專利名稱：利用小麥麥糠的β－葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法以及液體培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及同時(shí)高效生產(chǎn)β -葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法以及對(duì)制造這兩種酶有用的液體培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，為了有效利用纖維素資源，人們探索了有效分解纖維素的方法。人們已經(jīng)了解到自然界中的纖維素主要是被微生物分解的，細(xì)菌和絲狀菌等各種各樣的微生物生產(chǎn)纖維素分解酶。這些微生物將纖維素分解酶分泌到菌體外，纖維素經(jīng)該酶作用后，主要經(jīng)纖維低聚糖、纖維二糖，被分解為葡萄糖。纖維素分解酶一般稱為纖維素酶。在人工制造纖維素酶時(shí)，作為分泌纖維素酶的微生物已知有木霉屬的微生物，并被廣泛利用。而且，也已經(jīng)知道利用含有碳源和氮源等營(yíng)養(yǎng)素的培養(yǎng)基培養(yǎng)屬于木霉屬的微生物，可使其分泌纖維素酶的方法。然而，以前用于制造纖維素酶的方法，作為碳源能夠使用的材料以及前處理方法都受到限制，高價(jià)的結(jié)晶纖維素，或者假定即使為價(jià)格便宜的纖維素資源，也要進(jìn)行加熱處理或堿處理等前處理，所以需要的成本都比較高。例如，專利文獻(xiàn)1報(bào)道了將廢紙于硫酸亞鐵溶液中蒸煮，可接種纖維素酶生產(chǎn)菌生產(chǎn)纖維素酶用的底物。另外，專利文獻(xiàn)2報(bào)道了將微粉碎的甘蔗渣于氫氧化鈉中蒸煮，然后再用次氯酸鹽溶液處理，作為可接種纖維素酶生產(chǎn)菌的里氏木霉(Trichoderma reesei) 的生產(chǎn)纖維素酶用底物的制造方法。然而，利用這些以往方法得到的纖維素酶主要含β -葡聚糖酶，而木聚糖酶活性低，對(duì)于像甘蔗渣和稻秸等那樣的含木聚糖的纖維素資源的分解能力差。因此，對(duì)于目的是有效利用天然存在的各種各樣的纖維素資源來(lái)說(shuō)效率低。專利文獻(xiàn)3報(bào)道了包括對(duì)屬于里氏木霉的變異株進(jìn)行液體培養(yǎng)，對(duì)得到的纖維素酶進(jìn)行提取的工序在內(nèi)的纖維素酶的制造方法。作為培養(yǎng)基的碳源，羅列了纖維素粉末、纖維二糖、濾紙、一般紙類、鋸末、麥糠、稻殼、甘蔗渣、大豆粕、咖啡粕等化學(xué)構(gòu)造和性質(zhì)不同的各種材料(第0011段落)。然而，其中培養(yǎng)操作實(shí)際使用的材料只是纖維二糖(實(shí)施例1)和微晶纖維素(實(shí)施例幻，至于其他材料，即天然纖維素材料沒(méi)有證實(shí)纖維素酶的生成。專利文獻(xiàn)4報(bào)道了使用除去了固體構(gòu)成成分、進(jìn)行非揮發(fā)成分的濃縮、對(duì)濃縮物進(jìn)行高壓釜處理等予處理的黑麥稀乙醇蒸餾廢液，對(duì)屬于木霉屬的微生物進(jìn)行培養(yǎng)，制造木聚糖酶的方法。然而，由于本技術(shù)中作為碳源使用的黑麥獲得困難，還必須進(jìn)行復(fù)雜的前處理，需要高成本，另外，使用該方法反倒使β-葡聚糖酶的產(chǎn)量降低了。此外，小麥麥糠是將小麥制成面粉時(shí)剩下的小麥表皮(外皮)。小麥麥糠含食物纖維很多，除了用于谷物食品等食用外，還被用作日本酒釀造時(shí)培養(yǎng)粬菌用的個(gè)體培養(yǎng)基。另外，小麥麥糠還被用作以制造酶為目的、培養(yǎng)微生物所使用的液體培養(yǎng)基的原料。例如，專利文獻(xiàn)5報(bào)道了作為液體培養(yǎng)基的碳源，使用了木聚糖、含有木聚糖的小麥麥糠、紙漿、甘蔗渣、玉米纖維、稻秸等農(nóng)產(chǎn)業(yè)廢棄物或植物纖維等。然而，在本技術(shù)中，培養(yǎng)的微生物是屬于芽孢桿菌屬的微生物。而且生成的酶是木聚糖酶，沒(méi)有證實(shí)有β-葡聚糖酶的生成。就是說(shuō)，使用屬于木霉屬的微生物，利用小麥麥糠作為用于同時(shí)高效生產(chǎn)β -葡聚糖酶和木聚糖酶的培養(yǎng)基到目前為止還為人所不知。專利文獻(xiàn)1 日本特開(kāi)2003-137901專利文獻(xiàn)2 日本特公平5-33984號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3 日本特開(kāi)平9-163980號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4 日本特開(kāi)平11-113568號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)5 日本特開(kāi)2004-12125
