專利名稱：有效建立誘導(dǎo)的多能干細胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及有效建立人工多能干(下文稱為iPS)細胞的方法和為此的試劑，更具體而言涉及通過使下述物質(zhì)與體細胞接觸建立iPS細胞的方法(a)0ct3/4或編碼其的核酸、(b)Klf4或編碼其的核酸、和(c) Sox2或編碼其的核酸、以及(dl) L-Myc或編碼其的核酸和/或(d2)p53的功能抑制劑，并且涉及由上文(a)至(c)以及(dl)和/或(d2)組成的iPS細胞誘導(dǎo)劑。本發(fā)明還 涉及包含上文(a)至(c)的核酸因子以及(dl)和/或(d2)的核酸因子的附加型載體，或其為附加型載體和IoxP序列的組合的載體，特別涉及早期自我去除型的附加型載體，和使用附加型載體無需經(jīng)歷核酸因子在基因組中的整合快速建立喪失外源核酸因子的iPS細胞的方法。
背景技術(shù)：
近年來，小鼠和人iPS細胞已相繼地建立。Yamanaka等人通過將0ct3/4、Sox2、Klf4和C-MyC基因引入衍生自小鼠的成纖維細胞內(nèi)且迫使細胞表達基因而誘導(dǎo)iPS細胞[WO 2007/069666A1 ；Takahashi, K.和 Yamanaka, S.，Cell,126 :663-676(2006)]。其后，揭示iPS細胞還可以由除c-Myc基因外的3種因子產(chǎn)生[Nakagawa, Μ.等人，Nat.Biotechnol. ,26 :101-106 (2008)]。此外，Yamanaka等人通過將與小鼠中使用的那些相同的4種基因引入人表皮成纖維細胞內(nèi)成功建立了 iPS細胞[WO 2007/069666A1 ；Takahashi,K.等人,Cell, 131 :861-872 (2007)]。另一方面,Thomson等人的團體使用 Nanog和 Lin28 代替 Klf4 和 c-Myc 產(chǎn)生了人 iPS 細胞[WO 2008/118820A2 ;Yu，J.等人，Science，318 :1917-1920(2007)] ο然而，iPS細胞建立的效率低至小于I %。特別地，當(dāng)它們通過將除c-Myc外的3種因子(0ct3/4、Sox2和Klf4)引入體細胞內(nèi)產(chǎn)生時，出現(xiàn)iPS細胞建立的極低效率的問題，害怕所述c-Myc在由iPS細胞分化的組織或個體中中引起腫瘤生成。病毒載體例如逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒提供了比非病毒載體更高的轉(zhuǎn)染效率，并且因此是有利的，因為它們使得iPS細胞更容易生成。然而，逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒變得整合在染色體中，造成考慮到iPS細胞的臨床應(yīng)用的安全性問題。為此，使用不在染色體中發(fā)生載體整合的腺病毒載體或非病毒載體例如質(zhì)粒生成的iPS細胞已得到報道[Stadtfeld，Μ.等人，Science, 322 :945-949(2008) ；0kita,K.等人，Science, 322 :949-953 (2008) ；Yu, J.等人，Science, 324 :797-801 (2009)]。然而，這些載體在iPS細胞建立效率中低于逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒?？赡苁且驗樵趇PS細胞選擇條件下重編程因子的持續(xù)高表達的需求，所以即使當(dāng)使用質(zhì)粒載體時，獲得具有重編程因子以一定效率摻入染色體中的穩(wěn)定表達系的某些情況也是存在的，所述質(zhì)粒載體一般公認為不太可能引起摻入[Okita, K.等人，Science,322 :949-953(2008) ；Kaji, K.等人，Nature，458 :771-775 (2009)]。因此,通過首先使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒建立iPS細胞，隨后從染色體中去除外源基因，已做出協(xié)調(diào)高建立效率和安全的嘗試。例如，包含慢病毒和Cre-IoxP系統(tǒng)的組合的技術(shù)已得到報道[Chang, C. W.等人，Stem Cells, 27 :1042-1049(2009) ；Soldner, F.