專利名稱：在連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生所關(guān)心多肽或病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生所關(guān)心多肽或病毒的連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)策略。本文所述的連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)策略合并了恒化器和灌流培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。
背景技術(shù)：
產(chǎn)生所關(guān)心多肽或病毒的能力對(duì)于生物技術(shù)工業(yè)日益重要。過(guò)去二十年，生物技術(shù)的進(jìn)步引起了對(duì)許多多肽和病毒的關(guān)注，這些多肽和病毒具有作為疫苗和醫(yī)藥的潛在治療用途。大規(guī)模生產(chǎn)一般涉及例如在細(xì)菌、酵母、昆蟲、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或其它細(xì)胞類型中重組產(chǎn)生所述所關(guān)心多肽或病毒。具體來(lái)說(shuō)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生所關(guān)心多肽或病毒優(yōu)于在細(xì)菌或其它低級(jí)微生物宿主中的產(chǎn)生，原因在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞能夠?qū)?fù)雜的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行翻譯后加工，例如經(jīng)由依賴于二硫鍵的折疊和糖基化作用。哺乳動(dòng)物細(xì)胞在體外一般以兩種模式繁殖作為非錨定依賴性細(xì)胞，在培養(yǎng)物的整個(gè)本體中自由懸浮生長(zhǎng)；或作為錨定依賴性細(xì)胞，需要粘附到供其繁殖的固體基質(zhì)(即， 單層類型的細(xì)胞生長(zhǎng))。已經(jīng)開發(fā)出微載體系統(tǒng)來(lái)容納兩種類型的生長(zhǎng)。例如，錨定依賴性細(xì)胞可以在包含小固體顆粒的微載體系統(tǒng)中繁殖，所述小固體顆粒利用緩慢攪動(dòng)懸浮于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。該系統(tǒng)允許錨定依賴性細(xì)胞粘附到懸浮顆粒的表面，并生長(zhǎng)到匯合，而同時(shí)微載體保持懸浮于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中?；蛘撸梢允褂么罂孜⑤d體從而在生物反應(yīng)器中含有非錨定依賴性細(xì)胞，例如利用細(xì)胞到這些微載體的表面的非特定粘附。非錨定依賴性細(xì)胞或錨定依賴性細(xì)胞的微載體懸浮培養(yǎng)是大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞和細(xì)胞產(chǎn)物的最廣泛使用的方式。大規(guī)模懸浮培養(yǎng)可以在封閉系統(tǒng)中操作，例如作為分批式(batch)或流加式 (fed-batch)封閉系統(tǒng)，封閉系統(tǒng)比開放系統(tǒng)更方便操作和放大。通常，在封閉系統(tǒng)中，沒有細(xì)胞、產(chǎn)物和/或廢物除去(盡管可能利用通風(fēng)來(lái)加入空氣(例如氧氣)和除去CO2)。在分批式生長(zhǎng)系統(tǒng)情況下可見的典型生長(zhǎng)曲線涉及遲緩期，后面為指數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。 在這些分批式系統(tǒng)中，隨著養(yǎng)分耗盡和代謝物積聚，環(huán)境連續(xù)發(fā)生變化。在流加式系統(tǒng)中， 關(guān)鍵養(yǎng)分被連續(xù)送入系統(tǒng)中從而延長(zhǎng)生長(zhǎng)周期，盡管細(xì)胞、產(chǎn)物、副產(chǎn)物和廢物(包括毒性代謝物)未除去。因此，利用分批式或流加式系統(tǒng)來(lái)產(chǎn)生所關(guān)心多肽或病毒受到細(xì)胞和有害物質(zhì)諸如毒性代謝物的積聚的限制。大規(guī)模懸浮培養(yǎng)也可以在開放系統(tǒng)中操作，例如在灌流系統(tǒng)或恒化器系統(tǒng)中。在灌流系統(tǒng)中，使新鮮培養(yǎng)基灌流穿過(guò)培養(yǎng)物，同時(shí)利用各種細(xì)胞截留裝置截留細(xì)胞。細(xì)胞截留裝置的類型包括例如微載體、微孔旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器、中空纖維、平板膜過(guò)濾器、沉降管、超聲波細(xì)胞截留裝置等。通常，灌流培養(yǎng)物設(shè)計(jì)成增加細(xì)胞密度到最大值，而細(xì)胞截留裝置設(shè)計(jì)和操作成具有> 90%的細(xì)胞截留率。這些培養(yǎng)物通常達(dá)到> 2X107的細(xì)胞密度，這必須利用稀釋率大于約2. OcT1的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)料來(lái)供應(yīng)。然而，由于生物質(zhì)不受控制的增加，使得系統(tǒng)很難保持穩(wěn)態(tài)，并且難以控制和/或達(dá)到一致的生產(chǎn)條件。恒化器系統(tǒng)利用培養(yǎng)基連續(xù)流入與細(xì)胞和產(chǎn)物的流出來(lái)操作。在恒化器系統(tǒng)中， 沒有細(xì)胞截留裝置，以致生物反應(yīng)器中細(xì)胞的濃度和從生物反應(yīng)器收獲的上清液中細(xì)胞的濃度大致相同。通常，培養(yǎng)基以預(yù)定的恒定速率送入反應(yīng)器，從而保持培養(yǎng)物的低稀釋率 (通常為0. 3d-1至0. Sd-1)。為防止細(xì)胞沖壞，稀釋率一般選擇為小于、有時(shí)等于細(xì)胞的最大比生長(zhǎng)率。含有細(xì)胞、細(xì)胞產(chǎn)物、副產(chǎn)物、廢物等的培養(yǎng)流體同時(shí)除去，或大致同時(shí)除去。 恒化器系統(tǒng)通常提供高的控制程度，因?yàn)榕囵B(yǎng)物可以在比生長(zhǎng)率等于稀釋率下平衡，即，達(dá)到穩(wěn)態(tài)。此平衡決定了細(xì)胞、代謝物、廢物、表達(dá)產(chǎn)物(例如，分泌蛋白)等的濃度。由于至少一種限制性基質(zhì)，恒化器系統(tǒng)中的比生長(zhǎng)率通常低于最大生長(zhǎng)率。不過(guò)，在一些系統(tǒng)中， 穩(wěn)態(tài)可以通過(guò)控制和調(diào)整生物質(zhì)而保持在最大比生長(zhǎng)率，例如在恒化器培養(yǎng)的turbidstat 系統(tǒng)中。優(yōu)選地，這些恒化器培養(yǎng)物含有在整個(gè)生物反應(yīng)器中均勻分布的細(xì)胞(例如，單細(xì)胞懸浮液)。但是，與灌流系統(tǒng)相比，恒化器系統(tǒng)通常產(chǎn)生較低的細(xì)胞密度。此外，恒化器系統(tǒng)的固有缺點(diǎn)在于，細(xì)胞的進(jìn)料不能夠獨(dú)立于生物反應(yīng)器系統(tǒng)中的細(xì)胞密度來(lái)進(jìn)行控制。用于在無(wú)血清和/或化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基中產(chǎn)生重組蛋白的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)也受到限制，因?yàn)闊o(wú)血清和/或化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基與含有血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞相比，通常支持較慢的生長(zhǎng)率。培養(yǎng)物中生長(zhǎng)率降低意味著所關(guān)心多肽或病毒的產(chǎn)量降低。因此，仍需要開發(fā)能夠持續(xù)所關(guān)心多肽或病毒的產(chǎn)生的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，尤其是能夠長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)以便滿足例如低成本下產(chǎn)量增加的需求的培養(yǎng)。本發(fā)明提供針對(duì)此需要和其它需要的方法和組合物。

發(fā)明內(nèi)容
