專利名稱：增加的轉(zhuǎn)基因表達(dá)和加工的產(chǎn)品和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于轉(zhuǎn)基因表達(dá)的方法和真核宿主細(xì)胞。通過偏愛同源重組(HR)超過非同源末端連接(NHEJ)，轉(zhuǎn)基因表達(dá)被推進(jìn)。本發(fā)明還涉及在非靈長類真核宿主細(xì)胞中提供在靈長類，特別是人類中涉及的蛋白質(zhì)，介導(dǎo)或影響跨過ER膜易位和/或跨過細(xì)胞質(zhì)膜分泌的途徑。
背景技術(shù)：
治療性蛋白的生物技術(shù)產(chǎn)生以及基因和細(xì)胞療法取決于導(dǎo)入到真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因的成功表達(dá)。成功的轉(zhuǎn)基因表達(dá)常常要求轉(zhuǎn)基因整合進(jìn)宿主染色體并受整合的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)目的限制和受外遺傳效應(yīng)等的限制，外遺傳效應(yīng)可引起低的或不穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄和/或高克隆變異性。轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物不能或降低的轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞也常常限制治療性蛋白的產(chǎn)生以及基因和細(xì)胞療法。出版物和其它材料——包括本文中用于說明本發(fā)明，特別是用于提供關(guān)于實(shí)施的另外細(xì)節(jié)的專利和登錄號——以其全部通過引用被并入本文。為方便起見，在下文中出版物通過作者和日期被引用并在文獻(xiàn)目錄中按作者字母順序列出。真核生物的DNA被高度壓縮成染色質(zhì)的事實(shí)允許全部真核基因組在幾微米直徑的細(xì)胞核內(nèi)適合。然而，該事實(shí)使得基因表達(dá)通過染色質(zhì)的局部和暫時的壓縮和解壓縮而被控制，其包括高度調(diào)節(jié)的和復(fù)雜的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。此外，轉(zhuǎn)基因整合進(jìn)宿主染色體在大多數(shù)情況下是隨機(jī)事件，其導(dǎo)致隨機(jī)的整合位置和變化的拷貝數(shù)。通常在穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因表達(dá)中觀察到的獨(dú)立轉(zhuǎn)化體中的高度變異性被認(rèn)為依賴在宿主基因組內(nèi)整合的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)目并依賴在轉(zhuǎn)基因整合位點(diǎn)的染色質(zhì)環(huán)境(Kalos and Fournier, 1995 ；ReciIlas-Targa et al.，200幻。整合進(jìn)隨機(jī)位置的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)可受在整合位置的調(diào)控元件的任意存在的影響以及受與整合位置相鄰的染色體結(jié)構(gòu)域的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)影響。例如，由于活性基因靠近抑制性異染色質(zhì)，被稱作位置效應(yīng)變化的現(xiàn)象可引起活性基因隨著時間沉默(Robertson et al.，1995 ；Henikoff,1996 ；Wakimoto,1998)。已發(fā)展了很多方法，如磷酸鈣DNA共沉淀、聚乙稀亞胺法、電穿孔和聚陽離子脂質(zhì)來促進(jìn)具有可變的轉(zhuǎn)染率的基因轉(zhuǎn)移。擴(kuò)大轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)并因此增加轉(zhuǎn)基因表達(dá)的一個方法是基因擴(kuò)增(Kaufman，2000)。可選的方法是通過插入合成的或天然調(diào)節(jié)序列來優(yōu)化表達(dá)載體。為了增加和穩(wěn)定在哺乳動物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，外遺傳調(diào)節(jié)子正日益增加地用于保護(hù)轉(zhuǎn)基因抵御負(fù)位置效應(yīng)(Bell and Felsenfeld, 1999)并包括邊界或絕緣子元件、基因座控制區(qū)(LCRs)、穩(wěn)定和抗阻抑物(STAR)元件、無所不在地作用染色質(zhì)開放 (ubiquitously acting chromatin opening) (UCOE)元件和上述的基質(zhì)附著區(qū)(MARs)。所有這些外遺傳調(diào)節(jié)子已用于哺乳動物細(xì)胞系中重組蛋白質(zhì)產(chǎn)生(Zahn-Zabal et al., 2001 ；Kim et al.，2004)并用于基因療法(Agarwal et al. , 1998 ；Allen et al.，1996 ； Castilla et al. ,1998)。如上所述，失敗或降低的轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞還常常限制治療用蛋白質(zhì)的產(chǎn)生以及基因和細(xì)胞療法。轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物常常遇到不同的瓶頸只裝備有處理和轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞固有蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)的細(xì)胞才能通過某些類型的轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)而變得容易地過多裝載，尤其是當(dāng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物以如通常期望的異常高的水平產(chǎn)生，使產(chǎn)物聚集在細(xì)胞內(nèi)和/或，例如，防止功能蛋白質(zhì)產(chǎn)物的正確折疊時。已追求不同的方法來克服轉(zhuǎn)運(yùn)和加工瓶頸。例如，具有改進(jìn)的分泌性質(zhì)的CHO細(xì)胞通過充當(dāng)膜狀囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和此后分泌的蛋白質(zhì)胞吐的調(diào)節(jié)子的SM蛋白MimclSc或Slyl 的表達(dá)而被工程改造(美國專利申請20090247609)。X盒結(jié)合蛋白質(zhì)1 0(bpl)——調(diào)節(jié)分泌細(xì)胞分化和ER保持和擴(kuò)大的轉(zhuǎn)錄因子、或各種蛋白質(zhì)二硫化異構(gòu)酶(PDI)——也已用于降低ER應(yīng)激和增加蛋白質(zhì)分泌(Mohan et al. 2007)。增加蛋白質(zhì)分泌的其它嘗試包括在 CHO細(xì)胞中蛋白伴侶ERp57、鈣聯(lián)接蛋白、肌鈣網(wǎng)蛋白的表達(dá)(Chung et al.，2004)。最后， 冷休克誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)——冷誘導(dǎo)的RNA結(jié)合蛋白質(zhì)(CIRP)——的表達(dá)顯示增加重組Y-干擾素的產(chǎn)量。還進(jìn)行了嘗試來過量表達(dá)分泌性復(fù)合體的蛋白質(zhì)。然而，例如，Lakkaraju等 (2008)報道了 WT人類細(xì)胞中(例如在未被工程改造以表達(dá)低SRP14水平的細(xì)胞中)的外源性SRP14表達(dá)沒有提高分泌型堿性磷酸酶蛋白的分泌效率。因此，存在有效的、更可靠的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，例如，重組蛋白質(zhì)產(chǎn)生的需求和基因療法的需求。還存在成功地將轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外的需求。本領(lǐng)域中需求這和其它需求通過本發(fā)明的某些實(shí)施方式來解決。發(fā)明概述本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因表達(dá)方法，包括(a)提供真核生物優(yōu)選哺乳動物的宿主細(xì)胞， 其中所述宿主細(xì)胞已被修飾或處理以在所述細(xì)胞中增加同源重組(HR)，降低非同源末端連接(NHEJ)和/或提高HR/NHEJ比，和(b)用至少一種包括所述轉(zhuǎn)基因的載體，并任選地，用基質(zhì)附著區(qū)(ΜΑ 元件，轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞，其中所述MAR元件以順式或反式提供給所述轉(zhuǎn)基因。(b)中的轉(zhuǎn)染可以是隨后的轉(zhuǎn)染，包括只是單個隨后的轉(zhuǎn)染，并可以在用核酸如載體或核酸片段的最初的轉(zhuǎn)染——包括只是單個最初的轉(zhuǎn)染——之后。所述細(xì)胞的細(xì)胞群體的細(xì)胞周期可被同步，例如，通過使細(xì)胞群體經(jīng)受化學(xué)或溫度處理。當(dāng)群體的大部分細(xì)胞在細(xì)胞周期的Gl期時，最初和隨后的轉(zhuǎn)染可發(fā)生。細(xì)胞群體的超過30%、超過31%、32%、 33%、34%、35%、36%、36%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%或 45% 的細(xì)胞可處于 Gl期。優(yōu)選，在初始轉(zhuǎn)染之前，可給予HR酶、HR激活劑和/或NHEJ抑制劑。細(xì)胞還可以是重組真核宿主細(xì)胞并可包括編碼HR酶、HR激活劑和/或NHEJ抑制劑的轉(zhuǎn)基因序列。細(xì)胞的NHEJ或HR基因還可被突變?？蛇x地或另外，所述細(xì)胞基因組可被突變以使NHEJ失活， 以增加至少一個HR酶、至少一個HR激活劑和/或至少一個NHEJ抑制劑的表達(dá)或活性。所述最初轉(zhuǎn)染的核酸在某些實(shí)施方式中是包括轉(zhuǎn)基因的載體。最初轉(zhuǎn)染的載體和所述至少一個隨后轉(zhuǎn)染的至少一個載體在整合進(jìn)細(xì)胞基因組之前和/或之后可形成串聯(lián)結(jié)構(gòu)(concatemeric structures)。串聯(lián)結(jié)構(gòu)可包括所述轉(zhuǎn)基因的至少200、300、400、500或600個拷貝。細(xì)胞的HR/NHEJ比比分別不包括所述轉(zhuǎn)基因序列和未被突變的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的比可高達(dá)2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30倍。細(xì)胞的NHEJ活性可等于約0。所述至少一個隨后的轉(zhuǎn)染之后，整合進(jìn)所述細(xì)胞基因組的所述轉(zhuǎn)基因的整合拷貝數(shù)可以是大于代表通過用(b)的載體直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得的整合拷貝數(shù)的參考值兩倍。最初轉(zhuǎn)染的核酸可以是包括MAR元件和所述轉(zhuǎn)基因的載體。最初轉(zhuǎn)染，例如，單個最初轉(zhuǎn)染之后，所述轉(zhuǎn)基因的表達(dá)可達(dá)到最初的水平，隨后的轉(zhuǎn)染，例如，單個隨后的轉(zhuǎn)染之后，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)可達(dá)到隨后的水平，該水平超過累加的，優(yōu)選超過所述最初水平的兩倍、三倍或四倍?？蛇x地或另外，最初轉(zhuǎn)染之后，整合進(jìn)細(xì)胞基因組的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)等于 (η)，至少一個隨后的轉(zhuǎn)染之后，整合進(jìn)基因組的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)可大于2 (η)、3 (η)或4 (η)。 轉(zhuǎn)基因可在單個基因座作為串聯(lián)結(jié)構(gòu)而整合進(jìn)所述細(xì)胞的基因組。(b)中的MAR元件可改善表達(dá)，基本上或完全防止來自包括轉(zhuǎn)基因的載體的多重拷貝的共整合的抑制效應(yīng)。 至少一個隨后轉(zhuǎn)染的載體的大于過50%、60%、70%、80%被運(yùn)送進(jìn)細(xì)胞核。最初的轉(zhuǎn)染之后，可達(dá)到轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的最初水平和最初轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)。所述至少一個隨后的轉(zhuǎn)染之后，轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的水平可增加到隨后的水平，最初轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)可增加到隨后的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)，其中轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的第一和第二水平之間的增加可超過最初的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)和隨后的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)之間的增加20%、30(%、40(%、50(%或60(%。至少一個第一轉(zhuǎn)染的所述載體的載體序列可與至少所述隨后的轉(zhuǎn)染(或多個)的第一個的載體的載體序列具有100 %或至少95 %、90 %、85 %或80 %序列同一性。最初轉(zhuǎn)染的載體可包括MAR元件，所述MAR元件可與至少所述隨后的轉(zhuǎn)染(或多個)的第一個的載體的MAR元件具有100%或至少95%、90%、85%或80%序列同一性。最初轉(zhuǎn)染的載體可包括轉(zhuǎn)基因，該轉(zhuǎn)基因可與至少所述隨后的轉(zhuǎn)染(或多個)的第一個的載體的轉(zhuǎn)基因具有 100%或至少95%、90%、85%或80%序列同一性。MAR元件可作為(b)中載體的部分以順式被提供。在某些實(shí)施方式中，至少兩個MAR元件位于轉(zhuǎn)基因側(cè)翼。MAR元件可位于所述轉(zhuǎn)基因的啟動子/增強(qiáng)子序列的上游。MAR序列可與SEQ ID NOs :1_3具有至少90%的序列同一性或是其變體。本發(fā)明還涉及重組真核生物，優(yōu)選哺乳動物的宿主細(xì)胞，包括(a)表達(dá)NHEJ抑制劑的轉(zhuǎn)基因序列，(b)表達(dá)一個或多個HR酶或HR激活劑的轉(zhuǎn)基因序列，(c)滅活或下調(diào)NHEJ基因的突變，和/或(d)增強(qiáng)HR酶、HR激活劑或NHEJ抑制劑的表達(dá)或活性的突變，其中重組真核宿主細(xì)胞具有的HR/NHEJ比比在不包括(a)和/或(b)所述的轉(zhuǎn)基因序列的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的比高超過2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30倍，和包括，任選地，基質(zhì)附著區(qū)(ΜΑ 元件。本發(fā)明還涉及重組真核生物，優(yōu)選哺乳動物的宿主細(xì)胞，包括(a)表達(dá)NHEJ抑制劑的轉(zhuǎn)基因序列，(b)表達(dá)一個或多個HR酶或HR激活劑的轉(zhuǎn)基因序列，(c)滅活或下調(diào)NHEJ基因的突變，和/或(d)增強(qiáng)HR酶、HR激活劑或NHEJ抑制劑的表達(dá)或活性的突變，
整合進(jìn)所述細(xì)胞基因組的轉(zhuǎn)基因，和任選地，MAR元件，其中所述MAR元件以順式或反式提供給所述轉(zhuǎn)基因。一個或多個 HR 酶可以是 Rad 51、Rad 52、RecA, Rad 54、RuvC 或 BRCA2 禾口 / 或 HR 激活劑可以是RS-I和/或NHEJ抑制劑可以是NU7(^6和/或渥曼青霉素。轉(zhuǎn)基因可功能地連接到可誘導(dǎo)表達(dá)的控制元件如誘導(dǎo)型啟動子，其中所述誘導(dǎo)型啟動子任選地是物理上活化的啟動子如熱休克啟動子或化學(xué)上活化的啟動子如IPTG或四環(huán)素活化的啟動子。(c)或(d)中的突變(或多個)可以是在xrcc4基因、RAD51鏈轉(zhuǎn)移酶基因、依賴 DNA的蛋白激酶基因、Rad 52基因、RecA基因、Rad M基因、RuvC基因和/或BRCA2基因中的突變(或多個)。轉(zhuǎn)基因可被整合進(jìn)細(xì)胞基因組的單一基因座并可形成串聯(lián)結(jié)構(gòu)。串聯(lián)結(jié)構(gòu)可包括轉(zhuǎn)基因的至少200、300、400、500或600個拷貝。本發(fā)明還涉及重組真核生物，優(yōu)選哺乳動物的宿主細(xì)胞，包括整合進(jìn)基因組單個基因座功能地連接到啟動子的轉(zhuǎn)基因的串聯(lián)結(jié)構(gòu)，其中串聯(lián)結(jié)構(gòu)包括轉(zhuǎn)基因的至少300、400、500或600個拷貝和至少一個MAR元件，其中所述MAR元件以順式或反式提供給所述轉(zhuǎn)基因，其中所述細(xì)胞優(yōu)選是已被同步的細(xì)胞群體的部分。至少一個MAR可以順式提供，對于所述轉(zhuǎn)基因中的每個，可將MAR提供給多數(shù)所述轉(zhuǎn)基因，和/或所述MAR元件中至少兩個可位于轉(zhuǎn)基因側(cè)翼。至少一個MAR元件可與SEQ ID NOs :1-3具有至少90%的序列同一性或可以是SEQ ID NOs 1_3的變體和/或可位于所述轉(zhuǎn)基因的啟動子/增強(qiáng)子序列的上游。細(xì)胞可以是CHO細(xì)胞、HEK 293細(xì)胞、干細(xì)胞或祖細(xì)胞。本發(fā)明還涉及本文提到的重組真核宿主細(xì)胞中任何一個的用途，特別是用于所述轉(zhuǎn)基因表達(dá)的用途。本發(fā)明還涉及試劑盒，其包括a.在第一容器中，任選地包括MAR元件和轉(zhuǎn)基因整合進(jìn)所述載體的限制位點(diǎn)的載體，b.在第二容器中，本文提到的重組真核宿主，和c.如何在轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞中使用所述載體用于轉(zhuǎn)基因表達(dá)的說明書。試劑盒還可含有同步化劑或關(guān)于如何使包括所述細(xì)胞(或多個)的細(xì)胞群體同步化的說明書。載體可用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞至少兩次，每次是當(dāng)所述細(xì)胞群體的多數(shù)細(xì)胞處于Gl期時。本發(fā)明還涉及非靈長類重組真核宿主細(xì)胞，其包括編碼跨過ER膜易位和/或跨過細(xì)胞質(zhì)膜分泌中涉及的至少一個靈長類蛋白質(zhì)或靈長類RNA——如信號識別顆粒(SRP)的蛋白質(zhì)或RNA或分泌復(fù)合體(易位子)的蛋白質(zhì)或其亞基——的轉(zhuǎn)基因序列。細(xì)胞可進(jìn)一步包括功能地連接到信號肽編碼序列的轉(zhuǎn)基因，其中所述轉(zhuǎn)基因可以以多個拷貝，優(yōu)選以串聯(lián)結(jié)構(gòu)的形式存在于細(xì)胞中。細(xì)胞可包括轉(zhuǎn)基因的至少200、300、 400,500或600個拷貝。由所述信號肽編碼序列編碼的信號肽可包括氨基酸的疏水段并可具有與SRPM相互作用的一個或多個序列。細(xì)胞還可包括外遺傳調(diào)節(jié)子元件，如MAR元件，其以順式或反式位于所述轉(zhuǎn)基因?？邕^ER膜易位和/或跨過細(xì)胞質(zhì)膜分泌中涉及的蛋白質(zhì)或 RNA 可以是 SRP，特別是 SRP9、SRP14、SRP19、SRP54、SRP68、SRP72 和 / 或 7SRNA 的蛋白質(zhì)或RNA。SRP的蛋白質(zhì)可以是人類SRP14，優(yōu)選與跨過ER膜易位和/或跨過細(xì)胞質(zhì)膜分泌中涉及的所述蛋白質(zhì)或RNA中的一個或多個其它的組合。所述蛋白質(zhì)中的一個或多個其它的蛋白質(zhì)可以是人類SR和/或人類易位子蛋白。SRP的蛋白質(zhì)可以是人類SRPM，優(yōu)選與跨過ER膜易位和/或跨過細(xì)胞質(zhì)膜分泌中涉及的所述蛋白質(zhì)或RNA中的一個或多個其它的蛋白質(zhì)或RNA組合。所述蛋白質(zhì)中的一個或多個其它的蛋白質(zhì)可以是人類SR和/或人類易位子蛋白。在跨過細(xì)胞質(zhì)膜分泌和/或易位中涉及的蛋白質(zhì)或RNA可以是易位子蛋白質(zhì)，特別是α β Y、Sec62, Sec63和/或其亞基中的一個。在跨過細(xì)胞質(zhì)膜分泌和/或易位中涉及的蛋白質(zhì)或RNA可以是SRP9、SR14和易位子蛋白的組合。轉(zhuǎn)基因可以是免疫球蛋白、其亞基或片段或融合蛋白。非靈長類細(xì)胞可以是嚙齒動物細(xì)胞，優(yōu)選CHO細(xì)胞。信號序列編碼序列可與SEQ ID NOs :4-11具有至少90%的序列同一性或可以是所述序列中任一個的變體。本發(fā)明還涉及非靈長類重組真核宿主細(xì)胞在轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物跨過細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜分泌和/或易位中的用途。本發(fā)明還涉及試劑盒，其包括(a)在一個容器中，非靈長類重組宿主細(xì)胞，其包括作為細(xì)胞基因組的部分，編碼跨過ER膜易位和/或跨過細(xì)胞質(zhì)膜分泌中涉及的至少一個蛋白質(zhì)或RNA——如信號識別顆粒(SRP)的蛋白質(zhì)或RNA或分泌復(fù)合體(易位子)的蛋白質(zhì)或其亞基——的轉(zhuǎn)基因序列，(b)在獨(dú)立的容器中，至少一個包括轉(zhuǎn)基因整合進(jìn)所述載體的限制位點(diǎn)和任選地 MAR元件的載體，和(c)利用所述細(xì)胞表達(dá)和分泌所述轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的說明書。本發(fā)明進(jìn)一步涉及轉(zhuǎn)基因的蛋白質(zhì)分泌的方法，包括提供非靈長類真核宿主細(xì)胞，該細(xì)胞包括(a)編碼在跨過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和/或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和/或細(xì)胞質(zhì)膜分泌和/或易位中涉及的至少一個靈長類蛋白質(zhì)或靈長類RNA——如信號識別顆粒(SRP)的蛋白質(zhì)或RNA或分泌復(fù)合體(易位子)的蛋白質(zhì)或其亞基——的轉(zhuǎn)基因序列，和(b)功能地連接到信號肽編碼序列的轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因序列可增加存在于所述細(xì)胞的在跨過細(xì)胞質(zhì)膜分泌和/或易位中涉及的蛋白質(zhì)或RNA的總量高于在包括/表達(dá)所述轉(zhuǎn)基因序列之前在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的水平超過 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100%。轉(zhuǎn)基因可作為整合進(jìn)細(xì)胞基因組的串聯(lián)結(jié)構(gòu)存在于細(xì)胞中，其中串聯(lián)結(jié)構(gòu)優(yōu)選包括轉(zhuǎn)基因的至少200、300、400、500或600個拷貝，并可在所述細(xì)胞基因組的單個基因座被整合。由信號肽編碼序列編碼的信號肽可包括氨基酸的疏水段并可具有與SRPM相互作用的序列。(b)中的轉(zhuǎn)染可以是隨后的轉(zhuǎn)染并可在用核酸如載體或核酸片段的最初轉(zhuǎn)染之后。
