專利名稱：Znf217乳腺癌復(fù)發(fā)、浸潤和轉(zhuǎn)移表型的一種新預(yù)后和預(yù)測生物標志物的制作方法
ZNF21 7 乳腺癌復(fù)發(fā)、浸潤和轉(zhuǎn)移表型的一種新預(yù)后和預(yù)
測生物標志物本發(fā)明涉及用于確定乳腺癌預(yù)后的方法和試劑盒。方法涉及確定取自患者的樣本中ZNF217基因的表達水平，其中ZNF217的過量表達與癌癥的轉(zhuǎn)移幾率和再發(fā)/復(fù)發(fā)幾率相關(guān)聯(lián)。癌癥是主要的健康問題，每年使全世界幾百萬人死亡。癌癥的診斷方法已經(jīng)得到改進，現(xiàn)在經(jīng)常有可能在早期診斷癌癥。為了使癌癥治療有效，需要精確和簡單的癌癥預(yù)后方法。經(jīng)?；诮M織學(xué)和臨床數(shù)據(jù)確定癌癥預(yù)后，如腫瘤大小、浸潤、擴散到淋巴結(jié)或轉(zhuǎn)移。然而，這種確定方式經(jīng)常難以當(dāng)在臨床癥狀和組織學(xué)數(shù)據(jù)不可用或不可信時早期診斷的癌癥中進行。傳統(tǒng)地，乳腺癌標志物如ER α (ER)(通過免疫組織化學(xué)檢測)和ERBB2/HER2 (通過免疫組織化學(xué)和/或FISH檢測)已經(jīng)用于癌癥預(yù)后，并且ER-陰性和/或ERBB2/HER2-陽性的乳腺腫瘤是具有不良的預(yù)后的腫瘤。然而，約60-70 %的乳腺癌是ER+乳腺癌，而 ERBB2/HER2+乳腺癌僅代表全部乳腺癌的約15_20%。因此急需新的預(yù)后生物標志物，或者向目前使用的生物標志物增加新的預(yù)后/預(yù)測價值，或者預(yù)測癌癥的復(fù)發(fā)/再發(fā)，特別是在目前視為“具有較好預(yù)后的癌癥”的那些乳腺癌，即在ER-陽性乳腺癌中，和特別地，在 ER-陽性HER2-陰性乳腺癌中。近來，已提出了免疫組織學(xué)(ER、PR、HER2、KI67)和/或臨床(SBR)參數(shù)將乳腺癌分類為生物上獨特和行為完全不同的亞型(Blows等，2010 ；Cheang等，2009 ；Hugh等， 2009 ；Millar等，2009 ；Nguyen等，2008)。不同分子亞組的預(yù)后和化學(xué)治療敏感性不同。 Luminal-樣癌癥是ER+和/或PR(黃體酮受體)-陽性的，并且因此對于內(nèi)分泌治療敏感， 具有比HER2+和Triple陰性亞型更有利的預(yù)后，甚至在不進行任何治療的情況下。Luminal B亞型與表達HER2或具有由KI67或SBR給出的高增殖表型的那些亞型等同(考慮觀察到的有絲分裂次數(shù))(Cheang 等，2009 ；Hugh 等，2009 ；Mi Ilar 等，2009 ；Nguyen 等，2008 ；Voduc 等，2010)。已顯示Luminal B乳腺癌具有比Luminal A乳腺癌更不利的長期存活率(Blows 等，2010 ；Cheang 等，2009 ；Hugh 等，2009 ；Nguyen 等，2008 ；Voduc 等，2010)。最重要的是關(guān)于旨在將Luminal亞類，特別是Luminal A亞類重新分級的標志物。W098/02539描述了來自癌癥相關(guān)的染色體20上擴增區(qū)域的基因。披露的基因可以用作對20ql3擴增子特異的探針，用于監(jiān)測腫瘤細胞基因組中相應(yīng)序列的相對拷貝。根據(jù)此文件，ZABC-I基因(ZNF217基因)定位于20ql3. 2擴增子的核心，并且在原發(fā)性和具有20ql3. 2擴增的乳癌細胞系中過量表達。根據(jù)W098/02539，是否存在20ql3蛋白和/或 20ql3蛋白的表達水平是是否存在癌癥或癌癥程度的指示。然而，在W098/02539中，腫瘤樣本中未測量ZABC-I基因(ZNF217基因)的表達水平，而較短的無病存活僅與高水平20ql3 擴增相關(guān)聯(lián)。W02006/065940描述了新的預(yù)后和治療靶標，HTPAP基因，當(dāng)其擴增后可以在乳腺癌患者中賦予不良的預(yù)后。HTPAP基因的擴增可以與其它擴增如ZNF217擴增子的檢測相關(guān)。Sun Guiqin等Q008)描述了 ZNF217沉默對于人類卵巢癌細胞系生物行為的影響 (Sun 等，2008)。根據(jù)Li Jing等Q006)，ZNF217擴增與卵巢癌顯著相關(guān)(Li等，2006)。Quinlan等Q007)關(guān)注ZNF217是致癌基因的證據(jù)，其在多種癌癥中擴增 (Quinlan 等，2007)。Huang Guiqing等Q005)提供了實驗室實驗，顯示ZNF217抑制與化學(xué)治療和端粒功能紊亂有關(guān)的細胞死亡(Huang等，2005)。W003/079748涉及通過ZNF217抑制的癌癥治療的作用增強。在6.8% (Tanner 等，2000)、8% (Ginestier 等，2006 ;Plevova 等，2010)和 19 % (Letessier等，2006)的乳腺癌中發(fā)現(xiàn)高水平20ql3擴增。然而，由于幾項研究已顯示，在某些情況下，基因或染色體區(qū)域的擴增水平對腫瘤樣本中基因表達水平具有主要影響，其它機制如外遺傳、轉(zhuǎn)錄或后轉(zhuǎn)錄機制也是對基因表達做出貢獻的重要事件。對于ZNF217的擴增和ZNF217的表達水平也是如此，因為在乳腺腫瘤和不具有擴增的乳腺細胞系中能觀察到高 ZNF217 表達水平(Collins 等，1998 ;Collins 等，2001)。此外，Mackay 等 Q009)未發(fā)現(xiàn)ZNF217表達和ZNF217基因拷貝數(shù)之間的任何顯著關(guān)聯(lián)(Mackay等，2009)。進一步地，20ql3擴增與乳腺癌中具有不良的預(yù)后的關(guān)聯(lián)程度還不清楚。 Letessier等Q006)未發(fā)現(xiàn)高水平20ql3擴增和乳腺癌中不良結(jié)果之間的任何關(guān)聯(lián) (Letessier等，2006)。相反地，另一項研究可觀察到乳腺癌中20ql3擴增的預(yù)后值，但是只有高水平20ql3擴增而沒有低/中水平20ql3擴增(Tanner等，1995)。引人注目的是， 20ql3擴增可能同時與乳腺癌中良好的預(yù)后或預(yù)后差有關(guān)。Ginestier等Q006)觀察到兩種類型的擴增。在第一種類型中，ZNF217基因座擴增但是20ql3的另外兩個基因座沒有檢測到擴增(Ginestier等，2006)。在第二種類型中，擴增區(qū)域更長而且涉及ZNF217、MYBL2和 STK6中的兩個或三個基因座。兩種類型表現(xiàn)出不同的基因表達譜，并且與包括淋巴結(jié)狀態(tài)和存活率的不同組織臨床特征相關(guān)。在兩個或三個基因座擴增的腫瘤與良好的預(yù)后相關(guān)， 而僅在ZNF217擴增的腫瘤更頻繁地與不良的預(yù)后相關(guān)。Ginestier等進一步確證了 ZNF217 mRNA表達水平和僅擴增ZNF217的腫瘤中的ZNF217擴增之間沒有統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)，而且ZNF217 mRNA表達水平不能將這些腫瘤與沒有任何擴增的腫瘤相區(qū)分(Ginestier等，2006)。最后，兩項研究發(fā)現(xiàn)ZNF217擴增與ER-和PR-陰性狀態(tài)相關(guān)(Letessier等，2006 ； Plevova 等，2010)。因此乳腺癌中ZNF217擴增和ZNF217表達水平的預(yù)后值仍然很不清楚。本發(fā)明顯示ZNF217的表達水平，其獨立于ZNF217基因的擴增，代表乳腺癌患者中易再發(fā)和發(fā)展轉(zhuǎn)移的不良的預(yù)后的新標志物。更具體地，ZNF217是乳腺癌的強力的不良的預(yù)后標志物，所述乳腺癌通過目前可用的臨床標志物/參數(shù)分類為具有良好/更好的預(yù)后的癌癥(例如ER+亞類，HER2-亞類，Luminal亞類(ER+和/或I3R+)，ER+/HER2-亞類，SBRl 禾口 /或SBR2亞類，無/少淋巴結(jié)侵入亞類(彡3)，ER+和/或PR+和SBRl和/或SBR2亞類，ER+/HER2-/SBR1和/或SBR2亞類，ER+/HER2-/SBR1和/或SBR2/無/少淋巴結(jié)侵入 (彡3)亞類，Luminal A亞類)。因此單獨或者與其它預(yù)后標志物一起評價ZNF217表達水平可以將分類為具有良好/更好的預(yù)后的癌癥重新分級為兩個亞類“良好的預(yù)后”乳腺癌(低ZNF217表達水平)或“預(yù)后差”乳腺癌(高ZNF217表達水平)，從而幫助臨床醫(yī)生做出治療決定。令人吃驚地是，ZNF217比常用于癌癥預(yù)后的其它標志物如ERBB2/HER2和ESR1/ER 的預(yù)后值更高。因此通過常規(guī)技術(shù)分類為具有“良好的預(yù)后”，但具有表達的ZNF217水平高于正常水平的腫瘤的患者為侵襲性癌癥治療的候選者。此外，由于去調(diào)控的ZNF217表達水平與對內(nèi)分泌治療或內(nèi)分泌/化學(xué)治療的應(yīng)答減弱有關(guān)，所以ZNF217也代表抗癌治療的預(yù)測性標志物，并且特別是，內(nèi)分泌治療的預(yù)測性標志物。本發(fā)明顯示ZNF217是一種強大的工具，用于在ER-陽性或ER-陽性HER2-陰性乳腺腫瘤中鑒定患有侵襲性腫瘤、對于無復(fù)發(fā)存活具有不良的預(yù)后和/或?qū)τ诳偞婊罹哂胁涣嫉念A(yù)后的患者。因此，ZNF217是不良預(yù)后的生物標志物，與乳腺癌的實際生物標志物相比具有增加的價值，因為ZNF217允許對ER+和/或PR+乳腺腫瘤樣本和ER+和/或 PR+/HER2-乳腺腫瘤樣本進行分級。通常通過內(nèi)分泌療法治療ER-陽性乳腺腫瘤。ZNF217 表達狀態(tài)的確定為臨床醫(yī)生提供有用的信息來決定最佳療程，因為ER-陽性HER2-陰性 ZNF217-陽性腫瘤是易于發(fā)展轉(zhuǎn)移和/或在治療下再發(fā)的更具侵襲性的腫瘤。這些腫瘤因此為更具有侵襲性的癌癥療法的候選者。發(fā)明簡述本發(fā)明涉及用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，所述乳腺癌如由傳統(tǒng)免疫組織化學(xué)和/或組織學(xué)分級確定的具有良好的預(yù)后，所述方法包括測定來自所述患者的樣本中 ZNF217基因的表達水平，和如果所述樣本中ZNF217基因過量表達則將癌癥分類為具有不良的預(yù)后。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法可以將如通過常規(guī)方法確定的具有“良好”預(yù)后的患者重新分級或重新分類。優(yōu)選地，所述患者已經(jīng)診斷為患有乳腺癌，顯示選自如下的良好的預(yù)后的至少一種標志物ER+、PR+> HER2-、低增殖指數(shù)(由SBRl和SBR2給出或由低KI67給出)、 Luminal亞類、Luminal A亞類和淋巴結(jié)狀態(tài)(無/少淋巴結(jié)侵入，^ 3)。在本發(fā)明的方法中，如果所述樣本中ZNF217基因過量表達，則將癌癥分類或再分類為易復(fù)發(fā)和/或易發(fā)展浸潤或轉(zhuǎn)移表型。在第一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，所述方法包括下述步驟-對先前取自所述患者的樣本測試乳腺癌的至少一種預(yù)后標志物，并評價所述樣本中ZNF217基因的表達水平；-如果樣本顯示出可將乳腺癌分類為具有有利的預(yù)后的至少一種標志物，當(dāng)所述樣本中ZNF217基因過量表達時則將乳腺癌再分類為具有不良的預(yù)后。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于確定患者中乳腺癌患者的預(yù)后的方法，所述方法包括下述步驟-對先前取自所述患者的樣本測試乳腺癌的至少一種預(yù)后標志物，-如果樣本顯示至少一種將乳腺癌分類為具有有利的預(yù)后的標志物，則評價 ZNF217基因的表達水平，