本文公開了一種用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、尤其非錨定依賴性細(xì)胞中產(chǎn)生所關(guān)心多肽和/或病毒的連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)。本文公開的連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)方法合并了灌流開放系統(tǒng)和恒化器開放系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，并允許細(xì)胞密度和細(xì)胞生長(zhǎng)的增加，特別是在無(wú)血清或化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基中。細(xì)胞密度和細(xì)胞生長(zhǎng)的增加提高所關(guān)心蛋白質(zhì)和/或病毒的產(chǎn)率，同時(shí)允許更好地控制工藝參數(shù)。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及用于在連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生所關(guān)心多肽和/或病毒的方法，所述方法包含在連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)表達(dá)所述多肽和/或病毒的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)包含細(xì)胞截留裝置并且具有小于約2d-1的稀釋率和小于約2X107細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度；和從自細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)除去的培養(yǎng)基中回收所關(guān)心多肽和/或病毒。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞經(jīng)過(guò)基因修飾以便重組表達(dá)所關(guān)心多肽和/或病毒。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞截留裝置選擇為截留細(xì)胞的能力低于典型的細(xì)胞截留裝置。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞截留裝置產(chǎn)生的細(xì)胞截留率為小于約90%、小于約85%、小于約80%或小于約75%。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞截留裝置包含大孔微載體，例如基于纖維素的顆粒。稀釋率和細(xì)胞密度優(yōu)選保持在所選值或范圍。在一些實(shí)施方案中，稀釋率為小于約Id—1，例如在約0. IcT1與約1. OcT1之間。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞密度為小于約IXlO7細(xì)胞/mL。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的稀釋率和比生長(zhǎng)率的比率(D/μ)保持在所選值或范圍。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的稀釋率和比生長(zhǎng)率的比率為大于約1， 例如在約1. 2與約5. 0之間或在約1. 8與約3之間。在一些實(shí)施方案中，比生長(zhǎng)率保持在 0. 2(Γ 與 0. 8cT 之間。本文所述的連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的某些實(shí)施方案的優(yōu)點(diǎn)在于該培養(yǎng)可以持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間。例如，在一些實(shí)施方案中，稀釋率和/或細(xì)胞密度保持細(xì)胞在連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)時(shí)間的至少約80%。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)例如大于20天、優(yōu)選大于40天、更優(yōu)選大于50天，從而允許在低成本下增加所關(guān)心多肽和/或病毒的產(chǎn)量。連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的某些實(shí)施方案的另一優(yōu)點(diǎn)為較高細(xì)胞密度引起的相比于典型恒化器培養(yǎng)的體積生產(chǎn)率的增加。例如，在特定優(yōu)選實(shí)施方案中，體積生產(chǎn)率增加70%、 90%或更高。連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的某些實(shí)施方案的再一優(yōu)點(diǎn)為例如由于在培養(yǎng)單元中滯留時(shí)間降低而引起的所回收蛋白質(zhì)的比活性提高，這可能會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)和/或功能具有有利影響。本文所述的連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的某些實(shí)施方案的另一優(yōu)點(diǎn)在于系統(tǒng)可以放大以進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。也就是說(shuō)，通過(guò)允許與標(biāo)準(zhǔn)恒化器培養(yǎng)系統(tǒng)相比增加細(xì)胞密度和/或細(xì)胞生長(zhǎng)，本文公開的連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)提供所關(guān)心多肽和/或病毒的商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。例如， 在一些實(shí)施方案中，在至少約250L培養(yǎng)基，例如至少約500L或至少約1，000L培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，在無(wú)血清培養(yǎng)基和/或化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包含預(yù)培養(yǎng)步驟，例如以便使細(xì)胞適應(yīng)如本文所述的在連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中所關(guān)心多肽和/或病毒的產(chǎn)生。因此，在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包含在培養(yǎng)步驟之前，懸浮預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞，例如直到培養(yǎng)物達(dá)到適當(dāng)體積。在特定實(shí)施方案中，所關(guān)心多肽為去整合素樣金屬肽酶含血小板反應(yīng)蛋白1基元 13(ADAMTS13)蛋白。在一些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞為CHO細(xì)胞，例如經(jīng)過(guò)基因修飾以表達(dá)ADAMTS13蛋白的CHO細(xì)胞。在特定實(shí)施方案中，提供用于在連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生所關(guān)心多肽和/或病毒的方法，所述方法包含(a)在連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)表達(dá)所關(guān)心多肽和 /或病毒的非錨定依賴性哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)包含細(xì)胞截留率小于90%的細(xì)胞截留裝置，且具有在0. IcT1與1. OcT1之間的稀釋率⑶和小于IXlO7細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度；和(b)從自細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)除去的培養(yǎng)基中回收所關(guān)心多肽和/或病毒。在另一特定實(shí)施方案中，提供用于在連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生所關(guān)心多肽和/或病毒的方法，所述方法包含(a)在連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)表達(dá)所關(guān)心多肽和/或病毒的非錨定依賴性CHO細(xì)胞，其中細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)包含細(xì)胞截留率小于90%的大孔微載體細(xì)胞截留裝置，且具有在0. IcT1與1. OcT1之間的稀釋率(D)和小于IXlO7細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度；和(b) 從自細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)除去的培養(yǎng)基中回收所關(guān)心多肽和/或病毒。在再一特定實(shí)施方案中，提供用于在連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生ADAMTS13的方法，所述方法包含(a)在連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)表達(dá)重組ADAMTS13蛋白的非錨定依賴性哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)包含細(xì)胞截留率小于90%的大孔微載體細(xì)胞截留裝置，且具有在0. IcT1與1. OcT1之間的稀釋率⑶和小于IXlO7細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度；和(b)從自細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)除去的培養(yǎng)基中回收ADAMTS13。
