專利名稱：轉(zhuǎn)化體及其制造方法以及乳酸的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化體及其制造方法以及乳酸的制造方法。
背景技術(shù)：
乳酸廣泛用于食品用途和醫(yī)療、化妝品等的化學(xué)原料用途。另外，使用乳酸而得到的聚乳酸作為在微生物等的作用下最終分解為二氧化碳和水的生物分解性塑料而受到關(guān)注。因此，需要廉價地以高生產(chǎn)率制造乳酸。作為乳酸的制造方法，已知利用乳酸菌使糖發(fā)酵而進(jìn)行制造的生物學(xué)方法。但是， 由于乳酸菌的耐酸性低，因此為了以該方法獲得高生產(chǎn)率，需要用堿中和發(fā)酵所產(chǎn)生的乳酸而形成乳酸鹽。這種利用堿進(jìn)行的中和需要從乳酸鹽恢復(fù)成乳酸的步驟，因此制造步驟變得繁雜，制造成本也升高。因此，作為不用堿進(jìn)行中和而獲得乳酸的方法，提出了 使用以酵母菌屬的酵母等耐酸性微生物為宿主、在該耐酸性微生物中導(dǎo)入有編碼乳酸脫氫酶的基因的轉(zhuǎn)化體的方法 (專利文獻(xiàn)1)；使用導(dǎo)入有編碼乳酸脫氫酶的基因、且編碼丙酮酸脫羧酶1的基因缺失或失活的釀酒酵母(出芽酵母)的方法(專利文獻(xiàn)2)?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1 日本特開2001-204464號公報專利文獻(xiàn)2 日本特開2008-487 號公報

發(fā)明內(nèi)容
但是，專利文獻(xiàn)1的方法即使在20 M小時的培養(yǎng)時間下也僅達(dá)到獲得2 5% 的乳酸的程度，生產(chǎn)率不充分。另外，專利文獻(xiàn)2的方法在大量生產(chǎn)乳酸時需要用堿進(jìn)行中和，因而不適合工業(yè)性的乳酸的大量生產(chǎn)。因此，期待不用堿進(jìn)行中和即可以高生產(chǎn)率制造乳酸的方法。因此，本發(fā)明的目的在于提供不需要用堿中和即可以高生產(chǎn)率生產(chǎn)乳酸的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的轉(zhuǎn)化體及該轉(zhuǎn)化體的制造方法。此外，本發(fā)明的目的還在于提供適于在高濃度的糖存在下產(chǎn)生乳酸、并且也適于高密度發(fā)酵的轉(zhuǎn)化體及該轉(zhuǎn)化體的制造方法。另外，本發(fā)明的目的在于提供使用上述轉(zhuǎn)化體、在不進(jìn)行堿中和步驟的情況下以高生產(chǎn)率制造乳酸的方法。需要說明的是，本發(fā)明中所說的乳酸是指利用生物學(xué)方法得到的L-乳酸。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體以粟酒裂殖酵母為宿主，重組有乳酸脫氫酶基因，且編碼上述粟酒裂殖酵母宿主的丙酮酸脫羧酶的基因簇部分缺失或失活。另外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體中，上述缺失或失活的編碼丙酮酸脫羧酶的基因優(yōu)選為 PDC2基因。上述乳酸脫氫酶基因優(yōu)選為哺乳動物的乳酸脫氫酶基因。并且，上述乳酸脫氫酶基因優(yōu)選重組到粟酒裂殖酵母的染色體中。另外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的制造方法為制造重組有乳酸脫氫酶基因且編碼丙酮酸脫羧酶的基因簇部分缺失或失活的轉(zhuǎn)化體的方法，其中，包括下述步驟以粟酒裂殖酵母為宿主，使用具有包含在粟酒裂殖酵母內(nèi)發(fā)揮作用的啟動子、終止子和乳酸脫氫酶基因的表達(dá)盒的載體，將上述表達(dá)盒導(dǎo)入上述宿主中而得到轉(zhuǎn)化體；和使用編碼丙酮酸脫羧酶的基因簇部分缺失或失活的宿主作為上述宿主，或者使上述得到的轉(zhuǎn)化體的編碼丙酮酸脫羧酶的基因簇部分缺失或失活。另外，優(yōu)選上述載體還具有對粟酒裂殖酵母的染色體進(jìn)行同源重組的重組位點(diǎn)， 使用該載體將表達(dá)盒導(dǎo)入粟酒裂殖酵母的染色體中。并且，宿主的染色體中進(jìn)行同源重組的靶位點(diǎn)優(yōu)選為轉(zhuǎn)座子基因Tf2。另外，本發(fā)明的方法中，上述缺失或失活的編碼丙酮酸脫羧酶的基因優(yōu)選為PDC2 基因。上述乳酸脫氫酶基因優(yōu)選為哺乳動物的乳酸脫氫酶基因。此外，本發(fā)明為一種乳酸的制造方法，其中，將上述轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)， 并從該培養(yǎng)液中獲取乳酸。另外，該乳酸的制造方法中，優(yōu)選使用含有濃度為1 50質(zhì)量％ (更優(yōu)選2 16 質(zhì)量％)的葡萄糖的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。另外，優(yōu)選在通過由上述轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的乳酸的作用使上述培養(yǎng)液的PH達(dá)到3. 5以下后，進(jìn)一步繼續(xù)培養(yǎng)。并且，上述培養(yǎng)液中的轉(zhuǎn)化體的初始菌體濃度優(yōu)選設(shè)定為0. 1 50克(以干燥菌體換算)/升(更優(yōu)選0.2 40克(以干燥菌體換算)/升)。另外，優(yōu)選在不中和由上述轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的培養(yǎng)液中的乳酸的情況下繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，并且，優(yōu)選在不中和培養(yǎng)液中的乳酸的情況下從培養(yǎng)液中分離乳酸。發(fā)明效果本發(fā)明的粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化體不需要用堿中和即可以高生產(chǎn)率產(chǎn)生乳酸。另夕卜，適于在高濃度的糖、特別是葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖的存在下產(chǎn)生乳酸，并且也適于高密度培養(yǎng)。此外，通過本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的制造方法，能夠簡便地得到上述轉(zhuǎn)化體。另外，本發(fā)明的乳酸的制造方法能夠在不進(jìn)行堿中和步驟的情況下以高生產(chǎn)率制造乳酸。
