專利名稱：包含甘露糖啟動(dòng)子的載體和甘露糖啟動(dòng)子的制作方法
包含甘露糖啟動(dòng)子的載體和甘露糖啟動(dòng)子本發(fā)明涉及在原核宿主細(xì)胞中可表達(dá)的載體，其包含甘露糖可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子用于，編碼例如多肽、例如重組蛋白的核酸的異源表達(dá)。具體地，本發(fā)明涉及用于在宿主中異源表達(dá)的新的載體，其包含可操作地連接于轉(zhuǎn)錄單元的甘露糖操縱子的啟動(dòng)子區(qū)，所述轉(zhuǎn)錄單元包含對(duì)于所述宿主而言為異源的核酸序列，而所述核酸序列的表達(dá)受到所述甘露糖操縱子的啟動(dòng)子區(qū)的控制。此外，本發(fā)明涉及這些載體用于異源表達(dá)編碼例如多肽、例如重組蛋白的核酸的用途。已經(jīng)描述了很多用于在原核系統(tǒng)中異源表達(dá)編碼例如多肽的核酸(結(jié)構(gòu)基因)的系統(tǒng)。為此，以包含可操作地連接于啟動(dòng)子的目標(biāo)結(jié)構(gòu)基因的核酸序列的載體轉(zhuǎn)化宿主，所述啟動(dòng)子是能夠使結(jié)構(gòu)基因被轉(zhuǎn)錄的核酸序列。通過(guò)適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)，啟動(dòng)子被激活并允許結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。誘導(dǎo)可以在陰性或陽(yáng)性控制下。在陰性控制誘導(dǎo)中，阻抑子與啟動(dòng)子結(jié)合并阻止結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。如果存在合適的誘導(dǎo)子，則阻抑子被失活而轉(zhuǎn)錄被允許。在陽(yáng)性控制誘導(dǎo)中，當(dāng)與激活子結(jié)合之后，啟動(dòng)子被激活，其中激活子與啟動(dòng)子的結(jié)合由合適的誘導(dǎo)子介導(dǎo)。典型的誘導(dǎo)子可以是原核宿主代謝所需的底物，例如，不同種類(lèi)的糖。本發(fā)明涉及陽(yáng)性可誘導(dǎo)系統(tǒng)，其中，在存在適當(dāng)?shù)牡孜锛凑T導(dǎo)子時(shí)，激活子與啟動(dòng)子結(jié)合，這會(huì)啟動(dòng)可操作地連接于所述啟動(dòng)子的基因的轉(zhuǎn)錄。到目前為止，原核宿主系統(tǒng)中的多數(shù)異源基因表達(dá)系統(tǒng)都專有性地依賴于細(xì)菌啟動(dòng)子的有限的集合。所以，可以用作誘導(dǎo)子的底物的數(shù)目也是有限的。此外，異源表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)率依賴于可利用的經(jīng)轉(zhuǎn)化的原核宿主的數(shù)目。因此，需要能夠生長(zhǎng)至高細(xì)胞密度的原核宿主系統(tǒng)，即，允許快速增殖而不在細(xì)胞分裂時(shí)喪失載體。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)提供下列新的載體而實(shí)現(xiàn)了這些和其它目標(biāo)，其將通過(guò)以下說(shuō)明書(shū)而變得明顯，所述新的載體包含可操作地連接于轉(zhuǎn)錄單元的甘露糖操縱子的啟動(dòng)子區(qū)，所述轉(zhuǎn)錄單元包含對(duì)于所述宿主而言為異源的核酸序列，而所述核酸序列的表達(dá)受到所述甘露糖操縱子的啟動(dòng)子區(qū)的控制。還提供了所述新的載體用于核酸序列在原核宿主中的受控的異源表達(dá)的用途；在宿主中可表達(dá)的分離且純化的核酸序列，其包含甘露糖操縱子的啟動(dòng)子區(qū)；以所述載體或所述分離且純化的核酸序列轉(zhuǎn)化的原核宿主；使用所述載體或所述分離且純化的核酸序列在宿主中生產(chǎn)多肽的方法；以及以所述載體或所述分離且純化的核酸序列轉(zhuǎn)化的原核宿主在發(fā)酵、特別是高細(xì)胞密度發(fā)酵中的用途。通過(guò)參考隨附的示例性附圖和隨附的權(quán)利要求，通過(guò)閱讀以下詳細(xì)描述，其它方面和優(yōu)點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)變得明顯。