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題本發(fā)明正是要解決上述以往問(wèn)題的發(fā)明，發(fā)明的目的就在于以低成本制造對(duì)含有木聚糖的纖維素資源具有優(yōu)良分解能力的纖維素酶。解決課題的手段本發(fā)明人等為了同時(shí)高效生產(chǎn)β -葡聚糖酶和木聚糖酶，對(duì)能夠分解(糖化)纖維素原料的酶的制造方法以及該酶的制造進(jìn)行了不斷的銳意研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用(a) 小麥麥糠和(b)氨態(tài)氮或氨基態(tài)氮作為液體培養(yǎng)基的原料，對(duì)屬于木霉屬的微生物進(jìn)行培養(yǎng)，可同時(shí)高效生產(chǎn)β-葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法以及對(duì)制造該酶有用的液體培養(yǎng)基。本發(fā)明提供一種β -葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，包括使用含有(a)小麥麥糠作為碳源、和(b)氨態(tài)氮或氨基態(tài)氮作為氮源的液體培養(yǎng)基，對(duì)屬于木霉屬的微生物進(jìn)行培養(yǎng)的工序。在一實(shí)施方式中，上述液體培養(yǎng)基中的小麥麥糠濃度為3% W/V以上。在一實(shí)施方式中，上述液體培養(yǎng)基中的小麥麥糠濃度為4 15% W/V。在一實(shí)施方式中，上述液體培養(yǎng)基中的氨態(tài)氮或氨基態(tài)氮濃度為30 660mM。在一實(shí)施方式中，上述液體培養(yǎng)基中的氨態(tài)氮或氨基態(tài)氮濃度為40 580mM。在一實(shí)施方式中，上述屬于木霉屬的微生物是里氏木霉。在一實(shí)施方式中，在培養(yǎng)的過(guò)程中對(duì)上述液體培養(yǎng)基追加碳源。另外，本發(fā)明提供一種用于培養(yǎng)屬于木霉屬的微生物的液體培養(yǎng)基，其含有(a) 小麥麥糠作為碳源和(b)氨態(tài)氮或氨基態(tài)氮作為氮源。在一實(shí)施方式中，含有2% W/V以上的上述小麥麥糠。在一實(shí)施方式中，含有30 660mM的氨態(tài)氮或氨基態(tài)氮。另外，本發(fā)明提供通過(guò)上述任一形式所述方法制造的β -葡聚糖酶和木聚糖酶。另外，本發(fā)明提供一種以使用上述葡聚糖酶和木聚糖酶為特征的對(duì)纖維素資源進(jìn)行分解或糖化的方法。發(fā)明的效果本發(fā)明由于有效利用了小麥麥糠，使食品產(chǎn)業(yè)廢棄物減少，有益于環(huán)境問(wèn)題的解決。另外，由于可同時(shí)高效生產(chǎn)作為纖維素分解酶的葡聚糖酶和木聚糖酶，對(duì)于甘蔗渣和稻秸等天然纖維素資源的糖化極其有用。特別是對(duì)由纖維素資源制造酒精的生物量乙醇制造有用。


圖1是表示小麥麥糠為5%的培養(yǎng)基中的、相對(duì)于硫酸銨濃度的培養(yǎng)上清液的酶活性變化的圖。圖2是表示小麥麥糠為5%的培養(yǎng)基中的、相對(duì)于氯化銨濃度的培養(yǎng)上清液的酶活性變化的圖。圖3是表示小麥麥糠為5%的培養(yǎng)基中的、相對(duì)于磷酸氫二銨濃度的培養(yǎng)上清液的酶活性變化的圖。圖4是表示小麥麥糠為5%的培養(yǎng)基中的、相對(duì)于亮氨酸濃度的培養(yǎng)上清液的酶活性變化的圖。圖5是表示小麥麥糠為5%的培養(yǎng)基中的、相對(duì)于尿素濃度的培養(yǎng)上清液的酶活性變化的圖。圖6是表示硫酸銨為480mM的培養(yǎng)基中的、相對(duì)于小麥麥糠濃度的培養(yǎng)上清液的酶活性變化的圖。圖7是表示結(jié)晶纖維素為的培養(yǎng)基中的、相對(duì)于硫酸銨濃度的培養(yǎng)上清液的酶活性變化的圖。圖8是表示硫酸銨濃度為160mM的培養(yǎng)基中的、相對(duì)于結(jié)晶纖維素濃度的培養(yǎng)上清液的酶活性變化的圖。圖9是表示小麥麥糠為的培養(yǎng)基中的、相對(duì)于硫酸銨濃度的培養(yǎng)上清液的酶活性變化的圖。圖10是表示小麥麥糠為5%的培養(yǎng)基中的、相對(duì)于硫酸銨濃度的培養(yǎng)上清液的酶活性變化的圖。圖11是分別使用實(shí)施例1得到的小麥麥糠為5%的培養(yǎng)基以及參考例2得到的結(jié)晶纖維素為的培養(yǎng)基的上清液對(duì)啤酒粕糖化時(shí)，對(duì)生成的葡萄糖濃度進(jìn)行比較的圖。圖12是分別使用實(shí)施例1得到的小麥麥糠為5%的培養(yǎng)基以及參考例2得到的結(jié)晶纖維素為的培養(yǎng)基的上清液對(duì)稻秸糖化時(shí)，對(duì)生成的葡萄糖濃度進(jìn)行比較的圖。
具體實(shí)施例方式液體培養(yǎng)基本發(fā)明的液體培養(yǎng)基含有生產(chǎn)纖維素分解酶的微生物成長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)，例如屬于木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)、頂孢霉屬(Acremonium)、分枝孢屬 (Sporotrichum)、青霉屬(Penicillium)、碟節(jié)菌屬(Talaromyces)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、 Neocallimastix屬、嗜熱真菌屬(Thermomyces屬)或梭菌屬(Clostridium)、鏈霉屬(Streptomyces)的微生物。這樣的液體培養(yǎng)基是以將以下給出的培養(yǎng)基組成溶解或懸浮于IOOml水后的液體培養(yǎng)基(一般稱為Mandel培養(yǎng)基)為基礎(chǔ)調(diào)配的，一般來(lái)說(shuō)是含有作為介質(zhì)的水、作為碳源的小麥麥糠、和作為氮源的氨態(tài)氮或氨基態(tài)氮的培養(yǎng)基。以下給出了一例優(yōu)選的培養(yǎng)基組成。