專利名稱：真核細(xì)胞的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在含碳酸氫鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)真核細(xì)胞的裝置和方法，所述培養(yǎng)基允許在不直接向該培養(yǎng)基中添加堿的情況下維持細(xì)胞培養(yǎng)物的PH。
背景技術(shù)：
用于細(xì)胞建庫(kù)、用于細(xì)胞產(chǎn)品的生產(chǎn)例如重組蛋白生產(chǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)，受到細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)條件變化的妨礙。雖然不銹鋼生物反應(yīng)器常被用于細(xì)胞生產(chǎn)，然而一次性用品 (disposables)越來(lái)越多的在生物制品的制造的所有階段中使用(Rao等，2009)。在上游工藝中，相比不銹鋼制品，一次性的生物反應(yīng)器存在諸多的優(yōu)勢(shì)(從減少交叉污染到成本和時(shí)間的節(jié)省)。WAVE Bioreactor 是在生物醫(yī)藥工業(yè)中用于重組蛋白生產(chǎn)的一次性上游技術(shù)的一個(gè)文獻(xiàn)充分記載的實(shí)例(Cronin等，2007 ；Haldankar等，2006 ；Ling等，2003 Je等， 2009)。由Singh (Singh，1999)所開(kāi)發(fā)的WAVE Bioreactor 系統(tǒng)包含預(yù)先消毒的、柔性的、一次性的培養(yǎng)室(Cellbag )，CO2-和/或O2-空氣混合控制器，和用于搖動(dòng)和加熱 Celling 的氣動(dòng)控制平臺(tái)。由該平臺(tái)產(chǎn)生的搖擺(rock)運(yùn)動(dòng)在Celling 中提供了混合和氣體傳遞。WAVE Bioreactor 系統(tǒng)可以進(jìn)一步裝備以提供在線pH和溶解氧(DO)監(jiān)控以及實(shí)時(shí)反饋控制(Mikola等，2007 ;Tang等，2007)。然而，對(duì)額外設(shè)備的需求以及對(duì)專門設(shè)計(jì)的以容納PH和DO探測(cè)器的袋子的需求，增加了運(yùn)營(yíng)成本和系統(tǒng)的復(fù)雜性。另外，在pH控制生物反應(yīng)器中為使培養(yǎng)物PH增加到規(guī)定的設(shè)定點(diǎn)所需要的堿加入，會(huì)增加培養(yǎng)物的摩爾滲透壓濃度。取決于生物反應(yīng)器中摩爾滲透壓濃度增加的程度，在細(xì)胞增長(zhǎng)和存活力方面的相關(guān)衰減(deZengotita等，2002 ；Zhu等，2005)可能抵消pH值控制的優(yōu)勢(shì)。另外，如果 PH探測(cè)器發(fā)生故障，由此產(chǎn)生的pH值混亂可能改變細(xì)胞代謝并促進(jìn)細(xì)胞死亡(Miller等， 1988 ；Osman 等，2002)。對(duì)于某些細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用來(lái)說(shuō)嚴(yán)格的pH值和DO控制不是必須的，諸如，例如在小規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)如搖瓶和轉(zhuǎn)瓶中用于細(xì)胞的維持和擴(kuò)大的常規(guī)細(xì)胞傳代。然而，PH值和DO的極值對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和生存力是不利的(Lin等，1993 ；Link等，2004 ；Miller等，1988 ；Osman等 2001)，并可影響產(chǎn)品質(zhì)量(Restelli等2006 ；Yoon等，2005)。因此，對(duì)于生物制品制造的全階段，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)條件保持一些控制是極其重要的。研究人員先前證明，在6. 8-7. 3的 PH值范圍內(nèi)和在10-100 %空氣飽和度的DO值范圍內(nèi)的CHO細(xì)胞培養(yǎng)是成功的(Link等 2004 ；Restelli 等 2006 ；Trummer 等 2006 ；Yoon 等 2005)。向常規(guī)生物反應(yīng)器增加功能，如實(shí)時(shí)pH監(jiān)測(cè)和DO監(jiān)控控制，將顯著增加生物制品制造中細(xì)胞培養(yǎng)的成本和勞動(dòng)強(qiáng)度。