具體實(shí)施例方式[轉(zhuǎn)化體]本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體為以粟酒裂殖酵母為宿主、重組有乳酸脫氫酶基因、且編碼粟酒裂殖酵母宿主的丙酮酸脫羧酶的基因簇部分缺失或失活的轉(zhuǎn)化體。<粟酒裂殖酵母>作為宿主的粟酒裂殖酵母為屬于裂殖酵母屬的酵母(裂殖酵母)，是與其他酵母相比耐酸性特別優(yōu)良的微生物。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)粟酒裂殖酵母與釀酒酵母等其他酵母相比， 在高濃度葡萄糖下的乳酸的生產(chǎn)率優(yōu)良，也適于高密度培養(yǎng)(使用大量酵母的培養(yǎng))，并且發(fā)現(xiàn)通過使用粟酒裂殖酵母的轉(zhuǎn)化體，能夠以極高的生產(chǎn)率制造乳酸。需要說明的是，粟酒裂殖酵母的染色體的全堿基序列作為“khizosaccharomyces pombe Gene DB (http //www. genedb. org/genedb/pombe/)，，收錄、公開于桑格研究所的數(shù)據(jù)庫“GeneDB”中。本說明書中記載的粟酒裂殖酵母的基因的序列數(shù)據(jù)可通過基因名或上述系統(tǒng)名從上述數(shù)據(jù)庫中檢索獲得。本發(fā)明中使用的粟酒裂殖酵母只要具有耐酸性則沒有特別限定。粟酒裂殖酵母可從公共或民間的保藏機(jī)構(gòu)、S卩、美國典型培養(yǎng)物保藏中心 (American Type Culture Collection) (ATCC、馬納薩斯、VA、USA)、英國酵母菌種保藏中心(National Collection of Yeast Cultures) (NCYC、諾里奇、英國)、NITE 生物資源中心 (NBRC、日本千葉縣木更津市)、酵母遺傳資源中心(YGRC、日本大阪市立大學(xué)研究生院理學(xué)研究科內(nèi))等處獲得。<編碼丙酮酸脫羧酶的基因>粟酒裂殖酵母中編碼丙酮酸脫羧酶的基因(丙酮酸脫羧酶基因、以下也稱為“PDC 基因”)簇有以下4種編碼丙酮酸脫羧酶1的基因(以下也稱為“PDC1基因”)、編碼丙酮酸脫羧酶2的基因(以下也稱為“PDC2基因”)、編碼丙酮酸脫羧酶3的基因(以下也稱為 “PDC3基因”)、編碼丙酮酸脫羧酶4的基因(以下也稱為“PDC4基因”)。其中，粟酒裂殖酵母中，PDC2基因和PDC4基因是具有主要功能的PDC基因。各PDC基因的系統(tǒng)名如下所示。PDCl 基因(Pdcl) SPACl3A11. 06PDC2 基因(Pdc2) :SPAC1F8. 07cPDC3 基因(Pdc3) :SPAC186. 09PDC4 基因(Pdc4) :SPAC3G9. lie上述PDC基因的序列數(shù)據(jù)可通過基因名或系統(tǒng)名從上述粟酒裂殖酵母基因數(shù)據(jù)庫中檢索獲得。在野生型粟酒裂殖酵母中，通過糖酵解將葡萄糖代謝至丙酮酸，利用由前述的PDC 基因所表達(dá)的丙酮酸脫羧酶將丙酮酸轉(zhuǎn)變成乙醛，繼而由醇脫氫酶將該乙醛轉(zhuǎn)變成乙醇， 由此進(jìn)行乙醇發(fā)酵。另外，野生型粟酒裂殖酵母不具有具備功能的乳酸脫氫酶基因，因此不存在由丙酮酸生成乳酸的途徑。另一方面，由重組的乳酸脫氫酶基因所表達(dá)的乳酸脫氫酶通過將丙酮酸還原成乳酸而產(chǎn)生乳酸。因此，即使在野生型粟酒裂殖酵母中重組入乳酸脫氫酶基因以使其能夠產(chǎn)生乳酸，在該狀態(tài)下也會同時進(jìn)行乙醇發(fā)酵和乳酸發(fā)酵，因此乳酸的生產(chǎn)率不能充分提高。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體具有編碼上述丙酮酸脫羧酶的基因簇中部分缺失或失活的染色體。通過使轉(zhuǎn)化體的PDC基因簇部分缺失或失活，轉(zhuǎn)化體的乙醇發(fā)酵的效率降低，轉(zhuǎn)變成乙醇的丙酮酸量減少，因此乳酸的生產(chǎn)率提高。但是，若使PDC基因簇完全缺失或失活，則將完全無法進(jìn)行乙醇發(fā)酵而抑制生長，因此將缺失或失活設(shè)定為在PDC基因簇的一部分發(fā)生。缺失或失活的PDC基因特別優(yōu)選為PDC2基因。PDC2基因是具有特別主要功能的 PDC基因。如前所述，若使PDC基因完全缺失或失活，則該轉(zhuǎn)化體無法進(jìn)行乙醇發(fā)酵因而會抑制生長。因此，PDC基因的缺失或失活必須以保留生長所必需的乙醇發(fā)酵能力從而獲得充分的轉(zhuǎn)化體量、同時降低乙醇發(fā)酵能力從而提高乳酸的發(fā)酵效率的方式進(jìn)行。針對該課題本發(fā)明人進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，若使PDC2基因缺失或失活，則PDC4基因會以某種程度活化，能夠兼顧獲得充分的轉(zhuǎn)化體量的程度的乙醇發(fā)酵能力和高發(fā)酵效率的乳酸生產(chǎn)。
PDC基因的缺失或失活可利用公知的方法進(jìn)行。例如，可通過使用Latour法(記載于Nucreic Acids Res雜志、2006年、；34卷、ell頁，國際公開第2007/063919號小冊子等中)使PDC基因缺失。另外，通過使PDC基因的堿基序列的一部分發(fā)生缺失、插入、取代、添加，也可以使該P(yáng)DC基因失活。這些缺失、插入、取代、添加所致的突變，可以只發(fā)生其中的任意一種，也可以發(fā)生兩種以上。在PDC基因的一部分中導(dǎo)入上述突變的方法可以使用公知的方法。例如，可以列舉使用誘變劑的突變分離法(酵母分子遺傳學(xué)實(shí)驗法、1996年、學(xué)會出版中心)、利用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))的隨機(jī)突變法(PCR Methods Appl.、1992年、第2 卷、第觀-33頁)等。另外，在其一部分中導(dǎo)入有突變的PDC基因可以是表達(dá)溫度敏感突變型丙酮酸脫羧酶的PDC基因。溫度敏感突變型丙酮酸脫羧酶是指在某一培養(yǎng)溫度下顯示出與野生型丙酮酸脫羧酶同等的活性、但達(dá)到特定的培養(yǎng)溫度以上時可觀察到活性的消失或降低的酶。表達(dá)這種突變型丙酮酸脫羧酶的突變株，可以通過選擇在活性不受限制的溫度條件下顯示出與野生型酵母同等的生長速度、在活性受到限制的特定的溫度條件下生長速度顯著降低的突變株而獲得?！此拗鳌礟DC基因缺失或失活的粟酒裂殖酵母的突變體，可作為用于制造本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的宿主而使用。此外，也可將除PDC基因以外進(jìn)一步使PDC基因以外的特定基因缺失或失活的粟酒裂殖酵母作為宿主。作為使除PDC基因以外的特定基因缺失或失活的粟酒裂殖酵母宿主，例如，記載于國際公開第2002/101038號小冊子、國際公開第2007/015470號小冊子等中。通過使蛋白酶基因等缺失或失活，能夠提高異種蛋白的表達(dá)效率，通過應(yīng)用于本發(fā)明中的宿主中，可期待乳酸生產(chǎn)效率的提高。并且，作為宿主使用的粟酒裂殖酵母，優(yōu)選使用具有用于選擇轉(zhuǎn)化體的標(biāo)記的粟酒裂殖酵母。例如，優(yōu)選使用通過使某一基因缺失而使其生長需要特定營養(yǎng)成分的宿主。