專利名稱：人體內(nèi)產(chǎn)生對(duì)hiv的廣泛t細(xì)胞應(yīng)答的制作方法
人體內(nèi)產(chǎn)生對(duì)HIV的廣泛T細(xì)胞應(yīng)答本發(fā)明涉及用作藥物或者疫苗的重組的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)及其在治療和/或預(yù)防HIV感染和AIDS中的用途，所述病毒的病毒基因組中包含用于表達(dá)HIV蛋白或者其部分或衍生物的ー個(gè)或者多個(gè)表達(dá)盒，所述HIV蛋白選自Gag、Pol、Tat、Vif、Vpu、Vpr、Rev 和 Nef0
背景技術(shù)：
人類免疫缺陷病毒(HIV)是獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)的病原體。與所有的逆轉(zhuǎn)錄病毒一祥，該病毒的基因組編碼Gag、Pol和Env蛋白。此外，該病毒的基因組還編碼調(diào)節(jié)蛋白(即Tat和Rev)以及輔助蛋白(即Vpr、Vpx、Vpu、Vif和Nef)。盡管公共衛(wèi)生組織努力控制AIDS傳染病的傳播，但新發(fā)感染的數(shù)量仍在增加。世界衛(wèi)生組織估計(jì)2003年底全球有3780萬感染者。如果綜合預(yù)防機(jī)制沒有進(jìn)ー步改善，預(yù) 計(jì)這十年全球出現(xiàn)的新HIV感染的數(shù)量達(dá)到4500萬(2004年UNAIDS和WHO在The GlobalAIDS Epidemic 上的報(bào)告)。HIV感染是ー種慢性感染性疾病，其可以部分地得到控制，但是不能治愈。目前存在預(yù)防并發(fā)癥和延緩發(fā)展成為AIDS進(jìn)程的有效方法。目前，并非所有感染HIV的人都發(fā)展成為AIDS，但是一般認(rèn)為大部分人將會(huì)如此。被稱為高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療劑(HAART)的幾種抗逆轉(zhuǎn)錄病毒試劑的組合物已經(jīng)非常有效地降低了病毒載量，從而能夠提高T細(xì)胞數(shù)量。這還不能治愈HIV，而且進(jìn)行HAART的人雖然HIV水平受到抑制，但是仍然能夠?qū)⒉《緜魅窘o其他人。但是，有確切的證據(jù)表明如果HIV的水平持續(xù)受到抑制并且CD4的數(shù)量保持大于200，那么生命的質(zhì)量和壽命可以得到顯著提高和延長。考慮到該流行病的穩(wěn)步傳播，已經(jīng)研發(fā)出多種不同的HIV疫苗遞送方案，例如新型載體或者佐劑系統(tǒng)，并且在不同的臨床前條件以及臨床試驗(yàn)中對(duì)其進(jìn)行了評(píng)估。已進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)的第一個(gè)疫苗候選物基于明礬中的包膜蛋白gpl20 (Francis 等，AIDS Res. Hum. Retroviruses 1998 ； 14 (Suppl 3)(5) :S325_31)。但是,第一次臨床研究的結(jié)果并不樂觀。盡管HAART療法中使用的藥物能夠降低病毒滴度，但是對(duì)于抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法，存在ー些擔(dān)憂。關(guān)于HAART的ー個(gè)主要問題是(長期的)副作用和由此產(chǎn)生的患者依從度。如果患者遺漏幾次劑量，就會(huì)產(chǎn)生抗藥性。并且，抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物價(jià)格昂貴，世界上大多數(shù)感染者都無法獲得HIV和AIDS的藥物和治療。過去經(jīng)過效果測(cè)試的疫苗通?；趩蝹€(gè)HIV蛋白，例如Env。然而，即使產(chǎn)生了對(duì)該單個(gè)蛋白(例如Env)的免疫應(yīng)答，所述免疫應(yīng)答經(jīng)證實(shí)并非有效。無效的ー個(gè)原因是HIV的高突變率，特別是對(duì)于Env蛋白，這導(dǎo)致產(chǎn)生了其蛋白不能被疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答識(shí)別的病毒。由于沒有有效的預(yù)防性治療，仍然需要向臨床弓I入有效疫苗。發(fā)明詳述本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，一種包含Hiv-I蛋白Gag、Pol、Tat、Vif、Vpu、Vpr、Rev和Nef的基于MVA的HIV疫苗在人體內(nèi)，特別是感染HIV的無免疫應(yīng)答人體內(nèi)能夠誘導(dǎo)對(duì)這些HIV蛋白中多達(dá)6種蛋白的T細(xì)胞應(yīng)答。該發(fā)現(xiàn)之前無法預(yù)期，因?yàn)橐阎朔NMVA向免疫系統(tǒng)提供免疫顯性表位，可以說這使得T細(xì)胞應(yīng)答所需表位被這些免疫顯性表位所覆蓋。此外，臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，接受接種的HIV感染者的免疫應(yīng)答在首次免疫后20周仍然高于基線。
確實(shí)，相比于本發(fā)明相，目前還沒有人體內(nèi)的臨床試驗(yàn)用以研究HIV疫苗對(duì)免疫細(xì)胞的作用，而是僅獲得了體外數(shù)據(jù)或者小鼠模型中的體內(nèi)數(shù)據(jù)。實(shí)際上，動(dòng)物研究不及人類好，因?yàn)槟Ｐ屯ǔ２荒茴A(yù)測(cè)人類的應(yīng)答比例和應(yīng)答量級(jí)。小鼠和兔比人類更具免疫應(yīng)答性。由于本發(fā)明是從感染HIV的人體中獲得的數(shù)據(jù)，因此，對(duì)發(fā)明人獲得的數(shù)據(jù)必須高度評(píng)估，而遠(yuǎn)不能根據(jù)已知的MVA免疫顯性現(xiàn)象對(duì)其預(yù)測(cè)。參與所附實(shí)施例中描述的臨床試驗(yàn)的HIV感染者的CD4數(shù)量少于350/yl，并且基于此較低數(shù)量，將不能預(yù)期對(duì)施用于臨床試驗(yàn)參與者的基于MVA的疫苗所包含的8種HIV-I蛋白中的6種蛋白產(chǎn)生如此廣泛的T細(xì)胞應(yīng)答。例如，US2006/188961和W003/097675描述了基于MVA的HIV疫苗。但是，這些文獻(xiàn)沒有顯示對(duì)如本文中描述的重組MVA中使用的HIV-I蛋白的廣泛T細(xì)胞應(yīng)答。EP1921146 和 W001/47955 描述了ー種基于 MVA 的 HIV 疫苗，其包含 Gag、Pol 和 Nef或者Gag、Pol、Nef、Vpr和Vpu的CTL表位，用以誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答。但是，這些文獻(xiàn)沒有提供顯示廣泛T細(xì)胞應(yīng)答的數(shù)據(jù)，更沒有人體中獲得的數(shù)據(jù)。W02006/123256與W001/47955非常相似，但是除了更多的特異性CTL表位之外，并沒有提供任何超越WO 01/47955所描述的數(shù)據(jù)。W02008/118936 描述了ー種基于 MVA 的 HIV 疫苗，其包含選自 Env、Gag、Nef、RT、Tat和Rev的HIV蛋白。但是，該文獻(xiàn)的缺點(diǎn)是僅具有動(dòng)物模型數(shù)據(jù)，但由該數(shù)據(jù)不能合理地推斷至人類。Greenough 等(2008)，Vaccine. 26 :6883-6893 報(bào)道了包含 Env、Tat、Rev、Nef 和 RT的重組痘病毒HIV-I疫苗的安全性和免疫原性研究，所述疫苗對(duì)已感染HIV并且進(jìn)行HAART的年輕成人施用。然而，作者報(bào)道其疫苗可能不能得到進(jìn)ー步開發(fā)。因此，將不能預(yù)期對(duì)8種HIV蛋白中的6種蛋白產(chǎn)生廣泛的T細(xì)胞應(yīng)答，更不要說在無免疫應(yīng)答的受試者中的免疫應(yīng)答。特別是無論體外數(shù)據(jù)還是動(dòng)物模型均不能形成用于合理預(yù)期其在HIV治療領(lǐng)域的成功的基礎(chǔ)。這確實(shí)是因?yàn)镠IV的“真實(shí)”模型系統(tǒng)是人，特別是感染HIV的人?；趧?dòng)物實(shí)驗(yàn)和通過排列多個(gè)CTL表位擴(kuò)大免疫應(yīng)答(例如W001/47955或者W02008/118936)的嘗試(不一定產(chǎn)生對(duì)期望HIV蛋白的免疫應(yīng)答)，不能預(yù)期在無免疫應(yīng)答的人體中8種HIV蛋白中的6種蛋白被免疫系統(tǒng)識(shí)別。因此，本發(fā)明涉及一種用作藥物或者疫苗的重組的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)，其病毒基因組中包含用于表達(dá)至少3種HIV蛋白或者其部分或衍生物的一個(gè)或者多個(gè)表達(dá)盒，所述 HIV 蛋白選自 Gag、Pol、Tat、Vif、Vpu、Vpr、Rev 和 Nef。在一個(gè)實(shí)施方案中，用作藥物或者疫苗的所述重組MVA在病毒基因組中包含用于表達(dá)至少6種HIV蛋白或者其部分或衍生物的一個(gè)或者多個(gè)表達(dá)盒，所述HIV蛋白選自Gag、Pol、Tat、Vif > Vpu、Vpr > Rev 和 Nef。