另外，這些功能的失靈或者故障可導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)的不可接受的變動(dòng)和潛在的損失，這是非常耗費(fèi)時(shí)間和資源的。因此，需要用于培養(yǎng)真核細(xì)胞的改進(jìn)方法，該方法將無(wú)需引入強(qiáng)堿以及無(wú)需額外地進(jìn)行PH值和DO的監(jiān)測(cè)和實(shí)時(shí)控制。發(fā)明概述本發(fā)明提供了在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中無(wú)需加入堿即可維持PH值的裝置和方法。在含碳酸氫鹽的細(xì)胞培養(yǎng)基中，基于碳酸-碳酸氫鹽緩沖液平衡(反應(yīng)式1)CO2+HOH< = = = >H2CO3< = = = >H++HCO3_pH = pK-log ([CO2] / [HCO3-])，培養(yǎng)基中CO2的量將影響培養(yǎng)基的pH值。因此，本發(fā)明利用這種關(guān)系，通過(guò)使用細(xì)胞培養(yǎng)體系中液相和氣相的動(dòng)態(tài)界面來(lái)增加或者減少溶解的CO2濃度，無(wú)需添加強(qiáng)酸或者堿，調(diào)整細(xì)胞培養(yǎng)基的PH值。本發(fā)明提供了一種用于實(shí)現(xiàn)此調(diào)節(jié)的方法和用于實(shí)施該方法的裝置。一般地，向本發(fā)明的裝置供給空氣、氧氣或者這些氣體的組合，以維持細(xì)胞培養(yǎng)物的溶解氧。通過(guò)向裝置的頂部空間提供氣體混合物(可以操控其組成和引入速度)，取決于液相和氣相之間不同的CO2濃度，CO2可以被加入細(xì)胞培養(yǎng)基也可以從中移除。從頂部空間除去CO2將增加培養(yǎng)PH值，這是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的溶解CO2會(huì)擴(kuò)散進(jìn)入到頂部空間中。相反，當(dāng)以高于培養(yǎng)基中的濃度向所述裝置添加CO2時(shí)，CO2將溶解到培養(yǎng)基中并且培養(yǎng)pH值將減小。本發(fā)明提供了一種允許CO2轉(zhuǎn)移入和轉(zhuǎn)移出細(xì)胞培養(yǎng)物以維持培養(yǎng)pH值而無(wú)需添加堿的方法。因此，本發(fā)明提供了一種用于培養(yǎng)真核細(xì)胞的方法，包括在容器中在含碳酸氫鹽的培養(yǎng)液中培養(yǎng)真核細(xì)胞，其中所述容器具有封裝細(xì)胞培養(yǎng)物的壁和位于所述細(xì)胞培養(yǎng)物上方的氣相頂部空間。該容器還包括至少一個(gè)提供氣體自所述頂部空間進(jìn)出的口(port)。 攪動(dòng)該容器以提供在液相和氣相之間的動(dòng)態(tài)界面?？梢员O(jiān)測(cè)培養(yǎng)物的PH，并且可以通過(guò)所述的口向頂部空間供應(yīng)氣體，其中所述氣體包含一定量的CO2,以隨著更多的CO2溶解到細(xì)胞培養(yǎng)物中而降低PH，或者可以通過(guò)該口，從頂部空間排出累積的CO2，以使細(xì)胞培養(yǎng)物pH 值增加。由此PH值被維持在一個(gè)預(yù)定的范圍。一般地，在細(xì)胞培養(yǎng)基中溶解的CO2的分壓維持在1至200mmHg的量。在某些實(shí)施方式中，溶解的CO2的分壓為10至180mmHg。在某些實(shí)施方式中，溶解的CO2的分壓為20 至150mmHg。在某些實(shí)施方式中，溶解的CO2的分壓為100至180mmHg。在某些實(shí)施方式中， 溶解的CO2的分壓為20至80mmHg。在某些實(shí)施方式中，溶解的CO2的分壓為30至60mmHg。 在某些實(shí)施方式中，溶解的CO2的分壓為35至50mmHg。在某些實(shí)施方式中，溶解的CO2的分壓為40mmHg。頂部空間清除可以連續(xù)地或間歇地進(jìn)行。一般地，DO值維持在10%以上。在某些實(shí)施方式中，DO值維持在20%以上。在某些實(shí)施方式中，DO值維持在30%以上。在某些實(shí)施方式中，DO值維持在40%以上。在某些實(shí)施方式中，DO值維持在50 %以上。在某些實(shí)施方式中，DO值維持在60 %以上。在某些實(shí)施方式中，氣體進(jìn)入容器的流速是每分鐘0. 001頂部空間體積(hvm)。在某些實(shí)施方式中，氣體進(jìn)入容器的流速是0. 005hvmo在某些實(shí)施方式中，氣體進(jìn)入容器的流速是O.Olhvm。在某些實(shí)施方式中，氣體進(jìn)入容器的流速是0.02hvm。