通過在載體中重組該缺失的基因(營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)標(biāo)記)，使轉(zhuǎn)化體中宿主的營養(yǎng)缺陷性消失。利用該宿主與轉(zhuǎn)化體的營養(yǎng)缺陷性的差異，能夠區(qū)別出兩者而得到轉(zhuǎn)化體。例如，以乳清酸核苷磷酸脫羧酶基因(ura4基因)缺失或失活而形成的尿嘧啶缺陷型粟酒裂殖酵母為宿主，利用具有ura4基因(營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)標(biāo)記)的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，選擇尿嘧啶缺陷性消失的轉(zhuǎn)化體，由此能夠得到重組有載體的轉(zhuǎn)化體。對于宿主中通過缺失而導(dǎo)致營養(yǎng)缺陷性的基因而言，只要可用于轉(zhuǎn)化體的選擇則不限定于ura4基因，可以是異丙基蘋果酸脫氫酶基因(Ieul基因)等。另外，也可以使用PDC基因簇既未缺失也未失活的粟酒裂殖酵母作為用于轉(zhuǎn)化體制造的宿主。作為該情況下的宿主，可以使用除PDC基因以外的上述基因(營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記或蛋白酶基因等)缺失或失活的宿主。使用該宿主制造轉(zhuǎn)化體后，使該轉(zhuǎn)化體的PDC基因簇部分缺失或失活，能夠得到本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體。<乳酸脫氫酶基因>本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體具有乳酸脫氫酶基因(編碼乳酸脫氫酶的基因、以下也稱為“LDH 基因”)。如上所述，粟酒裂殖酵母本來不具有LDH基因。因此，利用基因工程的方法將粟酒裂殖酵母之外的生物的LDH基因?qū)胨诰屏阎辰湍钢?，得到轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明中的LDH基因沒有特別限定，可以列舉例如屬于雙歧桿菌屬、乳桿菌屬等的微生物來源的LDH基因、人等哺乳動物來源的LDH基因。其中，從粟酒裂殖酵母的乳酸產(chǎn)生效率優(yōu)良的方面考慮，優(yōu)選為哺乳動物來源的LDH基因。其中，更優(yōu)選為人來源的LDH 基因(文獻(xiàn)Tsujibo H，Tiano HF, Li SS-L Nucleotide sequences of the cDNA and an intronless pseudogene for human lactate dehydrogenase—^ isozyme. Eur. J. Biochem. (1985) 147,9-15)。進(jìn)一步優(yōu)選為下述序列表的序列號1所示的LDH基因。[轉(zhuǎn)化體的制造]本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體通過以PDC基因簇部分缺失或失活的粟酒裂殖酵母為宿主，利用基因工程的方法將LDH基因?qū)胨诰屏阎辰湍钢卸玫?。另外，以PDC基因簇既未缺失也未失活的粟酒裂殖酵母為宿主，利用基因工程的方法將LDH基因?qū)胨诰屏阎辰湍钢卸玫睫D(zhuǎn)化體，然后使所得到的轉(zhuǎn)化體的PDC基因簇部分缺失或失活，也能夠得到本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體。在后述的實(shí)施例中，利用前一方法制造了目標(biāo)轉(zhuǎn)化體，但利用后一方法也能夠制造大致等同的轉(zhuǎn)化體。以下，以前一方法為例對轉(zhuǎn)化體的制造方法進(jìn)行說明。作為利用基因工程的方法將LDH基因?qū)胨拗髦械姆椒?，可以使用公知的方法?作為以粟酒裂殖酵母為宿主、向其中導(dǎo)入異種蛋白的結(jié)構(gòu)基因的方法，可以使用例如日本特開平5-15380號公報、國際公開第95/09914號小冊子、日本特開平10-234375號公報、日本特開2000-262^4號公報、日本特開2005-198612號公報等中記載的方法。LDH基因優(yōu)選導(dǎo)入粟酒裂殖酵母的染色體中。通過向染色體中導(dǎo)入LDH基因，可獲得傳代中的維持穩(wěn)定性優(yōu)良的轉(zhuǎn)化體。另外，也可以向染色體中導(dǎo)入多個LDH基因。通過導(dǎo)入多個LDH基因，能夠提高LDH基因的表達(dá)效率，進(jìn)而可提高乳酸的生產(chǎn)效率。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體中，重組到染色體中的LDH基因個數(shù)優(yōu)選為1 20，特別優(yōu)選為1 8。作為向染色體中導(dǎo)入LDH基因的方法，可以使用公知的方法。例如，可以通過上述日本特開2000-262284號公報中記載的方法，向染色體中導(dǎo)入多個LDH基因。另外，也可以通過該方法向染色體中導(dǎo)入一個LDH基因。另外，還可以如后所述在染色體的多個位置上導(dǎo)入一個或多個LDH基因。作為將LDH基因?qū)胨诰屏阎辰湍傅娜旧w中的方法，優(yōu)選使用具有包含LDH基因的表達(dá)盒和重組位點(diǎn)的載體，利用同源重組法進(jìn)行導(dǎo)入的方法。以下，對該方法中使用的載體和同源重組法進(jìn)行說明。< 載體 >載體具有包含LDH基因的表達(dá)盒和重組位點(diǎn)。表達(dá)盒是指表達(dá)乳酸脫氫酶所需要的DNA的組合，包含LDH基因、在粟酒裂殖酵母內(nèi)發(fā)揮作用的啟動子和在粟酒裂殖酵母內(nèi)發(fā)揮作用的終止子。此外，還可以包含5’ -非翻譯區(qū)、3’-非翻譯區(qū)中的任意一個以上。此外，還可以包含上述營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)標(biāo)記。優(yōu)選的表達(dá)盒為包含LDH基因、啟動子、終止子、5’ -非翻譯區(qū)、3’ -非翻譯區(qū)、營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)標(biāo)記的表達(dá)盒。表達(dá)盒中可以存在多個LDH基因。表達(dá)盒中的LDH基因個數(shù)優(yōu)選為1 8， 更優(yōu)選為1 5。在粟酒裂殖酵母內(nèi)發(fā)揮作用的啟動子和終止子，只要滿足以下條件即可即使因本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體使乳酸蓄積而成酸性(即使PH達(dá)到6以下)，也能夠在轉(zhuǎn)化體內(nèi)發(fā)揮作用而維持乳酸脫氫酶的表達(dá)。作為在粟酒裂殖酵母內(nèi)發(fā)揮作用的啟動子，可以使用粟酒裂殖酵母本來所具有的啟動子(優(yōu)選轉(zhuǎn)錄起始活性高的啟動子)或粟酒裂殖酵母本來不具有的啟動子(病毒來源的啟動子等)。需要說明的是，載體內(nèi)可存在兩種以上的啟動子。