在另ー實(shí)施方案中，用作藥物或者疫苗的所述重組MVA在病毒基因組中包含表達(dá)至少8種HIV蛋白或者其部分或衍生物的一個(gè)或者多個(gè)表達(dá)盒，所述HIV蛋白選自Gag、Pol、Tat、Vif > Vpu、Vpr > Rev 和 Nef。在本發(fā)明其他具體實(shí)施方案中，用作藥物或者疫苗的所述重組MVA在病毒基因組中包含用于表達(dá)3種或者4種或者5種或者6種或者7種或者8種HIV蛋白或者其部分或衍生物的一個(gè)或者多個(gè)表達(dá)盒，所述HI V蛋白選自Gag、Po I、Tat、Vi f、Vpu、Vpr、Re V和Nef。本發(fā)明還包括一種用作藥物或者疫苗的重組的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)，其病毒基因組中包含用于表達(dá)選自Gag、Pol、Tat、Vif、Vpu、Vpr、Rev和Nef的8種HIV蛋白以及ー種或多種額外的結(jié)構(gòu)和/或輔助/調(diào)節(jié)HIV蛋白或者其部分或衍生物的ー個(gè)或者多個(gè)表達(dá)盒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種用作藥物或者疫苗的重組的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)，其病毒基因組中包含用于表達(dá)HIV蛋白Gag、Pol、Tat、Vif、Vpu、Vpr、Rev和Nef或者所述蛋白的部分或衍生物的一個(gè)或者多個(gè)表達(dá)盒。在進(jìn)ー步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種用作藥物或者疫苗的重組的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)，其病毒基因組中包含用于表達(dá)HIV蛋白Gag、Pol、Vpu、Vpr、Rev和Nef或者所述蛋白的部分或衍生物的一個(gè)或者多個(gè)表達(dá)盒。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種重組的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)，其病毒基因組中包含表達(dá)至少6種HIV蛋白或其部分或者所述蛋白的衍生物的ー個(gè)或者多個(gè)表達(dá)盒，所述HIV蛋白選自Gag、Pol、Tat、Vif、Vpu、Vpr、Rev和Nef。所述MVA用于誘導(dǎo)人類受試者內(nèi)對(duì)選自Gag、Pol、Vpr、Vpu、Rev和Nef中至少3種HIV蛋白的T細(xì)胞應(yīng)答。在另ー特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種重組的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)，其病毒基因組中包含用于表達(dá)至少6種HIV蛋白或者其部分或者所述蛋白的衍生物的ー個(gè)或者多個(gè)表達(dá)盒，所述HIV蛋白選自Gag、Po I、Vpu、Vpr、Rev和Nef，所述MVA用于誘導(dǎo)人類受試者內(nèi)對(duì)選自Gag、Po I、Vpr、Vpu、Re V和Nef中至少3種HIV蛋白的T細(xì)胞應(yīng)答。在進(jìn)ー步特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種重組的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)，其病毒基因組中包含用于表達(dá)至少8種HIV蛋白或其部分或者所述蛋白的衍生物的一個(gè)或者多個(gè)表達(dá)盒，所述HIV蛋白選自Gag、Pol、Tat、Vif、Vpu、Vpr、Rev和Nef,所述MVA用于誘導(dǎo)人類受試者內(nèi)對(duì)選自Gag、Pol、Vpr、Vpu、Rev和Nef中至少3種HIV蛋白的T細(xì)胞應(yīng)答。本發(fā)明還提供了包含如本文中定義的重組MVA的藥物或者疫苗組合物，具體地，所述重組MVA的病毒基因組中包含用于表達(dá)至少6種HIV蛋白或其部分或者所述蛋白的衍生物的一個(gè)或者多個(gè)表達(dá)盒，所述HIV蛋白選自Gag、Pol、Tat、Vif、Vpu、Vpr、Rev和Nef。
更優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物或者疫苗組合物包含重組MVA，所述重組MVA的病毒基因組中包含用于表達(dá)至少8種HIV蛋白或其部分或者所述蛋白的衍生物的一個(gè)或者多個(gè)表達(dá)盒，所述 HIV 蛋白選自 Gag、Pol、Tat、Vif、Vpu、Vpr、Rev 和 Nef。
在進(jìn)ー步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述組合物包含重組MVA，所述重組MVA的病毒基因組中包含用于表達(dá)至少6種HIV蛋白或其部分或者所述蛋白的衍生物的一個(gè)或者多個(gè)表達(dá)盒，所述 HIV 蛋白選自 Gag、Pol、Vpu、Vpr、Rev 和 Nef。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含于所述藥物或者疫苗組合物中的MVA在所述藥物或者疫苗組合物中的劑量是大約2X 10TCID5(l/ml。在另ー個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含于所述藥物或者疫苗組合物中的MVA經(jīng)制備用于在3個(gè)間隔時(shí)間施用。所述3個(gè)間隔時(shí)間優(yōu)選為第0、4和12周。利用根據(jù)本發(fā)明的重組MVA可以表達(dá)大量的HIV蛋白。這些蛋白能夠誘導(dǎo)廣泛的免疫應(yīng)答。因此，產(chǎn)生對(duì)不同HIV分離株(isolate)有效的保護(hù)性免疫應(yīng)答的可能性増加。根據(jù)本發(fā)明，改良的安卡拉痘苗病毒(MVA)適用于人類和幾種動(dòng)物物種中，例如小鼠和非人靈長類動(dòng)物。已知MVA非常安全。本文中使用的術(shù)語“受試者”特別地是指人類受試者。本文中所指人類受試者可以是例如由于感染HIV而無免疫應(yīng)答，即人類受試者感染了 HIV感染者，例如感染了 HIV-1。本文中所指人類受試者可以表征為其CD4細(xì)胞數(shù)量少于350/yl。