在某些實(shí)施方式中， 氣體進(jìn)入容器的流速是0.05hvm。在某些實(shí)施方式中，氣體進(jìn)入容器的流速是0. lhvm。在某些實(shí)施方式中，氣體進(jìn)入容器的流速是0. 2hvm0在某些實(shí)施方式中，氣體進(jìn)入容器的流速是Ojhm。在某些實(shí)施方式中，氣體進(jìn)入容器的流速是0.9hvm。在某些實(shí)施方式中，氣體進(jìn)入容器的流速是1. Ohvm。真核細(xì)胞可以是脊椎動(dòng)物細(xì)胞，例如但不限于青蛙、兔、嚙齒動(dòng)物、綿羊、山羊、狗、 貓、牛、馬、豬、非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物或人類的細(xì)胞。該方法可以在具有硬的或者可塑的壁的容器中進(jìn)行，例如塑料容器或者一次性培養(yǎng)袋。所述的容器可以通過(guò)任何能夠在容器中提供液相和氣相之間的動(dòng)態(tài)界面的工具來(lái)攪動(dòng)。這種攪動(dòng)(agitation)可以是例如搖擺(rocking)、定軌運(yùn)動(dòng)(orbital motion), 八字形運(yùn)動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)、振蕩(shaking)等。在某些實(shí)施方式中，攪動(dòng)通過(guò)搖擺來(lái)實(shí)現(xiàn)。搖擺的速度和角度可以調(diào)整以達(dá)到所需的攪動(dòng)。在某些實(shí)施方式中，搖擺的角度是20°、19°、18°、17°、16°、15°、14°、 13°、12°、11°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°、或者 1°。在某些實(shí)施方式中， 搖擺的角度是6-16°之間。在某些實(shí)施方式中，搖擺的角度是在7-16°之間。在某些實(shí)施方式中，搖擺的角度是在8-12°之間。在某些實(shí)施方式中，搖擺速度是1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17， 18，19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39,40rpmo 在某些實(shí)施方式中，搖擺速度是在19-25rpm之間。在某些實(shí)施方式中，搖擺速度是在20-24rpm 之間。在某些實(shí)施方式中，搖擺速度是在21-23rpm之間。所述方法可以在包含允許氣體進(jìn)出培養(yǎng)物的頂部空間的單個(gè)口的容器中進(jìn)行?；蛘?，所述容器可以包含多數(shù)個(gè)進(jìn)出口。培養(yǎng)物的pH值可以連續(xù)地或者間歇性地監(jiān)測(cè)，可以將氣體注入到頂部空間，如此提供在頂部空間中的氣體的(X)2水平，以增加或減少培養(yǎng)物液相中的溶解(X)2的濃度，從而將液相的pH值調(diào)整到預(yù)定值。在一個(gè)備選實(shí)施方式中，所述的方法可以包括步驟通過(guò)培養(yǎng)基進(jìn)口，將新鮮的培養(yǎng)基灌注到細(xì)胞培養(yǎng)物中。所述新鮮的培養(yǎng)基具有在加入后能調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)物的總PH的 PH值，由此通過(guò)新鮮培養(yǎng)基的pH值，部分地將細(xì)胞培養(yǎng)物維持在預(yù)定pH值范圍。在培養(yǎng)方法中使用具有預(yù)定PH值的新鮮培養(yǎng)基來(lái)調(diào)整pH值是有幫助的，但是還不足以完全控制pH值。所述的方法可以適應(yīng)于任何尺寸的培養(yǎng)。在某些實(shí)施方式中，所述的方法在商業(yè)可得的一次性生物反應(yīng)袋中進(jìn)行?？捎萌莘e500mL，1L，2L，10L, 20L, 50L, 100L, 200L, 500L 和1000L的該生物反應(yīng)袋。培養(yǎng)的多個(gè)參數(shù)可以被監(jiān)測(cè)和控制。參數(shù)可以通過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行計(jì)算，在自動(dòng)化過(guò)程中控制?？梢詥为?dú)或者組合控制的一些參數(shù)，包括但不限于，氣體流量、PH值、溶解的(X)2 濃度、溫度和攪動(dòng)。本發(fā)明還提供了實(shí)施本發(fā)明方法的裝置。附圖簡(jiǎn)介