作為粟酒裂殖酵母本來所具有的啟動子，可以列舉例如醇脫氫酶基因啟動子、參與硫胺素代謝的nmtl基因啟動子、參與葡萄糖代謝的果糖-1，6- 二磷酸酶基因啟動子、參與分解代謝物阻遏的轉(zhuǎn)化酶基因的啟動子(參考國際公開第99/23223號小冊子)、熱休克蛋白基因啟動子(參考國際公開第2007/26617號小冊子)等。
作為粟酒裂殖酵母本來不具有的啟動子，可以列舉例如日本特開平5-15380號公報、日本特開平7-163373號公報、日本特開平10-234375號公報中記載的動物細(xì)胞病毒來源的啟動子，優(yōu)選hCMV啟動子、SV40啟動子。
作為在粟酒裂殖酵母內(nèi)發(fā)揮作用的終止子，可以使用粟酒裂殖酵母本來所具有的終止子或粟酒裂殖酵母本來不具有的終止子。需要說明的是，載體內(nèi)可存在兩種以上的終止子。
作為終止子，可以列舉例如日本特開平5-15380號公報、日本特開平7-163373號公報、日本特開平10-234375號公報中記載的人來源的終止子，優(yōu)選人脂皮素I的終止子。
載體的重組位點(diǎn)是具有能夠?qū)λ诰屏阎辰湍傅娜旧w中的同源重組的靶位點(diǎn)進(jìn)行同源重組的堿基序列的位點(diǎn)。另外，靶位點(diǎn)是粟酒裂殖酵母的染色體內(nèi)成為重組表達(dá)盒的標(biāo)靶的位點(diǎn)。靶位點(diǎn)可以通過使載體的重組位點(diǎn)為對該靶位點(diǎn)進(jìn)行同源重組的堿基序列而自由地設(shè)定。
上述重組位點(diǎn)的堿基序列與靶位點(diǎn)的堿基序列的相同性需要設(shè)定為70%以上。另外，從容易發(fā)生同源重組的觀點(diǎn)考慮，重組位點(diǎn)的堿基序列與靶位點(diǎn)的堿基序列的相同性優(yōu)選設(shè)定為90%以上，更優(yōu)選為95%以上。通過使用具有這樣的重組位點(diǎn)的載體，利用同源重組將表達(dá)盒重組到靶位點(diǎn)中。
重組位點(diǎn)的長度(堿基數(shù))優(yōu)選為20 2000bp。重組位點(diǎn)的長度為20bp以上時，容易發(fā)生同源重組。另外，重組位點(diǎn)的長度為2000bp以下時，容易防止因載體過長而難以發(fā)生同源重組。重組位點(diǎn)的長度更優(yōu)選為IOObp以上，進(jìn)一步優(yōu)選為200bp以上。另外， 重組位點(diǎn)的長度更優(yōu)選為SOObp以下，進(jìn)一步優(yōu)選為400bp以下。
載體中除上述表達(dá)盒和重組位點(diǎn)以外可具有其他DNA區(qū)域。可以列舉例如對于在大腸桿菌內(nèi)復(fù)制所必需的稱為“ori”的復(fù)制起始區(qū)或抗生素抗性基因(新霉素抗性基因等)。這些是使用大腸桿菌構(gòu)建載體時通常所需要的基因。但是，上述復(fù)制起始區(qū)優(yōu)選如后所述在將載體重組到宿主的染色體中時除去。
載體是具有環(huán)形DNA結(jié)構(gòu)或線形DNA結(jié)構(gòu)的載體，在導(dǎo)入到粟酒裂殖酵母的細(xì)胞中時優(yōu)選以線形DNA結(jié)構(gòu)導(dǎo)入。即，在通常使用的質(zhì)粒DNA等具有環(huán)形DNA結(jié)構(gòu)的載體的情況下，優(yōu)選用限制性內(nèi)切酶將載體切開為線形后導(dǎo)入粟酒裂殖酵母的細(xì)胞中。
該情況下，將具有環(huán)形DNA結(jié)構(gòu)的載體的切開位置設(shè)定在重組位點(diǎn)內(nèi)。由此，使被切開的載體的兩端分別存在部分重組位點(diǎn)，通過同源重組將整個載體重組到染色體的靶位點(diǎn)中。
只要載體能夠形成兩端分別具有部分重組位點(diǎn)的線形DNA結(jié)構(gòu)，也可以采用除了將具有環(huán)形DNA結(jié)構(gòu)的載體切開的方法以外的方法進(jìn)行構(gòu)建。
作為載體，可以適合使用例如pBR322、pBR325、pUCl 18、pUCl 19、pUC18、pUC19 等大腸桿菌來源的質(zhì)粒。
該情況下，用于同源重組時的質(zhì)粒載體優(yōu)選已將在大腸桿菌內(nèi)復(fù)制所必需的稱為 “ori”的復(fù)制起始區(qū)除去。由此，將上述載體重組到染色體中時，能夠提高其重組效率。
除去復(fù)制起始區(qū)的載體的構(gòu)建方法沒有特別限定，優(yōu)選使用日本特開 2000-262284號公報中記載的方法。S卩，優(yōu)選事先構(gòu)建在重組位點(diǎn)內(nèi)的切割部位插入有復(fù)制起始區(qū)的前體載體，在如前所述地形成線形DNA結(jié)構(gòu)的同時，將復(fù)制起始區(qū)切除的方法。 由此，能夠簡便地得到除去復(fù)制起始區(qū)的載體。
另外，也可以采用以下方法應(yīng)用日本特開平5-15380號公報、日本特開平 7-163373號公報、國際公開第96/23890號小冊子、日本特開平10-234375號公報等中記載的表達(dá)載體及其構(gòu)建方法，構(gòu)建具有表達(dá)盒及重組位點(diǎn)的前體載體，再利用通常的基因工程的方法從該前體載體中除去復(fù)制起始區(qū)，得到用于同源重組的載體。
<靶位點(diǎn)>
用于重組入載體的靶位點(diǎn)在粟酒裂殖酵母的染色體中可以僅存在于1處，也可以存在于2處以上。存在2處以上的靶位點(diǎn)時，可以使重組到粟酒裂殖酵母的染色體中的載體為2處以上。另外，表達(dá)盒中的LDH基因為多個的情況下，可以在靶位點(diǎn)的1個部位重組多個LDH基因。此外，也可以在2種以上的靶位點(diǎn)，使用具有與各靶位點(diǎn)對應(yīng)的重組位點(diǎn)的 2種以上的載體來重組入表達(dá)盒。通過這些方法，能夠在粟酒裂殖酵母的染色體中重組入多個LDH基因，由此能夠增大乳酸脫氫酶的表達(dá)量，提高乳酸的生產(chǎn)率。
在1處靶位點(diǎn)重組表達(dá)盒時，例如可以使用日本特開2000-262284號公報中記載的方法。使用具有不同重組位點(diǎn)的2種以上的載體，能夠?qū)⑤d體分別重組到不同的靶位點(diǎn)中。但是，將載體重組到染色體的2處以上時，該方法較為繁雜。
若能夠以染色體中多處存在的實(shí)質(zhì)上彼此相同的堿基序列部分為靶位點(diǎn)、將載體分別重組到該多處的靶位點(diǎn)中，則能夠使用1種載體將載體重組到染色體的2處以上。實(shí)質(zhì)上彼此相同的堿基序列是指堿基序列的相同性為90 %以上。靶位點(diǎn)之間的相同性優(yōu)選為 95%以上。另外，實(shí)質(zhì)上彼此相同的堿基序列的長度為包含上述載體的重組位點(diǎn)的長度，優(yōu)選為IOOObp以上。與在1處靶位點(diǎn)重組有多個LDH基因的情況相比，即使LDH基因的重組數(shù)相同，當(dāng)在多個存在的靶位點(diǎn)分散地重組有LDH基因時，轉(zhuǎn)化體增殖時LDH基因曾經(jīng)從染色體上脫落的情況減少，轉(zhuǎn)化體在傳代中的維持穩(wěn)定性提高。