最初轉(zhuǎn)染的載體可對應(yīng)于(b)中的載體。轉(zhuǎn)基因序列可與選自SEQ ID NOs :4-11的序列具有至少90%的序列同一性或可以是所述序列中任一個的變體。本發(fā)明還涉及鑒定轉(zhuǎn)基因序列的蛋白質(zhì)分泌和/或易位增加活性的方法，包括監(jiān)測包括編碼重組蛋白的轉(zhuǎn)基因的第一哺乳動物細(xì)胞，其中所述重組蛋白由所述細(xì)胞以第一水平分泌，監(jiān)測包括編碼所述重組蛋白的所述轉(zhuǎn)基因的第二哺乳動物細(xì)胞，其中重組蛋白由所述細(xì)胞以第二水平分泌，其中所述第二水平超過所述第一水平，將編碼在跨過細(xì)胞質(zhì)膜分泌和/或易位中涉及的至少一個蛋白質(zhì)或RNA的轉(zhuǎn)基因序列導(dǎo)入到所述第一哺乳動物細(xì)胞，和測定在所述第一細(xì)胞中所述重組蛋白的分泌水平改變，其中超過第一水平的增加鑒定到所述轉(zhuǎn)基因序列的蛋白質(zhì)分泌增加活性。附圖簡述

圖1 (A)至(F) =MAR和連續(xù)轉(zhuǎn)染對基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)的作用的分析和通過含有MAR 的表達(dá)載體的雙轉(zhuǎn)染獲得的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的圖解。圖2(A)至(D)通過細(xì)胞分裂周期測定連續(xù)轉(zhuǎn)染和細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)展之間的最佳時機(jī)。圖3㈧至(E)連續(xù)轉(zhuǎn)染之后DNA轉(zhuǎn)運(yùn)、整合和表達(dá)以及平均GFP熒光和單克隆細(xì)胞群體中轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)之間的關(guān)系。圖4 (A)至(C)轉(zhuǎn)染的DNA的亞細(xì)胞分布和DNA構(gòu)象對基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)的影響。圖5㈧至(E)通過MARS的高轉(zhuǎn)基因表達(dá)、質(zhì)粒同源性和同源重組和通過用MAR 的重復(fù)轉(zhuǎn)染的提高的表達(dá)模式。圖6㈧至(C)通過高和低重組IgG生產(chǎn)CHO克隆表達(dá)的免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的鑒定。圖7 高和低IgG生產(chǎn)者的ER折疊和UPR結(jié)構(gòu)(machinery)的鑒定。圖8 (A)、⑶重組的產(chǎn)生IgG的CHO克隆的SRP14轉(zhuǎn)染消除輕鏈聚集和挽救IgG 分泌。圖9 表達(dá)SRP9、SRP14、SRP54, SR和易位子的多種組合的CHO細(xì)胞庫(pools)中 Mab產(chǎn)生的增加。圖10 顯示SGE位于側(cè)翼的目的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)盒的表達(dá)載體圖。多種優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)描述本發(fā)明上下文中使用的轉(zhuǎn)基因是分離和純化的脫氧核糖核苷酸(DNA)序列，其編碼給定的成熟蛋白質(zhì)(本文也被稱作編碼蛋白的DNA)或前體蛋白或功能RNA。根據(jù)本發(fā)明的一些優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因是編碼免疫球蛋白(Igs)和Fc-融合蛋白和其它蛋白，特別是具有治療活性的蛋白(“生物治療藥物”)的轉(zhuǎn)基因。如本文所用，術(shù)語轉(zhuǎn)基因在DNA編碼蛋白的上下文中將不包括未轉(zhuǎn)錄的側(cè)翼區(qū)如RNA轉(zhuǎn)錄起始信號、多聚腺苷酸化添加位點(diǎn)、啟動子或增強(qiáng)子。通常，當(dāng)提到通過轉(zhuǎn)染導(dǎo)入進(jìn)細(xì)胞如真核宿主細(xì)胞的DNA序列時，術(shù)語轉(zhuǎn)基因在本發(fā)明上下文中使用(在本發(fā)明的上下文中，該術(shù)語還包括通過病毒載體導(dǎo)入外源DNA的過程，其有時還被稱作轉(zhuǎn)導(dǎo))，其編碼目的產(chǎn)物——本文也稱作“轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物”或“異源蛋白質(zhì)”。轉(zhuǎn)基因可功能地連接到信號肽編碼序列，其編碼信號肽，信號肽反過來介導(dǎo)和 /或促進(jìn)跨過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和/或細(xì)胞質(zhì)膜易位和/或分泌并在分泌之前或期間被除去。另一方面，當(dāng)提到通過轉(zhuǎn)染導(dǎo)入進(jìn)細(xì)胞如真核宿主細(xì)胞的DNA序列時，使用術(shù)語“轉(zhuǎn)基因序列”，其增加目的產(chǎn)物的表達(dá)和/或分泌。轉(zhuǎn)基因序列常常編碼蛋白質(zhì)或RNA序列。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因序列是，例如，特異地增強(qiáng)HR(同源重組)或降低非同源末端連接(NHEJ)的那些轉(zhuǎn)基因序列。下面更詳細(xì)地討論各自的蛋白質(zhì)。其它“轉(zhuǎn)基因序列”是編碼在加工、跨過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和 /或細(xì)胞質(zhì)膜分泌和/或易位中涉及的蛋白質(zhì)(或多個)或RNA(或多個)那些轉(zhuǎn)基因序列。“轉(zhuǎn)基因序列”可包括非翻譯控制序列。相對于從不包括各自的轉(zhuǎn)基因序列的對照細(xì)胞獲得的值來測量表達(dá)和/或分泌的增強(qiáng)。相對于對照值的任何統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的增加都稱作促進(jìn)。HR/NHEJ比(或HR/NHEJ活性比)是在細(xì)胞如真核細(xì)胞，例如，重組的真核宿主細(xì)胞中存在的HR(同源重組)與NHEJ(非同源末端連接)活性之比。HR/NHEJ比通常在細(xì)胞群體一即，一組，例如，同樣類型的真核細(xì)胞，例如，CHO細(xì)胞克隆——中測量。當(dāng)本文提到，例如，優(yōu)化或增強(qiáng)(增加)，例如，細(xì)胞的HR/NHEJ比時，應(yīng)當(dāng)理解在各自的細(xì)胞群體中發(fā)生的這種優(yōu)化或增強(qiáng)的事實(shí)。任何這種優(yōu)化或增強(qiáng)的參考點(diǎn)是在相應(yīng)的細(xì)胞群體中存在的比，在該細(xì)胞群體中沒有進(jìn)行測量來增強(qiáng)或優(yōu)化HR/NHEJ比。這是，例如，所述細(xì)胞的親本細(xì)胞群體，即，獲得增強(qiáng)或優(yōu)化的細(xì)胞的細(xì)胞群體。HR/NHEJ比(或HR/NHEJ活性比)可被增加以超過參照細(xì)胞群體的HR/NHEJ比大于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15倍，本文中參照細(xì)胞群體可被稱作，例如，“不包括所述轉(zhuǎn)基因序列和/或未被突變的細(xì)胞”。優(yōu)化和增強(qiáng)測量包括處理，其中細(xì)胞被通?！疤幚怼?，不被遺傳上地改變。這種處理包括同步化細(xì)胞群體的簡單測量以便，例如，群體的多數(shù)細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時處于Gl期。已知不同的方法實(shí)現(xiàn)這種同步，包括但不限于，化學(xué)劑(同步化學(xué)品)的使用和低溫。Golzio等Q002)描述了通過使細(xì)胞經(jīng)受用丁酸鈉處理的細(xì)胞同步。Grosjean等000 描述了在施用含羞草氨酸作為同步化學(xué)品之后，多數(shù)細(xì)胞停滯在Gl和S期的邊界。Bjursell等(1973)描述了利用胸苷同步CHO細(xì)胞。HR已被報道需要一組RAD51相關(guān)蛋白質(zhì)(West 2003)。因此，可通過將補(bǔ)充的HR 蛋白(HR酶)提供給細(xì)胞而增強(qiáng)HR，其包括，例如，Rad 51、Rad 52、RecA, Rad54、RuvC或 BRCA2。還可以利用HR激活劑。那些包括，但不限于，RS-I (RD51-刺激化合物)。RS-I通過促進(jìn)活性突觸前絲的形成而增強(qiáng)hRAD51的同源重組活性(Jayathilaka et al. 2008)。 NHEJ已被報道在哺乳動物細(xì)胞中包括兩個蛋白質(zhì)復(fù)合體，與DNA-PKcs相關(guān)的異二聚體 Ku80-Ku70和具有輔因子XRCC4的連接酶IV (Delacdte et al.，2002)。NHEJ的抑制劑——其還可在本發(fā)明的上下文中使用——包括NU7(^6 (2-(嗎啉-4-基)-苯并(h) chomen-4-酮)， 一種DNA-PK抑制劑。利用化學(xué)品NU7(^6的NHEJ功能的抑制可促進(jìn)DNA末端進(jìn)入未受損的同源重組修復(fù)途徑(Yang et al. 2009)。另一個NHEJ抑制劑是渥曼青霉素，一種pllOPI 3 激酶的PI3k抑制劑，其還抑制依賴DNA的蛋白激酶——已知其介導(dǎo)DNA雙鏈修復(fù)(Boulton et al. ，1996)。通過過量表達(dá)那些HR酶、HR激活劑和/或NHEJ抑制劑或通過HR活化或NHEJ抑制物理或化學(xué)處理可提高細(xì)胞的HR/NHEJ比。實(shí)現(xiàn)這種過量表達(dá)的一個方法是通過將編碼這種酶等的“轉(zhuǎn)基因序列”導(dǎo)入各自的細(xì)胞。這種序列被稱作“轉(zhuǎn)基因序列”以表示它不是相應(yīng)的未修飾細(xì)胞的部分。轉(zhuǎn)基因序列常常被整合進(jìn)細(xì)胞的基因組。以上描述的蛋白質(zhì)，如HR酶、激活劑和/或NHEJ抑制劑可在修飾的細(xì)胞中誘導(dǎo)地或組成地表達(dá)。技術(shù)人員可容易地確定允許誘導(dǎo)或組成性表達(dá)的適當(dāng)載體的構(gòu)建。同樣地，細(xì)胞已通過突變被修飾以增加HR和/或降低NHEJ和/或提高細(xì)胞的HR/ NHEJ比。幾個出版物將NHEJ途徑、負(fù)責(zé)細(xì)胞中多核苷酸隨機(jī)整合的途徑的抑制描述為增加HR/NHEJ比的方法(參見例如Krappmann et al.，2006)。可被滅活以阻斷NHEJ的基因和/或蛋白質(zhì)包括Ku80、Ku70、連接酶IV或XRCC4(還參見本文對V3. 3突變體的引用)并可在本發(fā)明的上下文中導(dǎo)致HR/NHEJ比的非常顯著的增加和轉(zhuǎn)基因表達(dá)的提高，如達(dá)轉(zhuǎn)基因表達(dá)平均值之上的5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50或甚至達(dá)60倍增加。同樣地，某些突變可增加HR，例如，通過提高細(xì)胞的某些內(nèi)源性HR酶或激活劑的表達(dá)。HR/NHEJ峰(或HR/NHEJ活性峰)是真核細(xì)胞細(xì)胞群體的細(xì)胞周期過程中的時期， 在該時期HR/NHEJ比升高并是峰。在本發(fā)明的上下文中，如果提到細(xì)胞的HR/NHEJ峰，應(yīng)當(dāng)理解為提到相同種類的細(xì)胞群體——例如，由轉(zhuǎn)基因序列修飾以表達(dá)HR酶的細(xì)胞群體—— 的細(xì)胞?！癏R/NHEJ峰”包括繪制時間對代表HR/NHEJ或僅僅HR的值的圖中最高HR/NHEJ升高(峰的尖端，峰尖端)周圍的時間間隔。用于轉(zhuǎn)染的優(yōu)選時間間隔是在HR/NHEJ峰之前 (例如在細(xì)胞周期的Gl期)，以便隨著峰尖端周圍的時間(峰尖端，例如S期晚期和G2期) DNA到達(dá)細(xì)胞核，峰尖端由時間點(diǎn)確定，在該時間點(diǎn)已達(dá)到來自值的HR/NHEJ(或僅僅HR)的 50%上升或更多，線在該值朝著峰的尖端開始上升(“最低值(bottom value)")到峰的尖端。峰開始存在，例如，當(dāng)細(xì)胞群體中最低數(shù)量的細(xì)胞處于Gl或S期早期——當(dāng)已知HR活性低的期，和/或當(dāng)多數(shù)細(xì)胞處于S期或處于G2期時，當(dāng)已知HR活性是最高時。當(dāng)細(xì)胞群體中的多數(shù)細(xì)胞處于Gl期時的時間點(diǎn)也顯示在圖2(B)所示的圖中。這里顯示與每個細(xì)胞周期狀態(tài)(Gl、S、G2/M)相關(guān)的群體百分比。如從該圖可以看出，超過 80 %、超過85 %、超過90 %或甚至超過95 %的描述的群體細(xì)胞被鑒定為處于Gl、S期或G2/ M期。在發(fā)現(xiàn)的處于這些期之一的細(xì)胞中，在該實(shí)例中發(fā)現(xiàn)21小時之后，多數(shù)處于Gl期。 與S或G2/M期細(xì)胞的百分率相比，Gl期細(xì)胞的百分率因此是最高的。功能RNA包括在細(xì)胞中產(chǎn)生直接或間接作用的任何類型的RNA，其區(qū)別于被翻譯成蛋白質(zhì)。典型的實(shí)例是反義RNAs或小干擾RNAs (si RNAs)。真核宿主細(xì)胞是“容納(host)”或被設(shè)計(jì)以“容納”根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞。 重組真核宿主細(xì)胞在遺傳上被修飾，即含有另外的序列，該序列或作為基因組的部分或作為染色體外元件如載體的部分，通常來提高轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)或分泌。多連體或串聯(lián)結(jié)構(gòu)是長的連續(xù)的DNA序列段或含有多重拷貝的串聯(lián)連接的相同單體DNA序列的分子。在本發(fā)明的上下文中，單體DNA序列是或常常包括轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因——其可包括，例如，啟動子和增強(qiáng)子序列——的串聯(lián)結(jié)構(gòu)通常整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組。該整合可發(fā)生在宿主染色體的多個位置(基因座)(整合位點(diǎn))或單個基因座。單個串聯(lián)結(jié)構(gòu)可包括超過200、300、400、500、600、700或超過800個包括所述轉(zhuǎn)基因的單體DNA 序列。優(yōu)先地觀察到單體DNA序列的頭對尾排列。所述的以多重拷貝存在于細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因可具有串聯(lián)結(jié)構(gòu)。根據(jù)本發(fā)明的MAR元件、MAR構(gòu)建物、MAR序列、S/MAR或僅僅MAR是核苷酸序列，其與天然存在的“SAR”或“MAR”共享一個或多個(如兩個、三個或四個)特性并具有至少一個促進(jìn)由所述MAR影響的任何基因的蛋白表達(dá)的性質(zhì)。MAR元件還具有成為具有MAR活性，特別是具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，優(yōu)選增加活性，但還具有，例如表達(dá)穩(wěn)定活性和/或還在“提高的 MAR構(gòu)建物”下描述的其它活性的分離和/或純化的核酸的特征。MAR元件屬于較寬的組的外遺傳調(diào)節(jié)子元件，該元件還包括邊界或絕緣子元件、基因座控制區(qū)(LCRs)、穩(wěn)定和抗阻抑物(STAR)元件、無所不在地作用染色質(zhì)開放(UCOE)元件。MAR元件可基于它們主要基于的經(jīng)鑒定的MAR而被限定因此，MAR S4構(gòu)建物是多數(shù)核苷酸(50%以上)基于MAR S4的MAR 元件。常常在SARs和/或MARs內(nèi)已發(fā)現(xiàn)A和T含量高的幾個簡單序列模體，但是對于大部分，還未解決它們的功能重要性和潛在的作用方式。這些包括A盒、T盒、DNA解旋模體、 SATBl結(jié)合部位(H盒，A/T/C25)和針對脊椎動物或果蠅屬的共有序列拓?fù)洚悩?gòu)酶II位點(diǎn)。如通常在MAR元件中發(fā)現(xiàn)的富含AT/TA 二核苷酸的彎曲DNA區(qū)(以下稱作“富含 AT區(qū)”)是包括大量A和T特別是以二核苷酸AT和TA形式的彎曲DNA區(qū)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，它在100個連續(xù)堿基對的一段序列上含有至少10%二核苷酸TA和/或至少12%二核苷酸AT，優(yōu)選在100個連續(xù)堿基對的一段序列上(或當(dāng)富含AT區(qū)具有較短的長度時在各自較短的一段序列上)含有至少33%二核苷酸TA和/或至少33%二核苷酸AT，而具有彎曲的二級結(jié)構(gòu)。然而，“富含AT區(qū)”可以是短如約30個核苷酸或更少，但優(yōu)選是約50個核苷酸、約75個核苷酸、約100個核苷酸、約150、約200、約250、約300、約350或約400個核苷酸長或更長。一些結(jié)合部位還常常具有相對高的A和T含量，如SATBl結(jié)合部位(H盒，A/T/C25) 和針對脊椎動物(RNYNNCNNGYNGKTNYNY)或果蠅屬(GTNWAYATTNATNNR)的共有序列拓?fù)洚悩?gòu)酶II位點(diǎn)。然而，通過比較區(qū)的彎曲模式，結(jié)合部位區(qū)(模塊)，特別是包括一群結(jié)合部位的TFBS區(qū)，可容易地與來自A和T含量高的MAR元件的富含AT和TA 二核苷酸區(qū)(“富含AT區(qū)”)區(qū)分。例如，對于人類MAR 1_68，后者可具有超過約3. 8或約4.0的平均曲率度，而TFBS區(qū)可具有低于約3. 5或約3. 3的平均曲率度。識別的MAR區(qū)還可被可選的方法確定，如但不限于，如本文別處所描述的相對解鏈溫度。然而，這樣的值是種特異的并因此可在種與種之間變化，并可以，例如，較低。因此，各自富含AT和TA 二核苷酸區(qū)可具有較低曲率度如從約3. 2至約3. 4或從約3. 4至約3. 6或從約3. 6至約3. 8，TFBS區(qū)可具有按比例較低的曲率度，這樣的低于約2. 7、低于約2. 9、低于約3. 1、低于約3. 3。在SMAR Scan II 中，各自的較低的窗口大小將由熟練的技術(shù)人員選擇。術(shù)語MAR元件、MAR構(gòu)建物、MAR序列、S/MAR或僅僅MAR還包括提高的MAR構(gòu)建物，提高的MAR構(gòu)建物具有構(gòu)成超過天然存在和/或識別的MAR的增加的性質(zhì)，根據(jù)本發(fā)明的MAR構(gòu)建物可基于天然存在和/或識別的MAR。這種性質(zhì)包括，但不限于，相對于天然存在和/或識別的MAR的全長的減少的長度、基因表達(dá)/轉(zhuǎn)錄增加、表達(dá)的穩(wěn)定性、組織特異性、誘導(dǎo)性增強(qiáng)或其組合。因此，被提高的MAR元件可，例如，包括小于約90%，優(yōu)選小于約 80%，甚至更優(yōu)選小于約70%，小于約60%，或小于約50%的識別的MAR序列的核苷酸數(shù)。 MAR元件可提高用所述構(gòu)建物轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞之后轉(zhuǎn)基因的基因表達(dá)和/或轉(zhuǎn)錄。MAR元件優(yōu)選插入到啟動子區(qū)的上游，目的基因可操作地連接或可以可操作地連接到啟動子區(qū)。然而，在某些實(shí)施方式中，MAR元件位于目的基因/核苷酸序列的上游以及下游或只是下游是有利的。其它的多個順式和/或反式MAR排列也處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明還涉及與一個或多個非MAR外遺傳調(diào)節(jié)子如，但不限于，組蛋白改性物如組蛋白脫乙酰酶(HDAC)，其它DNA元件(外遺傳調(diào)節(jié)子元件)如基因座控制區(qū)(LCRs)、絕緣子如cHS4或抗阻抑物元件(例如，穩(wěn)定劑和抗阻抑物元件(STAR或UCOE元件)或熱點(diǎn) (Kwaks THJ和Otte AP)聯(lián)合的MAR元件的用途。當(dāng)在MAR/MAR元件的上下文中使用時，合成物指MAR，該MAR的設(shè)計(jì)不只是包括識別的MARs或基于此的MARs的序列/區(qū)或部分區(qū)的簡單改組、復(fù)制和/或缺失。特別地，合成的MARs/MAR元件通常包括一個或多個，優(yōu)選一個識別的MAR的區(qū)，然而，在某些實(shí)施方式中其可以是合成的或修飾的，以及特異地設(shè)計(jì)的、良好表征的元件，如單個或一系列TFB^， 其在優(yōu)選實(shí)施方式中被合成地產(chǎn)生。這些設(shè)計(jì)者元件在許多實(shí)施方式中是相對短的，特別地，它們通常不超過約300bps長，優(yōu)選不超過約100、約50、約40、約30、約20或約IObps 長。在某些實(shí)施方式中，這些元件可被多聚化。這種合成的MAR元件也是本發(fā)明的一部分并且應(yīng)當(dāng)理解，通常本說明書可被理解為所述適用于“MAR元件”的任何事物同樣地適用于合成的MAR元件。識別的MAR元件的核苷酸序列的功能片段也包括在以上限定中，只要它們保持如上面所述的MAR元件的功能。一些優(yōu)選識別的MAR元件包括，但不限于MAR 1_68、MARX_29、MAR 1_6、MAR S4、 MAR S46，其包括如W02005040377和美國專利申請20070178469中所公開的所有它們的變換，由于公開這些和其它MAR元件的序列，它們也通過引用被具體地并入本申請。雞溶菌酶 MAR也是優(yōu)選的實(shí)施方式(參見，US專利號7，129，062，由于其公開MAR元件，其也被具體地并入本文)。順式指在同一核酸分子如，但不限于，同一載體或染色體上的兩個或多個元件 (如染色質(zhì)元件)的放置。反式指在兩個或多個核酸分子如，但不限于，兩個或多個載體或染色體上的兩個或多個元件(如染色質(zhì)元件)的放置。當(dāng)序列發(fā)揮它的來自順式/反式位置的活性時，可以說序列在，例如，基因上以順式和/或反式作用。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因序列常常是載體的一部分。根據(jù)本發(fā)明的載體是能轉(zhuǎn)運(yùn)另一個核酸——如將由該載體表達(dá)的轉(zhuǎn)基因——的核酸分子，該轉(zhuǎn)基因已被連接到該載體上，通常它已被整合進(jìn)該載體。例如，質(zhì)粒是一種類型的載體，反轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒是另一種類型的載體。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，載體在轉(zhuǎn)染之前被線性化。載體的載體序列是載體的DNA或RNA序列，排除任何“其它”核酸如轉(zhuǎn)基因以及遺傳元件如MAR元件。當(dāng)本說明書提到“質(zhì)粒”或“載體”同源性時，該術(shù)語指包括MARs和基因的整個質(zhì)粒或載體的同源性(本文使用的與序列同一性同義)。根據(jù)本發(fā)明，包括哺乳動物細(xì)胞，如重組的真核宿主細(xì)胞的真核生物，能在細(xì)胞培養(yǎng)條件下被維持。這種類型細(xì)胞的非限制的例子是非靈長類真核宿主細(xì)胞如中國倉鼠卵巢 (CHOs)細(xì)胞和幼地鼠腎細(xì)胞(BHK，ATCC CCL 10)。靈長類真核宿主細(xì)胞包括，例如，人類宮頸癌細(xì)胞(HELA,ATCC CCL 2)和用 SV40 轉(zhuǎn)化的猴腎 CVl 系(C0S_7，ATCC CRL-1587)。重組的真核宿主細(xì)胞表示已被修飾，例如，通過用轉(zhuǎn)基因序列轉(zhuǎn)染和/或通過突變的細(xì)胞。真核宿主細(xì)胞能進(jìn)行由所述細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄后修飾。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，真核(例如，非靈長類)宿主細(xì)胞的細(xì)胞負(fù)體具有完全的功能，即，未被，例如，突變滅活。