-如果所述樣本中ZNF217基因過量表達，將乳腺癌分類為具有不良的預(yù)后。優(yōu)選地，所述將乳腺癌分類為具有有利的預(yù)后的預(yù)后標志物通過組織學(xué)分級系統(tǒng)和/或免疫組織化學(xué)分級系統(tǒng)和/或ERBB2擴增的檢測而確定。更優(yōu)選地，所述將乳腺癌分類為具有有利的預(yù)后的預(yù)后標志物選自下組ER+、 PR+、HER2-、低增殖指數(shù)(由SBRl和SBR2給出或有低KI67給出)、Luminal亞型、Luminal A亞型和淋巴結(jié)狀態(tài)(無/少淋巴結(jié)浸潤(S3))。甚至更優(yōu)選地，所述將乳腺癌分類為具有有利的預(yù)后的預(yù)后標志物將乳腺癌分類為選自下組的亞類ER+亞類、HER2-亞類、Luminal亞類(ER+和/或PR+)、ER+/HER2-亞類、SBRl和/或SBR2亞類、無/少淋巴結(jié)浸潤亞類(彡3)、ER+和/或PR+和SBRl和/或 SBR2 亞類、ER+/HER2-/SBR1 和 / 或 SBR2 亞類、ER+/HER2-/SBR1 和 / 或 SBR2/ 無 / 少淋巴結(jié)浸潤(< 3)亞類、Luminal A亞類。表現(xiàn)為低增殖表型的SBRl和/或SBR2可以由相應(yīng)亞類中的低KI67代替。優(yōu)選地，如果在所述樣本中ZNF217基因過量表達，則將癌癥再分類為易復(fù)發(fā)和/ 或易發(fā)展浸潤或轉(zhuǎn)移表型。優(yōu)選地，如果在所述樣本中ZNF217基因過量表達，則將癌癥分類或再分類為對于無再發(fā)存活具有不良的預(yù)后。在其它實施方案中，如果在所述樣本中ZNF217基因過量表達，則將癌癥分類或再分類為對于總存活具有不良的預(yù)后。在其它實施方案中，如果在所述樣本中ZNF217基因過量表達，則將癌癥分類或再分類為在內(nèi)分泌治療下具有不良的預(yù)后。在其它實施方案中，如果在所述樣本中ZNF217基因過量表達，則將癌癥分類或再分類為在化學(xué)治療和/或在內(nèi)分泌治療下具有不良的預(yù)后。在其它實施方案中，如果在所述樣本中ZNF217基因過量表達，則將癌癥分類或再分類為在內(nèi)分泌治療下具有不良的預(yù)后。在其它實施方案中，如果在所述樣本中ZNF217基因過量表達，則將癌癥分類或再分類為在化學(xué)治療下具有不良的預(yù)后。在本發(fā)明的方法中，ZNF217基因的表達水平優(yōu)選與對照樣本相比較。在一些實施方案中，對照樣本是健康群體中觀察到的ZNF217基因表達的中值水平。有利地，對照樣本是取自患有乳腺癌的患者的樣本中ZNF217表達的中值水平。優(yōu)選地，所述樣本是乳腺腫瘤樣本。本發(fā)明還涉及將如通過免疫組織化學(xué)和/或ERBB2擴增的檢測和/或組織學(xué)分級確定的具有有利的預(yù)后的乳腺癌患者再分級的方法，所述方法包括測量來自至少一位患者的樣本中的ZNF217基因的表達水平，并且如果在所述樣本中ZNF217基因過量表達則將患者再分類為具有不良的預(yù)后。優(yōu)選地，乳腺癌患者具有選自如下的良好的預(yù)后的至少一個標志物ER+、PR+、 HER2-、SBRl 和 / 或 SBR2、低 KI67、Luminal 亞類、Luminal A 亞類和淋巴結(jié)狀態(tài)(< 3)。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法包括通過定量ZNF217基因的mRNA而測量樣本中ZNF217基因的表達水平。
優(yōu)選地，本發(fā)明的方法包括通過定量由ZNF217基因編碼的多肽而測量樣本中ZNF 基因的表達水平。發(fā)明詳述本發(fā)明基于ZNF217基因的表達水平是乳腺癌的顯著預(yù)后標志物的觀察結(jié)果。更具體地，ZNF217在乳腺癌患者中有高的預(yù)后值，所述患者先前已通過傳統(tǒng)技術(shù)分類為具有 “有利”或“良好”的預(yù)后。ZNF217是通過當(dāng)前可用的臨床標志物/指示物分類為具有良好 /更好的預(yù)后的乳腺癌(例如ER+亞類、HER2-亞類、Luminal亞類(ER+和/或I3R+)、ER+/ HER2-亞類、SBRl和/或SBR2亞類、無/少淋巴結(jié)浸潤亞類(彡3)、ER+和/或PR+和SBRl 和 / 或 SBR2 亞類、ER+/HER2-/SBR1 和 / 或 SBR2 亞類、ER+/HER2-/SBR1 和 / 或 SBR2/ 無 / 少淋巴結(jié)浸潤(彡3)亞類、Luminal A亞類、表現(xiàn)出低增殖表型的SBRl和/或SBR2可以由相應(yīng)亞類中的低KI67代替)的強的預(yù)后不良標志物。因此單獨或與其它預(yù)后標志物一起評價ZNF217表達水平可以將這些分類為具有良好/更好的預(yù)后的癌癥再分級成兩個亞類“預(yù)后良好”的乳腺癌(低ZNF217表達水平)或“預(yù)后差”的乳腺癌(高ZNF217表達水平)，從而為臨床醫(yī)生提供有幫助的信息。令人驚訝的是，ZNF217具有高于常用于癌癥預(yù)后的其他標志物，如ERBB2/HER2和ESR1/ER的預(yù)后值。ZNF217的過量表達或高表達水平是具有浸潤或轉(zhuǎn)移表型、對于無再發(fā)存活具有不良的預(yù)后和/或?qū)τ诳偞婊罹哂胁涣嫉念A(yù)后的乳腺腫瘤的特征。這個基因在乳腺癌細胞中的過量表達與疾病復(fù)發(fā)增加和預(yù)后變差在統(tǒng)計學(xué)上顯著相關(guān)。本發(fā)明涉及鑒定易復(fù)發(fā)的乳腺癌和/或乳腺腫瘤和/或患有或易發(fā)展浸潤或轉(zhuǎn)移表型的乳腺癌和/或乳腺腫瘤的方法。更特別地，本發(fā)明涉及鑒定易復(fù)發(fā)的乳腺癌和/或乳腺腫瘤和/或患有或易發(fā)展浸潤或轉(zhuǎn)移表型的乳腺癌和/或乳腺腫瘤的方法，其中所述乳腺癌或乳腺腫瘤先前由傳統(tǒng)技術(shù)分類為具有有利的預(yù)后?！鞍敝讣膊?，所述疾病中一組細胞表現(xiàn)不受控制的生長/分化、浸潤和有時轉(zhuǎn)移。“統(tǒng)計上顯著的”優(yōu)選指至少95%的置信水平(ρ < 0. 05)的關(guān)聯(lián)或相關(guān)。術(shù)語“浸潤”或“侵襲”指癌或快速生長的腫瘤，其具有擴展超越其邊界進入臨近組織的趨勢。術(shù)語“轉(zhuǎn)移”指癌或腫瘤從起源器官擴散至患者體內(nèi)的其它氣管/遠端部位。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，所述乳腺癌如通過免疫組織化學(xué)和/或ERBB2擴增的檢測和/或組織學(xué)分級確定的具有“良好”的預(yù)后， 所述方法包括測量來自所述患者的樣本中ZNF217基因的表達水平，并且如果在所述樣本中ZNF217基因過量表達，則將癌再分類為具有不良的預(yù)后。在第一個實施方案中，本發(fā)明涉及確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，所述方法包括下述步驟-對先前取自所述患者的樣本測試乳腺癌的至少一種預(yù)后標志物，并評價所述樣本中ZNF217基因的表達水平；-如果樣本顯示將乳腺癌分類為具有有利的預(yù)后的至少一種標志物，并且如果在所述樣本中ZNF217基因過量表達，則將乳腺癌再分類為具有不良的預(yù)后?？梢酝瑫r對樣本測試至少一種傳統(tǒng)預(yù)后標志物和ZNF217表達水平。也可以連續(xù)和獨立評價預(yù)后標志物和ZNF217表達水平。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，所述方法包括下述步驟-對先前取自所述患者的樣本測試乳腺癌的至少一種預(yù)后標志物，-如果樣本顯示至少一種將乳腺癌分類為具有有利的預(yù)后的標志物，則評價 ZNF217基因的表達水平，-如果在所述樣本中ZNF217基因過量表達，則將乳腺癌分類為具有不良的預(yù)后。對于通過傳統(tǒng)方法確定為具有有利的預(yù)后的乳腺癌，ZNF217表達水平的預(yù)后值增強。很多通過常規(guī)方法確定為具有“良好”的預(yù)后的乳腺癌患者仍然發(fā)展浸潤、轉(zhuǎn)移型癌或具有降低的無再發(fā)存活率或具有降低的總存活率。測量ZNF217基因的表達水平可將這些先前分類為具有“良好”的預(yù)后的患者再分類為兩個亞類“預(yù)后良好”的乳腺癌(低 ZNF217表達水平)或“預(yù)后差”的乳腺癌(高ZNF217表達水平)。術(shù)語“良好的預(yù)后”或“有利的”預(yù)后指患者比沒有預(yù)后優(yōu)良的一個或幾個給定標志物的患者和/或具有預(yù)后差的一個或幾個給定標志物的患者具有更好的預(yù)后。術(shù)語“標志物”指提供乳腺癌預(yù)后的指示物。乳腺癌腫瘤的亞分型和亞分類通常用標志物組合進行。這些標志物將乳腺癌分類成不同的亞型或亞類。傳統(tǒng)上使用免疫組織化學(xué)和/或ERBB2擴增的檢測和組織學(xué)分級確定乳腺癌的預(yù)后，從而確定對于乳腺癌患者最有效的療程。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法供用于對通過常規(guī)方法如免疫組織化學(xué)和/或ERBB2擴增的檢測和組織學(xué)分級確定的具有“良好”的預(yù)后的患者再分級或再分類。例如浸潤性乳腺癌的惡性可以根據(jù)任何合適的組織學(xué)分級系統(tǒng)評分。目前用于乳腺癌的大多數(shù)腫瘤分級系統(tǒng)組合了核分級、微管形成和有絲分裂率。最常用的分級系統(tǒng)之一是 karff-Bloom-Richardson (SBR)系統(tǒng)(Bloom 和 Richardson，1957)。SBR 等級或組織學(xué)等級對應(yīng)于腫瘤微管形成分數(shù)，加上有絲分裂分數(shù)的數(shù)目，加上核多形性分數(shù)的加和。然后將組合的分數(shù)轉(zhuǎn)換成下述SBR等級SBR1對應(yīng)于低等級，SBR2對應(yīng)于中等級，SBR3對應(yīng)于高等級。本發(fā)明的方法供用于對具有有利的SBR等級的乳腺癌患者再分級。在這些先前分類為具有“良好的預(yù)后”的患者中，ZNF217的高表達水平是預(yù)后差的標志物。其它傳統(tǒng)標志物是基于下述受體存在與否的受體狀態(tài)雌性激素受體(ER)、黃體酮受體(PR)和/或人類表皮生長因子受體2 (HER2/ErbB-2)。通常地，將ER+、PR+和/或 HER2-乳腺癌分類為具有“較好”/ “良好”的預(yù)后。