專利名稱：具有β-葡糖苷酶活性的新蛋白質(zhì)及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有β-葡糖苷酶活性的新蛋白質(zhì)及其用途，詳細地說，涉及來源于解纖維頂孢霉(Acremonium cellulolyticus)的具有β -葡糖苷酶活性的新蛋白質(zhì)、該蛋白質(zhì)的類似體和改變體、編碼這些蛋白質(zhì)的多核苷酸、以及這些蛋白質(zhì)的制造方法和用途。
背景技術(shù)：
纖維素是高等植物細胞的主要構(gòu)成成分，廣泛地天然存在。纖維素是由葡萄糖通過β-1，4-糖苷鍵聚合而成的高分子多糖，天然纖維素以結(jié)晶狀或非結(jié)晶狀態(tài)存在，進一步與其他成分、木質(zhì)素、半纖維素類、果膠類等復(fù)雜地結(jié)合而構(gòu)成植物組織。纖維素酶是分解纖維素的酶的總稱，一般由微生物生產(chǎn)的纖維素酶包含多種纖維素酶成分。纖維素酶成分從其底物特異性方面出發(fā)，被分類為纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶3種，在作為產(chǎn)生纖維素酶的絲狀菌的黑曲霉(Aspergillus niger)的情況下，認為最多產(chǎn)生4種纖維二糖水解酶、15種內(nèi)切葡聚糖酶、15種β-葡糖苷酶。認為這些顯示各種作用方式的多個酶互補表達協(xié)同效果，從而分解作為植物細胞壁的主成分的纖維素。葡糖苷酶被認為催化使葡萄糖從纖維寡糖、纖維二糖或與苷元形成β-D-吡喃葡萄糖基結(jié)合的配糖體中游離出來的反應(yīng)，是在纖維素的糖化系的最終階段和葡萄糖從配糖體的游離中重要的酶。從生物質(zhì)轉(zhuǎn)換乙醇具有可能容易獲得、能夠避免材料的燃燒或地下掩埋、和乙醇燃料清潔等優(yōu)點。木材、農(nóng)業(yè)殘留物、草本性作物和都市的固體狀垃圾作為乙醇制造用生物質(zhì)被關(guān)注。這些材料主要包含纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。一旦纖維素被轉(zhuǎn)化為葡萄糖，葡萄糖就容易地被酵母發(fā)酵成乙醇。另一方面，纖維二糖不會容易地被酵母發(fā)酵成乙醇，殘留的纖維二糖造成乙醇收量的降低。更重要的是，纖維二糖對內(nèi)切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶來說是強的抑制劑。因此水解中的纖維二糖的積累對于乙醇制造是不優(yōu)選的。由于纖維素酶產(chǎn)生微生物一般基本不產(chǎn)生β -葡糖苷酶，因而在酶的水解中發(fā)生的纖維二糖的積累成為主要問題。為了促進從纖維二糖向葡萄糖的轉(zhuǎn)化，在宿主中過量表達葡糖苷酶、增加葡糖苷酶的收量是促進從生物質(zhì)向葡萄糖的糖化的有效方法。因此，期望用與導(dǎo)入纖維
素酶產(chǎn)生微生物并表達的、新的葡糖苷酶基因的分離。另一方面，關(guān)于絲狀菌解纖維頂孢霉，已經(jīng)報告了其生產(chǎn)糖化力強的纖維素酶 (非專利文獻1)，在飼料用途和/或青貯料用途中具有高有用性(專利文獻1-；3)。另外，關(guān)于所含有的纖維素酶成分(專利文獻4-10)也進行了詳細研究，明確了其與其他絲狀菌同樣地分泌多種纖維素酶成分。特別是關(guān)于纖維素酶中的葡糖苷酶活性，報告了活性顯著高于里氏木霉(Trichoderma reesei)等的纖維素酶(專利文獻11)。從這樣的特性出發(fā)，作為分離葡糖苷酶基因的對象，解纖維頂孢霉受到關(guān)注。然而，到目前為止從解纖維頂孢霉分離出的基因還很少(專利文獻9、10)，而且對于分離出的基因，到目前為止還沒有成功地在除解纖維頂孢霉以外的絲狀菌中表達。
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專利文獻1 日本特開平7464994號公報專利文獻2 日本特許第2531595號說明書專利文獻3 日本特開平7-236431號公報專利文獻4 日本特開2001-17180號公報專利文獻5 國際公開97/33982號小冊子專利文獻6 國際公開99/011767號小冊子專利文獻7 日本特開2000/69978號公報專利文獻8 日本特開平10-066569號公報專利文獻9 日本特開2002/101876號公報專利文獻10 國際公開2002/(^6979號小冊子專利文獻11 日本特公昭60-43卯4號公報非專禾Ij文獻1 :“了夕D力卟手工，A · 了 >卜·· · K 4才口夕力卟 夂笑叉卜D — (Agricultural and Biological Chemistry)(日本)，1987 年，第 51 卷，第 65 頁

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明是鑒于這樣的狀況而做出的，其目標在于從解纖維頂孢霉中分離新的葡糖苷酶基因。本發(fā)明的進一步目標在于使分離出的葡糖苷酶基因在宿主中高表
達，增加從宿主的葡糖苷酶的收量。用于解決課題的方法本發(fā)明者們?yōu)榱私鉀Q上述課題，對于來源于解纖維頂孢霉的葡糖苷酶的分離、純化方法反復(fù)進行了深入研究，結(jié)果終于成功地在解纖維頂孢霉中鑒定出了與到目前為止已知的葡糖苷酶不同的新的葡糖苷酶。并且，還成功地分離出了編碼所鑒定出的葡糖苷酶的基因。關(guān)于從解纖維頂孢霉中分離葡糖苷酶基因，認為經(jīng)過長年試驗也沒有分離出本發(fā)明者們所發(fā)現(xiàn)的基因是由于，該基因所編碼的蛋白質(zhì)的疏水性高， 其分離、純化困難的緣故。進而，本發(fā)明者們對于使分離出的來源于解纖維頂孢霉的β-葡糖苷酶基因在宿主中高表達，在宿主中生產(chǎn)具有優(yōu)異的活性的葡糖苷酶的方法進行了深入研究，結(jié)果通過在β -葡糖苷酶基因中引入多個堿基的改變，在世界上首次成功地在除解纖維頂孢霉以外的絲狀菌內(nèi)高表達葡糖苷酶基因，并且使表達產(chǎn)物發(fā)揮高的葡糖苷酶活性。 由此，可以在宿主中高表達來源于解纖維頂孢霉的葡糖苷酶，增加葡糖苷酶的生產(chǎn)量。本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)，如果利用從這樣制作的轉(zhuǎn)化體獲得的β -葡糖苷酶或纖維素酶制備物，則可以有效地進行從生物質(zhì)向葡萄糖的糖化、和/或纖維素系底物的各種處理、改變， 從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明涉及來源于解纖維頂孢霉的具有葡糖苷酶活性的新蛋白質(zhì)、其類似體和改變體、編碼這些蛋白質(zhì)的多核苷酸、以及這些蛋白質(zhì)的制造方法和用途，更詳細地說，本發(fā)明提供下述方案。(1)編碼具有葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)的、下述⑴ (Vi)的任一項所記載的多核苷酸，