本文中使用的“無免疫應(yīng)答”是免疫系統(tǒng)防御或者抵抗感染性疾病的能力受損或者完全喪失的狀態(tài)。已經(jīng)通過使痘苗病毒的安卡拉株(CVA)在雞胚成纖維細(xì)胞中長期連續(xù)傳代來制備 MVA(綜述參見 Mayr, A.，Hochstein-Mintzel, V.和 Stickl, H. [1975] Infection 3,6-14 ;瑞士專利第568，392號(hào))。已經(jīng)依照布達(dá)佩斯條約的要求保藏并且用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的重組病毒的MVA病毒株的實(shí)例是1994年I月27日保藏在歐洲動(dòng)物細(xì)胞保藏中心(European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Salisbury (UK))的保藏號(hào)是ECACC 94012707的病毒株MVA 572 ；2000年12月7日保藏的保藏號(hào)是ECACC 00120707的病毒株MVA 575 ；以及2000年8月30日保藏于ECACC的保藏號(hào)是00083008的MVA-BN。在大量臨床試驗(yàn)中已經(jīng)證明了與在疫苗開發(fā)中的用途有關(guān)的MVA病毒株的幾個(gè)優(yōu)異的性質(zhì)(Mayr 等，ZbI.Bakt. Hyg. I，Abt. Org. B 167，375-390 [1987])。在對(duì)超過120，000人(包括高風(fēng)險(xiǎn)患者)進(jìn)行的這些研究中，未發(fā)現(xiàn)副作用(Stickl等,Dtsch. med.Wschr. 99，2386-2392[1974])。已經(jīng)進(jìn)ー步發(fā)現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，MVA在病毒復(fù)制周期的晚期被阻斷(Sutter, G.和 Moss，B.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89，10847-10851 [1992])。因此，MVA 完全復(fù)制其DNA，合成早期、中期和晩期基因產(chǎn)物，但是不能裝配成能夠從被感染細(xì)胞釋放的成熟感染性病毒粒子。由于這個(gè)原因，即其復(fù)制受限的性質(zhì)，MVA可以用作基因表達(dá)載體。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，重組MVA選自MVA病毒株MVA575、MVA572和MVA-BN0在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組MVA病毒在人和非人靈長類動(dòng)物中不能復(fù)制。術(shù)語在人類和/或非人靈長類動(dòng)物中“不能復(fù)制”的病毒，以及同義術(shù)語在人類和/或非人靈長類動(dòng)物中“不能復(fù)制成感染性子代病毒”的病毒均優(yōu)選是指在接種了所述病毒的人類和/或非人靈長類動(dòng)物細(xì)胞中完全不能復(fù)制的MVA病毒。但是，顯示由施用了重組MVA病毒的人類和/或非人靈長類動(dòng)物的免疫系統(tǒng)控制的少量殘留復(fù)制活性的病毒也在本申請(qǐng)的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，不能復(fù)制的重組MVA病毒可以是能夠感染用所述病毒作為疫苗的人類和/或非人靈長類動(dòng)物的細(xì)胞的病毒?！澳軌蚋腥炯?xì)胞”的病毒是能夠與宿主細(xì)胞相互作用至如此程度從而使病毒或者至少病毒基因組整合到宿主細(xì)胞中的病毒。盡管根據(jù)本發(fā)明使用的病毒能夠感染已接種的人類和/或非靈長類動(dòng)物的細(xì)胞，其不能在已接種的人類和/或非靈長類動(dòng)物的細(xì)胞中復(fù)制成感染性子代病毒。根據(jù)本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解，能夠感染第一種動(dòng)物的細(xì)胞但是不能在所述細(xì)胞中復(fù)制成感染性子代病毒的病毒可能在第二種動(dòng)物中表現(xiàn)不同。例如，MVA-BN和其衍生物(見下文)是能夠感染人類細(xì)胞但是不能在人類細(xì)胞中復(fù)制成感染性子代病毒的病毒。但是，相同的病毒在雞中有效復(fù)制，即在雞中，MVA-BN是既能感染細(xì)胞又能在這些細(xì)胞中復(fù)制成感染性子代病毒的病毒。能夠預(yù)測(cè)ー種病毒能否在人體內(nèi)復(fù)制的合適試驗(yàn)公開于W002/42480(通過引用并入本文)中，并且使用了免疫嚴(yán)重受損的AGRl29小鼠株。此外，除了 AGRl29小鼠之外，可以使用不能產(chǎn)生成熟B和T細(xì)胞并因此使免疫嚴(yán)重受損且非常易于感染正在復(fù)制的病毒的任何其他小鼠株。據(jù)報(bào)道，該小鼠模型中獲得的結(jié)果對(duì)人類是指示性的，因此根據(jù)本申請(qǐng)，認(rèn)為在所述小鼠模型中不能復(fù)制的病毒是“不能在人體內(nèi)復(fù)制”的病毒。在其他實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的病毒優(yōu)選能夠在至少ー種動(dòng)物的至少ー種細(xì)胞類型中復(fù)制。因此，可以在向待接受接種和/或處理的動(dòng)物施用前擴(kuò)增病毒。作為示例，提 及的有能夠在CEF (雞胚成纖維細(xì)胞)細(xì)胞中擴(kuò)增的MVA-BN，但是該病毒是不能在人體內(nèi)復(fù)制成感染性子代病毒的病毒。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語病毒的“衍生物”或者“變體”是指與親代病毒顯示相同特性但是其基因組的一部分或者多個(gè)部分顯示不同的子代病毒。術(shù)語“衍生物”或者“MVA的變體”或者“MVA-BN”描述與MVA相比具有相同功能特性的病毒。例如，MVA-BN的衍生物/變體具有MVA-BN的特性，優(yōu)選具有保藏于ECACC保藏號(hào)是00083008的MVA-BN的特性。MVA-BN或者其變體的這些特性之一分別是其減弱和不能在人細(xì)胞系中進(jìn)行再生性復(fù)制，所述人細(xì)胞系為例如人角化細(xì)胞系HaCaT、人胚腎細(xì)胞系293、人骨肉瘤細(xì)胞系143B和人子宮頸腺癌細(xì)胞系HeLa。此外和/或可選擇地，MVA-BN和其衍生物具有不能在不能產(chǎn)生成熟B和T細(xì)胞的小鼠模型中復(fù)制的性質(zhì)，和/或具有在痘苗病毒初級(jí)/痘苗病毒加強(qiáng)免疫策略中誘導(dǎo)與DNA初級(jí)/痘苗病毒加強(qiáng)免疫策略至少相同水平的特異性免疫應(yīng)答的能力。如果在痘苗病毒初級(jí)/痘苗病毒加強(qiáng)免疫策略中，經(jīng)W002/42480中公開的“測(cè)試I”和“測(cè)試2”之一或者兩者測(cè)定的CTL應(yīng)答與DNA-初級(jí)/痘苗病毒加強(qiáng)免疫策略相比時(shí)至少基本相同，則認(rèn)為痘苗病毒(尤其是MVA病毒株)在痘苗病毒初級(jí)/痘苗病毒加強(qiáng)免疫策略中誘導(dǎo)與DNA初級(jí)/痘苗病毒加強(qiáng)免疫策略相比時(shí)至少基本相同水平的免疫。更優(yōu)選地，施用痘苗病毒初級(jí)/痘苗病毒加強(qiáng)免疫后，至少ー種測(cè)試中的CTL應(yīng)答高于DNA初級(jí)/痘苗病毒加強(qiáng)免疫策略。最優(yōu)選地，兩個(gè)測(cè)試中的CTL均較高。根據(jù)本發(fā)明使用的病毒可以是克隆純化的病毒，例如單克隆病毒。根據(jù)本發(fā)明使用的病毒可以是已經(jīng)在無血清條件下產(chǎn)生/傳代的病毒，以減少感染血清中所含物質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)本發(fā)明的MVA施用的濃度范圍是IO4至109TCID5(l/ml，優(yōu)選濃度范圍是例如IO5至5X108TCID5Q/ml，更優(yōu)選濃度范圍是例如IO6至108TCID5(l/ml或者IO7至109TCID5(l/ml，甚至更優(yōu)選濃度范圍是例如IO8至109TCID5Q/ml，并且最優(yōu)選濃度是2X 108TCID5Q/ml。實(shí)際濃度取決于病毒類型和接受接種的物種。對(duì)于MVA-BN，通過皮下施用于人的常規(guī)接種劑量包括 5X IO7TCID50 至 5X IO8TCID5。，例如大約 IXlO8 或者 2X 108TCID5。。