通?？筛鶕?jù)公知的方法通過免疫組織化學(xué)和/或ERBB2擴增的檢測而確定受體狀態(tài)。ERBB2擴增的檢測通常通過FISH(熒光原位雜交)而進行。盡管很多這類患者將經(jīng)歷他們的乳腺癌復(fù)發(fā)，但是仍將ER+和/或HER2-亞類的乳腺癌視作具有“有利的”預(yù)后。在本發(fā)明的方法中，通過評價ZNF217基因的表達水平而進行這些患者/乳腺腫瘤的更精確的分類或再分級。其它傳統(tǒng)上視為預(yù)后“優(yōu)良”的乳腺癌亞型是Luminal和Luminal A亞型。 Luminal-樣癌癥是ER+和/或PR+的乳腺癌。Luminal A乳腺癌為ER+和/或PR+，HER2-并且具有低增殖指數(shù)(由低KI67給出或由SBRl和SBR2給出)(Cheang等，2009 ；Hugh等，2009 ；Voduc等，2010)。Luminal A乳腺癌也可為具有ER+和/或PR+和HER2-狀態(tài)的乳腺癌(Millar等，2009 ；Nguyen等，2008)或具有ER+和/或PR+和低增殖指數(shù)(由低KI67給出或由SBRl和SBR2給出)的乳腺癌(Voduc等，2010)。Luminal B乳腺癌是具有ER+和 /或PR+并且也具有HER2+或高增殖指數(shù)(高KI67或SBR!3)狀態(tài)的那些癌癥(Cheang等， 2009 ；Hugh等，2009)。Luminal B乳腺癌也可為僅具有ER+和/或PR+和HER2+的那些癌癥(Millar 等，2009 ；Nguyen 等，2008)。在本發(fā)明的方法中，Luminal和/或Luminal A亞型的乳腺腫瘤通過評價ZNF217 基因的表達水平而再分級或再分類。乳腺癌中另一個公知的預(yù)后指示物是淋巴結(jié)狀態(tài)?；加袥]有或很少浸潤淋巴結(jié) (^ 3)的乳腺癌的患者通常分類為具有有利的預(yù)后。在本發(fā)明的方法中，評價ZNF217基因的表達水平也供用于對組合幾種“良好”預(yù)后標志物的乳腺腫瘤亞型再分級，所述標志物如ER+亞類，HER2-亞類，Luminal亞類(ER+ 和/或PR+)，ER+/HER2-亞類，SBRl和/或SBR2亞類，無/少淋巴結(jié)浸潤亞類(< 3)，ER+ 和 / 或 PR+ 和 SBRl 和 / 或 SBR2 亞類，ER+/HER2-/SBR1 和 / 或 SBR2 亞類，ER+/HER2-/SBR1 和/或SBR2/無/少淋巴結(jié)浸潤(彡3)亞類，Luminal A亞類。顯示低增殖表型的SBRl和 /或SBR2可以由相應(yīng)亞類中的低KI67替代。在本發(fā)明的方法中，如果在所述樣本中ZNF217基因過量表達，則將具有有利預(yù)后的至少一個傳統(tǒng)指示物的乳腺癌再分類或再分級為易復(fù)發(fā)和/或易發(fā)展浸潤或轉(zhuǎn)移表型。在一些實施方案中，如果在所述樣本中ZNF217基因過量表達，則將乳腺癌再分類或再分級為對于無再發(fā)存活具有不良的預(yù)后。在其它實施方案中，如果在所述樣本中ZNF217基因過量表達，則將乳腺癌再分類或再分級為對于總存活率具有不良的預(yù)后。在其它實施方案中，如果在所述樣本中ZNF217基因過量表達，則將乳腺癌分類為在內(nèi)分泌治療下具有不良的預(yù)后。百分之七十的乳腺癌患者對于雌性激素受體α (ERa) 是陽性的，因此適合于內(nèi)分泌治療，其為旨在阻斷雌性激素對乳腺癌細胞促有絲分裂作用的策略。內(nèi)分泌治療中使用不同的分子選擇性雌性激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)如他莫昔芬 (tamoxifen)，其防止雌性激素與其受體結(jié)合；選擇性雌性激素受體下調(diào)劑(SERD)如氟維司群(fulvestrant) (ICI 182，780)，也可誘導(dǎo)受體去穩(wěn)定化和降解的ER拮抗劑；芳香酶抑制劑(如依西美坦(exemestane)，來曲唑(Ietrozole)，阿那曲唑(anastrozole))，其通過阻斷芳香酶活性而抑制雄激素轉(zhuǎn)化成雌性激素。因此ZNF217的表達水平也具有預(yù)測價值。在內(nèi)分泌治療下的患者中，ZNF217表達水平與轉(zhuǎn)移和侵襲型乳腺癌相關(guān)聯(lián)。因此在其它實施方案中，ZNF217的表達水平也具有預(yù)測價值。在內(nèi)分泌治療和/ 或化學(xué)治療下的患者中，ZNF217表達水平和轉(zhuǎn)移和侵襲型乳腺癌相關(guān)聯(lián)。在本發(fā)明的方法中，ZNF217基因的表達水平優(yōu)選與對照樣本比較。在一些實施方案中，對照樣本是健康群體中觀察到的ZNF基因表達的中值水平。更有利地，對照樣本是取自患有乳腺癌的患者的樣本(更優(yōu)選乳腺腫瘤樣本)中 ZNF217表達的中值水平。本發(fā)明還涉及對如通過免疫組織化學(xué)和/或ERBB2擴增的檢測和/或組織學(xué)分級確定的具有良好的預(yù)后的乳腺癌患者再分級的方法，所述方法包含測量來自至少一名患者的樣本中ZNF217基因的表達水平，和如果在所述樣本中ZNF217基因過量表達則將所述患者再分類為具有不良的預(yù)后。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法包括通過定量ZNF217基因的mRNA而測量樣本中ZNF217基因的表達水平。在其它實施方案中，本發(fā)明的方法包括通過定量由ZNF217基因編碼的多肽而測量樣本中ZNF217基因的表達水平。本發(fā)明證明患者原發(fā)性乳腺腫瘤中ZNF217的高表達水平或過量表達易再發(fā)和/ 或發(fā)展轉(zhuǎn)移。有趣的是，ZNF217表達的預(yù)后值高于乳腺癌其它預(yù)后標志物如ERBB2/HER2和 ESR1/ER的預(yù)后值?！邦A(yù)后”是疾病可能的進程和結(jié)果。預(yù)后可包括癌癥并發(fā)癥、轉(zhuǎn)移、擴散的可能性， 癌癥的可能的結(jié)果，恢復(fù)的可能性，總存活率和/或總死亡率。優(yōu)選地，預(yù)后是患者恢復(fù)或具有癌癥的復(fù)發(fā)/再發(fā)的概率。這個信息不僅對于患者有用，對于醫(yī)生和/或臨床醫(yī)生確定最有效的療程也有用。確定癌癥再發(fā)的可能性或轉(zhuǎn)移的可能性能幫助醫(yī)生和/或臨床醫(yī)生確定是否應(yīng)采取更保守或更激進的治療方法。預(yù)后供用于對預(yù)測為可從給定治療方案獲益的患者進行選擇和分類。本發(fā)明的方法在診斷為乳腺癌之后和/或癌癥的治療，特別是在內(nèi)分泌治療下的過程中為乳腺癌提供預(yù)后。在本發(fā)明的方法中，ZNF217基因的過量表達與對于無再發(fā)存活具有不良/更差的預(yù)后相關(guān)聯(lián)。在一個實施方案中，不良的預(yù)后是具有更高水平的ZNF217基因表達的癌癥患者發(fā)生癌癥復(fù)發(fā)或再發(fā)的概率高于患相同癌癥但沒有ZNF217過量表達的患者。與患相同癌癥但沒有ZNF217過量表達的患者相比，來自患者的樣本中更高水平的ZNF217基因表達與患者中癌癥再發(fā)或復(fù)發(fā)的更高概率相關(guān)聯(lián)。優(yōu)選地，不良的預(yù)后是癌癥患者從取樣之日在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多年內(nèi)癌癥有至少30^^40% ,50^^60% ,70^^80%或更多的機會再發(fā)。在一些實施方案中，有 30%或更多的機會癌癥會在10年內(nèi)再發(fā)。無再發(fā)存活(Rre)定義為在原發(fā)性乳腺癌的診斷后不再發(fā)的患者的百分比。在這種情況下，Kaplan-Meier曲線只代表在y時間后不再發(fā)的患者的x%。在另一個實施方案中，不良的預(yù)后是具有較高水平的ZNF217基因表達的癌癥患者的總生存率低于患相同癌癥而無ZNF217過量表達的患者。與患相同癌癥而無ZNF217過量表達的患者相比，來自患者的樣本中更高水平的 ZNF217基因表達與癌癥對于所述患者會是致死性的更高幾率相關(guān)聯(lián)。優(yōu)選地，不良的預(yù)后是從取樣之日起1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多年內(nèi)癌癥患者具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或更多的機會所述癌癥會是致死性的。在一些實施方案中，有30%或更多的機會所述癌癥在5年內(nèi)會是致命性的。總生存率(0 定義為在原發(fā)性乳腺癌的診斷后存活的患者百分比。在這種情況下，Kaplan-Meier曲線簡單代表y時間后存活患者的x%。本發(fā)明還涉及提供乳腺癌患者中發(fā)展轉(zhuǎn)移的預(yù)測、無再發(fā)存活率(RR5)的預(yù)后或總存活率的預(yù)后(0 的預(yù)后的方法，所述方法包括a)從所述患者獲得樣本，b)測量所述樣本中ZNF217的表達水平，c)根據(jù)ZNF217測量水平預(yù)測發(fā)生轉(zhuǎn)移、RFS或OS的可能性，其中，當(dāng)ZNF217的所述水平與對照或正常樣本相比增加時，發(fā)生轉(zhuǎn)移的所述可能性增加，所述RFS降低或所述 OS降低。本發(fā)明還涉及提供乳腺癌患者中發(fā)展轉(zhuǎn)移的預(yù)測、無再發(fā)存活率的預(yù)后(RFS)或總存活率的預(yù)后(0 的方法，所述方法包括a)從所述患者獲得樣本，b)對所述樣本測試常規(guī)的乳腺癌預(yù)后標志物，c)如果樣本具有“良好”預(yù)后的至少一個標志物或標志物組合，則評價所述樣本中 ZNF217基因的表達水平，d)基于ZNF217的測量水平預(yù)測發(fā)生轉(zhuǎn)移、RFS或OS的可能性，其中當(dāng)ZNF217的所述表達水平與對照或正常樣本相比增加時，發(fā)生轉(zhuǎn)移的所述可能性增加，所述RFS降低或所述OS降低。本發(fā)明還涉及提供乳腺癌患者中發(fā)展轉(zhuǎn)移的預(yù)測、無再發(fā)存活率的預(yù)后(RFS)或總存活率的預(yù)后(0 的方法，所述方法包括a)從所述患者獲得樣本，b)對所述樣本測試常規(guī)的乳腺癌預(yù)后標志物，并評價ZNF217基因的表達水平，c)如果樣本具有至少一個預(yù)后“優(yōu)良”標志物或標志物組合，則評價所述樣本中 ZNF217基因的表達水平，基于ZNF217測量水平預(yù)測發(fā)生轉(zhuǎn)移、RFS或OS的可能性，其中當(dāng) ZNF217的所述水平與對照或正常樣本相比增加時，發(fā)生轉(zhuǎn)移的所述可能性增加，所述RFS 降低或所述OS降低。本發(fā)明的方法包括測量來自患者的樣本中ZNF217基因的表達水平。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法為體外方法。本發(fā)明的方法在先前取自患者的生物學(xué)樣本上進行。通常地，患者已被診斷患有乳腺癌。術(shù)語“樣本”指獲得自/取自患者的任何生物學(xué)樣本，包括血液樣本、血漿樣本、組織樣本、細胞樣本或腫瘤樣本。通常地，樣本包含癌細胞或腫瘤細胞，例如乳腺癌細胞。在優(yōu)選的實施方案中，樣本是先前取自患者的乳腺腫瘤樣本。