除了它的細(xì)胞負(fù)體(例如，非靈長類)，轉(zhuǎn)基因序列(例如，靈長類)被表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)染是將核酸導(dǎo)入容易接受的真核細(xì)胞，如但不限于，通過電穿孔、 脂轉(zhuǎn)染，通過病毒載體(有時被稱作“轉(zhuǎn)導(dǎo)”)或通過化學(xué)方法，其包括包含聚陽離子脂質(zhì)的那些化學(xué)方法。如本文所用，轉(zhuǎn)化指通過加入核酸而修飾真核細(xì)胞。例如，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞包括已用轉(zhuǎn)基因序列轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，例如，通過包括該序列的載體的電穿孔。然而，在本發(fā)明的許多實(shí)施方式中，將本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因序列導(dǎo)入細(xì)胞的方法不限于任何特定方法。單一轉(zhuǎn)染指描述的轉(zhuǎn)染只進(jìn)行一次。轉(zhuǎn)錄指從DNA模板合成RNA?！坝修D(zhuǎn)錄活性的”指正被轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)基因。同一性指如由兩條這樣的序列——如完全和全部序列——之間匹配的同一性所確定的兩個核苷酸序列之間的序列關(guān)聯(lián)性程度。同一性可被容易地計(jì)算。雖然存在許多測量兩個核苷酸序列之間同一性的方法，術(shù)語“同一性”對熟練的技術(shù)人員是熟知的(Computational Molecular Biology, Lesk，Α. Μ.，ed.，Oxford University Press， New York，1988 ；Biocomputing :Informatics and Genome Projects，Smith，D. W.，ed.， Academic Press，New York, 1993 ；Computer Analysis of Sequence Data，Part I， Griffin，A. M.，and Griffin，H. G.，eds.，Humana Press，New Jersey,1994 ；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje， G. ， Academic Press，1987 ；禾口 Sequence Analysis Primer，Gribskov，M. and Devereux, J.，eds.，M Stockton Press，New York， 1991)。通常利用的測定兩個序列之間同一性的方法包括，但不限于Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed. , Academic Press,San Diego,1994,禾口 Carillo, H. , and Lipman, D.，SIAM J Applied Math. 48 :1073 (1988)中公開的那些方法。測定同一性的優(yōu)選方法被設(shè)計(jì)成給出被檢測的兩個序列之間的最大匹配。將這樣的方法整理在計(jì)算機(jī)程序中。優(yōu)選的測定兩個序列之間同一性的計(jì)算機(jī)程序方法包括，但不限于，GCG (遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組(Genetics Computer Group) ,Madison Wis.)禾呈序包(Devereux, J.，et al.，Nucleic Acids Researchl2(l). 387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA (Altschul et al. (1990)； Altschul et al. (1997))。眾所周知的Smith Waterman算法也可用于測定同一性。作為例證，包括與參考核苷酸序列具有至少，例如，95% “同一性”的核苷酸序列的核酸指核酸的核苷酸序列與參考序列相同，除了該核苷酸序列可包括參考核苷酸序列的每100個核苷酸達(dá)五個點(diǎn)突變。換言之，為了獲得具有與參考核苷酸序列至少95%相同的核苷酸序列的核苷酸，參考序列中達(dá)5%的核苷酸可缺失或由其它核苷酸置換，或參考序列中全部核苷酸的達(dá)5%的核苷酸可被摻入到參考序列。參考序列的這些突變可發(fā)生在參考核苷酸序列的5’或3’末端位置或那些末端位置之間的任何地方，其單獨(dú)地分散在參考序列或參考序列內(nèi)一個或多個連續(xù)的組的核苷酸中。約60 %、約70 %、約75 %、約85 %或約 90 %的序列同一性也處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。與另一個核酸序列具有大量同一性的核酸序列指在它的序列中具有點(diǎn)突變、缺失或添加的序列，該點(diǎn)突變、缺失或添加對描述的各自的方法沒有影響或具有最低的影響，并且該核酸序列常常表現(xiàn)為IOObp中一、ニ、三或四個突變。本發(fā)明涉及多核苷酸和多肽變體?！白凅w”指與本發(fā)明多核苷酸或多肽不同但保留其基本性質(zhì)的多核苷酸或多肽。通常，變體與本發(fā)明的多核苷酸或多肽總體上非常相似并在許多區(qū)中相同。變體在編碼區(qū)、非編碼區(qū)、或這兩個區(qū)可含有改變。尤其優(yōu)選的是含有改變的多核苷酸變體，這些改變產(chǎn)生沉默置換、添加或缺失，但不改變編碼的多肽的性質(zhì)或活性。由于遺傳密碼的簡并性，由沉默置換產(chǎn)生的核苷酸變體是優(yōu)選的。而且，其中5-10、1-5或1-2 個氨基酸以任何組合被置換、缺失或添加的變體也是優(yōu)選的。本發(fā)明還包括所述多核苷酸的等位基因變體。等位基因變體表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的兩個或多個可選形式中的任何ー個。等位基因變異通過突變而自然地發(fā)生，并可導(dǎo)致群體內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中沒有變化)或可編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因變體是基因的等位基因變體編碼的多月TU啟動子序列或僅僅啟動子是被宿主細(xì)胞識別用于特定核酸序列表達(dá)的核酸序列。 啟動子序列含有調(diào)節(jié)多核苷酸表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列。啟動子可以是在選擇的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核酸序列，包括突變的、截短的和雜交的啟動子，并可從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因而獲得。如果特異的核酸序列在所述啟動子上運(yùn)用它的功能，那么啟動子被“功能地連接”到特異的核酸序列。增強(qiáng)子是DNA的順式作用元件，通常約10至約300個核苷酸長，其作用到啟動子上以增加它的轉(zhuǎn)錄。可利用來自珠蛋白、弾性蛋白酶、白蛋白、α-甲胎蛋白的增強(qiáng)子和胰島素增強(qiáng)子。然而，可利用來自病毒的增強(qiáng)子；例子包括復(fù)制起點(diǎn)近側(cè)上的SV40，巨細(xì)胞病毒早期啟動子增強(qiáng)子，復(fù)制起點(diǎn)近側(cè)上的多瘤增強(qiáng)子和腺病毒增強(qiáng)子。如本文所用指數(shù)地不是確切的數(shù)學(xué)術(shù)語，但描述細(xì)胞的生物學(xué)生長曲線，其中這樣的生長的圖不是作為直線，而是向上指和，超過一定時期，連續(xù)地變得更陡的曲線。無論如何，它意味著不只是添加，例如増加。如在本發(fā)明的上下文中所用的表達(dá)的變異性指一個轉(zhuǎn)化的細(xì)胞對另ー個相同種類轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的表達(dá)的變異性。該變異性是區(qū)分轉(zhuǎn)基因拷貝和/或轉(zhuǎn)基因整合位點(diǎn)的結(jié)果。同樣，在相同基因座的轉(zhuǎn)基因多重拷貝的共整合可導(dǎo)致沉默并因此有助于變異性。而且，術(shù)語包括和其衍生不排除其它元件或步驟。而且，不定冠詞“ー (a) ”和其衍生不排除多數(shù)。權(quán)利要求中提到的特征中的幾個的功能可通過整體實(shí)現(xiàn)。與特性或值連接的術(shù)語基本上、約、大約和類似的術(shù)語特別地還準(zhǔn)確地限定該特性或準(zhǔn)確地限定該值。同源重組(HR)、非同源末端連接(NHEJ)和轉(zhuǎn)基因表達(dá)變異性的降低獨(dú)立的轉(zhuǎn)化體中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的變異性受穩(wěn)定地整合進(jìn)細(xì)胞基因組的許多基因的影響和受整合位點(diǎn)的影響。雖然研究MARs，特別是雖然確定為什么MARs產(chǎn)生較高的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，但是進(jìn)行了ー些觀察，其導(dǎo)致較寬的、不依賴MAR的發(fā)現(xiàn)首先，通過定量PCR可證明MAR元件増加整合進(jìn)轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)。這些結(jié)果證實(shí)了先前的半定量的觀察結(jié)果(Kim et al. ,2004 ；Girod et al.，2005)。此外，穩(wěn)定的細(xì)胞庫中的中期染色體的熒光原位雜交分析顯示在用MARs轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中較高的熒光強(qiáng)度，因此證實(shí)轉(zhuǎn)基因整合的増加。
進(jìn)ー步的研究導(dǎo)致這樣的發(fā)現(xiàn)，用轉(zhuǎn)基因和各自的MAR的単一轉(zhuǎn)染之后，MAR對轉(zhuǎn)染之后轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核的質(zhì)粒的量沒有發(fā)揮顯著的作用?？赡艿慕忉屖沁B環(huán)化和/或整合解釋整合進(jìn)細(xì)胞基因組的高拷貝數(shù)。最初想法是MARs可作為DNA重組信號發(fā)揮作用。由于它們的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，如它們的解旋和不配對潛能，存在它們可增加轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒之間同源重組的頻率的可能性，因此允許較大的多聯(lián)體的形成和高質(zhì)?？截悢?shù)的整合。其次，研究現(xiàn)象，在某些情況下，用轉(zhuǎn)基因，接下來是MAR的兩個連續(xù)的轉(zhuǎn)染(單個最初轉(zhuǎn)染和隨后的轉(zhuǎn)染)允許轉(zhuǎn)基因表達(dá)超過累加的増加而不是提供僅僅累加，例如，兩倍増加，其是人們將從，例如，兩個獨(dú)立的轉(zhuǎn)染期望的。通過定量PCR顯示，與連續(xù)的MAR轉(zhuǎn)染相關(guān)的高轉(zhuǎn)基因表達(dá)基于與一個單個事件相比，多個轉(zhuǎn)染事件之后整合的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的相似的高的増加。雖然存在進(jìn)入細(xì)胞核的質(zhì)粒數(shù)的増加，但是進(jìn)一歩研究是否連續(xù)的MAR轉(zhuǎn)染中整合的高轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)可，至少部分，是由于連續(xù)轉(zhuǎn)染期間導(dǎo)入細(xì)胞的同源質(zhì)粒之間的較好的連環(huán)化。包括同源重組的過程被懷疑并通過研究質(zhì)粒同源性的作用而被檢測。特別地， 用轉(zhuǎn)基因、質(zhì)粒骨架和/或MARs的不同組合進(jìn)行雙重轉(zhuǎn)染(double transfection) 0 FACS 分析顯示，高質(zhì)粒同源性(載體序列同源性和轉(zhuǎn)基因以及MAR同源性)通常是整合的較高效率和轉(zhuǎn)基因表達(dá)所需要的。改變表達(dá)基因和載體序列或MARs降低整合的效率和轉(zhuǎn)基因表達(dá)。事實(shí)上，當(dāng)所有的序列不相同時，觀察到的雙重轉(zhuǎn)染的作用被完全消除。此外，連續(xù)轉(zhuǎn)染之間的時機(jī)顯示對獲得最佳的蛋白表達(dá)是非常重要的。假設(shè)，在第 ニ轉(zhuǎn)染吋，細(xì)胞應(yīng)處于有利于較高重組率的細(xì)胞周期狀態(tài)，導(dǎo)致形成較大的多聯(lián)體和更多的質(zhì)粒整合進(jìn)宿主基因組。如上面所討論的，轉(zhuǎn)基因的連環(huán)化可由存在于真核細(xì)胞的兩個主要機(jī)制產(chǎn)生，ー個是HR，另ー個是NHEJ。因此，檢測ー個或另ー個對雙重轉(zhuǎn)染的影響。對此，利用在非同源末端連接或同源重組中缺失的不同的CHO突變體。發(fā)現(xiàn)NHEJ途徑對抗有效的轉(zhuǎn)基因整合和表達(dá)，而同源重組途徑和轉(zhuǎn)染的載體上的同源DNA序列支持高水平表達(dá)。當(dāng)使用単獨(dú)依賴同源重組的突變的CHO細(xì)胞吋，與非突變的細(xì)胞相比，含有MAR的載體的轉(zhuǎn)染產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平非常高的増加。同樣，F(xiàn)ISH分析沒有顯示在特定時間間隔—— 這里是21小時——伴隨連續(xù)轉(zhuǎn)染的任何多個整合事件，表明所有的轉(zhuǎn)基因在ー個染色體基因座整合。因此，非同源末端連接或同源重組中缺失的宿主細(xì)胞對MAR影響的轉(zhuǎn)基因的整合的作用導(dǎo)致與MARs無關(guān)的較寬的概念，即HR支持轉(zhuǎn)基因整合而NHEJ不支持轉(zhuǎn)基因整合。 因此，我們設(shè)計(jì)方法和構(gòu)建物，其利用該發(fā)現(xiàn)以增加轉(zhuǎn)基因整合和因此增加轉(zhuǎn)基因表達(dá)。該方法包括在整合時用處理——如化學(xué)或溫度處理或允許細(xì)胞群體同步的其它處理——增加HR、降低NHEJ和/或増加HR/NHEJ比的方法。上面在HR/NHEJ比的討論中描述了其它的處理和修飾。構(gòu)建物主要是細(xì)胞，其具有合適的組成以允許HR増加、NHEJ降低和/或HR/ NHEJ比增加。在宿主細(xì)胞中NHEJ降低和/或HR或HR/NHEJ比增加在可包括或可不包括MAR的連續(xù)轉(zhuǎn)染的背景下也具有特別有利的作用。然而，雖然不依賴MAR的過程在轉(zhuǎn)基因整合和表達(dá)方面提供相當(dāng)大的進(jìn)展，但是 MARs和其它外遺傳調(diào)節(jié)子仍然提供另外有利的性質(zhì)，該有利的性質(zhì)部分可通過有利地影響同源重組以及通過其它機(jī)制而被解釋，這些機(jī)制中的一些先前已討論了(參見，例如，美國專利申請 US 2007/0178469)。MAR元件已被描述具有通過保護(hù)轉(zhuǎn)基因抵御沉默效應(yīng)而減少表達(dá)低蛋白質(zhì)水平的群體而改善轉(zhuǎn)基因表達(dá)的能力，這可能由在非允許的異染色質(zhì)基因座中的整合產(chǎn)生(Bell and Felsenberg,1999) 0在存在MAR的情況下觀察到的抗沉默效應(yīng)可由染色質(zhì)修飾如在轉(zhuǎn)基因整合位點(diǎn)的組蛋白高度乙?；閷?dǎo)(Recillas-Targa et al. ,2002 ；Yasuiet al.， 2002)或亞核定位的改變介導(dǎo)。另外，MARs可招募調(diào)節(jié)蛋白，其修飾染色質(zhì)以接受轉(zhuǎn)錄上更允許的狀態(tài)，或它們可招募活化基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子(Yasui et al. ,2002 ；Hart and Laemmli，1998)?？蛇x地，但不是排他地，MAR可招募蛋白質(zhì)以朝著更允許整合事件的開放狀態(tài)而改造染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。同樣轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄可通過MAR進(jìn)行的轉(zhuǎn)基因啟動子或增強(qiáng)子的活化而被提高。MAR還可支持染色體內(nèi)允許基因座中的整合。最后，它們可通過與HR不相關(guān)的機(jī)制増加在宿主基因組中整合的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)。在該上下文中，應(yīng)注意較高的拷貝數(shù)總是支持較強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的理解不是必然有效的，因?yàn)檎线M(jìn)宿主基因組的多重拷貝的存在支持沉默，其由重復(fù)的元件在異染色質(zhì)中向配對和聚集的傾向引起。可選地，重復(fù)基因的表達(dá)可導(dǎo)致形成雙鏈和/或小干擾RNAs， 這反過來可導(dǎo)致外遺傳沉默。然而，在本發(fā)明的上下文中，應(yīng)顯示轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)和細(xì)胞熒光水平被顯示在存在MAR時非常相關(guān)聯(lián)。因此，轉(zhuǎn)基因表達(dá)的增加可能不僅由更多的轉(zhuǎn)基因拷貝在細(xì)胞基因組中的整合引起，還將得到MAR介導(dǎo)的外遺傳沉默事件的抑制的支持，該外遺傳沉默事件與串聯(lián)基因拷貝的整合相關(guān)。如上所述，尤其是在連續(xù)轉(zhuǎn)染的上下文中，在進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)基因整合/表達(dá)的増加可通過定量在細(xì)胞核中轉(zhuǎn)運(yùn)的轉(zhuǎn)基因的量而被部分解釋。實(shí)際上，可能顯示細(xì)胞核通過兩個轉(zhuǎn)染，特別是用MARs的轉(zhuǎn)染，并且特別是在第二轉(zhuǎn)染期間接受更多的質(zhì)粒，因?yàn)榈?ー轉(zhuǎn)染可促進(jìn)第二轉(zhuǎn)染期間細(xì)胞進(jìn)行的DNA攝取和細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)。實(shí)際上，每個轉(zhuǎn)染之后通過評價DNA的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和定量細(xì)胞的細(xì)胞器如溶酶體、細(xì)胞核和細(xì)胞溶膠中標(biāo)記的pDNA 的百分率，可顯示負(fù)荷MAR的質(zhì)粒DNA似乎逃避溶酶體降解和在第二轉(zhuǎn)染期間更有效得多地進(jìn)入細(xì)胞核。解釋可以是，質(zhì)粒，特別是第一轉(zhuǎn)染那些質(zhì)粒，可使細(xì)胞降解結(jié)構(gòu)飽和，因此允許第二轉(zhuǎn)染期間更有效的DNA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核。因此，將具有提高的HR/NHEJ比、提高的HR和/或降低的NHEJ的細(xì)胞與MAR元件組合可以是非常有效的并是本發(fā)明的一部分。同源重組(HR)和非同源末端連接(NHEJ)的機(jī)制轉(zhuǎn)基因利用重組系統(tǒng)以在雙鏈斷裂處整合進(jìn)宿主基因組。雙鏈斷裂(DSBs)是生物學(xué)上最有害的基因組損傷類型，潛在地導(dǎo)致細(xì)胞死亡或各種各樣的基因重排。準(zhǔn)確的修復(fù)對遺傳信息的成功保持和增殖是必要的。有兩種主要的DSB修復(fù)機(jī)制非同源末端連接(NHEJ)和同源重組(HR)。同源重組是共享同源性的DNA序列之間的基因交換過程并只在細(xì)胞周期的S/G2期工作，而NHEJ簡單地拼接兩個斷裂的DNA末端——通常沒有序列同源性，它在細(xì)胞周期的所有時期起作用但在有絲分裂的細(xì)胞的GO-Gl和S期早期特別重要(Wong and Capecchi，1985 ；Delacote and Lopez, 2008)。在脊椎動物中，HR和NHEJ有區(qū)別地有助于DSB修復(fù)，這取決于DSB的性質(zhì)和細(xì)胞周期的時期(Takata et al.，1998)。NHEJ 基本機(jī)制
概念上地，NHEJ過程的分子機(jī)制似乎簡單1) 一組酶捕獲斷裂的DNA分子，2)形成使兩個DNA末端在一起的分子橋和幻斷裂的分子重新連接。為了進(jìn)行這樣的反應(yīng)，哺乳動物細(xì)胞中的NHEJ結(jié)構(gòu)包括兩個蛋白復(fù)合體，與DNA-PKcs (依賴DNA的蛋白激酶的催化亞基)相關(guān)的異ニ聚體Ku80/Ku70和具有其輔因子XRCC4(X線互補(bǔ)中國倉鼠基因4)和許多蛋白因子如Artemis和XLF(XRCC4樣因子或Cernunnos)的DNA連接酶IV( Delacdte et al.，2002)。NHEJ經(jīng)常被認(rèn)為易錯DSB修復(fù)，因?yàn)樗唵蔚仄唇觾蓚€斷裂的DNA末端——通常沒有序列同源性并且它產(chǎn)生小的插入和缺失(Moore and Haber, 1996 ；Wilson et al.， 1999)。NHEJ提供貫穿細(xì)胞周期的DSBs修復(fù)的機(jī)制，但在有絲分裂的細(xì)胞的GO-Gl和S期早期特別重要(Takata et al. , 1998 ；Delacote and Lopez，2008)。在從細(xì)菌到哺乳動物的生物體中觀察到通過NHEJ的DSBs修復(fù)，表明在進(jìn)化過程中它已被保存。DSB形成之后，NHEJ修復(fù)途徑中的關(guān)鍵步驟是斷裂的DNA末端的物理并列。 KU70/80異ニ聚體蛋白復(fù)合體與斷裂的DNA分子兩端的結(jié)合啟動NHEJ以將末端捕獲、拴在一起和產(chǎn)生用于其它NHEJ關(guān)鍵因子組裝的支架。DNA結(jié)合的Ku異ニ聚體復(fù)合體將 DNA-PKcs招募到DSB，一種屬于PIKK (蛋白激酶的磷酸肌醇3-激酶樣家族)的460kDa 的蛋白(Gottlieb and Jackson，1993)，并活化它的絲氨酸/蘇氨酸激酶功能(Yaneva et al.，1997)。兩個DNA-PKcs分子跨過DSB —起相互作用，因此在兩個斷裂的DNA末端之間形成分子橋并抑制它們的降解(DeFazio et al.，200 。然后，DNA末端可被直接地連接， 盡管在結(jié)扎之前從DSB產(chǎn)生的多數(shù)末端不得不被適當(dāng)?shù)靥幚?Nikjoo et al.，1998)。依賴斷裂的性質(zhì)，通過填充缺ロ、去除斷裂周圍的損傷的DNA或ニ級結(jié)構(gòu)，可需要加工酶的不同組合的作用以產(chǎn)生相容的突出端。NHEJ處理中的該步驟被認(rèn)為是與NHEJ修復(fù)相關(guān)的核苷酸的偶然丟失的原因。哺乳動物NHEJ中的一個關(guān)鍵的末端加工酶是Artemis——酶的金屬-β-內(nèi)酰胺酶超家族的成員，其在多數(shù)放射敏感的重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)患者中被發(fā)現(xiàn)為突變的基因(Moshous et al.，2001)。Artemis對含有DNA的ds_ss轉(zhuǎn)換和DNA發(fā)夾具有5，- 3，外切核酸酶活性和DNA-PKcs依賴的內(nèi)切核酸酶活性(Ma et al.，2002)。 它的活性還被ATM調(diào)節(jié)。因此，Artemis似乎可能參與多重DNA損傷反應(yīng)。然而，只有ー組 DNA損害似乎被Artemis修復(fù)，因?yàn)樵谌鄙貯rtemis的細(xì)胞中沒有觀察到DSB修復(fù)的主要缺點(diǎn)(Wang et al. ,2005, Darroudi et al. ,2007)。DNA缺ロ必須被填充以能夠進(jìn)行修復(fù)。將核苷酸加入到DSB受聚合酶μ和λ的限制(Lee et al.，2004 ；Capp et al.，2007)。通過與XRCC4相互作用，多核苷酸激酶(PNK) 也被招募到DNA末端以允許DNA聚合和連接(Koch et al.，2004)。最后，通過DNA末端的連接完成NHEJ——由含有XRCC4、DNA連接酶IV和XLF的復(fù)合體實(shí)現(xiàn)的步驟(Grammder et al.