培養(yǎng)基組成含有小麥麥糠5g、(NH4)2SO4:0. 14g、KH2PO4 :1. 5g、CaCl2 · 2H20 :0. 03g、 MgSO4 · 7H20 :0. 03g、玉米浸漬液(corn steep liquor) Jml、吐溫 80 :0. lml、微量元素液 (H3BO4 6mg、(NH4)6MO7Om · 4H20 26mg、FeCl3 · 6H20 lOOmg、CuSO4 · 5H20 40mg、MnCl2 · 4H20 8mg、ZnSO4 · 7H20 200mg溶液):0. 1ml、水:100ml (用磷酸或氫氧化鈉將PH調(diào)整為4. 8)所謂小麥麥糠指的是小麥的外皮和胚芽的混合物。而從小麥去除小麥麥糠(即外皮和胚芽)后精細(xì)加工后的產(chǎn)物是小麥面粉。小麥麥糠作為例如工業(yè)上獲得食用小麥粉的制造面粉工序的副產(chǎn)物而大量產(chǎn)生，很容易得到。而這樣的小麥麥糠由于是制造食品的副產(chǎn)物，所以都嚴(yán)格進(jìn)行原料階段的品質(zhì)檢查以及制造工序管理，衛(wèi)生品質(zhì)上非常安全，優(yōu)選用于本發(fā)明的方法中。用于制備小麥麥糠的小麥的種類沒(méi)有特別限定，如北進(jìn)(*々ν >，Hokushin), 福清(么< 々力、Fukusayaka)、農(nóng)林61號(hào)、南部小麥(f > 7·· 二 Λ年，Nanbukomugi)、北之香(今夕乂力才1J , Kitanokaori)、春富(‘、卟二夕力，haruyutaka)、春之戀(春忑戀)寸。一般小麥麥糠的粒子形狀為薄片狀。薄片狀的小麥麥糠可原樣使用。也可以將它們適當(dāng)粉碎、使粒子細(xì)化后使用，還可以造粒形成粒子塊后使用。小麥麥糠的形態(tài)，可以是例如、大的麥糠、小的麥糠、末粉等。也可以使用食品原料以及作為健康食品等市場(chǎng)上銷售的產(chǎn)品。在小麥麥糠導(dǎo)入液體培養(yǎng)基時(shí)也可進(jìn)行前處理。優(yōu)選的前處理，例如為粉碎處理和脫木質(zhì)素處理。如果從小麥麥糠除去木質(zhì)素，則堅(jiān)固的細(xì)胞壁崩解，使得纖維素的利用變得更容易，酶的生產(chǎn)也變得容易。另外通過(guò)對(duì)小麥麥糠進(jìn)行粉碎處理，可以更有效地進(jìn)行脫木質(zhì)素處理。脫木質(zhì)素處理的方法雖然沒(méi)有特別限定，例如可舉出在像氫氧化鈉那樣的強(qiáng)堿性物質(zhì)存在下，或者在像硫酸或磷酸那樣的強(qiáng)酸性物質(zhì)存在下，高溫加熱，使其分解的方法； 通過(guò)微生物使其分解的方法；在高溫·高壓下通過(guò)水熱處理使其分解的方法。如果考慮到處理設(shè)備、對(duì)環(huán)境的負(fù)荷，優(yōu)選高溫·高壓下通過(guò)水熱處理使其分解的方法。另外，還可以進(jìn)一步進(jìn)行通過(guò)加熱殺菌等對(duì)液體培養(yǎng)基的原料通常進(jìn)行的前處理。液體培養(yǎng)基中的小麥麥糠濃度優(yōu)選為3% W/V以上。如果小麥麥糠的濃度低于3% W/V，則纖維素酶、特別是β-葡聚糖酶的產(chǎn)量有時(shí)增大量不大。液體培養(yǎng)基中的小麥麥糠濃度更優(yōu)選為4% W/V以上，進(jìn)一步優(yōu)選為5% W/V以上、6% W/V以上、7% W/V以上、8% W/ V以上。液體培養(yǎng)基中的小麥麥糠濃度越高越好。即，其上限限制于能夠?qū)σ后w培養(yǎng)基進(jìn)行攪拌混合的量。因?yàn)槿绻后w培養(yǎng)基不能攪拌，微生物就不能均一地混合在液體培養(yǎng)基
6中，培養(yǎng)就不能正常進(jìn)行。液體培養(yǎng)基中小麥麥糠濃度的上限根據(jù)攪拌設(shè)備的性能，可以為20、15、10或8% W/V。一般來(lái)說(shuō)，上述濃度的優(yōu)選范圍為4 15% W/V，更優(yōu)選的范圍為 5 10% W/V。所謂氨態(tài)氮指的是氨或由氨衍生的銨鹽中含有的氮。而所謂的氨基態(tài)氮指的是胺或由胺衍生的氨基化合物中含有的氮。含有氨態(tài)氮或氨基態(tài)氮的化合物，例如、硫酸銨、硝酸銨、磷酸氫二銨、氯化銨、氨水、尿素、氨基酸及其鹽(例如、亮氨酸、谷氨酸鈉)。其中，作為氮源，特別適用于本發(fā)明的液體培養(yǎng)基的化合物是硫酸銨。其理由是價(jià)格低，而且很容易得到。液體培養(yǎng)基中氨態(tài)氮或氨基態(tài)氮的濃度，作為銨的摩爾數(shù)，為30 660mM。優(yōu)選 40 580mM。如果濃度低于30mM，則纖維素酶、特別是β -葡聚糖酶的產(chǎn)量有時(shí)增大量不大。 另外，該濃度如果超過(guò)660mM，則酶的生產(chǎn)率將降低。另外，液體培養(yǎng)基中氨態(tài)氮或氨基態(tài)氮的濃度優(yōu)選地根據(jù)液體培養(yǎng)基中的小麥麥糠的濃度進(jìn)行增減，例如，小麥麥糠的濃度為3% W/V時(shí)，如果考慮到成本等，優(yōu)選50mM。