作為在染色體中多處存在的靶位點(diǎn)，優(yōu)選轉(zhuǎn)座子基因Tf2。已知Tf2是在粟酒裂殖酵母的3條(單倍體)染色體中分別合計存在13處的轉(zhuǎn)座子基因，長度(堿基數(shù))約為 4900bp，這些基因間的堿基序列相同性為99. 7% (參考下述文獻(xiàn))。
Nathan J. Bowen et al,"Retrotransposons and Their Recognition of pol II Promoters :A Comprehensive Survey of the Transposable Elements From the Complete Genome Sequence of Schizosaccharomyces pombe，，，Genome Res. 200313 :1984-1997
可以僅在染色體中存在13處的Tf2中的1處重組入載體。該情況下，通過重組入具有2個以上LDH基因的載體，能夠得到具有2個以上LDH基因的轉(zhuǎn)化體。另外，通過在2 處以上的Tf2中重組入載體，能夠得到具有2個以上LDH基因的轉(zhuǎn)化體。該情況下，通過重組入具有2個以上LDH基因的載體，能夠得到具有更多LDH基因的轉(zhuǎn)化體。若在所有13處Tf2中重組入載體，則可能會對轉(zhuǎn)化體的生存和增殖造成過大負(fù)荷。優(yōu)選在13處Tf2的8 處以下重組入載體，更優(yōu)選在5處以下重組入載體。
<轉(zhuǎn)化方法>
作為利用同源重組法對粟酒裂殖酵母宿主進(jìn)行轉(zhuǎn)化的方法，可以使用公知的同源重組法。作為本發(fā)明的轉(zhuǎn)化方法，優(yōu)選以上述PDC基因簇部分缺失或失活的粟酒裂殖酵母為宿主、使用上述載體通過同源重組在宿主染色體中重組入表達(dá)盒的方法。根據(jù)該制造方法，能夠簡便地制造本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)化法中，通常在進(jìn)行同源重組后，對所得的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行選擇。作為選擇的方法，例如，可以列舉以下所示的方法。使用能夠利用上述營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記對轉(zhuǎn)化體進(jìn)行選擇的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，從所得的菌落中選擇多個菌落。然后，將這些菌落分別進(jìn)行液體培養(yǎng)后，考察各培養(yǎng)液中的異種蛋白的表達(dá)量，選擇異種蛋白的表達(dá)量更多的轉(zhuǎn)化體。另外， 利用脈沖場凝膠電泳法對這些選擇出的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行基因組分析，由此能夠考察出染色體中重組的載體數(shù)和表達(dá)盒數(shù)。
染色體中重組的載體數(shù)可通過調(diào)節(jié)重組條件等進(jìn)行某種程度的調(diào)節(jié)，但根據(jù)載體的大小(堿基數(shù))、結(jié)構(gòu)的不同，重組效率和重組數(shù)也會發(fā)生變化。
認(rèn)為通過在粟酒裂殖酵母的染色體中重組多個LDH基因，能夠增大乳酸脫氫酶的表達(dá)量，提高乳酸的生產(chǎn)率。但是，本發(fā)明的目的在于獲得乳酸的生產(chǎn)效率高的轉(zhuǎn)化體，其目的并不在于獲得僅僅是表達(dá)盒的總數(shù)更多的轉(zhuǎn)化體。一般而言，表達(dá)盒數(shù)越多，預(yù)測乳酸脫氫酶的表達(dá)效率越高，進(jìn)而乳酸的生產(chǎn)效率越高。但是，表達(dá)盒數(shù)過多時，對細(xì)胞的生存和增殖的負(fù)荷增大，進(jìn)而乳酸生產(chǎn)效率也降低。另外，載體變大時，重組到染色體中的概率降低，難以增加重組的載體數(shù)，進(jìn)而獲得轉(zhuǎn)化體本身也變得困難。
[乳酸的制造方法]
本發(fā)明的乳酸的制造方法是在培養(yǎng)液中培養(yǎng)上述本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體，并從該培養(yǎng)液中獲取乳酸的乳酸的制造方法。
通過將本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體在含糖的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，由該糖經(jīng)糖酵解而得到的丙酮酸被乳酸脫氫酶還原而產(chǎn)生乳酸，從培養(yǎng)液中獲取產(chǎn)出于培養(yǎng)液中的乳酸，由此能夠制造乳酸制造。
作為乳酸的制造中使用的培養(yǎng)液，可以使用含有糖的公知的酵母培養(yǎng)用培養(yǎng)基， 并且只要是含有粟酒裂殖酵母可同化的氮源、無機(jī)鹽類等、能夠以良好的效率進(jìn)行粟酒裂殖酵母的培養(yǎng)的培養(yǎng)基即可。作為培養(yǎng)液，可以使用天然培養(yǎng)基，也可以使用合成培養(yǎng)基。
作為碳源的糖，可以列舉例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖等糖。作為氮源，可以列舉例如氨、氯化銨、乙酸銨等無機(jī)酸或無機(jī)酸的銨鹽、蛋白胨、酪蛋白水解物、酵母提取物等。作為無機(jī)鹽類，可以列舉例如磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉等?？梢赃M(jìn)一步含有蛋白脂質(zhì)等發(fā)酵促進(jìn)因子等。
本發(fā)明的乳酸的制造方法中，特別優(yōu)選使用含有葡萄糖作為糖的培養(yǎng)液。培養(yǎng)初期的培養(yǎng)液(100質(zhì)量％)中的葡萄糖濃度優(yōu)選為1質(zhì)量％以上，更優(yōu)選為1 50質(zhì)量％， 進(jìn)一步優(yōu)選為2 16質(zhì)量％。由于葡萄糖濃度會隨培養(yǎng)而降低，因此優(yōu)選根據(jù)需要添加葡萄糖而繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)末期的葡萄糖濃度可變?yōu)?質(zhì)量％以下。另外，在邊分離乳酸邊使培養(yǎng)液循環(huán)而進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)的情況下，優(yōu)選維持上述葡萄糖濃度。通過使葡萄糖濃度為2質(zhì)量％以上，可進(jìn)一步提高乳酸的生產(chǎn)率。另外，通過使培養(yǎng)液中的葡萄糖為16質(zhì)量％ 以下，可進(jìn)一步提高乳酸的生產(chǎn)率。
