗性，補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)缺陷型缺乏，或供給培養(yǎng)基中沒(méi)有的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物。表達(dá)調(diào)控序列可以包括本領(lǐng)域熟知的組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、 轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止子等。當(dāng)兩種或更多種外源編碼核酸共同表達(dá)時(shí)，可以將兩種核酸插入到例如單一表達(dá)載體中或分離的表達(dá)載體中。對(duì)于單一載體表達(dá)，編碼核酸可以可操作地連接到一個(gè)共同的表達(dá)調(diào)控序列或連接到不同的表達(dá)調(diào)控序列，諸如一個(gè)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和一個(gè)組成型啟動(dòng)子。參與代謝或合成途徑的外源核酸序列的轉(zhuǎn)化可以使用本領(lǐng)域中熟知的方法證實(shí)。所述方法包括例如，核酸分析諸如Northern印跡或mRNA的聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)擴(kuò)增，或用于基因產(chǎn)物表達(dá)的免疫印跡，或檢測(cè)導(dǎo)入的核酸序列表達(dá)或其相應(yīng)基因產(chǎn)物的其他合適的分析方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可知外源核酸以產(chǎn)生所需產(chǎn)物的足夠量表達(dá)， 且進(jìn)一步可知可利用本領(lǐng)域熟知的和本文公開(kāi)的方法優(yōu)化表達(dá)水平以獲得充分的表達(dá)。使用上述示例的本領(lǐng)域中熟知的方法構(gòu)建本發(fā)明的非自然存在的微生物體，以足以產(chǎn)生4-HB諸如單體4-HB，或BDO的量外源表達(dá)至少一種編碼4-HB或BDO途徑酶的核酸。 當(dāng)然本發(fā)明的微生物體在足以產(chǎn)生4-HB或BDO的條件下培養(yǎng)。每個(gè)途徑中4-HB酶的示例性表達(dá)水平在下面的實(shí)施例中將進(jìn)一步描述。按照本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)，本發(fā)明的非自然存在的微生物體可以實(shí)現(xiàn)4-HB諸如單體4-HB，或BDO的生物合成，其產(chǎn)生的胞內(nèi)濃度在大約0. 1至200mM之間或以上，例如0. 1至25mM之間或以上。一般而言，4-HB諸如單體 4-HB，或BDO的胞內(nèi)濃度是在大約3至150mM之間或以上，特別在大約5至125mM之間或以上，以及更特別在大約8至IOOmM之間，例如，大約3-20mM，尤其在大約5至15mM之間且更特別在大約8至12mM之間，包括大約10mM、20mM、50mM、80mM或更高。在這些示例性范圍的每一個(gè)之間和之上的胞內(nèi)濃度也可由從本發(fā)明的非自然存在的微生物體實(shí)現(xiàn)。具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的微生物體尤其是諸如此處公開(kāi)的菌株(參見(jiàn)實(shí)施例XII-XIX和表觀)，可通過(guò)增加BDO的產(chǎn)生和/或降低不合需要的副產(chǎn)品而提供所需產(chǎn)物諸如BDO的生產(chǎn)。所述產(chǎn)量水平包括但不限于，此處公開(kāi)的那些并且包括從大約每升1克至大約25克，例如大約每升 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 克或甚至更高量的產(chǎn)物。一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)條件包括厭氧或基本上厭氧的生長(zhǎng)或保持條件。示例性的厭氧條件之前已經(jīng)描述過(guò)并且為本領(lǐng)域所熟知。