_7] β -本發(fā)明中使用的屬于木霉屬的微生物只要是能生產(chǎn)纖維素糖化所必需的纖維素酶，沒(méi)有特別限定。優(yōu)選的屬于木霉屬微生物是木霉屬絲狀菌，具體的如里氏木霉 (Trichoderma reesei)或綠色木霉(Trichoderma viride)。從同時(shí)高效生產(chǎn)β -葡聚糖酶和木聚糖酶觀點(diǎn)看，特別優(yōu)選里氏木霉。里氏木霉和綠色木霉的菌學(xué)性質(zhì)例如在Ε. G. Simmons, Abst. 2ndInternational Mycological Congress (美國(guó)福羅里達(dá)州Tampa，1077年8月)618頁(yè)中有報(bào)道。液體培養(yǎng)使用通常的通氣攪拌培養(yǎng)設(shè)備，使用上述液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為20 330C，優(yōu)選觀 30°C，培養(yǎng)pH為4 6，進(jìn)行4 10天培養(yǎng)。在從培養(yǎng)最初就使用上述液體培養(yǎng)基的情況下，液體培養(yǎng)基中含有的成分(例如、碳源和氮源)的濃度相當(dāng)于本發(fā)明的培養(yǎng)方法中上述成分的初期濃度。培養(yǎng)過(guò)程中也可向液體培養(yǎng)基中追加碳源。由于隨著培養(yǎng)進(jìn)行，培養(yǎng)基中的小麥麥糠被分解，有時(shí)通過(guò)補(bǔ)充碳源可以提高纖維素酶的生成效率。追加的碳源優(yōu)選含天然纖維素，而淀粉等營(yíng)養(yǎng)成分少的材料。追加的優(yōu)選碳源為小麥麥糠、啤酒粕、麥茶抽提粕、紙、 果實(shí)的渣餅(特別是蘋(píng)果渣餅)等。追加碳源時(shí)，追加的方式可以是連續(xù)式的，也可以是間歇式的，可以對(duì)追加的時(shí)期和量進(jìn)行調(diào)節(jié)，以使得追加后還能攪拌混合。追加碳源時(shí)，在培養(yǎng)過(guò)程中也可以根據(jù)需要適當(dāng)追加氨態(tài)氮或氨基態(tài)氮。然后可根據(jù)需要，通過(guò)離心分離、過(guò)濾等眾所周知的方法從該培養(yǎng)液中除去菌體， 得到木霉屬絲狀菌培養(yǎng)上清液。在木霉屬絲狀菌培養(yǎng)液或培養(yǎng)上清液中含有目標(biāo)的高濃度的纖維素酶、即β-葡聚糖酶和木聚糖酶。得到的培養(yǎng)液或培養(yǎng)上清液的β -葡聚糖酶活性在30U/ml以上，優(yōu)選為50U/ml 以上，更優(yōu)選為60U/ml以上，進(jìn)一步優(yōu)選在70U/ml以上。而該培養(yǎng)液或培養(yǎng)上清液的木聚糖酶活性在25U/ml以上，優(yōu)選在30U/ml以上，更優(yōu)選在40U/ml以上，更優(yōu)選在50U/ml以上。培養(yǎng)液或培養(yǎng)上清液的葡聚糖酶活性、木聚糖酶活性中的任一個(gè)如果低于上述下限，對(duì)于目的是有效利用天然存在的各種各樣纖維素資源的效果就要降低。
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另外，上述半纖維素酶活性可以通過(guò)以來(lái)自“oat spelts”的木聚糖為底物的酶加水分解后生成的還原糖與DNS反應(yīng)，通過(guò)MOnm的吸光度的增加量進(jìn)行定量。更具體來(lái)說(shuō)，在1. 9ml的木聚糖底物溶液(將Sigma公司生產(chǎn)的“Xylan，from oat spelts”溶解在200mM醋酸緩沖液(pH4. 5))中加入0. Iml培養(yǎng)液或培養(yǎng)上清液，然后于40°C下準(zhǔn)確進(jìn)行10分鐘酶反應(yīng)后，加^ilDNS試劑(含0. 75%二硝基水楊酸、1. 2%氫氧化鈉、22. 5%酒石酸鈉鉀4水和物、0. 3%乳糖1水和物)，進(jìn)行充分混合，停止反應(yīng)。為了對(duì)反應(yīng)停止液中的還原糖量進(jìn)行定量，將反應(yīng)停止液于沸騰水浴中準(zhǔn)確加熱15分鐘。然后冷卻到室溫后，通過(guò)測(cè)定540nm的吸光度以相當(dāng)于木糖的還原糖量進(jìn)行定量。1單位的半纖維素酶活性以于40°C下反應(yīng)10分鐘的條件下，1分鐘生成相當(dāng)于1 μ mol木糖的還原糖的酶量表不。本發(fā)明中所謂的“對(duì)屬于木霉屬的微生物進(jìn)行培養(yǎng)”指的是像技術(shù)常識(shí)那樣對(duì)該微生物進(jìn)行培養(yǎng)的操作。即，在以制造葡聚糖酶和木聚糖酶為目的進(jìn)行液體培養(yǎng)的方法中，只要至少存在在上述本發(fā)明的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于木霉屬微生物的過(guò)程，該培養(yǎng)方法就屬于本發(fā)明的方法?！┻M(jìn)行培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)由于屬于木霉屬微生物的消費(fèi)將減少。因此，在培養(yǎng)末期，也許培養(yǎng)基中的碳源和氮源的濃度達(dá)不到規(guī)定的濃度，結(jié)果是在不屬于本發(fā)明的液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于木霉屬的微生物。即便在這樣場(chǎng)合，例如在開(kāi)始培養(yǎng)的時(shí)刻，使用的液體培養(yǎng)基屬于含有規(guī)定濃度的碳源和氮源的本發(fā)明液體培養(yǎng)基，由于至少在培養(yǎng)初期，屬于木霉屬的微生物是在本發(fā)明的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的，所以該培養(yǎng)方法當(dāng)然也屬于本發(fā)明方法。