圖1顯示本發(fā)明裝置的一個(gè)例子，該裝置包括灌注過(guò)濾器。所述裝置包括氣體入口和氣體出口、用于向培養(yǎng)物提供新鮮培養(yǎng)基的口、用于排出用過(guò)的培養(yǎng)基的灌注過(guò)濾器、 搖擺板和基部。搖擺運(yùn)動(dòng)允許攪動(dòng)以提供在培養(yǎng)基內(nèi)和外有效的O2和CO2傳遞。圖2顯示用于測(cè)量在WAVE Bioreactor 中的氧氣傳遞的無(wú)細(xì)胞研究。(圖A)在恒定的0. 2L/min空氣流速下?lián)u擺速度和搖擺角度對(duì)I^a的影響；(圖B)搖擺速度、搖擺角度和空氣流速對(duì)Kp的影響；(圖C)對(duì)于不同的搖擺角度、搖擺速度和和恒定的0. 2L/min(這里也被稱為L(zhǎng)PM)氣體流速的原始DO數(shù)據(jù)；(圖D)對(duì)于兩個(gè)的不同搖擺設(shè)定點(diǎn)，以不同的氣體流速得到的原始DO時(shí)間-進(jìn)程數(shù)據(jù)。圖3顯示為評(píng)估在WAVE Bioreactor 中CO2剝離(stripping)速度進(jìn)行的無(wú)細(xì)胞研究。(圖A)；在恒定的氣體流速0. 2LPM下不同搖擺角度和搖擺速度時(shí)原始pH值上升數(shù)據(jù)；(圖B)不同氣體流速下兩個(gè)不同搖擺設(shè)定點(diǎn)的原始pH值上升時(shí)間-進(jìn)程數(shù)據(jù)。(圖 C)對(duì)于圖A所示的不同搖擺條件，計(jì)算的pH值變化速度；(圖D)對(duì)于圖B所示的不同搖擺條件和不同氣體流速，計(jì)算的PH值變化速度。實(shí)心條是頭5分鐘的pH值變化速度，空心條是計(jì)算出的下面55分鐘的pH值變化速度。圖4顯示對(duì)于WAVE Bioreactor 分批培養(yǎng)，(圖A) VCC,(圖B)離線pH值，(圖 C)離線pC02，以及(圖D)離線DO曲線。工藝條件在下面表2中概述。對(duì)于⑴生產(chǎn)MAb B的細(xì)胞系只評(píng)估了接種階段，而對(duì)于(ii)生產(chǎn)MAb C的細(xì)胞系則評(píng)估了接種和規(guī)模放大階段(在此期間，工作體積從6L增加到20L)。在每個(gè)階段，在第一天泵入到頂部空間的空氣以8% (V/V)、在第二天以5% (V/V)、其后以2% (V/V)補(bǔ)充了 CO2。圖5顯示對(duì)于WAVE Bioreactor 灌流培養(yǎng)，使用生產(chǎn)MAb A的細(xì)胞系，在非優(yōu)化條件下運(yùn)行，(圖A)VCC、(圖B)培養(yǎng)物存活力、(圖C)離線pH，以及(圖D)D0濃度。頭6 天細(xì)胞以分批方式培養(yǎng)，隨后以灌流模式培養(yǎng)。在分批培養(yǎng)期間，Cellbag 中的工作容積首先用6L培養(yǎng)物接種，第3天，通過(guò)添加新鮮的培養(yǎng)基，將此培養(yǎng)物體積增加到25L。在灌流培養(yǎng)期間，以每天1體積的灌注速度，將培養(yǎng)體積維持在25L。對(duì)于這組實(shí)驗(yàn)，搖擺速度 ISrpm，搖擺角度是8度，而進(jìn)入到頂部空間的空氣流速是0. 2L/min。對(duì)于整個(gè)培養(yǎng)持續(xù)期間，用5% CO2(ν/ν)補(bǔ)充此空氣。圖6顯示分批(0-6天)/灌流(6-14天)過(guò)程的細(xì)胞培養(yǎng)物生長(zhǎng)曲線和pH曲線。 (圖Α)用％ PCV表示的收集細(xì)胞體積(packed cell volume)；(圖B)細(xì)胞生活力；(圖C) PH值曲線；(圖D)由ViCell AS測(cè)量的以活細(xì)胞數(shù)(VCC)表示的細(xì)胞生長(zhǎng)。圖7顯示來(lái)自不同的頂部空間清除速率(hvm)的培養(yǎng)性能。(圖A)顯示以一步增加氣流來(lái)實(shí)現(xiàn)頂部空間清除速率增加(( )為0. Ihvm和(-▲-)為0.02hvm)的2個(gè)實(shí)驗(yàn)。另一種頂部空間清除速率策略是在第10和11天的多步驟增加(0. 007hvm至0. 013hvm 至 0.02hvm) (-■-)。(圖 B)通過(guò) nova BioProfile 400 測(cè)量的溶解 CO2 分壓。圖8顯示對(duì)于六種不同細(xì)胞系——每一種生產(chǎn)一種不同的MAb，使用優(yōu)化工藝進(jìn)行WAVE Bioreactor 培養(yǎng)，(圖A) VCC、(圖B)培養(yǎng)物生活力、(圖C)離線pH以及(圖D) D0。在6L接種階段，培養(yǎng)物以21rpm搖擺，并且進(jìn)入到頂部空間的空氣流速是0. 2L/min。 第一天以8% (ν/ν)，第二天以5% (ν/ν)，隨后以2% (ν/ν)，在該空氣中補(bǔ)充C02。