圖1 用于繪制manP啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的來(lái)自枯草芽孢桿菌(B. subtilis) 的核酸序列，其中腺嘌呤核苷酸處的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)以高亮標(biāo)示，推導(dǎo)的-35和-10盒以斜體標(biāo)示，manR的終點(diǎn)和Iys基因的起點(diǎn)以箭頭標(biāo)示，限制性位點(diǎn)Bglll、XbaI, AflII和NdeI 以下劃線標(biāo)示。圖2 包含manP啟動(dòng)子的啟動(dòng)子區(qū)的核酸序列，鳥(niǎo)嘌呤核苷酸處的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)以高亮標(biāo)示，推導(dǎo)的-10和-35盒以斜體標(biāo)示，manR基因的起點(diǎn)以箭頭標(biāo)示，HindIII限制性位點(diǎn)和推定的ere序列以下劃線標(biāo)示。圖3 分別包含于pSU擬91、pSUN384. 1和pSUN385. 2中的獲自枯草芽孢桿菌的核酸序列，所述序列包含manR啟動(dòng)子的啟動(dòng)子區(qū)，IacZ的起點(diǎn)以箭頭標(biāo)示，限制性位點(diǎn)以下劃線標(biāo)示。圖4 根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體PSUN279. 2的質(zhì)粒圖譜。圖5 包含根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)粒pSUN279. 2、pSUN284. 1或pSUN291的枯草芽孢桿菌 3NA的β -半乳糖苷酶活性。圖6 獲自枯草芽孢桿菌的核酸序列，其包含來(lái)自枯草芽孢桿菌的manP啟動(dòng)子的啟動(dòng)子區(qū)，包括manR的C-末端，manR與manP之間的基因間區(qū)域被報(bào)告基因IacZ替換，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，-35和-10盒以粗體標(biāo)示，manR的終點(diǎn)和IacZ的起點(diǎn)以箭頭標(biāo)示，限制性位點(diǎn)以下劃線標(biāo)示。圖7 含有質(zhì)粒PSUN279. 2以及如圖6所示的含有不同長(zhǎng)度的核酸序列片段的其它質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌3NA的半乳糖苷酶活性。圖8 含有具有如圖3所示的核酸序列的載體pSU擬91、pSUN384. 1或pSUN345. 2 的枯草芽孢桿菌3NA的β -半乳糖苷酶活性。圖9 根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體ρ麗168. 1的質(zhì)粒圖譜。圖10的圖顯示了枯草芽孢桿菌3ΝΑ中ρ麗168. 1的質(zhì)粒穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果，其中含有質(zhì)粒的細(xì)胞的procental部分相對(duì)于世代數(shù)作圖。圖11-14的圖顯示了在運(yùn)行1至運(yùn)行4中，干生物質(zhì)濃度相對(duì)于發(fā)酵持續(xù)時(shí)間的對(duì)數(shù)作圖，以及在發(fā)酵運(yùn)行1至運(yùn)行4中，熒光信號(hào)(RFU)相對(duì)于發(fā)酵持續(xù)時(shí)間的作圖。圖15和16的圖是在發(fā)酵運(yùn)行5和運(yùn)行6中，熒光信號(hào)相對(duì)于發(fā)酵持續(xù)時(shí)間的作圖。圖17 根據(jù)實(shí)驗(yàn)如“質(zhì)粒ρ麗168. 1的構(gòu)建”而獲得的啟動(dòng)子起始區(qū)的示意結(jié)構(gòu)。圖18 質(zhì)粒pMW168. 1的構(gòu)建流程圖；和圖 19 SDS page 圖。發(fā)明詳述如本文所使用，提供了以下定義以促進(jìn)理解本發(fā)明?！霸谒拗髦锌杀磉_(dá)的載體”或“表達(dá)載體”是重組或合成產(chǎn)生的多核酸構(gòu)建體，其具有允許在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄特定核酸序列的一系列指定的多核酸元件。通常而言，這種載體包括轉(zhuǎn)錄單元，其包含可操作地連接于啟動(dòng)子的待轉(zhuǎn)錄的特定核酸序列。在宿主中可表達(dá)的載體可以是例如自主或自我復(fù)制性質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒。 