在本發(fā)明ー個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)應(yīng)用于本發(fā)明的用途和方法時(shí)，本文中描述的重組MVA施用至少3次。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)應(yīng)用于本發(fā)明的用途和方法時(shí)，所述重組MVA在第0、4和12周施用。單次施用上文所定義的MVA，特別是病毒株MVA-BN和其衍生物，可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。通常，可以在同質(zhì)初級(jí)加強(qiáng)免疫策略中施用根據(jù)本發(fā)明的MVA，特別是MVA-BN和其衍生物，即可以使用重組MVA用于首次接種，和用以通過施用與首次接種中使用的重組MVA相同或者相關(guān)的重組MVA而增強(qiáng)首次接種中產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明的MVA特別是MVA-BN和其衍生物還可以用于異質(zhì)初級(jí)-加強(qiáng)免疫策略中，并且在所述異質(zhì)初級(jí)-加強(qiáng)免疫策略中，用上文所定義的MVA進(jìn)行一次或者多次接種，并且其中利另ー種類型的疫苗(例如另ー種病毒疫苗、蛋白或者核酸疫苗)進(jìn)行一次或者多次接種。施用方式可以是靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、鼻內(nèi)或者皮下施用。優(yōu)選靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或者特 別是皮下施用。但是，可以使用任何其他的施用方式，例如劃痕(scarification)。本申請(qǐng)文中使用的術(shù)語“HIV”是指任何類型的HIV，包括HIV-I和HIV-2以及相應(yīng)的亞型，例如HIV-I亞型A、B或者C。實(shí)例是HIV-I病毒株，例如亞型B。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，由表達(dá)盒編碼的HIV蛋白是HIV-I蛋白。本申請(qǐng)中使用的術(shù)語“HIV蛋白的部分”是指包含相應(yīng)全長HIV蛋白的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸的肽或者蛋白，例如所述全長蛋白的至少20、30或者40個(gè)氨基酸。作為實(shí)例并且不限于所述實(shí)施方案，提及的有g(shù)enebank數(shù)據(jù)庫公開的多個(gè)HIV序列，特別是HIV-I分離株HXB2R的序列(genebank登錄號(hào)是K03455)。本說明書中使用的術(shù)語“HIV蛋白氨基酸序列的衍生物”是指與相應(yīng)的天然存在的HIV蛋白相比氨基酸序列發(fā)生改變的HIV蛋白。改變的氨基酸序列可以是其中HIV蛋白序列的一個(gè)或者多個(gè)氨基酸被置換、插入或者缺失并且因而突變的序列。更具體地，“HIV蛋白氨基酸序列的衍生物”是當(dāng)?shù)鞍籽苌锏陌被嵝蛄信c已知HIV分離株各自的HIV蛋白的氨基酸序列相比時(shí)顯示至少50 %，例如至少60 %、65 %、70 %、75 %，或者至少80 %或85 %，或者甚至至少90%、95%、98%或者99%同一性的氨基酸序列。即使發(fā)現(xiàn)與僅僅ー種HIV分離株的相應(yīng)蛋白具有同源性/同一性，也認(rèn)為氨基酸序列具有上述的序列同源性或者同一性，而不管其可能與其他分離株中的相應(yīng)蛋白顯示較低的同源性。例如，如果融合蛋白中的Vpr衍生物顯示與ー種HIV分離株的Vpr序列具有95%的同源性，但是與(所有)其他HIV分離株僅具有50-70%的同源性，則認(rèn)為所述Vpr衍生物的同源性是至少90%。特別地，術(shù)語“HIV蛋白的衍生物”是指顯示與HIV-I分離株HXB2R中各HIV蛋白(genebank登錄號(hào) K03455)具有至少 50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或者 90%、95%、98%或者99%同源性的氨基酸序列。HIV蛋白的衍生物和HIV蛋白的部分可以具有完整的活性，活性降低、無活性或者反式顯性(transdominant)活性。例如,根據(jù)本發(fā)明的重組MVA表達(dá)HIV調(diào)節(jié)和/或輔助蛋白。這些蛋白的生物活性可能具有不期望的副作用。因此，由重組MVA表達(dá)的ー種或者多種HIV蛋白與野生型蛋白相比活性降低，這也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。確定HIV蛋白是否具有降低的生物活性的測(cè)試是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。對(duì)病毒的體內(nèi)復(fù)制十分關(guān)鍵的Vif蛋白的分子機(jī)制仍不為人所知，但是Vif具有強(qiáng)的自結(jié)合(self association)趨勢(shì)。經(jīng)證明，這種多聚化對(duì)Vif在病毒生命周期中的功能十分重要(Yang S.等，J Biol Chem 2001 ；276 :4889-4893)。此外，經(jīng)證明，vif特異性地與病毒核蛋白復(fù)合體結(jié)合，這在功能上可能具有重要作用(Khan M. A.等，J Virol. 2001 ；75(16) :7252-65)。因此，活性降低的Vif蛋白顯示降低的多聚化和/或與核蛋白復(fù)合體的
彡ロロ。Vpr蛋白在病毒生活周期中發(fā)揮重要作用。Vpr調(diào)節(jié)病毒前整合復(fù)合體的核運(yùn)輸，并且促進(jìn)感染非分裂細(xì)胞，例如巨曬細(xì)胞(Agostini等，AIDS Res Hum Retroviruses2002 ；18(4) :283-8) 0此外，Vpr蛋白還具有由與LTR的相互作用介導(dǎo)的反式激活活性(Vanitharani R.等,Virology 2001 ；289 (2) :334-42)。因此，活性降低的 Vpr 蛋白顯示降低的或者甚至無反式激活活性和/或與病毒前整合復(fù)合體的相互作用。與Vpr高度同源的Vpx對(duì)于病毒在非分裂細(xì)胞中的高效復(fù)制也十分關(guān)鍵。Vpx通
過與gag前體多聚蛋白的p6結(jié)構(gòu)域的相互作用而被包裝在病毒顆粒內(nèi)。同Vpr —祥，Vpx參與將前整合復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)至核中(Mahalingam等，J. Virol 2001 ；75(1) :362-74)。因此，活性降低的Vpx通過gag前體結(jié)合前整合復(fù)合體的能力下降。已知Vpu蛋白與⑶4的胞質(zhì)末端相互作用，并引起⑶4降解(Bour等，Virology1995 ；69(3) :1510-20)。因此，活性降低的Vpu引發(fā)CD4降解的能力下降。經(jīng)明確表征的Tat蛋白的相關(guān)生物學(xué)活性是通過與反式激活應(yīng)答元件(TAR)相互作用而反式激活轉(zhuǎn)錄。已經(jīng)證明Tat能夠反式激活缺少除TAR之外的其他HIV序列的異源啟動(dòng)子(Han P.等，Nucleic Acid Res 1991 ；19(25) :7225-9)。因此，活性降低的 Tat 蛋白顯示通過TAR元件對(duì)啟動(dòng)子的反式激活作用減弱。根據(jù)本發(fā)明，還可以使用反式顯性Tat?？梢酝ㄟ^下列置換獲得反式顯性Tat 22(Cys > Gly)和37 (Cys > Ser)。Nef蛋白通過誘導(dǎo)細(xì)胞表面⑶4的下調(diào)而對(duì)負(fù)責(zé)疾病發(fā)展的病毒復(fù)制十分重要(Lou T等，J Biomed Sci 1997 ；4(4) :132)。這種下調(diào)由CD4和Nef的直接相互作用起始(Preusser A.等，Biochem Biophys Res Commun 2002 ；292 (3) :734-40) 因此，功能減弱的Nef蛋白顯示與CD4的相互作用減弱。實(shí)例是氨基端截短的Nef蛋白，例如缺少N末端19個(gè)氨基酸的蛋白。根據(jù)本發(fā)明，還可以使用截短的Nef，特別是缺失N末端19個(gè)氨基酸的 Nef0Rev的相關(guān)功能是由與病毒RNA的Rev應(yīng)答元件(RRE)相互作用起始的轉(zhuǎn)錄后反式激活作用(Iwai 等，1992 ;Nucleic Acids Res 1992 ；20(24) :6465-72)。因此，活性降低的Rev顯示與RRE的相互作用減弱。 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，以單個(gè)蛋白表達(dá)ー種或者多種HIV蛋白。根據(jù)進(jìn)ー步的實(shí)施方案，以融合蛋白表達(dá)兩種或者多種HIV蛋白。優(yōu)選地，以融合蛋白表達(dá)兩種或者更多種HIV輔助/調(diào)節(jié)蛋白。在本文中參考W003/097675，其內(nèi)容通過引用隨同并入。