(i)編碼包含序列號3所記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸，(ii)包含序列號1或2所記載的堿基序列的編碼區(qū)的多核苷酸，(iii)編碼由在序列號3所記載的氨基酸序列中置換、缺失、插入和/或添加了 1 個或多個氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的多核苷酸，(iv)編碼包含與序列號3所記載的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸，(ν)與由序列號1或2所記載的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸，(vi)從(i) (ν)所記載的多核苷酸中除去了編碼信號序列的堿基序列的多核苷酸。(2)根據(jù)⑴所述的多核苷酸，來源于絲狀菌。(3)根據(jù)( 所述的多核苷酸，絲狀菌是解纖維頂孢霉。(4)編碼具有β -葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)的、下述(i)或(ii)所記載的多核苷酸，(i)編碼包含序列號5所記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸，(ii)包含序列號4所記載的堿基序列的編碼區(qū)的多核苷酸。(5)多核苷酸，是由在序列號4所記載的堿基序列中置換、缺失、插入和/或添加了 1個或多個堿基的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸，該多核苷酸編碼具有葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)，并且能在綠色木霉中表達。(6)根據(jù)( 所述的多核苷酸，能夠使該多核苷酸在綠色木霉中表達的情況下的轉(zhuǎn)化體中的葡糖苷酶活性，與綠色木霉的親株中的葡糖苷酶活性相比，提高至5倍以上。(7)從(4) (6)的任一項所述的多核苷酸中除去了編碼信號序列的堿基序列的多核苷酸。(8)表達載體，包含(1) (7)的任一項所述的多核苷酸。(9)宿主細胞，經(jīng)(8)所述的表達載體轉(zhuǎn)化。(10)由(1) (7)的任一項所述的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)。(11)根據(jù)(10)所述的蛋白質(zhì)，是重組蛋白質(zhì)。(12) (11)所述的蛋白質(zhì)的制造方法，包括培養(yǎng)(9)所述的宿主細胞，由該宿主細胞和/或其培養(yǎng)物中采集所表達的蛋白質(zhì)的工序。(13)纖維素酶制備物，包含(11)所述的蛋白質(zhì)。(14)分解或轉(zhuǎn)換纖維素材料的方法，包括用(10)所述的蛋白質(zhì)或(1 所述的纖維素酶制備物處理纖維素材料的工序。(15)被分解或轉(zhuǎn)換了的纖維素材料的制造方法，包括用(10)所述的蛋白質(zhì)或 (13)所述的纖維素酶制備物處理纖維素材料、回收纖維素材料分解物的工序。(16)根據(jù)(1 所述的方法，纖維素材料分解物是糖。(17)洗劑組合物，包含(10)所述的蛋白質(zhì)或(1 所述的纖維素酶制備物。(18)含纖維素的纖維的處理方法，包括使(10)所述的蛋白質(zhì)、(13)所述的纖維素酶制備物、或(17)所述的洗劑組合物與含纖維素的纖維接觸的工序。(19)廢紙的脫墨方法，其特征在于，在將廢紙用脫墨藥品處理進行脫墨的工序中，使用(10)所述的蛋白質(zhì)或(1 所述的纖維素酶制備物。(20)濾水性被改善了的紙漿的制造方法，包括用(10)所述的蛋白質(zhì)或(1 所述的纖維素酶制備物處理紙漿的工序。(21)消化能力被改善了的動物樣品的制造方法，包括用(10)所述的蛋白質(zhì)或 (13)所述的纖維素酶制備物處理動物飼料的工序。(22)由(2)所述的多核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)的表達被抑制了的絲狀菌。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，提供來源于解纖維頂孢霉的新的葡糖苷酶基因、和用于在宿主內(nèi)高效地表達葡糖苷酶的、該葡糖苷酶基因的類似體和改變體。進而，提供高表達該葡糖苷酶、顯示優(yōu)異的葡糖苷酶活性的宿主。由此，可以作為純化蛋白質(zhì)或作為纖維素酶制備物，以高收量獲得來源于解纖維頂孢霉的β -葡糖苷酶。


圖1是顯示質(zhì)粒pBGLB的限制性酶圖譜的圖。
具體實施例方式肺本發(fā)明提供新的具有葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)和編碼該蛋白質(zhì)的多核苷酸。在本發(fā)明中，“β-葡糖苷酶”是指顯示β-葡糖苷酶活性的酶、S卩β-D-Glucoside glucohydrolase EC3. 2. 1. 21?！?β -葡糖苷酶活性”是指以外切機制水解纖維寡糖、纖維二糖、或與苷元形成β -D-吡喃葡萄糖基結(jié)合的配糖體，生成葡萄糖的活性。本發(fā)明的編碼具有β-葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)的“多核苷酸”可包含例如，DNA 或RNA、或它們的修飾體或嵌合體，優(yōu)選為DNA。DNA包含cDNA、基因組DNA、和化學(xué)合成 DNA。由本發(fā)明者們所分離出的編碼來源于解纖維頂孢霉的新的葡糖苷酶(以下稱為 "acBGLB")的cDNA的堿基序列示于序列號1，基因組DNA的堿基序列示于序列號2。另外， 由這些DNA所編碼的acBGLB的氨基酸序列示于序列號3。本發(fā)明的多核苷酸的優(yōu)選方式是編碼由序列號3所記載的氨基酸序列構(gòu)成的 acBGLB的多核苷酸，可列舉例如，包含序列號1或2所記載的堿基序列的編碼區(qū)的多核苷酸。本發(fā)明還包含編碼與acBGLB功能上同等的蛋白質(zhì)的多核苷酸。作為這樣的多核苷酸，可列舉例如，acBGLB的突變體、衍生物、等位基因、變異體和同源物。這里“功能上同等”是指作為對象的蛋白質(zhì)具有葡糖苷酶活性。優(yōu)選與acBGLB相比具有70%以上、優(yōu)選為80%以上、更優(yōu)選為90%以上、最優(yōu)選為95%以上的β-葡糖苷酶活性。作為對象的蛋白質(zhì)和acBGLB的β -葡糖苷酶活性，可以在用文獻(Methods in ENZYMOLOGY, vol. 160, Biomass Part A Cellulose and Hemicellulose, Willis A. Wood 編 pl09_110)記載的方法測定時，作為1分鐘由對硝基苯基-葡糖苷生成1 μ moL的對硝基苯酚的活性進行評價。編碼與acBGLB功能上同等的蛋白質(zhì)的多核苷酸的一種方式，是編碼由在序列號3 所記載的氨基酸序列中置換、缺失、和/或添加了 1個或多個氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成、且具有葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。被改變的氨基酸殘基的數(shù)優(yōu)選為1 40個、更優(yōu)選為1 20個、進一步優(yōu)選為 1 8個、最優(yōu)選為1 4個。