欧美在线观看视频网站,亚洲熟妇色自偷自拍另类,啪啪伊人网,中文字幕第13亚洲另类,中文成人久久久久影院免费观看 ,精品人妻人人做人人爽,亚洲a视频

干細(xì)胞用于減少白細(xì)胞外滲的用途的制作方法

文檔序號(hào):392785閱讀:358來(lái)源:國(guó)知局
專利名稱:干細(xì)胞用于減少白細(xì)胞外滲的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明總得來(lái)說(shuō)涉及借助分泌可減少白細(xì)胞外滲的因子的細(xì)胞來(lái)減少炎癥的方法。具體地,本發(fā)明涉及使用可分泌因子的細(xì)胞的方法,所述因子可下調(diào)細(xì)胞粘附分子在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)。下調(diào)細(xì)胞粘附分子的表達(dá)可減少白細(xì)胞粘附至內(nèi)皮細(xì)胞,從而使得減少外滲。結(jié)果是減少了炎癥。因此,本發(fā)明提供用于治療與不合需要的炎性組分相關(guān)的病理學(xué)病癥(包括心血管疾病)的方法。本發(fā)明還涉及用于篩選試劑的藥物發(fā)現(xiàn)方法,所述試劑調(diào)節(jié)所述細(xì)胞的下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中細(xì)胞粘附分子表達(dá)的能力。本發(fā)明還涉及細(xì)胞庫(kù),其可被用于提供用于給予受試者的細(xì)胞,所述庫(kù)包含在下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中的細(xì)胞粘附分子的表達(dá)和減少白細(xì)胞粘附和外滲方面具有所需能力的細(xì)胞。本發(fā)明還涉及包含具有特定所需能 力的細(xì)胞的組合物。本發(fā)明還涉及在給予所述細(xì)胞之前進(jìn)行的診斷方法,包括用于評(píng)估待給予的細(xì)胞的所需能力的測(cè)定。本發(fā)明還涉及治療后診斷測(cè)定以評(píng)估所述細(xì)胞對(duì)被治療的受試者的作用。本發(fā)明還涉及藥物組合物中具有需要能力的細(xì)胞。所述細(xì)胞是具有多能特性的非胚胎非生殖細(xì)胞。所述多能特性可包括多能標(biāo)記物的表達(dá)和廣泛的分化潛能。
背景技術(shù)
羞癥急性炎癥的過(guò)程由受傷組織局部的血管初始,所述血管改變以允許血漿蛋白質(zhì)和白細(xì)胞滲出進(jìn)入周圍組織中。流體進(jìn)入所述組織的流動(dòng)增加可導(dǎo)致與炎癥相關(guān)的特征性腫脹。血管經(jīng)受顯著的血管變化,包括血管舒張、通透性增大和血流變緩,這些變化是由各種炎癥介質(zhì)的作用所誘導(dǎo)。增加的血管通透性可導(dǎo)致血漿移動(dòng)進(jìn)入所述組織,引起由于血液中細(xì)胞濃度的增加而產(chǎn)生的淤滯。淤滯使得白細(xì)胞沿著內(nèi)皮邊緣化(marginate),這是它們向所述組織中的募集的關(guān)鍵過(guò)程。正常流動(dòng)的血液可以防止上述過(guò)程的發(fā)生,因?yàn)檠刂苤苓叺募羟辛?huì)將血液中的細(xì)胞移動(dòng)到血管中部。因此,所述變化使得白細(xì)胞穿過(guò)構(gòu)成血管的內(nèi)皮和基底膜外滲。一旦進(jìn)入所述組織,所述細(xì)胞就沿著趨化梯度移動(dòng)到達(dá)所述損傷位點(diǎn),在這里它們能夠嘗試除去刺激物并且修復(fù)所述組織。白細(xì)胞穿過(guò)血管從血液至組織中的移動(dòng)被稱為外滲,并且可被分為多個(gè)大步驟(I)白細(xì)胞定位(localisation)并且募集至炎癥位點(diǎn)局部的內(nèi)皮-包括邊緣化
和粘附至內(nèi)皮細(xì)胞白細(xì)胞的募集是受體介導(dǎo)的。炎癥的產(chǎn)物(例如組胺)可促進(jìn)P-選擇蛋白在內(nèi)皮細(xì)胞表面上立即表達(dá)。該受體微弱地結(jié)合至白細(xì)胞表面的碳水化合物配體,使得它們隨著鍵的形成和斷裂而沿著內(nèi)皮表面“滾動(dòng)”。來(lái)自受損細(xì)胞的細(xì)胞因子可誘導(dǎo)E-選擇蛋白在內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá),其與P-選擇蛋白的功能類似。細(xì)胞因子也可誘導(dǎo)整聯(lián)蛋白配體在內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá),這進(jìn)一步使得白細(xì)胞慢下來(lái)。這些微弱結(jié)合的白細(xì)胞如果沒(méi)有被受傷組織產(chǎn)生的趨化因子活化就能自由分離?;罨稍黾咏Y(jié)合的整聯(lián)蛋白受體對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞表面上配體的親和性,將白細(xì)胞牢固地結(jié)合至內(nèi)皮。(2)通過(guò)血細(xì)胞滲出過(guò)程的穿過(guò)內(nèi)皮的遷移,被稱作變移(transmigration):趨化因子梯度可刺激粘附的白細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞之間移動(dòng)并且穿過(guò)基底膜進(jìn)入組織。
(3)白細(xì)胞通過(guò)趨化作用在組織中移動(dòng)達(dá)到組織間質(zhì)的白細(xì)胞通過(guò)表達(dá)的整聯(lián)蛋白和CD44結(jié)合至細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì),以防止它們從位點(diǎn)上脫落。趨化物(chemoattractant)使得白細(xì)胞沿著趨化梯度朝向炎癥源移動(dòng)。白細(xì)胞外滲是白細(xì)胞從循環(huán)系統(tǒng)移出,朝向組織損傷或感染的位點(diǎn)的移動(dòng)。該過(guò)程形成先天免疫應(yīng)答的一部分,包括募集非特異性白細(xì)胞。單核細(xì)胞還可在不存在感染和組織損傷的情況下,在它們發(fā)育為巨噬細(xì)胞的過(guò)程中使用該過(guò)程。白細(xì)胞外滲主要出現(xiàn)在毛細(xì)血管后微靜脈,此處血流動(dòng)力學(xué)剪切力被最小化??蓪⒃撨^(guò)程理解為多個(gè)步驟,下文概括為“趨化作用(chemoattraction)” “滾動(dòng)粘附” “緊密粘附”和“(內(nèi)皮)變移”。已經(jīng)證明每當(dāng)這些步驟中的任一步驟被抑制時(shí),白細(xì)胞募集軍即停止。趨化作用識(shí)別病原體并被其活化后,感染組織中的定居巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子,例如IL-1、TNF-α和趨化因子。IL-I和TNF-α可引起感染位點(diǎn)附近血管的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞粘附分子,包括選擇蛋白。循環(huán)白細(xì)胞由于趨化因子的存在而朝向損傷或感染位點(diǎn)集中。滾動(dòng)粘附像尼龍搭鏈一樣,循環(huán)白細(xì)胞上的碳水化合物配體通過(guò)邊緣親和力與血管內(nèi)壁上的選擇蛋白分子結(jié)合。這使得白細(xì)胞慢下來(lái)并且開(kāi)始沿著血管壁內(nèi)表面滾動(dòng)。在這種滾動(dòng)中,在選擇蛋白和它們的配體之間發(fā)生短暫的鍵形成和斷裂。緊密粘附同時(shí),由巨噬細(xì)胞釋放的趨化因子活化所述滾動(dòng)的白細(xì)胞并且使得表面整聯(lián)蛋白分子從默認(rèn)的低親和性狀態(tài)轉(zhuǎn)換為高親和性狀態(tài)。這是通過(guò)整聯(lián)蛋白的鄰分泌活化促進(jìn)的,其中所述整聯(lián)蛋白的鄰分泌活化是通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞釋放的趨化因子和可溶因子實(shí)現(xiàn)。