術(shù)語(yǔ)“宿主”、“宿主細(xì)胞”和“重組宿主細(xì)胞”在本文中可相互替換地使用，是指其中導(dǎo)入了本發(fā)明的一種或多種載體或分離且純化的核酸序列的原核細(xì)胞。要理解，此類(lèi)術(shù)語(yǔ)不僅是指特定的主題細(xì)胞，而且是指此類(lèi)細(xì)胞的子代或潛在子代。由于突變或環(huán)境影響， 在隨后的世代中可能發(fā)生某些修飾，所以，此類(lèi)子代事實(shí)上可能與親代細(xì)胞不同，但是仍然包括在如本文使用的術(shù)語(yǔ)的范圍內(nèi)。術(shù)語(yǔ)“包括”一般意義是“包括”，也就是說(shuō)，允許存在一個(gè)或多個(gè)其它特征或成分。如本文使用的“啟動(dòng)子”是指控制轉(zhuǎn)錄單元之表達(dá)的核酸序列?！皢?dòng)子區(qū)”是能夠與細(xì)胞中的RNA聚合酶結(jié)合并起始下游(3’方向)編碼序列之轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)區(qū)。在啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)有負(fù)責(zé)結(jié)合RNA聚合酶的蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(共有序列)，例如推定的-35盒和ft~ibnow 盒(-10盒)。此外，啟動(dòng)子區(qū)可以包含轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)?！案事短遣倏v子”是指枯草芽孢桿菌的甘露糖操縱子。在甘露糖操縱子中鑒定了 3 個(gè)基因(Kunst F. N.等人,“The complete genome sequence of gram-positive bacterium Bacillus subtil is”，Nature 390，pages 249 to 256(1997))。第一個(gè)基因，manP，編碼甘露糖特異性酶成分(轉(zhuǎn)運(yùn)子)，其屬于果糖-通透酶家族。第二個(gè)基因，manA，編碼甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶，而第三個(gè)基因yjdF的功能是未知的。 在這3個(gè)基因的上游并與它們相同的方向上，有調(diào)節(jié)基因manR，其編碼ManR，ManR是甘露糖操縱子的激活子。由三個(gè)基因manP-manA-yjdF組成的甘露糖操縱子(以下合稱“manP”)處于manP 啟動(dòng)子控制之下，該啟動(dòng)子本身是陽(yáng)性調(diào)節(jié)的。另外一種啟動(dòng)子，manR啟動(dòng)子，負(fù)責(zé)manR的表達(dá)，manR對(duì)于manP啟動(dòng)子的甘露糖依賴性誘導(dǎo)是必需的。manR啟動(dòng)子區(qū)還包含manR基因的分解代謝物調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點(diǎn)(分解代謝物應(yīng)答元件(ere))。"Cre序列”是指位于分解代謝基因上游(5’方向)的核酸序列。ere序列結(jié)合分解代謝物控制蛋白(CCP)，阻止碳分解代謝物阻抑(CCR)中的分解代謝基因的表達(dá)?！案事短遣倏v子的啟動(dòng)子區(qū)”意指調(diào)節(jié)manP的表達(dá)以及具有或不具有ere序列的 manR的表達(dá)的啟動(dòng)子區(qū)。本文所提及的“manP啟動(dòng)子”至少包括_35區(qū)、Pribnow盒和ManR結(jié)合位點(diǎn)。本文所提及的“manR啟動(dòng)子”至少包括推定的-35區(qū)、I^ribnow盒、ManR結(jié)合位點(diǎn)和可選的ere序列。D-甘露糖也被稱作“甘露糖”，其是葡萄糖的2-差向立體異構(gòu)體并且存在于甘露聚糖和異甘露聚糖多糖、糖蛋白和多種其它糖綴合物中?！癈cpA^t思是“分解代謝物控制蛋白A”，其為普遍性調(diào)節(jié)蛋白，并且能夠激活或抑制一些分解代謝操縱子的激活。在甘露糖操縱子的情況下，CcpA通過(guò)與ere序列結(jié)合而發(fā)揮阻抑作用?！霸鰪?qiáng)子”是增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄單元之轉(zhuǎn)錄的核酸序列，與轉(zhuǎn)錄單元的身份、該序列相對(duì)于轉(zhuǎn)錄單元的位置或該序列的方向無(wú)關(guān)。