另外，在像上述那樣從培養(yǎng)的開(kāi)始時(shí)刻大量含有碳源的情況下，如上所述，考慮到對(duì)液體培養(yǎng)基進(jìn)行攪拌混合時(shí)的方便性，最好是將小麥麥糠濃度的上限限制在某一程度。相反，在培養(yǎng)初期，即使培養(yǎng)基中的碳源或氮源濃度比規(guī)定的濃度低，用不屬于本發(fā)明的液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，例如此后再追加，使培養(yǎng)基中的碳源或氮源濃度達(dá)到規(guī)定濃度以上時(shí)，由于此后屬于木霉屬的微生物是在本發(fā)明的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的，所以該培養(yǎng)方法屬于本發(fā)明的方法。纖維素資源的分解或糖化方法通過(guò)本發(fā)明的方法得到的β -葡聚糖酶和木聚糖酶可用于對(duì)纖維素資源進(jìn)行分解或糖化。這里所說(shuō)的纖維素資源可為合成纖維素或天然纖維素資源的任一種。所謂合成纖維素表示作為纖維素粉末已經(jīng)流通的材料。所謂天然纖維素資源指的是如甘蔗渣、稻秸、 麥秸、啤酒粕、木材等。本發(fā)明由于可以同時(shí)高效生產(chǎn)葡聚糖酶和木聚糖酶，所以特別適于對(duì)甘蔗渣、稻秸、麥秸、啤酒粕等天然纖維素資源的糖化。纖維素資源的分解或糖化方法只要是使用眾所周知的方法就可以，沒(méi)有特別限制，舉一例子，如使作為底物的纖維素資源懸浮于水性溶劑中，添加上述培養(yǎng)液或培養(yǎng)上清液，一邊攪拌或震蕩，一邊加溫，進(jìn)行糖化反應(yīng)的方法。也可以替代顯示纖維素分解活性的上述培養(yǎng)液或培養(yǎng)上清液，使用其干燥物、或?qū)⒏稍镂锓稚⒒蛉芙庥谒蟮娜芤?。纖維素原料最好是預(yù)先進(jìn)行脫木質(zhì)素。懸浮方法、攪拌方法、上述混合液的添加方法、添加順序、它們的濃度等反應(yīng)條件可以按照能夠以更高收率獲得葡萄糖的方式進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。
此時(shí)的反應(yīng)液的pH和溫度只要是處于不使酶失活的范圍內(nèi)就可以，一般來(lái)說(shuō)，在常壓下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，溫度可設(shè)定在30 70°C、pH可為3 7的范圍。另外，對(duì)于該壓力、溫度、PH也可以像上述那樣，可以按照能夠更高收率獲得葡萄糖的方式進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，優(yōu)選地在常壓下，在醋酸或磷酸緩沖液中，溫度50 60°C、pH4 6的范圍下進(jìn)行。反應(yīng)時(shí)間一般為6 147小時(shí)、優(yōu)選M 72小時(shí)。通過(guò)纖維素的糖化，可以得到含有葡萄糖的水溶液。得到的水溶液可以根據(jù)需要， 實(shí)施脫色、脫鹽、除酶等精制處理。精制方法只要是眾所周知的方法沒(méi)有特別的限制，例如， 可以使用活性炭處理、離子交換樹(shù)脂處理、色譜分析處理、精密過(guò)濾、超濾、反滲透過(guò)濾等過(guò)濾處理、晶析處理等，可以單獨(dú)使用這些處理方法，也可以使用2種以上處理方式組合。通過(guò)上述方法精制了的葡萄糖為主要成分的水溶液可以直接使用，也可以根據(jù)需要，通過(guò)干燥使其固化。干燥方法只要是眾所周知的方法，沒(méi)有特別限制，例如，可以使用噴霧干燥、冷凍干燥、鼓式干燥、薄膜干燥、板式干燥、氣流干燥、真空干燥等，可以單獨(dú)使用這些方法，也可以使用2種以上處理方式組合。實(shí)施例以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體說(shuō)明，但本發(fā)明并不限定于這些實(shí)施例。實(shí)施例1對(duì)小麥麥糠(昭和產(chǎn)業(yè)社生產(chǎn))進(jìn)行粉碎處理，于0. 3N氫氧化鈉水溶液中在 121°C下通過(guò)15分鐘的高壓釜處理除去木質(zhì)素，充分水洗后，使其干燥。將里氏木霉QM9414(NBRC 31329)于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上在下培養(yǎng) 7天，使孢子充分形成。將作為Mandel培養(yǎng)基碳源的結(jié)晶纖維素置換為經(jīng)脫木質(zhì)素處理的5%小麥麥糠(5g/100mL)，另外按照作為氮源的硫酸銨的氨基態(tài)氮的摩爾濃度分別達(dá)到 15mM、35mM、50mM、65mM、80mM、IOOmM或115mM的方式進(jìn)行添加，然后將pH用磷酸或氫氧化鈉調(diào)整到4. 8的IOOmM液體培養(yǎng)基置于帶擋板的500mL容量三角燒瓶中備用。將培養(yǎng)的里氏木霉1白金圈接種于該液體培養(yǎng)基，于^°C、ISOrpm下震蕩培養(yǎng)7天。在第7天，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離，測(cè)定上清液的β -葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。(酶活性的測(cè)定)對(duì)上述得到的培養(yǎng)液進(jìn)行酶活性測(cè)定。β -葡聚糖酶活性，使用Mega-Zyme公司生產(chǎn)的β -葡聚糖酶測(cè)定試劑盒，通過(guò)對(duì)以色素標(biāo)記的葡聚糖為底物進(jìn)行酶分解生成的染色片段進(jìn)行吸光度測(cè)定。具體來(lái)說(shuō)， 向0. ImL偶氮大麥葡聚糖底物溶液中加入0. ImL培養(yǎng)液，于40°C下準(zhǔn)確進(jìn)行10分鐘酶反應(yīng)后，加0. 6mL停止液〔(pH5)含有4%醋酸鈉、0. 4%醋酸鋅、80%甲氧基乙醇〕，然后放置5 鐘，停止反應(yīng)。然后離心分離后，對(duì)上清液測(cè)定590nm的吸光度。1單位的β -葡聚糖酶活性以在40°C、反應(yīng)10分鐘條件下，1分鐘內(nèi)生成的相當(dāng)于1 μ mol葡萄糖的還原糖的酶量表