用于發(fā)酵過(guò)程的示例性的厭氧條件在本文描述并且例如在2007年8月10日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)系列No. 11/891,602中描述。與本領(lǐng)域熟知的其他厭氧條件一樣，任何這些條件可用于非天然發(fā)生的微生物體。在所述厭氧條件下，4-HB或BDO生產(chǎn)者可以與本文示例的所有其他濃度一樣，以5-10mM或更高的胞內(nèi)濃度合成4-HB或BD0。當(dāng)然，即使上述描述指胞內(nèi)濃度，4-HB或BDO產(chǎn)生微生物體可在胞內(nèi)和/或?qū)a(chǎn)物分泌入培養(yǎng)基而生產(chǎn)4-HB或BD0。與發(fā)酵和其他大規(guī)模培養(yǎng)過(guò)程一樣，所述培養(yǎng)條件可包括例如液體培養(yǎng)過(guò)程。如本文所述，在厭氧或基本上厭氧的培養(yǎng)條件下可獲得特別有用的本發(fā)明生物合成產(chǎn)物的產(chǎn)
出ο
如本文所述，用于實(shí)現(xiàn)4-HB或BDO生物合成的一種示例性的培養(yǎng)條件包括厭氧培養(yǎng)或發(fā)酵條件。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的非自然存在的微生物體可以在厭氧或基本上厭氧的條件下維持、培養(yǎng)或發(fā)酵。簡(jiǎn)言之，厭氧條件指沒(méi)有氧的環(huán)境。基本上厭氧的條件包括例如培養(yǎng)、分批發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵，以便培養(yǎng)基中的溶解氧濃度保持在飽和狀態(tài)的0和 10%之間?；旧蠀捬醯臈l件還包括在液體培養(yǎng)基中或在固體瓊脂上培養(yǎng)或靜止細(xì)胞，所述液體培養(yǎng)基或固體瓊脂處于維持在小于氧的氣氛下的密封室中。氧的百分比可以通過(guò)例如用隊(duì)/0)2混合物或其它適合的一種或多種非氧氣體噴射培養(yǎng)物來(lái)維持。本發(fā)明還提供非自然存在的微生物生物催化劑，其包括具有4-羥基丁酸G-HB) 和1，4_ 丁二醇(BDO)生物合成途徑的微生物體，所述途徑包括至少一種外源核酸，該核酸編碼4-羥基丁酸脫氫酶、CoA-非依賴性琥珀酸半醛脫氫酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依賴性琥珀酸半醛脫氫酶、4-羥基丁酸CoA轉(zhuǎn)移酶、谷氨酸琥珀酸半醛轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸脫羧酶、CoA-非依賴性醛脫氫酶、CoA-依賴性醛脫氫酶或醇脫氫酶，其中外源核酸以足以產(chǎn)生 1，4_丁二醇(BDO)的量表達(dá)。4-羥基丁酸CoA轉(zhuǎn)移酶也被稱為4-羥基丁酰CoA 乙酰-CoA 轉(zhuǎn)移酶。本文還公開(kāi)了另外的4-HB或BDO途徑酶(參見(jiàn)實(shí)施例和圖8-13)。本發(fā)明進(jìn)一步提供非自然存在的微生物生物催化劑，其包括具有4-羥基丁酸 (4-HB)和1，4_ 丁二醇(BDO)生物合成途徑的微生物體，所述途徑包括至少一種外源核酸， 所述核酸編碼4-羥基丁酸脫氫酶、琥珀酰-CoA合成酶、CoA-依賴性琥珀酸半醛脫氫酶、 4-羥基丁酸CoA轉(zhuǎn)移酶、4-丁酸激酶、磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶、α -酮戊二酸脫羧酶、醛脫氫酶、醇脫氫酶或醛/醇脫氫酶，其中外源核酸以足以產(chǎn)生1，4_ 丁二醇(BDO)的量表達(dá)。也可以產(chǎn)生生物合成BDO的非自然存在的微生物體。如同本發(fā)明的產(chǎn)生4-ΗΒ的微生物體，產(chǎn)生BDO的微生物體也可在胞內(nèi)產(chǎn)生BDO或分泌BDO到培養(yǎng)基中。按照先前提供的用于構(gòu)建合成4-ΗΒ的微生物體的教導(dǎo)和指導(dǎo)，可以將另外的BDO途徑摻入產(chǎn)生4-ΗΒ 的微生物體中，以產(chǎn)生也合成BDO和其它BDO家族化合物的生物。