整聯(lián)蛋白在活化狀態(tài)下與內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的互補(bǔ)受體以高親和性緊密結(jié)合。這使得白細(xì)胞固定不動(dòng),盡管有流動(dòng)中的血流的剪切力。變簽白細(xì)胞的細(xì)胞骨架以如下方式重組,即白細(xì)胞鋪展在內(nèi)皮細(xì)胞上。白細(xì)胞以這種形式伸出偽足并且通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞間的空隙。白細(xì)胞變移是隨著出現(xiàn)在白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表面上的PECAM蛋白相互作用并且有效地將所述細(xì)胞拉動(dòng)穿過(guò)內(nèi)皮而發(fā)生。白細(xì)胞可分泌降解基底膜的蛋白酶,使得它們能夠逸出血管一該過(guò)程被稱為血細(xì)胞滲出。一旦白細(xì)胞處于間隙液中,就沿著趨化梯度朝向損傷或感染的位點(diǎn)移動(dòng)。嗜中性粒細(xì)胞在炎癥位點(diǎn)的積聚是由特定類的細(xì)胞粘附分子介導(dǎo)的,所述細(xì)胞粘附分子包括白細(xì)胞上的CD18整聯(lián)蛋白和選擇蛋白(內(nèi)皮上的P-和E-選擇蛋白,以及白細(xì)胞上的L-選擇蛋白)。這一點(diǎn)得到了對(duì)患有白細(xì)胞粘附缺陷綜合征的患者進(jìn)行的研究的支持,所述患者的白細(xì)胞在CD18或選擇蛋白碳水化合物配體表達(dá)方面有遺傳缺陷(例如,II型白細(xì)胞粘附缺陷)。詵擇蛋白選擇蛋白在內(nèi)皮細(xì)胞(通過(guò)組織巨噬細(xì)胞)的細(xì)胞因子活化后很快表達(dá)?;罨膬?nèi)皮細(xì)胞最初表達(dá)P-選擇蛋白分子,但是到活化后2小時(shí)內(nèi),傾向于表達(dá)E-選擇蛋白。內(nèi)皮選擇蛋白與白細(xì)胞跨膜糖蛋白(包括唾液酸化路易斯血型抗原X (Sialyl-Lewisx))上的碳水化合物 結(jié)合。P-選擇蛋白P-選擇蛋白在活化的內(nèi)皮細(xì)胞和血小板上表達(dá)。P-選擇蛋白的合成可由凝血酶、白細(xì)胞三烯B4、補(bǔ)體片段C5a、組胺、TNF-α或LPS誘導(dǎo)。這些細(xì)胞因子誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中的懷布爾_帕拉德體(Weibel-Palade body)的外化,將預(yù)先形成的P-選擇蛋白呈遞于內(nèi)皮細(xì)胞表面上。P-選擇蛋白可作為配體結(jié)合PSGL-I。E-選擇蛋白內(nèi)皮白細(xì)胞粘附分子-I是由細(xì)胞因子刺激的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。人們認(rèn)為它負(fù)責(zé)通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞粘附至血管內(nèi)壁而在炎癥位點(diǎn)處積聚血液白細(xì)胞。它表現(xiàn)出與LYAMl的結(jié)構(gòu)特征類似的結(jié)構(gòu)特征,包括存在凝集素-或EGF-樣結(jié)構(gòu)域,之后有含6個(gè)保守半胱氨酸殘基的短共有重復(fù)序列(short consensus repeat, SCR)結(jié)構(gòu)
域。這些蛋白質(zhì)是細(xì)胞粘附分子的選擇蛋白家族的一部分(Watson et al.,_J. Exp.
Med. 172:263-272(1990) ; Collins et al.,—J. Biol. Chem. 266:2466-2473 (1991))。在P-選擇蛋白合成后不久就是E-選擇蛋白合成,其由例如IL-I和TNF-α的細(xì)胞因子誘導(dǎo)。E-選擇蛋白可結(jié)合PSGL-I和ESL-I。L-選擇蛋白=L-選擇蛋白在一些白細(xì)胞上組成型表達(dá),并且已知其作為配體與GlyCAM-I、MadCAM-I 和 CD34 結(jié)合。一些選擇蛋白的表達(dá)受抑制可導(dǎo)致免疫應(yīng)答減緩。如果L-選擇蛋白沒(méi)有產(chǎn)生,則免疫應(yīng)答可能會(huì)慢10倍,因?yàn)镻-選擇蛋白(其也可由白細(xì)胞產(chǎn)生)會(huì)相互結(jié)合。P-選擇蛋白可以以高親和性相互結(jié)合,但是其發(fā)生的頻率較低,因?yàn)槭荏w位點(diǎn)密度比更小的E-選擇蛋白分子低。這可增加初始的白細(xì)胞滾動(dòng)速度,延長(zhǎng)所述緩慢的滾動(dòng)階段。整聯(lián)蛋白參與細(xì)胞粘附的整聯(lián)蛋白主要在白細(xì)胞上表達(dá)。滾動(dòng)的白細(xì)胞上的β 2整聯(lián)蛋白與內(nèi)皮細(xì)胞粘附因子結(jié)合,阻止細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。LFA-I存在于循環(huán)白細(xì)胞上,可與內(nèi)皮細(xì)胞上的ICAM-I和ICAM-2結(jié)合。Mac-I存在于循環(huán)白細(xì)胞上,可與內(nèi)皮細(xì)胞上的ICAM-I結(jié)合。VLA-4存在于白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上,可促進(jìn)趨化作用;它還可與VCAM-I結(jié)合。通過(guò)細(xì)胞外趨化因子進(jìn)行的細(xì)胞活化可導(dǎo)致預(yù)先形成的β 2整聯(lián)蛋白從細(xì)胞儲(chǔ)庫(kù)中釋放出來(lái)。整聯(lián)蛋白分子遷移至細(xì)胞表面并且以高親合力斑塊(high-avidity patch)的形式聚集。細(xì)胞內(nèi)整聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域通過(guò)胞質(zhì)因子的介導(dǎo)作用與白細(xì)胞細(xì)胞骨架締合(associate),所述胞質(zhì)因子例如胞踝蛋白、α -輔肌動(dòng)蛋白和粘著斑蛋白。這種締合作用引起整聯(lián)蛋白四級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化,使得配體可以到達(dá)結(jié)合位點(diǎn)。二價(jià)陽(yáng)離子(例如,Mg2+)也是整聯(lián)蛋白-配體結(jié)合所需要的。整聯(lián)蛋白配體ICAM-I和VCAM-I是由炎癥細(xì)胞因子活化,而ICAM-2是由一些內(nèi)皮細(xì)胞組成型表達(dá),但是會(huì)被炎癥細(xì)胞因子下調(diào)。ICAM-I和ICAM-2共有兩個(gè)同源N-末端結(jié)構(gòu)域;兩者可都與LFA-I結(jié)合。在趨化作用期間,β I整聯(lián)蛋白與細(xì)胞外基質(zhì)組分的結(jié)合會(huì)促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)VLA-3、VLA-4和VLA-5與纖連蛋白結(jié)合,VLA-2和VLA-3與膠原蛋白和其他細(xì)胞外基質(zhì)組分
彡口口 細(xì)胞因子外滲受到由炎癥應(yīng)答產(chǎn)生的背景細(xì)胞因子環(huán)境的調(diào)節(jié),并且與具體的細(xì)胞抗原無(wú)關(guān)。最初免疫應(yīng)答中釋放的細(xì)胞因子誘導(dǎo)血管舒張并且降低沿血管表面的電荷。血流被減緩,這促進(jìn)了分子間結(jié)合。IL-I活化定居淋巴細(xì)胞和血管內(nèi)皮。TNF- α增加血管通誘件并目.活化血管內(nèi)皮。CXCL8 (IL-8)形成趨化梯度,其引導(dǎo)白細(xì)胞朝向組織損傷/感染位點(diǎn)移動(dòng)(CCL2具有與CXCL8類似的功能,包括單核細(xì)胞外滲和發(fā)育為巨噬細(xì)胞);還活化白細(xì)胞整聯(lián)蛋白。