7J\ ο而木聚糖酶活性，通過(guò)以來(lái)自“oat spelts”的木聚糖作為底物的酶加水分解生成的還原糖與DNS反應(yīng)，通過(guò)MOnm吸光度的增加值進(jìn)行定量。更具體來(lái)說(shuō)，向1. 9ml的
木聚糖底物溶液[將Sigma公司生產(chǎn)的“Xylan，from oat spelts”溶解于200mM醋酸緩沖液(PH4. 5)]中加入0. ImL培養(yǎng)液，于40°C下準(zhǔn)確進(jìn)行10分鐘酶反應(yīng)后，加入4mLDNS試劑 (含有0. 75%二硝基水楊酸、1. 2%氫氧化鈉、22. 5%酒石酸鈉鉀4水和物、0. 3%乳糖1水和物)充分混合，使反應(yīng)停止。為了對(duì)反應(yīng)停止液中含有的還原糖量進(jìn)行定量，將反應(yīng)停止液于沸騰水浴中準(zhǔn)確加熱15分鐘。然后冷卻至室溫后，通過(guò)測(cè)定540nm的吸光度，以相當(dāng)于木糖的還原糖量進(jìn)行定量。1單位的木聚糖酶活性表示為于40°C、10分鐘的反應(yīng)條件下， 1分鐘內(nèi)生成相當(dāng)于Iymol木糖的還原糖的酶量。結(jié)果如圖1所示。實(shí)施例2將作為Mandel培養(yǎng)基碳源的結(jié)晶纖維素置換為與實(shí)施例一樣得到的脫木質(zhì)素處理的5%小麥麥糠(5g/100mL)，然后將作為氮源的硫酸銨置換為氯化銨，按照氨態(tài)氮的摩爾濃度分別達(dá)到20mM、40mM、50mM、60mM、80mM、100mM或120mM的方式進(jìn)行添加，像實(shí)施例1 那樣準(zhǔn)備液體培養(yǎng)基。將里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上于
下，培養(yǎng)7天，使孢子充分形成，將其1白金圈接種于液體培養(yǎng)基，于、ISOrpm下， 震蕩培養(yǎng)7天。在第7天，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離，像實(shí)施例1那樣測(cè)定上清液的β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。結(jié)果如圖2所示。實(shí)施例3將作為Mandel培養(yǎng)基碳源的結(jié)晶纖維素置換為像實(shí)施例1那樣得到的脫木質(zhì)素處理的5%小麥麥糠(5g/100mL)，然后將作為氮源的硫酸銨置換為磷酸氫二銨，按照氨態(tài)氮的摩爾濃度分別達(dá)到15mM、35mM、50mM、65mM、80mM、100mM或115mM的方式進(jìn)行添力卩，與實(shí)施例1同樣地準(zhǔn)備了液體培養(yǎng)基。將里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上于下，培養(yǎng)7天，使孢子充分形成，將其1白金圈接種于液體培養(yǎng)基，于、 ISOrpm下，震蕩培養(yǎng)7天。在第7天，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離，像實(shí)施例1那樣測(cè)定了 β _葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。結(jié)果如圖3所示。實(shí)施例4將作為Mandel培養(yǎng)基碳源的結(jié)晶纖維素置換為像實(shí)施例1那樣得到的經(jīng)脫木質(zhì)素處理的5%小麥麥糠(5g/100mL)，然后將作為氮源的硫酸銨置換為亮氨酸，按照氨基態(tài)氮的摩爾濃度分別達(dá)到8福、151111、231111、311111、381111、461111或531111的方式進(jìn)行添加，像實(shí)施例1那樣準(zhǔn)備了液體培養(yǎng)基。將里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上于下，培養(yǎng)7天，使孢子充分形成，將其1白金圈接種于液體培養(yǎng)基，于、ISOrpm 下，震蕩培養(yǎng)7天。在第7天，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離，像實(shí)施例1那樣測(cè)定β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。結(jié)果如圖4所示。實(shí)施例5將作為Mandel培養(yǎng)基碳源的結(jié)晶纖維素置換為像實(shí)施例1那樣得到的經(jīng)脫木質(zhì)素處理的5%小麥麥糠(5g/100mL)，然后將作為氮源的硫酸銨置換為尿素，按照氨基態(tài)氮的摩爾濃度分別達(dá)到17mM、33mM、50mM、67mM、83mM或IOOmM的方式進(jìn)行添加，像實(shí)施例1那樣準(zhǔn)備了液體培養(yǎng)基。將里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上于