作為實(shí)例，根據(jù)本發(fā)明的重組MVA，例如MVA-BN和其衍生物，可以⑴以融合蛋白以此順序或者不同順序表達(dá)Vif-Vpu-Vpr-Rev,其中Vif、Vpu、Vpr和Rev表示全長蛋白或者全長蛋白的部分或衍生物(參見上文的定義)，(ii)Nef 或其部分或衍生物，特別是N末端氨基酸(例如前19個(gè)氨基酸)缺失的Nef蛋白，即N末端截短的Nef，(iii)Tat或其部分或衍生物，特別是反式顯性TatjP (iv)以例示順序或相反順序(Pol-Gag)排列的Gag-Pol融合蛋白，其中Gag和Po I表示全長蛋白或者全長蛋白的部分或衍生物。表達(dá)HIV蛋白的表達(dá)盒數(shù)量并不重要。作為實(shí)例，可以由2至5個(gè)表達(dá)盒表達(dá)HIV蛋白。ー個(gè)表達(dá)盒可以以融合蛋白表達(dá)以此順序或者不同順序的Vif-Vpu-Vpr-Rev,其中Vif.Vpu.Vpr和Rev表示全長蛋白或者全長蛋白的部分或衍生物(參見上文的定義)，第二表達(dá)盒可以表達(dá)Nef 或其部分或衍生物，特別是N末端氨基酸(例如前19個(gè)氨基酸)缺失的Nef蛋白，第三表達(dá)盒可以表達(dá)(iii) Tat或其部分或衍生物，特別是反式顯性Tat，第四表達(dá)盒可以表達(dá)以例示順序或相反順序(Pol-Gag)排列的Gag-Pol融合蛋白，其中Gag和Pol表示全長蛋白或者全長蛋白的部分或衍生物。優(yōu)選地，編碼Gag-Pol融合蛋白的表達(dá)盒與編碼Tat的表達(dá)盒被插入到相同的插入位點(diǎn)中。異源核酸序列的表達(dá)優(yōu)選但不是排他性地處于痘病毒啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下。合適的痘病毒啟動(dòng)子的實(shí)例是牛痘ATI啟動(dòng)子(參見W003/097844)。每個(gè)表達(dá)盒的表達(dá)均可以由不同啟動(dòng)子控制。可選地，所有表達(dá)盒可以由相同啟動(dòng)子的拷貝控制。作為實(shí)例，本發(fā)明涉及的重組病毒中所有的HIV表達(dá)盒(例如上文例示的4個(gè)表達(dá)盒)由W003/097844中定 義的牛痘ATI啟動(dòng)子或者其衍生物控制。在根據(jù)本發(fā)明的重組MVA(例如MVA-BN和其衍生物)中，可以將表達(dá)盒插入到病毒基因組內(nèi)I至10個(gè)插入位點(diǎn)中。意外地發(fā)現(xiàn)，如果不是所有的表達(dá)盒均被插入到相同的插入側(cè)，則可以容易地獲得用于表達(dá)HIV蛋白或者其部分或衍生物的重組MVA(特別是MVA-BN和其變體)。因此，可以將不同的表達(dá)盒插入到病毒基因組內(nèi)I至5、或者2至8、或者3至5、或者3個(gè)插入位點(diǎn)中?？梢詫愒春怂嵝蛄胁迦氲讲《净蚪M非關(guān)鍵區(qū)域中。根據(jù)本發(fā)明的另ー實(shí)施方案，將異源核酸序列插入到MVA基因組的天然缺失位點(diǎn)(公開于PCT/EP96/02926中)。根據(jù)進(jìn)一歩的可選方案，可以將異源序列插入到痘病毒基因組的基因間區(qū)域(參見W003/097845)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉將異源序列插入到痘病毒基因組中的方法。作為實(shí)例，可以將表達(dá)盒插入到MVA基因組(特別是MVA-BN和其衍生物的基因組)的ー個(gè)或者多個(gè)基因間區(qū)域 IGR 07/08, IGR I4L/I5L 和 IGR 136/137 中。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，重組MVA是MVA-BN或者其衍生物，并且將下列表達(dá)盒插入到下列插入位點(diǎn)中(i)將以融合蛋白表達(dá)以此順序或者不同順序的Vif-Vpu-Vpr-Rev的表達(dá)盒插入到基因間區(qū)域IGR 07/08中，其中Vif、Vpu、Vpr和Rev表示全長蛋白或者全長蛋白的部分或衍生物(參見上文的定義)；(ii)將表達(dá)Nef或其部分或衍生物，特別是缺失N末端氨基酸(例如前19個(gè)氨基酸)的Nef蛋白的第二表達(dá)盒插入到IGR I4L/I5L中，(iii)將表達(dá)Tat或其部分或衍生物，特別是反式顯性Tat的第三表達(dá)盒和表達(dá)Gag-Pol融合蛋白的第四表達(dá)盒插入到IGR 136/137中，其中Gag和Pol表示全長蛋白或者全長蛋白的部分或衍生物。在該實(shí)例中，第三和第四表達(dá)盒被插入到相同的整合位點(diǎn)，其中這兩個(gè)表達(dá)盒可以以兩種可能的順序排列。對(duì)于IGR的編號(hào)參見W003/097845。需要考慮的是，位于ー側(cè)的IGR I4L/I5L和位于另ー側(cè)的IGR 136/137、IGR 07/08屬于兩種不同的編號(hào)系統(tǒng)，這在W003/097845中有解釋。最優(yōu)選地，本發(fā)明的重組MVA是病毒基因組中包含下列表達(dá)盒的重組MVA (i)以融合蛋白表達(dá)Vif-Vpu-Vpr-Rev的表達(dá)盒，其被插入到基因間區(qū)域IGR07/08 中，(ii)表達(dá)缺失N末端前19個(gè)氨基酸的Nef蛋白的第二表達(dá)盒，其被插入到IGRI4L/I5L 中，(iii)表達(dá)反式顯性Tat的第三表達(dá)盒和表達(dá)Gag-Pol融合蛋白的第四表達(dá)盒,其均被插入到IGR 136/137中。根據(jù)本發(fā)明的重組病毒可以誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答。術(shù)語“保護(hù)性免疫應(yīng)答”是指經(jīng)接種的受試者能夠以某種方式控制接種所針對(duì)的病原體的感染。通常，已經(jīng)產(chǎn)生“保護(hù)性免疫應(yīng)答”的動(dòng)物比未接種受試者的臨床癥狀溫和和/或疾病的進(jìn)展被緩解。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含如上文所定義的重組MVA以及任選地藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、佐劑和/或添加劑的藥物組合物或者疫苗。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉多種制備痘病毒制劑的方法以及儲(chǔ)存方式。此處參考 W003053463。輔助物質(zhì)的非限定性實(shí)例是水、鹽溶液、甘油、こ醇、潤濕劑或者乳化剤、pH緩沖物質(zhì)、防腐劑或穩(wěn)定劑等。適合的載體通常選自包含代謝緩慢的大分子的組，所述大分子為例如蛋白、多糖、聚乳酸、聚こ醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物或脂質(zhì)聚合物等。為了制備疫苗，將根據(jù)本發(fā)明的重組MVA病毒轉(zhuǎn)化為生理上可接受的形式。這可以基于在針對(duì)天花的接種中使用的痘病毒疫苗的制備經(jīng)驗(yàn)而進(jìn)行(如Stickl，H等，Dtsch.med. Wschr. 99，2386-2392 [1974]有描述)。例如，將經(jīng)純化的病毒配制于IOmM Tris、140mMNaCl (pH7. 4)中，滴度為 5X 108TCID5(l/ml，儲(chǔ)存于-80°C。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的MVA病毒用于制備疫苗針劑。例如，將大約IO2至大約IO8個(gè)病毒顆粒凍干在含具有2%蛋白胨和I %人白蛋白的IOOml磷酸鹽緩沖液(PBS)的安瓿瓶，優(yōu)選玻璃安瓿瓶中。在另ー個(gè)非限定性實(shí)例中，通過使包含病毒的制劑逐步冷凍-干燥，而生產(chǎn)疫苗注射針劑。在某些實(shí)施方案中，該制劑可以含有額外的添加剤，例如甘露醇、葡萄聚糖、糖、甘氨酸、乳糖或聚こ烯吡咯烷酮或者適于體內(nèi)施用的其他輔料，例如抗氧化劑或者隋性氣體、穩(wěn)定劑或者重組蛋白(例如人血清白蛋白)。接著將玻璃安瓿瓶密封，其可以在4°C至室溫之間儲(chǔ)存數(shù)月。但是，只要不是急需，安瓿瓶?jī)?yōu)選在_20°C以下儲(chǔ)存。為了接種或者治療，可以將凍干物溶解于0. I至0. 5ml水溶液，優(yōu)選生理鹽水或者Tris緩沖液中，并且全身性或者局部施用，即通過胃腸外、皮下、肌內(nèi)、經(jīng)劃痕或者本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的任何其他施用途徑施用。