本發(fā)明的方法包括檢測或測量ZNF217基因的表達水平。ZNF217基因是首先由 Collins等描述的20ql3. 2上的候選致癌基因(Collins等，1998)。ZNF217基因的GENBANK 登錄號是 NC_000020. 10 (RefSeq :NM_006526. 2)。術(shù)語“表達”可指測量基因的轉(zhuǎn)錄水平和/或翻譯水平。在第一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括通過定量ZNF217基因轉(zhuǎn)錄物(mRNA)而測量樣本中ZNF217基因的表達水平。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括通過定量由ZNF217基因編碼的多肽而測量樣本中ZNF217基因的表達水平。在其它實施方案中，可以間接通過測量可調(diào)控基因表達的非編碼RNA(如miRNA) 而評價ZNF217mRNA的量。MicroRNA(miRNA)是可結(jié)合目標信使RNA轉(zhuǎn)錄物(mRNA)的3’ 未翻譯區(qū)(3’ UTR)中互補序列的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)子，通常引起基因沉默。miRNA是短核糖核酸(RNA)分子，平均僅22個核苷酸長。人類基因組可以編碼1000個以上的miRNA，其可靶向約60%的哺乳動物基因，并且在很多人類細胞類型中是豐富的。每個miRNA可以抑制上百個mRNA。miRNA在真核生物體中非常保守，被認為是基因調(diào)控的至關(guān)重要并且進化上古老的元件。其后，miRNA研究已揭示了其在負調(diào)控中的多種作用(轉(zhuǎn)錄物降解和掩蔽，翻譯抑制)并可能參與正調(diào)控(轉(zhuǎn)錄和翻譯活化)。通過影響基因調(diào)控，miRNA可能參與大多數(shù)生物過程。已經(jīng)在大量疾病狀態(tài)中出現(xiàn)miRNA的異常表達，并且基于miRNA的療法正在研究當(dāng)中。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)幾個miRNA與一些類型的癌癥有關(guān)。通過技術(shù)人員已知的多種方法中的任何方法確定ZNF217基因的表達水平。例如通過下述方法定量ZNF217基因的mRNA或轉(zhuǎn)錄物雜交或反轉(zhuǎn)錄并擴增 (RT-PCR)，然后通過任何已知的方法定量檢測產(chǎn)物。在本發(fā)明的方法中可以使用任何定量擴增方法。優(yōu)選地，用 SEQ ID NO. 1(5，-AGTCCAAATCCCTGCCATCT-3，)的引物和 SEQ ID NO. 2(5，-GGGGAAACACTGGTTTTAGG-3，)的引物進行定量 RT-PCR。例如通過免疫印跡、ELISA、質(zhì)譜或結(jié)合試驗定量ZNF217多肽。優(yōu)選地，在結(jié)合試驗中用一個或幾個抗-ZNF217抗體測量ZNF217多肽水平。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法包括檢測來自患者的腫瘤細胞或癌細胞樣本中ZNF217基因的表達水平，并將所述表達水平與對照表達水平或?qū)φ諛颖局械谋磉_水平相比較。基于癌/腫瘤中ZNF的表達是否高于對照而確定癌/腫瘤的侵襲性和預(yù)后。術(shù)語“過量表達”指統(tǒng)計學(xué)上顯著高于對照樣本中檢測的表達水平的表達水平。如果表達水平比對照樣本中檢測的表達水平高至少10%、25%、50%、75%、100% 或更高，則將ZNF217的表達水平鑒定為“過量表達”或“高于”對照。對照可以是“正?！睂φ諛颖荆庵阜悄[瘤細胞對照樣本或非癌細胞對照樣本。對照樣本可以是獲得自患者的自體對照樣本。在這種情況下，從獲得待評價樣本的同一患者獲得對照樣本。對照樣本優(yōu)選來自同一細胞類型或來自同一器官。對照樣本可為獲得自未患癌的個體的正常對照樣本。正常對照樣本也可以是標準樣本，其包含在生物樣本中正常發(fā)現(xiàn)的相同量的 ZNF217。正常對照樣本也可以是取自至少5、10、15、20或更多個不同患者的樣本中ZNF217 表達的中值水平，所述患者患有乳腺癌或患有相同亞型的乳腺癌。對照樣本優(yōu)選收集自組織庫(Tissue Bank)或生物資源中心(ResourcesBiological Center)，其中患者的完整臨床、組織學(xué)和生物學(xué)信息是可用的。如果與對照樣本相比較，待評價樣本中ZNF217基因過量表達，則將癌癥分類或再分類為易復(fù)發(fā)的乳腺癌和/或患有或易發(fā)展浸潤或轉(zhuǎn)移表型的乳腺癌。本發(fā)明還涉及鑒定易復(fù)發(fā)的乳腺癌和/或患有或易發(fā)展浸潤或轉(zhuǎn)移表型的癌癥的試劑盒，其包含源自ZNF217基因的引物和/或探針，和用于比較ZNF217基因表達水平的對照樣本。本發(fā)明還涉及鑒定易復(fù)發(fā)的腫瘤和/或患有或易發(fā)展浸潤或轉(zhuǎn)移表型的腫瘤的試劑盒，其包含ZNF217抗體，和用于比較ZNF217基因表達水平的對照樣本。試劑盒還可以包含陽性對照、陰性對照和進行本發(fā)明的方法所需的任何試劑或任何裝置。
本發(fā)明的方法和試劑盒還可以包含“不變”對照，其可為看家基因的表達水平。本發(fā)明還涵蓋用于實施本發(fā)明的方法的所述試劑盒的用途，和具體地鑒定易復(fù)發(fā)的癌癥和/或患有或易發(fā)展浸潤或轉(zhuǎn)移表型的癌癥或確定癌癥預(yù)后。附圖簡述

圖1 :MDA-MB-231乳腺癌細胞中ZNF217的過量表達。用抗-ZNF217抗體通過 Western印跡分析來自細胞系的全部蛋白提取物。將α -微管蛋白的表達用作不變對照。圖2 :ZNF過量表達對于MDA-MB-231細胞系中細胞增殖和細胞周期蛋白表達水平的影響。(A)如材料和方法部分所述，使用BrdU標記試劑盒分析增殖細胞。結(jié)果表示為來自三次獨立實驗的平均值士 s. d.(標準偏差)。**根據(jù)Mudent's t-檢驗，與相應(yīng)的 MDA-MB-231對照細胞相比，P < 0. 01。(B)ZNF_217轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細胞中細胞周期蛋白A2、細胞周期蛋白Dl和細胞周期蛋白E2蛋白表達水平的Western印跡分析。將α-微管蛋白的表達用作不變對照。圖3 :MDA-MB-231細胞中ZNF217的過量表達增加了它們在軟瓊脂中形成菌落的能力。在6-孔板中將MDA-MB-231對照、ZNF217-1和ZNF217-2細胞涂布在含0. 45%瓊脂的10% FCS-DMEM上(10000個細胞/孔)。在涂布后20天拍攝顯微照片(圖㈧和計數(shù) (B))。結(jié)果表示為來自至少三次獨立實驗的平均值士 s. d.。根據(jù)Mudent's t_檢驗， 與相應(yīng)的MDA-MB-231相比，P < 0. 001。所有圖像均在1. 25倍放大倍數(shù)下拍攝。圖4 博伊登小室侵襲試驗。在包含熒光-阻斷多孔聚碳酸酯膜插片的Transwell 細胞培養(yǎng)小室中進行對照、ZNF217-1和ZHF217-2細胞侵襲的定量。通過熒光在濾膜下側(cè)檢測通過Matrigel侵襲的細胞并計數(shù)。計數(shù)濾膜的全部表面，并且對于每種條件將每個試驗一式三份進行兩次。結(jié)果表示為平均值士s. d.。圖5 對照、ZNF217-1和ZNF217-2細胞侵襲培養(yǎng)試驗。(A)在Matrigel中培養(yǎng)1、 4、7、11、14和18天后來自至少三次獨立實驗的代表圖片。所有圖片均在1.5倍的放大倍數(shù)下拍攝。(B)使用ImageJ軟件測量對照(白色柱)、ZNF217_1 (黑色柱)和ZNF217-2 (灰色柱)細胞的Matrigel侵襲面積。結(jié)果表示為來自至少三次獨立實驗的平均值士s. d.。** 根據(jù) Mudent，s t_ 檢驗，P < 0. 01 和 ***P < 0. 001。圖6 :ZNF217促進乳腺癌細胞遷移(創(chuàng)傷愈合)將對照或過量表達ZNF217的MDA_MB_231細胞的匯合單層通過刮擦受傷，并在0 小時(H 小時(H 26)拍攝照片。圖片是至少三次獨立實驗的代表，并在2. 5倍放大倍數(shù)下拍攝。圖7 :ZNF217誘導(dǎo)表皮乳腺MCFlOA細胞中的EMT。(A) 10倍放大倍數(shù)下MCFlOA-對照和MCF10A-ZNF217細胞形態(tài)的代表圖片。(B)如材料和方法部分所述，使用特定抗體對 ZNF217、表皮標志物(E-鈣粘蛋白、α-連環(huán)蛋白、β-連環(huán)蛋白和遮光蛋白)和間充質(zhì)細胞標志物(波形蛋白和纖連蛋白)進行的Western印跡分析。測量微管蛋白的表達作為不變對照。顯示的Western印跡來自至少三次獨立試驗的一個代表實驗和細胞裂解物。圖8 :ZNF217mRNA水平的預(yù)后值。(A)來自CLBl群的乳腺腫瘤中RFS的 Kaplan-Meier曲線(對數(shù)級測試分析)。⑶來自CLBl群的乳腺腫瘤中OS的Kaplan-Meier 曲線(對數(shù)級測試分析)。圖9 來自CLB2群的乳腺腫瘤(n = 113)中ZNF217mRNA水平的預(yù)后值。RFS的Kaplan-Meier曲線(對數(shù)級測試分析)。圖10 來自CLB2群的ER-陽性(ER+)乳腺腫瘤(n = 68)中ZNF217mRNA水平的預(yù)后值。RFS的Kaplan-Meier曲線(對數(shù)級測試分析)。圖 11 來自 CLB2 群的 ER+ 和 HER2-陰性(HER2-)乳腺腫瘤(n = 57)中 ZNF217mRNA 水平的預(yù)后值。RFS的Kaplan-Meier曲線(對數(shù)級測試分析)。圖12 :ZNF217和ER表達水平在乳腺癌細胞中相關(guān)聯(lián)。用抗-ZNF217和抗-ER α抗體通過Western印跡分析來自細胞系的總蛋白提取物。將α -微管蛋白的表達用作不變對照。(A)組成型表達ER的MDA-MB-231乳腺癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子(S30細胞)中ZNF217的過量表達。(B)在用亂序 RNA(亂序的 MCF7)或用 siRNA_ZNF217 (MCF7siRNA_ZNF217)轉(zhuǎn)染的 MCF7 細胞中ZNF217和ERa表達的Western-印跡分析。圖13 在OH-Tam-抗性CL6. 7細胞中存在siRNA_ZNF217的情況下逆轉(zhuǎn)內(nèi)分泌抗性。用抗-ZNF217通過Western印跡分析來自細胞系的總蛋白提取物。將α-微管蛋白的表達用作不變對照。(A)在用亂序RNA或siRNA-ZNF217轉(zhuǎn)染的MVLN和CL6. 7細胞中 ZNF217的Wfestern-印跡分析。(B)在存在或不存在200nM OH-Tam的情況下，用亂序RNA 或siRNA-ZNF217轉(zhuǎn)染的MVLN和CL6. 7細胞的細胞增殖(BrdU測試)。這個試驗在無甾醇培養(yǎng)基中進行。當(dāng)P < 0. 05時認為P-值(Mudent ’ s t_檢驗)顯著。