等人，Cell，136 :964-977(2009)]。然而，在這些報道中，使用其中IoxP序列插入LTR中的復(fù)合構(gòu)建體，以使附近的癌基因通過在IoxP序列外的LTR序列激活的危險降到最低，所述LTR序列在Cre重組酶處理后保留，并且其中插入另一個啟動子例如CMV或EF Ia用于轉(zhuǎn)錄重編程因子；因此，存在關(guān)于開發(fā)可以更容易地構(gòu)建的載體的需求。盡管外源核酸因子可以使用piggyBac轉(zhuǎn)座子完全消除[Kaji，K.等人，Nature，458 :771_775 (2009)]，但擾亂內(nèi)源基因的可能性無法排除，因為基因組中的瞬時整合是不可避免的。 同時，在涉及使用能夠在染色體外穩(wěn)定自我復(fù)制的附加型載體的方法中，除上述低iPS細胞建立效率外，在藥物選擇中斷后載體的自發(fā)清除是低效率的，并且花費很長時間[Yu, J.等人，Science，324 :797-801 (2009)]。為此，存在關(guān)于在短時間內(nèi)以高效率去除載體，同時改善iPS細胞建立效率的方法的需要。此外，在發(fā)現(xiàn)關(guān)于人iPS細胞的臨床應(yīng)用中出現(xiàn)另一個問題；細胞可以變得被衍生自其他動物物種的成分污染，所述成分例如在iPS細胞建立和維持培養(yǎng)過程中的血清和飼養(yǎng)細胞。因此，希望從重編程因子轉(zhuǎn)移到人iPS細胞建立和維持培養(yǎng)的所有操作在“無異物(Xeno-free) ”條件下(不含異源成分)進行。然而，在無病毒條件下建立的人iPS細胞中，在從重編程因子轉(zhuǎn)移到iPS細胞建立和維持培養(yǎng)的至少一個步驟中使用異源成分已是常規(guī)實踐[Okita, K.等人，Science, 322 =949-953(2008) ；Yu, J.等人，Science, 324 797-801(2009) ；Kaji, K.等人，Nature，458 :771_775 (2009)]。同時，在無異物條件下建立的所有人iPS細胞已借助于逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒由重編程基因轉(zhuǎn)染，并且其中無一已在無病毒條件下制備[Rodoriguez-Piza, I.等人，Stem Cells, 28 :36_44 (2010) ；Ross, P. J.等A, Stem Cells Dev. , 2009Dec 23.(在印刷前的電子版)]。發(fā)明概述本發(fā)明涉及有效建立適合于臨床應(yīng)用的安全人iPS細胞。相應(yīng)地，本發(fā)明的第一個目的是提供改善iPS細胞特別是人iPS細胞的建立效率的工具，和通過使用該工具有效產(chǎn)生iPS細胞的方法。本發(fā)明的第二個目的是提供快速建立iPS細胞的方法，所述iPS細胞無需經(jīng)歷核酸因子在基因組中的整合已喪失外源核酸因子。本發(fā)明的第三個目的是生成人iPS細胞，而在從重編程因子轉(zhuǎn)移到iPS細胞建立和維持培養(yǎng)的時期過程中不使用任何病毒或異源成分(即在無病毒無異物條件下)，以從而提供可以在人臨床背景中安全使用的人iPS細胞。為了解決上述問題，本發(fā)明人首先進行研究，以發(fā)現(xiàn)使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的重編程基因的合適組合?；谑褂酶郊有洼d體用于建立人iPS細胞的由Yu，J.等人使用的6種因子
[Science, 324 797-801 (2009)]，本發(fā)明人嘗試由人表皮成纖維細胞(HDF)誘導(dǎo)人iPS細胞，使用除Nanog外的5種因子，或使用除Nanog外的5種因子(這包括L-Myc代替c-Myc)。出乎意料的是，使用除Nanog外的5種因子比由6種因子更有效地建立人iPS細胞。此外，由于c-Myc由L-Myc的替換，建立效率得到顯著改善。因此，人iPS細胞建立效率實際上在使用6種因子和使用包括L-Myc代替c-Myc的5種因子之間進行比較，使用附加型載體。因此，發(fā)現(xiàn)與由6種因子比較，使用包括L-Myc代替c-Myc的5種因子，建立效率得到顯著增加。接下來,將6種因子或除Nanog外且包括L-Myc代替c_Myc的5種因子連同編碼針對p53的shRNA的附加型載體一起轉(zhuǎn)移至HDF。由于p53的功能抑制，使用6種因子獲得與由包括L-Myc代替c-Myc的5種因子比較至相似程度的iPS細胞。當(dāng)5種因子與p53的功能抑制組合時，建立效率更加顯著地增加。還發(fā)現(xiàn)通過使用小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)而不是SNL細胞作為在轉(zhuǎn)染后HDF傳代時的飼養(yǎng)細胞，人iPS細胞建立效率得到急劇改善。