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用已知方法對(duì)施用方式、施用劑量和數(shù)量進(jìn)行優(yōu)化。但是，最常見的是，患者在首次接種針劑后約I個(gè)月至6周時(shí)接種第ニ針劑。第三注射和隨后的注射優(yōu)選在前次注射后4-12周給予。本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的重組MVA能夠誘導(dǎo)針對(duì)多于ー種重組表達(dá)的HIV蛋白的強(qiáng)的抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答。如上文已經(jīng)顯示的，考慮到觀察到的稱為免疫顯性的現(xiàn)象，這是出乎意料的結(jié)果，由此使宿主免疫系統(tǒng)僅給定免疫原中多個(gè)可能表位中的幾個(gè)表位產(chǎn)生應(yīng)答。對(duì)于MVA載體，之前的研究已經(jīng)表明非重組載體表位的免疫顯性阻止誘導(dǎo)針對(duì)重組抗原的強(qiáng)的⑶8T細(xì)胞應(yīng)答(Smith等，Immunodominance of poxviral-specif icし i'L in a human trial of recombmant-modiI led vaccinia Ankara. J. Immunol. 175 8431-8437，2005)。經(jīng)證明，疫苗引導(dǎo)的T細(xì)胞應(yīng)答主要針對(duì)痘病毒表位而引導(dǎo)。相比而言，使用本發(fā)明的重組MVA引起對(duì)多種重組HIV蛋白的強(qiáng)且廣泛的T細(xì)胞應(yīng)答。此外，對(duì)于誘導(dǎo)應(yīng)答的所有HIV蛋白，在接受首次接種后20周，免疫應(yīng)答仍高于基線水平。考慮到由于針對(duì)天花的較早接種而產(chǎn)生的針對(duì)骨架病毒載體的潛在的預(yù)先存在的免疫性和中和抗體的形成，這是進(jìn)一歩出乎意料的結(jié)果。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步涉及如上文所定義的重組MVA或者包含如上文所定義的重組MVA的藥物組合物或疫苗，用于誘導(dǎo)人類受試者體內(nèi)對(duì)至少3種、優(yōu)選至少4種、至少5種或者6種HIV蛋白的T細(xì)胞應(yīng)答，其中所述蛋白選自HIV Gag、Pol、Vpr、Vpu、Rev和Nef。本發(fā)明還涉及如上文所定義的重組MVA或者包含如上文所定義的重組MVA的藥物組合物或疫苗用于制備藥物的用途，所述藥物用于誘導(dǎo)人類受試者體內(nèi)對(duì)ー種或者多種HIV蛋白的T細(xì)胞應(yīng)答，特別是對(duì)3種、4種、5種、6種或者更多HIV蛋白的T細(xì)胞應(yīng)答，優(yōu)選對(duì)至少3種、至少4種、至少5種或者至少6種HIV蛋白的T細(xì)胞應(yīng)答，其中所述蛋白選自 HIV Gag、Pol、Vpr、Vpu、Rev 和 Nef。同樣地，本發(fā)明還涉及用于誘導(dǎo)人類受試者體內(nèi)對(duì)至少3種HIV蛋白的T細(xì)胞應(yīng)答的方法，所述HIV蛋白選自Gag、Pol、Vpr、Vpu、Rev和Nef，該方法包括施用如上文所定義的重組的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)。優(yōu)選待施用的重組MVA為有效量，以使其在人類受試者體內(nèi)誘導(dǎo)期望的效應(yīng)，即對(duì)至少3種HIV蛋白的T細(xì)胞應(yīng)答，優(yōu)選對(duì)至少4種，更優(yōu)選至少5種，甚至更優(yōu)選至少6種HIV蛋白的T細(xì)胞應(yīng)答，所述HIV蛋白選自Gag、Pol、Vpr、Vpu、Rev和Nef。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如上文所定義的重組MVA，其中所述MVA誘導(dǎo)人類受試者體內(nèi)對(duì)至少4種HIV-I蛋白的T細(xì)胞應(yīng)答，所述HIV-I蛋白選自Gag、Pol、Vpr > Vpu、Rev 和 Nef。在更加特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如上文所定義的重組MVA，其中所述MVA誘導(dǎo)人類受試者體內(nèi)對(duì)至少5種HIV-I蛋白的T細(xì)胞應(yīng)答，所述HIV-I蛋白選自Gag、Pol、Vpr > Vpu、Rev 和 Nef。在甚至更加特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如上文所定義的重組MVA，其中所述MVA誘導(dǎo)人類受試者體內(nèi)對(duì)至少6種HIV-I蛋白的T細(xì)胞應(yīng)答，所述HIV-I蛋白選自Gag、Pol、Vpr > Vpu、Rev 和 Nef。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文中定義的MVA誘導(dǎo)對(duì)選自Gag、Pol、Vpr、Vpu、Rev和Nef的蛋白的T細(xì)胞應(yīng)答所針對(duì)的HIV-I蛋白包括Gag、Pol和Nef。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述至少3種HIV蛋白是Gag、Pol和Nef。在另ー優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述3種HIV蛋白之一是選自由Gag、Pol、Nef、截短N(yùn)ef、Vpr、Vpu和Rev組成的組中的ー種。本發(fā)明進(jìn)一步涉及如上文所定義的重組MVA或者包含如上文所定義的重組MVA的藥物組合物或疫苗，其用于治療和/或預(yù)防HIV感染和/或AIDS。本發(fā)明還涉及如上文所定義的重組MVA或者包含如上文所定義的重組MVA的藥物組合物或疫苗在制備用于制備藥物中的用途，所述藥物用于治療和/或預(yù)防HIV感染和/或 AIDS。需要指出的是，術(shù)語“預(yù)防HIV感染和/或AIDS”(或“ HIV感染和/或AIDS的預(yù)防”)并不是指重組MVA在所有條件下在所有受試者中均預(yù)防HIV感染和/或AIDS。相反，該術(shù)語包括任何統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著意義的保護(hù)性作用，即使這種作用非常低。在進(jìn)ー步優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組MVA的施用劑量是IO5至5X 108TCID5Q/ml，優(yōu)選劑量是 2X108TCID5Q/ml。在另ー優(yōu)選的實(shí)施方案中，經(jīng)靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或者皮下施用所述重組MVA。附圖
簡(jiǎn)述圖I :表達(dá) 8 種 HIV 蛋白 Gag、Pol、Tat、Vif> Vpu、Vpr> Rev 和 Nef 的MVA-BN -MAG構(gòu)建體(MVA-mBN120B)。圖2 :HIV特異性T細(xì)胞應(yīng)答者比例。應(yīng)答者的百分?jǐn)?shù)由n (作為應(yīng)答者的受試者數(shù)量)并且基于N = 15的組計(jì)算得到。RT =逆轉(zhuǎn)錄酶，CTL =細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，HTL=輔助性T淋巴細(xì)胞。圖3A-D :所示HIV-I蛋白的中值SFU/1X106PBMC。箭頭表示接種。
