專利名稱：檢測結(jié)核性分枝桿菌復(fù)合群和分枝桿菌屬的組合物以及使用該組合物用多重實(shí)時(shí)pcr同 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可區(qū)別地檢測結(jié)核性分枝桿菌復(fù)合群(M. tuberculosis complex)和分枝桿菌屬(myccAacteria genus)的組合物以及使用該組合物通過實(shí)時(shí)多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT PCR)同時(shí)分析結(jié)核性分枝桿菌(M. tuberculosis)和分枝桿菌屬。更具體而言，本發(fā)明涉及一種檢測結(jié)核性分枝桿菌和分枝桿菌屬的組合物，其包含(i)靶向結(jié)核性分枝桿菌特異性基因(IS6110)的引物和/或探針；和(ii)靶向分枝桿菌屬特異性基因(內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS))的引物和/或探針；和非必需地，(iii)靶向作為內(nèi)對照的源自植物的基因的引物和/或探針。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是一種在人類歷史中呈現(xiàn)出最高死亡率的傳染病，其是由0. 2 0. 5 μ m 厚、1 4 μ m長且桿狀的分枝桿菌屬菌株引起的。分枝桿菌屬包括感染人和許多種動(dòng)物并導(dǎo)致如結(jié)核病的呼吸系統(tǒng)疾病和如麻風(fēng)病的疾病的各種分枝桿菌菌株，并且迄今已知大約100個(gè)物種(Shirmick TM等人， Mycobacterial taxonomy. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect Dis. 1994 ；13(11) :884-901)。盡管已知結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis)為引起人患結(jié)核病的最重要的分枝桿菌，但是有結(jié)核分枝桿菌、很少出現(xiàn)的牛分枝桿菌(mycobacterium bovis) 等。已知麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacterium leprae)引起麻風(fēng)病(Shinnick, Τ. M.禾口 Good, R. C. Mycobacterial taxonomy. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1994 ； 13 (11) 884-901)。在不發(fā)達(dá)國家中結(jié)核病是一種流行的疾病，在韓國，每年遇到120，000例結(jié)核分枝桿菌新增病例，2003年報(bào)道和計(jì)數(shù)的新結(jié)核病感染為30，687例(相當(dāng)于每十萬人64 例)，并且在30個(gè)OECD成員國中，韓國的結(jié)核病死亡數(shù)目恥辱地位居首位(2004年國家統(tǒng)計(jì)局(National Statistical Office)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù))。近來，獲得性免疫缺陷綜合征(AIDQ患者和其他免疫缺陷綜合征患者、具有較弱免疫系統(tǒng)的嬰兒等正在遭受非結(jié)核性分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria (NTM))的感染，而且表現(xiàn)出與結(jié)核性分枝桿菌感染相關(guān)癥狀相似的臨床癥狀的非典型性結(jié)核病患者正在增加。NTM的實(shí)例包括多種非結(jié)核性分枝桿菌(non-tuberculosis mycobacteria), 如鳥分枝桿菌(mycobacterium avium)(胞內(nèi)鳥分枝桿菌(M. avium-intracellulare) 或鳥分枝桿菌復(fù)合群(M. avium complex))、偶發(fā)分枝桿菌(M. fortuitum)、龜分枝桿菌 (M. chelonae)、戈登氏分枝桿菌(M. gordonae)、斯氏分枝桿菌(M. szulagai)、堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii)、日內(nèi)瓦分枝桿菌(M. genavense) (Barnes, P. F.等人，Tuberculosis in patients with human immunodeficiency virus infection. N. Engl. J. Med.1991 ；324(23) :1644-1650)。