可以得到總結(jié)炎癥中的外滲過(guò)程的綜述文章。參見(jiàn)Steeber, D. andTedder, T. , Immunologic Research, 22/2-3:299-317(2000);Steeber et aI. ,FSAEB J,9:866-873(1995);和 Wagner, D. and Frenette, P.,Blood,111:5271-5281 (2008)。CD15 (3-巖藻糖基_N_乙?;?乳糖胺)是一個(gè)分化抗原簇-一種免疫學(xué)上重
要的分子。CD15是能夠在糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖上表達(dá)的碳水化合物粘著分子(不是蛋白質(zhì))。_可介導(dǎo)吞噬作用和趨化作用,存在于嗜中性粒細(xì)胞上;在患有何杰金病、一些B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病、急性成淋巴細(xì)胞性白血病和大部分非淋巴細(xì)胞性白血病的患者中表達(dá)。它還被稱為路易斯X和SSEA-I (階段特異性胚胎抗原I)并且代表鼠多能干細(xì)胞的一種標(biāo)記物,其中它在植入前胚胎中的細(xì)胞粘附和遷移中起重要作用。它由_(巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶4)和FUT9合成。CD15s對(duì)于E-選擇蛋白和P-選擇蛋白介導(dǎo)的白細(xì)胞粘附,唾液酸化路易斯血型抗原X寡糖決定子是白細(xì)胞反受體的必要組分。該低聚糖分子分布在粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞的表面上。在最終使得白細(xì)胞離開(kāi)血管樹(shù)(vascular tree)并且被募集至淋巴組織和炎癥位點(diǎn)的過(guò)程中,白細(xì)胞粘附至這些選擇蛋白的形成在是早期的且重要的步驟。Natsuka et al.,J. Biol. Chem. 269:16789-16794 (1994)和 Sasaki et al.,J. Biol.Chem. 269:14730-14737(1994)分離了編碼人白細(xì)胞α-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶——FUT7,其能夠合成所述唾液酸化路易斯血型抗原X決定子——的cDNA。Natsuka等人發(fā)現(xiàn),當(dāng)FUT7在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)時(shí),所述cDNA指導(dǎo)細(xì)胞表面唾液酸化路易斯血型抗原X部分的合成,而不是路易斯X、路易斯A、唾液酸化路易斯a或VIM-2決定子的合成。Sasaki等人證明了在體內(nèi)FUT7合成所述可與E-選擇蛋白結(jié)合的唾液酸化路易斯血型抗原X部分的能力,并且報(bào)道了 FUT7在白細(xì)胞中受限的表達(dá)。Chen et al. , Proc. Nat. Acad. Sci. 103:16894-16899(2006)指出,活化的 T 細(xì)胞,尤其是Thl細(xì)胞表達(dá)唾液酸化路易斯血型抗原X,但是其他T細(xì)胞不表達(dá)。使用報(bào)告基因分析,他們證明了 TBET促進(jìn)了 FUT7的轉(zhuǎn)錄,而GATA3抑制了 FUT7的轉(zhuǎn)錄。TBET干擾GATA3與其靶DNA的結(jié)合,但是GATA3還干擾TBET與FUT7啟動(dòng)子的結(jié)合。GATA3通過(guò)以磷酸化依賴的方式募集組蛋白脫乙?;?3和HDAC5,并且通過(guò)與CBP/p300競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合至TBET的N端,調(diào)節(jié)FUT7的轉(zhuǎn)錄。通過(guò)ROG介導(dǎo)的對(duì)GATA3的抑制獲得了 FUT7和唾液酸化路易斯血型抗原X在T細(xì)胞中的最大表達(dá)。Chen等人(2006)得出以下結(jié)論GATA3/TBET轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體可調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞歸巢受體的細(xì)胞譜系特異性表達(dá);糖綴合物受到該復(fù)合體調(diào)節(jié)以在Thl和Th2淋巴細(xì)胞亞群中實(shí)現(xiàn)細(xì)胞譜系特異性表達(dá)。選擇蛋白P配體或P-選擇蛋白糖蛋白配體(PSGLl)是髓樣細(xì)胞和受激的T淋巴細(xì)胞上的P-選擇蛋白的高親和性反受體。因此,它在將這些細(xì)胞被錨定(tether)至活化的血小板或表達(dá)P-選擇蛋白的內(nèi)皮過(guò)程中起到關(guān)鍵作用?;诹魇郊?xì)胞術(shù)、免疫印跡和流式小室分析(flow chamber analyse),Fuhlbrigge et al. , Nature 389:978-981 (1997)提出由巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶-7介導(dǎo)的對(duì)PSGLl的差異翻譯后修飾可調(diào)節(jié)皮膚淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(CLA)的表達(dá),所述抗原在T細(xì)胞中可結(jié)合P-選擇蛋白和E-選擇蛋白。CLA-陽(yáng)性T細(xì)胞是皮膚歸巢記憶T細(xì)胞,所述細(xì)胞由它們與單克隆抗體HECA-452的反應(yīng)性界定。CLA-陽(yáng)性T細(xì)胞在很多炎性皮膚疾病(包括銀屑病)中浸潤(rùn)皮膚病損。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明廣義上涉及用于減少炎癥的方法。本發(fā)明更具體地涉及減少白細(xì)胞(嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞)外滲的方法。本發(fā)明更具體地涉及減少白細(xì)胞從循環(huán)系統(tǒng)浸潤(rùn)至周圍組織中的方法。本發(fā)明還涉及減少白細(xì)胞粘附至血管的方法。 本發(fā)明還涉及減少白細(xì)胞粘附至血管內(nèi)皮的方法。本發(fā)明還涉及減少白細(xì)胞粘附至血管壁中內(nèi)皮細(xì)胞的方法。本發(fā)明還涉及用于下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中粘附分子的表達(dá)的方法。本發(fā)明還涉及減少內(nèi)皮細(xì)胞活化的方法。本發(fā)明還涉及減少血管內(nèi)皮中的內(nèi)皮細(xì)胞活化的方法。內(nèi)皮細(xì)胞活化可能是因?yàn)楸┞队谘装Y細(xì)胞因子。細(xì)胞因子包括但不限于腫瘤壞死因子-α (TNF-α )、白細(xì)胞介素-I (IL_1 )、雙調(diào)蛋白、LPS和其他Toll樣受體配體(致病性肽,例如fMLP;來(lái)自受損傷組織的肽,例如纖連蛋白片段)、凝血酶、組胺、氧自由基和IFN-Y。在本發(fā)明的上下文中,活化包括血管內(nèi)皮細(xì)胞中細(xì)胞粘附分子的上調(diào)。本發(fā)明還涉及降低血管壁中的內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞上的粘附配體或部分結(jié)合的能力的方法。所述粘著配體或部分包括但不限于PSGL-UESL-1、⑶15s、α4-整聯(lián)蛋白、⑶44、β 2-整聯(lián)蛋白、L-選擇蛋白、⑶99和JAM。白細(xì)胞包括但不限于嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞包括B細(xì)胞和T細(xì)胞。T細(xì)胞包括⑶4+、⑶8+、Y δ T細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞。在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)并被下調(diào)的細(xì)胞粘附分子包括但不限于E-選擇蛋白VCAM、ICAM (I、2 )、P-選擇蛋白、CD99、PECAM-I、JAM、ESAM和骨橋蛋白(VCAM的共同受體)。