在又一特定實(shí)施方案中，提供用于在連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生所關(guān)心多肽和/或病毒的方法，所述方法包含(a)在連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)表達(dá)所關(guān)心多肽和/或病毒的非錨定依賴性哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)包含細(xì)胞截留率小于90 %的細(xì)胞截留裝置，且具有在0. IcT1與1. OcT1之間的稀釋率⑶和小于IXlO7細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度，以及在1. 2 與5之間的稀釋率和比生長(zhǎng)率的比率(D/μ)；和(b)從自細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)除去的培養(yǎng)基中回收所關(guān)心多肽和/或病毒；且進(jìn)一步，其中細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)大于50天，并且稀釋率、細(xì)胞密度以及稀釋率和比生長(zhǎng)率的比率各自保持細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)時(shí)間的至少 80%。本發(fā)明的另一方面涉及包含根據(jù)本文所述的方法產(chǎn)生的所關(guān)心多肽和/或病毒的組合物，例如包含據(jù)此產(chǎn)生的重組ADAMTS13蛋白的組合物。下面更詳細(xì)地描述本發(fā)明的這些和其它方面。
具體實(shí)施例方式本文所述的連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)合并了哺乳動(dòng)物細(xì)胞的灌流培養(yǎng)和恒化器培養(yǎng)的一些優(yōu)點(diǎn)。如上文所述，灌流培養(yǎng)系統(tǒng)利用新鮮培養(yǎng)基灌流穿過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)操作，同時(shí)使用細(xì)胞截留裝置截留細(xì)胞；恒化器培養(yǎng)系統(tǒng)利用培養(yǎng)基的連續(xù)流入與細(xì)胞和產(chǎn)物的流出來(lái)操作，沒有細(xì)胞截留裝置。本文所用的“灌流”指代生理營(yíng)養(yǎng)液在穩(wěn)定速率下的連續(xù)流動(dòng)，穿過(guò)或經(jīng)過(guò)細(xì)胞群。由于灌流系統(tǒng)一般涉及細(xì)胞在培養(yǎng)單元內(nèi)的截留，所以灌流培養(yǎng)物特有地具有相對(duì)高的細(xì)胞密度，但培養(yǎng)條件難以保持和控制。另外，因?yàn)榧?xì)胞生長(zhǎng)到高密度并接著在高密度下截留在培養(yǎng)單元內(nèi)，所以生長(zhǎng)率通常隨時(shí)間連續(xù)減小，從而達(dá)到細(xì)胞生長(zhǎng)的指數(shù)末期或甚至穩(wěn)定期。相比之下，本文所用的“恒化器”指代生理營(yíng)養(yǎng)液的連續(xù)流入結(jié)合細(xì)胞和其它產(chǎn)物隨取出培養(yǎng)基的連續(xù)流出，穿過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)物，例如在恒化器系統(tǒng)中。然而，由于細(xì)胞被連續(xù)除去，使得恒化器系統(tǒng)通常只支持較低細(xì)胞密度。本文所述的連續(xù)培養(yǎng)策略一般包含在連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中在生產(chǎn)階段期間培養(yǎng)表達(dá)所關(guān)心多肽和/或病毒的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如非錨定依賴性細(xì)胞?！胺清^定依賴性細(xì)胞”表示與繁殖期間粘附于或固定于固體基質(zhì)相反，在培養(yǎng)物整個(gè)本體中自由懸浮繁殖的細(xì)胞。連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)將包含與灌流系統(tǒng)中所使用的類似的細(xì)胞截留裝置，但其允許連續(xù)除去細(xì)胞的較大部分，優(yōu)選使得與灌流培養(yǎng)中相比截留較小百分比的細(xì)胞?！凹?xì)胞截留裝置”表示能夠在細(xì)胞培養(yǎng)期間的特定位置上截留細(xì)胞、尤其非錨定依賴性細(xì)胞的任何結(jié)構(gòu)。 非限制性實(shí)例包括可以將非錨定依賴性細(xì)胞截留在生物反應(yīng)器內(nèi)的微載體、微孔旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器、中空纖維、平板膜過(guò)濾器、沉降管、超聲波細(xì)胞截留裝置等。所關(guān)心多肽和/或病毒(例如重組多肽和/或重組病毒)可以從細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)回收，例如從自細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)除去的培養(yǎng)基中回收。本文公開的用于產(chǎn)生所關(guān)心多肽和/或病毒(例如重組多肽和/或重組病毒)的方法包含提供類似恒化器培養(yǎng)系統(tǒng)并使用細(xì)胞截留裝置的細(xì)胞培養(yǎng)方法。所述系統(tǒng)包含在具有細(xì)胞截留裝置的連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)表達(dá)所關(guān)心多肽和/或病毒的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。細(xì)胞截留裝置的作用在于防止用新鮮培養(yǎng)基補(bǔ)充用過(guò)的培養(yǎng)基期間從培養(yǎng)物除去一部分、優(yōu)選較大一部分活細(xì)胞。成功的細(xì)胞截留裝置應(yīng)當(dāng)盡可能多地滿足以下要求(1)極小的細(xì)胞損傷或?qū)?xì)胞生長(zhǎng)和生產(chǎn)率的影響，( 僅對(duì)活細(xì)胞的選擇性截留(非活細(xì)胞由于釋放毒性代謝物到培養(yǎng)環(huán)境中所以優(yōu)選地從培養(yǎng)物中除去)，(3)長(zhǎng)期培植的不間斷操作， (4)低能耗，(5)操作與維護(hù)簡(jiǎn)便，(6)對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)單元的放大能力，(7)結(jié)構(gòu)緊湊，和 (8)成本有效性。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所用的細(xì)胞截留裝置準(zhǔn)許細(xì)胞的部分截留。細(xì)胞截留裝置和/或方法在本領(lǐng)域眾所周知。其中許多以常規(guī)的沉積、離心和/或過(guò)濾技術(shù)為基礎(chǔ)。 細(xì)胞截留裝置的非限制性實(shí)例包括微載體、旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器諸如微孔旋轉(zhuǎn)過(guò)濾器、中空纖維、平板膜過(guò)濾器、沉降管、超聲波細(xì)胞截留裝置、重力沉降槽、離心機(jī)、聲學(xué)細(xì)胞過(guò)濾器、基于介電電泳的細(xì)胞分離器等(例如參見美國(guó)專利第5，019，512號(hào)；第5，626，734號(hào)，以引用的方式全部并入本文)。根據(jù)本文所述的培養(yǎng)系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施方案，可以使用微載體作為細(xì)胞截留裝置。 微載體可以充當(dāng)?shù)统杀究啥?biāo)(scalable)表面，非錨定依賴性細(xì)胞可以固定在上面以便幫助細(xì)胞截留。本文所用的“微載體”指代待用于懸浮培養(yǎng)中的足夠小的顆粒，優(yōu)選地?cái)嚢杷俾什粫?huì)引起對(duì)細(xì)胞的顯著剪切損傷。微載體可以為實(shí)心、多孔的，或者具有實(shí)心核心和多孔涂層。微載體可以為，例如但不限于，基于纖維素或葡聚糖的，并且它們的表面(多孔載體情況下的外表面和內(nèi)表面)可以帶正電。