這些NTM中的許多種類表現(xiàn)出對結(jié)核性分枝桿菌藥物的多藥耐藥性并且難以治療(Kam, K. M.等人，Trends in Multidrug-Resistant Mycobacterium tuberculosis in Relation to Sputum Smear Positivity in Hong Kong, 1989-1999. Clin. Infect. Dis. 2002 ；34(3) :324-329)。已知NTM中最常見的鳥分枝桿菌復(fù)合群(MAC)對原發(fā)性結(jié)核藥物表現(xiàn)出比結(jié)核性分枝桿菌低10 100倍的效能，并且美國胸科學(xué)會(huì)(American Thoracic Society(ATS)) 提出了關(guān)于由各種非結(jié)核性分枝桿菌菌種引起的疾病的診斷和治療的指導(dǎo)方針(American Thoracic Society, Diagnosis and treatment of disease caused by nontuberculous mycobacteria. Am J Respir Crit Care Med. 1997 ；156 (2) :S1_S25)。因此，非結(jié)核性分枝桿菌具有與結(jié)核性分枝桿菌非常相似的癥狀，但是就治療藥物而言它們可不同于結(jié)核性分枝桿菌。為了分別適宜地治療結(jié)核性分枝桿菌和非結(jié)核性分枝桿菌，需要準(zhǔn)確地區(qū)分結(jié)核性分枝桿菌與非結(jié)核性分枝桿菌并且對其早期檢測和診斷。診斷結(jié)核病的一般方法包括患者的臨床癥狀測試、結(jié)核菌素皮膚反應(yīng)測試、X射線顯像、結(jié)核性分枝桿菌測試等。結(jié)核菌素測試是最容易的方法，簡單易行，但是在由嚴(yán)重的結(jié)核病、麻疹和免疫抑制引起的無反應(yīng)性的情況下常常表現(xiàn)假陰性。大約25%的X射線顯像會(huì)根據(jù)檢測者的能力而有所不同，因此使用X射線顯像的診斷取決于檢測者發(fā)現(xiàn)異常陰影的能力和檢測者準(zhǔn)確地判斷該異常陰影的能力。結(jié)核性分枝桿菌檢測是最準(zhǔn)確的診斷結(jié)核病的方法并且包括涂片測試、培養(yǎng)測試、分子診斷測試等。涂片測試主要使用染色法，其中通過Ziehl-Neelsen染色確定耐酸性。此方法確保簡單和快速地獲得結(jié)果，但是不能區(qū)分結(jié)核性分枝桿菌與非結(jié)核性分枝桿菌，而且具有低靈敏性。培養(yǎng)測試在一定程度上具有高靈敏性，即，即使在Iml樣品中只有大約10個(gè)細(xì)菌存在也可檢出細(xì)菌，并且培養(yǎng)測試能夠分離和準(zhǔn)確診斷結(jié)核性分枝桿菌。此方法需要長的時(shí)間周期，例如，受過良好訓(xùn)練的研究人員進(jìn)行培養(yǎng)和觀察需要4 8周，因此對于治療是不利、不適合的。BACTEC (Becton Dickinson, US)是一種新開發(fā)的培養(yǎng)方法，其中將桿菌接種到含有C14棕櫚酸鹽的液體培養(yǎng)基中，并且從使用放射性同位素計(jì)算的生長商數(shù)估計(jì)桿菌代謝產(chǎn)生的wCD2的量。此方法平均起來能夠在16天之后獲得結(jié)果，但是不利地是需要設(shè)備和專業(yè)人員來處理放射性同位素。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)接著電泳是一種在2 3小時(shí)內(nèi)通過擴(kuò)增特異性基因位點(diǎn)而快速和準(zhǔn)確地確定結(jié)核性分枝桿菌存在的方法。此方法能夠在一天內(nèi)以95%以上的靈敏性和特異性從臨床樣品中檢測結(jié)核性分枝桿菌，因此是有用的(Wilson，S. Μ.等人， Progress toward a simplified polymerase chain reaction and its application to diagnosis of tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 1993 ；31 (4) :776-78)。然而，此方法的不利之處在于，具有攜帶污染的高風(fēng)險(xiǎn)并且需要專業(yè)人員 (Noordhoek，G. Τ.等人，Sensitivity and specificity of PCR for detection of Mycobacterium tuberculosis :a blind comparison study among seven laboratories.J.Clin. Microbiol. 1994 ；32(2) :277-284)。同時(shí)，在結(jié)核病診斷中，PCR測試在涂片陽性樣品中具有相當(dāng)高的靈敏性和特異性，并且應(yīng)當(dāng)考慮，耐酸細(xì)菌涂片陽性和PCR陰性樣品可被認(rèn)為是被NTM感染的事實(shí)。