BDO的化學(xué)合成和其下游產(chǎn)品是已知的。能夠進(jìn)行BDO生物合成的本發(fā)明的非自然存在的微生物體避免了使用4-ΗΒ 作為切入點(diǎn)的這些化學(xué)合成，如圖1中所示。如下面進(jìn)一步所描述，4-ΗΒ生產(chǎn)者例如也可以被用于將4-ΗΒ化學(xué)轉(zhuǎn)化為GBL以及然后轉(zhuǎn)化為BDO或THF。可選地，4-ΗΒ生產(chǎn)者可以被進(jìn)一步修飾，以包含將4-ΗΒ和/或GBL轉(zhuǎn)化為BDO的生物合成能力。另外的引入4-ΗΒ生產(chǎn)者中的BDO途徑包括，例如，在宿主缺乏的背景下外源表達(dá)或過(guò)量表達(dá)一種或更多種在圖1中步驟9-13示例的酶。一種這種途徑包括，例如，實(shí)施如圖1中步驟9、12和13顯示的反應(yīng)所必需的酶活性，其中醛和醇脫氫酶可以是具有醛和醇脫氫酶活性的分離酶或多功能酶。另一個(gè)這樣的途徑包括，例如，實(shí)施如圖1中步驟10、11、 12和13中顯示的反應(yīng)所必需的酶活性，同樣，其中醛和醇脫氫酶可以是具有醛和醇脫氫酶活性的分離酶或多功能酶。因此，引入至4-ΗΒ生產(chǎn)者的另外的BDO途徑包括，例如，在宿主缺乏的背景下外源表達(dá)或過(guò)量表達(dá)4-羥基丁酸CoA轉(zhuǎn)移酶、丁酸激酶、磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶、 CoA-非依賴性醛脫氫酶、CoA-依賴性醛脫氫酶或醇脫氫酶中的一種或更多種。在不存在能夠修飾4-ΗΒ的內(nèi)源?；?CoA合成酶的情況下，非自然存在的產(chǎn)生BDO的微生物體可進(jìn)一步包括選擇用于4-ΗΒ的外源酰基-CoA合成酶，或多種酶的組合，所述多種酶具有將4-ΗΒ 轉(zhuǎn)化成4-HB-CoA凈反應(yīng)。如下面在實(shí)施例中進(jìn)一步所示例，丁酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶展示出BDO途徑活性并且用4-HB底物催化圖1中示例的轉(zhuǎn)化。因此，這些酶在本文中也可以分別稱為4-羥基丁酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)羥基丁酰酶。可以用于這些4-HB向BDO的體內(nèi)轉(zhuǎn)化的示例性醇和醛脫氫酶在下面的表1中列
出ο表1.用于將4-HB轉(zhuǎn)化為BDO的醇和醛脫氫酶
醇I晦ec:1.1.1.1醇脫氫酶ec:1.1.1.2醇脫氫酶(NADP+)ec:1.1.1.4(R, R)-丁二醇脫氫酶ec:1.1.1.53-羥基丁酮脫氫酶ec:1.1.1.6甘油脫氫酶ec:1.1.1.7丙二醇-磷酸脫氫酶ec:.1.1.8甘油-3 -磷酸脫氫酶(NAD+)ec:.1.1.11D-阿拉伯糖醇4-脫氫酶ec:.1.1.12L-阿拉伯糖醇4-脫氫酶ec:.1.1.13L-阿拉伯糖醇2-脫氫酶ec:.1.1.14L-艾杜醇2-脫氫酶ec:.1.1.15D-艾杜醇2-脫氫酶ec:.1.1.16半乳糖醇2-脫氫酶ec:.1.1.17甘露醇-1-磷酸鹽5-脫氫酶ec:.1.1.18纖維醇2-脫氫酶ec:.1.1.21醛還原酶ec:.1.1.23組氨醇脫氫酶ec:.1.1.26乙醛酸還原酶ec:.1.1.27L-乳酸脫氫酶ec:.1.1.28D-乳酸脫氫酶ec:.1.1.29甘油酸脫氫酶ec:.1.1.303-羥基丁酸脫氫酶ec:.1.1.313-羥基異丁酸鹽脫氫酶ec:.1.1.353-羥酰-CoA脫氫酶ec:.1.1.36乙酰乙?；?CoA還原酶ec:.1.1.37蘋(píng)果酸脫氫酶ec:.1.1.38蘋(píng)果酸脫氫酶(草酰乙酸-脫羧基)ec:.1.1.39蘋(píng)果酸脫氫酵(脫羧基)ec:.1.1.40蘋(píng)果酸脫氫酶(草酰乙酸-脫敵基XNADP+)ec:.1.1.41異檸檬酸脫氫酶(NAD+)ec:.1.1.42異檸檬酸脫氫酶(NADP+)ec:.1.1.54烯丙-醇脫氫酶ec:.1.1.55乳醛還原酶(NADPH)ec:.1.1.56核糖醇2-脫氫酶ec:.1.1.593-羥基丙酸脫氫酶ec:.1.1.602-羥基-3 -氧代丙酸還原酶ec:.1.1.614-羥基丁酸脫氫酶ec:.1.1.66ω-羥基癸酸脫氫酶ec:.1.1.67甘露醇2-脫氫酶ec:.1.1.71醇脫氫酶[NAD(P)+]ec:.1.1.72甘油脫氫酶(NADP+)ec:.1.1.73辛醇脫氫酶ec:.1.1.75(R)-氨丙醇脫氫酶ec:.1.1.76(S, S)-丁二醇脫氫酶ec:.1.1.77乳醛還原酶ec:.1.1.78甲基乙二醛還原酶(NADH-依賴性)ec:.1.1.79ec:.1.1.80ec:.1.1.81ec:.1.1.82ec:.1.1.83ec:.1.1.84ec:.1.1.85ec:.1.1.86ec:.1.1.87ec:.1.1.88ec:.1.1.90ec:.1.1.91ec:.1.1.92ec:.1.1.94ec:.1.1.95ec:.1.1.97ec:.1.1.101ec:.1.1.103ec:.1.1.104ec:.1.1.105ec:.1.1.110ec:.1.1.112ec:.1.1.113ec:.1.1.129ec:.1.1.137ec:.1.1.138ec:.1.1.140ec:.1.1.142ec:.1.1.143ec:.1.1.144ec:.1.1.156ec:.1.1.157ec:.1.1.163ec:.1.1.164ec:.1.1.165ec:.1.1.166ec:.1.1.167ec:.1.1.174ec:.1.1.177ec:.1.1.178
乙醛酸還原酶(NADP+) 異丙醇脫氫酶(NADP+) 羥基丙酮酸還原酶蘋(píng)果酸脫氫酶(NADP+) D-蘋(píng)果酸脫氫酶(脫羧基) 二曱基蘋(píng)果酸脫氫酶 3-異丙基蘋(píng)果酸脫氫酶酮醇-酸還原異構(gòu)酶高異檸檬酸脫氫酶曱羥戊二酸單酰-CoA還原酶芳基醇脫氫酶芳基醇脫氫酶(NADP+) 草酰乙醇酸還原酶(脫羧基) 甘油_3 -磷酸脫氫酶[NAD(P)+] 磷酸甘油酸脫氫酶
3-羥基芐基-醇脫氫酶酰基甘油酮禱酸還原酶 L-蘇氨酸3-脫氫酶
4-氧代脯氨酸還原酶視黃醇脫氫酶
吲咮乳酸脫氫酶茚滿醇脫氫酶 L-木糖1-脫氫酶 L-蘇糖酸3-脫氫酶核糖醇-5-磷酸2-脫氫酶甘露醇2-脫氫酶(NADP+) 山梨糖醇-5-磷酸2-脫氫酶
醇脫氫酶紅杉醇脫氫酶紫蘇醇-醇脫氫酶甘油2_脫氫酶(NADP+) 3-羥基丁酰-CoA脫氫酶環(huán)戊醇脫氫酶十六醇脫氫酶 2-炔-1-醇-脫氫酶羥基環(huán)己烷甲酸脫氫酶羥基丙二酸脫氫酶環(huán)己胺-1, 2-二醇脫氫酶甘油-3-磷酸鹽1-脫氫酶(NADP+) 3 -羥基-2-甲基丁酰-CoA脫氫酶
28ec:1.11.185L-乙二醇脫氫酶ec:1.11.190吲哚-3 -醇脫氫酶(NADH)ec:1.11.191吲哚-3 -醇脫氫酶(NADPH)ec:1.11.192長(zhǎng)鏈-醇脫氫酶ec:1.11.194；^柏基-醇脫氫酶ec:1.11.195苯丙烯鹽基-醇脫氫酶ec:1.11.198(+)-冰片脫氫酶ec:1.11.2021,3-丙二醇脫氫酶ec:1.11.207(-)-薄荷醇脫氫酶ec:1.11.208(+)-新薄荷醇脫氫酶ec:1.11.216法呢醇脫氫酶ec:1.11.217芐基-2-曱基-羥基丁酸脫氫酶ec:1.11.222(R)-4-羥基苯基乳酸脫氫酶ec:1.11.223異薄荷二烯醇脫氫酶ec:1.11.2264-羥基環(huán)己烷甲酸脫氫酶ec:1.11.229二乙基2-甲基-3 -氧代琥珀酸還原酶ec:1.11.237羥基苯基丙酮酸還原酶ec:1.11.244曱醇脫氫酶ec:1.11.245環(huán)己醇脫氫酶ec:1.11.250D-阿拉伯糖醇2-脫氫酶ec:1.11.251半乳糖醇1-磷酸5-脫氫酶ec:1.11.255甘露醇脫氫酶ec:1.11.256芴-9-醇脫氫酶ec:1.11.2574-(羥甲基)苯橫酸脫氫酶ec:1.11.2586-羥基己酸脫氫酶ec:1.11.2593-羥基丁酰-CoA脫氫酶ec:1.11.261甘油-1-磷酸脫氫酶[NAD(P)+]ec:1.11.2653-曱基丁醛還原酶ec:1.11.283曱基乙二醛還原酶(NADH-依賴性)ec:1.11.286異檸檬酸-高異檸檬酸脫氫酶ec:1.11.287D-阿拉伯糖醇脫氫酶(NADP+)丁醇脫氫酶醛 ec:1.21.2甲酸脫氫酶ec:1.21.3醛脫氫酶(N AD+)ec:1.21.4醛脫氫酶(NADP+)ec:1.21.5醛脫氫酶[NAD(P)+]ec:1.21.7安息香醛脫氫酶(NADP+)ec:1.21.8甜菜堿-醛脫氫酶ec:1.21.9甘油醛-3-磷酸脫氫酶(NADP+)ec:1.2.1.10乙醛脫氫酶(乙?