關(guān)于微載體的更多細(xì)節(jié)可見于例如WO 02/29083中，該專利以引用的方式全部并入本文。在一個(gè)實(shí)施方案中，微載體為大孔微載體。本文所用的“大孔微載體”指代具有以下性質(zhì)的顆粒，例如基于纖維素的顆粒(a)足夠小以允許用于懸浮培養(yǎng)中，優(yōu)選地?cái)嚢杷俾什粫?huì)引起對(duì)細(xì)胞的顯著剪切損傷；和(b)具有足夠大小的孔和內(nèi)部空間以允許細(xì)胞遷移到內(nèi)部空間中。在一個(gè)實(shí)施方案中它們的表面(外部和內(nèi)部)可以帶正電。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體(a)具有約150 μ m與約350 μ m之間的總體粒徑；(b)具有平均孔開口直徑在約 15 μ m與約40 μ m之間的孔；和(c)具有約0. 8meq/g與2. Omeq/g之間的正電荷密度。在一些實(shí)施方案中，正電荷由DEAE(N，N，_ 二乙氨基乙基)基團(tuán)提供。有用的大孔微載體包括但不限于 CYTOPORE Its^pcytopore 2 (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ) 特別有用的大孔微載體為CYTOPORE 2 載體，其平均粒徑為230 μ m,平均孔徑為30 μ m，正電荷密度為1. 8meq/g。在一些實(shí)施方案中，攪動(dòng)培養(yǎng)單元。如本領(lǐng)域中所知，攪動(dòng)可以包含振蕩、攪拌、搖擺、振動(dòng)等。在優(yōu)選實(shí)施方案中，利用具有擋板的Rushton型葉輪進(jìn)行攪動(dòng)。擋板可以在約 140rpm，對(duì)應(yīng)于近似40W/m3的比功率/體積輸出。在一些實(shí)施方案中，比功率/體積輸出大于約40W/m3，例如約50W/m3、約60W/m3、約70W/m3、約80W/m3或更高。根據(jù)所使用的特定細(xì)胞或培養(yǎng)法適用時(shí)，可以使用其它速度。如本文所述的微載體的濃度一般較低，例如以便幫助保持稀釋率和細(xì)胞密度在特定范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)單元可以包含的微載體的量對(duì)應(yīng)于在0. 05-1. Og/L范圍內(nèi)的微載體終濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，微載體終濃度為約0. 05-0. lg/L。在一個(gè)實(shí)施方案中，微載體終濃度為約0. 1-0. 25g/L。在另一實(shí)施方案中，微載體終濃度為約0. 25-0. 5g/ L。在另一實(shí)施方案中，微載體終濃度為約0. 5-0. 75g/L。在另一實(shí)施方案中，微載體終濃度為約0. 75-1. Og/L。在另一實(shí)施方案中，載體濃度可以在連續(xù)培養(yǎng)期間增加或降低，例如以便調(diào)整細(xì)胞密度和稀釋率在預(yù)定范圍內(nèi)。
所公開的連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)具有優(yōu)選的稀釋率(D)和優(yōu)選的細(xì)胞密度。具體來(lái)說(shuō)，稀釋率和細(xì)胞密度保持在預(yù)定值或預(yù)定范圍內(nèi)。此外，所公開的連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可以在整個(gè)工藝時(shí)間內(nèi)具有極小比生長(zhǎng)率或預(yù)定范圍的比生長(zhǎng)率。稀釋率(D)指代每天供應(yīng)的培養(yǎng)基體積除以培養(yǎng)物的體積。雖然本文所述的連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)涉及細(xì)胞截留，但連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的稀釋率一般小于灌流培養(yǎng)的稀釋率， 例如小于約2稀釋體積/天OcT1)。在一個(gè)實(shí)施方案中，稀釋率保持在大于約0. 2CT1至小于約2. OcT1之間。在另一實(shí)施方案中，稀釋率保持在小于約2. OcT1，例如小于約1. Scf1，例如小于約1.5CT1，例如小于約1.2CT1等。在另一實(shí)施方案中，稀釋率保持在小于約l.Ocf1， 例如小于約0. 9CT1，例如小于約0. 8CT1，例如小于約0. 7CT1，例如小于約0. 6CT1等。在另一實(shí)施方案中，稀釋率保持在大于約0. 2CT1，例如大于約0. 3CT1，例如大于約0. 4CT1，例如大于約
0.5(Γ 等。另外，在本文所述的連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，細(xì)胞密度的值保持在小于灌流培養(yǎng)系統(tǒng)中所保持的值，但高于恒化器系統(tǒng)中所達(dá)到的細(xì)胞密度。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞密度小于約2Χ107細(xì)胞/mL，例如小于約1. 5X107細(xì)胞/mL，例如小于約IXlO7細(xì)胞/mL，例如小于約 8X106細(xì)胞/mL，例如小于約6X106細(xì)胞/mL，例如小于約5X106細(xì)胞/mL。在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞密度可以為大于約IXlO6細(xì)胞/mL，例如大于約1. 5X106細(xì)胞/mL，例如大于約2X106 細(xì)胞/mL，例如大于約3X106細(xì)胞/mL，例如大于約4X106細(xì)胞/mL等。在另一實(shí)施方案中， 細(xì)胞密度保持在約1.0X106細(xì)胞/mL到約2X106細(xì)胞/mL之間。在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞密度保持在約2X106細(xì)胞/mL到約4X106細(xì)胞/mL之間。在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞密度保持在約5X106細(xì)胞/mL到約IXlO7細(xì)胞/mL之間，例如約6X106細(xì)胞/mL到約8X106細(xì)胞/mL之間。在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞密度保持在約IXlO7細(xì)胞/mL到約2X107細(xì)胞/mL之間。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到用以保持細(xì)胞密度的機(jī)制涉及減少利用細(xì)胞截留裝置截留的細(xì)胞部分，即降低細(xì)胞截留率。一般來(lái)說(shuō)，灌流培養(yǎng)的細(xì)胞截留率大于90%或 95%，在許多情況下接近100%。在所公開的連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，細(xì)胞截留率小于90%。 在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞截留率小于約85 %，例如小于約75 %。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞截留率小于約70%，例如小于約60%，例如小于約50%，例如小于約40%，例如小于約30%。 在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞截留率保持在約30%與約90%之間。在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞截留率保持在約30 %與約80 %之間。在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞截留率保持在約30 %與約70 % 之間。在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞截留率保持在約40%與約60%之間。在另一實(shí)施方案中， 細(xì)胞截留率保持在約40%與約70%之間。在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞截留率保持在約50%與約90%之間。在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞截留率保持在約60%與約90%之間。在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞截留率保持在約70%與約90%之間。在另一實(shí)施方案中，細(xì)胞截留率保持在約 80%與約90%之間。培養(yǎng)物還可以利用稀釋率和比生長(zhǎng)率的比率來(lái)表征。比生長(zhǎng)率(μ)指代每天每細(xì)胞質(zhì)量的細(xì)胞質(zhì)量增加(相對(duì)于總細(xì)胞質(zhì)量):μ = (1化幾))膽)-“-1))；其中Xt 為時(shí)間(t)的生物質(zhì)濃度和Xw為前一時(shí)間點(diǎn)的生物質(zhì)濃度。一般來(lái)說(shuō)，如本文所述的連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)的比生長(zhǎng)率應(yīng)當(dāng)恒定在預(yù)定范圍內(nèi)，優(yōu)選在某一極低水平以確保生長(zhǎng)相關(guān)的多肽和/或病毒表達(dá)的極低值。例如，本文所述的連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)的比生長(zhǎng)率可以為約o. id—1到約