本發(fā)明的載體可選地可以包括增強(qiáng)子。如本文使用的“轉(zhuǎn)錄單元”是指通常被轉(zhuǎn)錄為單一的RNA分子的核酸序列。轉(zhuǎn)錄單元可以包含一個(gè)基因(單順?lè)醋?或2個(gè)基因(雙順?lè)醋?或更多個(gè)基因(多順?lè)醋?， 它們編碼功能上相關(guān)的多肽分子。當(dāng)核酸分子被置于與另一核酸序列有功能上的關(guān)系時(shí)，其為“可操作地連接”。例如，如果啟動(dòng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則該啟動(dòng)子與該編碼序列可操作地連接；如果轉(zhuǎn)錄起始區(qū)例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)的位置是促進(jìn)多肽的翻譯，則該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)可操作地連接于編碼該多肽的核酸序列。可以通過(guò)在方便的限制性位點(diǎn)的連接而實(shí)現(xiàn)連接。如果此類(lèi)位點(diǎn)不存在，則根據(jù)常規(guī)做法使用合成的寡核苷酸適體或接頭。如本發(fā)明中提及的“核酸”或“核酸序列”或“分離且純化的核酸或核酸序列”可以是DNA、RNA或DNA/RNA雜合體。當(dāng)核酸或核酸序列位于載體中時(shí)，其通常是DNA。本文所提及的DNA可以是任何多聚脫氧核苷酸序列，包括例如雙鏈DNA，單鏈DNA，雙鏈DNA、其中一條或兩條鏈由兩個(gè)或更多個(gè)片段組成，雙鏈DNA、其中一條或兩條鏈具有連續(xù)的磷酸二酯骨架，含有一個(gè)或多個(gè)單鏈部分和一個(gè)或多個(gè)雙鏈部分的DNA，雙鏈DNA、其中DNA鏈?zhǔn)峭耆パa(bǔ)的，雙鏈DNA、其中DNA鏈僅是部分互補(bǔ)的，環(huán)狀DNA，共價(jià)閉合DNA，線性DNA，共價(jià)交叉連接DNA，cDNA,化學(xué)合成的DNA，半合成的DNA，生物合成的DNA，天然分離的DNA，酶消化的 DNA,剪切的DNA，標(biāo)記的DNA、例如放射標(biāo)記的DNA和熒光標(biāo)記的DNA，含有一個(gè)或多個(gè)非天然存在的核酸種類(lèi)的DNA。DNA序列可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)技術(shù)合成，例如，磷酸三酯法或通過(guò)自動(dòng)化合成方法和PCR方法。純化且分離的DNA序列也可以通過(guò)酶學(xué)技術(shù)產(chǎn)生。本文提及的RNA可以是例如單鏈RNA，cRNA,雙鏈RNA，雙鏈RNA、其中一條或兩條鏈由兩個(gè)或更多個(gè)片段組成，雙鏈RNA、其中一條或兩條鏈具有連續(xù)的磷酸二酯骨架，含有一個(gè)或多個(gè)單鏈部分和一個(gè)或多個(gè)雙鏈部分的RNA，雙鏈RNA、其中RNA鏈?zhǔn)峭耆パa(bǔ)的，雙鏈 RNA、其中RNA鏈僅是部分互補(bǔ)的，共價(jià)交聯(lián)的RNA，酶消化的RNA，剪切的RNA，mRNA，化學(xué)合成的RNA，半合成的RNA，生物合成的RNA，天然分離的RNA，標(biāo)記的RNA、例如放射標(biāo)記的RNA 和熒光標(biāo)記的RNA，含有一個(gè)或多個(gè)非天然存在的核酸種類(lèi)的RNA。“變體”或“序列的變體”意指與參考序列相差保守性核酸置換的核酸序列，其中一個(gè)或多個(gè)核酸被置換為具有相同性質(zhì)的其它核酸。變體還包括簡(jiǎn)并序列，具有刪除和插入的序列，只要此類(lèi)修飾序列顯示出與參考序列相同的功能(功能上等價(jià))。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”、“蛋白”、“多肽的”和“肽的”可相互替換地使用， 它們是指通過(guò)α氨基與相鄰殘基的羧基之間的肽鍵彼此連接起來(lái)的一系列氨基酸殘基。術(shù)語(yǔ)“分離且純化的核酸序列”是指根據(jù)本發(fā)明的核酸序列所處的狀態(tài)。核酸序列將不含或?qū)嵸|(zhì)上不含天然與其結(jié)合的物質(zhì)，例如在它們的天然環(huán)境下或它們的制備環(huán)境 (例如細(xì)胞培養(yǎng)物，當(dāng)此類(lèi)制備物是通過(guò)重組技術(shù)在體外或體內(nèi)進(jìn)行時(shí))下與其共存的其它核酸。