；?ec:1.2.1.11天冬氨酸-半醛脫氫酶ec:1.2.1.12甘油趁-3-磷酸脫氫酶(磷酸化)ec:1.2.1.13甘油酸磷酸脫氫酶(NADP+)(磷酸化)ec:1.2.1.15丙二酸-半醛脫氫酶ec:1.2.1.16琥珀酸-半醛脫氫酶[NAD(P)+]ec:1.2.1.17乙醛酸脫氫酶(?；?ec:1.2.1.18丙二酸-半醛脫氫酶(乙?；?ec:1.2.1.19氨基丁醛脫氫酶ec:1.2.1.20戊二酸-半醛脫氫酶ec:1.2.1.21乙醇醛脫氫酶ec:1.2.1.22乳醛脫氫酶ec:1.2.1.232-氧化醛脫氫酶(NAD+)ec:1.2.1.24琥珀酸-半醛脫氫酶ec:1.2.1.252-氧代異戊酸脫氫酶(?；?ec:1.2.1.262,5-二氧戊酸脫氫酶ec:1.2.1.27曱基丙二酸-半醛脫氫酶(?；?ec:1.2.1.28安息香醛脫氫酶(NAD+)ec:1.2.1.29芳基醛脫氫酶ec:1.2.1.30芳基醛脫氫酶(N ADP+)ec:1.2.1.31L-氨基己二酸-半醛脫氫酶ec:1.2.1.32氨基粘康酸-半醛脫氫酶ec:1.2.1.36視黃醛脫氫酶ec:1.2.1.39苯乙醛脫氫酶ec:1.2.1.41谷氨酸-5-半醛脫氫酶ec:1.2.1.42十六醛脫氫酶(?；?ec:1.2.1.43甲酸脫氫酶(NADP+)ec:1.2.1.454-羧基-2-羥基粘康酸-6-半醛脫氫酶ec:1.2.1.46曱醛脫氫酶ec:1.2.1.474-三甲基銨基丁醛脫氫酶ec:1.2.1.48長(zhǎng)鏈-醛脫氫酶ec:1.2.1.492-氧化醛脫氫酶(NADP+)ec:1.2.1.51丙酮酸脫氫酶(NADP+)ec:1.2.1.52酮戊二酸脫氫酶(NADP+)ec:1.2.1.534-羥基苯乙醛脫氫酶ec:1.2.1.57丁醛脫氫酶ec:1.2.1.58笨乙醛酸脫氫酶(?；?ec:1.2.1.59甘油醛-3-磷酸脫氫酶(NAD(P)+)(磷酸化)ec:1.2.1.624-甲酰基苯橫酸脫氫酶ec:1.2.1.636-氧代己酸脫氫酶ec:1.2.]L 644-羥基苯甲醛脫氫酶ec:1.2.] .65水楊醛脫氫酶ec:1.2.] .66真菌硫醇-依賴性甲醛脫氫酶ec:1.2.][.61香蘋(píng)醛脫氫酶ec:1.2.] .68松柏基-醛脫氫酶ec:1.2.] .69氟乙醛脫氫酶ec:1.2.]L71琥珀酰谷氨酸-半醛脫氫酶其他示例性的酶和途徑在此處公開(kāi)(參見(jiàn)實(shí)施例)。此外，可以理解的是可利用酶用于完成底物不是自然底物的反應(yīng)。雖然對(duì)于非自然底物的活性低于自然底物，可以理解的是可利用所述酶，無(wú)論其是自然存在的或利用如本文公開(kāi)的直接進(jìn)化或適應(yīng)進(jìn)化修飾的 (也參見(jiàn)實(shí)施例)。通過(guò)本文公開(kāi)的任何途徑的BDO產(chǎn)生在某種程度上以用于前體轉(zhuǎn)化至BDO的合適酶的鑒定為基礎(chǔ)。已經(jīng)鑒定了許多用于一些反應(yīng)階段的特異性酶。對(duì)于其中尚未鑒定對(duì)反應(yīng)前體酶特異性的那些轉(zhuǎn)化，已確定最適于催化所述反應(yīng)步驟的酶候選物。如下所論述的， 已顯示酶對(duì)大量底物起作用。另外，蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域的進(jìn)展也使得改變酶以有效作用于底物是可行的，即使其不是自然底物。如下所述的為適于BDO途徑以及已用于開(kāi)發(fā)酶以作用于非自然底物的方法而來(lái)自不同類別的廣-特異性酶。BDO途徑的關(guān)鍵酶類為氧化還原酶，其相互轉(zhuǎn)變酮或醛與醇(1. 1. 1)。該類中許多示例性的酶可對(duì)大量底物起作用。純化自短桿菌屬土壤菌KU1309 (Hirano等，J. Biosc. Bioeng. 100 =318-322(2005))的醇脫氫酶(1. 1. 1. 1)顯示對(duì)脂族以及芳香醇的過(guò)剩以高活性起作用。表2顯示所述酶的活性和其對(duì)不同醇的Km。所述酶是可逆的且對(duì)一些醛也具有很高的活性(表3)。表2.來(lái)自短桿菌屬KU的醇脫氫酶對(duì)氧化各種醇的相對(duì)活性
權(quán)利要求