在一個(gè)實(shí)施方案中,在具有外傷性腦損傷的受試者中,內(nèi)皮細(xì)胞上的I-CAM和P-選擇蛋白被上調(diào)。本發(fā)明涉及減少細(xì)胞粘附分子的表達(dá)。表達(dá)可以是細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的,例如在內(nèi)皮細(xì)胞表面上。因此,可減少表達(dá),使得當(dāng)培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)這些分子向細(xì)胞培養(yǎng)基中的分泌減少。細(xì)胞外和細(xì)胞表面表達(dá)包括在蛋白質(zhì)水平上減少表達(dá)。細(xì)胞內(nèi)表達(dá)包括減少所述細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯。根據(jù)本發(fā)明,全部上述效應(yīng)(B卩,炎癥、外滲、白細(xì)胞至內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、粘附分子的表達(dá)等)的減少可通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)將所述白細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞暴露于非生殖細(xì)胞,所述非生殖細(xì)胞具有胚胎干細(xì)胞的一些多能特性但來(lái)源自非胚胎組織。根據(jù)本發(fā)明,全部上述效應(yīng)可通過(guò)給予細(xì)胞或由所述細(xì)胞條件化的培養(yǎng)基(medium conditioned by the cell)實(shí)現(xiàn)。細(xì)胞包括但不限于具有胚胎干細(xì)胞特性但來(lái)源自非胚胎組織的非胚胎非生殖細(xì)胞。這樣的細(xì)胞可以是多能的并且表達(dá)多能標(biāo)記物,例如oct4、端粒酶、rex-l、rox-l、sox-2、nanog、SSEA_l和SSEA-4中的一種或多種。其他多能性的特征可以包括分化為超過(guò)一個(gè)胚層(例如外胚層、內(nèi)胚層和中胚層胚胎胚層中的兩個(gè)或三個(gè))的細(xì)胞類型的能力。這樣的細(xì)胞可以在培養(yǎng)中被永生化或轉(zhuǎn)化,或者不可以在培養(yǎng)中被永生化或轉(zhuǎn)化。這樣的細(xì)胞可以高度擴(kuò)增,同時(shí)不 被轉(zhuǎn)化,并且維持正常的核型。例如,在一個(gè)實(shí)施方案中,所述非胚胎非生殖細(xì)胞可進(jìn)行至少10-40次(例如30、40、50、60或更多次)細(xì)胞倍增,其中所述細(xì)胞沒(méi)有被轉(zhuǎn)化并且具有正常的核型。所述細(xì)胞可以表達(dá)端粒酶活性以便能夠?qū)崿F(xiàn)超過(guò)30次(例如35、40、45、50或更多次)細(xì)胞群倍增(細(xì)胞倍增)。但是,如上所述,所述細(xì)胞還能夠表達(dá)oct4、端粒酶、rex-l、rox_l、sox_2、nanog、SSEAl或SSEA4中的一種或多種。這樣的細(xì)胞可以分化為內(nèi)胚層、外胚層和中胚層胚胎細(xì)胞系中兩種的每種的至少一種細(xì)胞類型,并且可以包括成為所有三種胚層的分化。此外,它們可以是致瘤的,或者可以不是致瘤的,例如不產(chǎn)生畸胎瘤。如果細(xì)胞被轉(zhuǎn)化或者是致瘤的,并且需要將它們用于融合,則這樣的細(xì)胞可被致缺陷(disable)以使它們不能在體內(nèi)形成腫瘤,例如通過(guò)防止細(xì)胞增殖成為腫瘤的處理。這樣的處理在本領(lǐng)域中是公知的。這樣的細(xì)胞可以自然地達(dá)到本文所述的效應(yīng)(即,達(dá)到該效應(yīng)沒(méi)有經(jīng)過(guò)遺傳學(xué)或藥物學(xué)方法修飾)。但是,天然表達(dá)子可以被遺傳學(xué)或藥物學(xué)方法修飾以增加效能。鑒于這些細(xì)胞實(shí)現(xiàn)以上效應(yīng)的特性,所述細(xì)胞可被用于篩選試劑的藥物發(fā)現(xiàn)方法,所述試劑可調(diào)節(jié)所述細(xì)胞實(shí)現(xiàn)以上所述效應(yīng)的能力。這樣的試劑包括但不限于小的有機(jī)分子、反義核酸、siRNA DNA適體、肽、抗體、非抗體蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子、趨化因子和趨化物。然后,所述試劑可被用于增加所述細(xì)胞實(shí)現(xiàn)任意上述效應(yīng)的效能。作為一個(gè)實(shí)例,該測(cè)定已經(jīng)被用于鑒定用TNF-α、IFN- Y , IL-I β或它們的結(jié)合物對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行的預(yù)處理,所述預(yù)處理用于產(chǎn)生抑制內(nèi)皮細(xì)胞分子的上調(diào)或者下調(diào)這些分子的表達(dá)的細(xì)胞。一些細(xì)胞必須與活化的內(nèi)皮細(xì)胞共同培養(yǎng),以產(chǎn)生下調(diào)粘附分子表達(dá)(或抑制上調(diào))的因子。因此,可將原初細(xì)胞(naive cell)(沒(méi)有暴露于活化的內(nèi)皮細(xì)胞)暴露于需要的試劑,然后測(cè)定對(duì)它們對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活化、粘附部分的表達(dá)或任意上述效應(yīng)的作用。由于本申請(qǐng)中描述的所述效應(yīng)可以由從所述細(xì)胞分泌的因子引起,因此不僅所述細(xì)胞,而且培養(yǎng)所述細(xì)胞時(shí)產(chǎn)生的條件化培養(yǎng)基(conditioned medium)也可用于實(shí)現(xiàn)所述效應(yīng)。這樣的培養(yǎng)基將包含所述分泌的因子,并因此可被用于代替所述細(xì)胞或者被添加至所述細(xì)胞。因此,當(dāng)可以使用細(xì)胞時(shí),應(yīng)理解所述培養(yǎng)基也是有效的,并且可被代替或添加。考慮到這些細(xì)胞實(shí)現(xiàn)上述效應(yīng)的特性,可以建立細(xì)胞庫(kù),其包含因具有實(shí)現(xiàn)上述效應(yīng)所需的效能而被選出的細(xì)胞。因此,本發(fā)明包括測(cè)定這類細(xì)胞的實(shí)現(xiàn)任意上述效應(yīng)的能力,選擇具有所需效能的細(xì)胞并將其建庫(kù)。所述庫(kù)可提供用于制備用于給予所述受試者的藥物組合物的源??梢詮乃鰩?kù)直接使用細(xì)胞,或者在使用前擴(kuò)增細(xì)胞。因此,本發(fā)明還涉及在將這些細(xì)胞給予受試者之前進(jìn)行的診斷方法,所述預(yù)診斷方法包括評(píng)估所述細(xì)胞實(shí)現(xiàn)一種或多種上述效應(yīng)的能力。所述細(xì)胞可從細(xì)胞庫(kù)中取出并且直接使用,或者在給藥前擴(kuò)增。在兩種情況下,都會(huì)評(píng)估所述細(xì)胞的所需效能?;蛘?,所述細(xì)胞可以來(lái)自于所述受試者并且在給藥之前被擴(kuò)增。在這種情況下,在給藥之前還評(píng)估所述細(xì)胞的所需效能。盡管針對(duì)效力而選擇的細(xì)胞必然會(huì)在所述選擇操作過(guò)程中被測(cè)定,但是在給予所述受試者進(jìn)行治療之前再次測(cè)定所述細(xì)胞以確保所述細(xì)胞在所需水平上仍然有效,這是優(yōu)選的并且是謹(jǐn)慎的。這在所述細(xì)胞已被儲(chǔ)存——例如在細(xì)胞庫(kù)中,其中細(xì)胞在儲(chǔ)存期間很可能被冷凍一任意時(shí)長(zhǎng)的情況下是特別優(yōu)選的。