實(shí)施例以下實(shí)施例將進(jìn)ー步闡述本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員將充分理解，所提供的實(shí)施例不能被解釋為將本發(fā)明提供的技術(shù)的應(yīng)用性限定于這些實(shí)施例。實(shí)施例I :重組MVA-BN的產(chǎn)生(該重組MVA-BN的病毒基因組中包含均處于ATI啟動(dòng)子調(diào)控下的截短的nef基因、gag-pol融合基因、反式顯性Tat基因和Vif-Vpr-Vpu-Rev融合基因)按照美國專利第7，501，127號(hào)中的描述產(chǎn)生MVA載體mBN87，所述美國專利通過引用并入本文。簡(jiǎn)而言之，利用PCR從感染HXB2的細(xì)胞的DNA獲得gag-pol融合基因。利用PCR從MVA-nef(LAI)的DNA擴(kuò)增nef基因，以獲得截短形式。去除前19個(gè)氨基酸，得到截短的Nef。利用RT-PCR從原始分離株MvP-899的HIV RNA獲得vif和vpu基因，而vpr、rev和tat基因則通過基于HXB2的序列的寡核苷酸退火合成。通過在Tat中引入兩個(gè)突變而產(chǎn)生突變的Tat蛋白，所述突變沒有定位于重要表位處但會(huì)導(dǎo)致喪失反式激活活性。所述突變是下列取代22(Cys > Gly)和37 (Cys > Ser)。將DNA構(gòu)建體克隆到重組載體中。在5輪斑純化后,通過PCR證實(shí)外源DNA的插入(截短的nef基因、gag-pol融合基因、反式顯性Tat基因和Vif-Vpr-Vpu-Rev融合基因)以及野生型病毒的消失。所產(chǎn)生的重組病毒克隆被命名為mBN87A。在非選擇性條件下進(jìn)行5輪斑純化后，可以分離出缺少選擇盒的重組病毒MVA-mBN87B。利用標(biāo)準(zhǔn)方法證實(shí)重組載體的身份。在MVA_mBN87B中，Vif-Vpr-Vpu-Rev基因在末端沒有終止密碼子，這導(dǎo)致31個(gè)非特異性氨基酸的加入。因此，將終止密碼子加入該融合基因中，克隆出新的重組病毒MVA-mBN120B。該構(gòu)建體(還參見圖I)用于在小鼠體內(nèi)的臨床前研究和在人體內(nèi)的臨床研究中。實(shí)施例2:在小鼠體內(nèi)的臨床前研究 研究MVA-mBN120B是否能夠在成年非轉(zhuǎn)基因小鼠(BALB/c)中發(fā)動(dòng)(mount)HIV特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。選擇最有希望的表位，并且對(duì)于每種蛋白合成兩種CD4細(xì)胞和兩種⑶8T細(xì)胞的肽。在第0和21天，對(duì)小鼠皮下(s.c.)施用作為對(duì)照的500 ill TBS(第I組)或者大約4X 108TCID5(lMVA-mBN120B (第2組)。在第35天，通過眼窩后穿刺從所有動(dòng)物收集血液樣品，并進(jìn)行處理，以使血清用于未來可能的分析。血液采樣后，通過頸椎脫位處死小鼠，并解剖出脾臟，以用于利用IFN y -ELISpot試驗(yàn)對(duì)由疫苗插入物中編碼的HIV特異性肽對(duì)脾細(xì)胞的再刺激產(chǎn)生的細(xì)胞免疫應(yīng)答進(jìn)行隨后分析。通過用特異性肽對(duì)脾細(xì)胞的再刺激以及隨后通過ELISpot試驗(yàn)對(duì)由脾細(xì)胞釋放的IFNy的檢測(cè)，確定HIV蛋白特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。所述肽如下所示，顯示肽名稱、T細(xì)胞限制和肽序列
NeM CD4FHHVARELHPEYFKNC (SEQ ID NO:1)
Nef-2 CD4DPEREVLEWRFDSRLA (SEQ ID NO:2)
Nef-3 CD8HTQGYFDP (SEQ ID NO:3)
Nef-4 CD8RYPLTFGWC (SEQ ID NO:4)
Gag-1 CD4IYKRWIILGLNK (SEQ ID NO:5)
Gag-2 CD4GLNKIVRMYSPT (SEQ ID NO:6)
Gag-3 CD8AMQMLKETI (SEQ ID NO:7)
Gag-4 CD8EIYKRWIIL (SEQ ID NO:8)
Pol-1 CD4VQNANPDCK (SEQ ID NO:9)
Pol-2 CD4TIKIGGQLK (SEQ ID NO: 10)
Pol-3 CD8IFQSSMTKI (SEQ ID NO: 11)
Pol-4 CD8QPDKSESEL (SEQ ID NO:12)
Tat-1 CD4FITKALGISYGRK (SEQ ID NO: 13)
Tat-2 CD4RQRRRAHQN (SEQ ID NO: 14)
Tat-3 CD8QPKTAGTNC (SEQ ID NO: 15)
Tat-4 CD8SFITKALGI (SEQ ID NO: 16)
Vif-1 CD4KKAKGWMYK (SEQ ID NO: 17)
Vif-2 CD4RCEYQAGHN (SEQ ID NO: 18)
Vif-3 CD8QYLALAALI (SEQ ID NO: 19)
Vif-4 CD8AGHNKVGSL (SEQ ID N0:20)
Vpu-1 CD4KPQKTKGHR (SEQ ID NO:21)
Vpu-2 CD4WAGVEAIIR (SEQ ID NO:22)
Vpu-3 CD8TYGDTWAGV (SEQ ID NO:23)
Vpu-4 CD8AGVEAIIRl (SEQ ID NO:24)
Vpr-1 CD4IVLIEYRKI (SEQ ID NO:25)
Vpr-2 CD4EEALAALVD (SEQ ID NO:26)
Vpr-3 CD8TQPIPIVAI (SEQ ID NO:27)
Vpr-4 CD8VLIEYRKIL (SEQ ID NO:28)
Rev-1 CD4RQARRNRRR (SEQ ID NO:29)
Rev-2 CD4SPQILVESP (SEQ ID N0:30)
Rev-3 CD8SGDSDEELI (SEQ ID NO:31)
Rev-4 CD8LPPLERLTL (SEQ ID NO:32)簡(jiǎn)而言之，首先將含有500 yg各肽的試樣溶解于小體積的ニ甲基亞砜中，接著用RPMI培養(yǎng)基進(jìn)一歩稀釋，以獲得lmg/ml的儲(chǔ)存液(額外需要體積為5至25 的こ酸以確保肽#4、14、20和21的完全重建；額外需要5至25 ill的體積以確保肽#20、22、23和24
的完全重建)。利用“ Saw 03”程序在Dispomix管中進(jìn)行脾臟勻漿化。勻漿化后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至50ml管中，離心，并用紅血細(xì)胞裂解液使紅細(xì)胞裂解5分鐘。在兩次清洗步驟后，將細(xì)胞懸液的小試樣與臺(tái)盼藍(lán)混合，并利用計(jì)數(shù)室(Madaus)通過手動(dòng)計(jì)數(shù)計(jì)算細(xì)胞濃度。針對(duì)單獨(dú)的脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度。在將細(xì)胞鋪在ELISpot板(預(yù)先包被有抗IFNy抗體)中后，加入終濃度為2. g/ml的肽。在具有被水平鋪板的不同小鼠的脾細(xì)胞和被垂直鋪板的不同刺激物(即板1+5、2+6、3+7、4+8分別覆蓋用肽#1-8、9-16、17-24、25-32的刺激)的水平朝向的ELISpot板上進(jìn)行每孔2. 5X IO5個(gè)脾細(xì)胞一式雙份的孵育。在板5和10上，在第B、E或者H行分別用0. 5 ii g刀豆球蛋白A(ConA)和0. 5 y g/ml葡萄球菌腸毒素B(SEB)作為陽性對(duì)照或者用培養(yǎng)基對(duì)照作為陰性對(duì)照進(jìn)行孵育。過夜孵育19小時(shí)后，按照生產(chǎn)商的建議使ELISpot板顯色。
權(quán)利要求
1.一種重組的改良安卡拉痘苗病毒(MVA),其病毒基因組中包含用于表達(dá)至少6種HIV蛋白或者其中包含對(duì)應(yīng)于全長蛋白的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸的所述蛋白的一部分或所述蛋白的衍生物的一個(gè)或者多個(gè)表達(dá)盒，所述HI V蛋白選自Gag、Po I、Tat、Vi f、Vpu、Vpr、Re V和Nef,所述病毒用于誘導(dǎo)人類受試者體內(nèi)對(duì)選自Gag、Pol、Vpr> Vpu、Rev和Nef中至少3種HIV蛋白的T細(xì)胞應(yīng)答，其中HIV蛋白氨基酸序列的衍生物是顯示與已知HIV分離株中相應(yīng)HIV蛋白的氨基酸序列具有至少50%同源性的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)，其中所述病毒基因組包含用于表達(dá)至少6種HIV蛋白或其部分或所述蛋白的衍生物的ー個(gè)或者多個(gè)表達(dá)盒，所述HIV 蛋白選自 Gag、Pol、Vpu、Vpr> Rev 和 Nef。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的重組的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)，其中所述病毒基因組包含用于表達(dá)至少8種HIV蛋白或其部分或所述蛋白的衍生物的一個(gè)或者多個(gè)表達(dá)盒，所述 HIV 蛋白選自 Gag、Pol、Tat、Vif、Vpu、Vpr> Rev 和 Nef。