1.非天然存在的微生物體，包括具有1，4_丁二醇(BDO)途徑的微生物體，該途徑包括編碼在一定條件下以足夠量表達(dá)而生產(chǎn)BDO的BDO途徑酶的至少一種外源核酸，其中所述微生物體經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)外源的琥珀酰-輔酶A合成酶；以表達(dá)外源的α -酮戊二酸脫羧酶；以表達(dá)外源的琥珀酸半醛脫氫酶和4-羥基丁酸脫氫酶并且任選地表達(dá)4-羥基丁酰-輔酶A-乙酰-輔酶A移轉(zhuǎn)酶；以表達(dá)外源的丁酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶；以表達(dá)外源的 4-羥基丁酰-輔酶A還原酶；和以表達(dá)外源的4-羥基丁醛還原酶；以表達(dá)外源的丙酮酸脫氫酶；以破壞編碼需氧的呼吸控制調(diào)節(jié)系統(tǒng)的基因；以表達(dá)外源的NADH不敏感的檸檬酸合成酶；以表達(dá)外源的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶。
2.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物體，其中所述琥珀酰-輔酶A合成酶由大腸桿菌 sucCD基因編碼。
3.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物體，其中所述α-酮戊二酸脫羧酶由牛分枝桿菌 sucA基因編碼。
4.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物體，其中所述琥珀酸半醛脫氫酶(輔酶A-依賴性的)、4_羥基丁酸脫氫酶和4-羥基丁酰-輔酶A/乙酰-輔酶A移轉(zhuǎn)酶由牙齦卟啉單胞菌 W83基因編碼。
5.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物體，其中所述丁酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶由丙酮丁醇梭菌bukl和ptb基因編碼。
6.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物體，其中所述4-羥基丁酰-輔酶A還原酶由拜氏梭菌Ald基因編碼。
7.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物體，其中所述4-羥基丁醛還原酶由熱葡糖苷酶地芽孢桿菌adhl基因編碼。
8.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物體，其中所述外源的丙酮酸脫氫酶是NADH不敏感的。
9.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物體，其中所述外源的丙酮酸脫氫酶由肺炎克雷伯氏桿菌IpdA基因編碼。
10.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物體，其中所述微生物體的一種或多種所述丙酮酸脫氫酶亞基基因在丙酮酸甲酸酯裂解酶啟動(dòng)子的調(diào)控下。
11.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物體，其中所述厭氧呼吸控制調(diào)節(jié)系統(tǒng)的破壞是對(duì)arcA基因的破壞。
12.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物體，進(jìn)一步包括對(duì)編碼蘋(píng)果酸脫氫酶的基因的破壞。
13.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物體，其中所述NADH不敏感的檸檬酸合成酶由 gltA編碼。
14.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物體，其中所述NADH不敏感的檸檬酸合成酶由 gltA的R163L突變體編碼。
15.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物體，其中所述磷酸烯醇丙酮酸羧激酶由流感嗜血桿菌磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因編碼。