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”、“轉(zhuǎn)化的”或“將核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞”意思是細(xì)胞外的核酸例如載體(其具有或不具有伴隨它的物質(zhì))進(jìn)入宿主細(xì)胞的任何過(guò)程。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”意思是其中導(dǎo)入了細(xì)胞外的核酸、并因此攜帶所述細(xì)胞外的核酸的細(xì)胞或其子代。所述核酸可以導(dǎo)入細(xì)胞中使得該核酸可作為染色體整合物或作為染色體外元件復(fù)制。使用例如表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞可以通過(guò)熟知的方法進(jìn)行，例如微注射、電穿孔、顆粒轟擊或通過(guò)化學(xué)方法，例如磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，描述于例如Maniatis等人1982，Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 或 Ausubel 等人 1994, Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons?！爱愒春怂嵝蛄小被颉爱愒从谒拗鞯暮怂嵝蛄小币馑际蔷幋a對(duì)于宿主而言為異源的表達(dá)產(chǎn)物(“異源表達(dá)”或“異源產(chǎn)物”)例如多肽的核酸序列，即源自不同于宿主的供體的核酸序列或化學(xué)合成的核酸序列，它們編碼對(duì)于宿主而言為異源的表達(dá)產(chǎn)物例如多肽。當(dāng)宿主是特定的原核物種時(shí)，異源核酸序列優(yōu)選源自不同的屬或科，更優(yōu)選來(lái)自不同的目或綱，特別是來(lái)自不同的門(mén)(division)，最特別是來(lái)自生物的不同的界(empire)。在導(dǎo)入宿主細(xì)胞之前，源自不同于宿主的供體的異源核酸序列可以被修飾，修飾是通過(guò)突變、插入、刪除或置換單一核酸或異源核酸序列的一部分，只要此類(lèi)修飾的序列顯示出與參考序列相同的功能(功能上等價(jià))。本文所提及的異源核酸序列還包括源自生物的不同的界(empire)的核酸序列，例如來(lái)自真核生物的(真核起源的)，例如已被用于噬菌體顯示文庫(kù)的人類(lèi)抗體，以及其中的單一核酸或核酸序列的一部分已經(jīng)根據(jù)原核宿主的 “密碼子使用情況”被修飾的那些。在本發(fā)明的意義內(nèi)，術(shù)語(yǔ)“異源核酸序列，，或“異源于宿主的核酸序列，，還包括衍生于宿主并編碼在該宿主中天然表達(dá)的多肽的核酸序列，其中所述核酸序列被插入到本發(fā)明的載體中并處于本發(fā)明的甘露糖操縱子的啟動(dòng)子區(qū)控制下。“轉(zhuǎn)錄起始區(qū)”是促進(jìn)轉(zhuǎn)錄起始的信號(hào)區(qū)，其包含用于核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列，例如 Shine Dalgarno 序列。通常而言，轉(zhuǎn)錄起始區(qū)位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的下游，并可操作地連接于待表達(dá)的基因?！稗D(zhuǎn)錄終止區(qū)”是指引起RNA聚合酶終止轉(zhuǎn)錄的序列。轉(zhuǎn)錄終止區(qū)通常是轉(zhuǎn)錄單元的一部分，其能夠避免其它附近基因的不想要的轉(zhuǎn)錄或從其它潛在啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，并且能夠增加mRNA的穩(wěn)定性。“抗體”是指在被抗原刺激之后，由免疫系統(tǒng)的B細(xì)胞產(chǎn)生的一類(lèi)漿蛋白。哺乳動(dòng)物(例如人類(lèi))抗體是IgG、M、A、E或D類(lèi)別的免疫球蛋白。用于本發(fā)明目的的術(shù)語(yǔ)“抗體”包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、抗獨(dú)特型抗體和存在于自身免疫疾病、例如糖尿病、多發(fā)性硬化和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的自身抗體以及嵌合抗體。