1.OcT1。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)所保持的比生長(zhǎng)率為大于約o. id-1,例如大于約0. 15CT1，例如大于約0. 2CT1，例如大于約0. 25CT1，例如大于約0. 3CT1，例如大于約0. 35(1-1等。在另一實(shí)施方案中，本文所述的連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)所保持的比生長(zhǎng)率為小于約 1. Ocf1，例如小于約0. 8CT1，例如小于約0. 7CT1，例如小于約0. 6CT1，例如小于約0. 5CT1，例如小于約0. 45CT1。在另一實(shí)施方案中，比生長(zhǎng)率可以保持在約0. IcT1到約0. 45CT1之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)所保持的比生長(zhǎng)率在約0. Ιδ -1到約0. 3CT1之間。 在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)所保持的比生長(zhǎng)率在約0. 2CT1到約0. 25(^2 間。如上文所述，本文公開的連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)保持小于約2X107細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度。如本文所述細(xì)胞密度可以得到保持的機(jī)制涉及保持稀釋率與比生長(zhǎng)率的特定比率。恒化器培養(yǎng)的稀釋率近似等于比生長(zhǎng)率，D/μ比率近似為1。灌流培養(yǎng)一般具有較高的絕對(duì)稀釋率和非常低的比生長(zhǎng)率，故D/μ比率顯著大于1。但在本文公開的連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)中，優(yōu)選保持稀釋率稍高于比生長(zhǎng)率。因此，在本文公開的連續(xù)培養(yǎng)中，保持大于1的D/μ比率。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，依據(jù)截留裝置的效率計(jì)算和設(shè)定稀釋率以便保持比生長(zhǎng)率在預(yù)定范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，稀釋率與比生長(zhǎng)率的比率為大于約1. 0，例如大于約1. 2，例如大于約1. 5，例如大于約2，例如大于約2. 5。在另一實(shí)施方案中，稀釋率與比生長(zhǎng)率的比率為小于約5，例如小于約4，例如小于約3。在一個(gè)實(shí)施方案中，D/μ比率在約1.2與約5之間。在另一實(shí)施方案中，稀釋率與比生長(zhǎng)率的比率在約1.8與約3之間。在另一實(shí)施方案中，稀釋率與比生長(zhǎng)率的比率在約2. 0與約2. 5之間。本發(fā)明的方法可以在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)單元或生物反應(yīng)器中進(jìn)行。生物反應(yīng)器可以具有任何尺寸，只要它適用于培養(yǎng)細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。由于具有低細(xì)胞密度的工藝一般容易放大，所以本發(fā)明的方法對(duì)于大規(guī)模培養(yǎng)(即，培養(yǎng)體積大于250L)特別有利并且特別適合從小的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模培養(yǎng)(例如10L)放大到生產(chǎn)規(guī)模培養(yǎng)(例如250L和250L以上)， 其中培養(yǎng)條件進(jìn)行極小修改。培養(yǎng)單元的內(nèi)部條件，包括但不限于ΡΗ、ρ02和溫度，通常在培養(yǎng)期期間進(jìn)行控制。生產(chǎn)培養(yǎng)單元指代在所關(guān)心多肽、病毒和/或任何其它產(chǎn)物的生產(chǎn)中使用的最終培養(yǎng)單元。大規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)單元的體積一般大于約250升，可以為約300、約 500、約800、約1000、約2500、約5000、約8000、約10，000、約12，0000L或更多，或任何中間體積。適合的培養(yǎng)單元或生產(chǎn)培養(yǎng)單元可以由適合在其中所涵蓋的培養(yǎng)條件下容納懸浮于培養(yǎng)基中的細(xì)胞培養(yǎng)物以及有益于哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)和成活的任何材料構(gòu)成(即，由所述材料構(gòu)造)。適用材料的實(shí)例包括但不限于玻璃、塑料和/或金屬。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述材料不干擾、或不顯著干擾或大致不干擾所需產(chǎn)物例如所關(guān)心多肽和/或病毒的表達(dá)和 /或穩(wěn)定性。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到并且將能夠選擇適用于實(shí)踐本發(fā)明連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)的培養(yǎng)單元。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)工藝在多于一個(gè)不同的培養(yǎng)單元中操作，諸如使用一個(gè)或多個(gè)種子(繁殖)培養(yǎng)單元，之后使用生產(chǎn)培養(yǎng)單元。這樣，在一些實(shí)施方案中，該工藝涉及轉(zhuǎn)移約50L繁殖后的種子培養(yǎng)物(具有約1. OXlO6細(xì)胞/mL)到含有約150L培養(yǎng)基的250L培養(yǎng)單元中。一般來(lái)說(shuō)，本文所述的連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)僅施加至生產(chǎn)培養(yǎng)單元。例如， 首先使種子哺乳動(dòng)物細(xì)胞在一個(gè)或多個(gè)種子培養(yǎng)單元中繁殖，例如在分批式、流加式、灌流和/或恒化器系統(tǒng)中。在細(xì)胞轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)培養(yǎng)單元后，可以根據(jù)本文所述的連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)細(xì)胞，例如利用細(xì)胞截留裝置在稀釋率小于約2CT1和細(xì)胞密度小于約2X107細(xì)胞/mL的CN 102549142 A
細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中?；蛘?，可以在一個(gè)物理培養(yǎng)單元中將細(xì)胞擴(kuò)增到生產(chǎn)培養(yǎng)單元和生產(chǎn)階段。例如， 可以將細(xì)胞擴(kuò)增到最終生產(chǎn)規(guī)模并將工藝切換到生產(chǎn)條件，由此可以使用針對(duì)本文所述的連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的條件。意外發(fā)現(xiàn)，可以使用本發(fā)明的培養(yǎng)方法保持細(xì)胞密度和稀釋率在預(yù)定范圍內(nèi)，例如以便支持持續(xù)時(shí)間類似于恒化器或灌流系統(tǒng)的生產(chǎn)階段?！邦A(yù)定范圍”表示目標(biāo)范圍，例如本文中針對(duì)根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案操作連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)所述的范圍。例如，在一些實(shí)施方案中，稀釋率的目標(biāo)范圍在0. 2CT1到2. OcT1之間，而細(xì)胞密度的目標(biāo)范圍為小于2X107細(xì)胞/ mL。在另一實(shí)施方案中，稀釋率保持為小于2. Ocf1，例如小于1. 8CT1，例如小于1. 5CT1或例如小于1. 2CT1，而細(xì)胞密度為小于1. 5X107細(xì)胞/mL，例如小于IXlO7細(xì)胞/mL或例如小于 ^QO6細(xì)胞/mL。在一些實(shí)施方案中，比生長(zhǎng)率為0. IcT1到LOcT1且稀釋率與比生長(zhǎng)率的比率在1. 2與5之間。在一些實(shí)施方案中，稀釋率的目標(biāo)范圍在0. 5CT1到1. OcT1之間且細(xì)胞密度為小于5X106細(xì)胞/mL。在一些實(shí)施方案中，比生長(zhǎng)率為0. 