，1997)。其它連接酶可部分代替DNA連接酶IV，因?yàn)镹HEJ可在缺少XRCC4和連接酶 IV時發(fā)生(Yan et al.，2008)。此外，研究顯示XRCC4和連接酶IV在NHEJ外面不具有作用，然而相反，KU在其它過程如轉(zhuǎn)錄、凋亡和對微環(huán)境的反應(yīng)中起作用(Monferran et al., 2004 ；Muller et al.，2005 ；Downs and Jackson,2004)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解的，上面提到的蛋白(例如，異ニ聚體Ku80/Ku70、 DNA-PKcs,但特別是 DNA 連接酶 IV、XRCC4、Artemis 和 XLF(XRCC4 樣因子或 Cernunnos)、 PIKK(蛋白激酶的磷酸肌醇3-激酶樣家族)的基因之一中或周圍的任何突變——將降低或關(guān)閉NHEJ——位于本發(fā)明的范圍內(nèi)。同樣地，作用于以上途徑中的任何ー個以降低它或關(guān)閉它的任何蛋白質(zhì)或轉(zhuǎn)基因序列位于本發(fā)明的范圍內(nèi)。HR:基本機(jī)制同源重組(HR)是非常精確的修復(fù)機(jī)制。同源染色単體充當(dāng)斷裂鏈的修復(fù)模板。HR 發(fā)生在細(xì)胞周期的S期和G2期期間，那時獲得姊妹染色単體。典型的HR主要被表征為三個步驟1)斷裂末端的5’的切除，2)用同源的DNA雙鏈體的鏈侵入和交換，和3)重組中間體的分解。不同的途徑可完成DSB修復(fù)，取決于進(jìn)行鏈進(jìn)入的能力，并包括合成依賴的鏈退火 (SDSA)途徑、典型的雙鏈斷裂修復(fù)(DSBR) (Szostak et al，1983)、斷裂引起的復(fù)制(BIR)， 和可選地，單鏈退火(SSA)途徑。所有的HR機(jī)制是相互聯(lián)系的和共享許多酶促步驟。所有HR反應(yīng)的第一步對應(yīng)于用核酸酶在MRN復(fù)合體(MRE11、RAD50、NBN (先前的 NBS1，針對Nijmegen斷裂綜合征1))和CtIP(CtBP-相互作用蛋白)(Sun et al.，1991 ； White and Haber, 1990)的幫助下的5，末端斷裂的DNA鏈的切除。3，單鏈DSB的最終產(chǎn)生能尋找同源序列。同源雙鏈體的侵入通過由用RAD51重組酶蛋白包被的3’ ss-DNA組成的核線進(jìn)行(Benson et al.，1994)。復(fù)制蛋白A(RPA)、異三聚體的ssDNA結(jié)合蛋白——參與真核生物中與ssDNA相連的DNA代謝過程(Wold，1997)——的需要對RAD51絲的組裝是必需的(Song and sung, 2000) 然后RAD51與RAD52相互作用，RAD52具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)(Shen et al.，1996)以替換 RPA 分子和促進(jìn) RAD51 裝入(Song and sung，2000)。Rad52 在酵母中對重組過程是重要的(Symington，200 。然而，在脊椎動物中，BRCA2 (乳腺癌2型敏感性蛋白)而不是RAD52似乎在鏈進(jìn)入和交換中發(fā)揮重要作用(Davies and Pellegrini, 2007 ； Esashi et al. ,2007) RAD51/RAD52相互作用被RAM4的結(jié)合而穩(wěn)定。RAM4在D環(huán)形成之后在重組中間體的成熟中也發(fā)揮作用(Bugreev et al.，2007)。在其它方面，BRCAl (乳腺癌1)與BARDl (BRCA1相關(guān)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)域1)和BACHl (BTB和CNC同源物1)相互作用以分別執(zhí)行連接酶和螺旋酶DSB修復(fù)活性(Greenberg et al.，2006)。針對DNA損傷，BRCAl 也與CtIP以⑶K依賴的方式相互作用并進(jìn)行泛素化(Limbo et al.，2007)。因此，BRCA1、 CtIP和MRN復(fù)合體在細(xì)胞周期的S期和G2期HR介導(dǎo)的DNA修復(fù)的激活中發(fā)揮作用。核線的侵入導(dǎo)致被稱作替位環(huán)(D環(huán))的異源雙鏈體的形成并包括用侵入的鏈替換雙鏈體的一條鏈和與另一條鏈配對。然后，幾個HR途徑可完成修復(fù)，利用同源序列作為模板來替換包圍DSB的序列。依賴使用的機(jī)制，同源的模板和斷裂的DNA分子之間的相互交換(交換)可與HR修復(fù)相關(guān)或可與HR修復(fù)相關(guān)。交換可具有重要的遺傳后果，如基因組重排或雜合性丟失。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解的，上面提到的蛋白(例如，MRN復(fù)合體(MRE11、 RAD50、NBN(先前的NBS1，針對Ni jmegen斷裂綜合征1))的蛋白和CtIP (CtBP相互作用蛋白)、RAD51——復(fù)制蛋白A(RPA)、Rad52、BRCA2 (乳腺癌2型敏感性蛋白)、RAM4、BRCA1 (乳腺癌1)與BARDl (BRCA1相關(guān)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)域1)、BACHl (BTB和CNC同源物1)相互作用)的基因之一中或周圍的任何突變——該突變將增強(qiáng)HR——位于本發(fā)明的范圍內(nèi)。同樣地，作用于以上途徑中的任何一個以增加它的任何蛋白質(zhì)或轉(zhuǎn)基因序列位于本發(fā)明的范圍內(nèi)。DNA DSB修復(fù)途徑之間的選擇NHEJ和HR似乎是兩個主要的真核生物DSB修復(fù)途徑。然而，它們之間的平衡在物種中有很大不同。脊椎動物細(xì)胞較酵母使用NHEJ更頻繁。ー個解釋是高等真核生物基因組的復(fù)雜度使尋找HR必需的同源物更困難。此外，高水平的重復(fù)性在異位重組的情況下對遺傳穩(wěn)定性可以是危險的?？蛇x地，在脊椎動物而不是在酵母中發(fā)現(xiàn)了ー些因子，如 DNA-PKcs、BRCAl 和 Artemis。在哺乳動物中，已知NHEJ和HR以競爭的和合作的方式起作用，對嚙齒動物細(xì)胞和人類癌細(xì)胞系的研究已顯示NHEJ和HR途徑之間的選擇取決于細(xì)胞周期階段。NHEJ提供貫穿細(xì)胞周期的DSBs修復(fù)的機(jī)制，但在有絲分裂的細(xì)胞的GO-Gl期和S期早期特別重要(Takata et al.，1998 ；Delacote and Lopez，2008)，而 HR 在 S 期晚期/G2 期是活躍的。 幾個因素在兩個途徑之間的選擇的調(diào)節(jié)中也是重要的，包括修復(fù)蛋白的調(diào)節(jié)的表達(dá)和磷酸化、修復(fù)因子的染色質(zhì)接近性和同源修復(fù)模板的可用性。調(diào)節(jié)HR效率的一個關(guān)鍵因素是模板的可用性。因此當(dāng)姊妹染色單體是可得到的吋，在細(xì)胞周期的S和G2期期間細(xì)胞上調(diào)HR是不令人驚奇的，因?yàn)樗鼈兪荋R喜愛的模板 (Dronkert et al.，2000)。這種偏愛可通過從姊妹染色単體在S期形成的時間直到它們在后期分離的姊妹染色単體之間的鄰近效應(yīng)來解釋。但是同源模板的存在對HR能力是不夠的。日益増加的證據(jù)表明，當(dāng)細(xì)胞從Gl進(jìn)展到S/G2，從NHEJ到HR的轉(zhuǎn)換被有效地調(diào)節(jié)。實(shí)際上，在哺乳動物細(xì)胞中HR被依賴CDK的細(xì)胞周期控制緊密地調(diào)節(jié)。已證明， ⑶K介導(dǎo)的BRCA2絲氨酸3291的磷酸化阻斷它在M期和Gl期早期與RAD51的相互作用。 這種磷酸化代表HR被下調(diào)的機(jī)制之一(Esashi et al.，2007)。另外，HR和NHEJ之間的基本差別是HR介導(dǎo)的修復(fù)需要DNA切除(大約100-200個核苷酸)用于同源性查找和鏈侵入 (Sung and Klein，2006)?，F(xiàn)在清楚DNA 5，末端的切除是通過啟動HR和進(jìn)ー步抑制NHEJ 的可能性而有助于DSB修復(fù)選擇的關(guān)鍵步驟。切除依賴CDKl活性。有趣地，阻斷CDKl導(dǎo)致在DSB位點(diǎn)MREl的持久性，提示末端切除的調(diào)節(jié)而不是MRN募集到斷裂的末端需要CDKl活性(Ira et al.，2004)。最后，RAD51和RAD52表達(dá)在S期期間增加并有助于HR激活(Chen et al.，1997)。相比之下，NHEJ在S期被DNA-PK活性的降低而下調(diào)(Lee et al.，1997)。在HR/NHEJ界面的蛋白修復(fù)途徑之間的選擇的調(diào)節(jié)可由在兩個修復(fù)途徑中都起作用的早期作用蛋白來控制。MRN復(fù)合體和ATM在它們之中，并連同它們的介質(zhì)和轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白形成感覺和信號傳導(dǎo)任何DNA損傷的高效網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)在損傷之后非?？焖俚亻_始工作并在任務(wù)完成之后不久被關(guān)閉。MRN復(fù)合體參與DNA修復(fù)機(jī)制，如HR、NHEJ、DNA復(fù)制、端粒維護(hù)和參與將信號傳導(dǎo)到細(xì)胞周期檢查點(diǎn)(D’ Amours and Jackson, 2002 ；van den Bosch et al.，2003)。DNA 損傷修復(fù)的第一歩是通過MREl的DNA結(jié)合模體，作為異四聚體(M2R2)的MRN復(fù)合體與DSBs 斷裂末端的結(jié)合(de Jager et al.，2001)。該結(jié)合被排列為具有RAD50WalkerA和B模體和橋DNA分子的球形的結(jié)構(gòu)域。MRN復(fù)合體因此是DSBs的第一傳感器，它通過兩步活化ATM (Mirzoeva andPetrini，2003 ；Lavin 2007)。首先，它將DNA末端的局部濃度增加到觸發(fā)ATM單體化的水平。然后結(jié)合到ATM的NBN將它轉(zhuǎn)化成活性構(gòu)象(Dupre et al.，2006)。一旦被活化， ATM在DSB信號傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用和磷酸化許多種蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。例如，ATM通過p53中間物的作用來誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯(Canman et al.，1998 ；Waterman et al.，1998)。其它底物， 例如 NBS、MREl、BRCAl、CHK2、FANCD2、Artemis 和 DNA-PKcs 被活化的 ATM 激酶磷酸化并通過在DNA修復(fù)、細(xì)胞周期控制和轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮作用而對決定細(xì)胞命運(yùn)是重要的。MRN復(fù)合體和ATM在DSBs的識別和信號傳導(dǎo)中是相互獨(dú)立的(LaVin，2007)。在對DSBs的反應(yīng)中還觀察到ATM在C端S139殘基對H2A的快速磷酸化(Burma et al.，2001 ；Stiffet al. ,2004) 在幾秒內(nèi)發(fā)現(xiàn)磷酸化的 Η2ΑΧ( γ H2AX)在包圍 DSBs 的兆堿基區(qū)上并通過充當(dāng)幾個蛋白的停泊位點(diǎn)而充當(dāng)DNA損傷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Kim et al.，2006)。已發(fā)現(xiàn)MREll的核酸酶活性在哺乳動物細(xì)胞中通過加工3’-ssDNA——RPA的結(jié)合
部位(White and Haber，19990)-而與CtIP合作來調(diào)節(jié)單鏈DNA的產(chǎn)生(Limbo et al.，
2007 ；Sartori et al.，2007)。RPA_ssDNA復(fù)合體抑制任何另外的核酸酶活性并提供修復(fù)結(jié)構(gòu)的作用位點(diǎn)(Sugiyma et al. ,1997 ；Williams et al. ,2007) 這之后是 HR 或 A-NHEJ， 取決于同源序列的存在、蛋白調(diào)節(jié)和切除的大小(Rass et al.，2009)。CtIP被首先表征為轉(zhuǎn)錄阻抑物CtBP(羧基端結(jié)合蛋白)的輔因子和它結(jié)合細(xì)胞周期調(diào)節(jié)子，如視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白和BRCAl (Fusco et al. ,1998 ；Schaeper et al.，1998 ； Wong et al.，1998)。已知CtIP在細(xì)胞周期進(jìn)展中具有轉(zhuǎn)錄依賴的和不依賴的含義(Liuand Lee, 2006 ；Wu and Lee，2006)。除了它在針對DNA DSB的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)中的重要作用，最近的工作提示CtIP通過啟動DBS末端切除而控制HR進(jìn)行的修復(fù)DSB損傷的決定(Sartori et al.，2007 ；You et al.，2009)。此外，它還可參與Gl期期間MMEJ需要的DSB末端的有限切除(Yun and Hiom, 2009) 0因此，CtIP連接細(xì)胞周期控制、DNA損傷檢查點(diǎn)和修復(fù)。由于MRN復(fù)合體對DSB末端切除也是必需的，可能CtIP提供MRN復(fù)合體和BRCAl之間的物理 3 (Bernstein and Rothstein, 2009 ；Takeda et al. ，2007)。DNA修復(fù)中涉及的這些基因中的突變分別導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性綜合征，如共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥樣病癥(ATLD) Gteward et al. ,1999 ；Taylor et al. ,2004), Nijmegen斷裂綜合征(NBQ和MREll、NBS和RAD50中突變的Nijmegen斷裂綜合征的變體形式(Bendix-Waltes et al.，2005)。此外，無效突變導(dǎo)致小鼠中胚胎的致死現(xiàn)象(Xiao and Weaver 1997 ；Luo et al.，1999 ；Zhu et al.，2001)。ATM 或 ATR 基因中的其它突變分別引起基因組不穩(wěn)定性綜合征，如共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(A-T) -kckel綜合征(SCKLl) (O'Driscoll et al.，2003)。Artemis 缺乏癥(Moshous et al.，2001)、DNA 連接酶 IV 缺乏癥(LigIV) (0，Driscoll et al.，2001)、Cernunnos-XLF (XRCC4 樣因子)缺乏癥(Buck et al.，2006)、布盧姆綜合征(BS)、維爾納綜合征(WS)和范康尼貧血(FA)與DNA損傷修復(fù)結(jié)構(gòu)的其它成員相關(guān)(Taniguchi and D'Andrea，2006)。而且，除了基因組不穩(wěn)定性異常，具有這樣的綜合征的患者常常遭受各種類型的惡性腫瘤，這表明未修復(fù)的DNA損傷與癌癥發(fā)生之間的聯(lián)系。因此DNA修復(fù)中涉及的基因在腫瘤預(yù)防中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解的，上面提到的基因之一中或周圍的任何突變—— 將增加HR、降低NHEJ和/或増加HR/NHEJ比，例如，通過將修復(fù)途徑之間的選擇轉(zhuǎn)換到 HR——位于本發(fā)明的范圍內(nèi)。同樣地，作用于以上途徑中的任何一個以增加HR、降低NHEJ 和/或増加HR/NHEJ比的任何蛋白質(zhì)或轉(zhuǎn)基因序列位于本發(fā)明的范圍內(nèi)。轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)4勿在非靈長類真ホ亥宿t細(xì)朐,Φ的:!:曾力□的ノzH必在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞群體中通常有少數(shù)產(chǎn)生大量的轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的細(xì)胞(顯示分別超過10-100和100-1000相對光單位(RLUs)的中等或高生產(chǎn)者克隆/細(xì)胞)和幾乎不產(chǎn)生任何轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的細(xì)胞(低生產(chǎn)者克隆/細(xì)胞，例如，顯示小于lORLUs)。然而，在某些情況下，沒有高生產(chǎn)者克隆/細(xì)胞可從特異的轉(zhuǎn)基因獲得?？娠@示該轉(zhuǎn)基因表達(dá)差別是產(chǎn)物特異的，存在某些“難于表達(dá)的“蛋白。針對這種難于表達(dá)的蛋白的低生產(chǎn)者細(xì)胞，但是在范圍還有中等或高生產(chǎn)者細(xì)胞一一例如，針對容易表達(dá)的蛋白，顯示特別是前體蛋白的細(xì)胞內(nèi)沉淀和潛在的多肽交聯(lián)，因此指示在最終產(chǎn)物的加工、折疊和/或裝配中的可能的問題。本文提出的另外的數(shù)據(jù)提示在蛋白質(zhì)分泌，特別是在ER易位和加工中的問題。盡管通過表達(dá)蛋白質(zhì)分泌途徑的組分來増加蛋白質(zhì)分泌的先前不成功的嘗試(Lalckaraju et al.，2008)，但是非靈長類細(xì)胞，如CHO細(xì)胞與編碼這種組分的轉(zhuǎn)基因序列，特別是靈長類， 例如人類序列的組合導(dǎo)致不但低生產(chǎn)者細(xì)胞，而且在高生產(chǎn)者細(xì)胞中使人驚奇的分泌的提高。在測試的組分中，特定的組分和特定的組合產(chǎn)生特別有利的結(jié)果。例如，SRP14是被成功測試的蛋白之一。它可需要停止延伸直到在SRPM的幫助下新生的多肽可找到可用的 SR。由干與易位子(Transl)的另外的組合提供特別高的分泌，為了易位發(fā)生，產(chǎn)生的復(fù)合體可需要與Transl結(jié)合，其自身導(dǎo)致信號肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中去除和導(dǎo)致適當(dāng)加工和裝配的蛋白質(zhì)的分泌。然而，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解的，其它組分的轉(zhuǎn)基因序列和這種序列的組合的導(dǎo)入位于本發(fā)明的范圍內(nèi)。本文別處對蛋白質(zhì)分泌途徑的描述進(jìn)行特別的引用。在本文中，術(shù)語易位主要用于指跨過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)。然而，應(yīng)認(rèn)識到該術(shù)語在文獻(xiàn)中常常使用來指更普通的概念。蛋白質(zhì)分泌途徑蛋白質(zhì)的分泌是所有三個界的生物體共有的過程。該復(fù)合體分泌途徑最顯著地需要從細(xì)胞溶膠跨過細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜的蛋白質(zhì)易位。蛋白質(zhì)到達(dá)它的最終目的地需要多個步驟和許多種因子。在哺乳動物細(xì)胞中，該分泌途徑包括兩個主要的大分子裝配，信號識別顆粒(SRP)和分泌復(fù)合體(Sec復(fù)合體或易位子)。SRP由質(zhì)量為9、14、19、54、68和72kDa 的六個蛋白質(zhì)和7S RNA組成(Keenan，F(xiàn)reymann et al. 2001)，易位子是由Sec61 α β γ、 Sec62和Sec63組成的環(huán)狀顆粒。蛋白質(zhì)分泌中的第一步依賴信號肽，信號肽包括在多肽氨基端的特異的肽序列， 其介導(dǎo)新生蛋白質(zhì)跨過膜易位并進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)腔。在該步驟期間，從前導(dǎo)翻譯核糖體出現(xiàn)的信號肽與識別信號肽的SRP顆粒的亞基，即SRPM相互作用。SRP結(jié)合到信號肽阻斷新生多肽的進(jìn)ー步延伸，導(dǎo)致翻譯停滯。延伸停滯需要SRP9和-14蛋白(Walter and Blobel 1981)。在第二步中，核糖體-新生多肽-SRP復(fù)合體通過SRPM與SRP受體(SR)的相互作用錨定在 ER 膜(Gilmore, Blobel et al. 1982 ；Pool, Stumm et al. 2002)。SR 是含有兩個顯示GTP酶活性的蛋白SRa和SR3的異ニ聚復(fù)合體(Gilmore,Walter et al. 1982)。SR 與SRPM的相互作用依賴GTP的結(jié)合(Connolly，Rapiejko et al. 1991)。SR協(xié)調(diào)SRP從核糖體-新生多肽復(fù)合體的釋放和核糖體的出ロ位點(diǎn)與復(fù)合體(易位子)的結(jié)合。生長中的新生多肽通過易位子通道進(jìn)入ER，翻譯以其正常速度重新開始。核糖體受約束地待在易位子的細(xì)胞質(zhì)面上直到翻譯完成。除了核糖體，易位子與核糖體結(jié)合糖蛋白在細(xì)胞質(zhì)面上緊密結(jié)合并與蛋白伴侶，如肌鈣網(wǎng)蛋白和鈣聯(lián)接蛋白，并與蛋白質(zhì)ニ硫鍵異構(gòu)酶(PDI) 和寡糖基轉(zhuǎn)移酶在腔面上緊密結(jié)合。生長中的新生多肽擠進(jìn)ER的腔里之后，信號肽由被稱作信號肽酶的酶從前蛋白切割，由此將成熟蛋白釋放進(jìn)ER。翻譯后修飾、正確折疊和多聚化之后，蛋白質(zhì)離開ER并遷移到高爾基體，然后到分泌小泡。分泌小泡與質(zhì)膜的融合在細(xì)胞外環(huán)境中釋放小泡的內(nèi)容物。