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在宿主中可表達(dá)的載體，其包含可操作地連接于轉(zhuǎn)錄單元的甘露糖操縱子的啟動(dòng)子區(qū)，所述轉(zhuǎn)錄單元包含對(duì)于該宿主而言為異源的核酸序列， 而所述核酸序列的表達(dá)受到所述甘露糖操縱子的啟動(dòng)子區(qū)的控制。根據(jù)本發(fā)明的載體優(yōu)選為自主或自我復(fù)制型質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒。宿主/載體的多種組合可用于表達(dá)本發(fā)明的核酸序列。例如，有用的表達(dá)載體可以由染色體的區(qū)段、非染色體和/或合成的核酸序列組成。合適的載體包括具有特定宿主范圍的載體，例如分別特異于例如枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的載體，以及具有寬宿主范圍的載體，例如用于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌的載體。可以使用“低拷貝”、“中等拷貝”以及“高拷貝”質(zhì)粒。例如，在枯草芽孢桿菌中，低拷貝質(zhì)粒是pAMbetal，中等拷貝質(zhì)粒是pBS72衍生物，高拷貝質(zhì)粒是PUB110。根據(jù)本發(fā)明，甘露糖操縱子的啟動(dòng)子區(qū)分別包括manR啟動(dòng)子區(qū)和manP啟動(dòng)子區(qū)。圖1顯示了來(lái)自枯草芽孢桿菌的核酸序列，包括manR的C末端、manR與manP之間的基因間區(qū)域、后跟作為報(bào)告基因的溶葡球菌酶基因lys。包含manP的啟動(dòng)子區(qū)的本發(fā)明的核酸序列優(yōu)選包括圖1的核酸序列，從bp_80至Iys的起始密碼子(SEQ ID NO :1)，更優(yōu)選為圖1的核酸序列，從bp-80開(kāi)始并包括bp-1， 艮口，bp+1處的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)A的上游(SEQ ID NO 2)。圖2和圖3顯示了來(lái)自枯草芽孢桿菌的核酸序列，包括manR的啟動(dòng)子區(qū)，bp+Ι處的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)G，推定的ere序列，bp+1與manR之間的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，以及manR的一部分， 其中manR被IacZ替換。包含manR的啟動(dòng)子區(qū)的本發(fā)明的核酸序列優(yōu)選包括圖3的核酸序列，從bp-122至IacZ的起始密碼子(SEQ ID NO 3)，更優(yōu)選，圖3的核酸序列，從bp-122至 bp+7，即包括推定的ere序列(SEQ ID NO :4)，特別地，圖3的核酸序列，從bp-122至bp_l， 艮口，bp+1處的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)G的上游(SEQ ID NO 5)。manP和manR的啟動(dòng)子區(qū)都包含ManR的結(jié)合位點(diǎn)。本發(fā)明還包括互補(bǔ)于SEQ ID NO 1-5任一項(xiàng)的序列及其變體。 用于本發(fā)明中的甘露糖操縱子的啟動(dòng)子區(qū)，例如manP啟動(dòng)子區(qū)、manR啟動(dòng)子區(qū) (含有或不含ere序列)以及根據(jù)序列SEQ ID NO 1_5的啟動(dòng)子區(qū)，其互補(bǔ)序列或其變體， 通常是來(lái)自枯草芽孢桿菌的甘露糖操縱子或來(lái)自其它原核生物的功能等價(jià)的啟動(dòng)子區(qū)，特別是長(zhǎng)桿菌科(bacilaceae)的生物。其它原核生物的功能等價(jià)的啟動(dòng)子區(qū)包括可以被 D-甘露糖誘導(dǎo)的啟動(dòng)子區(qū)，即，相對(duì)于不存在甘露糖時(shí)，在存在甘露糖時(shí)具有更高表達(dá)活性的啟動(dòng)子區(qū)。在很多原核生物例如硬壁菌門(mén)(Firmicutes)例如枯草芽孢桿菌中，甘露糖操縱子參與D-甘露糖的代謝?？莶菅挎邨U菌可以使用很多不同的糖作為碳源。己糖例如葡萄糖和D-甘露糖主要通過(guò)磷酸烯醇丙酮酸碳水化合物磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTQ攝取。