在20L 放大階段(第3-6天)，重復(fù)該空氣流方式。在20L灌流模式培養(yǎng)期間(自第6天起)，進(jìn)入頂部空間的空氣流速維持在0. 6L/min，無(wú)CO2補(bǔ)充，而在進(jìn)口氣體中O2比空氣的混合在第8天由0% (ν/ν)增加到30% (ν/ν)，并且在剩余的培養(yǎng)期間維持在30% (ν/ν) 0 20L分批和灌流培養(yǎng)以23rpm搖擺。所有培養(yǎng)的搖擺角度恒定在10°。圖9顯示在WAVE Bioreactor ( ·)和攪拌釜生物反應(yīng)器(□)中生產(chǎn)MAb E 的細(xì)胞系的平行培養(yǎng)物的(圖A) VCC、(圖B)生活力、(圖C)離線pH以及(圖D)離線DO。發(fā)明詳述本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知很多用于培養(yǎng)真核細(xì)胞的方案和方法、以及用于該培養(yǎng)的許多培養(yǎng)基。在文獻(xiàn)和教科書中描述了這樣的方案和培養(yǎng)基，如動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，一種實(shí)用方法，第2版，Rickw00d，D.和HameS，B.D.編著，牛津大學(xué)出版社，紐約(1992)。一般的使用方法也可以在互聯(lián)網(wǎng)上得到，如protocol-online. org/prot/Cell_Biology/Cell_Culture。 細(xì)胞培養(yǎng)基也可以從各種熟知的來(lái)源購(gòu)買獲得。這里引用的所有文獻(xiàn)以參考的形式特此并入。定義本文述及或提及的一般細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)以及工藝是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知、和慣常以常規(guī)方法進(jìn)行使用的。如果適用的話，涉及使用商購(gòu)試劑盒以及試劑的操作，除非另有說(shuō)明，否則通常按照制造商所規(guī)定的操作方案和/或參數(shù)來(lái)進(jìn)行。在描述本發(fā)明方法之前，應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明不限于所描述的具體方法學(xué)、操作方案、細(xì)胞系、動(dòng)物種或?qū)?、?gòu)建體以及試劑，因?yàn)樗鼈儺?dāng)然是可以變化的。還應(yīng)當(dāng)理解的是，這里使用的術(shù)語(yǔ)僅僅旨在用于描述特定實(shí)施方式，而不旨在對(duì)本發(fā)明范圍構(gòu)成限制，本發(fā)明范圍僅由后附權(quán)利要求限定。必須注意的是，除非上下文清楚地另有說(shuō)明，這里以及在后附權(quán)利要求書中所使用的，單數(shù)形式“a”，“an”，和“the”包括復(fù)數(shù)對(duì)象。在說(shuō)明書和相關(guān)權(quán)利要求中所述及的所有數(shù)字(例如，l-200mm Hg等)應(yīng)理解為受術(shù)語(yǔ)“約”修飾。本文所提到的所有出版物通過(guò)參考而并入本文，以公開(kāi)和描述與被引用的出版物有關(guān)的方法和/或材料。本文引用的出版物因其早于本申請(qǐng)的申請(qǐng)日的公開(kāi)而被引用。在此無(wú)一應(yīng)被解釋為承認(rèn)本發(fā)明人無(wú)權(quán)依據(jù)更早的優(yōu)選權(quán)日或在先發(fā)明日而享有早于這些出版物的權(quán)利。此外，實(shí)際出版日可能不同于所示的日期，需要單獨(dú)核實(shí)。此處所使用“約”指比所述值多或少10%的值。此處所使用的“攪動(dòng)”是指擾動(dòng)，以便培養(yǎng)物的液相和培養(yǎng)物上方的氣相處于動(dòng)態(tài)相互作用中。攪動(dòng)可以是指運(yùn)動(dòng)如振蕩、攪拌、搖擺、定軌振蕩、滾動(dòng)、八字型搖蕩、或者能使液相處于非靜止態(tài)從而增加氣體在液相內(nèi)和外的擴(kuò)散的任何方式。此處使用的“氣體”是指純氣體或者氣體的混合物，其可以包括氮?dú)?、氧氣、以及二氧化碳。通常，氮?dú)庖钥倸怏w濃度的約60-90%的量存在，氧氣以總氣體濃度的約10-40% 的量存在，二氧化碳以總氣體濃度的約0-50%的量存在。此處使用的“含碳酸氫鹽的細(xì)胞培養(yǎng)液”是指用于培養(yǎng)真核細(xì)胞的合適培養(yǎng)基，其包含碳酸氫鹽緩沖體系作為其組成的一部分。所述培養(yǎng)基還可包含其他緩沖劑如HEPES或者M(jìn)OPS等，但是必須包含碳酸氫鹽基體系。此處使用的“細(xì)胞培養(yǎng)物”是指在包含緩沖劑和對(duì)于活細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或維持所必須的營(yíng)養(yǎng)素的液體培養(yǎng)基中包含真核細(xì)胞的液體制品。