16.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物體，其中編碼所述外源表達(dá)酶的一種或多種基因整合入宿主生物體的fimD基因座中。
17.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物體，其中所述生物體表達(dá)非-磷酸轉(zhuǎn)移酶蔗糖攝取系統(tǒng)。
18.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物體，其中所述生物體進(jìn)一步包括對(duì)內(nèi)源的乳酸脫氫酶、醇脫氫酶和丙酮酸甲酸酯裂解酶的破壞。
19.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物體，其中所述BDO途徑包括4-羥基丁酸脫氫酶、 琥珀酰-輔酶A合成酶、輔酶A-依賴性的琥珀酸半醛脫氫酶、4-羥基丁酰輔酶A移轉(zhuǎn)酶、 4- 丁酸激酶、磷酸轉(zhuǎn)丁酰酶、α -酮戊二酸脫羧酶、醛脫氫酶、醇脫氫酶或醛/醇脫氫酶。
20.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物體，其中所述BDO途徑包括4-氨基丁酸輔酶A 移轉(zhuǎn)酶、4-氨基丁酰-輔酶A水解酶、4-氨基丁酸-輔酶A連接酶、4-氨基丁酰-輔酶A氧化還原酶(去氨基)、4_氨基丁酰-輔酶A氨基轉(zhuǎn)移酶或4-羥基丁酰-輔酶A脫氫酶。
21.權(quán)利要求20的非天然存在的微生物體，其中所述BDO途徑進(jìn)一步包括4-羥基丁酰-輔酶A還原酶(醇形成)、4_羥基丁酰-輔酶A還原酶或1，4- 丁二醇脫氫酶。
22.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物體，其中所述BDO途徑包括4-氨基丁酸輔酶A 移轉(zhuǎn)酶、4-氨基丁酰-輔酶A水解酶、4-氨基丁酸-輔酶A連接酶、4-氨基丁酰-輔酶A還原酶(醇形成)、4_氨基丁酰-輔酶A還原酶、4-氨基丁 -1-醇脫氫酶、4-氨基丁 -1-醇氧化還原酶(去氨基)或4-氨基丁 -1-醇氨基轉(zhuǎn)移酶。
23.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物體，其中所述BDO途徑包括4-氨基丁酸激酶、 4-氨基丁醛脫氫酶(磷酸化)、4_氨基丁 -1-醇脫氫酶、4-氨基丁 -1-醇氧化還原酶(去氨基)、4_氨基丁 -1-醇氨基轉(zhuǎn)移酶、[(4-氨基丁醇基)氧]膦酸氧化還原酶(去氨基)、 [(4-氨基丁醇基)氧]膦酸氨基轉(zhuǎn)移酶、4-羥基丁酰-磷酸鹽脫氫酶或4-羥基丁醛脫氫酶(磷酸化)。
24.權(quán)利要求23的非天然存在的微生物體，其中所述BDO途徑進(jìn)一步包括1，4-丁二醇脫氫酶。
25.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物體，其中所述BDO途徑包括α-酮戊二酸5-激酶、2，5-二氧代戊酸半醛脫氫酶(磷酸化)、2，5-二氧代戊酸還原酶、α-酮戊二酸輔酶A 移轉(zhuǎn)酶、α-酮戊二酸基-輔酶A水解酶、α-酮戊二酸基-輔酶A連接酶、α -酮戊二酸基-輔酶A還原酶、5-羥基-2-氧代戊酸脫氫酶、α -酮戊二酸基-輔酶A還原酶(醇形成)、5_羥基-2-氧代戊酸脫羧酶或5-羥基-2-氧代戊酸脫氫酶(脫羧)。
26.權(quán)利要求25的非天然存在的微生物體，其中所述BDO途徑進(jìn)一步包括4-羥基丁酰-輔酶A還原酶(醇形成)、4_羥基丁酰-輔酶A還原酶或1，4- 丁二醇脫氫酶。
27.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物體，其中所述BDO途徑包括谷氨酸輔酶A移轉(zhuǎn)酶、谷氨?；?輔酶A水解酶、谷氨?；?輔酶A連接酶、谷氨酸5-激酶、谷氨酸-5-半醛脫氫酶(磷酸化)、谷氨?；?輔酶A還原酶、谷氨酸-5-半醛還原酶、谷氨?；?輔酶A還原酶(醇形成)、2-氨基-5-羥基戊酸氧化還原酶(去氨基)、2-氨基-5-羥基戊酸氨基轉(zhuǎn)移酶、5-羥基-2-氧代戊酸脫羧酶、5-羥基-2-氧代戊酸脫氫酶(脫羧)。