作為氨基酸的改變，優(yōu)選為保守置換?！氨Ｊ刂脫Q”是指以實質(zhì)上不改變多肽的活性的方式將1個或多個氨基酸殘基用其他化學(xué)上類似的氨基酸殘基置換?？闪信e例如，將某個疏水性氨基酸殘基用其他疏水性氨基酸殘基置換的情況、將某個極性氨基酸殘基用具有相同電荷的其他極性氨基酸殘基置換的情況等?？梢赃M行這樣的置換的功能上類似的氨基酸對于各個氨基酸是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。如果列舉具體例，則作為非極性(疏水性)氨基酸，可列舉丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、 苯丙氨酸、蛋氨酸等。作為極性(中性)氨基酸，可列舉甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。作為具有正電荷的(堿性)氨基酸，可列舉精氨酸、組氨酸、 賴氨酸等。另外，作為具有負電荷的(酸性)氨基酸，可列舉天冬氨酸、谷氨酸等。本發(fā)明的編碼具有葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸，在綠色木霉中表達的情況下，特別優(yōu)選為編碼包含序列號5所記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸(例如，包含序列號4所記載的堿基序列的編碼區(qū)的多核苷酸)。序列號4所記載的堿基序列與編碼 acBGLB的多核苷酸的堿基序列(序列號1)相比，13. 2%以上的堿基被改變。而且，在其編碼的氨基酸序列中，對于20種氨基酸中的16種氨基酸，進行了編碼的堿基序列的改變，在確定與各氨基酸對應(yīng)的密碼子時，考慮了宿主中的密碼子的使用頻率分布。由此，成功地在能夠在綠色木霉中表達的同時，使表達產(chǎn)物發(fā)揮高的葡糖苷酶活性。一旦得到了這樣的憂化序列，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員，就能夠以該序列為基礎(chǔ)，進一步改變堿基序列，獲得與包含序列號4所記載的堿基序列的編碼區(qū)的多核苷酸同樣地能夠在木霉屬中表達的多核苷酸。因此，本發(fā)明提供由在序列號4所記載的堿基序列中置換、缺失、插入和/或添加了 1個或多個(優(yōu)選為30個堿基以內(nèi)、進一步優(yōu)選為20個堿基以內(nèi)、進一步優(yōu)選為10個堿基以內(nèi)、進一步優(yōu)選為5個堿基以內(nèi))堿基的堿基序列構(gòu)成，且編碼具有葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)，并且能夠在綠色木霉中表達的多核苷酸。這樣的多核苷酸的優(yōu)選方式，是能夠使在綠色木霉中表達的情況下的轉(zhuǎn)化體中的葡糖苷酶活性，與綠色木霉的親株(尿嘧啶生物合成基因未缺失的原綠色木霉菌株)中的葡糖苷酶活性(參照實施例5)相比， 提高至5倍以上(優(yōu)選為7倍以上)的多核苷酸。本發(fā)明中的、編碼與acBGLB功能上同等的蛋白質(zhì)的多核苷酸的其他方式，是編碼由與序列號3所記載的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列構(gòu)成、且具有 β-葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。這里“同一性(identity) ”是指在作為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的同源性檢索程序的 FASTA3 [Science，227，1435-1441 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444-2448 (1988)、http://www. ddbj. nig. ac. jp/E-mail/homology-j. html] 中使用默認(初始設(shè)定)的參數(shù)計算出的數(shù)值。作為所述同一性，優(yōu)選為95%以上的同一性、進一步優(yōu)選為98%以上的同一性、特別優(yōu)選為99%以上的同一性。本發(fā)明中的、編碼與acBGLB功能上同等的蛋白質(zhì)的多核苷酸的其他方式，是與由序列號1或2所記載的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸在嚴格條件下雜交、且編碼具有β -葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸。這里“嚴格條件”是指將雜交后的膜的洗滌操作在高溫度低鹽濃度溶液中進行，例如，在2XSSC濃度(1XSSC :15mmol/L檸檬酸3鈉、150mmol/L氯化鈉)、0. 5% SDS溶液中、60°C、20分鐘的洗滌條件。
本發(fā)明還提供從編碼acBGLB或與acBGLB功能上同等的蛋白質(zhì)的多核苷酸中除去了編碼信號序列的堿基序列的多核苷酸。acBGLB的信號序列，是在序列號3所記載的氨基酸序列中-18位 -1位的氨基酸序列。本發(fā)明的蛋白質(zhì)在不影響β-葡糖苷酶活性的范圍內(nèi)，可以在與成熟蛋白質(zhì)部分對應(yīng)的各氨基酸序列的N末端和/或C末端賦予任意的多肽序列。作為這樣的多肽序列， 可列舉例如，信號序列、檢測用標記(例如，F(xiàn)LAG標簽)、純化用多肽[例如，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)]。本發(fā)明的編碼具有葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的制備對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說可以利用常規(guī)方法來進行。在本發(fā)明的編碼具有葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)的基因組DNA的制備中，例如，首先，從解纖維頂孢霉等目標微生物中通過慣用方法提取基因組DNA。將該基因組DNA用適當?shù)南拗菩悦赶螅c適當?shù)妮d體連接，從而制作解纖維頂孢霉的基因組DNA文庫。作為載體，可以使用例如，質(zhì)粒載體、噬菌體載體、粘粒載體、BAC載體等各種載體。接著，可以基于本發(fā)明的編碼具有葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的堿基序列(例如，序列號2)制成適當?shù)奶结?，從基因組DNA文庫中通過雜交來分離所需的基因組DNA。另外，還可以基于本發(fā)明的編碼具有葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的堿基序列(例如，序列號2)制成引物，以解纖維頂孢霉的基因組DNA為模板進行PCR， 將擴增出的DNA片段與適當?shù)妮d體連接，從而分離所需的基因組DNA。