另外，為了提高乳酸制造的生產(chǎn)率，優(yōu)選進(jìn)行高密度培養(yǎng)。高密度培養(yǎng)時，優(yōu)選使培養(yǎng)液中的轉(zhuǎn)化體的初始菌體濃度以干燥菌體重量換算值表示為0. 1 50克/升。更優(yōu)選使培養(yǎng)液中的轉(zhuǎn)化體的初始菌體濃度以干燥菌體重量換算值表示為0. 2 40克/升。通過提高初始菌體濃度，能夠在短時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)高生產(chǎn)率。另外，初始菌體濃度過高時，可能會產(chǎn)生菌體的凝聚或純化效率的降低等問題。
需要說明的是，后述的實(shí)施例等中所示的菌體濃度是由利用日本分光公司制造的可見光紫外分光光度計V550測定的波長660nm的光的吸光度(0D660)換算得到的值。 660nm下OD = 1時相當(dāng)于裂殖酵母干重的0. 2g、濕重的0. 8g。
培養(yǎng)可以使用公知的酵母培養(yǎng)方法，例如可通過振蕩培養(yǎng)、攪拌培養(yǎng)等進(jìn)行。
另外，培養(yǎng)溫度優(yōu)選為23 37°C。另外，培養(yǎng)時間可以適當(dāng)決定。
另外，培養(yǎng)可以是分批培養(yǎng)，也可以是連續(xù)培養(yǎng)。例如，對于分批培養(yǎng)，在進(jìn)行培養(yǎng)后，從培養(yǎng)液中分離出菌體，可以獲得含有乳酸的培養(yǎng)液。另外，對于連續(xù)培養(yǎng)法，可以列舉例如從培養(yǎng)中的培養(yǎng)槽中抽出部分培養(yǎng)液，從抽出的培養(yǎng)液中分離乳酸，同時回收培養(yǎng)上清，向該培養(yǎng)上清中加入葡萄糖和新的培養(yǎng)液并將其返回到培養(yǎng)槽中，重復(fù)上述操作從而進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)的方法。通過進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，可進(jìn)一步提高乳酸的生產(chǎn)率。
在使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的乳酸的制造方法中，即使因乳酸的蓄積而達(dá)到較低的 pH(pH2 4左右)，也能夠在不進(jìn)行中和的情況下生產(chǎn)乳酸。因此，在培養(yǎng)液的pH達(dá)到4 以下之后也能通過進(jìn)一步繼續(xù)培養(yǎng)的連續(xù)培養(yǎng)來制造乳酸。培養(yǎng)末期的PH和連續(xù)培養(yǎng)中的PH優(yōu)選為1 4，特別優(yōu)選為1. 5 3. 5。為了提高乳酸的生產(chǎn)率，優(yōu)選在培養(yǎng)液的pH 達(dá)到3. 5以下之后進(jìn)一步繼續(xù)培養(yǎng)。由于本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的耐酸性優(yōu)良，因此能夠在不中和轉(zhuǎn)化體所產(chǎn)生的培養(yǎng)液中的乳酸的情況下繼續(xù)培養(yǎng)。
從培養(yǎng)液中獲取乳酸可以使用公知的方法進(jìn)行。特別優(yōu)選在不中和培養(yǎng)液中的乳酸的情況下將培養(yǎng)液和乳酸分離而獲取乳酸。可以列舉例如通過離心分離從培養(yǎng)結(jié)束后的培養(yǎng)液中分離菌體，將PH調(diào)節(jié)為1以下后用乙醚、乙酸乙酯等進(jìn)行提取的方法；使其吸附于離子交換樹脂上，洗滌后將其洗脫的方法；使用活性炭除去雜質(zhì)的方法；在酸催化劑的存在下與醇反應(yīng)后進(jìn)行蒸餾的方法；使用分離膜進(jìn)行分離的方法。另外，根據(jù)情況也可以在對培養(yǎng)液中的乳酸進(jìn)行中和后將培養(yǎng)液與乳酸鹽分離而獲取乳酸。例如，通過將培養(yǎng)液中的乳酸轉(zhuǎn)變成鈣鹽或鋰鹽并使該中和鹽析出的方法也能夠獲取乳酸。
以上說明的本發(fā)明的乳酸的制造方法，由于使用了以耐酸性特別優(yōu)良的粟酒裂殖酵母為宿主的轉(zhuǎn)化體，因此即使不用堿進(jìn)行中和也能夠以高生產(chǎn)率簡便地制造乳酸。另外， 由于PDC基因簇部分缺失或失活而使乙醇發(fā)酵的效率降低，因此乳酸的對糖收率(乳酸的生產(chǎn)量相對于消耗的糖量的比例)提高。本發(fā)明中，能夠容易地使乳酸的對糖收率為50質(zhì)量％以上。根據(jù)情況，乳酸的對糖收率也可達(dá)到70質(zhì)量％以上。另外，本發(fā)明的乳酸的制造方法也適合高濃度葡萄糖存在下及高濃度轉(zhuǎn)化體的高密度培養(yǎng)。
實(shí)施例
以下，示出實(shí)施例及比較例詳細(xì)地說明本發(fā)明。但是，本發(fā)明不受以下記載的限定。需要說明的是，本實(shí)施例中，若無特別說明，則“ ％ ”表示“質(zhì)量％ ”。
[例1]
<粟酒裂殖酵母基因刪除株的制作>
按照Latour 法(記載于 Nucleic Acids Res.雜志、2006 年、34 卷、ell 頁，國際公開第2007/063919號小冊子)對粟酒裂殖酵母的尿嘧啶缺陷型株(ARC010、基因型 h-leUl-32Ura4-D18、由東京大學(xué)研究生院理學(xué)系研究科附屬基因?qū)嶒炘O(shè)施的飯野雄一教授提供)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，制作刪除了丙酮酸脫羧酶(PDC)基因及醇脫氫酶(ADH)基因的刪除株。
制作刪除片段時，以利用DNeaSy(QIAGEN公司制)由粟酒裂殖酵母的ARC032株 (基因型h_、由東京大學(xué)研究生院理學(xué)系研究科附屬基因?qū)嶒炘O(shè)施的飯野雄一教授提供) 制備的全基因組DNA為模板，對于各個要刪除的基因分別使用如下所示序列的8種合成寡聚DNA (才 口>公司制)。
1)用于制作Pdcl (系統(tǒng)名:SPAC13A11. 06)刪除片段的寡聚DNA
UF :5，-AGGCAAATCGTGAACTCGG-3，(下述序列表的序列號2)
UR :5，-GCCAATTCCACTCTCAATAGCCCGAACGTTCCGTCTCG-3，(下述序列表的序列號 3)
OF :5，-GCTATTGAGAGTGGAATTGGC-3，(下述序列表的序列號 4)
OR :5，-AGTGGGATTTGTAGCTAAGCTACTGGTTTCCACATTGTTTGG-3，(下述序列表的序列號5)
DF :5，-AAGTTTCGTCAATATCACAAGCTCGAGACGGAACGTTCGG-3，(下述序列表的序列號 )