關(guān)于用所述細(xì)胞進(jìn)行處理的方法,在所述細(xì)胞最初被分離和給予受試者之間可以有多個(gè)(即相繼的)對(duì)于調(diào)節(jié)的測(cè)定。這是為了確保所述細(xì)胞在該時(shí)間范圍內(nèi)發(fā)生的操作之后仍然能夠在所需水平上達(dá)到所述效應(yīng)。例如,可在所述細(xì)胞的每次擴(kuò)增之后進(jìn)行測(cè)定。如果細(xì)胞儲(chǔ)存于細(xì)胞庫(kù)中,它們可在被從存儲(chǔ)中釋放之后進(jìn)行測(cè)定。如果它們被冷凍,則可在解凍后對(duì)它們進(jìn)行測(cè)定。如果來(lái)自細(xì)胞庫(kù)的細(xì)胞被擴(kuò)增,可在擴(kuò)增之后對(duì)它們進(jìn)行測(cè)定。優(yōu)選地,可對(duì)最終細(xì)胞制品(即實(shí)際給予所述受試者的細(xì)胞制品)的一部分進(jìn)行測(cè)定。本發(fā)明還涉及用于通過(guò)評(píng)估這類細(xì)胞實(shí)現(xiàn)一種或多種上述效應(yīng)的效能來(lái)確定所述細(xì)胞劑量的方法。本發(fā)明還包括給予所述細(xì)胞之后評(píng)估效能的處理后診斷測(cè)定。所述診斷測(cè)定包括但不限于本文描述的任何這樣的效應(yīng),即容易就所述效應(yīng)對(duì)受試者進(jìn)行測(cè)定。本發(fā)明還涉及包含具有所需效能的細(xì)胞群的組合物。這樣的細(xì)胞群被發(fā)現(xiàn)可作為適于給予受試者的和/或在細(xì)胞庫(kù)中的藥物組合物,來(lái)自所述細(xì)胞庫(kù)的細(xì)胞可被直接用于給予受試者或者在給予之前被擴(kuò)增。本發(fā)明的方法和組合物可用于治療涉及炎癥的任意疾病,其中所述炎癥的組分涉及白細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞粘附分子至血管內(nèi)皮的粘附。這包括心血管中的極性和慢性病癥,例如,急性心肌梗死;中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷,例如中風(fēng)、外傷性腦損傷、脊髓損傷;周圍血管疾??;肺部疾病,例如哮喘、ARDS ;自身免疫疾病,例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、狼瘡、硬皮病(scIerodoma);銀屑?。晃改c疾病,例如移植物抗宿主病、克羅恩病。但是,應(yīng)理解,對(duì)于以上任何病癥的治療,使用這樣的細(xì)胞可能是適當(dāng)?shù)模患?,在被給予以治療所述病癥前已經(jīng)針對(duì)一種或多種本文描述的所述效應(yīng)被評(píng)估并且針對(duì)所需效力水平被選擇的細(xì)胞。


圖I :人大動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)中MultiStem調(diào)節(jié)TNF-α導(dǎo)致的E-詵擇蛋白、V-CAM和I-CAM上調(diào)。(A)將細(xì)胞培養(yǎng)至接近匯合時(shí),用TNF-α將內(nèi)皮細(xì)胞在兩種情況下活化72小時(shí),一種情況是僅內(nèi)皮細(xì)胞,另一種情況是與MultiStem共培養(yǎng)。然后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)或PCR分析細(xì)胞的E-選擇蛋白、V-CAM或I-CAM的表達(dá)。(B-E)TNF-a誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子表面表達(dá)在MultiStem存在的情況下以細(xì)胞劑量依賴性方式減小。當(dāng)HAEC與MultiStem在TNF-a (10ng/ml)存在的情況下共培養(yǎng)72小時(shí)時(shí),HAEC顯示出E-選擇蛋白(B、C)、V-CAM⑶和I-CAM(E)表達(dá)的細(xì)胞表面上調(diào)降低。測(cè)定表達(dá)E-選擇蛋白和V-CAM的細(xì)胞數(shù)量,并且表示為用TNF-α誘導(dǎo)來(lái)表達(dá)這些標(biāo)記的細(xì)胞的總數(shù)的百分比。對(duì)于I-CAM,所有的細(xì)胞都有一些水平表達(dá),即使是在活化前。因此,計(jì)算了每細(xì)胞的信號(hào)強(qiáng)度,并將所述數(shù)據(jù)表示為TNF-α誘導(dǎo)的信號(hào)的百分比。圖2 :MultiStem抑制人肺內(nèi)皮細(xì)朐(HPMEC)中的細(xì)朐表面粘附分子h.調(diào)或者由IL-I β導(dǎo)致的細(xì)胞表面粘附分子上調(diào)(A)當(dāng)與MultiStem在TNF-a (10ng/ml)存在的情況下共培養(yǎng)72小時(shí)時(shí),HPMEC顯示出E-選擇蛋白、V-CAM和I-CAM表達(dá)的細(xì)胞表面上調(diào)降低,類似于HAEC。細(xì)胞表面表達(dá)是通過(guò)FACS測(cè)量。⑶HAEC中另一種促炎因子——IL-I β對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記物的誘導(dǎo)在以MultiStem共培養(yǎng)的HAEC中也降低。 圖3 :MultiStem在轉(zhuǎn)錄水平h調(diào)節(jié)細(xì)朐粘附分子h調(diào)(A)通討ELISA測(cè)量來(lái)自MultiStem和內(nèi)皮細(xì)朐(HAEC或HPMEC)共培養(yǎng)物的培養(yǎng)某中可溶件E-詵擇蛋白(sE~詵擇蛋白)的水平。(B)在TNF-α存在或不存在的情況下與不同細(xì)胞劑量的MultiStem共培養(yǎng)72小時(shí)之后從HAEC中分離mRNA。對(duì)E-選擇蛋白、V_CAM、I-CAM和GAPDH進(jìn)行定量RT-PCR。與未處理對(duì)照細(xì)胞相比,MultiStem減少了 TNF-α誘導(dǎo)的E-選擇蛋白、V-CAM和I-CAM的mRNA表達(dá)。圖4 :與MultiStem不同,在用TNF-α活化時(shí),MSC不會(huì)抑制內(nèi)皮細(xì)朐中粘著分子的細(xì)胞表面表達(dá)。(A-C) TNF- α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子表面表達(dá)在MSC存在的情況下不會(huì)改變,而與MultiStem的共培養(yǎng)可減少粘著分子表達(dá)。當(dāng)在TNF-a (10ng/ml)存在的情況下與MSC共培養(yǎng)72小時(shí)時(shí),HAEC顯示E-選擇蛋白、V-CAM和I-CAM表達(dá)的細(xì)胞表面上調(diào)
沒(méi)有變化。圖5 :與至單獨(dú)用TNF-a誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)朐的結(jié)合相比,在TNF-α和MultiStem存在的情況下嗜中性粒細(xì)胞與共培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的粘附減少。(A)在單獨(dú)孵育或者與MultiStem孵育72小時(shí)后,將活化或未活化的內(nèi)皮細(xì)胞用活化的嗜中性粒細(xì)胞孵育I分鐘。然后洗滌細(xì)胞,并拍照。通過(guò)在每種條件下重復(fù)拍照3次并且對(duì)在每個(gè)高倍視野(IOX )中結(jié)合的嗜中性粒細(xì)胞數(shù)目計(jì)數(shù)來(lái)確定結(jié)合的嗜中性粒細(xì)胞的數(shù)目。(B)與對(duì)照內(nèi)皮細(xì)胞相t匕,結(jié)合至與MultiStem共培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的嗜中性粒細(xì)胞數(shù)目顯著減少。(C)顯示嗜中性粒細(xì)胞與MultiStem共培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合減少的代表性照片。圖6 AMI三天后,與賦形物(vehicle)處理的心臟相比,MultiStem處理的心臟中嗜中件粒細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少。(A)通過(guò)永久性LAD結(jié)扎誘導(dǎo)急性心肌梗死。