引人注意的是，分泌性蛋白已進(jìn)化，具有特定的信號序列，該信號序列非常適合它們自己的跨過細(xì)胞膜的易位。作為不同的信號肽被發(fā)現(xiàn)的各種序列可以獨(dú)特的方式與分泌器官相互作用。信號序列天然地主要是疏水性的——一種可參與引導(dǎo)新生肽到分泌性蛋白的特點(diǎn)。除了氨基酸的疏水段，多數(shù)哺乳動物分泌信號共享許多共有序列特點(diǎn)。不同的信號肽在它們引導(dǎo)異源蛋白質(zhì)分泌的效率上不同，但是幾個分泌信號肽(即白細(xì)胞介素-、免疫球蛋白_、組織相容性-信號序列的那些信號肽等)已被鑒定，其可用于引導(dǎo)異源的重組蛋白的分泌。盡管具有相似性，但是這些序列對促進(jìn)一些難于表達(dá)的蛋白質(zhì)的有效分泌不是最佳的，因?yàn)樵谔烊坏谋尘巴?，天然的信號肽不可正確地起作用，或因?yàn)榕c宿主細(xì)胞或與分泌過程連接的差別。切割的信號肽內(nèi)的序列與成熟蛋白其它部分的相互作用進(jìn)ー步使對異源蛋白質(zhì)有效分泌的合適信號序列的選擇復(fù)雜化(Johansson，Nilsson et al. 1993)。圖的詳細(xì)描述重復(fù)轉(zhuǎn)染對轉(zhuǎn)基因表達(dá)的影響某些人類MARs，例如，MAR 1-68,已被發(fā)現(xiàn)當(dāng)插入到啟動子/增強(qiáng)子序列的上游吋，在培養(yǎng)細(xì)胞以及小鼠中有效地增加和穩(wěn)定基因表達(dá)(Girod et al. 2007, Galbete et al. 2009)。MARs和連續(xù)轉(zhuǎn)染對基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)的影響的分析顯示在圖1中。圖1 (A)描述 GFP-表達(dá)細(xì)胞多克隆群體中的熒光分布。將CHO DG44細(xì)胞與缺乏MAR元件的GFP表達(dá)載體(GFP，左側(cè)曲線)共轉(zhuǎn)染，或與含有MAR 1-68的載體共轉(zhuǎn)染(MAR1-68GFP，左起第二個曲線)，并與介導(dǎo)抵抗嘌呤霉素的pSVpuro質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。將這些細(xì)胞中的一些用相同的GFP 表達(dá)載體——但是用介導(dǎo)新霉素抗性的選擇質(zhì)?！诘谝晦D(zhuǎn)染(右側(cè)曲線)之后的一天或嘌呤霉素抗性選擇2周之后(右起第二個曲線)進(jìn)行第二轉(zhuǎn)染。嘌呤霉素和/或新霉素抗性選擇兩周之后，eGFP熒光通過細(xì)胞熒光測定法來定量。顯示的曲線代表四個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。在圖I(B)中，柱狀圖顯示對應(yīng)顯示小于10相對光單位(RLU)的非/低表達(dá)子的全部細(xì)胞，或顯示中等和高(> 100RLU)或非常高(> 1000RLU)GFP熒光的細(xì)胞的百分比，如從如圖A中所示的穩(wěn)定細(xì)胞庫的分析所確定的。在圖I(C)中每個穩(wěn)定的多克隆細(xì)胞庫的平均GFP熒光被標(biāo)準(zhǔn)化到從MARGFP的轉(zhuǎn)染獲得的GFP熒光，四個獨(dú)立轉(zhuǎn)染的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差顯示為超過通過沒有MAR的一個轉(zhuǎn)染獲得的熒光的成倍増加。星號表示GFP表達(dá)的顯著性差異(斯氏t檢驗(yàn)(Studuent，s t-test)，P < 0. 05)。圖1 (D)描述用或沒有人類MAR單獨(dú)或雙重轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中eGFP轉(zhuǎn)基因染色體整合位點(diǎn)的FISH分析的結(jié)果。將穩(wěn)定的細(xì)胞庫的中期染色體分散與沒有MAR的GFP質(zhì)粒雜交，顯示了結(jié)果的代表性圖解。在圖1Φ)中， 顯示了染色體的擴(kuò)大以圖示熒光強(qiáng)度的差異。這些圖顯示，當(dāng)用流式細(xì)胞術(shù)分析吋，GFP表達(dá)載體和抗生素抗性質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染—— 之后是它們的基因組中具有穩(wěn)定整合的轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞的抗生素選擇——通常在多克隆細(xì)胞群體中產(chǎn)生熒光的雙峰分布(圖1A)。在該實(shí)驗(yàn)裝置中重疊Y軸的第一細(xì)胞亞群對應(yīng)于以不能檢測到的水平表達(dá)GFP的細(xì)胞，而另ー個細(xì)胞亞群表達(dá)顯著的GFP水平。MAR 1_68的包含増加發(fā)熒光的細(xì)胞的表達(dá)水平和伴隨地降低的沉默細(xì)胞的比例(15%對36%，圖1B)。當(dāng)用不同的抗生素抗性基因共轉(zhuǎn)染相同的GFP表達(dá)載體2周以后，對第二抗生素的抗性選擇之后觀察到平均2. 4倍熒光的増加，這接近期望的2倍増加(圖IA和1C)。相比之下，用兩個抗生素的選擇之后，從在連續(xù)的日子里進(jìn)行的兩個連續(xù)轉(zhuǎn)染觀察到GFP表達(dá)出乎意料地高G至5倍)的増加。平均起來，遍及多克隆群體的所有細(xì)胞，相對于沒有 MAR的単一轉(zhuǎn)染，通過含有MAR質(zhì)粒的連續(xù)轉(zhuǎn)染獲得20倍表達(dá)增加(圖1C)。另外，細(xì)胞中的一些顯示非常高的表達(dá)水平，沉默細(xì)胞的出現(xiàn)幾乎完全從多克隆群體中消除(0.5%，圖 1B)。沒有MAR的連續(xù)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生適度的GFP表達(dá)，導(dǎo)致當(dāng)與単一轉(zhuǎn)染相比時全部熒光水平的 3. 2倍増加，并且它不消除沉默細(xì)胞的出現(xiàn)(圖1C，數(shù)據(jù)未顯示)。因此，MAR的存在和重復(fù)轉(zhuǎn)染協(xié)同地作用以介導(dǎo)提高的表達(dá)水平。總體上，從含有MAR質(zhì)粒的兩個連續(xù)(第一和隨后的)轉(zhuǎn)染獲得的表達(dá)水平很高以致于在日光下，沒有紫外光照射，就可從細(xì)胞培養(yǎng)單層容易地看到GFP熒光(圖1F，其顯示通過在白天細(xì)胞單層的可見的GFP熒光，從用MAR-GFP載體轉(zhuǎn)染兩次的穩(wěn)定多克隆細(xì)胞庫中獲得的GFP表達(dá)水平)。該作用不限于在該研究中使用的GFP轉(zhuǎn)基因或SV40啟動子， 因?yàn)橛脭y帯CMV啟動子和DsRed報告基因的質(zhì)粒獲得相似的結(jié)果，而且連續(xù)轉(zhuǎn)染之后還獲得了非常高的治療性免疫球蛋白表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)，并且圖1G，其顯示轉(zhuǎn)基因表達(dá)和細(xì)胞分裂周期持續(xù)時間之間的關(guān)系。用抗生素抗性質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染含有SV 40啟動子上游的人類 MAR 1-68和每個輕鏈和重鏈的免疫球蛋白G表達(dá)載體，選擇抗生素抗性細(xì)胞三周。通過兩輪有限稀釋分離單克隆細(xì)胞群體，并測定分泌的IgG的量和平均細(xì)胞分裂時間。正方形和三角形分別顯示一個或兩個轉(zhuǎn)染之后獲得的克隆)。有意思的是，單克隆CHO細(xì)胞克隆表達(dá)的非常高水平的免疫球蛋白常常與増加的細(xì)胞分裂時間相關(guān)聯(lián)。這表明在蛋白質(zhì)合成方面細(xì)胞可能正在達(dá)到它們的生理極限。這可被預(yù)期，因?yàn)楫?dāng)它們自身的細(xì)胞蛋白質(zhì)相比時，細(xì)胞正在合成相似量的重組蛋白(每個細(xì)胞大約IOOpg)。這將加倍每個細(xì)胞分裂時需要的能量輸入。盡管如此，發(fā)現(xiàn)大比例的克隆以非常高的水平表達(dá)異源蛋白質(zhì)而不干擾它們的自身代謝，因?yàn)樗鼈儧]有顯著減慢細(xì)胞分裂(圖1G)。重復(fù)轉(zhuǎn)染之后轉(zhuǎn)基因的共整合發(fā)現(xiàn)重復(fù)轉(zhuǎn)染之后驅(qū)動高表達(dá)的重要參數(shù)是轉(zhuǎn)染之間的時間間隔。當(dāng)兩個轉(zhuǎn)染表現(xiàn)為兩個獨(dú)立的和因此附加的事件吋，當(dāng)兩周之后再轉(zhuǎn)染細(xì)胞時未觀察到表達(dá)的協(xié)同效應(yīng) (圖1C)。這提示每個轉(zhuǎn)染的DNA可必須相互作用為細(xì)胞核內(nèi)染色體外的附加體并可在整合進(jìn)細(xì)胞基因組之前形成混合的多聯(lián)體。這通過來自穩(wěn)定的多克隆群體的中期染色體伸展的熒光原位雜交(FISH)分析來評價。將用或不用MAR元件轉(zhuǎn)染一次的80個獨(dú)立的中期細(xì)胞與由沒有MAR的GFP質(zhì)粒組成的探針雜交。觀察到單個整合位點(diǎn)，但從用MAR轉(zhuǎn)染的細(xì)胞觀察到較高的熒光強(qiáng)度(圖ID和幻。熒光強(qiáng)度由雙重轉(zhuǎn)染過程進(jìn)ー步増加，提示較高數(shù)目的轉(zhuǎn)基因拷貝已整合。記錄單個和兩個連續(xù)轉(zhuǎn)染之后所有情況下的獨(dú)特的整合位點(diǎn)。然而，當(dāng)幾乎沒有染色體外的附加型DNA應(yīng)從第一轉(zhuǎn)染保留吋，在以一周間隔轉(zhuǎn)染兩次的細(xì)胞的大約一半細(xì)胞中觀察到雙重整合事件。這表明如果第二轉(zhuǎn)染進(jìn)行之前來自第一轉(zhuǎn)染的 DNA整合已被完成，那么獨(dú)立的整合事件可發(fā)生。雙重轉(zhuǎn)染不導(dǎo)致可檢測到的染色體重排， 它們也沒有可檢測地導(dǎo)致在優(yōu)選染色體基因座的插入，因?yàn)闆]有分析的細(xì)胞都不具有相同的整合位點(diǎn)。因此，兩個轉(zhuǎn)染之后的轉(zhuǎn)基因整合似乎不被靶向至任何特異的染色體或染色體位點(diǎn)，如早期對含有MAR質(zhì)粒的單ー轉(zhuǎn)染的報道(Girod et al. 2007)。高轉(zhuǎn)基因表達(dá)和細(xì)胞周期的相和轉(zhuǎn)染因?yàn)檗D(zhuǎn)染之間的時間選擇(時機(jī))似乎在高的轉(zhuǎn)基因表達(dá)中起作用，所以分析轉(zhuǎn)染之間時間間隔的系統(tǒng)變異的作用。在模型細(xì)胞中，當(dāng)?shù)谝晦D(zhuǎn)染之后21小時進(jìn)行第二轉(zhuǎn)染時，觀察到最高的GFP表達(dá)水平，與単一轉(zhuǎn)染相比，產(chǎn)生熒光的連貫地5倍増加。圖2描述如何確定連續(xù)轉(zhuǎn)染之間的最佳時間選擇。圖2(A)顯示穩(wěn)定的多克隆群體由単一轉(zhuǎn)染(減號)或被標(biāo)明的時間間隔分開的MAR-GFP表達(dá)質(zhì)粒的兩個連續(xù)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生。 選擇兩周之后，測定全部多克隆群體的平均GFP表達(dá)。將熒光水平標(biāo)準(zhǔn)化到獲得的最大值并顯示為超過從單ー轉(zhuǎn)染獲得的表達(dá)的成倍増加，其中(η)對應(yīng)于獨(dú)立轉(zhuǎn)染數(shù)。星號表示 GFP表達(dá)的顯著性差異(斯氏t檢驗(yàn)，P < 0. 05)。圖2(B)顯示細(xì)胞周期進(jìn)展的分析。在第一和第二轉(zhuǎn)染吋，收獲CHO細(xì)胞并用碘化丙啶染色和通過細(xì)胞熒光測定木分析熒光。相對的碘化丙啶(PI)熒光分布代表每個細(xì)胞的基因組DNA的量。與每個細(xì)胞周期狀態(tài)(G1、 S、G2/M)相關(guān)的群體百分比如所顯示的。結(jié)果顯示當(dāng)?shù)诙D(zhuǎn)染進(jìn)行l(wèi) u24h和2 之后，獲得相對于單一轉(zhuǎn)染的3至3. 5 倍表達(dá)的增加。然而，該增加較21h之后獲得的增加顯著低(圖2A)。因?yàn)榧?xì)胞傳代之后該時期接近細(xì)胞分裂周期的持續(xù)時間(圖2C和D)，這提示連續(xù)轉(zhuǎn)染之后高轉(zhuǎn)基因表達(dá)可與細(xì)胞分裂周期的特定時期相關(guān)聯(lián)。沿著分裂周期的細(xì)胞分布通過DNA的碘化丙啶染色來測定。該分析顯示細(xì)胞傳代之后18h Gl期細(xì)胞的過度表示，并發(fā)現(xiàn)這對應(yīng)于從單一轉(zhuǎn)染產(chǎn)生最高表達(dá)的時機(jī)(圖2B， 數(shù)據(jù)未顯示)，和圖2C和D，其通過細(xì)胞分裂周期顯示細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)展。圖2 (C)代表細(xì)胞周期進(jìn)展的時間曲線。每兩個小時收獲CHO DG44細(xì)胞用于細(xì)胞周期分析，從細(xì)胞傳代之后18 小時開始，這對應(yīng)于第一轉(zhuǎn)染的最佳時機(jī)。在獲得10’ 000個細(xì)胞的熒光水平之前，將細(xì)胞固定并用碘化丙啶染色DNA。圖2(D)顯示細(xì)胞周期持續(xù)時間的測定結(jié)果。傳代細(xì)胞之后每兩個小時測定Gl期細(xì)胞的百分比。括弧顯示兩個最大值之間的時機(jī)，其被取作ー個周期持續(xù)時間(14個小時)。由于在t = 0細(xì)胞傳代，延長的18h的第一周期被擾亂，該延遲歸因于細(xì)胞附著到培養(yǎng)皿表面和繼續(xù)細(xì)胞分裂周期進(jìn)展需要的4個額外小時)。Gl細(xì)胞的相似模式和過度表示在第一轉(zhuǎn)染之后21h獲得，這再次對應(yīng)于第二轉(zhuǎn)染之后產(chǎn)生最高表達(dá)水平的時機(jī)。如果表達(dá)確實(shí)與細(xì)胞周期定相聯(lián)系，那么當(dāng)?shù)诙D(zhuǎn)染在對應(yīng)于兩個細(xì)胞分裂的間期進(jìn)行時，應(yīng)觀察到轉(zhuǎn)基因表達(dá)的另一個最適條件。42小時之后，兩個轉(zhuǎn)染的協(xié)同效應(yīng)喪失，因?yàn)楸磉_(dá)與ー個轉(zhuǎn)染獲得的表達(dá)相似。然而，48小時之后觀察到轉(zhuǎn)基因表達(dá)的第二—— 雖然較低——協(xié)同作用的増加。從在1 的第一轉(zhuǎn)染觀察到的較高水平的表達(dá)和對于以21 或4 間期進(jìn)行的第二轉(zhuǎn)染的較高水平的表達(dá)意味最佳DNA轉(zhuǎn)移和/或表達(dá)可發(fā)生在特定的細(xì)胞分裂階段。MAR和連續(xù)轉(zhuǎn)染對細(xì)胞DNA攝取的影響FISH分析提示，連續(xù)轉(zhuǎn)染之后提高的表達(dá)可部分地來自基因組中較高轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的整合(圖1D)。一天間期的連續(xù)轉(zhuǎn)染可導(dǎo)致細(xì)胞核中質(zhì)粒附加體濃度的増加，因此增加轉(zhuǎn)基因整合進(jìn)細(xì)胞基因組的概率。為了評價每個轉(zhuǎn)染時進(jìn)入細(xì)胞核的轉(zhuǎn)基因的量，分別進(jìn)行瞬時單ー和雙重轉(zhuǎn)染，之后是從第二轉(zhuǎn)染之后1或2天分離的細(xì)胞核提取質(zhì)粒和通過實(shí)時定量PCR(qPCR)定量轉(zhuǎn)基因。圖3顯示連續(xù)轉(zhuǎn)染之后DNA轉(zhuǎn)運(yùn)、整合和表達(dá)。圖3 (A)顯示用GFP或具有或沒有 MAR的DsRed( “RED”)質(zhì)粒的単一和雙重瞬時轉(zhuǎn)染期間轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞核的GFP轉(zhuǎn)基因的量。 MAR-GFP+MAR-RED對應(yīng)于雙重轉(zhuǎn)染，其中在第一轉(zhuǎn)染期間MAR-GFP被轉(zhuǎn)移，而MAR-RED在第 ニ轉(zhuǎn)染中使用。分別在單一或第二轉(zhuǎn)染之后分離細(xì)胞核和提取總DNA，轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞核的GFP轉(zhuǎn)基因數(shù)通過qPCR定量。將結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化到參考CHO細(xì)胞基因組GAPDH基因的結(jié)果，結(jié)果代表4個獨(dú)立轉(zhuǎn)染的平均值。圖3(B)顯示MAR和連續(xù)轉(zhuǎn)染對整合的GFP轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的影響。穩(wěn)定的多克隆細(xì)胞庫的3周選擇之后，將全部基因組-整合轉(zhuǎn)基因DNA從先前描述的 GFP-表達(dá)細(xì)胞中提取，將DNA如針對A—樣定量。圖3 (C)顯示MAR和連續(xù)轉(zhuǎn)染對GFP表達(dá)的影響。B中分析的穩(wěn)定細(xì)胞庫的GFP熒光水平通過細(xì)胞熒光測定木來測定。圖3(D)和(E)顯示單克隆細(xì)胞群體中平均GFP熒光和轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)之間的關(guān)系。在圖3(D)中，將用GFP、MAR-GFP轉(zhuǎn)染或用MAR-GFP轉(zhuǎn)染兩次的不同的穩(wěn)定細(xì)胞克隆的平均GFP熒光水平顯示為每個基因組它們的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的函數(shù)，如通過qPCR所測定的。在圖3Φ)中，被標(biāo)準(zhǔn)化到轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的GFP熒光水平之間的關(guān)系被表示為每個基因組整合的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的函數(shù)。計(jì)算的回歸曲線由虛線表示，R2表示相關(guān)系數(shù)。結(jié)果顯示用MAR-GFP雙重轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯示它們的細(xì)胞核中GFP轉(zhuǎn)基因拷貝較用 MAR-GFP只轉(zhuǎn)染一次的細(xì)胞多3. 8倍(圖3A)。當(dāng)比較用這些不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的表達(dá)GFP或 DsRed( “RED”)的細(xì)胞時，觀察到由MAR-GFP的第二轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的核遞送較從該質(zhì)粒的単一轉(zhuǎn)染觀察到的核遞送高4. 2倍。然而，第一轉(zhuǎn)染的GFP質(zhì)粒的核轉(zhuǎn)運(yùn)沒有通過進(jìn)行第二轉(zhuǎn)染而顯著地増加。得出這樣的結(jié)論，來自第二轉(zhuǎn)染的DNA到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)通過進(jìn)行先前的第一轉(zhuǎn)染而得到支持。這些結(jié)論通過DNA轉(zhuǎn)運(yùn)的共焦成像而被加強(qiáng)，其中將用于第一轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒用羅丹明標(biāo)記，而將第二轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒用Cy5標(biāo)記(分別為深色(小點(diǎn))和白色(小點(diǎn))的標(biāo)記，圖 4A)。特別地，圖4描述轉(zhuǎn)染的DNA的亞細(xì)胞分布。圖4(A)顯示DNA細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)墓步癸@微鏡檢查分析。如所表示的，利用荷載或沒荷載用羅丹明和Cy5熒光團(tuán)標(biāo)記的MAR的質(zhì)粒， 在CHO細(xì)胞中進(jìn)行瞬時單ー或雙重轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后!3h、6h、21h，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞固定并用DAPI 染色(大的深色區(qū)點(diǎn))。表達(dá)GFP的細(xì)胞在圖片上呈現(xiàn)為大的亮的分布區(qū)點(diǎn)。圖4(B)顯示亞細(xì)胞質(zhì)粒DNA分布的定量，其在針對A進(jìn)行的共聚焦激光顯微鏡上進(jìn)行，除了將內(nèi)體/溶酶體區(qū)室用LysoTracker Red DND-99染色。來自羅丹明或Cy5熒光的簇的像素區(qū)用于估計(jì)大約120細(xì)胞中質(zhì)粒DNA的量。用或沒用MAR的第一轉(zhuǎn)染之后在細(xì)胞核中觀察到相似數(shù)量的羅丹明標(biāo)記的質(zhì)粒簇，如通過qPCR評價的，這與缺少M(fèi)AR對DNA轉(zhuǎn)運(yùn)的影響充分相關(guān)(圖3A和4A)。兩個轉(zhuǎn)染之后在基本上所有細(xì)胞中觀察到核質(zhì)粒簇。然而只有很少數(shù)的細(xì)胞表達(dá)GFP，這與先前的觀察結(jié)果一致只有少量細(xì)胞能表達(dá)瞬時轉(zhuǎn)染的基因(Akita et al. 2007)。轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA在CHO細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)——其已知包括細(xì)胞攝取、溶酶體逃逸和核輸入——受內(nèi)體/溶酶體降解的限制(Akita et al. 2007) 0因此，內(nèi)體/溶酶體和核區(qū)室的特異染色以將它們與細(xì)胞溶膠區(qū)分之后，轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸通過定量每個轉(zhuǎn)染之后它在細(xì)胞器和細(xì)胞溶膠中的分布來評價。概述在圖4B中的結(jié)果顯示第一轉(zhuǎn)染之后 21h具有或沒有MAR的質(zhì)粒DNA的相似亞細(xì)胞分布，盡管在較早的時間點(diǎn)含有MAR的質(zhì)粒的核轉(zhuǎn)運(yùn)似乎有些快。進(jìn)行缺乏MAR的質(zhì)粒的第二轉(zhuǎn)染沒有產(chǎn)生提高的核轉(zhuǎn)運(yùn)。然而，荷載MAR元件的質(zhì)粒逃脫溶酶體截留并更有效地進(jìn)入細(xì)胞核，因?yàn)榕c缺乏MAR的質(zhì)粒的小于 40%相比，第二轉(zhuǎn)染之后2Ih在存在MAR吋，全部Cy5-標(biāo)記的pDNA的80%位于細(xì)胞核。更確切地說，大部分缺乏MAR的質(zhì)粒在溶酶體/內(nèi)體區(qū)室中終止，如也針對第一轉(zhuǎn)染所發(fā)現(xiàn)的。MAR和重復(fù)基因轉(zhuǎn)移對溶酶體逃逸的協(xié)同效應(yīng)的意外發(fā)現(xiàn)因此為分離的細(xì)胞核中増加的附加體濃度提供解釋(圖3A和4B)。該現(xiàn)象可部分由第一轉(zhuǎn)染的DNA進(jìn)行的細(xì)胞降解區(qū)室的飽和產(chǎn)生的，因此允許第二轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒保持在細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞質(zhì)中MAR可促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞核。MAR元件増加基因組整合的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)接下來，檢測是否由MAR和連續(xù)轉(zhuǎn)染引起的増加的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)運(yùn)可增加轉(zhuǎn)基因整合進(jìn)CHO細(xì)胞基因組。如針對圖1，選擇穩(wěn)定的多克隆細(xì)胞群體，利用qPCR在全部細(xì)胞DNA 上測定每個基因組的穩(wěn)定整合的GFP轉(zhuǎn)基因拷貝平均數(shù)。轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒中MAR元件的包含顯著増加穩(wěn)定細(xì)胞庫的基因組中整合的轉(zhuǎn)基因數(shù)(圖3B)。由于單ー轉(zhuǎn)染之后MAR不起作用來増加核轉(zhuǎn)運(yùn)(圖3A)，這意味著MAR可增加質(zhì)粒本身的基因組整合。該發(fā)現(xiàn)證實(shí)先前的提議——MARs的使用増加在受體細(xì)胞基因組中整合的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)(Girod et al. 2005, Kim et al. 2004)。連續(xù)轉(zhuǎn)染還介導(dǎo)質(zhì)粒整合4倍増加，其與在同瞬時轉(zhuǎn)染中記錄的游離細(xì)胞外附加體増加相當(dāng)(圖3A和3B)。可估計(jì)，當(dāng)缺乏MAR轉(zhuǎn)染一次吋，平均起來48個GFP質(zhì)?？截愐颜?，而從用MAR的一個或兩個連續(xù)轉(zhuǎn)染分別獲得平均大約163個拷貝和676個拷貝?？偟膩碚f，當(dāng)與MAR驅(qū)動的質(zhì)粒整合增加組合吋，由MAR和連續(xù)轉(zhuǎn)染協(xié)同地引起的増加的核轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)大于10倍的増加。如從先前觀察到的MAR的抗沉默效應(yīng)所期望的，這還產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因表達(dá)甚至更高的增加(超過15倍，圖3C) (Galbete et al. 2009)。當(dāng)評價從多克隆群體分離的單個細(xì)胞克隆中的GFP表達(dá)和轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)吋，在轉(zhuǎn)基因表達(dá)和拷貝數(shù)之間發(fā)現(xiàn)良好的總相關(guān)性(圖3D)。這表示，轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)是含有MAR的質(zhì)粒的雙重轉(zhuǎn)染之后増加的表達(dá)的主要驅(qū)動者。另外，從含有MAR的克隆——具有共整合的非常高的轉(zhuǎn)基因拷貝和MARs數(shù)目——沒有檢測到表達(dá)的顯著降低(圖3E)。因此，得出結(jié)論，MAR能阻止可由共整合的質(zhì)粒的重復(fù)性質(zhì)和/或反義轉(zhuǎn)錄——可歸于該MAR元件有效力的抗沉默性質(zhì)的效應(yīng)——產(chǎn)生的抑制效應(yīng)(Galbete et al. 2009)。然而，平均的表達(dá)水平不總是與拷貝數(shù)完全匹配，如在用dsRED載體的共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)分析單個細(xì)胞克隆吋， 或當(dāng)比較來自第一或第二轉(zhuǎn)染的DNA的GFP表達(dá)時所記錄的(圖加和3C)。這得出這樣的結(jié)論含有MAR的質(zhì)粒的兩次轉(zhuǎn)染之后觀察到的増加的轉(zhuǎn)基因表達(dá)可部分由提高的核輸入和基因組整合和因此轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)——沉默的缺少——來解釋，以及由每個轉(zhuǎn)基因拷貝的較高轉(zhuǎn)基因表達(dá)來解釋，但是取決于轉(zhuǎn)染史和條件，其它的效應(yīng)也可影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)。DNA同源性對質(zhì)粒整合和表達(dá)的影響由于從含有MAR的質(zhì)粒的連續(xù)轉(zhuǎn)染觀察到的高GFP熒光部分是由在單個染色體基因座的増加的轉(zhuǎn)基因整合產(chǎn)生，所以評價該效應(yīng)的分子基礎(chǔ)。例如，第一轉(zhuǎn)染期間含有MAR 的質(zhì)粒的整合可促進(jìn)第二轉(zhuǎn)染期間在相同基因組基因座的第二整合，如可從MAR保持染色質(zhì)在可達(dá)狀態(tài)和因此提供用于同源重組的適當(dāng)?shù)陌械哪芰λA(yù)期的?？蛇x地，從連續(xù)轉(zhuǎn)染觀察到的高的整合的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)可由兩個轉(zhuǎn)染期間導(dǎo)入的質(zhì)粒更有效的連環(huán)化而產(chǎn)生， 其可由細(xì)胞核中高濃度的染色體外附加體介導(dǎo)。人們提出同源重組介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒的大的多聯(lián)體的形成(Folger et al. 1985)，其可導(dǎo)致用基因組DNA重組之后多個質(zhì)粒拷貝的共整合。在后者的模型中，同源重組可發(fā)生在第一和第二轉(zhuǎn)染期間使用的質(zhì)粒上的相似的質(zhì)粒序列，因此轉(zhuǎn)基因整合和表達(dá)的效能將取決于DNA序列同源性。