下，培養(yǎng)7天，使孢子充分形成，將其1白金圈接種于液體培養(yǎng)基，于觀！、ISOrpm下， 震蕩培養(yǎng)7天。在第7天，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離，像實(shí)施例1那樣測(cè)定葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。結(jié)果如圖5所示。實(shí)施例6將作為Mandel培養(yǎng)基碳源的結(jié)晶纖維素置換為像實(shí)施例1那樣得到的經(jīng)脫木質(zhì)素處理的小麥麥糠，按照濃度分別達(dá)到1^^2^^3^3^^5^^6%或7%的方式進(jìn)行添加，而作為氮源的硫酸銨的氨態(tài)氮的摩爾濃度按照達(dá)到480mM的方式進(jìn)行添加，像實(shí)施例1那樣準(zhǔn)備液體培養(yǎng)基。將里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上于下，培養(yǎng)7天，使孢子充分形成，將其1白金圈接種于液體培養(yǎng)基，于觀！、ISOrpm下， 震蕩培養(yǎng)7天。在第7天，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離，像實(shí)施例1那樣測(cè)定β -葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。結(jié)果如圖6所示。參考例1將作為Mandel培養(yǎng)基碳源的結(jié)晶纖維素的濃度設(shè)定為1 %，作為氮源的硫酸銨的氨態(tài)氮的摩爾濃度按照分別達(dá)到15mM、35mM、50mM、65mM、80mM、100mM或115mM的方式進(jìn)行添加，像實(shí)施例1那樣準(zhǔn)備了液體培養(yǎng)基。將里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上于下，培養(yǎng)7天，使孢子充分形成，將其1白金圈接種于液體培養(yǎng)基， 于觀！、ISOrpm下，震蕩培養(yǎng)7天。在第7天，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離，像實(shí)施例1那樣測(cè)定β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。結(jié)果如圖7所示。參考例2將作為Mandel培養(yǎng)基碳源的結(jié)晶纖維素的濃度按照分別達(dá)到1 %、1. 5%、2%、 2.5^^3^^3.5%或4%的方式進(jìn)行添加，而作為氮源的硫酸銨的氨態(tài)氮的摩爾濃度按照達(dá)到160mM的方式進(jìn)行添加，像實(shí)施例1那樣準(zhǔn)備了液體培養(yǎng)基。將里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上于下，培養(yǎng)7天，使孢子充分形成，將其1白金圈接種于液體培養(yǎng)基，于、ISOrpm下，震蕩培養(yǎng)7天。在第7天，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離， 像實(shí)施例1那樣測(cè)定β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。結(jié)果如圖8所示。參考例3將作為Mandel培養(yǎng)基碳源的結(jié)晶纖維素置換為像實(shí)施例1那樣得到的經(jīng)脫木質(zhì)素處理的小麥麥糠(lg/100mL)，作為氮源的硫酸銨的氨態(tài)氮的摩爾濃度按照分別達(dá)到 15mM、35mM、50mM、65mM、80mM、100mM或115mM的方式進(jìn)行添加，像實(shí)施例1那樣準(zhǔn)備了液體培養(yǎng)基。將里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上于下，培養(yǎng)7 天，使孢子充分形成，將其1白金圈接種于液體培養(yǎng)基，于^°C、ISOrpm下，震蕩培養(yǎng)7天。 在第7天，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離，像實(shí)施例1那樣測(cè)定β -葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。結(jié)果如圖9所示。實(shí)施例7將作為Mandel培養(yǎng)基碳源的結(jié)晶纖維素置換為像實(shí)施例1那樣得到的經(jīng)脫木質(zhì)素處理的小麥麥糠(5g/100mL)，另外按照作為氮源的硫酸銨的氨態(tài)氮的摩爾濃度分別達(dá)到 330福、4201111、5001111、5801111、6601111、7201111或 8001111 的方式進(jìn)行添加，像實(shí)施例 1 那樣準(zhǔn)備了液體培養(yǎng)基。將里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上于