所有大鼠在接受AMI后,接受賦形物對(duì)照(PBS)或者大鼠MultiStem (I千萬(wàn)個(gè)細(xì)胞)的直接注射。通過(guò)在來(lái)自處理或未處理動(dòng)物的心臟切片中顯示彈性蛋白酶染色的細(xì)胞來(lái)測(cè)量嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。表I顯示來(lái)自每只動(dòng)物的彈性蛋白酶陽(yáng)性細(xì)胞的平均數(shù)目(每只動(dòng)物檢測(cè)了 4個(gè)切片)。(B)通過(guò)彈性蛋白酶染色測(cè)量嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。在手術(shù)后3天,與MultiStem處理的動(dòng)物的彈性蛋白酶染色(12. 185PMN/hpf)相比,對(duì)照組具有顯著更高的彈性蛋白酶染色(35. 25PMS/hpf) (p=0. 005823)。(C)在MultiStem處理的動(dòng)物和未處理的動(dòng)物中,嗜中性粒細(xì)胞水平的代表性照片(由彈性蛋白酶染色測(cè)量的)。圖7 :在炎癥過(guò)稈中介導(dǎo)白細(xì)胞慕集的多個(gè)連續(xù)步驟。白細(xì)胞被捕獲,并且開(kāi)始在P-和-E-選擇蛋白和它們的配體P-選擇蛋白糖蛋白配體-I (PSGL-I)和E-選擇蛋白配體-I (ESL-I)上滾動(dòng)。一些白細(xì)胞(例如淋巴細(xì)胞或者造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞)也開(kāi)始在a 4整聯(lián)蛋白及其內(nèi)皮受體血管細(xì)胞粘附分子-I (VCAM-I)上滾動(dòng)。L-選擇蛋白對(duì)于淋巴組織中HEV上的淋巴細(xì)胞滾動(dòng)是至關(guān)重要的。隨著炎癥發(fā)展,白細(xì)胞滾動(dòng)速率減慢,允許整合來(lái)自選擇蛋白配體和G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的活化信號(hào)。這些活化信號(hào)導(dǎo)致緩慢滾動(dòng)的白細(xì)胞極化,并且使得L-選擇蛋白和PSGL-I聚簇在主極,所述主極可使白細(xì)胞通過(guò)繼發(fā)性錨定進(jìn)一步募集,所述繼發(fā)性錨定是通過(guò)白細(xì)胞-白細(xì)胞相互作用進(jìn)行的。白細(xì)胞活化增強(qiáng)整聯(lián)蛋白親和性和親合力,導(dǎo)致牢固粘附于在內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的細(xì)胞間粘附分子-I(ICAM-1)。粘附的白細(xì)胞不斷地側(cè)向遷移,以檢查微血管系統(tǒng)并且尋找變移的可能位點(diǎn)。白細(xì)胞通??梢酝ㄟ^(guò)連接(細(xì)胞旁側(cè)(paracellular))途徑,或者通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞途徑(跨細(xì)胞途徑)變移,所述連接途徑是通過(guò)連接粘附分子(JAM)、CD99和血小板/內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-I (PECAM-1)、內(nèi)皮細(xì)胞選擇性粘附分子(ESAM)之間的相互作用進(jìn)行。
具體實(shí)施例方式應(yīng)理解本發(fā)明不限于本文描述的具體方法、方案和試劑等,因?yàn)檫@些都可以變化。本文使用的術(shù)語(yǔ)目的僅是用于描述具體的實(shí)施方案,不意欲限制本發(fā)明的范圍,其僅由權(quán)利要求界定。本文使用的章節(jié)標(biāo)題僅用于組織目的,并且不應(yīng)以任意方式理解為限制所描述的主題。除非另有說(shuō)明,本申請(qǐng)的方法和技術(shù)一般根據(jù)本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法以及本說(shuō)明書(shū)通篇中所引用的和討論的各種概括性的和具體的參考文獻(xiàn)中描述的常規(guī)方法進(jìn)行。參見(jiàn),例如,Sambrook et al. , Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd ed. , ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)和 Ausubel etal. , Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992),以及 Harlow and Lane, Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1990)。定義“一”或“一種”在本文中是指一種或超過(guò)一種,至少一種。當(dāng)本文使用復(fù)數(shù)形式時(shí),
其一般包括單數(shù)形式。本文使用的術(shù)語(yǔ)“粘附”,當(dāng)在體內(nèi)時(shí)是指足以導(dǎo)致外滲的白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的締合。在本發(fā)明的上下文中,可被本發(fā)明的試劑減少或防止的所述粘附是以這樣的足量出現(xiàn)的。在體外應(yīng)用中,粘附的程度(親合力)可以不必為上述水平。例如,在藥物發(fā)現(xiàn)的情形中,可能需要檢測(cè)具有較低數(shù)量級(jí)的親合力的粘附(結(jié)合)?!凹?xì)胞庫(kù)”是已經(jīng)被培養(yǎng)并且存儲(chǔ)用于將來(lái)使用的細(xì)胞的行業(yè)命名。細(xì)胞可以被等分存儲(chǔ)。它們可被從儲(chǔ)庫(kù)中直接取出使用或者可在存儲(chǔ)后被擴(kuò)增。這樣方便,使得有可用于給藥的“成品”細(xì)胞。所述細(xì)胞可能已經(jīng)被儲(chǔ)存在可藥用賦形劑中,這樣它們可被直接給予,或者當(dāng)它們被從儲(chǔ)庫(kù)中取出時(shí)可與合適賦形劑混合。細(xì)胞可被冷凍,或者以其他保持活性的方式儲(chǔ)存。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,可創(chuàng)造這樣的細(xì)胞庫(kù),即其中已經(jīng)針對(duì)實(shí)現(xiàn)一種或多種所述效應(yīng)的增強(qiáng)效能對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行了選擇,所述效能例如減少一種或多種粘附分子的表達(dá)。從所述儲(chǔ)庫(kù)中取出之后,并且在給予所述受試者之前,優(yōu)選再次測(cè)定所述細(xì)胞的效能。這可以通過(guò)直接或者間接地使用本申請(qǐng)描述的或者本領(lǐng)域中已知的測(cè)定法進(jìn)行。然后,具有所需效能的細(xì)胞能夠被給予所述受試者用于治療。“共給予”是指相互結(jié)合、一起、并列給藥,包括同時(shí)或者順序給予兩種或多種試劑。
“包括(comprising)”是指(沒(méi)有其他限制地)必需含有所述指示物,對(duì)于其他可以含有的事項(xiàng)沒(méi)有任何限制或排除。例如,“包括X和I的組合物”涵蓋包含X和I的任意組合物,無(wú)論所述組合物中存在何種其他組分。類似地,“包括步驟X的方法”涵蓋其中進(jìn)行X的任意方法,無(wú)論X是所述方法中的唯一步驟還是X僅是眾多步驟之一,無(wú)論其中有多少其他步驟,也無(wú)論與所述其他步驟相比X多么簡(jiǎn)單或者復(fù)雜?!鞍?Comprised of)”和使用相同詞根“包括(comprise)”的類似短語(yǔ)在本文中均用作“包括(comprising)”的同義詞,并且具有相同的含義?!鞍?comprised of )” 是“包括(comprising)” 的同義詞(見(jiàn)上文)?!皸l件化的細(xì)胞培養(yǎng)基(Conditioned cell culture medium)”是本領(lǐng)域中公知的術(shù)語(yǔ),是指已經(jīng)在其中培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基。本文中,這是指所述細(xì)胞被培養(yǎng)足夠的時(shí)間以分泌可以有效達(dá)到本申請(qǐng)中描述的任意效應(yīng)的因子,所述效應(yīng)包括減少細(xì)胞粘附分子的表達(dá);減少白細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的粘附;減少外滲等。