15CT1到0. 3CT1且稀釋率與比生長(zhǎng)率的比率在1. 8與3之間。在一些實(shí)施方案中，比生長(zhǎng)率為0. 2d-1到0. 25(1^1且稀釋率與比生長(zhǎng)率的比率在2. 0與2. 5之間。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞密度為5X106細(xì)胞/mL或更小，稀釋率為小于0. 6CT1，且比生長(zhǎng)率為0. 18到0. 27CT1。在另一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞密度為小于5X106細(xì)胞/mL，稀釋率在0. 55CT1與0. ecf1之間，且比生長(zhǎng)率為 0. led-1到0. 26(1-1.實(shí)施方案包括在總連續(xù)培養(yǎng)時(shí)間和/或生產(chǎn)階段時(shí)間的至少約50%， 例如至少約60 %，例如至少約70 %，例如至少約80 %，例如至少約90 %，例如至少約95 %， 例如至少約98%，保持稀釋率和/或細(xì)胞密度和/或比生長(zhǎng)率和/或稀釋率與比生長(zhǎng)率的比率在目標(biāo)范圍(例如，上文提及的范圍)內(nèi)。本文所述的連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可以允許由哺乳動(dòng)物細(xì)胞持續(xù)產(chǎn)生所關(guān)心多肽和/ 或病毒。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)大于約7天的總連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)大于約9天、大于約14天、大于約21天、大于約觀天、大于約35天、大于約40天、大于約45天或大于約50天。術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞培養(yǎng)基(cellculture medium) ”和“培養(yǎng)基” (culture medium 或簡(jiǎn)稱 "medium")指代用于真核細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)液，通常提供來(lái)自以下一個(gè)或多個(gè)種類的至少一種組分(1)促進(jìn)培養(yǎng)基滲透壓的鹽(例如，鈉、鉀、鎂、鈣等)；(2)能源，通常呈諸如葡萄糖等碳水化合物的形式；C3)所有必需氨基酸，和通常二十種氨基酸的基本集(basic set)； ⑷維生素和/或所需的其它低濃度有機(jī)化合物；和(5)微量元素，其中微量元素定義為通常需要的非常低濃度、通常在微摩爾濃度范圍內(nèi)的無(wú)機(jī)化合物。營(yíng)養(yǎng)液任選地可以補(bǔ)充來(lái)自以下任一種類的一種或多種組分(a)動(dòng)物血清；(b)激素和其它生長(zhǎng)因子諸如(例如) 胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和表皮生長(zhǎng)因子；和(c)植物、酵素和/或組織的水解產(chǎn)物，包括其蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。在無(wú)血清培養(yǎng)基、化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基或沒有動(dòng)物源性組分的培養(yǎng)基中培植表達(dá)所關(guān)心多肽和/或病毒的哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，本發(fā)明連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)特別有用?；瘜W(xué)成分明確的培養(yǎng)基是其中的所有組分具有已知的化學(xué)結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)基?；瘜W(xué)成分明確的培養(yǎng)基可以從商業(yè)供應(yīng)商獲得，諸如(例如)Sigma、JRH Biosciences、Gibco和Gemini。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，培養(yǎng)基可以含有來(lái)源于本領(lǐng)域中已知的任何來(lái)源或方法的氨基酸，包括但不限于來(lái)源于添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸或添加蛋白胨或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物(包括動(dòng)物、酵母或植物來(lái)源的水解產(chǎn)物)的氨基酸。支持在本發(fā)明條件下的細(xì)胞生長(zhǎng)和保持的任何細(xì)胞培養(yǎng)基都可以使用。通常，培養(yǎng)基含有水、滲透壓調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、能源、氨基酸、無(wú)機(jī)或重組鐵源、一種或多種合成或重組生長(zhǎng)因子、維生素和輔因子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，培養(yǎng)基沒有動(dòng)物源性組分。本文所用的 “動(dòng)物源性”組分是完整動(dòng)物中產(chǎn)生的任何組分(諸如(例如)從血清分離和純化的蛋白質(zhì))，或使用完整動(dòng)物中產(chǎn)生的組分產(chǎn)生的任何組分(諸如(例如)使用從動(dòng)物分離和純化的酶來(lái)水解植物來(lái)源材料所得的氨基酸)。相比之下，具有動(dòng)物蛋白的序列(即，具有動(dòng)物基因組來(lái)源的序列)但是使用沒有在完整動(dòng)物中產(chǎn)生的或從完整動(dòng)物分離和純化的組分的培養(yǎng)基在體外的細(xì)胞培養(yǎng)中(諸如(例如)在重組酵母或細(xì)菌細(xì)胞中或在建立的重組或非重組的連續(xù)真核細(xì)胞細(xì)胞系中)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，不是“動(dòng)物源性”組分。例如，在酵母或細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生的胰島素，或在建立的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系諸如CHO、BHK或HEK細(xì)胞中產(chǎn)生的胰島素，或在Namalwa細(xì)胞中產(chǎn)生的干擾素，不構(gòu)成“動(dòng)物源性”組分。因此，沒有動(dòng)物源性組分的細(xì)胞培養(yǎng)基可以含有重組產(chǎn)生的動(dòng)物蛋白；不過(guò)，這種培養(yǎng)基不含有例如動(dòng)物血清或從動(dòng)物血清純化的蛋白質(zhì)或其它產(chǎn)物。例如，這種培養(yǎng)基可以含有來(lái)源于植物的一種或多種組分。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，在細(xì)胞生長(zhǎng)階段期間使用的培養(yǎng)基含有濃培養(yǎng)基， 即所含的養(yǎng)分濃度高于正常需要的或正常提供給生長(zhǎng)培養(yǎng)物的濃度的培養(yǎng)基。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到哪些細(xì)胞培養(yǎng)基、接種培養(yǎng)基等適合培養(yǎng)特定細(xì)胞，例如動(dòng)物細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)。例如，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠?yàn)樘囟ㄅ囵B(yǎng)物適當(dāng)?shù)剡x擇葡萄糖和其它養(yǎng)分諸如谷氨酰胺、鐵、微量元素等的量，以及其它培養(yǎng)變量，諸如(例如)發(fā)泡、滲透壓等的量(例如參見 Mather, J. P.，等人(1999) "Culture media, animal cells, large scale production,，，Encyclopedia of Bioprocess Technology :Fermentation, Biocatalysis, and Bios印aration，Vol. 2 :777-785 (尤其第780頁(yè)到第783頁(yè))；美國(guó)專利申請(qǐng)公開案第 2006/0121568號(hào)(尤其第
段到第
段和第
段到第