實施例材料和方法細胞培養(yǎng)MCF7和MDA-MB-231乳腺癌細胞購自ATCC，并根據(jù)推薦在補加10 %胎牛血清anvitrogen，Cergy Pontoise, Paris)的DMEM培養(yǎng)基中生長。S30細胞和它們的 MDA-MB-231對照細胞先前已經(jīng)描述(Levenson等，2003)。內(nèi)分泌抗性的細胞模型(MVLN和 CL6. 7細胞)先前已建立并描述(Demirpence等，1993)。MDA-MB-231-ZNF217 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子使用 pcDNA6/V5-His 質(zhì)粒(Invitrogen, Cergy Pontoise, Paris),用全 長ZNF217cDNA構(gòu)建ZNF217表達質(zhì)粒。簡言之，通過向由Collins博士慷慨提供的 PEGFP-N1-ZNF217質(zhì)粒加入缺失的cDNA序列(編碼ZNF217蛋白的最后6個C-末端氨基酸)而獲得全長ZNF217cDNA，然后將所述cDNA亞克隆入pcDNA6/V5_His質(zhì)粒 (pcDNA6/V5-His-ZNF217)。根據(jù)ATCC推薦培養(yǎng)MDA-MB-231乳腺癌細胞(具備低內(nèi)源水平的 ZNF217)，然后用 6 μ g 空 pcDNA6/V5-His 質(zhì)?；?pcDNA6/V5-His_ZNF217 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。在存在20yg/ml殺稻瘟菌素(Invitrogen)的情況下選擇轉(zhuǎn)染的細胞群。然后分離兩個MDA-MB-231-ZNF217細胞克隆(稱作ZNF217-1和ZNF217-2)。根據(jù)生產(chǎn)商的推薦，使用 Qiagen(Germantown，MD, USA)RNA 提取試劑盒提取總 RNA。使用 BioAnalyzer 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)評價 RNA 質(zhì)量。MCF10A-ZNF217 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子根據(jù)ATCC推薦培養(yǎng)MCF10A細胞，其是永生化的但未轉(zhuǎn)化的來自乳腺組織的人類乳房表皮細胞(Soule 等，1990)。用 6 μ g 空 pcDNA6/V5_His 質(zhì)?；?pcDNA6/V5-His_ZNF217 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞。在存在20yg/ml殺稻瘟菌素(Invitrogen)的情況下選擇轉(zhuǎn)染的細胞群。
實時定量PCR(RTQ-PCR)分析將來自每個樣本的一微克總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，并如前所述(Girault等， 2003 ；Vendrell 等，2005)，使用 LightCycler 480 (Roche, Meylan, France)或 ABI Prism7700 序列檢測系統(tǒng)(Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 根據(jù)生產(chǎn)商的推薦，用相應(yīng)的STOR Green試劑盒進行RTQ-PCR測量。設(shè)計正向引物 5，-AGTCCAAATCCCTGCCATCT-3，和反向引物 5，-GGGGAAACACTGGTTTTAGG-3，特異性地靶向ZNF217轉(zhuǎn)錄物(NM_006526. 2)。靶向ESRl (雌激素受體α)轉(zhuǎn)錄物的引物是正向引物 5，-TGTTCCAAACCCATCGTCAGT-3’ ；反向引物 5，-CTCTATAACCAATGACCTCTCTGTGAA -3，。靶向ERBB2轉(zhuǎn)錄物的引物是正向引物5，-ACTGGCCCTCATCCACCATA-3，；反向引物 5， -GGTTGGCAGTGTGGAGCAG-3，。Western 印跡如前所述(Vendrell等，2004)進行細胞提取物制備和^iestern印跡分析。由 Covalab (Lyon, France)制備ZNF217抗體；Ε-鈣粘蛋白、α-連環(huán)蛋白、β-連環(huán)蛋白和纖連蛋白抗體購自BD Biosciences (Franklin Lakes，NJ，USA)。遮光蛋白抗體來自Zymed Laboratories (San Francisco, CA, USA), ^ SJfiftt g Dako (Glostrup, Denmark), M 胞周期蛋白 E2 和 ERa 抗體來自 Santa CruzBiotechnology Inc. (Santa Cruz，CA，USA)，細胞周期蛋白Dl抗體來自Cel ISignaling (Beverly，MA, USA)，而細胞周期蛋白Α2和α-微管蛋白抗體來自 Sigma Chemical Co. (St. Louis，M0，USA)。細胞增殖試驗(BrdU)使用細胞增殖ELISA，BrdU (比色)試劑盒(Roche，Meylan, France)分析增殖細胞。簡而言之，用5-溴脫氧尿苷(BrdU)將細胞標記M小時，并根據(jù)生產(chǎn)商的推薦使用特定的抗-BrdU抗體鑒定標記的核。軟瓊脂菌落形成試驗首先用包含0. 75%瓊月旨(Seaplaque Agarose , Lonza, Basel, Switzerland)的瓊脂層在補加10% FCS(Gibco)的DMEM覆蓋六孔板。然后將MDA-MB-231對照、ZNF217-1 和ZNF217-2細胞懸浮于包含0. 45%瓊脂的10% FCS-DMEM中并涂布入孔中(10000個細胞每孔)。將培養(yǎng)物返回至培養(yǎng)箱并每2天補加10% FCS-DMEM生長培養(yǎng)基。二十天后，用 0.005%結(jié)晶紫(Sigma-Aldrich，SaintQuentin Fallavier, France)將細胞染色 1 小時。 然后在1. 25倍的放大倍數(shù)下拍攝菌落的顯微照片。博伊登小室侵襲試驗在包含熒光阻斷多孔聚碳酸酯膜插片(Fluoroblock ;BD Biosciences ；孔大小為 8 μ m)的Transwell細胞培養(yǎng)室中進行細胞侵襲的定量。在Transwell室中制備生長因子降低的100 μ 1 2mg/ml Matrigel (來自Engelbreth-Holm-Swarm腫瘤的商業(yè)上制備的重組基底膜；BD Biosciences)。將細胞培養(yǎng)為單層細胞，然后胰蛋白酶化并涂布在位于Transwell 裝置上部小室內(nèi)厚層Matrigel (約500 μ m)頂層上包含2% FCS的培養(yǎng)基中(105)。對照不做處理。然后分別用含2%和10% FCS的培養(yǎng)基填充上部和下部小室，從而建立化學(xué)誘劑的可溶性梯度，促進細胞對Matrigel的侵襲。將細胞在37°C儲存于5% CO2中并允許通過凝膠遷移，然后在3. 7%甲醛中固定15分鐘。通過熒光檢測濾膜下側(cè)上侵襲通過Matrigel 的細胞并計數(shù)。計數(shù)濾膜的全部表面，并且對于每種條件將每個試驗一式三份進行兩次。
Matrigel 侵襲分析將厚層Matrigel (600 μ 1) (BD Biosciences)覆蓋在 8_ 孔 LabTec 小室玻片上，并進行部分聚合。將一百萬個細胞懸浮于1 μ 1 DMEM中，并接種于Matrigel層中間。在37°C溫育30分鐘后，我們加入150 μ 1 DMEM ；每2天更換培養(yǎng)基。一式三份分析樣本。使用Centre Commun de Quantimetrie (Lyon, UniversiteClaude Bernard,法國)白勺{到:B Diavert H微鏡(Leica Microsystems，Rueil-Malmaison，法國，1. 5 倍放大倍數(shù))，每 1、4、7、11、14 和 18 天拍攝照片。使用由National Institute of Health(USA)開發(fā)的ImageJ軟件測量經(jīng)過 Matrigel的細胞侵襲的數(shù)量/數(shù)量級(magnitude)。創(chuàng)傷愈合使用創(chuàng)傷愈合試驗檢測細胞運動性的改變。將細胞以DMEM中2. 5x IO6個細胞涂布在 60-mm 培養(yǎng)板上。在 Centre Commun de Quantimetrie(Lyon)使用 P-200 移液器尖端將匯合的單層通過刮擦受傷，并在O小時和26小時拍攝照片(2. 5倍放大倍數(shù))?；虺聊?hvitrogen 獲得靴向 ZNF217 的 Stealth siRNA(siRNA_ZNF217)和亂序的對照 RNA(亂序的)。用 lipofectamin RNAimax(Invitrogen)將五納摩爾 siRNA_ZNF217 或亂序的轉(zhuǎn)染入細胞系。CLBl 群來自 Centre Leon Berard 的乳腺腫瘤樣本(n = 47)我們選擇了 47個獲得自在Centre Leon B6rard(Lyon，法國)手術(shù)的女性的原發(fā)性乳腺腫瘤樣本(表1)。已獲得全部患者的知情同意，并且實驗得到機構(gòu)倫理委員會的批準。乳腺腫瘤樣本切除自手術(shù)前未接受內(nèi)分泌治療、化學(xué)治療或放射性治療的女性。在進行化學(xué)治療和/或內(nèi)分泌治療時，十四名患者發(fā)展轉(zhuǎn)移(Met+組)，而33名患者未發(fā)展轉(zhuǎn)移(Met-組)。標準預(yù)后因子如表1所示?；颊?平均年齡53歲；范圍40-8 符合下述標準原發(fā)性單側(cè)乳腺癌；可用的完整的臨床、組織學(xué)和生物學(xué)信息；術(shù)前未進行放射性治療或化學(xué)治療；和在CentreI^on B6rard的完全隨訪。在手術(shù)時確立陽性腋窩淋巴結(jié)的組織學(xué)類型和數(shù)目。根據(jù)karff-Bloom-Richardson (SBR)組織學(xué)分級系統(tǒng)(Bloom和 Richardson, 1957)給浸潤癌瘤的惡性評分。使用x 2檢驗，兩組間在年齡、組織學(xué)等級、淋巴結(jié)狀態(tài)、腫瘤大小或雌激素受體狀態(tài)上沒有顯著差異(表1)。通過免疫組織化學(xué)確定雌激素受體α (ER)狀態(tài)。Met+組的患者在術(shù)后0.6-4. 6年之間發(fā)展轉(zhuǎn)移。手術(shù)后立即將腫瘤樣本放在液氮中，直至RNA提取。使用Macherey-Nagel (Hoerd，F(xiàn)rance) RNA提取試劑盒,根據(jù)生產(chǎn)商的推薦，提取總 RNA。使用 BioAnalyzer2100 (Agilent Technologies,Palo Alto, CA, USA)評價 RNA 質(zhì)量。來自Centre ReneHuguenin的乳腺腫瘤樣本我們選擇了 48個獲得自在Centre ReneHuguenin (St Cloud，法國)手術(shù)的女性的 ER+原發(fā)性乳腺腫瘤樣本(表2)。已獲得全部患者的知情同意，并且實驗得到機構(gòu)倫理委員會的批準。腫瘤取自原始手術(shù)后僅輔助內(nèi)分泌治療的患者。