下，培養(yǎng)7天，使孢子充分形成，將其1白金圈接種于液體培養(yǎng)基，于、ISOrpm下， 震蕩培養(yǎng)7天。在第7天，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離，像實(shí)施例1那樣測(cè)定葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。結(jié)果如圖10所示。實(shí)施例8使用實(shí)施例1中得到的培養(yǎng)上清液(5%小麥麥糠、氨態(tài)氮為IOOmM硫酸銨)以及參考例2中得到的培養(yǎng)上清液(1%結(jié)晶纖維素、氨態(tài)氮為IOOmM的硫酸銨)，進(jìn)行纖維素原料的糖化試驗(yàn)。作為供糖化用的纖維素原料，準(zhǔn)備啤酒粕和稻秸。這些纖維素原料用以下方法進(jìn)行脫木質(zhì)素處理。對(duì)纖維素原料進(jìn)行微粉碎，然后懸浮于0. 3N的NaOH中，于120°C下處理15分鐘， 用水充分洗凈后，進(jìn)行干燥。將由纖維素原料0.3g、培養(yǎng)上清液9.5ml、lM醋酸緩沖液 (pH4. 8) :0. 2ml構(gòu)成的溶液(3%纖維素原料溶液)于50°C、pH4. 8下震蕩48小時(shí)，進(jìn)行纖維素原料的糖化，對(duì)生成的葡萄糖用Glucous CII-Test Wako (和光純藥工業(yè))進(jìn)行測(cè)定。 結(jié)果如圖11和圖12所示。產(chǎn)業(yè)上利用的可能性可同時(shí)高效生產(chǎn)對(duì)甘蔗渣、稻秸等天然纖維素資源的糖化非常有用的β -葡聚糖酶和木聚糖酶，可用于由纖維素資源制造乙醇的生物量乙醇制造中。
權(quán)利要求
1.一種葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，包括使用含有(a)小麥麥糠作為碳源、且含有(b)氨態(tài)氮或氨基態(tài)氮作為氮源的液體培養(yǎng)基，對(duì)屬于木霉屬的微生物進(jìn)行培養(yǎng)的工序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，其特征在于，所述液體培養(yǎng)基中的所述小麥麥糠濃度為3% W/V以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的β-葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，其特征在于，所述液體培養(yǎng)基中的所述小麥麥糠濃度為4 15% W/V。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的β-葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，其特征在于，所述液體培養(yǎng)基中的所述氨態(tài)氮或氨基態(tài)氮的濃度為30 660mM。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的β-葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，其特征在于，所述液體培養(yǎng)基中的所述氨態(tài)氮或氨基態(tài)氮的濃度為40 580mM。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的β-葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，其特征在于，所述屬于木霉屬的微生物為里氏木霉。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的β-葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，其特征在于，在培養(yǎng)過(guò)程中向所述液體培養(yǎng)基中追加碳源。
8.一種用于培養(yǎng)屬于木霉屬的微生物的液體培養(yǎng)基，其含有(a)小麥麥糠作為碳源和 (b)氨態(tài)氮或氨基態(tài)氮作為氮源。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的液體培養(yǎng)基，其特征在于，含有2%W/V以上的所述小麥麥糠。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的液體培養(yǎng)基，其特征在于，含有30 660mM的氨態(tài)氮或氨基態(tài)氮。
11.一種β -葡聚糖酶和木聚糖酶，其是使用權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)所述方法制造的。
12.—種纖維素資源的分解或糖化方法，其特征在于，使用了權(quán)利要求11所述的葡聚糖酶和木聚糖酶。
全文摘要
以低成本制造對(duì)含有木聚糖的纖維素資源具有優(yōu)良分解能力的纖維素酶。一種β-葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，包括使用含有(a)小麥麥糠作為碳源、和(b)氨態(tài)氮或氨基態(tài)氮作為氮源的液體培養(yǎng)基，對(duì)屬于木霉屬的微生物進(jìn)行培養(yǎng)的工序。
文檔編號(hào)C12P19/14GK102482653SQ20108003690
公開(kāi)日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月21日
發(fā)明者福田和郎 申請(qǐng)人:朝日集團(tuán)控股株式會(huì)社