段)；兩者均已引用的方式全部并入本文)。本發(fā)明還涵蓋這些已知培養(yǎng)基的變體，包括例如這些培養(yǎng)基的養(yǎng)分富集變體、濃培養(yǎng)基、化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基、無(wú)血清培養(yǎng)基，和另外根據(jù)本發(fā)明各種實(shí)施方案修改的培養(yǎng)基。連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)不限于非錨定依賴性哺乳動(dòng)物細(xì)胞的任何類型。哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以是表達(dá)所關(guān)心重組多肽(和/或重組病毒)的基因修飾哺乳動(dòng)物細(xì)胞，或表達(dá)所關(guān)心多肽(和/或病毒)的未修飾哺乳動(dòng)物細(xì)胞。許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞系為適合多肽和/或病毒重組表達(dá)的宿主細(xì)胞。哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系包括例如COS、PER. C6、TM4、VERO、MDCK、BRL-3A、 W138,Hep G2、MMT、MRC 5、FS4、CH0、293T、A431、3T3、CV-l、C3H10Tl/2、Colo205、293、HeLa、 L 細(xì)胞、BHK、HL-60、FRhL-2、U937、HaK、Jurkat 細(xì)胞、Rat2、BaF3、32D、FDCP_l、PC12、Mlx、鼠骨髓瘤(例如SP2/0和NS0)和C2C12細(xì)胞，以及轉(zhuǎn)化的靈長(zhǎng)類細(xì)胞系、雜交瘤、正常二倍體細(xì)胞，和來(lái)源于初生組織與初生外植體的體外培養(yǎng)的細(xì)胞株?？梢赃m應(yīng)懸浮培養(yǎng)的任何哺乳動(dòng)物細(xì)胞都可以在所公開的細(xì)胞培養(yǎng)方法中使用。非限制性實(shí)例包括CHO細(xì)胞，其在血清和適當(dāng)表面存在下培植時(shí)具有錨定依賴性，但很容易適應(yīng)懸浮培養(yǎng)中的生長(zhǎng)(參見例如 Rasmussen 1998，Cytotechnology 28 第 31-42 頁(yè)，尤其第；34_37 頁(yè)，關(guān)于培養(yǎng)無(wú)血清 CHO
11細(xì)胞系)。能夠表達(dá)所關(guān)心多肽和/或病毒(不管是重組產(chǎn)生或非重組產(chǎn)生)的任何哺乳動(dòng)物細(xì)胞也都可以在所公開的細(xì)胞培養(yǎng)方法中使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用本文公開的連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)方法來(lái)使錨定依賴性細(xì)胞系改造成非錨定依賴性細(xì)胞系。許多細(xì)胞系可以從商業(yè)來(lái)源諸如美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)來(lái)培養(yǎng)基因修飾CHO細(xì)胞。如本文所述，連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可以進(jìn)行所關(guān)心多肽和/或病毒(例如重組多肽和/或重組病毒)的回收。多肽和/或病毒通常從自系統(tǒng)除去的用過(guò)的培養(yǎng)基中回收。本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的優(yōu)點(diǎn)包括降低蛋白質(zhì)和/或病毒在生物反應(yīng)器中的滯留時(shí)間，這對(duì)容易降解的產(chǎn)物特別有用。不過(guò)，本文公開的連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)并不限于這類不穩(wěn)定多肽或病毒，也可以用于其它所關(guān)心多肽或病毒的回收。本發(fā)明涉及用于表達(dá)一種或多種所關(guān)心蛋白質(zhì)和/或病毒的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的改進(jìn)大規(guī)模連續(xù)培養(yǎng)的方法，不管所述表達(dá)是來(lái)自內(nèi)源基因或自然感染，或是向所述細(xì)胞中引入編碼所關(guān)心蛋白質(zhì)或病毒的重組基因之后。所述蛋白質(zhì)的非限制性實(shí)例包括酶、激素、 抗體、蛋白質(zhì)受體、融合蛋白(例如可溶受體與IgG的Fc域的融合蛋白)、疫苗、細(xì)胞因子、 趨化因子、生長(zhǎng)因子、血液因子蛋白等。在一個(gè)實(shí)施方案中，所關(guān)心蛋白質(zhì)是ADAMTS13。在另一實(shí)施方案中，所關(guān)心蛋白質(zhì)是因子VII或因子VIII。在另一實(shí)施方案中，所關(guān)心蛋白質(zhì)是α-1-蛋白酶抑制劑。本發(fā)明還涉及用于表達(dá)一種或多種所關(guān)心病毒(包括病毒顆粒和病毒載體)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的改進(jìn)大規(guī)模連續(xù)培養(yǎng)的方法，不管所述病毒是野生型還是重組病毒。所述野生型或重組病毒、病毒顆粒和/或病毒載體的非限制性實(shí)例包括腺病毒、皰疹病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、流感病毒等。重組病毒、病毒顆粒的產(chǎn)生以及重組病毒載體的使用在本領(lǐng)域眾所周知。對(duì)于病毒的表達(dá)，本發(fā)明的方法特別適合但不限于利用非溶解性(non-lytic) 病毒諸如(例如)A型肝炎和TBE病毒的感染和這些病毒在例如Vero細(xì)胞中的表達(dá)，或者利用慢病毒的感染和這些病毒在例如HEK293或其它人或哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中的表達(dá)。一旦培養(yǎng)基自培養(yǎng)單元中除去，就可以使它經(jīng)歷一種或多種加工步驟以獲得所關(guān)心蛋白質(zhì)和/或病毒。下游加工步驟包括但不限于離心和/或過(guò)濾以除去先前未從培養(yǎng)物取出的細(xì)胞；親和色譜法、疏水性相互作用色譜法；離子交換色譜法；尺寸排除色譜法；電泳程序(例如制備型等電點(diǎn)聚焦(IEF)、差別溶解度(例如硫酸銨沉淀法)、萃取等。 大體上，參見 Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag,紐約，1982 ；禾Π Protein Purification，編著 J. -C. Janson 和 Lars Ryden, VCH Publishers，紐約，1989。在某些實(shí)施方案中，讓哺乳動(dòng)物細(xì)胞經(jīng)歷預(yù)培養(yǎng)步驟，例如使細(xì)胞適應(yīng)所關(guān)心多肽和/或病毒的產(chǎn)生的預(yù)培養(yǎng)步驟。在一些實(shí)施方案中，所述適應(yīng)包含懸浮預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞，例如持續(xù)的時(shí)間使培養(yǎng)物達(dá)到例如約5L、約8L、約10L、約12L、約15L或約20L等的所需最終工作體積。此時(shí)，將培養(yǎng)物切換到連續(xù)培養(yǎng)基進(jìn)料并根據(jù)本文所述的連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行操作。在下面提供的實(shí)施例中進(jìn)一步討論本文公開的本發(fā)明的示例性實(shí)施例。但是所述實(shí)施例和它們的具體細(xì)節(jié)并非意在限制本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1 在化學(xué)成分明確的BA⑶-A13培養(yǎng)基(富集的DMEM/F12調(diào)配物)中利用表達(dá)人ADAMTS13的重組CHO細(xì)胞系制備恒化器培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)基如表1. 1中所示進(jìn)行補(bǔ)充。
表1.1:細(xì)胞培養(yǎng)基BACD-A13的組成組分濃度丨g/kglDMEM/HAMS F12 BaxS912.74L-谷氨酰胺1.3Synperonic1.00乙醇胺0.00153ZnSO4JH2O0.001NaHCO31.5
使表達(dá)人ADAMTS13的重組CHO細(xì)胞適應(yīng)化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基，即BCS培養(yǎng)基， 如表1. 2中所示。