在進行內(nèi)分泌治療時，二十四名患者再發(fā)并發(fā)展轉(zhuǎn)移(Met+組)，而M名患者未再發(fā)和發(fā)展轉(zhuǎn)移(Met-組)。標準預(yù)后因子如表2所示?；颊?平均年齡70. 7歲；范圍力4-86)符合下述標準原發(fā)性單側(cè)絕經(jīng)后乳腺癌；可用的完整的臨床、組織學(xué)和生物學(xué)信息；術(shù)前未進行放射性治療或化學(xué)治療；和在Centre ReMHuguenin的完全隨訪。在手術(shù)時確立陽性腋窩淋巴結(jié)的組織類型和數(shù)目。根據(jù)SBR組織學(xué)分級系統(tǒng)(Bloom和Richardson，1957)給浸潤腫瘤的惡性評分。使用X2 檢驗，兩組間在年齡、組織學(xué)等級、淋巴結(jié)狀態(tài)或腫瘤大小上沒有顯著差異(表幻。通過使用定量生物化學(xué)方法(葡聚糖-炭末法或酶免疫試驗)在蛋白質(zhì)水平確定ER狀態(tài)，并通過 RTQ-PCR確認。所有患者都接受術(shù)后輔助內(nèi)分泌治療(他莫昔芬，每天20mg，持續(xù)3-5年) 而不進行其它治療。Met+組的患者在術(shù)后和他莫昔芬治療開始時1. 3-10. 0年之間發(fā)展轉(zhuǎn)移。手術(shù)后立即將腫瘤樣本放在液氮中，直至RNA提取。通過酸-酚胍鹽方法從冷凍腫瘤樣本提取總RNA。通過變性瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性。CLB2 群來自 Centre Leon Berard 的乳腺腫瘤樣本(n = 113)我們選擇了 113個獲得自在Centre Leon B6rard(Lyon，法國)手術(shù)的女性的原發(fā)性乳腺腫瘤樣本(表7)。已獲得全部患者的知情同意，并且實驗得到機構(gòu)倫理委員會的批準。乳腺腫瘤樣本采自手術(shù)前未接受內(nèi)分泌治療、化學(xué)治療或放射性治療的女性。在進行化學(xué)治療和/或內(nèi)分泌治療時，十九名患者再發(fā)(再發(fā)組)，而94名患者未再發(fā)(無再發(fā)組)。 標準預(yù)后因子如表7所示?；颊?平均年齡53歲；范圍40-8 符合下述標準原發(fā)性單側(cè)乳腺癌；可用的完整的臨床、組織學(xué)和生物學(xué)信息；術(shù)前未進行放射性治療或化學(xué)治療； 和在Centre Leon B6rard的完全隨訪。在手術(shù)時確立陽性腋窩淋巴結(jié)的組織類型和數(shù)目。 根據(jù)SBR組織學(xué)分級系統(tǒng)(Bloom和Richardson，1957)給浸潤腫瘤的惡性評分。通過免疫組織化學(xué)確定ER和黃體酮受體(PR)狀態(tài)。通過免疫組織化學(xué)確定HER2狀態(tài)并通過FISH 對少量樣本進行驗證。使用χ 2檢驗，兩組間在年齡、組織學(xué)等級、淋巴結(jié)狀態(tài)、腫瘤大小、ER 狀態(tài)、I3R狀態(tài)或HER2狀態(tài)上沒有顯著差異(表7)。再發(fā)組的患者在術(shù)后0. 5-4. 5年之間發(fā)展轉(zhuǎn)移。手術(shù)后立即將腫瘤樣本放在液氮中，直至RNA提取。使用Macherey-Nagel RNA提取試劑盒，根據(jù)生產(chǎn)商的推薦提取總RNA。使用BioAnalyzer 2100 (Agilent Technologies) 評價RNA質(zhì)量。CLB2群中乳腺癌亞型的分類使用目前臨床使用的免疫組織化學(xué)和臨床病理學(xué)參數(shù)，將乳腺腫瘤分為以下分子亞組Luminal 亞類(ER+ 和 / 或 PR+)，HER2+ 亞類(ER-/PR-/HER2+)和 iTriple 陰性亞類 (ER-/PR-/HER2-)。根據(jù) Hugh 等 0009)和 Cheang 等 0009)或 Mi Ilar 等 0009)和 Nguyen 等O008)給出的分類將Luminal亞類再分類為Luminal A和Luminal B亞組。在第一種分類中，Luminal A乳腺腫瘤為ER+和/或PR+、HER2_和低增殖指數(shù)(由低KI67給出或由 SBRl和SBR2給出)，而Luminal B具有ER+和/或PR+，還具有HER2+或高增殖指數(shù)(高 KI67或SBR!3)狀態(tài)；在第二種分類中，Luminal A腫瘤是具有ER+和/或PR+而且HER2-狀態(tài)的乳腺癌，而Luminal B腫瘤僅具有ER+和/或PR+和HER2+。統(tǒng)計分析使用Statgraphics 3plus 軟件(Statgraphics Centurion, Herndon, VA, USA)，用 Mann-Whitney檢驗和Spearman等級檢驗進行RTQ-PCR的統(tǒng)計分析。置信水平大于95%的結(jié)果(P < 0. 05)視為顯著。對于每個基因，將乳腺腫瘤群分為2組一個為“低”mRNA水平 (低于所有乳腺腫瘤樣本的mRNA水平中值)，而另一個為“高”mRNA水平(高于所有乳腺腫瘤樣本的mRNA水平中值)。感興趣的事件是總存活(0 和無再發(fā)存活(REQ。從診斷之日起至死亡或在最后一次隨訪時檢查通過期間測量0S。從診斷之日至再發(fā)或在最后一次隨訪時檢查通過期間測量RFS。通過Kaplan-Meier方法估計存活率分布，并使用SPSS 軟件(Chicago, IL, USA)，通過對數(shù)-秩檢驗(單變量分析)確定存活率之間的差異顯著性。因為本研究為探索性分析，所以全部統(tǒng)計分析在0. 05顯著性水平進行，并且未對多次測試施以校正。在多變量Cox模型中輸入單變量分析中0. 10顯著水平的RFS的候選預(yù)后因子，并使用反向選擇過程建立最終的模型。結(jié)果MDA-MB-231乳腺癌細胞中ZNF217過量表達促進細胞增殖建立組成型過量表達ZNF217蛋白的穩(wěn)定MDA_MB_231乳腺癌細胞(參見材料和方法)。選擇這些細胞是因為它們的內(nèi)源ZNF217表達水平低。用包含ZNF217全長cDNA序列的真核表達載體pcDNA6/V5-His或用作陰性對照的空載體轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細胞。在殺稻瘟菌素選擇后，選擇過量表達ZNF217mRNA和蛋白的兩個細胞克隆(ZNF217-1和ZNF217-2) 以及用空pcDNA6/V5-His轉(zhuǎn)染的細胞克隆(MDA-MB-231對照細胞)。ZNF217-1和ZNF217-2 細胞中的ZNF217mRNA水平分別為MDA-MB-231對照細胞的2. 0至3. 5倍(數(shù)據(jù)未給出)。 因此,與MDA-MB-231對照細胞相比，ZNF217-1和ZNF217-2細胞中ZNF217蛋白表達分別增加5. 4和5. 1倍(圖1)。因此，可觀察到在mRNA水平和蛋白水平，ZNF217的表達之間有良好的一致性。在使用BrdU標記的細胞增殖試驗中，ZNF217-1和ZNF217-2中ZNF217過量表達與細胞增殖增加(圖2A)和細胞周期蛋白A2、細胞周期蛋白Dl和細胞周期蛋白E2的表達增加(圖2B)相關(guān)。ZNF217促進乳腺癌細胞的非貼壁依賴性生長、遷移和體外浸潤性。非貼壁依賴性增殖是惡性細胞在體內(nèi)形成腫瘤的標志(Irshad等，2004 ；Lee等， 2004)，被認為與高度轉(zhuǎn)移的癌細胞相關(guān)(Glondu等，2002 ；Muraoka-Cook等，2004)，并且能通過軟瓊脂菌落形成而測定。因此我們接著檢查了不同細胞群中ZNF217過量表達對軟瓊脂菌落形成的影響。我們發(fā)現(xiàn)與MDA-MB-231對照細胞相比，當(dāng)ZNF217過量表達時形成的 ZNF217-1和ZNF217-2菌落增加約67倍和70倍(圖3)?；啄さ钠茐幕驖B透被認為是腫瘤細胞浸潤的必需步驟。強遷移能力是腫瘤惡性的另一個標志(Gupta和Massague，2006)。在多項研究中，高度轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞在使用博伊登小室進行的體外浸潤試驗(Chen等，2006 ；Galaup等，2006)和創(chuàng)傷愈合試驗(Hu 和Verkman，2006)中表現(xiàn)出上調(diào)的遷移性。因此我們試圖研究ZNF217過量表達是否影響腫瘤浸潤和/或遷移。我們在體外博伊登小室試驗(圖4)中研究了 ZNF217-1、ZNF217-2 和對照細胞的浸潤性，其中將細胞涂布在模擬生理基底膜的厚層Matrigel頂部。圖4顯示，隨著ZNF217的表達，浸潤性顯著增加，在兩個克隆中有相似的變化。與對照細胞相比， 2順217-過量表達克隆中的浸潤細胞數(shù)高6.3和7。Matrigel浸潤試驗提供了支持數(shù)據(jù)，也清楚地證明了 ZNF217-1和ZNF217-2細胞的浸潤性質(zhì)(圖5)。MDA-MB-231細胞中ZNF217 的過量表達也導(dǎo)致遷移性增加，如創(chuàng)傷愈合試驗所證明的(圖6)。總之，這些結(jié)果表明了 ZNF217在乳腺癌細胞的浸潤性以及非貼壁依賴性生長中的重要作用。ZNF217誘導(dǎo)表皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)移(EMT)因為已經(jīng)證明EMT與癌細胞浸潤有關(guān)(Yilmaz和Christofori，2009)，所以我們接著檢查人類乳腺表皮細胞MCFlOA (Soule等，1990 ；Tait等，1990)中ZNF217的影響。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MCFlOA細胞中ZNF217的過量表達足以觸發(fā)EMT的一些形態(tài)學(xué)特征，包括成纖維細胞的形態(tài)學(xué)，這些特征與表皮標志物(E-鈣粘蛋白、α-連環(huán)蛋白、連環(huán)蛋白、遮光蛋白)的顯著降低和間充質(zhì)蛋白水平(波形蛋白和纖連蛋白)的增加有關(guān)(圖7)。因此我們提出促進EMT的能力是潛藏于ZNF217浸潤能力增強之下的另一個重要特征。ZNF217是轉(zhuǎn)移性乳腺癌的預(yù)后標志物為了研究ZNF217的臨床相關(guān)性，我們通過RTQ-PCR考察了在CentreI^on B6rard(法國)收集的47個乳腺腫瘤樣本(CLB1群)中ZNF217mRNA水平(表1)。使用 Marm-Whitney檢驗，我們用臨床和病理學(xué)參數(shù)比較了 ZNF217的表達(表3)；在任何一種情況下都沒有觀察到顯著的相關(guān)性。因為所述群由在化學(xué)治療和/或內(nèi)分泌治療時發(fā)展轉(zhuǎn)移 (術(shù)后0. 6和4. 6年)(Met+組，η = 14)或未轉(zhuǎn)移(Met-組，η = 33)的女性組成，所以我們評價了這兩組患者的ZNF217表達水平。如表4所示，高ZNF217mRNA水平與轉(zhuǎn)移的發(fā)展顯著相關(guān)(Met+組中顯著的ZNF217mRNA過量表達，P = O. 002，Mann-Whitney檢驗)。然后我們使用單變量分析(對數(shù)-秩檢驗)進一步研究ZNF217的預(yù)后值。單變量分析顯示ZNF217mRNA的高表達水平與較短的RFS顯著相關(guān)(P = 0. 003，表5和圖8A)。