另外，在本發(fā)明的編碼具有β -葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)的cDNA的制備中，例如，首先，基于從解纖維頂孢霉等目標微生物中提取出的mRNA合成cDNA。將該cDNA用適當?shù)南拗菩悦赶?，與適當?shù)妮d體連接，從而制作解纖維頂孢霉的cDNA文庫。接著，可以基于本發(fā)明的編碼具有葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的堿基序列(例如，序列號1)制成適當?shù)奶结槪瑥腸DNA文庫中通過雜交分離出所需的cDNA。另外，可以基于本發(fā)明的編碼具有葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的堿基序列(例如，序列號1)制成引物，以解纖維頂孢霉的cDNA為模板進行 PCR,將擴增出的DNA片段與適當?shù)妮d體連接，從而分離所需的cDNA。另外，本發(fā)明的編碼具有β-葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸也可以人工化學(xué)合成。在本發(fā)明中，提供以能夠在宿主微生物內(nèi)復(fù)制、且能夠表達由該多核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的狀態(tài)包含本發(fā)明的編碼具有葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的表達載體。本發(fā)明的表達載體可以以自我復(fù)制載體、即作為染色體外的獨立體存在、其復(fù)制不依賴于染色體的復(fù)制的例如質(zhì)粒為基礎(chǔ)來構(gòu)建。另外，本發(fā)明的表達載體在被導(dǎo)入宿主微生物時，還可以插入到該宿主微生物的基因組中，與其所插入的染色體一起復(fù)制。本發(fā)明的表達載體的構(gòu)建的步驟和方法可以使用基因工程學(xué)領(lǐng)域慣用的步驟和方法。本發(fā)明的表達載體為了能夠?qū)嶋H導(dǎo)入宿主微生物并表達具有葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)，優(yōu)選除了上述本發(fā)明的編碼具有葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列之夕卜，還包含控制其表達的多核苷酸序列和/或用于篩選微生物的基因標記等。作為控制表達的多核苷酸序列，可列舉例如，啟動子、終止子、或編碼信號肽的多核苷酸序列。啟動子只要在宿主微生物中顯示轉(zhuǎn)錄活性即可，不特別限定，可以來源于宿主微生物的同種微生物， 也可以來源于異種微生物。另外，信號肽只要是在宿主微生物中有助于蛋白質(zhì)的分泌即可， 不特別限定，可以來源于宿主微生物的同種微生物，也可以來源于異種微生物。另外，基因標記可以根據(jù)轉(zhuǎn)化體的篩選方法適宜選擇，例如，可以利用編碼耐藥性的基因和/或互補營養(yǎng)缺陷型的基因。而且，本發(fā)明提供經(jīng)該表達載體轉(zhuǎn)化的微生物。作為本發(fā)明中使用的宿主微生物， 不特別限定，可列舉例如，絲狀菌、酵母、大腸桿菌、放線菌等。作為酵母細胞，可列舉例如， 屬于酵母屬(Saccharomyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)、或畢赤酵母屬(Pichia)的酵母細胞，優(yōu)選的酵母細胞的一例是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 0另外，作為絲狀菌， 可列舉例如，屬于腐質(zhì)霉屬(Humicola)、曲霉屬(Aspergillus)或木霉屬(Trichoderma)、 鐮刀菌屬(Fusarium)、或頂孢霉屬(Acremonium)的絲狀菌，優(yōu)選的絲狀菌的例子是特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)、或綠色木霉(Trichoderma viride)、尖抱鍵刀菌(Fusarium oxysporum)、或角軍纖維頂孢霉(Acremonium cellulolyticus)。本發(fā)明的表達載體的這些微生物的轉(zhuǎn)化可以按照本領(lǐng)域慣用的方法來進行?？梢詫⑦@樣制備的轉(zhuǎn)化體在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)，從其培養(yǎng)物(例如，培養(yǎng)細胞、 培養(yǎng)上清)中回收本發(fā)明的具有葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)(或后述的本發(fā)明的纖維素酶制備物)。轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)及其條件可以與所使用的微生物的培養(yǎng)及其條件本質(zhì)上同等。另夕卜，在培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體之后回收目標蛋白質(zhì)的方法可以使用本領(lǐng)域慣用的方法。例如，可以使用轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)物通過離心分離等除去而得的上清液作為粗酶。進而，可以將該上清液通過超濾法等濃縮，加入防腐劑等制成濃縮酶。進而，濃縮后可以通過噴霧干燥法等制成粉末酶。本發(fā)明的具有葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)(或本發(fā)明的纖維素酶制備物) 可以將這些濃縮酶或粉末酶根據(jù)需要部分純化或高度純化而獲得。作為純化方法，可以單獨或適宜組合使用常規(guī)方法，例如利用硫酸銨等的鹽析法、利用醇等的有機溶劑沉淀法、膜分離法、或使用離子交換體、疏水色譜用載體、或凝膠過濾用載體等的色譜分離法。本發(fā)明還提供這樣的本發(fā)明的具有β-葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)(或本發(fā)明的纖維素酶制備物)的制造方法。纖維素酶制備物本發(fā)明提供包含上述本發(fā)明的具有葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)的纖維素酶制備物。本發(fā)明的纖維素酶制備物除了本發(fā)明的具有葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)以外，還可以包含其他蛋白質(zhì)。