表1.2:細(xì)胞培養(yǎng)基BCS的組成組分濃度[g/kg]DMEM/HAMS F12 Bax Special11.75L-谷氨酰胺0.9Synperonic1.00乙醇胺0.00153腐胺.2HC10.0036FeS04.7H200.0006NaHCO32.0使發(fā)展工作細(xì)胞庫(kù)(Development Working Cell Bank)融化，在BCS培養(yǎng)基中制備細(xì)胞接種物。把細(xì)胞轉(zhuǎn)移到具有Rushton型葉輪的IOL培養(yǎng)單元中，在BACD-A13培養(yǎng)基中的重復(fù)分批式培養(yǎng)中培植，利用線內(nèi)控制參數(shù)，如下pH 7. 10，溫度36°C，和DO 20%空氣飽和。2批次循環(huán)后，培養(yǎng)物達(dá)到最終工作體積10L，第4天把培養(yǎng)物切換到連續(xù)培養(yǎng)基進(jìn)料，并一直以恒化器模式操作到第18天。利用此培養(yǎng)物，對(duì)具有Rushton型葉輪和細(xì)胞截留裝置的第二個(gè)IOL培養(yǎng)單元接種以用于類似恒化器灌流，使用同樣的細(xì)胞培養(yǎng)基，并在重復(fù)分批式培養(yǎng)中培植8天。添加 CYT0P0RE 2 微載體(GE Healthcare) (0. 25g/L)，進(jìn)一步以連續(xù)類似恒化器灌流模式操作培養(yǎng)單元，與恒化器模式的另一培養(yǎng)單元并行進(jìn)行。在140rpm下利用具有擋板的Rushton 型葉輪攪動(dòng)培養(yǎng)單元，所述HOrpm對(duì)應(yīng)于近似40W/m3的比功率/體積輸出。兩種培養(yǎng)單元并行操作M天。以3個(gè)周間隔和另一 3天的間隔計(jì)算數(shù)據(jù)(表 1. 3 (恒化器)和表1. 4 (類似恒化器灌流)。表1. 3中四個(gè)間隔(第沈-32天、第33-39天、 第40-46天和第47-49天)的數(shù)據(jù)直接與表1. 4中所示的四個(gè)間隔(第9_15天、第16-22 天、第23- 天和第30-32天)的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。從培養(yǎng)單元取樣，利用ELISA分析ADAMTS13濃度，利用FRETS-73試驗(yàn)分析ADAMTS13活性。利用Nucleocounter技術(shù)測(cè)定細(xì)胞計(jì)數(shù)。對(duì)于灌流培養(yǎng)物，分開測(cè)量總細(xì)胞計(jì)數(shù)和上清液中的細(xì)胞計(jì)數(shù)以計(jì)算相對(duì)細(xì)胞截留。測(cè)量稀釋率，使用稀釋率計(jì)算生長(zhǎng)率和體積生產(chǎn)率。下面提供方程恒化器培養(yǎng)中的生長(zhǎng)率(μ)使用方程μ =0+111(^/^)/(^)計(jì)算，其中D = 稀釋率，Xt =時(shí)間t時(shí)的總細(xì)胞密度，和(t-tj = t與％之間的時(shí)間。類似恒化器灌流培養(yǎng)中的生長(zhǎng)率(μ)使用方程μ = In (XtAw) / (t-tj+D x(logmean XSN/logmean /(t-tj計(jì)算；其中D =稀釋率，Xt =時(shí)間t時(shí)的總細(xì)胞密度，(t-tj =t與％之間的時(shí)間，logmean X =總細(xì)胞密度的對(duì)數(shù)平均值=(Xt-Xw)/ (In(Xt)-In(Xw)),和logmean Xsn =上清液細(xì)胞密度的對(duì)數(shù)平均值。細(xì)胞截留率計(jì)算為100x(l-XSN/X) [% ]0
權(quán)利要求
1.一種用于在連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生所關(guān)心多肽和/或病毒的方法，所述方法包含(a)在連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)表達(dá)所述所關(guān)心多肽和/或病毒的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)包含細(xì)胞截留裝置并且具有小于2CT1的稀釋率(D)和小于2X107細(xì)胞 /mL的細(xì)胞密度；和(b)從自所述細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)除去的培養(yǎng)基中回收所述所關(guān)心多肽和/或病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞截留裝置產(chǎn)生小于90%的細(xì)胞截留率。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述稀釋率在0.IcT1與1. OcT1之間。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞密度小于IXlO7細(xì)胞/mL。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的稀釋率和比生長(zhǎng)率的比率(D/μ)在1.2與5之間。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的比生長(zhǎng)率在 0. 2(Γ 與 0. 8cT 之間。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞在所述細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)大于20天。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞在所述細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)大于40天。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞在所述細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)大于50天。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述稀釋率和所述細(xì)胞密度保持所述細(xì)胞在所述細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)時(shí)間的至少80%。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞截留裝置包含大孔微載體。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞在至少250L培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞是非錨定依賴性細(xì)胞。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包含在所述培養(yǎng)步驟之前，懸浮預(yù)培養(yǎng)所述細(xì)胞。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞經(jīng)過(guò)基因修飾以表達(dá)所述所關(guān)心多肽和/或病毒。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述多肽是去整合素樣金屬肽酶含血小板反應(yīng)蛋白1基元13(ADAMTS13)蛋白。
19.一種組合物，其包含根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的所關(guān)心多肽和 /或病毒°
20.一種組合物，其包含根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的重組ADAMTS13蛋白。
全文摘要
本文描述一種類似恒化器連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其合并了灌流開放系統(tǒng)和恒化器開放系統(tǒng)的某些優(yōu)點(diǎn)從而改進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如基因修飾細(xì)胞的培養(yǎng)，特別是在無(wú)血清或化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基中的培養(yǎng)。本文所述的連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)涉及在包含細(xì)胞截留裝置的連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的稀釋率(D)小于約2d-1，細(xì)胞密度小于約2X107細(xì)胞/mL。本文還描述一種用于在連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生所關(guān)心多肽和/或病毒的方法，所述方法包含在包含細(xì)胞截留裝置的連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)表達(dá)所關(guān)心多肽和/或病毒的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的稀釋率(D)小于約2d-1，細(xì)胞密度小于約2X107細(xì)胞/mL；和從細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的培養(yǎng)基中回收所關(guān)心多肽和/或病毒。
文檔編號(hào)C12N5/00GK102549142SQ201080036754
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2010年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月31日
發(fā)明者D·弗萊施漢德爾, L·格里爾伯格, M·賴特爾 申請(qǐng)人:巴克斯特保健股份有限公司, 巴克斯特國(guó)際公司