沒有觀察到在ZNF217mRNA水平和OS之間顯著的相關(guān)性，但存在接近顯著的趨勢(P = 0. 15， 表6和圖8B)。然后我們評價了不同地理來源的乳腺癌患者獨立群中我們的發(fā)現(xiàn)的相關(guān)性。該群由Centre Rer^Huguenin (法國)收集，由在內(nèi)分泌治療時發(fā)展或未發(fā)展轉(zhuǎn)移( 個Met+ 樣本和M個Met-樣本)的ER+乳腺癌患者組成。同樣地，發(fā)現(xiàn)與Met-組(中值=1. 0 ； 范圍0. 21-2. 15 ；P = 0. 0003，Mann-Whitney 檢驗)相比，在 Met+組中 ZNF217 表達顯著上升(中值=2. 4 ；范圍0. 24-14. 62)，并且ZNF217的高表達水平與更短的RFS (P = 0. 039， 對數(shù)-秩檢驗)顯著相關(guān)。因此我們確認，在兩個不同的乳腺癌患者群中，第一，易發(fā)展轉(zhuǎn)移的患者的原發(fā)性乳腺腫瘤中ZNF217高表達水平的存在和，第二，ZNF217與RFS的顯著相關(guān)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明ZNF217能代表一種新的不良預(yù)后標志物。ERBB2 (HER2)是乳腺癌中一種公知的不良預(yù)后標志物。ERBB2表達水平與RFS或 OS沒有顯著相關(guān)性(表5和6)。然而，對于RFS可以觀察到接近顯著的趨勢(P = 0.09， 對數(shù)秩檢驗；表5)。也沒有ESRl (ER α )表達水平和RFS或OS相關(guān)的證據(jù)(表5和6)。 以單變量分析中0. 10的顯著性水平使用RFS的候選預(yù)后因子進行RFS的Cox多變量回歸分析(ZNF217和ERBB2)。最有趣的發(fā)現(xiàn)是在多變量分析中(P = 0. 002 ；HR = 9. 56 ；95% CI ； 1. 57至31. 59 ；表5)，只有ZNF217的預(yù)后值保持顯著?？偠灾@些結(jié)果證明，第一， ZNF217是易發(fā)展轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者中與RFS相關(guān)的新預(yù)后標志物，和第二，ZNF217的預(yù)后值可以提供的信息比ERBB2更多。最后，我們通過來自60個乳腺腫瘤樣本的先前研究的基因表達陣列數(shù)據(jù)的回溯統(tǒng)計分析研究了我們的發(fā)現(xiàn)的相關(guān)性，所述樣本來自在使用他莫昔芬時已發(fā)展轉(zhuǎn)移或未發(fā)展轉(zhuǎn)移的患者( 個Met+和32個Met-) (Ma等，2004)?；谶@個基因表達譜研究的數(shù)據(jù)， 我們發(fā)現(xiàn)Met+樣本中ZNF217的表達水平顯著高于Met-樣本(P = 7. 5x 1 (T4，Mann-Whitney 檢驗)，而且ZNF217的高表達水平與RFS顯著相關(guān)(P = 0. 01 ；對數(shù)-秩檢驗)，因此驗證了我們的發(fā)現(xiàn)。ZNF217在分類為“具有良好預(yù)后的腫瘤”的乳腺腫瘤中具有較高的預(yù)后值使用由Centre ReneBerard收集的113個乳腺腫瘤樣本的新群(稱為CLB2群) (表7)研究在乳腺腫瘤的特定亞類中ZNF217的預(yù)后值是否仍存在或改進。
使用Marm-Whitney檢驗，我們比較了 ZNF217表達的臨床和病理學(xué)參數(shù)在任何情況下都沒有觀察到顯著相關(guān)(表8)。然而，我們確證了 ZNF217的高表達水平和更短的RFS 顯著相關(guān)(P = 0. 023，對數(shù)秩檢驗；表9和圖9)。在評價這個群中幾種臨床和病理學(xué)參數(shù)的預(yù)后值時，我們僅發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)狀態(tài)(> 3個浸潤節(jié))與更短的RFS相關(guān)(P = 0.044，對數(shù)秩檢驗，表9)。使用ZNF217和節(jié)浸潤狀態(tài)進行RFS的Cox多變量回歸分析。令人驚訝的是，在多變量分析中只有ZNF217的預(yù)后值保持顯著(P = 0. 019 ；HR = 5. 54 ；表9)，證明 ZNF217的預(yù)后值提供的信息比淋巴結(jié)浸潤狀態(tài)更多。由免疫組織化學(xué)檢測的乳腺癌標志物如ER和HER2 (ERBB2)傳統(tǒng)上用于癌癥預(yù)后， 而ER-和/或HER2+的乳腺腫瘤是具有不良的預(yù)后的腫瘤。然而，只有30-40%的乳腺癌是ER-，而15-20%的乳腺癌是HER2+。因此在目前被視為“更好預(yù)后癌癥”(即具有ER+和 /或HER2-狀態(tài))的乳腺癌中急需新的預(yù)后生物標志物。在CLB2群的ER+(n = 68)和ER+/HER2_(n = 57)亞類中，仍然存在與RFS相關(guān)的ZNF217預(yù)后值，并且令人驚訝的是，與全部群中獲得的預(yù)后值相比得到了改進(分別為 !^[ . ^和？二化㈨么對數(shù)秩檢驗，表川，圖川和丨丨)。通過獨立群的回溯分析(Ma等， 2004)，我們驗證了與全部群(P = 0.014，對數(shù)秩檢驗，表10)相比，在ER+/HER2-亞類中的 ZNF217預(yù)后值更顯著(P = 0. 001，對數(shù)秩檢驗，表10)。在使用ER狀態(tài)、HER2狀態(tài)、SBR狀態(tài)和/或淋巴結(jié)狀態(tài)將CLB2群的113個乳腺腫瘤分級時，我們發(fā)現(xiàn)在顯示“預(yù)后優(yōu)良”的標志物的乳腺腫瘤亞類，即ER+(P = 0.014)、 HER2-(P = 0. 007) ,SBR1+SBR2 (P = 0. 004)或 SBR2 亞類(P = O-Ol)中，ZNF217 的高表達水平與更短的RFS顯著相關(guān)(對數(shù)秩檢驗，表11)。在收集自具有少量浸潤淋巴結(jié)(< 3)的患者的腫瘤中也能觀察到接近顯著的趨勢(P = O. 052，對數(shù)秩檢驗，表11)。相反地，在顯示 “預(yù)后差”的常規(guī)標志物，如ER-、HER2+、SBR3或淋巴結(jié)狀態(tài)(> 3)的乳腺腫瘤亞類中沒有發(fā)現(xiàn)ZNF217和RFS之間的顯著關(guān)聯(lián)(對數(shù)秩檢驗，表11)。最后在組合幾種“良好預(yù)后”參數(shù)如 ER+ 和 / 或 PR+、ER+ 和 / 或 PR+ 和 SBRl+2、ER+/SBRl+2，或 ER+/HER2-/SBR1+2 的亞類中，ZNF217的高表達水平仍然與更短的RFS顯著相關(guān)(分別為P = O. 013，P = 0. 002，P = 0.015和P = 0.031，對數(shù)秩檢驗，表11)。有趣的是，在ER+/HER2-/SBR1+2/淋巴結(jié)(彡3) 亞類(n = 27)中幾乎達到顯著水平(P = 0. 067，對數(shù)秩檢驗，表11)。最后，僅在全部群中 ZNF217的高表達水平與OS顯著相關(guān)(P = 0. 049 ；對數(shù)秩檢驗，表11)。有趣的是，在ER+/ HER2亞類(n = 27)中也存在接近顯著的趨勢(P = 0. 055)(表11)。近來，已經(jīng)提出免疫組織學(xué)(ER，PR, HER2，KI67)和/或臨床(SBR)參數(shù)，將乳腺癌分為生物學(xué)上獨特而且行為方式不同的亞類(Blows等，2010 ；Cheang等，2009 ；Hugn等， 2009 ；Millar等，2009 ；Nguyen等，2008)。不同分子亞組的預(yù)后和化學(xué)治療敏感性不同。 Luminal-樣癌癥是ER+和/或PR(黃體酮受體)-陽性的，因此對于內(nèi)分泌治療敏感，而且即使不進行任何治療，也可具有比HER2+和"Triple陰性亞型更有利的預(yù)后。Luminal B亞型相當(dāng)于表達HER2或具有由KI67或SBR (考慮觀察到的有絲分裂數(shù)目)給出的高增殖表型的亞型(Cheang 等，2009 ；Hugh 等，2009 ；Mi Ilar 等，2009 ；Nguyen 等，2008 ；Voduc 等，2010)。 Luminal B乳腺癌已經(jīng)顯示比Luminal A乳腺癌更不利的長期存活(Blows等，2010 ；Cheang 等，2009 ；Hugh 等，2009 ；Nguyen 等，2008 ；Voduc 等，2010)。最重要的是旨在對 Luminal 亞類，特別是Luminal A亞類再分級的標志物。在CLB2群中，我們發(fā)現(xiàn)Luminal乳腺癌中ZNF217的高表達水平與更短的RFS顯著相關(guān)(P = 0. 013，對數(shù)秩檢驗，表12)，但是HER2+ 或Triple陰性亞型中則不是。有趣的是，在Luminal B亞類中檢測不到ZNF217的預(yù)后值， 而在LuminalA亞類中高ZNF217表達水平與更短的RFS相關(guān)(P = 0. 012和P = 0. 014，對數(shù)秩檢驗，表12)。總之，這些數(shù)據(jù)證明ZNF217表達水平是乳腺癌患者中不良預(yù)后的新標志物，特別是在具有至少一種良好預(yù)后的常規(guī)標志物(ER+和/或PR+、HER2-、SBR1+2、淋巴結(jié)狀態(tài) (^3), Luminal Α)的乳腺腫瘤中。因此ZNF217對于目前的常規(guī)標志物有增加的值，并允許將患有視為具有良好預(yù)后的癌癥的乳腺癌的患者再分級。因此，ZNF217狀態(tài)可以幫助臨床醫(yī)生作出治療決定。ZNF217和ER信號傳導(dǎo)途徑之間存在交流(cross-talk)鑒于ER+乳腺癌中ZNF217的不良預(yù)后值起主要作用的事實，我們考察了 ZNF217和ER表達之間的關(guān)系。通過RTQ-PCR，我們發(fā)現(xiàn)在乳腺腫瘤樣本的兩個獨立群中ZNF217mRNA水平和ESRlmRNA水平之間顯著相關(guān)Spearman秩相關(guān)系數(shù)=+0. 47 ；P = 0. 0001 (在33個ER+和34個ER-的乳腺腫瘤群中)和Spearman秩相關(guān)系數(shù)=+0. 69 ；P = 0. 0001 (在39個ER+乳腺腫瘤群中)。之前已經(jīng)用野生型ERSl穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ER-MDA-MB-231細胞系，產(chǎn)生組成型表達ERa的新細胞系(S30細胞)(Levenson等，2003)。我們通過Wfestern 印跡證明S30細胞中ER的組成型表達與對照MDA-MB-231細胞相比更高的ZNF217蛋白表達水平相關(guān)(圖12A)。相反地，在ER+MCF7乳腺癌細胞系中，所述細胞系具有高內(nèi)源水平的 ZNF217，通過siRNA策略敲除ZNF217表達與降低的ER表達相關(guān)(圖12B)。在內(nèi)分泌治療下藥物抗性和再發(fā)的發(fā)展代表ER+乳腺癌臨床治療中的真實問題。 有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)ZNF217是僅用輔助內(nèi)分泌療法治療的下述兩個患者群中不良預(yù)后和再發(fā)的標志物由Centre ReneHuguenin收集的群(P = 0. 