NTM肺病高發(fā)的美國建議，當(dāng)確定是否存在PCR抑制劑以及被試者再次測試為陰性時(shí)，耐酸細(xì)菌涂片陽性和PCR陽性被試者暫時(shí)地診斷為結(jié)核病，耐酸細(xì)菌涂片陽性和PCR 陰性被試者暫時(shí)地診斷為NTM。完成最終的NTM感染診斷花費(fèi)4 8周的培養(yǎng)時(shí)間(疾病控制禾口予頁防中心(Centers for Disease Control and Prevention (CDC)). Update :Nucleic acid amplification tests for tuberculosis. MMWR Morb. Mortal, ffkly. Rep. 2000 ；49 593-4)。近來，可以根據(jù)這些指導(dǎo)方針檢測NTM感染，但是，如可能，NTM的直接檢測將在臨床上更有用。在韓國，結(jié)核病的發(fā)病率高而NTM疾病低發(fā)。因此，一般認(rèn)為耐酸細(xì)菌涂片陽性被試者是感染了結(jié)核病，并且通常進(jìn)行抗結(jié)核病藥物治療。然而，近來，在韓國，NTM和NTM 疾病的識(shí)別率提高了，NTM可以在免疫功能弱的那些人中引起疾病，不易診斷，由于高耐藥性比例而難以治療，并且具有高復(fù)發(fā)率(Scientific committee in Korean academy of tuberculosis and respiratory disease. National survey of mycobacterial diseases other than tuberculosis in Korea. Tuberc. Respir. Dis. 1995 ；42 :277-94.)。因此，日益需要可區(qū)別地診斷NTM的方法。最近的檢測NTM的方法包括AFB染色，通常用于使用分子生物學(xué)方法(包括使用限制性內(nèi)切酶的PCR-RFLP和使用特異性探針的PCR雜交)區(qū)分分枝桿菌種類的方法。所有這些方法的靈敏性都低，并且不利地需要在先培養(yǎng)或者牽涉復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)步驟，因此不適合用于早期快速檢測結(jié)核性分枝桿菌和分枝桿菌屬。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題因此，本發(fā)明致力于解決上述問題和其他的仍然有待解決的技術(shù)問題。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種對IS6110 (結(jié)核性分枝桿菌特異性基因位點(diǎn))具有優(yōu)異的靈敏性的引物和/或探針，從而準(zhǔn)確地診斷結(jié)核性分枝桿菌。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測在分枝桿菌屬中普遍存在的ITS基因的高度特異性基因位點(diǎn)并因此具有優(yōu)異的靈敏性的引物和/或探針，從而確定分枝桿菌屬(非結(jié)核性分枝桿菌)的存在。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種使用所述引物和/或探針通過實(shí)時(shí)多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)同時(shí)檢測結(jié)核性分枝桿菌復(fù)合群和非結(jié)核性分枝桿菌的方法。技術(shù)方案1.檢測結(jié)核件分枝桿菌或分枝桿菌屬的引物本發(fā)明涉及一種可區(qū)別地檢測結(jié)核性分枝桿菌和非結(jié)核性分枝桿菌的組合物，其包含含有No. 1堿基序列和kq. No. 2堿基序列中的一種或多種的引物；和含有kq. No. 3堿基序列 kq. No. 11堿基序列中的一種或多種的引物。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及一種可區(qū)別地檢測結(jié)核性分枝桿菌和非結(jié)核性分枝桿菌的組合物，其包含含有No. 1堿基序列的引物和含有kq. No. 2堿基序列的引物；或者含有kq. No. 3堿基序列 kq. No. 9堿基序列中的一種或兩種或更多種的引物和含有kq. No. 10堿基序列 kq. No. 11堿基序列中的一種或兩種或更多種的引物兩者。更優(yōu)選地，本發(fā)明涉及一種可區(qū)別地檢測結(jié)核性分枝桿菌和非結(jié)核性分枝桿菌的組合物，其包含含有No. 1堿基序列的引物；含有kq. No. 3堿基序列 kq. No. 9堿基序列中的一種或兩種或更多種的引物；和含有No. 10堿基序列 kq. No. 11堿基序列中的一種或兩種或更多種的引物。