4.權(quán)利要求I至3中任一項(xiàng)所述的重組的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)在制備藥物或者疫苗中的用途，所述藥物或者疫苗用于誘導(dǎo)人類受試者體內(nèi)對(duì)至少3種HIV蛋白的T細(xì)胞應(yīng)答，所述HIV蛋白選自Gag、Pol、Vpr、Vpu、Rev和Nef。
5.一種誘導(dǎo)人類受試者體內(nèi)對(duì)至少3種HIV蛋白的T細(xì)胞應(yīng)答的方法，所述HIV蛋白選自Gag、Pol、Vpr、Vpu、Rev和Nef,所述方法包括施用權(quán)利要求I至3中任一項(xiàng)所述的重組的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項(xiàng)的所述重組的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)、權(quán)利要求.4所述的用途或者權(quán)利要求5所述的方法，其中所述MVA誘導(dǎo)人類受試者體內(nèi)對(duì)至少4種HIV-I蛋白的T細(xì)胞應(yīng)答。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至3和6中任一項(xiàng)所述的重組的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)、權(quán)利要求4或6所述的用途或者權(quán)利要求5或6所述的方法，其中所述MVA誘導(dǎo)人類受試者體內(nèi)對(duì)至少5種HIV-I蛋白的T細(xì)胞應(yīng)答。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至3、6和7中任一項(xiàng)所述的重組的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)、權(quán)利要求4、6和7中任一項(xiàng)所述的用途、或者權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述MVA誘導(dǎo)人類受試者體內(nèi)對(duì)至少6種HIV-I蛋白的T細(xì)胞應(yīng)答。
9.根據(jù)權(quán)利要求I至3和6至8中任一項(xiàng)所述的重組的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)、權(quán)利要求4和6至8中任一項(xiàng)所述的用途、或者權(quán)利要求5至8中任一項(xiàng)所述的方法，其中MVA誘導(dǎo)的人類受試者體內(nèi)的T細(xì)胞應(yīng)答所針對(duì)的HIV-I蛋白包括Gag、Pol和Nef。
10.根據(jù)權(quán)利要求I至3和6至9中任一項(xiàng)所述的重組MVA、權(quán)利要求4和6至9中任一項(xiàng)所述的用途、或者權(quán)利要求5至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受試者是無免疫應(yīng)答的。
11.根據(jù)權(quán)利要求I至3和6至10中任一項(xiàng)所述的重組MVA、權(quán)利要求4和6至10中任一項(xiàng)所述的用途、或者權(quán)利要求5至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受試者感染了HIV-I0
12.根據(jù)權(quán)利要求I至3和6至11中任一項(xiàng)所述的重組MVA、權(quán)利要求4和6至11中任一項(xiàng)所述的用途、或者權(quán)利要求5至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受試者的CD4細(xì)胞數(shù)量少于350/ii I。
13.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的重組MVA、用途或者方法，其中所述MVA的基因組包含編碼含有Vif、Vpu、Vpr和Rev的融合蛋白的表達(dá)盒、編碼Nef的表達(dá)盒、編碼Gag-Pol融合蛋白的表達(dá)盒以及編碼Tat的表達(dá)盒。
14.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的重組MVA、用途或者方法，其中所述Nef是N末端截短的Nef和/或其中所述Tat是反式顯性Tat。
15.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的重組MVA、用途或者方法，其中病毒基因組中包含 (i)表達(dá)作為融合蛋白的Vif-Vpu-Vpr-Rev的表達(dá)盒，其被插入到基因間區(qū)域IGR07/08 中， (ii)表達(dá)缺失N末端前19個(gè)氨基酸的Nef蛋白的第二表達(dá)盒，其被插入到IGRI4L/I5L 中， (iii)表達(dá)反式顯性Tat的第三表達(dá)盒和表達(dá)Gag-Pol融合蛋白的第四表達(dá)盒,其均被插入到IGR 136/137中。
16.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的重組MVA，其任選地與藥學(xué)上可接受的載體、稀釋齊U、佐劑和/或添加劑一起施用。
17.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的重組MVA、用途或者方法，用于在治療和/或預(yù)防HIV感染和/或AIDS。
18.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的重組MVA、用途或者方法在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療和/或預(yù)防HIV感染和/或AIDS。
19.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的重組MVA、用途或者方法，其中向人類受試者施用劑量為IO7至109TCID5Q/ml的所述重組MVA。
20.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的重組MVA、用途或者方法，其中向人類受試者施用劑量為IO8至109TCID5Q/ml的所述重組MVA。
21.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的重組MVA、用途或者方法，其中向人類受試者施用劑量為2X108TCID5Q/ml的所述重組MVA。
22.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的重組MVA、用途或者方法，其中所述重組MVA被施用至少3次。
23.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的重組MVA、用途或者方法，其中在第0、4和12周施用所述重組MVA。
24.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的重組MVA、用途或者方法，其中所述重組MVA是MVA-BN0
25.包含如上述權(quán)利要求任ー項(xiàng)中所述的重組MVA的藥物組合物或者疫苗組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及用作藥物或者疫苗的重組的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)及其在治療和/或預(yù)防HIV感染和AIDS中的用途，所述病毒的病毒基因組中包含用于表達(dá)HIV蛋白或者其部分或衍生物的一個(gè)或者多個(gè)表達(dá)盒，所述HIV蛋白選自Gag、Pol、Tat、Vif、Vpu、Vpr、Rev和Nef，或者選自Gag、Pol、Vpu、Vpr、Rev和Nef。
文檔編號(hào)C12N15/863GK102656271SQ201080041553
公開日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2010年10月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月8日
發(fā)明者保羅·查普林, 理查德·尼古拉斯 申請(qǐng)人:巴法里安諾迪克有限公司