條件化培養(yǎng)基是指這樣的培養(yǎng)基,即其中已經(jīng)培養(yǎng)細(xì)胞以分泌因子進(jìn)入所述培養(yǎng)基。為本發(fā)明的目的,可以通過(guò)足夠數(shù)量的細(xì)胞分裂來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞以產(chǎn)生有效量的此類因子,這樣使得所述培養(yǎng)基可以減少細(xì)胞粘附分子的表達(dá),從而減少白細(xì)胞的粘附,進(jìn)而減少外滲等。通過(guò)本領(lǐng)域中已知的任意方法從所述培養(yǎng)基中除去細(xì)胞,所述方法包括但不限于離心、過(guò)濾、免疫耗竭(例如,經(jīng)標(biāo)記的抗體和磁化柱)和FACS分選?!跋陆怠被颉皽p少”是指降低所述效應(yīng)或者完全阻止所述效應(yīng),例如減少白細(xì)胞外滲、粘附、粘附部分的表達(dá)或者本文描述的任意效應(yīng)?!癊C細(xì)胞”是從對(duì)稱為畸胎癌的一類癌癥的分析中發(fā)現(xiàn)的。1964年,研究人員指出畸胎瘤中的單個(gè)細(xì)胞可被分離并且在培養(yǎng)中保持未分化狀態(tài)。這種類型的干細(xì)胞被人們稱為胚胎癌細(xì)胞(EC細(xì)胞)?!坝行Я俊?一般是指提供所需的局部或全身效應(yīng)的量,例如,通過(guò)影響導(dǎo)致外滲的粘附而有效地改善不需要的炎癥效應(yīng)的量。例如,有效量是足以實(shí)現(xiàn)有益或所需臨床結(jié)果的量。所述有效量可以在單次給藥中一次全部提供,或者以分?jǐn)?shù)次給藥提供有效量的分次量提供。對(duì)于可被認(rèn)為是有效量的量的準(zhǔn)確確定可基于各個(gè)受試者的個(gè)體因素,包括其體型、年齡、損傷和/或待治療的疾病和損傷,以及所述損傷出現(xiàn)或疾病開(kāi)始以來(lái)的時(shí)間量。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)這些本領(lǐng)域中常規(guī)的考慮因素確定對(duì)于給定受試者的有效量。本文使用的“有效劑量”與“有效量”的含義相同?!坝行緩健币话闶侵赣糜趯⒃噭┻f送至所需要的區(qū)室、系統(tǒng)或部位的途徑。例如,有效途徑是通過(guò)其可以給予試劑以在所需作用位點(diǎn)提供足以實(shí)現(xiàn)有益或所需臨床結(jié)果的試劑量的途徑?!芭咛ジ杉?xì)胞(ESC)”是本領(lǐng)域中公知的,并且已經(jīng)從很多不同的哺乳動(dòng)物種中制備得到。胚胎干細(xì)胞是衍生自被稱為胚泡的早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的干細(xì)胞。它們能夠分化成為三種原胚層的所有衍生細(xì)胞外胚層、內(nèi)胚層和中胚層。這些包括成人體內(nèi)超過(guò)220種細(xì)胞類型的每一種。ES細(xì)胞可以成為身體中的任何組織,但胎盤(pán)除外。僅桑葚胚細(xì)胞是全能的,能夠變成所有組織和胎盤(pán)。類似于ESC的一些細(xì)胞可以通過(guò)將體細(xì)胞核的核轉(zhuǎn)移至去核受精卵中來(lái)產(chǎn)生?!巴鉂B”是指液體從它的容器中泄漏出來(lái)。在炎癥的情況下,它是指白細(xì)胞從毛細(xì)血管中移動(dòng)至它們周圍的組織中。這在發(fā)明的背景技術(shù)部分也討論過(guò)。使用術(shù)語(yǔ)“包括”并不意欲進(jìn)行限制。
“增加”是指在沒(méi)有預(yù)先存在的效應(yīng)的情況下完全誘導(dǎo),或者提高所述效應(yīng)的程度,所述效應(yīng)例如白細(xì)胞外滲、粘附、粘附部分的表達(dá)或者本文描述的任意效應(yīng)?!罢T導(dǎo)的多能干細(xì)胞(IPSC或IPS細(xì)胞)”是已經(jīng)被重編程的體細(xì)胞,例如,通過(guò)引入賦予體細(xì)胞分化程度較低的表型的外源基因來(lái)重編程。然后這些細(xì)胞能夠被誘導(dǎo)分化成為分化程度較低的子代。可以使用最初于2006年發(fā)現(xiàn)的方法的修飾來(lái)衍生IPS細(xì)胞(Yamanaka, S. et al. , Cell Stem Cell,1:39-49 (2007))。例如,在一種情況下,為了產(chǎn)生IPS細(xì)胞,科學(xué)家用皮膚細(xì)胞起始,然后通過(guò)使用反轉(zhuǎn)錄病毒將基因插入細(xì)胞DNA的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)修飾所述皮膚細(xì)胞。在一種情況下,所述摻入的基因是0ct4、Sox2、Lif4和c_myc,已知它們可以作為天然調(diào)節(jié)子共同發(fā)揮作用以保持細(xì)胞處于胚胎干細(xì)胞樣狀態(tài)。這些細(xì)胞已經(jīng)記載于文獻(xiàn)中。例如,參見(jiàn) Wernig et al. , PNAS, 105:5856-5861 (2008) ; Jaenisch etal. , Cell, 132:567-582(2008) ;Hanna et al.,Cell, 133:250-264(2008);和Brambrink etal. ,Cell Stem Cell,2:151-159 (2008)。這些參考文獻(xiàn)因其對(duì)IPSC和產(chǎn)生它們的方法的教導(dǎo)而以引用的方式納入本文。通過(guò)特定的培養(yǎng)條件(暴露于特定的試劑)產(chǎn)生這樣的細(xì)胞也是可能的。術(shù)語(yǔ)“分離的”是指不與以下成分締合的細(xì)胞在體內(nèi)與所述細(xì)胞締合的一種或多種細(xì)胞或者一種或多種細(xì)胞組分。“富集的群”是指相對(duì)在體內(nèi)或者在原代培養(yǎng)中一種或多種其他細(xì)胞類型,所需細(xì)胞在數(shù)目上相對(duì)增加。但是,本文使用的術(shù)語(yǔ)“分離的”并不表示僅有干細(xì)胞存在。相反,術(shù)語(yǔ)“分離的”是指細(xì)胞被從它們的天然組織環(huán)境中移出并且以高于所述正常組織環(huán)境的濃度存在。因此,含除干細(xì)胞之外,“分離的”細(xì)胞群可以進(jìn)一步包其他細(xì)胞類型,并且可以包含其他的組織組分。這還可以表述為,例如細(xì)胞倍增。細(xì)胞可能已經(jīng)在體外或離體進(jìn)行10、20、30、40或更多次倍增,這樣使得與在體內(nèi)或在所述細(xì)胞的最初組織環(huán)境中(例如骨髓、外周血、月旨肪組織等)的其初始數(shù)目相比,所述細(xì)胞被富集。“MAPC”是“多能成體祖細(xì)胞(multipotent adult progenitor cell)”的首字母縮略詞。在本申請(qǐng)中,該術(shù)語(yǔ)用于命名一類細(xì)胞,即具有胚胎干細(xì)胞特征的非胚胎干細(xì)胞。它可以在分化時(shí)衍生超過(guò)一種胚層的細(xì)胞譜系,例如兩種或全部三種胚層(即,內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)。MAPC可以表達(dá)端粒酶、Oct 3/4(即Oct 3A)、rex-l、rox-l、sox_2以及SSEA-4中的一種或多種。MAPC中的術(shù)語(yǔ)“成體”是非限制性的。它是指非胚胎體細(xì)胞。MAPC核型正常并且在體內(nèi)不形成畸胎瘤。該首字母縮略詞在PCT/US2000/21387中首次用于描述從骨髓分離的多能細(xì)胞。但是,這些細(xì)胞被從骨髓中分離之后,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了具有多能標(biāo)記物和/或分化潛能的其他細(xì)胞,為了本發(fā)明的目的,所述其他細(xì)胞可以在本文描述的效應(yīng)方面與首次被命名為“MAPC”的細(xì)胞在功能上等價(jià)。