本文所用術(shù)語“含有kq. No. χ堿基序列的引物”包括具有95%以上的序列相同性的堿基序列。例如，在引物是20bp的情況下，當(dāng)20bp中的2或更多bp不同的情況下，解鏈溫度的下降5度以上，因此得到不好的結(jié)果，而在其只有Ibp不同的情況下，當(dāng)PCR過程中在稍微下降的退火溫度下進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，可以得到同一結(jié)果。在本說明書中，以下，為了更好地說明，“含有^^. No. χ堿基序列的引物”將簡稱為 "Seq. No. χ 引物”。在本說明書中，Seq. No. 1引物和Seq. No. 2引物是靶向IS6110基因位點(diǎn)(結(jié)核性分枝桿菌復(fù)合群特異性基因位點(diǎn))的引物。通常，“結(jié)核性分枝桿菌”狹義地指結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis)。本發(fā)明中，“結(jié)核性分枝桿菌”廣義地指結(jié)核分枝桿菌以及牛分枝桿菌、田鼠分枝桿菌(mycobacterium microti)禾口非洲分枝桿菌(mycobacterium africanum)。在一些情況下，將其稱為“結(jié)核性分枝桿菌復(fù)合群”或“TB復(fù)合群”。IS6110基因是在結(jié)核性分枝桿菌復(fù)合群(如結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌)中發(fā)現(xiàn)的插入序列。已知結(jié)核性分枝桿菌復(fù)合群包含10 12個(gè)拷貝的IS6110(IS6110廣泛用于結(jié)核病的 PCR 診斷)(Thierry D.等人，J. Clin. Microbiol. 1990 ；28 (12) :2668-2673) 然而，據(jù)Kent等人報(bào)道，取決于引物位置的選擇，IS6110表現(xiàn)出不同的假陽性風(fēng)險(xiǎn)比率 (J.Clin. Microbiol. 1995 ；33(9) :2290-2293)。因此，本發(fā)明的發(fā)明人通過堿基序列分析研究了具有低假陽性風(fēng)險(xiǎn)的位點(diǎn)。結(jié)果， 從下列實(shí)施例中可以看出，No. 1引物和kq. No. 2引物是只擴(kuò)增結(jié)核性分枝桿菌復(fù)合群的IS6110基因并且在結(jié)核性分枝桿菌復(fù)合群的IS6110基因位點(diǎn)中表現(xiàn)出97%以上的相當(dāng)高的靈敏性和99%以上的陽性預(yù)測率(這說明假陽性的風(fēng)險(xiǎn)非常低)的引物堿基序列。 這樣表現(xiàn)出高靈敏性和陽性預(yù)測率的引物迄今還未發(fā)現(xiàn)過。因此，當(dāng)使用kq. No. 1引物、Seq. No. 2引物或其組合時(shí)，可以高度可靠地檢測結(jié)核性分枝桿菌復(fù)合群。為了確定非結(jié)核性分枝桿菌的存在與否，分枝桿菌的識(shí)別是重要的。關(guān)于這一點(diǎn)， 在分枝桿菌屬中rpoB基因是共有的，因此眾所周知，rpoB的存在可以用于識(shí)別分枝桿菌物種(Lee，Hye-Young，等人，韓國專利公開 No. 10-2001-0038701)。然而，該專利使用PCR-RFLP，因此問題在于，例如，由于低靈敏性而必需進(jìn)行在先培養(yǎng)并且實(shí)驗(yàn)步驟復(fù)雜，因此不適合用于早期快速檢測結(jié)核性分枝桿菌復(fù)合群和分枝桿菌
jM ο因此，為了解決這些問題，本發(fā)明人開發(fā)了一種新的特異性針對rpoB基因位點(diǎn)的引物，該引物形成適合用于實(shí)時(shí)PCR的IOObp以下的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(Kang Jin kok等人， 韓國專利申請No. 2008-0090156)。
然而，rpoB是編碼RNA聚合酶β亞單位的基因，并且從該申請的特異性測試結(jié)果可以看出，許多種微生物都沒有表現(xiàn)出陽性，但是表現(xiàn)出與結(jié)核病相似的肺炎癥狀的諾卡氏菌屬(Nocardia genus)微生物和與分枝桿菌屬相似的紅球菌屬(rhodococcus genus) 表現(xiàn)出陽性，這是由于在一些微生物中存在執(zhí)行共同功能的相似堿基序列。同時(shí)，為了確定非結(jié)核性分枝桿菌的存在，分枝桿菌屬的識(shí)別是重要的。眾所周知，ITS基因以及rpoB基因包含在分枝桿菌屬中，因此用于識(shí)別細(xì)菌種類(Kim In Soo等人，韓國專利No. 0725579)。然而，該專利使用的引物為了用于PCR反向雜交而形成大小為約250 450bp的 PCR產(chǎn)物，因此不利地不適合用于快速檢測的實(shí)時(shí)PCR。