039，對數(shù)秩檢驗)，和通過回溯分析，由Ma等描述的群(P = 0. 014，對數(shù)秩檢驗)(Ma等，2004)。通過對來自基因表達陣列數(shù)據(jù)的回溯統(tǒng)計分析，所述數(shù)據(jù)來自之前另一項對于1 個來自患者的乳腺腫瘤樣本進行的研究，所述患者在使用他莫昔芬時發(fā)展轉(zhuǎn)移或未發(fā)展轉(zhuǎn)移(44個Met+和155個Met-) (Chanrion等，2008)，我們再次確證了高ZNF217mRNA水平是不良預(yù)后和再發(fā)的標志物(P = 0.01，對數(shù)秩檢驗)。MVLN是源自MCF7細胞的ER+、激素應(yīng)答和OH-他莫昔芬(OH-Tam)敏感的乳腺癌細胞系(Demirpence等，1993)。對MVLN使用OH-Tam六個月，允許出現(xiàn)OH-Tam抗性但是仍然依賴雌性激素的CL6. 7細胞克隆。通過可在MVLN細胞中檢測的分子的細胞抑制活性的損失和CL6. 7細胞增殖的強刺激發(fā)生(雌性激素-樣效應(yīng))，在用OH-Tam處理的情況下表征由CL6. 7細胞發(fā)展出的OH-Tam抗性表型((ihayad等，2010)(圖13)。在使用BrdU標記的細胞增殖試驗中，組合敲除ZNF217 (siRNA策略)和OH-Tam處理導(dǎo)致敏感MVLN細胞系中對內(nèi)分泌治療(P = 0. 001，Student檢驗)敏感性的增加和對CL6. 7細胞系中激素抗性的恢復(fù)(ΟΗ-Tam雌性激素-樣活性現(xiàn)在恢復(fù)至細胞增殖的35%抑制率，P < 10_5)(圖13)。總之，這些數(shù)據(jù)表明在ZNF217和ER表達水平之間存在交流，并且高ZNF217表達水平與對內(nèi)分泌治療的應(yīng)答降低相關(guān)?？傊?，這些數(shù)據(jù)強烈表明ZNF217可代表內(nèi)分泌治療的預(yù)測性標志物。結(jié)論
總而言之，我們在體外實驗中證明了乳腺癌細胞中ZNF217過量表達觸發(fā)增殖性、 無貼壁依賴性生長，并且與浸潤和EMT表型相關(guān)。我們已顯示ZNF217表達代表易再發(fā)和發(fā)展轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者不良預(yù)后的新標志物。更精確地，ZNF217表達水平是對于由目前可用的臨床標志物/參數(shù)分類為具有良好/更好預(yù)后的癌癥的乳腺癌(例如ER+亞類、HER2-亞類、Luminal亞類(ER+和/或I3R+)、ER+/HER2-亞類、SBRl和/或SBR2亞類、無/少淋巴結(jié)浸潤亞類(彡3)、ER+和/或PR+和SBRl和/或SBR2亞類、ER+/HER2-/SBR1和/或SBR2 亞類、ER+/HER2-/SBR1和/或SBR2/無/少淋巴結(jié)浸潤(彡3)亞類、Luminal A亞類)的有力的不良預(yù)后標志物。因此單獨或與其它預(yù)后標志物一起評價ZNF217表達水平可允許將這些分類為具有良好/更好預(yù)后的癌癥再分級為兩個亞類“良好預(yù)后”乳腺癌(低ZNF217 表達水平)或“預(yù)后差”乳腺癌(高ZNF217表達水平)，從而幫助臨床醫(yī)生作治療決定。在 Luminal乳腺癌中ZNF217的預(yù)后值可以(至少部分)由ZNF217和ER之間存在的交流解釋。此外，因為去調(diào)節(jié)的ZNF217表達水平與對內(nèi)分泌治療(在3個群中發(fā)現(xiàn))或?qū)?nèi)分泌 /化學(xué)治療(在2個群中發(fā)現(xiàn))的應(yīng)答降低相關(guān)，所以ZNF217也可以代表抗癌治療的預(yù)測性標志物，并且特別是內(nèi)分泌治療的預(yù)測性標志物。表權(quán)利要求
1.用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，所述方法包括下述步驟a)對先前取自所述患者的樣本測試至少一種乳腺癌預(yù)后標志物，并評價所述樣本中 ZNF217基因的表達水平；b)如果樣本顯示至少一種預(yù)后標志物，則將乳腺癌分類為具有有利的預(yù)后，如果所述樣本中ZNF217基因過量表達，則重新將乳腺癌分類為具有不良的預(yù)后。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，其中將乳腺癌分類為具有有利的預(yù)后的所述預(yù)后標志物通過組織學(xué)分級系統(tǒng)、免疫組織化學(xué)分級系統(tǒng)和/或ERBB2擴增的檢測而確定。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項的用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，其中將乳腺癌分類為具有有利的預(yù)后的預(yù)后標志物選自下組ER+、PR+、HER2-、低增殖指數(shù)、無/少淋巴結(jié)侵入(^ 3) λ Luminal 禾口 Luminal A。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，其中將乳腺癌分類為具有有利的預(yù)后的至少一種預(yù)后標志物可以將乳腺癌的亞型分類為下述亞型ER+和 / 或 ra+、HER2-、ER+/HER2-、SBRl 和 / 或 SBR2、無 / 少淋巴結(jié)侵入(彡 3)、ER+ 和 / 或 PR+/ SBRl 和 / 或 SBR2、ER+/HER2-/SBR1 和 / 或 SBR2、ER+/HER2_/SBR1 和 / 或 SBR2、無 / 少淋巴結(jié)侵入(<3)、Luminal A。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，其中如果所述樣本中ZNF217基因過量表達，則將癌癥重新分類為易復(fù)發(fā)和/或易發(fā)展浸潤或轉(zhuǎn)移表型。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項的用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，其中如果所述樣本中ZNF217基因過量表達，則將癌癥重新分類為對于無再發(fā)存活具有不良的預(yù)后。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項的用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，其中如果所述樣本中ZNF217基因過量表達，則將癌癥重新分類為對于總存活具有不良的預(yù)后。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項的用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，其中如果所述樣本中ZNF217基因過量表達，則將癌癥重新分類為在內(nèi)分泌治療下具有不良的預(yù)后。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項的用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，其中如果所述樣本中ZNF217基因過量表達，則將癌癥重新分類為在化學(xué)治療和/或在內(nèi)分泌治療下具有不良的預(yù)后。
10.用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，所述方法包含下述步驟a)對于至少一種乳腺癌預(yù)后標志物，測試先前取自所述患者的樣本，b)如果樣本顯示至少一種將乳腺癌分類為具有有利的預(yù)后的標志物，則評價ZNF217 基因的表達水平，c)如果所述樣本中ZNF217基因過量表達，則將乳腺癌分類為具有不良的預(yù)后。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，其中將乳腺癌分類為具有有利的預(yù)后的所述預(yù)后標志物通過組織學(xué)分級系統(tǒng)、免疫組織化學(xué)分級系統(tǒng)和/或ERBB2 擴增的檢測而確定。
12.根據(jù)權(quán)利要求10-11中任一項的用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，其中將乳腺癌分類為具有有利的預(yù)后的預(yù)后標志物選自下組ER+、PR+、HER2-、低增殖指數(shù)、無/少淋巴結(jié)侵入(<3)、Luminal 和 Luminal A。
13.根據(jù)權(quán)利要求10-12中任一項的用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，其中將乳腺癌分類為具有有利的預(yù)后的至少一種預(yù)后標志物可以將乳腺癌的亞型分類為下述亞型 ER+ 和 / 或 PR+、HER2-、ER+/HER2-、SBRl 和 / 或 SBR2、無 / 少淋巴結(jié)侵入(<= 3)、ER+ 和 / 或 PR+/SBR1 和 / 或 SBR2、ER+/HER2-/SBR1 和 / 或 SBR2、ER+/HER2-/SBR1 和 / 或 SBR2/ 無 /少淋巴結(jié)侵入(<=3)、Luminal A。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項的用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，其中將ZNF217 基因的表達水平與對照樣本相比較。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項的用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，其中對照樣本是取自患有乳腺癌的患者的樣本中ZNF217表達的中值水平。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項的用于確定患者中乳腺癌預(yù)后的方法，其中所述樣本是乳腺腫瘤樣本。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項的方法，所述方法包括通過定量ZNF217基因的mRNA 而測量樣本中ZNF217基因的表達水平。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項的方法，所述方法包括通過定量由ZNF217基因編碼的多肽而測量樣本中ZNF217基因的表達水平。
全文摘要
本發(fā)明涉及確定癌癥預(yù)后的方法。方法包括確定癌細胞樣本或腫瘤樣本中ZNF217基因的表達水平，其中ZNF217的過量表達與癌癥轉(zhuǎn)移的幾率和癌癥再發(fā)/復(fù)發(fā)的幾率相關(guān)。
文檔編號C12Q1/68GK102575291SQ201080041659
公開日2012年7月11日 申請日期2010年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月17日
發(fā)明者J·文德雷爾, P·科恩, P·魯 申請人:克勞德伯納德里昂第一大學(xué), 利昂貝拉爾中心