本發(fā)明人已設(shè)計了附加型載體，以允許其對于其自我復(fù)制必需的組成成分通過Cre重組酶的作用從其中切掉，所述Cre重組酶具有置于載體組成成分的兩端的IoxP序列，以便允許轉(zhuǎn)移的附加型載體在iPS細胞建立后從iPS細胞中快速脫落。在人iPS細胞建立后，分離細胞的基因組DNA和染色體外DNA且就轉(zhuǎn)基因的存在或不存在分開檢查。因此，轉(zhuǎn)移的載體在任一 DNA未檢測到；出乎意料的是，發(fā)現(xiàn)載體是從細胞中快速脫落的早期自我去除載體，無需使用Cre重組酶。此外，本發(fā)明人在從重編程因子轉(zhuǎn)移到iPS細胞建立和維持培養(yǎng)的完全無病毒和無異物條件下成功生成了人iPS細胞，使用上述附加型載體。根據(jù)這些結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過從重編程因子中排除Nanog且使用L-Myc代替c-Myc，或使用p53的功能抑制劑代替其，或加上其，人iPS細胞建立效率可以得到顯著改善，通過精心設(shè)計附加型載體可以快速獲得無需經(jīng)歷核酸因子在基因組中的整合已喪失外源核酸因子的iPS細胞，并且通過組合上述重編程因子和附加型載體可以在無病毒和無異物條件下生成人iPS細胞，并且已發(fā)展了本發(fā)明。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了 [I]產(chǎn)生iPS細胞的方法，其包括使下述物質(zhì)與體細胞接觸(a)0ct3/4或編碼其的核酸、(b)Klf4或編碼其的核酸、和(c) Sox2或編碼其的核酸、以及(dl)L-Myc或編碼其的核酸和/或(d2)p53的功能抑制劑。[2]根據(jù)上文[I]的方法，其進一步包括使(e)Lin28或Lin28b或編碼其的核酸與體細胞接觸。[3]根據(jù)上文[I]或[2]的方法，其中p53的功能抑制劑是選自針對p53的siRNA和shRNA和編碼其的DNA的核酸。[4]根據(jù)上文[2]或[3]的方法，其包括將下述物質(zhì)轉(zhuǎn)移至體細胞(a)編碼0ct3/4的核酸、(b)編碼Klf4的核酸、(c)編碼Sox2的核酸、(dl)編碼L-Myc的核酸和/或(d2)編碼針對p53的shRNA的核酸、以及(e)編碼Lin28或Lin28b的核酸。[5]根據(jù)上文[4]的方法，其中選自前述(a)、(b)、(c)、(dl)和(e)的至少一種核酸以附加型載體的形式轉(zhuǎn)移。[6]根據(jù)上文[4]或[5]的方法，其中(d2)編碼針對p53的shRNA的核酸以在細胞中不能自我復(fù)制的質(zhì)粒載體的形式轉(zhuǎn)移。[7]根據(jù)上文[5]或[6]的方法，其中所述附加型載體是以50%或更多的頻率到第5次傳代時從iPS細胞中脫落的自我去除載體。[8]根據(jù)上文[5]_[7]中任一項的方法，其中所述附加型載體具有以相同方向置于對于核酸復(fù)制必需的載體組成成分的5’和3’側(cè)上的IoxP序列。[9]根據(jù)上文[8]的方法，其不包括用Cre重組酶處理細胞的過程。[10]根據(jù)上文[1]-[9]中任一項的方法，其中所述體細胞是人細胞。[11]根據(jù)上文[10]的方法，其包括在從前述因子(a)、(b)、(c)、以及(dl)和/或(d2)或另外的(e)與體細胞接觸到iPS細胞建立的期間過程中不存在來自非人動物的成分的情況下培養(yǎng)細胞。[12]根據(jù)上文[11]的方法，其中人細胞用作飼養(yǎng)細胞，或其中不使用飼養(yǎng)細胞。[13]根據(jù)上文[12]的方法，其中所述飼養(yǎng)細胞衍生自與所述體細胞相同的個體。[14] iPS細胞誘導(dǎo)促進劑，其包含(a)編碼0ct3/4的核酸、(b)編碼Klf4的核酸、(c)編碼Sox2的核酸、(dl)編碼L-Myc的核酸和/或(d2)編碼針對p53的shRNA的核酸、以及(e)編碼Lin28 或Lin28b的核酸。