此處所使用的“溶解CO2的濃度”由以mmHg為單位的CO2相對(duì)測(cè)量分壓表示。因此，溶解CO2的分壓被用作溶解的CO2的濃度的反映?！癉O”是指溶解氧。此處使用的“動(dòng)態(tài)界面”是指由攪動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)物引起的液相和氣相之間的增強(qiáng)氣體活躍交換。此處所使用的“真核細(xì)胞”是指動(dòng)物細(xì)胞，其可以是非脊椎動(dòng)物或者脊椎動(dòng)物的細(xì)胞。此處所使用的“頂部空間”是指用于培養(yǎng)細(xì)胞的容器中位于細(xì)胞培養(yǎng)物的液相上方的氣相。此處使用的hvm是指每分鐘頂部空間體積，其指示頂部空間中的氣體被清除的速度。KLa 是指體禾只氧傳質(zhì)系數(shù)(volumetric oxygen transfer coefficient)。KLaC02是指體積二氧化碳傳質(zhì)系數(shù)。LPM是指每分鐘的氣流公升數(shù)。此處使用的“調(diào)整/調(diào)節(jié)”是指實(shí)現(xiàn)值的增加或者減小。此處使用的“監(jiān)測(cè)”是指通過(guò)連續(xù)或者間歇地取樣和分析以確定特定的值來(lái)跟蹤該值。PCO2是指溶解的CO2濃度的分壓。此處使用的“口”是指出入一個(gè)封閉系統(tǒng)的點(diǎn)。此處使用的“預(yù)定的”是指針對(duì)一個(gè)具體參數(shù)提前選擇的值，該值被用作目標(biāo)值。此處使用的“rpm”是指每分鐘搖擺數(shù)。VCC是指活細(xì)胞濃度。此處使用的“容器”是指容納器物(container)。此處使用的容器可以是，例如，搖瓶，生物反應(yīng)器，一次性生物反應(yīng)袋，培養(yǎng)室等。此處使用的“vvm”是指每分鐘的容器容積。理論方面在WAVE Bioreactor 培養(yǎng)中 02 的傳質(zhì)為了確定WAVE Bioreactor 中O2的傳質(zhì)速率，我們假定對(duì)在線DO探測(cè)器有足夠快的響應(yīng)時(shí)間，在Cellbag 中理想的混合，以及由液相界面引起的傳質(zhì)阻力占主要。在這些假定條件下，以下質(zhì)量平衡公式可以給出由氣相到液相的氧氣傳質(zhì)速率大概值
權(quán)利要求
1.一種用于分批培養(yǎng)真核細(xì)胞的方法，包括向容器中提供包含在含碳酸氫鹽的培養(yǎng)液中的真核細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)接種物，所述的容器具有封裝所述細(xì)胞培養(yǎng)物的壁和位于所述細(xì)胞培養(yǎng)物上方的氣相頂部空間，并且其中所述容器包含至少一個(gè)提供氣體進(jìn)出所述頂部空間的口；攪動(dòng)所述的容器；和通過(guò)所述口向所述頂部空間提供氣體，其中所述的氣體包含一定量的C02，并且其中為了維持所述細(xì)胞培養(yǎng)物的預(yù)定PH，隨時(shí)間調(diào)節(jié)在所述氣體中所述C02量以調(diào)整所述細(xì)胞培養(yǎng)物的PH。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的攪動(dòng)是以15-30rpm的搖擺速度和5°-15°的搖擺角度，搖擺所述容器。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中搖擺速度在19-25rpm之間，搖擺角度在8°-12°。
4.權(quán)利要求1所述方法，其中所述C02以所述氣體的10%和0%(ν/ν)之間的量提供。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述C02以所述氣體的8%和2%(ν/ν)之間的量提{共。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述C02在第1天以所述氣體的8%(ν/ν)的量提供， 在第2天以所述氣體的5% (ν/ν)的量提供，并且此后以所述氣體的2% (ν/ν)的量提供。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述氣體流速在0到1.Ohvm。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述氣體流速在0.001和0. 