DR :5，-TTACAATGCTGAGTGTGTATTCC-3，(下述序列表的序列號 7)
FF :5，-TGAACTCGGTTGAAAAATGTCG-3，(下述序列表的序列號 8)
FR :5，-TGAGTGTGTATTCCTTTTTCGC-3，(下述序列表的序列號 9)。
⑵用于制作Pdc2(系統(tǒng)名SPAC1F8. 07c)刪除片段的寡聚DNA
UF :5，-CTCTCCAGCTCCATCCATAAG-3，(下述序列表的序列號 10)
UR :5，-GACACAACTTCCTACCAAAAAGCCTTTCTGCCCATGTTTTCTGTC-3'(下述序列表的序列號11)
OF :5，-GCTTTTTGGTAGGAAGTTGTGTC-3，(下述序列表的序列號 12)
OR :5，-AGTGGGATTTGTAGCTAAGCTGTATCCATTTCAGCCGTTTGTG-3’ (下述序列表的序列號13)
DF :5，-AAGTTTCGTCAATATCACAAGCTGACAGAAAACATGGGCAGAAAG-3'(下述序列表的序列號14)
DR :5，-GTTCCTTAGAAAAAGCAACTTTGG-3，(下述序列表的序列號 15)
FF :5，-CATAAGCTTGCCACCACTTC-3，(下述序列表的序列號 16)
FR :5，-GAAAAAGCAACTTTGGTATTCTGC-3，(下述序列表的序列號 17)。
⑶用于制作Pdc3(系統(tǒng)名SPAC186. 09)刪除片段的寡聚DNA
UF :5，-AAGGCATATTCGTTGATTAACCC-3，(下述序列表的序列號 18)
UR :5，-GGTGGAAAGGTTTGTGCAATCCGTCAACTCATGATATTTCTTTATGG-3’(下述序列表的序列號19)
OF :5，-GATTGCACAAACCTTTCCACC-3，(下述序列表的序列號 20)
OR :5，-AGTGGGATTTGTAGCTAAGCTCATCCCACATCTGTAATAATCACG-3'(下述序列表的序列號21)DF 5' -AAGTTTCGTCAATATCACAAGCTCCATAAAGAAATATCATGAGTTGACG-3，(下述序列 表的序列號22)DR :5，-TTTGAGAAGAAAATTTTATGTCCAGC-3，(下述序列表的序列號 23)FF :5，-CCATTTAGCAGTATAAGGGTCG-3，(下述序列表的序列號 24)FR :5，-AAGTAAAAATGTGAAAGCAATGTAGG-3，(下述序列表的序列號 25)。(4)用于制作pdc4(系統(tǒng)名SPAC3G9. lie)刪除片段的寡聚DNAUF :5，-ACACACAAACACTTCCATTCC-3，(下述序列表的序列號洸)UR 5，-CCTAACAAAAGCATCATTTGAGAAGACGAATGAAATGACAGCAAC-3，(下述序列表的 序列號27)OF :5，-TTCTCAAATGATGCTTTTGTTAGG-3，(下述序列表的序列號沘)OR :5，-AGTGGGATTTGTAGCTAAGCTCTGGACAAGTCTACCTTGGAG-3，(下述序列表的序列 號四)DF :5，-AAGTTTCGTCAATATCACAAGCTGTTGCTGTCATTTCATTCGTC-3，(下述序列表的序 列號30)DR :5，-GATACAGGAGTACAACAAAACAC-3，(下述序列表的序列號 31)FF :5，-TCTCCATCCCTCCTCCC-3，(下述序列表的序列號 32)FR :5，-ACGCTACTTAAACAAGACAAGC-3，(下述序列表的序列號 33)。(5)用于制作adhl (系統(tǒng)名SPCC13B11. 01)刪除片段的寡聚DNAUF :5，-TCATTCCTCGATATTCAGTTC-3，(下述序列表的序列號 34)UR :5，-GCCAGTGGGATTTGTAGCTACTCTGATCGGCATTTTTTGG-3，(下述序列表的序列號 35)OF :5，-GTTTCGTCAATATCACAAGCTTCCCCAACCTCCCATTTCCTCC-3，(下述序列表的序 列號36)OR 5，-CTACGATCAGAAGAAGATCAATGAGACGCGGAAGGGGAGCGCC-3，(下述序列表的序 列號37)DF :5，-GGCGCTCCCCTTCCGCGTCTCATTGATCTTCTTCTGATCGTAG-3，(下述序列表的序 列號3 DR :5，-ATGCATTTCACTCTATTCCTC-3，(下述序列表的序列號 39)FF :5，-GCTATAGTTAAGTGTAAGAC-3，(下述序列表的序列號 40)FR :5，-TTGTCCACACCACTCATTCG-3，(下述序列表的序列號 41)。(6)用于制作adh4(系統(tǒng)名SPAC5H10. 06c)刪除片段的寡聚DNAUF :5，-ATCGTCGTCGATGCTGATTGG-3，(下述序列表的序列號 42)UR :5，-GCCAGTGGGATTTGTAGCTCAGCAGTCATTCTCATTCCG-3，(下述序列表的序列號 43)OF :5，-CGTCAATATCACAAGCTTGTCTCCCCTTCTATTGGGATTTGC-3，(下述序列表的序列 號44)OR :5，-GATTACCTGCAATCATGTTTCCGGCCTTTTGTGAAACCTGCC-3，(下述序列表的序列 號4
DF :5，-GGCAGGTTTCACAAAAGGCCGGAAACATGATTGCAGGTAATC-3，(下述序列表的序列號46)
DR :5，-GGAGAATGATGTATTGGTAAATAAC-3，(下述序列表的序列號 47)
FF :5，-CCTTGGGAATGAGCGAATTC-3，(下述序列表的序列號 48)
FR :5，-GGGTTGTGAAGAGCATACTG-3，(下述序列表的序列號 49)。
(7)用于制作adhX(系統(tǒng)名SPBC1773. 06c)刪除片段的寡聚DNA
UF :5，-GAAGGAGATTATGTGAAACAAGTTGAAATC-3，(下述序列表的序列號 50)
UR 5，-AGCTTAGCTACAAATCCCACTCTGAGGGTAGTGTTCTTGCTACAAAAATCT-3，(下述序列表的序列號51)
OF :5，-AAGTTTCGTCAATATCACAAGCTCATGACGGAAGATTCCGAGAAATTCCGTTT-3，(下述序列表的序列號52)
OR :5，-CAAAGCCATGCTTTTAATGTTAAAGTGAAT-3，(下述序列表的序列號 53)
DF 5 ’-ATTCACTTTAACATTAAAAGCATGGCTTTGATCGATTGAGATTTTTGTAGCAAGAACACT-3’ (下述序列表的序列號
DR :5，-GGAAATGGTTCATGTGGACTGGGTTTTATT-3，(下述序列表的序列號 55)
FF :5，-CCTGCTCTTAAAATGACGAATGGTGTAGGC-3，(下述序列表的序列號 56)
FR :5，-ATATAGTGCGATATGGATGAAGGAGAAGAG-3，(下述序列表的序列號 57)。