作為其他蛋白質(zhì)，例如，可以包含除本發(fā)明的具有葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)以外的葡糖苷酶、半纖維素酶、內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、氨肽酶、淀粉酶、 糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、 α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、加鹵酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽谷氨酰胺酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白質(zhì)分解酶、核糖核酸酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶或木聚糖酶。本發(fā)明的纖維素酶制備物所含的、除本發(fā)明的具有葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)以外的蛋白質(zhì)可以來源于表達本發(fā)明的具有β -葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體，也可以另外添加。本發(fā)明的纖維素酶制備物可以與一般含有的載體或介質(zhì)例如賦形劑(例如，乳糖、氯化鈉、山梨糖醇等)、表面活性劑、防腐劑等混合來制造。另外，本發(fā)明的纖維素酶制備物可以以適當?shù)男螤?、例如粉末或液體狀來制備。n有 β-mm^mm^^m^mmMM^mm^本發(fā)明提供包括用本發(fā)明的具有葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)或本發(fā)明的纖維素酶制備物處理纖維素材料的步驟的分解或轉(zhuǎn)換纖維素材料的方法。進而，本發(fā)明提供包括在處理纖維素材料之后回收纖維素材料分解物的步驟的被分解或轉(zhuǎn)換了的纖維素材料的制造方法。纖維素材料典型地為生物質(zhì)，作為其例子，可列舉稻秸、甘蔗渣、玉米秸、椰子果實等果實的榨渣、廢木材、和對它們進行適當?shù)那疤幚砗蟮牟牧希幌抻谶@些。在纖維素材料的處理中使用的、具有葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)或纖維素酶制備物可以是除去了細胞的形態(tài)、或者未除去的粗制發(fā)酵液的形態(tài)，也可以是半純化或純化后的制備物的形態(tài)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體在使用生物質(zhì)的發(fā)酵工藝中，可以作為生產(chǎn)本發(fā)明的具有葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)的源使用。轉(zhuǎn)化體中還可以導(dǎo)入各種纖維素酶基因、和/或編碼在生物質(zhì)的加工中有效的其他酶的基因。本發(fā)明的方法可以用于例如由生物質(zhì)化學(xué)地或作為發(fā)酵給料制造糖(例如，單糖類、二糖類、多糖類)。這樣獲得的糖是用于制造例如乙醇、塑料、其他生成物或中間體的原料。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的具有葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)或本發(fā)明的纖維素酶制備物的洗劑組合物。本發(fā)明的洗劑組合物還可以含有表面活性劑(可以是陰離子性、 非離子性、陽離子性、兩性或雙性離子性或它們的混合物)。另外，所述洗劑組合物還可以含有本領(lǐng)域已知的其他洗劑成分，例如，增潔劑、漂白劑、漂白活性劑、防腐劑、金屬離子螯合齊U、污垢解離聚合物、香料、其他酶(蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等)、酶穩(wěn)定劑、制劑化輔助劑、 熒光增白劑、和/或發(fā)泡促進劑等。本發(fā)明還提供包括使本發(fā)明的具有β -葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)、本發(fā)明的纖維素酶制備物、或該洗劑組合物與含纖維素的纖維接觸的工序的含纖維素的纖維的處理方法。 作為能夠通過本發(fā)明的處理方法來改善的、含纖維素的纖維的性質(zhì)，可列舉例如，(1)通過減量來改善纖維的肌膚觸感和外觀；( 賦予著色的含纖維素的纖維以顏色的局部變化， 即，向著色含纖維素的纖維、代表性地為牛仔布賦予石洗樣的外觀和手感；C3)使著色含纖維素的纖維的顏色清新化、(4)柔軟化(降低開始發(fā)硬的速度、減少發(fā)硬)、(5)除去毛刺 (降低開始起毛的速度、減少起毛)。本發(fā)明還提供廢紙的脫墨方法，其特征在于，在將廢紙用脫墨藥品處理進行脫墨的工序中，使用本發(fā)明的具有葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)或本發(fā)明的纖維素酶制備物。本發(fā)明還提供包括用本發(fā)明的具有葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)或本發(fā)明的纖維素酶制備物處理紙漿的工序的、濾水性被改善了的紙漿的制造方法。根據(jù)本發(fā)明，可以在不伴隨強度顯著降低的條件下改善紙漿的濾水性。作為處理對象的紙漿的例子，可列舉廢紙漿、再循環(huán)厚紙漿、牛皮紙漿、亞硫酸紙漿或加工熱處理和其他高收率紙漿，但不限于這些。本發(fā)明還提供包括用本發(fā)明的具有葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)或本發(fā)明的纖維素酶制備物處理動物飼料的工序的、消化能力被改善了的動物飼料的制造方法。根據(jù)本發(fā)明的方法，例如，可以改善動物體內(nèi)對飼料中的葡聚糖的消化能力。H有β -苷S^舌件的蛋白Jli的表達她抑泡IT的絲狀I(lǐng)f本發(fā)明提供本發(fā)明的具有β-葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)的表達被抑制了的絲狀菌。 絲狀菌優(yōu)選為屬于頂孢霉屬(Acremonium)的絲狀菌，最優(yōu)選為解纖維頂孢霉(Acremonium cellulolyticus)。絲狀菌中的本發(fā)明的具有β-葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)(內(nèi)源性蛋白質(zhì)) 的表達的抑制可以利用例如RNA干涉法、反義RNA *DNA法、同源重組等通用技術(shù)來進行。制成用于這些技術(shù)的多核苷酸分子(例如，siRNA、反義RNA、反義DNA、包含與用于同源重組的