該后者的概率首先由通過用轉(zhuǎn)基因(GFP或DsRed)、質(zhì)粒主鏈(氨卡青霉素或卡那霉素細(xì)菌抗性)和/或MARs (雞溶菌酶MAR或人類MAR 1-68)的不同組合進(jìn)行連續(xù)轉(zhuǎn)染而分析質(zhì)粒同源性對轉(zhuǎn)基因表達(dá)的影響來評價。圖5顯示MAR、質(zhì)粒同源性和同源重組如何介導(dǎo)高轉(zhuǎn)基因表達(dá)。對于圖5(A)，穩(wěn)定的多克隆細(xì)胞庫通過荷載不同轉(zhuǎn)基因(GFP或DsRed( “RED”))、MAR(針對人類1_68的 MAR1或針對雞溶菌酶MAR的MAR2)、和/或細(xì)菌抗性基因(氨卡青霉素或卡那霉素)的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染而產(chǎn)生，四個獨(dú)立轉(zhuǎn)染的相對平均的GFP熒光被顯示為超過從ー個沒有MAR的轉(zhuǎn)染獲得的熒光的成倍増加。星號顯示GFP表達(dá)的顯著性差異(斯氏t檢驗(yàn)，P <0.05)。對于圖5 (B)，用GFP或MAR1-68GFP質(zhì)粒的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染在親代CHO細(xì)胞系(AA8)和缺乏同源重組(51D1)或非同源末端連接(V3.;3)途徑的突變體中進(jìn)行。將從單一((B)的上圖)或兩個連續(xù)((B)的下圖)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的每個穩(wěn)定的多克隆細(xì)胞庫的平均GFP熒光標(biāo)準(zhǔn)化到從用缺乏MAR的質(zhì)粒單一轉(zhuǎn)染的AA8細(xì)胞獲得的熒光。星號表示GFP表達(dá)的顯著性差異(斯氏 t檢驗(yàn)，P < 0. 05)。從51D1細(xì)胞的雙重轉(zhuǎn)染未獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。結(jié)果顯示不同的MARs、轉(zhuǎn)基因、或細(xì)菌抗性的轉(zhuǎn)染都降低連續(xù)轉(zhuǎn)染通常觀察到的高表達(dá)(圖5A)。當(dāng)利用不同的MARs、轉(zhuǎn)基因和載體元件(MAR1-GFPiMAR2-RED構(gòu)建物)吋， 雙重轉(zhuǎn)染效應(yīng)幾乎被完全消除，這提示需要質(zhì)粒同源性來從連續(xù)轉(zhuǎn)染獲得高表達(dá)。在被稱作同源重組修復(fù)(HRR，ADD REF)的過程中，同源重組常常被引出為雙鏈斷裂的DNA修復(fù)機(jī)制。因此，檢測是否轉(zhuǎn)染之前質(zhì)粒線性化介導(dǎo)從連續(xù)轉(zhuǎn)染獲得的高表達(dá)。圖4(C)顯示DNA構(gòu)象對基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)的影響。為了比較用線性或環(huán)形質(zhì)粒進(jìn)行的単一或連續(xù)轉(zhuǎn)染之后的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平，使用相同等摩爾量的GFP和MAR-GFP環(huán)形DNA 或PvuI-消化的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)染。兩周選擇之后，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞群體的eGFP熒光通過細(xì)胞熒光測定木來分析。曲線顯示GFP熒光水平較用缺乏MAR的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染一次的對照細(xì)胞的熒光水平成倍増加。用線性或環(huán)形質(zhì)粒獲得的熒光值分別以黑色或淡灰色顯示。星號表示 GFP表達(dá)的顯著性差異中的ー些(斯氏t檢驗(yàn)，P < 0. 05)。用環(huán)形質(zhì)粒還觀察到超過轉(zhuǎn)基因表達(dá)的累加的増加，然而，全部表達(dá)較利用線性質(zhì)粒獲得的表達(dá)低(圖4C)，這與同源重組過程中線性DNA的増加的重組基因性質(zhì)一致 (Wong et al. 1986)。 同源重組介導(dǎo)増加的表達(dá)需要質(zhì)粒同源性和雙鏈斷裂以在雙重轉(zhuǎn)染之后達(dá)到較高的表達(dá)水平意味著可能涉及同源重組。轉(zhuǎn)基因被提出以利用稱作非同源末端連接(NHEJ)或同源重組(HR)的兩個拮抗途徑家族而整合進(jìn)細(xì)胞基因組。這些途徑在細(xì)胞周期的特定期期間更活躍，如HR所示例的，HR用于在細(xì)胞周期的S期和G2/M期的DNA復(fù)制期間或之后修復(fù)DNA損傷(Takata et al. 1998)。缺少典型的NHEJ基因的細(xì)胞顯示偏向支持HR的雙鏈斷裂(DSB)修復(fù)，這提示這兩個主要途徑通常競爭以修復(fù)這些DNA損害(Delacote et al. 2002)。因此，激活HR的 ー個方法是抑制或在遺傳上滅活NHEJ，如在酵母和哺乳動物細(xì)胞中所看到的(Delacote et al. 2002，Clikeman et al. 2001，Allen et al. 2002, Pierce et al. 2001)。在由 MAR 和/ 或連續(xù)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的増加的基因表達(dá)中，因此利用在任何一個途徑的關(guān)鍵組分突變的CHO細(xì)胞系直接評價HR相關(guān)機(jī)制的可能含義，該細(xì)胞系因此只對HR或NHEJ是感受態(tài)的。51D1CH0突變體衍生物缺少RAD51鏈轉(zhuǎn)移酶并因此缺少同源重組，而V3. 3CH0細(xì)胞缺少對啟動NHEJ途徑起重要作用的依賴DNA的蛋白激酶DNA-PK的催化活性(Jackson 1997，Hinz et al. 2006，Jeggo 1997)。與沒有MAR的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，全部GFP熒光的3倍増加由野生型親代細(xì)胞系(AA8)的多克隆群體中的MAR介導(dǎo)(圖5B)。然而，在抗生素抗性選擇之后幾乎沒有穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆在51D1細(xì)胞系中存活，且GFP表達(dá)保持非常低。 相比之下，在缺少NHEJ的細(xì)胞中觀察到加重的MAR驅(qū)動的轉(zhuǎn)基因表達(dá)活化，導(dǎo)致當(dāng)與用沒有MAR的GFP表達(dá)載體轉(zhuǎn)染一次的細(xì)胞相比時轉(zhuǎn)基因表達(dá)超過6倍的増加。針對連續(xù)轉(zhuǎn)染記錄到相似的趨勢，因?yàn)榕c親代AA8細(xì)胞相比，來自V3. 3細(xì)胞的GFP 表達(dá)被MAR的存在和連續(xù)轉(zhuǎn)染增加(圖5B，注意上部和下部的圖的不同比例)?？偟膩碚f， 當(dāng)與親代細(xì)胞中對照質(zhì)粒的単一轉(zhuǎn)染相比吋，從用MAR對缺少NHEJ的V3. 3細(xì)胞的兩個連續(xù)轉(zhuǎn)染獲得轉(zhuǎn)基因表達(dá)的35倍増加。相比之下，NHEJ途徑的滅活對缺乏MAR的質(zhì)粒的表達(dá)幾乎沒有影響，這顯示MAR和高HR活性的存在均是獲得高轉(zhuǎn)基因表達(dá)所必需的。一致地， HR缺乏的細(xì)胞產(chǎn)生低表達(dá)水平——在単一轉(zhuǎn)染中MAR較小的作用，而從雙重轉(zhuǎn)染沒有獲得抗生素抗性的克隆。這些結(jié)果闡明HR途徑在連續(xù)的基因轉(zhuǎn)移過程中使用的兩個選擇基因的整合和保持中的重要性。圖5(C)至(E)顯示由用MAR的重復(fù)轉(zhuǎn)染所得的一個提高的表達(dá)的模型。如在圖5(C)和⑶中顯示的圖中所看到的，質(zhì)粒增加的進(jìn)入和基因組整合進(jìn)細(xì)胞核部分地解釋轉(zhuǎn)基因表達(dá)的指數(shù)性増加，該增加由MAR元件和雙重轉(zhuǎn)染過程產(chǎn)生。第一轉(zhuǎn)染之后，MAR的存在可增加轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒之間的同源重組頻率，允許較大串聯(lián)結(jié)構(gòu)的形成和更多質(zhì)?？截惖恼稀４送?，MAR可招募蛋白質(zhì)以朝著開放狀態(tài)重塑染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。如可在圖 5(E)中所看到的，作為第一轉(zhuǎn)染的結(jié)果和細(xì)胞降解區(qū)室可能飽和的結(jié)果，第二轉(zhuǎn)染的質(zhì)?？杀桓行У剞D(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核。MAR元件可起作用以象以前一樣促進(jìn)重組，允許來自兩個轉(zhuǎn)染的同源質(zhì)粒的更好的連環(huán)化。細(xì)胞周期狀態(tài)也是獲得最佳蛋白質(zhì)表達(dá)的參數(shù)。通過當(dāng)細(xì)胞處于Gl期時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，質(zhì)?？稍诟欣谕粗亟M的細(xì)胞周期的較晚期(例如S或G2/M) 中到達(dá)細(xì)胞核，進(jìn)ー步有助于較大質(zhì)粒多聯(lián)體的形成和染色體整合。蛋白質(zhì)分泌低和高生產(chǎn)者CHO克隆產(chǎn)生的重組IgG的鑒定首先，我們研究可影響通過顯示高或低Mab產(chǎn)生水平的CHO細(xì)胞克隆進(jìn)行的IgG 重鏈和輕鏈的表達(dá)和分泌的瓶頸或缺點(diǎn)。產(chǎn)生表達(dá)不同的重組Ig(is的CHO-KlS的各種克隆。圖6描述由高和低重組IgG-生產(chǎn)者CHO克隆表達(dá)的免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的表征。圖6㈧顯示利用抗人類IgG抗體的細(xì)胞內(nèi)(細(xì)胞裂解物)和分泌的IgG(培養(yǎng)基)的蛋白質(zhì)印跡。將高(HP)和低(LP) IgG-生產(chǎn)者CHO-Kl-S進(jìn)行總細(xì)胞提取并在 LaemmliSDS-PAGE 8%上分析。免疫球蛋白重鏈和輕鏈在圖中分別被標(biāo)記為HC和LC。圖 6(B)描述TX-100溶解度分析。將細(xì)胞在含有I^1Triton XlOO的PBS中裂解。以10. 000 X g 離心10分鐘之后，將含有Tx可溶性蛋白質(zhì)的上清液和含有Tx不溶解性蛋白質(zhì)的沉淀物在還原和非還原性SDS-PAGE 8%下分解。圖6 (C)描述IgG的折疊和分泌動力學(xué)的基于放線酮的追蹤分析。將高(HP)和低(LP) IgG-生產(chǎn)者CHO-KlS克隆在存在100 μ M放線酮的情況下培養(yǎng)。在各個時間點(diǎn)，收獲細(xì)胞并在含有TX-100的緩沖液中裂解。然后將Tx溶解的和不溶解的部分在非還原性SDS-PAGE 4-10%上解析。免疫球蛋白的游離的、ニ聚體和裝配中間體復(fù)合體被分別標(biāo)記為游離的HC或游離的LC ； (LC)2和(HC)2 ；HC-LC和IgG。箭號表示適當(dāng)加工的結(jié)構(gòu)，而箭頭表示異常結(jié)構(gòu)。如從圖6可看出的，培養(yǎng)物上清中的Mab滴度根據(jù)過量表達(dá)的Mab蛋白而高度可變。然而，結(jié)果是高度可重現(xiàn)的，ー些Mabs—致地產(chǎn)生低產(chǎn)生細(xì)胞克隆，而其它的一致地產(chǎn)生高產(chǎn)生細(xì)胞克隆。然而，表達(dá)水平與用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒構(gòu)建不相關(guān)，并且它不依賴使用的信號序列，其對所有Mabs實(shí)際上是相同的(數(shù)據(jù)未顯示)。分析每個克隆表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)重鏈和輕鏈(HC和LC)以找到不同克隆的多肽生物合成和IgG分泌水平之間的相關(guān)性。將CHO-KlS克隆在穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生的總細(xì)胞提取物和分泌的 IgG免疫沉淀物在還原條件下通過SDS-PAGE解析。蛋白質(zhì)遷移曲線分別顯示高IgG-生產(chǎn)者克隆12B、16D和S29的HC和LC的預(yù)期的50kDa和25kDa帶。然而，低IgG-生產(chǎn)者CM 和C58表達(dá)的輕鏈以異常高的表觀分子量遷移(圖6A)。當(dāng)分析分泌的蛋白質(zhì)時記錄到同樣的異常行為。在細(xì)胞提取物和分泌的IgG上進(jìn)行的PNGase F介導(dǎo)的去糖基化實(shí)驗(yàn)沒有改變LC遷移率，顯示低生產(chǎn)者的LC的慢的電泳遷移不是由于加入聚糖部分(數(shù)據(jù)未顯示)。為了評價異常LC的生物化學(xué)性質(zhì)，我們在含有triton X-IOO(Tx)的PBS溶液中提取了細(xì)胞內(nèi)HC和LC內(nèi)容物和通過以10. OOOXg離心10分鐘而從Tx不溶解的蛋白質(zhì)中分離む溶解性蛋白質(zhì)。在含有SDS的添加尿素9M的Laemmli’ s緩沖液中完全的蛋白質(zhì)溶解之后，通過還原性SDS-PAGE解析這些部分。如期望的只檢測高IgG-生產(chǎn)者克隆的 LC和HC的Tx溶解性部分(Fig 6⑶泳道)。然而，CM和C58低生產(chǎn)者的LC的重要部分不能通過Tx處理而溶解，表明細(xì)胞內(nèi)沉淀和潛在的多肽交聯(lián)。令人驚奇的是，該LC的 Tx不溶解的部分不能在非還原條件下解析，因?yàn)樗Ａ粼诜e層膠(stacking gel)中，這表明高分子量聚集物和ニ硫鍵的形成。這些數(shù)據(jù)提示LC折疊或裝配過程的缺乏導(dǎo)致它以Tx 抵抗的形式的聚集。然后進(jìn)行基于放線酮的追蹤測定以研究IgG折疊和裝配動力學(xué)以及IgG聚集物在 CHO細(xì)胞克隆中的命運(yùn)。高生產(chǎn)者克隆在非還原條件下的SDS-PAGE分析顯示游離的LC種類的積累和HC和LC ニ聚體的形成。含有HC的種類似乎漸進(jìn)地降低，伴隨地?fù)饺際C-LC復(fù)合體和在完成的IgG四聚體中(圖6C)。相比之下，只在低IgG-生產(chǎn)者的聚集形式內(nèi)檢測到LC(圖1C，Tx-IOO不溶解的圖)或?qū)C摻入裝配的中間體復(fù)合體如HC-LC和在完成的 IgG中(圖6C =Tx-IOO溶解的圖)。有意思的是，去污劑不溶解性LC形式的量隨著時間保持恒定并因此不參與IgG折疊過程(圖6C =Tx-IOO不溶解的圖，Agr-LC)。這證明LC聚集物不勝任任何進(jìn)ー步的折疊和裝配過程。這些結(jié)果引起以下假設(shè)⑴通過大的生物合成和H-和LC的積累，高IgG-生產(chǎn)者的ER折疊結(jié)構(gòu)和分泌能力接近飽和，但是細(xì)胞可仍然進(jìn)行正常地構(gòu)成的Mab的裝配；(2) 低IgG-生產(chǎn)者產(chǎn)生的不勝任裝配的LC聚集物的積累解釋這些克隆的分泌缺陷；和(3) LC 信號肽切割的潛在缺乏和伴隨的低IgG生產(chǎn)者中的LC的聚集，其可表示在ER中多肽的共翻譯易位的缺乏。為了評價低生產(chǎn)者克隆中ER潛在的功能失常，研究了 ER蛋白質(zhì)折疊和應(yīng)激反應(yīng)的不同傳感器的表達(dá)。超過ER折疊能力的重組蛋白的過量表達(dá)已被顯示觸發(fā)ー組細(xì)胞反應(yīng)——被共同地稱作解折疊的蛋白質(zhì)反應(yīng)(UPR)。雖然這些細(xì)胞機(jī)制可起作用以提高ER折疊能力、降低ER應(yīng)激和恢復(fù)ER功能性，但是它們還可降低重組蛋白的產(chǎn)量(Khan SU etal,2008 ；Kang S-ff et al，2006)。例如，UPR之后ERAD (ER相關(guān)的降解)基因表達(dá)的活化可使解折疊或錯誤裝配的ER-保留的重組蛋白靶向到降解途徑。而且，嚴(yán)重的ER應(yīng)激的情況下，不能適應(yīng)它們的蛋白質(zhì)分泌結(jié)構(gòu)的細(xì)胞可觸發(fā)凋亡途徑。為了評價是否重組免疫球蛋白鏈的LC錯誤加工和/或過量表達(dá)可誘導(dǎo)ER應(yīng)激和/或UPR，將低和高生產(chǎn)者克隆培養(yǎng)7天并在培養(yǎng)操作的各個時間進(jìn)行分析。圖7顯示高和低IgG-生產(chǎn)者的ER折疊和UPR結(jié)構(gòu)的鑒定。將高(HP)、低(LP)IgG-生產(chǎn)者克隆和親代細(xì)胞在分批培養(yǎng)中培養(yǎng)。在各個時間點(diǎn)，培養(yǎng)的0、3、5和7天，收獲細(xì)胞。然后利用抗BiP抗體(上面的圖)和抗CHOP抗體(中間的圖)通過蛋白質(zhì)印跡法分析細(xì)胞提取物。蛋白質(zhì)加樣對照通過GAPDH含量來估計(jì)(底部的圖)。CHOP前體和活性形式分別用星號和箭頭表示。蛋白質(zhì)印跡顯示在兩個低生產(chǎn)者克隆中增加的BiP表達(dá)——WR活化的崗哨標(biāo)志。相反，對于高生產(chǎn)者克隆沒有檢測到BiP水平的增加(圖7)。這些結(jié)果提示，表達(dá)錯誤加工LC的低生產(chǎn)者克隆觸發(fā)BiP過量表達(dá)介導(dǎo)的ER應(yīng)激反應(yīng)。相反，高生產(chǎn)者克隆表達(dá)的低水平的BiP蛋白提示，這些細(xì)胞可處理和分泌非常高水平的重組IgG而無需活化UPR級聯(lián)。還分析CHOP促凋亡轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)折疊瓶頸或錯誤折疊不能由UI3R解決時，CHOP促凋亡轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)可被誘導(dǎo)。當(dāng)與不表達(dá)Mab的對照細(xì)胞相比時，低和高IgG-生產(chǎn)者CHO克隆顯示CHOP蛋白的過量表達(dá)(圖7)。有意思的是，CHOP蛋白在兩個低生產(chǎn)者克隆中漸進(jìn)地積累直到培養(yǎng)的第5天，而細(xì)胞CHOP水平和促凋亡途徑在高生產(chǎn)者克隆中似乎被組成性地弓I出。這些觀察結(jié)果暗示，BiP介導(dǎo)的低生產(chǎn)者克隆的WR反應(yīng)導(dǎo)致WR的末期和導(dǎo)致凋亡的細(xì)胞死亡程序的激活。相反，高生產(chǎn)者克隆不觸發(fā)BiP介導(dǎo)的UPR反應(yīng)，盡管CHOP介導(dǎo)的促凋亡反應(yīng)這些克隆中被誘導(dǎo)。這提示，重組Mab的異常和巨大的過量表達(dá)可能已啟動獨(dú)立于主要的ER應(yīng)激傳感器BiP的細(xì)胞死亡程序。還可顯示，不同的IgG-生產(chǎn)者克隆顯示重組IgG蛋白的各種折疊和加工狀態(tài)，在它們的表達(dá)和分泌期間宿主細(xì)胞的不同的細(xì)胞和分子反應(yīng)被誘導(dǎo)。因此，這些各種低和高生產(chǎn)者克隆均可面對可消極地影響容易或難以表達(dá)的重組蛋白的工業(yè)生產(chǎn)的局限性。我們因此繼續(xù)利用這些高和低IgG-生產(chǎn)者CHO克隆作為細(xì)胞模型來鑒定新的方法以利用生物工程方法提高重組IgG產(chǎn)生。糾正蛋白質(zhì)加工和拯救有效的分泌的策略低生產(chǎn)者克隆中LC溶解性的缺乏和它緩慢的遷移率提示肽信號的存在，并且它爭辯支持LC前蛋白的無效的靶向和/或錯誤加工至ER區(qū)室。因此，可能重組IgG的IgG輕鏈的信號肽錯誤加工和聚集可由不適當(dāng)?shù)陌邢蚝?或易位進(jìn)ER產(chǎn)生。最近的研究提示，將要表達(dá)ER應(yīng)激相關(guān)的蛋白質(zhì)如BiP的宿主細(xì)胞系的生物工程可提高異源蛋白質(zhì)的分泌(Peng and Μ. Fussenegger, 2009) 0然而，這不是可能在我們的情況下成功的選擇，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)ER應(yīng)激蛋白BiP在低生產(chǎn)者克隆中已經(jīng)被自發(fā)地上調(diào)。通過蛋白質(zhì)易位結(jié)構(gòu)組分的過量表達(dá)而提高蛋白質(zhì)分泌的嘗試還未在哺乳動物細(xì)胞系中被成功滿足。例如，超過正常水平的SR14表達(dá)沒有提高來自培養(yǎng)的人類細(xì)胞的分泌效率(Lakkaraju et al. ,2008) 不考慮這些結(jié)果，進(jìn)行了嘗試以通過表達(dá)信號識別顆粒(SRP)蛋白或與信號識別顆粒(SRP)相關(guān)的蛋白質(zhì)來增加蛋白質(zhì)分泌，信號識別顆粒是結(jié)合親和性信號肽和介導(dǎo)SRP-RNA-核糖體復(fù)合體?？康紼R膜上的多蛋白-RNA復(fù)合體。具體地，(1)人類SRP14亞基，(2)參與細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的FADD(FAS相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域)蛋白的顯性負(fù)性突變體被表達(dá)，以及⑶不相關(guān)的GFP蛋白作為對照。利用兩個克隆細(xì)胞系，一個表達(dá)低產(chǎn)量的單克隆抗體(例如英夫利昔單抗(infliximab)——一個難以表達(dá)的蛋白質(zhì))和一個表達(dá)高產(chǎn)量MAb (例如曲妥珠單抗——一個容易表達(dá)的蛋白質(zhì))——包含相同信號肽，通過電穿孔(MICR0P0RAT0R，1250V，20ms脈沖時間和3個脈沖)用5yg編碼指示的蛋白質(zhì)的質(zhì)粒再轉(zhuǎn)染5. IX IO5細(xì)胞。