因此，本發(fā)明人開發(fā)了形成大小適合用于ITS位點(diǎn)的實(shí)時(shí)PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物的引物。 也就是說，Seq. No. 3 11引物是靶向ITS基因位點(diǎn)(分枝桿菌屬特異性基因位點(diǎn))的引物。這些引物形成大小為IOObp以下的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，這些引物有利地確保分枝桿菌屬被相當(dāng)可靠地且快速地檢測并表現(xiàn)出比以往更高的特異性，這是因?yàn)樗鼈儾粫?huì)與諾卡氏菌屬微生物和紅球菌屬微生物反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的檢測結(jié)核性分枝桿菌或分枝桿菌屬的組合物可以進(jìn)一步有選擇地包含內(nèi)對照引物。該內(nèi)對照用于確定是否發(fā)生了假陰性問題，也就是說，PCR反應(yīng)正常進(jìn)行。 無論樣本中是否存在結(jié)核性分枝桿菌或分枝桿菌，可以隨機(jī)地選擇正常表達(dá)的基因。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述內(nèi)對照引物可為加入到所有樣本中的源自植物的基因特異性引物。該源自植物的基因優(yōu)選為凝集素，并且凝集素基因特異性引物可為含有kq. No. 15堿基序列的引物或者含有kq. No. 16堿基序列的引物。在本發(fā)明中，在下表1中給出kq. No. 1 11引物、kq. No. 15引物和kq. No. 16 引物的堿基序列。[表1]引物的堿基序列
權(quán)利要求
1.一種可區(qū)別地檢測結(jié)核性分枝桿菌和非結(jié)核性分枝桿菌的組合物，其包含含有kq. No. 1堿基序列和kq. No. 2堿基序列中的一種或多種的引物；和含有kq. No. 3堿基序列 kq. No. 11堿基序列中的一種或多種的引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述組合物包含含有No.1堿基序列的引物；和含有No. 2堿基序列的引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述組合物包含含有No.3堿基序列 Seq. No. 9堿基序列中的一種或兩種或更多種的引物；和含有kq. No. 10堿基序列 kq. No. 11堿基序列中的一種或兩種或更多種的引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述組合物包含含有kq. No. 1堿基序列的引物；含有kq. No. 2堿基序列的引物；含有kq. No. 3堿基序列 kq. No. 9堿基序列中的一種或兩種或更多種的引物；和含有kq. No. 10堿基序列 kq. No. 11堿基序列中的一種或兩種或更多種的引物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的組合物，其進(jìn)一步包含內(nèi)對照引物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中，所述內(nèi)對照引物是源自植物的基因特異性引物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中，所述源自植物的基因是凝集素，并且所述源自植物的基因特異性引物包括含有No. 15堿基序列的引物和含有kq. No. 16堿基序列的引物中的一種或兩種或更多種。
8.一種檢測結(jié)核性分枝桿菌(M. tuberculosis)的組合物，其包含含有kq. No. 1堿基序列的正義引物和含有No. 2堿基序列的反義引物中的一種或兩種或更多種，作為特異性針對結(jié)核性分枝桿菌的IS6110基因的引物。
9.一種檢測分枝桿菌屬的組合物，其包含含有kq. No. 3堿基序列 kq. No. 9堿基序列的正義引物中的一種或兩種或更多種；含有No. 10堿基序列 kq. No. 11堿基序列的反義引物中的一種或兩種或更多種引物；或其組合，作為特異性針對分枝桿菌屬ITS 基因的引物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中，所述特異性針對分枝桿菌屬ITS基因的引物形成長度為IOObp以下的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