002hvm之間。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述氣體流速是0.007hvm。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的真核細(xì)胞是脊椎動(dòng)物細(xì)胞。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中脊椎動(dòng)物細(xì)胞選自蛙細(xì)胞、兔細(xì)胞、嚙齒動(dòng)物細(xì)胞、 綿羊細(xì)胞、山羊細(xì)胞、狗細(xì)胞、貓細(xì)胞、牛細(xì)胞、馬細(xì)胞、非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物的細(xì)胞和人細(xì)胞。
12.一種用于灌流培養(yǎng)真核細(xì)胞的方法，包括向容器中提供包含在含碳酸氫鹽的培養(yǎng)液中的真核細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)接種物，所述的容器具有封裝所述細(xì)胞培養(yǎng)物的壁和位于所述細(xì)胞培養(yǎng)物上方的氣相頂部空間，并且其中所述的容器包含至少一個(gè)提供氣體進(jìn)和出所述頂部空間的口 ；攪動(dòng)所述的容器；將新鮮培養(yǎng)基灌流到所述容器中，并且從所述容器中移除廢培養(yǎng)基；通過(guò)所述口向所述頂部空間提供氣體以從所述容器的頂部空間掃出累積的C02，由此調(diào)節(jié)所述細(xì)胞培養(yǎng)物的PH，以維持所述細(xì)胞培養(yǎng)物的預(yù)定pH。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的攪動(dòng)是以15-30rpm的搖擺速度和5°-15° 的搖擺角度，搖擺所述容器。
14.權(quán)利要求12所述的方法，其中搖擺速度在19-25rpm之間，搖擺角度在8°-12°。
15.權(quán)利要求1所述方法，其中所述的氣體包含所述氣體的0%和50%(ν/ν)之間的量的02。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述02以所述氣體的20%和40%(ν/ν)之間的量提供。
17.權(quán)利要求12所述的方法，其中02在第1和2天以所述氣體的0%(ν/ν)的量提供， 并且此后以所述氣體的30% (ν/ν)的量提供。
18.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述氣體流速在0到1.Ohvm。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述氣體流速在0.001和0. (^hvm之間。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述氣體流速是0.Oawm。
21.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的真核細(xì)胞是脊椎動(dòng)物細(xì)胞。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中脊椎動(dòng)物細(xì)胞選自蛙細(xì)胞、兔細(xì)胞、嚙齒動(dòng)物細(xì)胞、 綿羊細(xì)胞、山羊細(xì)胞、狗細(xì)胞、貓細(xì)胞、牛細(xì)胞、馬細(xì)胞、非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物的細(xì)胞和人細(xì)胞。
23.權(quán)利要求1或12所述方法，其中所述的容器是硬質(zhì)容器。
24.權(quán)利要求1或12所述方法，其中所述的容器是可塑容器。
25.權(quán)利要求M所述方法，其中所述的容器是一次性培養(yǎng)袋。
26.權(quán)利要求1或12所述方法，還包含pH監(jiān)測(cè)器用于持續(xù)性或者間歇性監(jiān)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)的pH。
27.權(quán)利要求12所述方法，其中所述的新鮮培養(yǎng)基具有預(yù)定的pH以調(diào)節(jié)所述細(xì)胞培養(yǎng)物的PH。
28.權(quán)利要求12所述方法，其中所述新鮮培養(yǎng)基的注入是通過(guò)允許細(xì)胞保留在所述培養(yǎng)基中的灌留裝置來(lái)進(jìn)行。