在PTS中，各個(gè)己糖在攝取過(guò)程中同時(shí)被磷酸化并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞。特異性糖底物的攝取和利用經(jīng)歷碳分解代謝物阻抑 (CCR)。在存在葡萄糖(枯草芽孢桿菌的優(yōu)選糖底物)的情況下，用于攝取和利用其它底物的基因例如甘露糖操縱子的轉(zhuǎn)錄被抑制。已經(jīng)廣泛地研究了枯草芽孢桿菌中的葡萄糖依賴性CCR的機(jī)制，其是本領(lǐng)域已知的(Stiilke J.等人，"Regulation of carbon catabolism in Bacillus species，，，in Annu. Rev. Microbiol. 54，2000，pages 849-880)。根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄單元通常還包括處于所述轉(zhuǎn)錄單元的翻譯起始點(diǎn)(起始密碼子)上游的翻譯起始區(qū)，而翻譯起始區(qū)可操作地連接于核酸序列。翻譯起始區(qū)通常位于轉(zhuǎn)錄單元的翻譯起始點(diǎn)(可以是ATG、GTG或TTG)的緊接上游。翻譯起始區(qū)可以是甘露糖操縱子中的manP基因或manR基因的轉(zhuǎn)錄單元的翻譯起始區(qū)。甘露糖操縱子的manP基因或manR基因的翻譯起始區(qū)可以部分或完全被其它翻譯起始區(qū)替換。例如，可以使用tufA(延伸因子Tu)和gsiB(應(yīng)激蛋白JUrgen等人，1998， Mol. Gen. Genet. 258,538-545)的翻譯起始區(qū)，二者都是來(lái)自枯草芽孢桿菌。以下分別顯示了 tufA和gsiB的核酸序列，起始密碼子以粗體標(biāo)示，限制性位點(diǎn)以下劃線標(biāo)示，Shine-Dalgarno序列以高亮標(biāo)示。
權(quán)利要求
1.在原核宿主細(xì)胞中可表達(dá)的載體，其包含可操作地連接于轉(zhuǎn)錄單元的枯草芽孢桿菌的甘露糖操縱子的甘露糖可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，所述轉(zhuǎn)錄單元包括編碼多肽的異源核酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的載體，其中所述載體包含完整的或一部分的調(diào)節(jié)基因manR的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的載體，其中所述啟動(dòng)子是manP啟動(dòng)子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的載體，其中所述manP啟動(dòng)子包括選自SEQID N0:1和 SEQ ID NO :2的序列，其互補(bǔ)序列或其變體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的載體，其中所述啟動(dòng)子是manR啟動(dòng)子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的載體，其中所述manR啟動(dòng)子包括選自SEQIDNO :3、SEQ ID NO 4 和SEQ ID NO :5的序列，其互補(bǔ)序列或其變體。
7.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的載體，其中所述載體包括處于所述異源核酸序列上游的分解代謝物應(yīng)答元件。
8.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的載體，其中所述載體包括位于所述異源核酸序列下游的轉(zhuǎn)錄終止序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的載體，其中所述轉(zhuǎn)錄終止序列衍生自枯草芽孢桿菌的tufA基因的 3，區(qū)。
10.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的載體，其中所述載體是在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中可復(fù)制的穿梭載體。
11.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的載體，其中所述載體包括質(zhì)粒PUC18的復(fù)制起始點(diǎn)和/或 PBS72復(fù)制子或r印基因以及質(zhì)粒pUBllO的復(fù)制起始點(diǎn)。