[15]根據(jù)上文[14]的試劑，其中選自前述(a)、(b)、(c)、(dl)和(e)的至少一種核酸以附加型載體的形式。[16]根據(jù)上文[14]或[15]的試劑，其中(d2)編碼針對p53的shRNA的核酸以在細胞中不能自我復(fù)制的質(zhì)粒載體的形式。[17]根據(jù)上文[15]或[16]的試劑，其中所述附加型載體是以50%或更多的頻率到第5次傳代時從iPS細胞中脫落的自我去除載體。[18]根據(jù)上文[15]_[17]中任一項的試劑，其中所述附加型載體具有以相同方向置于對于前述核酸各自的復(fù)制必需的載體組成成分的5’和3’側(cè)上的IoxP序列。[19]無需經(jīng)歷核酸在基因組中的整合已喪失前述核酸的iPS細胞，其通過根據(jù)上文[5]_[9]中任一項的方法獲得。[20]根據(jù)上文[19]的iPS細胞，其為人iPS細胞。[21]不含來自非人動物的任何污染成分的人iPS細胞，其通過根據(jù)上文[11]-[13]中任一項的方法獲得。[22]根據(jù)上文[19]-[21]中任一項的iPS細胞在產(chǎn)生體細胞中的用途。[23]根據(jù)上文[19]-[21]中任一項的iPS細胞，其中所述iPS細胞在產(chǎn)生體細胞中充當(dāng)細胞來源。L-Myc代替c_Myc的使用和/或p53的功能抑制劑的使用以及Nanog的不使用，使得能夠顯著增加iPS細胞建立效率，并且因此在生成人iPS細胞中是特別有用的，特別是不涉及重編程基因在基因組中的整合類型的人iPS細胞，使用在建立效率中已是極低的6種因子(0ct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc、Nanog、Lin28)。另外,獨立開發(fā)的附加型載體的使用使得能夠建立iPS細胞而無需涉及外源核酸因子在基因組中的整合，并且引起附加體在其建立后從iPS細胞中快速脫落，從而載體可以比常規(guī)附加型載體更早從細胞中脫落。此外，因為人iPS細胞可以在從重編程因子轉(zhuǎn)移到iPS細胞建立和維持的期間過程中在完全無病毒和無異物條件下生成，所以本發(fā)明的方法在將人iPS細胞應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)中是高度有用的。在下文中，通過使用附加型載體建立的iPS細胞在本說明書中有時縮寫為“印i-iPS 細胞”或“印i-iPSC”。此外，當(dāng)引入的基因的組合縮寫為“￥1、￥2、￥3、￥4、11、了2或了3”時，組合如下表I中所示。表I.質(zhì)?；旌衔锏母爬?br> 權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生iPS細胞的方法，其包括使下述物質(zhì)與體細胞接觸(a)0ct3/4或編碼其的核酸、(b)Klf4或編碼其的核酸、和(c) Sox2或編碼其的核酸、以及(dl) L-Myc或編碼其的核酸和/或(d2)p53的功能抑制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其進一步包括使(e)Lin28或Lin28b或編碼其的核酸與所述體細胞接觸。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2的方法，其中所述p53的功能抑制劑是選自針對p53的siRNA和shRNA和編碼其的DNA的核酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3的方法，其包括將下述物質(zhì)轉(zhuǎn)移至體細胞(a)編碼Oct3/4的核酸、(b)編碼Klf4的核酸、(c)編碼Sox2的核酸、(dl)編碼L-Myc的核酸和/或(d2)編碼針對P53的shRNA的核酸、以及(e)編碼Lin28或Lin28b的核酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中選自前述(a)、(b)、(C)、(dl)和(e)的至少一種核酸以附加型載體的形式轉(zhuǎn)移。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的方法，其中(d2)所述編碼針對p53的shRNA的核酸以在細胞中不能自我復(fù)制的質(zhì)粒載體的形式轉(zhuǎn)移。