29.權(quán)利要求1的方法，其中向所述頂部空間提供所述的氣體，使細(xì)胞培養(yǎng)物維持溶解 C02分壓在約l-200mmHg的水平。
30.權(quán)利要求四的方法，其中向所述頂部空間提供所述的氣體，使細(xì)胞培養(yǎng)物維持溶解C02分壓在約10-150mmHg的水平。
31.權(quán)利要求30的方法，其中向所述頂部空間提供所述的氣體，使細(xì)胞培養(yǎng)物維持溶解C02分壓在約20-120mmHg的水平。
32.權(quán)利要求1的方法，其中向所述頂部空間提供所述的氣體，使細(xì)胞培養(yǎng)物維持溶解 C02分壓在約20-80mmHg的水平。
33.一種用于培養(yǎng)真核細(xì)胞的裝置，其包含容器，其具有限定容器內(nèi)部空間和將所述內(nèi)部空間與周圍環(huán)境分開(kāi)的壁；至少一個(gè)口，其提供氣體從所述裝置的進(jìn)和出；可逆地連接到容器的攪動(dòng)器；以及任選的，pH監(jiān)測(cè)器，其具有放置在所述內(nèi)部空間的探針。
34.權(quán)利要求33的裝置，其中所述的容器是一次性生物反應(yīng)袋。
35.權(quán)利要求33的裝置，其中所述容器包含多數(shù)個(gè)提供氣體從所述容器進(jìn)和出的口。
36.權(quán)利要求33的裝置，其中所述的容器還包含廢培養(yǎng)基口以從所述的容器中移除廢培養(yǎng)基和灌流口以向所述容器提供新鮮培養(yǎng)基。
37.權(quán)利要求33的裝置，其中所述的pH監(jiān)測(cè)器與計(jì)算機(jī)自動(dòng)化系統(tǒng)連接，其中所述的系統(tǒng)響應(yīng)于所述PH監(jiān)測(cè)器測(cè)量到的pH調(diào)整，調(diào)節(jié)所述容器的頂部空間清除，以調(diào)整所述容器中的C02濃度。
38.權(quán)利要求37的裝置，還含有至少一種其他監(jiān)測(cè)器以監(jiān)測(cè)選自氣流、溫度、攪動(dòng)、新鮮培養(yǎng)基灌流速度和溶解C02的參數(shù)。
39.一種用于分批培養(yǎng)真核細(xì)胞的方法，其包含向容器中提供包含在含碳酸氫鹽的培養(yǎng)液中的真核細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，所述的容器具有封裝所述細(xì)胞培養(yǎng)物的壁和位于所述細(xì)胞培養(yǎng)物上方的氣相頂部空間，并且其中所述的容器包含至少一個(gè)提供氣體從所述的頂部空間進(jìn)和出的口 ； 攪動(dòng)所述的容器；通過(guò)所述口向所述頂部空間提供氣體，其中所述的氣體在第1天包含氣體的8% (ν/ν) C02，在第2天氣體的5% (v/v)C02，以及此后氣體的2% (v/v)C02。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述容器在搖擺裝置上以21-30rpm的搖擺速度攪動(dòng)。
41.權(quán)利要求39所述的方法，其中所述容器在搖擺裝置上以8°至12°的搖擺角度攪動(dòng)。
42.權(quán)利要求41所述的方法，其中所述容器在搖擺裝置上以10°的搖擺角度攪動(dòng)。
43.一種灌流培養(yǎng)真核細(xì)胞的方法，其包含向容器中提供包含在含碳酸氫鹽的培養(yǎng)液中的真核細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物， 所述的容器具有封裝所述細(xì)胞培養(yǎng)物的壁和位于所述細(xì)胞培養(yǎng)物上方的氣相頂部空間，并且其中所述的容器包含至少一個(gè)提供氣體從所述的頂部空間進(jìn)和出的口 ； 攪動(dòng)所述的容器；通過(guò)所述口向所述頂部空間提供氣體，其中所述的氣體在灌流開(kāi)始后兩天補(bǔ)充至少 30% 02 (ν/ν)。
全文摘要
本發(fā)明提供在含碳酸氫鹽的細(xì)胞培養(yǎng)體系中無(wú)需添加堿而維持pH在利于細(xì)胞生長(zhǎng)的范圍內(nèi)的裝置和方法。所述方法依賴生物反應(yīng)器系統(tǒng)的氣體傳質(zhì)特性來(lái)調(diào)節(jié)CO2自和向細(xì)胞培養(yǎng)物的傳遞，從而細(xì)胞培養(yǎng)物的pH可以被維持在期望的范圍內(nèi)。
文檔編號(hào)C12M3/02GK102482633SQ201080039284
公開(kāi)日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月6日
發(fā)明者D·巴斯卡爾, I·H·尤克, J·熊, W-L·S·梁 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司