12.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的載體，其中所述異源核酸序列編碼抗體或其片段。
13.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的載體，其中所述manP基因或manR基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)被另一基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)替換。
14.權(quán)利要求13的載體，其中所述manP基因或manR基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)被tufA基因或 gsiB基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)替換。
15.枯草芽孢桿菌的甘露糖操縱子的甘露糖可誘導(dǎo)啟動(dòng)子區(qū)的分離且純化的核酸序列，其互補(bǔ)序列或其變體。
16.權(quán)利要求15的分離且純化的核酸序列，其中所述序列包括SEQID N0:l_5的任意項(xiàng)，其互補(bǔ)序列或其變體。
17.以權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的載體或以權(quán)利要求15或16任意項(xiàng)的核酸序列轉(zhuǎn)化的原核宿主細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的原核宿主細(xì)胞，其中所述原核宿主細(xì)胞經(jīng)歷碳分解代謝物阻抑并包括磷酸烯醇丙酮酸碳水化合物磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18的原核宿主細(xì)胞，其中所述原核宿主細(xì)胞是革蘭氏陽(yáng)性的。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19任意項(xiàng)的原核宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞屬于硬壁菌門(mén) (Firmicutes)。
21.用于在原核宿主細(xì)胞中產(chǎn)生多肽的方法，包括以下步驟構(gòu)建權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的載體；以所述載體轉(zhuǎn)化原核宿主細(xì)胞；通過(guò)使轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下在細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)而允許表達(dá)所述多肽；和，從所述細(xì)胞或從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收多肽。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述宿主細(xì)胞首先在存在不同于誘導(dǎo)子的碳源的情況下生長(zhǎng)，然后在第二步驟中在存在誘導(dǎo)子的情況下生長(zhǎng)。
23.權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的載體或權(quán)利要求15和16的任意項(xiàng)的分離且純化的核酸序列用于調(diào)節(jié)編碼多肽的異源核酸序列在原核宿主細(xì)胞中的表達(dá)的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及在原核宿主中可表達(dá)的載體，和包含枯草芽孢桿菌的甘露糖操縱子的甘露糖可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的核酸序列，其中所述載體和核酸序列可分別適合用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以表達(dá)編碼多肽的異源核酸序列，尤其是在高細(xì)胞密度發(fā)酵中。
文檔編號(hào)C12N15/75GK102471774SQ201080035390
公開(kāi)日2012年5月23日 申請(qǐng)日期2010年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月10日
發(fā)明者C·基茨亞克, J·埃爾滕布克納, 孫天齊 申請(qǐng)人:龍沙股份公司