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其中所述附加型載體是以50%或更多的頻率到第5次傳代時從iPS細胞中脫落的自我去除載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一項的方法，其中所述附加型載體具有以相同方向置于對于所述核酸復(fù)制必需的載體組成成分的5’和3’側(cè)上的IoxP序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其不包括用Cre重組酶處理所述細胞的過程。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項的方法，其中所述體細胞是人細胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其包括在從前述因子(a)、(b)、(C)、以及(dl)和/或(d2)或另外的(e)與所述體細胞接觸到iPS細胞建立的期間過程中不存在來自非人動物的成分的情況下培養(yǎng)細胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中人細胞用作飼養(yǎng)細胞，或其中不使用飼養(yǎng)細胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述飼養(yǎng)細胞衍生自與所述體細胞相同的個體。
14.一種iPS細胞誘導(dǎo)促進劑，其包含(a)編碼0ct3/4的核酸、(b)編碼Klf4的核酸、(c)編碼Sox2的核酸、(dl)編碼L-Myc的核酸和/或(d2)編碼針對p53的shRNA的核酸、以及(e)編碼Lin28或Lin28b的核酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的試劑，其中選自前述(a)、(b)、(C)、(dl)和(e)的至少一種核酸是以附加型載體的形式。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15的試劑，其中(d2)所述編碼針對p53的shRNA的核酸是以在細胞中不能自我復(fù)制的質(zhì)粒載體的形式。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16的試劑，其中所述附加型載體是以50%或更多的頻率到第5次傳代時從iPS細胞中脫落的自我去除載體。
18.根據(jù)權(quán)利要求15-17中任一項的試劑，其中所述附加型載體具有以相同方向置于對于前述核酸各自的復(fù)制必需的載體組成成分的5’和3’側(cè)上的IoxP序列。
19.一種無需經(jīng)歷核酸在基因組中的整合已喪失前述核酸的iPS細胞，其通過根據(jù)權(quán)利要求5-9中任一項的方法獲得。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的iPS細胞，其為人iPS細胞。
21.一種不含來自非人動物的任何污染成分的人iPS細胞，其通過根據(jù)權(quán)利要求11-13中任一項的方法獲得。
22.根據(jù)權(quán)利要求19-21中任一項的iPS細胞在產(chǎn)生體細胞中的用途。
23.根據(jù)權(quán)利要求19-21中任一項的iPS細胞，其中所述iPS細胞在產(chǎn)生體細胞中充當(dāng)細胞來源。
全文摘要
提供的是產(chǎn)生iPS細胞的方法，其包括使下述物質(zhì)與體細胞接觸(a)Oct3/4或編碼其的核酸、(b)Klf4或編碼其的核酸、和(c)Sox2或編碼其的核酸、以及(d1)L-Myc或編碼其的核酸和/或(d2)p53的功能抑制劑。優(yōu)選將(a)編碼Oct3/4的核酸、(b)編碼Klf4的核酸、(c)編碼Sox2的核酸、(d1)編碼L-Myc的核酸、和(e)編碼Lin28或Lin28b的核酸插入附加型載體內(nèi)，所述附加型載體具有以相同方向置于對于載體復(fù)制必需的載體組成成分的5’和3’側(cè)上的loxP序列，將(d2)編碼針對p53的shRNA的核酸插入確保瞬時表達的載體(質(zhì)粒載體等)內(nèi)，并且所有這些核酸轉(zhuǎn)移至體細胞。
文檔編號C12N5/10GK102625837SQ20108003515
公開日2012年8月1日 申請日期2010年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月7日
發(fā)明者中川誠人, 沖田圭介, 山中伸彌 申請人:國立大學(xué)法人京都大學(xué)