(8)用于制作akrY(系統(tǒng)名SPAC977. 14c)刪除片段的寡聚DNA
UF :5，-ATCATAACTTACTATATCGTGAAGAAGAGA-3，(下述序列表的序列號 58)
UR 5，-AGCTTAGCTACAAATCCCACTTAGAATGAGTAATTCAACTTCTTAAACCAC-3，(下述序列表的序列號59)
OF :5，-AAGTTTCGTCAATATCACAAGCTTTAGCTTAAAAGTAATAAGCTTCTATGTGA-3，(下述序列表的序列號60)
OR :5，-TGAAGACATTTTATAAAACTTAAATAAAAA-3，(下述序列表的序列號 61)
DF :5， -TTTTTATTTAAGTTTTATAAAATGTCTTCAGAAATTTAAATCTGTGGTTTAAGAAGTTGA-3’(下述序列表的序列號62)
DR :5，-ACTTTGTTTATTGTAGAAAGTCGAGCTTGA-3，(下述序列表的序列號 63)
FF :5，-CAAAAGACAGGGGTCGGATTGATTCCTTGG-3，(下述序列表的序列號 64)
FR :5，-TGTGCTGTTTTTCAAGTGGTCATGCGTTAC-3，(下述序列表的序列號 65)。
對于各個要刪除的基因，分別通過使用KOD-Dash (東洋紡公司制)的PCR法，以UF 和UR制作UP區(qū)域，以O(shè)F和OR制作OL區(qū)域，以DF和DR制作DN區(qū)域，然后再以它們?yōu)槟０澹ㄟ^使用FF和FR的同樣的PCR法分別制作全長的刪除片段。制作全長的刪除片段時， 使用下述2種合成寡聚DNA (才《口 >公司制)、以利用ARC032株同樣制備的全基因組DNA 為模板、通過同樣的PCR法制備得到的ura4區(qū)域片段也一并作為模板使用。
5，-AGCTTAGCTACAAATCCCACT-3，(下述序列表的序列號 66)
5，-AGCTTGTGATATTGACGAAACTT-3，(下述序列表的序列號 67)
使用制作成的各刪除片段而制作的刪除株的株名、刪除的基因示于表1。
[表1]
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)化體，其以粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)為宿主，重組有乳酸脫氫酶基因，且編碼所述粟酒裂殖酵母宿主的丙酮酸脫羧酶的基因簇部分缺失或失活。
2.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)化體，其中，缺失或失活的編碼丙酮酸脫羧酶的基因為PDC2基因。
3.如權(quán)利要求1或2所述的轉(zhuǎn)化體，其中，所述乳酸脫氫酶基因為哺乳動物的乳酸脫氫酶基因。
4.如權(quán)利要求1 3中任一項所述的轉(zhuǎn)化體，其中，所述乳酸脫氫酶基因重組到粟酒裂殖酵母的染色體中。
5.一種轉(zhuǎn)化體的制造方法，所述轉(zhuǎn)化體為重組有乳酸脫氫酶基因且編碼丙酮酸脫羧酶的基因簇部分缺失或失活的轉(zhuǎn)化體，所述制造方法中，包括下述步驟以粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)為宿主，使用具有包含在粟酒裂殖酵母內(nèi)發(fā)揮作用的啟動子、終止子和乳酸脫氫酶基因的表達(dá)盒的載體，將所述表達(dá)盒導(dǎo)入所述宿主中而得到轉(zhuǎn)化體，和使用編碼丙酮酸脫羧酶的基因簇部分缺失或失活的宿主作為所述宿主，或者使所述得到的轉(zhuǎn)化體的編碼丙酮酸脫羧酶的基因簇部分缺失或失活。
6.如權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化體的制造方法，其中，所述載體還具有對粟酒裂殖酵母的染色體進(jìn)行同源重組的重組位點(diǎn)，使用該載體將表達(dá)盒導(dǎo)入粟酒裂殖酵母的染色體中。
7.如權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)化體的制造方法，其中，宿主的染色體中進(jìn)行同源重組的靶位點(diǎn)為轉(zhuǎn)座子基因Tf2。
8.如權(quán)利要求5 7中任一項所述的轉(zhuǎn)化體的制造方法，其中，以編碼丙酮酸脫羧酶的基因PDC2基因缺失或失活的粟酒裂殖酵母作為宿主。
9.如權(quán)利要求5 8中任一項所述的轉(zhuǎn)化體的制造方法，其中，所述乳酸脫氫酶基因為哺乳動物的乳酸脫氫酶基因。
10.一種乳酸的制造方法，其中，將權(quán)利要求1 4中任一項所述的轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，并從該培養(yǎng)液中獲取乳酸。
11.如權(quán)利要求10所述的乳酸的制造方法，其中，使用含有濃度為1 50質(zhì)量％的葡萄糖的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。
12.如權(quán)利要求10或11所述的乳酸的制造方法，其中，在通過由所述轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的乳酸的作用使所述培養(yǎng)液的PH達(dá)到3. 5以下后，進(jìn)一步繼續(xù)培養(yǎng)。
13.如權(quán)利要求10 12中任一項所述的乳酸的制造方法，其中，使所述培養(yǎng)液中的轉(zhuǎn)化體的初始菌體濃度以干燥菌體換算為0. 1 50克/升。
14.如權(quán)利要求10 13中任一項所述的乳酸的制造方法，其中，在不中和由所述轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的培養(yǎng)液中的乳酸的情況下繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。
15.如權(quán)利要求10 14中任一項所述的乳酸的制造方法，其中，在不中和由所述轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的培養(yǎng)液中的乳酸的情況下從培養(yǎng)液中分離乳酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及以粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)為宿主、重組有乳酸脫氫酶基因、且編碼所述粟酒裂殖酵母宿主的丙酮酸脫羧酶的基因簇部分缺失或失活的轉(zhuǎn)化體。
文檔編號C12P7/56GK102498209SQ20108003719
公開日2012年6月13日 申請日期2010年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月21日
發(fā)明者東田英毅, 原太志, 浜祐子(已逝) 申請人:旭硝子株式會社