致微孔(Microporation)之后，將細(xì)胞加入到添加8mM谷氨酰胺和2 X HT的SFM4CH0培養(yǎng)基(HYCL0NE)中。兩天之后，以選擇標(biāo)記的適當(dāng)稀釋GOOyg/ml G418)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到T75平板中，并將細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)。大約兩周之后，抗藥細(xì)胞在搖瓶中擴(kuò)大，將SRP14-表達(dá)群體稀釋用于有限稀釋過程中的單細(xì)胞克隆化。以下顯示的結(jié)果用表達(dá)指示的蛋白質(zhì)的細(xì)胞克隆產(chǎn)生的。通過SRP14表達(dá)的Mab產(chǎn)生的增加首先，測定細(xì)胞內(nèi)HC和LC的Tx溶解性和表達(dá)SRP相關(guān)蛋白質(zhì)的高和低IgG-生產(chǎn)者克隆的分泌水平。圖8顯示，產(chǎn)生重組IgG的CHO克隆的SRP14轉(zhuǎn)染消除輕鏈聚集并拯救IgG分泌。用為各種對照或候選者蛋白——期望拯救重組IgG的正確加工和分泌——編碼的cDNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)染兩個不同的CHO克隆——產(chǎn)生高(F9)和低(A37)重組IgG的CHO克隆(A =GFP ；G :SRP14 ；H =FADD-DN)。在圖8 (A)中將共表達(dá)蛋白質(zhì)A、G或H的低和高生產(chǎn)者CHO克隆的細(xì)胞提取物的TX-100-溶解的和不溶解的部分在4%-10%梯度SDS-PAGE上分析，并通過化學(xué)發(fā)光來檢測IgG蛋白。淺色箭頭顯示低IgG生產(chǎn)的游離的和未加工的LC(淺色箭頭)和未加工的聚集的LC。G或H蛋白的轉(zhuǎn)染之后，低IgG生產(chǎn)者克隆生產(chǎn)的游離的和適當(dāng)加工的LC用黑色箭頭標(biāo)記。圖8(B)顯示用SRP14表達(dá)載體轉(zhuǎn)染之前(_)和之后(G) F9和A37克隆的比生產(chǎn)率分布，如從在細(xì)胞培養(yǎng)基上清液上進(jìn)行的分泌性Mabs的ELISA測定所評價的。有意思的是，蛋白質(zhì)印跡分析顯示全長人類SRP14(基因庫登錄號X73459. 1，其以其全部通過引用被并入本文)的過量表達(dá)導(dǎo)致促LC轉(zhuǎn)化成象勝任折疊和與HC裝配的正常LC成熟形式遷移的種類，而HC的遷移不受影響(圖8A，上圖的泳道G，參見箭頭)。更引人側(cè)目地，SRP14過量表達(dá)完全消除TX不溶解的部分中的LC聚集(圖8A，下圖)。對照GFP蛋白的表達(dá)沒有提高蛋白質(zhì)的溶解性，也沒有恢復(fù)LC的正確加工(圖8A，泳道A)。SRP14的表達(dá)對從高生產(chǎn)者克隆獲得的HC和LC遷移模式?jīng)]有影響，但是與對照相比游離的HC和LC的量和完全裝配的IgG的量有點(diǎn)增加(圖8A，F(xiàn)P-F9克隆，泳道G)。為了測定SRP14的外源性表達(dá)對重組IgG滴度的影響，然后通過ELISA分析上清液細(xì)胞培養(yǎng)物以對適當(dāng)裝配的Mab進(jìn)行探測。低IgG-生產(chǎn)者中SRP14的過量表達(dá)導(dǎo)致來自低生產(chǎn)者克隆的IgG分泌的顯著增加(圖:3B)。從低生產(chǎn)者細(xì)胞(LP-G群體)分離的克隆顯示比生產(chǎn)率(Qp)平均7倍增加。而且，SRP14的外源性表達(dá)的確還提高HP克隆的分泌，因?yàn)榭捎^察到Qp 30%的增加(HP-G克隆)。有意思的是，分離單個的克隆，該克隆對于難以和容易表達(dá)Mab可以以相同水平表達(dá)IgG(> 40pcd)，這提示易位中隨后的步驟變得速度受限。外源性SRP14表達(dá)的作用是意想不到的。假定該亞基在延伸停滯中的功能由SRP介導(dǎo)的，該表達(dá)在難以產(chǎn)生的IgG生產(chǎn)者克隆中可能已經(jīng)引起LC延伸的延長的延遲。低生產(chǎn)者克隆的Mabs的適當(dāng)加工可需要意想不到地長的翻譯中止，可能因?yàn)榻閷?dǎo)這些特定IgGs易位到ER上的復(fù)合體的停靠動力學(xué)可以較其它分泌性蛋白質(zhì)低。外源的SRP14組分進(jìn)行的翻譯動力學(xué)的調(diào)節(jié)作為結(jié)果可影響ER中促LC的共易位和因此恢復(fù)信號肽的有效加工。另一個對照蛋白——即具有死亡結(jié)構(gòu)域的FAS相關(guān)的蛋白(FADD)——的作用還通過表達(dá)FADD的顯性負(fù)性突變體(FADD-DN)來評價(Newton，Harris et al. 1998)。出乎意料地，還發(fā)現(xiàn)FADD-DN的過量表達(dá)消除LC聚集，如對于SRP14所發(fā)現(xiàn)的(圖8A，下圖，泳道H)。這不是期望的，因?yàn)橐阎狥ADD與通過形成誘導(dǎo)死亡的信號傳導(dǎo)復(fù)合物(DISC)而在細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的死亡受體(DR)蛋白家族相關(guān)聯(lián)。細(xì)胞質(zhì)定位的FADD的主要生理作用因此是觸發(fā)細(xì)胞死亡，并因此進(jìn)行了嘗試以滅活FADD以阻止CHO細(xì)胞凋亡。然而，依賴修飾和亞細(xì)胞定位，最近的工作已將多個非凋亡活性歸因于FADD。例如，F(xiàn)ADD磷酸化和核進(jìn)入調(diào)節(jié)基因表達(dá)和活化細(xì)胞周期和有絲分裂的進(jìn)展(Tourneur and Chiocchia 2010)。此外，被稱作RTN3的ER結(jié)合的蛋白可將FADD招募到ER膜，并且FADD自身可通過非典型的基于微泡的途徑來分泌。然而，到目前為止，通過ER的蛋白質(zhì)分泌調(diào)節(jié)中還未牽涉FADD。我們的發(fā)現(xiàn)因此可顯示在提高過量表達(dá)的Mabs的加工的背景中FADD的新功能。可選地，F(xiàn)ADD-DN的表達(dá)可已經(jīng)使翻譯結(jié)構(gòu)飽和，以某種方式減慢該過程和允許適當(dāng)?shù)陌邢駿R。然而，均未發(fā)現(xiàn)FADD-DN和GFP過量表達(dá)顯著恢復(fù)高水平的IgG分泌。因此，只有SRP14的外源性表達(dá)能恢復(fù)Mab產(chǎn)生。因此，假設(shè)SRP-復(fù)合體功能的調(diào)節(jié)對ER腔易位子配偶體的募集和/或?qū)π潞铣傻?neosynthetizecOLC與ER折疊蛋白伴侶的相互作用可以是特別需要的。非常高的Mab分泌水平保持超過6個月，這表示它是SRP14-表達(dá)細(xì)胞的穩(wěn)定的性質(zhì)。在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中，每升培養(yǎng)基獲得超過8克的Mab，這是我們從未獲得的無需用于該難以表達(dá)的蛋白質(zhì)的SRP14表達(dá)的大滴度。SRP14的表達(dá)之后獲得的好的結(jié)果推動可有助于ER中新生多肽適當(dāng)易位的其它蛋白質(zhì)作用的測試。還測試信號識別顆粒(SRP)——其是結(jié)合親和性-信號肽和介導(dǎo)SRP-RNA-核糖體復(fù)合體停靠到ER膜上的多蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合體——的其它蛋白質(zhì)，或與SRP功能有關(guān)的蛋白質(zhì)。具體地，我們表達(dá)(1)人類SRPM亞基，試圖增加信號序列識別，(2)人類SRP9和/或SRP14亞基，因?yàn)檫@兩個多肽在體內(nèi)形成復(fù)合體，以可能減慢翻譯，(3)試圖增加易位結(jié)構(gòu)能力的人類SRP受體(SR)亞基α和β，和(4)易位子人類亞基(Transl)，以可能提高ER中的易位。圖9描述表達(dá)SRP9、SRP14、SRP54、SR和易位子的各種組合的CHO細(xì)胞庫中Mab產(chǎn)生的增加。將低生產(chǎn)者A37克隆用驅(qū)動指示的候選者蛋白表達(dá)的cDNA構(gòu)建物進(jìn)行轉(zhuǎn)染。通過ELISA分析培養(yǎng)物上清液，并測定Mab分泌的滴度。
如可從圖所看出的，SRP14或SRPM的表達(dá)導(dǎo)致Mab分泌的強(qiáng)有力的增加，而SR和Transl導(dǎo)致分泌的較小但仍然顯著的增加，而單獨(dú)SRP9沒有顯著增加表達(dá)(圖9，數(shù)據(jù)未顯示)。還測試這些蛋白質(zhì)的組合。通過SRP14和/或M的表達(dá)(SRP9+SRP14+SRPM泳道)，SRP9完全消除積極的作用，這指示不是任何SRP蛋白的簡單表達(dá)導(dǎo)致提高的分泌。SR表達(dá)適當(dāng)?shù)卦黾覵RP14和Transl單獨(dú)介導(dǎo)的作用，然而它強(qiáng)烈地增加存在SRP 9、14和54 (比較SRP9+SRP14+SRP54泳道和SRP9+SRP14+SRP54+SR泳道)時獲得的分泌。然而，當(dāng)過量表達(dá)iTransl加上SRP14和StUSRPH+SR+I^ransl對SRP14+SR)時獲得分泌的最高的增加。SRP14、SRPM、SR和Transl的其它組合也將有助于提高蛋白質(zhì)分泌對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而易見的，并且所有這樣的組合因此包括在本發(fā)明中。材料和方法I.轉(zhuǎn)基因整合和表達(dá)質(zhì)粒和構(gòu)建物pGEGFP對照含有SV40早期啟動子、增強(qiáng)子和來自驅(qū)動來自pEGFP_Nl (CL0NTECH)eGFP基因表達(dá)的pGL3 G3ROMEGA)的載體骨架。pPAG01SV40EGFP由pGEGFP對照的SV40早期啟動子的雞溶菌酶MAR片段上游的插入產(chǎn)生(Girod et al. 2005)。利用DNA結(jié)構(gòu)性質(zhì)通過SMAI^can程序鑒定人類MAR 1-68。它在pBluescript中從人類細(xì)菌人工染色體被克隆，然后插入到SV40早期啟動子上游的pGEGFP對照，導(dǎo)致pl_68 (NcoI filled) SV40EGFP質(zhì)粒(Girod et al. 2007)。在CMV啟動子(包括增強(qiáng)子)的控制下，從pGL3_basic (PR0MEGA)中的pCMV-DsRed (CL0NTECH)，通過插入 DsRed 基因而建立 pGL3-CMV_DsRed。然后通過用 BspHI消化兩個質(zhì)粒交換pGL3-CMV-DsRed的氨卡青霉素基因和來自pCMV-DsRed(CL0NTECH)的卡那霉素抗性基因來建立pGL3-CMV-DsRed-kan。然后，將雞溶菌酶或人類1-68MAR插入到pGL3-CMV-DsRed-kan質(zhì)粒。它們在pGL3-CMV-DsRed_kan CMV啟動子的上游，作為含有雞溶菌酶片段的KpnI/Bglll片段，或作為KpnI/BamHI人類1-68MAR片段被插入，分別導(dǎo)致pPAG01GL3-CMV-DsRed和 pl_68(NcoI)filledGL3-CMV_DsRed。細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染將CHO DG44 細(xì)胞系(Urlaub 1983)在添加 HT(GIBCO)和 10%胎牛血清(FBS，GIBC0)的DMEM :F12 (GIBCO)中培養(yǎng)。親代CHO細(xì)胞AA8、缺乏NHEJ的細(xì)胞V3. 3和缺乏HR的細(xì)胞 51D1 (Adayapalam et al. ,2008)由 Dr. Fabrizio Palitti 友好提供并在添加 10%胎牛血清和抗生素的DMEM :F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。根據(jù)制造廠商的說明書(INVITR0GEN)，利用Lipofect-AMINE 2000對這些細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染(瞬時轉(zhuǎn)染)后一天、兩天或三天，利用熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)分析GFP或DsRed熒光水平。表達(dá)GFP和/或DsRed的CH0-DG44細(xì)胞的穩(wěn)定庫通過抗性質(zhì)粒pSVpuro (CL0NTECH)的共轉(zhuǎn)染獲得。用針對 CH0-DG44 (針對 AA8、V3. 3 和 51D1，8 μ g/ml 嘌呤霉素)的5 μ g/ml嘌呤霉素選擇兩周之后，通過FACS分析細(xì)胞。多重轉(zhuǎn)染如下進(jìn)行第一轉(zhuǎn)染之后，如上所述將細(xì)胞第二次轉(zhuǎn)染，除了抗性質(zhì)粒攜帶另一個抗性基因，pSV2neo(CL0NTECH)。除非本文另外指出，將兩個轉(zhuǎn)染定時以跟隨細(xì)胞周期。第二轉(zhuǎn)染之后二十四小時，將細(xì)胞傳代并用250 μ g/ml G418和/或2、5yg/ml嘌呤霉素(針對AA8、V3. 3和5AlDl，250y g/ml G418和4 μ g/ml嘌呤霉素)選擇。選擇3周之后，通過FACS分析GFP和/或DsRed表達(dá)。熒光激活細(xì)胞分選eGFP和DsRed蛋白的瞬時表達(dá)在轉(zhuǎn)染之后24h、48h或72h利用FACScalibur流式細(xì)胞儀(BECTON DICKINSON)來定量，而抗生素選擇至少2周之后測定穩(wěn)定細(xì)胞庫的表達(dá)。將細(xì)胞用PBS洗，在胰蛋白酶-EDTA中收獲、集中并在無血清的合成的ftx)CH05培養(yǎng)基(CAMBREX公司)中重懸浮。熒光分析在FACScalibur流式細(xì)胞儀(BECTON DICKINSON)上獲得，對于瞬時表達(dá)具有GFP通道(FL-I)上350V和DsRed通道(FLI)上450V的設(shè)定，而FL-1M0V和FL-3380V的設(shè)定用于分析穩(wěn)定的表達(dá)。對于穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染，獲得100，000個事件，對于瞬時轉(zhuǎn)染，獲得10’ 000個事件。利用WinMD軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。細(xì)胞周期分析用碘化丙啶(PI)染色DNA之后，在指定的時間，通過CHO細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期狀態(tài)。將細(xì)胞首先用(PBS)洗、受胰蛋白酶作用(trypsinized)和通過在微量離心機(jī)中以1500rpm離心5min而在Iml生長培養(yǎng)基中收獲。另外的PBS清洗之后，在渦旋中的攪拌下通過滴加500μ 1冷的70%乙醇到細(xì)胞懸浮液而用乙醇固定之前將細(xì)胞重懸浮于Iml PBS中。將樣品在_20°C溫育30分鐘并將細(xì)胞如之前一樣離心。將得到的細(xì)胞沉淀重懸浮于500 μ 1冷的PBS中，補(bǔ)充50 μ g/ml RNaseA,將DNA在暗處用40 μ g/ml PI染色30分鐘。然后將細(xì)胞用PBS洗、離心和在FACScalibur流式細(xì)胞儀(FL-3通道；BECTONDICKINSON)中分析之前重懸浮于500 μ 1 ProCH05培養(yǎng)基(CAMBREX公司)。每個樣品獲取10，000個事件。熒光原位雜交如在Derouazi et al. (2006)和 Girod et al. (2007)中所描述的，進(jìn)行 FISH(熒光原位雜交)。簡言之，中期染色體伸展從用或不用1-68人類MAR轉(zhuǎn)染的細(xì)胞獲得并用秋水仙素處理。利用通過沒有MAR的PSV40GEGFP質(zhì)粒的直接切口平移制備的雜交探針進(jìn)行熒光原位雜交。細(xì)胞核和DNA的分離瞬時轉(zhuǎn)染(或多個)之后一天、兩天或三天，從6孔板中生長的增殖和匯合的CH0DG44細(xì)胞分離細(xì)胞核。將1 X IO6細(xì)胞用冷的PBS洗兩次，重懸浮于2體積的冷緩沖液AdOmM HEPES(pH 7. 5) UOmM KClU. 5mM Mg(OAc)2、2mM二硫蘇糖醇)中并允許在冰上溶脹IOmin0利用杜恩斯勻漿器使細(xì)胞分裂。將勻漿在4°C以2000rpm離心aiiin。然后將破裂的細(xì)胞沉淀物重懸浮于150 μ 1 PBS和放置在緩沖液B (30%蔗糖、50mM Tris-HCl (pH 8.3)、5mM MgCl2、0. ImM EDTA)的墊上，并以1200g離心9min。將細(xì)胞核沉淀物重懸浮于200 μ 1緩沖液以40%甘油、501111 Tris-HCl (ρΗ8. 3)、5mM MgCl2、0. ImM EDTA)并在 _80°C冷凍儲存直到需要時(Milligan et al. 2000)。利用來自QIAGEN的DNeasy Tissue試劑盒從CHO DG44穩(wěn)定的細(xì)胞庫或從分離的細(xì)胞核分離總細(xì)胞DNA。對于穩(wěn)定的細(xì)胞庫，收集在6孔板中生長的IX IO6個匯合的CHODG44細(xì)胞。根據(jù)制造廠商的從培養(yǎng)的動物細(xì)胞分離總DNA的說明書進(jìn)行DNA提取。對于分離的細(xì)胞核，在遵照與對于穩(wěn)定細(xì)胞系相同的方案之后開始DNA提取之前，首先將冷凍的細(xì)胞核沉淀物解凍并以300g離心5min以去除緩沖液C。轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)測定核定量PCR
為了測定基因組中整合的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)，利用來自EUROGENTEC Inc.的SYBRGreen-Taq聚合酶試劑盒和ABI Prism 7700PCR機(jī)器通過定量PCR來分析大約6ng基因組 DNA。以下引物用于定量 GFP DNA GFP-For :ACATTATGCCGGACAAAGCC 和 GFP-Rev TTGTTTGGTAATGATCAGCAAGTTG,而引物 GAPDH-For CGACCCCTTCAT-TGACCTC 和 GAPDH-Rev CTCCACGACATACTCAGCACC用于擴(kuò)增GAPDH基因。如先前所描述的，計(jì)算GFP靶基因拷貝數(shù)相對于GAPDH參考基因拷貝數(shù)的比(Karlen et al. 2007)。為了測定轉(zhuǎn)染之后輸入細(xì)胞核的轉(zhuǎn)基因，利用與上面相同的GFP和GAPDH引物對，對從純化的細(xì)胞核提取的DNA進(jìn)行定量PCR。對于小鼠基因組，估計(jì)用作參考的GAPDH基因和假基因拷貝的數(shù)目，因?yàn)镃HO基因組序列還未得到。用通過小鼠基因組上GAPDH引物產(chǎn)生的190bp擴(kuò)增子的DNA序列的NCBI軟件進(jìn)行的BLAST分析進(jìn)行比對，這給出了每個單倍體基因組88命中(hits)的數(shù)值。因?yàn)镃HO DG44是近二倍體細(xì)胞(Derouazi et al. 2006)，所以我們估計(jì)176個拷貝GAPDH基因和假基因存在于CHO DG44細(xì)胞基因組。該數(shù)值用作標(biāo)準(zhǔn)化參考以測定GFP轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)。共焦顯微術(shù)將pGEGFP對照和pl_68 (NcoI填充的)SV40EGFP質(zhì)粒根據(jù)制造廠商的方案通過Label IT Tracker TH-羅丹明試劑盒用羅丹明標(biāo)記或通過Label IT Tracker Cy 5試劑盒(MIRUS，MIRUSBI0)用Cy5標(biāo)記，并通過乙醇沉淀來純化。對于轉(zhuǎn)染，根據(jù)供給者的說明書用Lipofectamine 2000試劑(INVITR0GEN)進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染之后3、6和21h，去除培養(yǎng)基并將細(xì)胞用4%多聚甲醛在室溫固定15min。當(dāng)指示時，在固定之前根據(jù)制造廠商的說明書用LysoTracker Red DND_99(分子探針，INVITR0GEN)以75nM終濃度將細(xì)胞處理30min，以染色酸性的細(xì)胞器(例如，內(nèi)體和溶酶體)。然后將固定的細(xì)胞用PBS洗兩次并在DAPI/Vectashied溶液中封固以染色細(xì)胞核。利用配備63XNA 1. 4平視消色差物鏡的CARL ZEISS LSM 510Meta倒置共焦激光掃描顯微鏡捕獲熒光和明視野圖像。從蓋玻片的底部到細(xì)胞的頂部獲得Z系列圖像。每個8位(bit) TIFF圖像被轉(zhuǎn)移到ImageJ軟件以定量每個目的區(qū)的總亮度和像素面積。對于數(shù)據(jù)分析，將細(xì)胞溶膠Si(Cyt)、細(xì)胞核Si(Mic)和溶酶體Si (Iys)中每個簇的像素面積在每個XY平面分開合計(jì)。將這些值(S'h^cythS'hjOmc)和S’ ^j(Iys)分別地)通過所有Z系列圖像和指示的S(cyt)、S(nUC)和S(Iys)分別進(jìn)一步合計(jì)。細(xì)胞中標(biāo)記的pDNA的簇的總像素面積，S (tot)，被計(jì)算為S (cyt)、S(Mic)和S(Iys)之和。每個區(qū)室中的pDNA部分被計(jì)算為F(k) = S (k)/S (tot)，在那里代表每個亞細(xì)胞區(qū)室(細(xì)胞核、細(xì)胞溶膠或溶酶體)。II.轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物分泌質(zhì)粒和構(gòu)建物表達(dá)載體含有來自Transposon Tn3 (AmpR)的細(xì)菌β -內(nèi)酰胺酶基因——給予氨卡青霉素抗性——和細(xì)菌ColEl復(fù)制起點(diǎn)。作為pGL3對照的衍生物(PR0MEGA)，載體的終止子區(qū)負(fù)載定位于SV40多腺苷酸化信號下游的SV40增強(qiáng)子。人類促胃液素終止子已在SV40多聚腺苷酸信號和SV40增強(qiáng)子之間被插入。每個載體還包括在SV40啟動子控制下位于表達(dá)盒側(cè)翼的兩個人類168SGE和整合的嘌呤霉素抗性基因。所有載體在hGAPDH啟動子的控制下編碼GOI (圖10)。遵從制造廠商的說明書(ROCHE)利用Pwo SuperYield DNA聚合酶試劑盒、人類通用cDNA作為模板(BioChain )和CDS的5'和3'末端的特異引物(MICROSYNTH AG，瑞士，參見表1)——5'尾攜帶用于克隆進(jìn)表達(dá)載體的相容的限制位點(diǎn)，通過PCR來擴(kuò)大不同克隆的轉(zhuǎn)基因。將PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體通過適當(dāng)?shù)南拗菩悦?NEW ENGLAND BIOLABS或PROMEGA)消化。將消化的DNA在w/v瓊脂糖(EUR0BI0，CHEMIE BRUNSCHWEIG AG)凝膠上電泳。在不損傷DNA的制備型UV燈下(UL-6L，VILBER L0URMAT)通過可視化將載體帶和消化的PCR產(chǎn)物從凝膠切掉，轉(zhuǎn)移到1. 5mL微管中，并遵從制造廠商的說明書利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(WIZARD SVGel 和 PCR CleanUp System , PROMEGA)純化。遵從制造廠商的說明書，利用LigaFast 快速DNA連接系統(tǒng)(PROMEGA)將純化的片段(消化Wklexis 表達(dá)載體和PCR產(chǎn)物)在IOyL的終體積中于RT(=室溫)持續(xù)5min連接在一起。遵從制造廠商的說明書，全部連接混合物用于轉(zhuǎn)化50 μ L感受態(tài)DH5 α細(xì)胞(INVITR0GEN)。新建立的質(zhì)粒的完整性和正確結(jié)構(gòu)通過限制性分析來檢查。一個細(xì)菌克隆在振動的管中的5mL LB+100yg/mL氨卡青霉素中擴(kuò)大，用于質(zhì)粒DNA的大量提取。遵從制造廠商的說明書，利用WIZARD Plus SVMinipr印s試劑盒(PROMEGA)來提取質(zhì)粒。質(zhì)粒的完整性通過測序GOI和相關(guān)的側(cè)翼序列來確認(rèn)。確認(rèn)之后，在添加100yg/mL氨卡青霉素的LB中用標(biāo)準(zhǔn)的DNA分離試劑盒(JETSTAR 2.0，GEN0MED)從150mL過夜培養(yǎng)物進(jìn)行載體的大量制備以獲得非常純的質(zhì)粒DNA。純化之后將DNA重懸浮于300 μ L無菌去離子水中。通過PvuI消化進(jìn)行線性化，利用Quant-iT PicoGreen dsDNA測定試劑盒(INVITR0GEN/分子探針)進(jìn)行DNA定量。表1 :PCR反應(yīng)中使用的以擴(kuò)增不同的目的轉(zhuǎn)基因的引物