28.權(quán)利要求27的非天然存在的微生物體，其中所述BDO途徑進(jìn)一步包括4-羥基丁酰-輔酶A還原酶(醇形成)、4_羥基丁酰-輔酶A還原酶或1，4- 丁二醇脫氫酶。
29.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物體，其中所述BDO途徑包括3-羥基丁酰-輔酶 A脫氫酶、3-羥基丁酰-輔酶A脫水酶、乙烯乙?；?輔酶Δ -異構(gòu)酶或4-羥基丁酰-輔酶A脫水酶。
30.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物體，其中所述BDO途徑包括高絲氨酸脫氨酶、高絲氨酸-輔酶A移轉(zhuǎn)酶、高絲氨酸-輔酶A水解酶、高絲氨酸-輔酶A連接酶、高絲氨酸-輔酶A脫氨酶、4-羥基丁 -2-烯?；?輔酶A移轉(zhuǎn)酶、4-羥基丁 -2-烯?；?輔酶A水解酶、 4-羥基丁 -2-烯?；?輔酶A連接酶、4-羥基丁 -2-烯酸酯還原酶、4-羥基丁酰-輔酶A 移轉(zhuǎn)酶、4-羥基丁酰-輔酶A水解酶、4-羥基丁酰-輔酶A連接酶或4-羥基丁 -2-烯?；?輔酶A還原酶。
31.權(quán)利要求30的非天然存在的微生物體，其中所述BDO途徑進(jìn)一步包括4-羥基丁酰-輔酶A還原酶(醇形成)、4_羥基丁酰-輔酶A還原酶或1，4- 丁二醇脫氫酶。
32.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物體，其中所述BDO途徑包括琥珀酰-輔酶A還原酶(醇形成)、4_羥基丁酰-輔酶A水解酶、4-羥基丁酰-輔酶A連接酶或4-羥基丁醛脫氫酶(磷酸化)。
33.權(quán)利要求32的非天然存在的微生物體，其中所述BDO途徑進(jìn)一步包括琥珀酰-輔酶A還原酶、4-羥基丁酸脫氫酶、4-羥基丁酰-輔酶A移轉(zhuǎn)酶、4-羥基丁酸激酶、磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酰酶、4-羥基丁酰-輔酶A還原酶、4-羥基丁酰-輔酶A還原酶(醇形成) 或1，4_ 丁二醇脫氫酶。
34.權(quán)利要求1的非天然存在的微生物體，其中所述BDO途徑包括谷氨酸脫氫酶、4-氨基丁酸氧化還原酶(去氨基)、4_氨基丁酸氨基轉(zhuǎn)移酶、谷氨酸脫羧酶、4-羥基丁酰-輔酶 A水解酶、4-羥基丁酰-輔酶A連接酶或4-羥基丁醛脫氫酶(磷酸化)。
35.權(quán)利要求34的非天然存在的微生物體，其中所述BDO途徑進(jìn)一步包括α-酮戊二酸脫羧酶、4-羥基丁酸脫氫酶、4-羥基丁酰-輔酶A移轉(zhuǎn)酶、4-羥基丁酸激酶、磷酸轉(zhuǎn)-4-羥基丁酰酶、4-羥基丁酰-輔酶A還原酶、4-羥基丁酰-輔酶A還原酶(醇形成)或1，4- 丁二醇脫氫酶。
36.非天然存在的微生物體，包括具有1，4_丁二醇(BDO)途徑的微生物體，該途徑包含編碼以足夠量表達(dá)以生產(chǎn)BDO的BDO途徑酶的至少一種外源核酸，其中所述微生物體如表 28的菌株3-20中任一菌株經(jīng)遺傳修飾。
37.用于生產(chǎn)1，4_丁二醇(BDO)的方法，包括在一定條件下和以足夠的時(shí)間培養(yǎng)權(quán)利要求1-36中任一項(xiàng)權(quán)利要求的非天然存在的微生物體以生產(chǎn)BD0。
全文摘要
本發(fā)明提供非天然存在的包含1，4-丁二醇(BDO)途徑的微生物體，該途徑包含編碼BDO途徑酶的至少一種外源核酸，所述核酸以足以產(chǎn)生BDO的量表達(dá)，并且為BDO的表達(dá)被進(jìn)一步優(yōu)化。本發(fā)明另外提供利用所述微生物體生產(chǎn)BDO的方法。
文檔編號(hào)C12P7/16GK102498215SQ201080034821
公開(kāi)日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2010年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月4日
發(fā)明者A·P·博加德, M·J·伯克, S·J·萬(wàn)殿, 凱瑟琳·J·普若爾-巴克斯利, 哈里·伊姆, 孫軍, 牛巍, 約翰·D·特拉威克, 羅伯特·哈瑟爾貝克, 羅賓·E·奧斯特豪特 申請(qǐng)人:基因組股份公司