11目標DNA相同的序列的多核苷酸等)、制成包含這些多核苷酸的載體、和向宿主導(dǎo)入載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。在利用這樣制作的絲狀菌進行在植物等中廣泛分布的纖維素的分解的情況下，在其分解過程中不生成作為最終分解物的葡萄糖，而是選擇性地制造兩分子葡萄糖以β _1，4鍵結(jié)合而成的纖維二糖。纖維二糖由于在有甜味的同時在人體內(nèi)不被分解，因而作為健康食品和/或糖尿病患者用食品的甜味料、化妝品原料、或藥品原料是有用的。如果利用本發(fā)明的絲狀菌，則可以廉價地提供這樣的制品原料。實施例通過實施例更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明在不超過其要旨的范圍內(nèi)不限于以下實施例。[實施例1]解纖維頂孢霉的β-葡糖苷酶的純化由解纖維頂孢霉制備噴霧干燥后的纖維素酶的粉末酶，溶解在含0.5Μ的 (NH4)2SO4 WTris-HCl緩沖液(0. 05Μ、ρΗ值7. 0)中，通過高速冷卻離心分離除去雜質(zhì)。將所得的上清作為酶純化的起始材料，用以下所示的方法純化。(a)疏水性色譜法(其1)在含0. 5M的(NH4)2SO4的Tris-HCl緩沖液(0. 05M、ρΗ值7. 0)中使上清所含的蛋白質(zhì)吸附于HiTrap Butyl FF(GE Healthcar社制)，接著在含(NH4)2S04 0· 5M OM的 Tris-HCl緩沖液(0. 05M、pH值7. 0)中進行所吸附的蛋白質(zhì)的梯度溶出，分離出顯示β -葡糖苷酶活性的級分。(b)疏水性色譜法(其2)使上述(a)所得的級分中的蛋白質(zhì)再次吸附于HiTrap Butyl FF(GE Healthcare 社制)，接著用與(a)同樣的方法進行所吸附的蛋白質(zhì)的梯度溶出，分離出顯示葡糖苷酶活性的級分。(c)強堿性陰離子交換色譜法在Tris-HCl緩沖液(0. 05Μ、ρΗ值7. 0)中，使上述(b)所得的級分中的蛋白質(zhì)吸附于 MonoQ (GE Healthcare 社制)，在含 NaCl OM IM 的 Tris-HCl 緩沖液(0. 05M、ρΗ 值 7.0)中進行所吸附的蛋白質(zhì)的梯度溶出，分離出顯示葡糖苷酶活性的級分。[實施例2]純化的β-葡糖苷酶的部分氨基酸序列確定對于實施例1的用強堿性陰離子交換色譜法分離出的具有β -葡糖苷酶活性的級分，使用12% Gel SDS-PAGE mini ( r 7 二社制)通過電泳進行分離，鑒定出解纖維頂孢霉的葡糖苷酶B(acBGLB)。切下acBGLB的條帶，然后還原羧甲基化，接著用賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶(Lysyl Endopeptidase)處理。將該分解產(chǎn)物使用 12% Gel SDS-PAGE mini ( r 7 -社制)通過電泳進行分離，點樣在PVDF膜(S V 社制)上。切下所得的肽片段的條帶，使用蛋白質(zhì)測序儀Model 492( Π八K 才* ；^〒Λ <社制)確定肽片段的N末端氨基酸序列。確定的acBGLB的部分氨基酸序列(“BGLB-LE-1 ”、“BGLB-LE-2”)分別示于序列號6和7。[實施例3]acBGLB基因的克隆(1)基因組DNA的分離將解纖維頂孢霉ACCP-5-1菌株用(s)培養(yǎng)基O %肉湯、0. 5 %酵母提取物和 2%葡萄糖)在32°C培養(yǎng)2天，通過離心分離回收菌體。按照堀內(nèi)等的方法(H. Horiuchiet.al.，J. Bacteriol.，170，272-278，(1988))從所得的菌體中分離基因組 DNA。(^acBGLB基因片段的獲得基于acBGLB的部分氨基酸序列制作以下引物。BGLB-F CCNTTYGTNGGNAAYACNGCNGCNCC (序列號 8)BGLB-R CATDATRTANCCNGGRAANCC (序列號 9)使用BGLB-F和BGLB-R作為引物，以基因組DNA為模板進行PCR。PCR使用LA taq 聚合酶(夕力，才社制)進行。PCR將“94°C下30秒、53°C下30秒、72°C下2分鐘，，進行35個循環(huán)。將擴增出的650bp的DNA片段使用TOPO TA克隆試劑盒(4 > e卜π 7 - > 社制)按照附帶的方案插入到PCR2. 1-T0P0質(zhì)粒載體中，得到質(zhì)?！癟OPO-pBGLB-partial ”?？寺〉劫|(zhì)粒“TOPO-pBGLB-partial ”中的插入DNA片段的測序，使用BigDye Terminator v3. 1 Cycle Sequebcing Kit ( 7 7° 7 F K 4 才 * 7 于 Λ 文社制)和 ABI PRISM遺傳分析儀(7 ” 4 κ /W ν ^ r Λ ^；'社制)按照附帶的方案來確定。將所得的堿基序列翻譯成氨基酸序列，對該氨基酸序列進行同源性檢索，結(jié)果是，與來源于土曲霉 (Aspergillus terreus)的β -葡糖苷酶(ΧΡ_001216552)顯示72%的同源性，與來源于馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)的 β -葡糖苷酶(ΧΡ_002149046. 1)顯示 88%的同源性，因此判斷本DNA片段是β-葡糖苷酶(Glycoside Hydrolase family 3)基因的一部分。(3)通過反向PCR法獲得acBGLB基因全長反向PCR法按照iTriglia等的方法(TTriglia et. al. ,Nucleic Acids Research, 16,8186, (1988))進行。將解纖維頂孢霉的基因組DNA用kal消化一夜，使用Mighty Mi(夕力，“才社制)由消化片段制作環(huán)狀DNA。以本環(huán)狀DNA為模板，使用基于acBGLB 基因片段的堿基序列信息制作的下述引物進行PCR，獲得acBGLB基因的5’上游區(qū)域以及 3’下游區(qū)域。BGLB-inv-F TAGGCGTTCGTTATGCGAAC(序列號 10)BGLB-inv-R :AAACGAGATTCCAGATGGCG (序列號 11)通過實施例3-( 所述的方法分析上述5’上游區(qū)域以及3’下游區(qū)域，確定BGLB 基因的全長堿基序列?；谕ㄟ^反向PCR法獲得的堿基序列制作以下引物，以基因組DNA為模板進行 PCR，擴增BGLB基因。pBGLB-F CTGGACCTATATTCCCCGAT (序列號 12)pBGLB-R TGGTTTGTCCATACTGCGTC (序列號 13)用Τ0Ρ0 TA克隆試劑盒(4 > '卜α夕工 > 社制)將擴增所得的DNA插入到pCR2. 1-T0P0質(zhì)粒載體中，得到質(zhì)?！皃BGLB”。用所得的質(zhì)?！皃BGLB”轉(zhuǎn)化大腸桿菌 (Escherichia coli)T0P10 菌株(4 > 卜口夕工 >社制)，從而得到 “Escherichia coli T0P10 菌株 /pBGLB，，。(4) acBGLB cDNA的制作和acBGLB基因組DNA的內(nèi)含子分析將解纖維頂孢霉ACCP-5-1菌株用纖維素酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基在32°C培養(yǎng)2天，通過離心分離回收菌體。將所得的菌體用液氮凍結(jié)，然后使用研缽和研杵磨碎。用IS0GEN( 二 ” ^ >^一>社)按照附帶的方案從該磨碎的菌體中分離總RNA。進而，使用mRNA純化試劑盒(7 7 > * 7社)按照附帶的方案從總RNA中純化mRNA。