11.一種檢測結(jié)核性分枝桿菌或分枝桿菌屬的組合物，其包含選自12堿基序列的探針、含有No. 13堿基序列的探針和含有kq. No. 14堿基序列的探針中的一種或兩種或更多種。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中，所述探針用熒光物質(zhì)在其5’末端和3’末端標(biāo)記，并且在5’末端標(biāo)記的熒光物質(zhì)(報(bào)道分子)和在3’末端標(biāo)記的熒光物質(zhì)(猝滅物)相互干擾。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，其中，所述在5’末端標(biāo)記的熒光物質(zhì)選自6-羧基熒光素(FAM)、六氯-6-羧基熒光素(HEX)、四氯-6-羧基熒光素和花青-5 (C0)中，而所述在3’末端標(biāo)記的熒光物質(zhì)為6-羧基四甲基若丹明(TAMRA)或黑洞猝滅劑-1，2，3(BHQ-1， 2,3)。
14.一種使用實(shí)時(shí)PCR測定區(qū)分、檢測和分析結(jié)核性分枝桿菌和分枝桿菌屬的組合物，其包含含有kq. No. 1堿基序列和kq. No. 2堿基序列中的一種或兩種或更多種的引物； 含有kq. No. 3堿基序列 kq. No. 11堿基序列中的一種或兩種或更多種的引物；和含有kq. No. 12堿基序列 kq. No. 14堿基序列中的一種或兩種或更多種的探針。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物，其進(jìn)一步包含 內(nèi)對照引物；和內(nèi)對照探針。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的組合物，其中，所述內(nèi)對照引物為含有kq.No. 15堿基序列的正義引物或者含有No. 16堿基序列的反義引物，并且所述內(nèi)對照探針為含有kq. No. 17堿基序列的探針。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的組合物，其中，所述組合物包含(i)特異性針對結(jié)核性分枝桿菌IS6110基因的引物和探針混合物，其包含含有kq. No. 1堿基序列的正義引物和含有kq. No. 2堿基序列的反義引物；以及含有kq. No. 12堿基序列的探針；( )特異性針對分枝桿菌屬ITS基因的引物和探針混合物，其包含含有kq. No. 3堿基序列 No. 9堿基序列的正義引物和含有kq. No. 10堿基序列 kq. No. 11堿基序列的反義引物；以及含有No. 13堿基序列的探針和/或含有kq. No. 14堿基序列的探針；(iii)特異性針對內(nèi)對照基因的引物和探針混合物，其包含含有No.15堿基序列的正義引物和含有kq. No. 16堿基序列的反義引物；以及含有kq. No. 17堿基序列的探針； 禾口(iv)PCR反應(yīng)混合物，其包含緩沖液、DNA聚合酶、dNTP和無菌蒸餾水。
18.—種結(jié)核性分枝桿菌分析試劑盒，其包含根據(jù)權(quán)利要求17所述的用于分析的組合物。
19.一種使用根據(jù)權(quán)利要求17所述的組合物分析結(jié)核性分枝桿菌或分枝桿菌屬的方法，其包括(1)將用于分析的組合物與從樣本中提取的細(xì)菌DNA混合以制備用于基因分析的樣本；(2)使所述用于基因分析的樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR以得到PCR產(chǎn)物；(3)定量PCR產(chǎn)物以得到定量曲線；和(4)使用所述定量曲線定量在所述從樣本中提取的細(xì)菌DNA中存在的IS6110特異性基因、ITS特異性基因和內(nèi)對照特異性基因。
20.—種ITS基因特異性引物，其包含kq. No. 3堿基序列 kq. No. 11堿基序列中的一種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測結(jié)核性分枝桿菌(M.tuberculosis)和分枝桿菌屬的組合物，其包含(i)靶向結(jié)核性分枝桿菌特異性基因(IS6110)的引物和/或探針；和(ii)靶向分枝桿菌屬特異性基因(內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS))的引物和/或探針；和非必需地，(iii)靶向作為內(nèi)對照的源自植物的基因的引物和/或探針。當(dāng)使用所述組合物進(jìn)行實(shí)時(shí)多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)時(shí)，可以通過單個(gè)反應(yīng)檢測非結(jié)核性分枝桿菌和分枝桿菌屬，因此可以以高可靠性快速且容易地實(shí)現(xiàn)臨床診斷。
文檔編號(hào)C12N15/31GK102471806SQ201080036118
公開日2012年5月23日 申請日期2010年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月26日
發(fā)明者俞恩珠, 姜鎮(zhèn)錫, 樸榮石 申請人:株式會(huì)社Lg生命科學(xué)