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因表達(dá)的方法，包括(a)提供真核生物，優(yōu)選哺乳動物的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞已被修飾或處理以在所述細(xì)胞中增加同源重組(HR)，降低非同源末端連接(NHEJ)和/或提高HR/NHEJ比，和(b)用至少一種包括所述轉(zhuǎn)基因的載體，并任選地，用基質(zhì)附著區(qū)(MAR)元件，轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞，其中所述MAR元件以順式或反式提供給所述轉(zhuǎn)基因。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中(b)中所述的轉(zhuǎn)染是隨后的轉(zhuǎn)染，并在用核酸如載體或核酸片段的最初的轉(zhuǎn)染之后。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述細(xì)胞的細(xì)胞群體的細(xì)胞周期被同步。
4.權(quán)利要求2或3所述的方法，其中所述最初和隨后的轉(zhuǎn)染每次發(fā)生在當(dāng)所述群體的多數(shù)所述細(xì)胞在所述細(xì)胞周期的Gl期時。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述細(xì)胞群體的大于30%、大于31^^32^^33%, 34%、35%、36%、36%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44% 或 45% 的所述細(xì)胞處于 Gl 期。
6.權(quán)利要求3和之后權(quán)利要求中任一個所述的方法，其中通過使所述細(xì)胞群體經(jīng)受化學(xué)或溫度處理，所述細(xì)胞周期被同步。
7.權(quán)利要求2或之后權(quán)利要求中任一個所述的方法，其中在所述初始轉(zhuǎn)染之前給予所述細(xì)胞HR酶、HR激活劑和/或NHEJ抑制劑。
8.以上權(quán)利要求中任一個所述的方法，其中所述細(xì)胞是重組的真核宿主細(xì)胞并包括編碼HR酶、HR激活劑和/或NHEJ抑制劑的轉(zhuǎn)基因序列和/或其中所述細(xì)胞的NHEJ或HR基因被突變。
9.以上權(quán)利要求中任一個所述的方法，其中所述細(xì)胞是重組的真核宿主細(xì)胞，并且所述細(xì)胞的基因組被突變以使NHEJ失活，以增加至少一個HR酶、至少一個HR激活劑和/或至少一個NHEJ抑制劑的表達(dá)或活性。
10.權(quán)利要求2或之后權(quán)利要求中任一個所述的方法，其中所述最初轉(zhuǎn)染的核酸是至少一個包括轉(zhuǎn)基因的載體，其中所述最初轉(zhuǎn)染的所述至少一個所述載體和所述至少一個隨后轉(zhuǎn)染的至少一個載體在整合進(jìn)所述細(xì)胞基因組之前和/或之后形成串聯(lián)結(jié)構(gòu)。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中所述最初轉(zhuǎn)染的至少一個載體和所述隨后轉(zhuǎn)染的所述至少一個載體形成整合進(jìn)所述細(xì)胞基因組的串聯(lián)結(jié)構(gòu)，其中所述串聯(lián)結(jié)構(gòu)包括所述轉(zhuǎn)基因的至少200、300、400、500或600個拷貝。
12.以上權(quán)利要求中任一個所述的方法，其中所述細(xì)胞的所述HR/NHEJ比比分別不包括所述轉(zhuǎn)基因序列和未被突變的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的比高達(dá)2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30 倍，或其中所述NHEJ活性等于0。
13.以上權(quán)利要求中任一個所述的方法，其中所述至少一個隨后的轉(zhuǎn)染之后，整合進(jìn)所述細(xì)胞基因組的所述轉(zhuǎn)基因的整合拷貝數(shù)比代表通過用(b)所述的載體直接轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞獲得的整合拷貝數(shù)的參考值大兩倍。
14.權(quán)利要求2和隨后的權(quán)利要求中任一個所述的方法，其中所述至少一個最初轉(zhuǎn)染是單一轉(zhuǎn)染。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述最初轉(zhuǎn)染的所述核酸是包括MAR元件和所述轉(zhuǎn)基因的載體，其中，所述最初轉(zhuǎn)染之后，所述轉(zhuǎn)基因的表達(dá)達(dá)到最初的水平，其中，所述隨后的轉(zhuǎn)染之后，所述轉(zhuǎn)基因的表達(dá)達(dá)到隨后的水平，該水平超過累加的，優(yōu)選，單個隨后的轉(zhuǎn)染之后，超過所述最初水平的兩倍、三倍或四倍。
16.權(quán)利要求14所述的方法，其中(a)中的所述核酸是包括MAR元件和所述轉(zhuǎn)基因的載體，其中，所述最初轉(zhuǎn)染之后，整合進(jìn)所述細(xì)胞基因組的所述轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)等于(n)，其中，至少一個隨后的轉(zhuǎn)染之后，整合進(jìn)所述基因組的所述轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)大于2(n)、3(n)或 4 (η)。
17.權(quán)利要求15或16所述的方法，其中所述至少一個隨后的轉(zhuǎn)染是單一轉(zhuǎn)染。
18.權(quán)利要求15或16所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因作為串聯(lián)結(jié)構(gòu)在單個基因座被整合進(jìn)所述細(xì)胞的基因組。
19.以上權(quán)利要求中任一個所述的方法，其中(b)中的所述MAR元件改善表達(dá)，基本上或完全防止來自包括所述轉(zhuǎn)基因的載體的多重拷貝的共整合的抑制效應(yīng)。
20.權(quán)利要求2和之后權(quán)利要求中任一個所述的方法，其中所述至少一個隨后轉(zhuǎn)染的所述載體的超過50 %、60 %、70 %、80 %被運(yùn)送進(jìn)細(xì)胞核。
21.以上權(quán)利要求中任一個所述的方法，其中，所述最初的轉(zhuǎn)染之后，達(dá)到轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的最初水平和最初的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)，其中，所述至少一個隨后的轉(zhuǎn)染之后，所述轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的水平增加到隨后的水平，所述最初轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)增加到隨后的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)， 其中轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的所述第一和第二水平之間的增加超過所述最初的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)和所述隨后的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)之間的增加20 %、30 %、40 %、50 %或60 %。
22.以上權(quán)利要求中任一個所述的方法，其中所述至少一個第一轉(zhuǎn)染的所述載體的所述載體序列與至少所述隨后轉(zhuǎn)染的第一個的所述載體的載體序列具有100%或至少95%、 90 %、85 %或80 %的序列同一性。
23.權(quán)利要求2或之后權(quán)利要求中任一個所述的方法，其中所述最初轉(zhuǎn)染的所述載體包括MAR元件，所述MAR元件與至少所述隨后轉(zhuǎn)染的第一個的載體的MAR元件具有100 %或至少95%、90%、85%或80%的序列同一性。
24.權(quán)利要求2或之后權(quán)利要求中任一個所述的方法，其中所述最初轉(zhuǎn)染的所述載體包括轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn)基因與至少所述隨后的轉(zhuǎn)染的第一個的載體的所述轉(zhuǎn)基因具有100% 或至少95 %、90 %、85 %或80 %的序列同一性。
25.以上權(quán)利要求中任一個所述的方法，其中所述MAR元件作為(b)中所述載體的部分以順式被提供。
26.以上權(quán)利要求中任一個所述的方法，其中(b)中所述至少一個MAR元件作為(b)中所述載體的部分以順式被提供，并且所述至少兩個MAR元件位于所述轉(zhuǎn)基因側(cè)翼。
27.以上權(quán)利要求中任一個所述的方法，其中所述MAR元件位于所述轉(zhuǎn)基因的啟動子/ 增強(qiáng)子序列的上游。
28.以上權(quán)利要求中任一個所述的方法，其中所述MAR序列與SEQID N0s:l_3具有至少90%的序列同一性或是其變體。
29.一種重組真核生物，優(yōu)選哺乳動物的宿主細(xì)胞，包括(a)表達(dá)NHEJ抑制劑的轉(zhuǎn)基因序列，(b)表達(dá)一個或多個HR酶或HR激活劑的轉(zhuǎn)基因序列，(c)滅活或下調(diào)NHEJ基因的突變，和/或(d)增加HR酶、HR激活劑或NHEJ抑制劑的表達(dá)或活性的突變，其中所述重組真核宿主細(xì)胞具有的HR/NHEJ比比在不包括(a)和/或(b)所述的轉(zhuǎn)基因序列的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的比高大于2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30倍，和包括，任選地，基質(zhì)附著區(qū)(ΜΑ 元件。
30.一種重組真核生物，優(yōu)選哺乳動物的宿主細(xì)胞，包括(a)表達(dá)NHEJ抑制劑的轉(zhuǎn)基因序列，(b)表達(dá)一個或多個HR酶或HR激活劑的轉(zhuǎn)基因序列，(c)滅活或下調(diào)NHEJ基因的突變，和/或(d)增強(qiáng)HR酶、HR激活劑或NHEJ抑制劑的表達(dá)或活性的突變，和整合進(jìn)所述細(xì)胞基因組的轉(zhuǎn)基因，和任選地，MAR元件，其中所述MAR元件以順式或反式提供給所述轉(zhuǎn)基因。
31.權(quán)利要求四或30所述的細(xì)胞，其中所述一個或多個HR酶是Rad51、Rad 52,RecA, Rad 54,RuvC或BRCA2和/或HR激活劑是RS-I和/或NHEJ抑制劑是NU7(^6和/或渥曼青霄素。
32.權(quán)利要求四或30所述的細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)基因功能地連接到可誘導(dǎo)表達(dá)的控制元件如誘導(dǎo)型啟動子，其中所述誘導(dǎo)型啟動子任選地是物理上活化的啟動子如熱休克啟動子或化學(xué)上活化的啟動子如IPTG或四環(huán)素活化的啟動子。
33.權(quán)利要求四或之后權(quán)利要求中任一個所述的細(xì)胞，其中(c)或(d)中的所述突變是xrcc4基因、RAD51鏈轉(zhuǎn)移酶基因、依賴DNA的蛋白激酶基因、Rad 52基因、RecA基因、 Rad 54基因、RuvC基因和/或BRCA2基因中的突變。
34.權(quán)利要求四或之后權(quán)利要求中任一個所述的細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)基因被整合進(jìn)所述細(xì)胞基因組的一個基因座并形成串聯(lián)結(jié)構(gòu)。
35.權(quán)利要求34或之后權(quán)利要求中任一個所述的細(xì)胞，其中所述串聯(lián)結(jié)構(gòu)包括所述轉(zhuǎn)基因的至少300、400、500或600個拷貝。
36.一種重組真核生物，優(yōu)選哺乳動物的宿主細(xì)胞，包括整合進(jìn)所述基因組單個基因座、功能地連接到啟動子的轉(zhuǎn)基因的串聯(lián)結(jié)構(gòu)，其中所述串聯(lián)結(jié)構(gòu)包括所述轉(zhuǎn)基因的至少300、400、500或600個拷貝和至少一個MAR元件，其中所述MAR元件以順式或反式提供給所述轉(zhuǎn)基因，其中所述細(xì)胞優(yōu)選是已被同步的細(xì)胞群體的部分。
37.權(quán)利要求36所述的細(xì)胞，其中所述至少一個MAR以順式被提供，并且所述多數(shù)轉(zhuǎn)基因被提供，每個所述轉(zhuǎn)基因具有MAR。
38.權(quán)利要求36所述的細(xì)胞，其中至少兩個所述MAR元件位于所述轉(zhuǎn)基因側(cè)翼。
39.權(quán)利要求四或之后權(quán)利要求中任一個所述的細(xì)胞，其中所述至少一個MAR元件與 SEQ ID NOs 1-3具有至少90%的序列同一性或是SEQ ID NOs :1_3的變體。
40.權(quán)利要求四或之后權(quán)利要求中任一個所述的細(xì)胞，其中所述MAR元件位于所述轉(zhuǎn)基因的啟動子/增強(qiáng)子序列的上游。
41.權(quán)利要求四或之后權(quán)利要求中任一個所述的細(xì)胞，其中所述的細(xì)胞是CHO細(xì)胞、 HEK 293細(xì)胞、干細(xì)胞或祖細(xì)胞。
42.權(quán)利要求四或之后權(quán)利要求中任一個所述的重組真核宿主細(xì)胞中任一個在所述轉(zhuǎn)基因表達(dá)中的用途。
43.一種試劑盒，其包括a.在第一容器中，任選地包括MAR元件和用于轉(zhuǎn)基因整合進(jìn)所述載體的限制位點(diǎn)的載體，b.在第二容器中，權(quán)利要求觀至42的重組真核宿主細(xì)胞，和c.如何在轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞中使用所述載體用于轉(zhuǎn)基因表達(dá)的說明書。
44.權(quán)利要求43所述的試劑盒，進(jìn)一步包括同步化劑或關(guān)于如何使包括所述細(xì)胞的細(xì)胞群體同步化的說明書。
45.權(quán)利要求44所述的試劑盒，其中當(dāng)所述細(xì)胞群體的多數(shù)細(xì)胞處于Gl期時，所述載體用于轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞至少兩次。
46.一種非靈長類重組真核宿主細(xì)胞，其包括編碼跨過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜易位和/或跨過細(xì)胞質(zhì)膜分泌中涉及的至少一個靈長類蛋白質(zhì)或靈長類RNA——如信號識別顆粒(SRP)的蛋白質(zhì)或RNA或分泌復(fù)合體(易位子)的蛋白質(zhì)或其亞基——的轉(zhuǎn)基因序列。
47.權(quán)利要求46所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞進(jìn)一步包括功能地連接到信號肽編碼序列的轉(zhuǎn)基因，其中所述轉(zhuǎn)基因以多個拷貝，優(yōu)選以串聯(lián)結(jié)構(gòu)的形式存在于所述細(xì)胞中。
48.權(quán)利要求47所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包括所述轉(zhuǎn)基因的至少200、300、400、500 或600個拷貝。
49.權(quán)利要求47或48所述的細(xì)胞，其中由所述信號肽編碼序列編碼的信號肽包括氨基酸的疏水段并具有與SRPM相互作用的序列。
50.權(quán)利要求46或之后權(quán)利要求中任一個所述的細(xì)胞，進(jìn)一步包括外遺傳調(diào)節(jié)子元件，如MAR元件，其以順式或反式位于所述轉(zhuǎn)基因。
51.權(quán)利要求46或之后權(quán)利要求中任一個所述的細(xì)胞，其中在跨過ER膜易位和/或跨過細(xì)胞質(zhì)膜分泌中涉及的所述蛋白質(zhì)或RNA是所述SRP，特別是SRP9、SRP14、SRP19、SRP54、 SRP68、SRP72和/或7SRNA的蛋白質(zhì)或RNA。
52.權(quán)利要求51所述的細(xì)胞，其中所述SRP的所述蛋白質(zhì)是人類SRP14，優(yōu)選與跨過ER 膜易位和/或跨過細(xì)胞質(zhì)膜分泌中涉及的一個或多個其它的所述蛋白質(zhì)或RNA組合。
53.權(quán)利要求52所述的細(xì)胞，其中所述一個或多個其它的所述蛋白質(zhì)是人類SR和/或人類易位子蛋白。
54.權(quán)利要求51所述的細(xì)胞，其中所述蛋白質(zhì)是人類SRPM，優(yōu)選與跨過ER膜易位和 /或跨過細(xì)胞質(zhì)膜分泌中涉及的一個或多個其它的所述蛋白質(zhì)或RNA組合。
55.權(quán)利要求M所述的細(xì)胞，其中所述一個或多個其它的所述蛋白質(zhì)是人類SR和/或人類易位子蛋白。
56.權(quán)利要求46或之后權(quán)利要求中任一個所述的細(xì)胞，其中在跨過ER膜易位和/或跨過細(xì)胞質(zhì)膜分泌中涉及的所述蛋白質(zhì)或RNA是易位子蛋白質(zhì)，特別是α β Y、Sec62、 Sec63和/或其亞基中的一個。
57.權(quán)利要求46或之后權(quán)利要求中任一個所述的細(xì)胞，其中在跨過ER膜易位和/或跨過細(xì)胞質(zhì)膜分泌中涉及的所述蛋白質(zhì)或RNA是SRP9、SR14和易位子蛋白的組合。
58.權(quán)利要求46或之后權(quán)利要求中任一個所述的細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)基因是免疫球蛋白、其亞基或片段或融合蛋白。
59.權(quán)利要求46或之后權(quán)利要求中任一個所述的細(xì)胞，其中所述非靈長類細(xì)胞是嚙齒動物細(xì)胞，優(yōu)選CHO細(xì)胞。
60.權(quán)利要求46或之后權(quán)利要求中任一個所述的細(xì)胞，其中所述信號肽編碼序列與 SEQ ID NOs :4-11具有至少90%的序列同一性或可以是所述序列中任一個的變體。
61.權(quán)利要求46或之后權(quán)利要求中任一個所述的非靈長類重組真核宿主細(xì)胞在跨過 ER膜易位和/或跨過所述細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜分泌中的用途。
62.一個試劑盒，包括(a)在一個容器中，非靈長類重組宿主細(xì)胞，其包括作為所述細(xì)胞基因組的部分，編碼在跨過ER膜易位和/或跨過細(xì)胞質(zhì)膜分泌中涉及的至少一個蛋白質(zhì)或RNA——如信號識別顆粒(SRP)的蛋白質(zhì)或RNA或分泌復(fù)合體(易位子)的蛋白質(zhì)或其亞基——的轉(zhuǎn)基因序列，(b)在獨(dú)立的容器中，至少一個包括轉(zhuǎn)基因整合進(jìn)所述載體的限制位點(diǎn)和任選地MAR 元件的載體，和(c)利用所述細(xì)胞表達(dá)和分泌所述轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的說明書。
63.轉(zhuǎn)基因的蛋白質(zhì)分泌的方法，包括提供非靈長類真核宿主細(xì)胞，該細(xì)胞包括(a)編碼在跨過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)易位和/或跨過細(xì)胞質(zhì)膜分泌中涉及的至少一個靈長類蛋白質(zhì)或靈長類RNA——如信號識別顆粒(SRP)的蛋白質(zhì)或RNA或分泌復(fù)合體(易位子)的蛋白質(zhì)或其亞基——的轉(zhuǎn)基因序列，和(b)功能地連接到信號肽編碼序列的轉(zhuǎn)基因。
64.權(quán)利要求63所述的蛋白質(zhì)分泌的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因序列增加存在于所述細(xì)胞的在跨過ER膜易位和/或跨過細(xì)胞質(zhì)膜分泌中涉及的蛋白質(zhì)或RNA的總量高于在表達(dá)所述轉(zhuǎn)基因序列之前在所述細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的水平超過10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、 80%、90% 或 100%。
65.權(quán)利要求63或64所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因作為整合進(jìn)所述細(xì)胞基因組的串聯(lián)結(jié)構(gòu)存在于所述細(xì)胞中，其中所述串聯(lián)結(jié)構(gòu)優(yōu)選包括所述轉(zhuǎn)基因的至少200、300、400、500 或600個拷貝，并在所述細(xì)胞基因組的單個基因座被整合。
66.權(quán)利要求63或之后權(quán)利要求中任一個所述的方法，其中由所述信號肽編碼序列編碼的信號肽包括氨基酸的疏水段并具有與SRPM相互作用的序列。
67.權(quán)利要求63或之后權(quán)利要求中任一個所述的方法，其中(b)中所述的轉(zhuǎn)染是隨后的轉(zhuǎn)染并在用核酸如載體或核酸片段的最初轉(zhuǎn)染之后。
68.權(quán)利要求67所述的方法，其中所述最初轉(zhuǎn)染的所述載體對應(yīng)于(b)中所述的載體。
69.權(quán)利要求63或之后權(quán)利要求中任一個所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因序列與選自 SEQ ID NOs :4-11的序列具有至少90%的序列同一性或是所述序列中任一個的變體。
70.鑒定轉(zhuǎn)基因序列的蛋白質(zhì)分泌和/或易位增加活性的方法，包括監(jiān)測包括編碼重組蛋白的轉(zhuǎn)基因的第一哺乳動物細(xì)胞，其中所述重組蛋白由所述細(xì)胞以第一水平分泌，監(jiān)測包括編碼所述重組蛋白的所述轉(zhuǎn)基因的第二哺乳動物細(xì)胞，其中重組蛋白由所述細(xì)胞以第二水平分泌，其中所述第二水平超過所述第一水平，將編碼在跨過ER膜易位和/或跨過細(xì)胞質(zhì)膜分泌中涉及的至少一個蛋白質(zhì)或RNA的轉(zhuǎn)基因序列導(dǎo)入到所述第一哺乳動物細(xì)胞，和測定在所述第一細(xì)胞中所述重組蛋白的分泌水平的改變，其中超過第一水平的增加鑒定了所述轉(zhuǎn)基因序列的蛋白質(zhì)分泌增加活性。
全文摘要
公開了用于轉(zhuǎn)基因表達(dá)的方法和真核宿主細(xì)胞。所述細(xì)胞可被處理和/或修飾以在所述細(xì)胞中增加同源重組(HR)、降低非同源末端連接(NHEJ)和/或增加HR/NHEJ比?？捎冒ㄞD(zhuǎn)基因的載體轉(zhuǎn)染這種細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)基因有利地整合進(jìn)所述細(xì)胞的基因組以形成可包括大于200個轉(zhuǎn)基因拷貝的串聯(lián)結(jié)構(gòu)。某些表達(dá)增強(qiáng)元件如MARs被有利地提供以進(jìn)一步增加和/或促進(jìn)轉(zhuǎn)基因表達(dá)。還公開了重組真核宿主細(xì)胞，特別是非靈長類宿主細(xì)胞，包括編碼在跨過ER膜易位和/或跨過細(xì)胞質(zhì)膜分泌中涉及的蛋白質(zhì)和/或RNA，特別是靈長類蛋白質(zhì)和/或RNA的轉(zhuǎn)基因序列。
文檔編號C12N15/113GK102575264SQ201080041064
公開日2012年7月11日 申請日期2010年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月18日
發(fā)明者A·雷加梅, D·卡拉布列茲, M·格朗讓, N·梅爾莫, P-A·希羅德, V·勒富爾 申請人:瑟萊克斯公司