使用 Time&iver cDNA Synthesis Kit ( 7 7 A * 7 社)按照附帶的方案由這樣獲得的mRNA合成cDNA。由acBGLB基因序列制成包含起始密碼子和終止密碼子的下述引物，以cDNA為模板進行PCR。 BGLB-N :ATGTATTCCGCATTTCTTTTGCTGC (序列號 14)BGLB-C CTATTGTAGGCATTGAGAATACCAT (序列號 15)通過實施例3-⑵所述的方法來分析擴增出的cDNA的堿基序列(序列號1)，與 PBGLB基因組DNA的堿基序列比較，從而確定基因組DNA中的內(nèi)含子的位置。(5) acBGLB的氨基酸序列的推定通過上述方法分離出的acBGLB基因組DNA的外顯子和內(nèi)含子由序列號2所記載的堿基序列的218 觀47位所示的^30bp構(gòu)成。另外，acBGLB基因組DNA包含序列號2 所記載的堿基序列的734 792位、1665 1717位和2523 沈01位所示的3個內(nèi)含子。 由開放閱讀框(ORF)預(yù)測的acBGLB的氨基酸序列如序列號3所示。該由ORF預(yù)測的氨基酸序列的一部分與在實施例2中確定的acBGLB的內(nèi)部序列一致。由該事實可明確，分離出的基因組DNA編碼acBGLB。此外，通過信號序列預(yù)測軟件SignalP 3. 0推定acBGLB的-18 至-1氨基酸殘基為信號序列。[實施例4]acBGLB基因在綠色木霉中的表達(1)適合在綠色木霉中表達的acBGLB基因密碼子的改變?yōu)榱耸筧cBGLB基因在綠色木霉中作為有活性的蛋白質(zhì)高表達，進行acBGLB基因的改變。由嘗試法的結(jié)果發(fā)現(xiàn)了伴隨從acBGLB基因中13. 2%以上的堿基改變的、由序列號 4所記載的堿基序列構(gòu)成的DNA。該改變acBGLB基因是對于20種氨基酸中的16種氨基酸進行編碼堿基序列的改變，同時考慮綠色木霉中的密碼子的使用頻率分布而設(shè)計出的。該改變acBGLB基因由株式會社7 — >〒〒< > 人工合成。人工合成時，設(shè)計成在起始密碼子的上游的序列包含和一Bi、在終止密碼子的下游包含gl和那樣。獲得了在 PUC19的插入了密碼子改變acBGLB基因的質(zhì)粒“pBGLBkai”。(2)密碼子改變BGLB表達質(zhì)粒BGLBkai-pCBl的構(gòu)建將質(zhì)粒“pBGLBkai”用Sn^BI和gl切害I]，得到約2. 7kbp的基因片段 “BGLBkai-N”。另一方面，為了從pCBl_Eg3X(國際公開98/11239號小冊子)中刪除潮霉素 B抗性盒，用限制性酶XMI切割，然后使用TaKaRa DNA Ligation Kit Mighty Mix(寶酒造社制)再制成環(huán)狀，將所得的質(zhì)粒作為“pCBl-Eg3X-hphleSS”。將“pCBl-Eg3X-hphleSS”用 StuI 和切害I]，回收約 7kbp 的片段。使用 TaKaRa DNA Ligation Kit Mighty Mix (寶酒造社制)將其與約2. 7kbp的基因片段“BGLBkai-N”連接，制成質(zhì)?！癇GLBkai-pCBl”。酶等的反應(yīng)條件按照試劑盒所附帶的說明書的條件。質(zhì)?！癇GLBkai-pCBl”構(gòu)建成在宿主綠色木霉內(nèi)使用自身的起始密碼子表達改變acBGLB那樣。(3)質(zhì)?！癇GLBkai-pCBl”的綠色木霉的轉(zhuǎn)化體的制作按照國際公開第2005/056787號小冊子所記載的方法用實施例4-(2)中所得的質(zhì)?！癇GLBkai-pCBl”轉(zhuǎn)化綠色木霉。以作為尿嘧啶生物合成基因(·4)缺失菌株的綠色木霉Strain2株為宿主，使用粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)的pyr4基因作為選擇標記， 通過共轉(zhuǎn)化法進行轉(zhuǎn)化。將綠色木霉strait株在50mL的菌體形成培養(yǎng)基(1%酵母提取物、麥芽提取物、2%多價蛋白胨、2. 5%葡萄糖、0. 磷酸氫二鉀、0. 05%硫酸鎂7水合物、0. 0001%尿苷(pH值7. 0))中在28°C培養(yǎng)24小時，以3000轉(zhuǎn)/分鐘離心分離10分鐘， 收集菌體。將所得的菌體用0. 5mol/L蔗糖洗滌，懸浮于用棉花過濾后的原生質(zhì)體化酶溶液(lmg/mL β -葡糖醛酸糖苷酶、0. 3mg/mL幾丁質(zhì)酶、0. 3mg/mL酵母裂解酶、0. 5mol/L蔗糖)中。在30°C振蕩60分鐘，使菌絲原生質(zhì)體化。過濾該懸浮液，然后以2500轉(zhuǎn)/分鐘離心分離10分鐘回收原生質(zhì)體，用SUTC緩沖液(0. 5mol/L蔗糖、10mmol/L氯化鈣、10mmol/L Tris-鹽酸(pH值7. 5))洗滌。將該原生質(zhì)體懸浮于100 μ L的SUTC緩沖液中，向其中加入添加有10 μ g分量的質(zhì)粒“BGLBkai-pCBl ”的DNA溶液10 μ L和添加有pyr4基因的DNA溶液10 μ L，在冰中靜置 5 分鐘。接著加入400μ L 的PEG 溶液(60% PEG4000、l(toimol/L 氯化鈣、l(toimol/L Tris-鹽酸(pH值7. 5))，在冰中靜置20分鐘，然后加入IOmL的SUTC緩沖液，以2500轉(zhuǎn)/分鐘離心分離10分鐘。將收集的原生質(zhì)體懸浮于ImL的SUTC緩沖液中，與軟瓊脂各200 μ L在含 0. 5mol/L蔗糖的基本培養(yǎng)基上一起疊層，在培養(yǎng)5天，然后將生長的菌落再次移植至基本培養(yǎng)基，將這里所形成的菌落作為轉(zhuǎn)化體。(4) “BGLBkai-pCBl”的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)和鑒定篩選導(dǎo)入質(zhì)?！癇GLBkai-pCBl”而在基本培養(yǎng)基上生長的菌株，依據(jù)國際公開第 98/11239號小冊子進行培養(yǎng)。將所得的培養(yǎng)上清液使用12% Gel SDS-PAGE mini ( r 7 二社制)進行電泳分離，篩選能良好地檢測出與實施例2中鑒定的acBGLB相同的泳動距離的條帶的培養(yǎng)上清。(5)重組改變acBGLB的部分氨基酸序列的鑒定為了確認在實施例4- )中大量表達的蛋白質(zhì)是改變acBGLB，確定了部分氨基酸序列。首先，對于培養(yǎng)上清中的蛋白質(zhì)使用12% Gel SDS-PAGE mini ( r 7 ^社制)通過電泳進行分離，按照實施例2的方法將分離的acBGLB的條帶用賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶處理。將該分解產(chǎn)物使用12% Gel SDS-PAGE mini ( r 7 二社制)通過電泳進行分離，點樣在PVDF膜 ($ 'J f 7社制)上。切下所得的肽片段的條帶，使用蛋白質(zhì)測序儀Model 492( 7 λ K ν ^ r Λ <社制)確定肽片段的N末端氨基酸序列。其結(jié)果與acBGLB的部分氨
基酸序列(序列號6) —致。[實施例5]綠色木霉轉(zhuǎn)化體中的酶活性的測定使用實施例4-(4)所得的“BGLBkai-pCBl”轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)上清測定β -葡糖苷酶活性。測定法依據(jù)文獻(Methods in ENZYM0L0GY,vol. 160,Biomass Part A Cellulose and Hemicellulose, Willis A. Wood編pl09_110)所述的方法。此外，β -葡糖苷酶活性定義為1分鐘內(nèi)由對硝基苯基-葡糖苷生成1 μ moL的對硝基苯酚的活性，作為每ImL培養(yǎng)上清的活性(U/mL)表示。其結(jié)果如表1所示。正如由表1可明確的那樣，轉(zhuǎn)化體顯示親株 (尿嘧啶生物合成基因未缺失的原綠色木霉菌株)的約7. 5倍的活性。表 權(quán)利要求
1.編碼具有葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)的、下述(i) (vi)的任一項所記載的多核苷酸，(i)編碼包含序列號3所記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸， ( )包含序列號1或2所記載的堿基序列的編碼區(qū)的多核苷酸，(iii)編碼由在序列號3所記載的氨基酸序列中置換、缺失、插入和/或添加了1個或多個氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的多核苷酸，(iv)編碼包含與序列號3所記載的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸，(ν)與由序列號1或2所記載的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸，(vi)從(i) (ν)所述的多核苷酸中除去了編碼信號序列的堿基序列的多核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多核苷酸，來源于絲狀菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多核苷酸，絲狀菌是解纖維頂孢霉。
4.編碼具有葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)的、下述(i)或(ii)所述的多核苷酸， (i)編碼包含序列號5所記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多核苷酸，( )包含序列號4所記載的堿基序列的編碼區(qū)的多核苷酸。
5.多核苷酸，是由在序列號4所記載的堿基序列中置換、缺失、插入和/或添加了1個或多個堿基的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸，該多核苷酸編碼具有β -葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)，并且能在綠色木霉中表達。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的多核苷酸，能夠使該多核苷酸在綠色木霉中表達的情況下的轉(zhuǎn)化體中的葡糖苷酶活性，與綠色木霉的親株中的葡糖苷酶活性相比，提高至5倍以上。
7.從權(quán)利要求4 6的任一項所述的多核苷酸中除去了編碼信號序列的堿基序列的多核苷酸。
8.表達載體，包含權(quán)利要求1 7的任一項所述的多核苷酸。
9.宿主細胞，經(jīng)權(quán)利要求8所述的表達載體轉(zhuǎn)化。
10.由權(quán)利要求1 7的任一項所述的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的蛋白質(zhì)，是重組蛋白質(zhì)。
12.權(quán)利要求11所述的蛋白質(zhì)的制造方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求9所述的宿主細胞，由該宿主細胞和/或其培養(yǎng)物中采集所表達的蛋白質(zhì)的工序。
13.纖維素酶制備物，包含權(quán)利要求11所述的蛋白質(zhì)。
14.分解或轉(zhuǎn)換纖維素材料的方法，包括用權(quán)利要求10所述的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求13所述的纖維素酶制備物處理纖維素材料的工序。
15.被分解或轉(zhuǎn)換了的纖維素材料的制造方法，包括用權(quán)利要求10所述的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求13所述的纖維素酶制備物處理纖維素材料、回收纖維素材料分解物的工序。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，纖維素材料分解物是糖。
17.洗劑組合物，包含權(quán)利要求10所述的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求13所述的纖維素酶制備物。
18.含纖維素的纖維的處理方法，包括使權(quán)利要求10所述的蛋白質(zhì)、權(quán)利要求13所述的纖維素酶制備物、或權(quán)利要求17所述的洗劑組合物與含纖維素的纖維接觸的工序。
19.廢紙的脫墨方法，其特征在于，在將廢紙用脫墨藥品處理進行脫墨的工序中，使用權(quán)利要求10所述的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求13所述的纖維素酶制備物。
20.濾水性被改善了的紙漿的制造方法，包括用權(quán)利要求10所述的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求 13所述的纖維素酶制備物處理紙漿的工序。
21.消化能力被改善了的動物樣品的制造方法，包括用權(quán)利要求10所述的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求13所述的纖維素酶制備物處理動物飼料的工序。
22.由權(quán)利要求2所述的多核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)的表達被抑制了的絲狀菌。
全文摘要
通過組合疏水性色譜法和強堿性陰離子交換色譜法，從而成功地從解纖維頂孢霉中鑒定出疏水性高的新的β-葡糖苷酶。進而，通過分離與鑒定出的β-葡糖苷酶對應(yīng)的基因，對于其堿基序列進行一些改變，從而成功地使該基因在綠色木霉中高表達，并且使表達產(chǎn)物發(fā)揮高的β-葡糖苷酶活性。
文檔編號C12N15/09GK102482665SQ201080036879
公開日2012年5月30日 申請日期2010年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月20日
發(fā)明者橫山健吾, 橫山史和, 間塚序子 申請人:明治制果藥業(yè)株式會社