術(shù)語(yǔ)“丨VIuUiSteinil<:_”是高度可擴(kuò)增的、核型正常的且在體內(nèi)不形成畸胎瘤的非胚胎非生殖細(xì)胞的商品名稱。它可以分化為超過(guò)一種胚層的細(xì)胞譜系。所述細(xì)胞可以表達(dá)端粒酶、oct3/4、rex-1、rox_l、sox-2和SSEA4中的一種或多種。Mll丨i1Stem_'K)是根據(jù)本專利申請(qǐng)中公開(kāi)的細(xì)胞培養(yǎng)方法制備的,具體地,降低氧量和增加血清量?!翱伤幱幂d體”是用于本發(fā)明中使用的細(xì)胞的任意可藥用介質(zhì)。這樣的介質(zhì)可保持等滲性、細(xì)胞代謝、pH等。它適合體內(nèi)給予受試者,并因此可用于細(xì)胞遞送和治療。術(shù)語(yǔ)“效能”是指細(xì)胞(或者來(lái)自所述細(xì)胞的條件化培養(yǎng)基)實(shí)現(xiàn)本申請(qǐng)描述的各種效應(yīng)的能力。因此,效能是指各種水平的效能,包括但不限于(I)減少炎癥;(2)減少白細(xì)胞浸潤(rùn)(嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞或單核細(xì)胞);(3)減少粘附,例如選擇蛋白與白細(xì)胞上的唾液酸化路易斯血型抗原X的粘附,所述白細(xì)胞包括但不限于CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞;和
(4)減少內(nèi)皮細(xì)胞上細(xì)胞粘附分子的表達(dá),所述粘附分子包括但不限于ICAM、VCAM、E-選擇蛋白和P-選擇蛋白。可培養(yǎng)并刺激“原始胚胎生殖細(xì)胞”(PG或EG細(xì)胞)以產(chǎn)生很多分化程度較低的細(xì)胞類型。 “祖細(xì)胞”是在干細(xì)胞分化過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)胞,其具有它們的最終分化子代的特性的一些但非全部。確定的祖細(xì)胞(例如“心臟祖細(xì)胞”)將限于一種細(xì)胞譜系,但不限于具體的或終末分化的細(xì)胞類型。首字母縮略詞“MAPC”中使用的術(shù)語(yǔ)“祖”并不將這些細(xì)胞限制于具體的細(xì)胞譜系。祖細(xì)胞可以形成比所述祖細(xì)胞分化程度更高的子代細(xì)胞。本文使用的術(shù)語(yǔ)“減少”是指阻止以及下降。在處理的情形中,“減少”是阻止或改善一種或多種臨床癥狀。臨床癥狀是如果不予處理將對(duì)受試者的生活質(zhì)量(健康)產(chǎn)生消極影響的一種(或多種)癥狀。這還適用于生物學(xué)效應(yīng),例如減少外滲、下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞上的粘附分子、減少白細(xì)胞至內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、減少白細(xì)胞向周圍組織中的浸潤(rùn)、減少白細(xì)胞結(jié)合等,其最終結(jié)果會(huì)是改善炎癥的有害效應(yīng)?!斑x擇”具有所需水平的效能(例如,減少一種或多種粘附分子的表達(dá))的細(xì)胞可以指鑒別(如通過(guò)測(cè)定法)、分離和擴(kuò)增細(xì)胞。這將產(chǎn)生具有比親代細(xì)胞群更高效能的細(xì)胞群,所述細(xì)胞群分離自所述親代細(xì)胞群。選擇細(xì)胞將包括確定是否存在所需效應(yīng)的測(cè)定,并且還將包括獲得該細(xì)胞。所述細(xì)胞可能天然具有所述效應(yīng),因?yàn)樗黾?xì)胞沒(méi)有與誘導(dǎo)所述效應(yīng)的試劑孵育,或者暴露于所述試劑。在進(jìn)行所述測(cè)定前可能不知道所述細(xì)胞具有所述效應(yīng)。由于所述效應(yīng)可以依賴于基因表達(dá)和/或分泌,本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以基于引起所述效應(yīng)的一種或多種基因進(jìn)行選擇。選擇可以是來(lái)自組織中的細(xì)胞。例如,在這種情況下,可將細(xì)胞從所需組織中分離,在培養(yǎng)中擴(kuò)增,針對(duì)所需效應(yīng)進(jìn)行選擇,并將選出的細(xì)胞進(jìn)一步擴(kuò)增。選擇還可以是來(lái)自離體的細(xì)胞,例如培養(yǎng)中的細(xì)胞。在這種情況下,可針對(duì)所述效應(yīng)測(cè)定培養(yǎng)中的一種或多種細(xì)胞,并且所得到的具有所述效應(yīng)的細(xì)胞可被進(jìn)一步擴(kuò)增。還可針對(duì)增強(qiáng)的效應(yīng)選擇細(xì)胞。在這種情況下,從其中獲得所述增強(qiáng)的細(xì)胞的細(xì)胞群已經(jīng)具有所述效應(yīng)。增強(qiáng)的效力是指與所述親代群體中的情況相比,每細(xì)胞的平均效應(yīng)量更高。從其中選出所述增強(qiáng)的細(xì)胞的親代群體可以是基本純系(homogeneous)的(相同的細(xì)胞類型)。從該群中獲得此類增強(qiáng)的細(xì)胞的一種方法是制備單一細(xì)胞或細(xì)胞庫(kù),并且測(cè)定這些細(xì)胞或細(xì)胞庫(kù)的所述效應(yīng),以獲得天然具有所述效應(yīng)的克隆(與用所述效應(yīng)的調(diào)節(jié)劑處理所述細(xì)胞的情況相反),然后擴(kuò)增這些天然增強(qiáng)的細(xì)胞。然而,可用將會(huì)增強(qiáng)內(nèi)源細(xì)胞途徑的效應(yīng)的一種或多種試劑處理細(xì)胞。因此,可處理基本純系的群體以增強(qiáng)調(diào)節(jié)作用。
如果所述群體不是基本純系的,那么,優(yōu)選地,待處理的親代細(xì)胞群包含至少100種可獲得增強(qiáng)的效應(yīng)的有效細(xì)胞類型,更優(yōu)選至少1000種這樣的細(xì)胞,甚至更優(yōu)選至少10000種這樣的細(xì)胞。處理之后,該子群體可通過(guò)已知的細(xì)胞選擇技術(shù)從所述異質(zhì)群體中回收,如果需要可以進(jìn)一步擴(kuò)增。因此,所需的效應(yīng)水平可以是比在給定在先群體中的水平高的水平。例如,置于來(lái)自組織的原代培養(yǎng)物中并且通過(guò)培養(yǎng)條件分離并擴(kuò)增的細(xì)胞可提供親代群體,所述培養(yǎng)條件沒(méi)有被特地設(shè)計(jì)為具有所述效應(yīng)。這樣的親代群體可被處理以增強(qiáng)每細(xì)胞的平均效應(yīng),或者被篩選以得到所述群體中表達(dá)更高效應(yīng)的一種或多種細(xì)胞。然后可將這樣的細(xì)胞擴(kuò)增以提供具有更高(需要的)效應(yīng)的 群體?!白晕腋隆笔侵府a(chǎn)生復(fù)制子代干細(xì)胞的能力,所述子代干細(xì)胞具有與其親代細(xì)胞相同的分化潛能。本文中使用的類似術(shù)語(yǔ)是“增殖”。“干細(xì)胞”是指可以進(jìn)行自我更新(即,子代具有相同的分化潛能)并且也可以產(chǎn)生分化潛能更受限的子代細(xì)胞的細(xì)胞。在本發(fā)明的上下文中,干細(xì)胞還可以涵蓋分化程度更高的細(xì)胞,其已經(jīng)通過(guò)例如以下方式去分化通過(guò)核轉(zhuǎn)移、通過(guò)與更原始的干細(xì)胞融合、通過(guò)導(dǎo)入特定的轉(zhuǎn)錄因子或者通過(guò)在特定條件下培養(yǎng)。參見(jiàn),例如,Wilmut et al.
,Nature, 385:810-813(1997);Ying et al. , Nature, 416:545-548(2002);Guan et al.,Nature, 440:1199-1203(2006);Takahashi et al.,Cell,126:663-676(2006);Okita etal. , Nature, 448:313-317(2007);和 Takahashi et al.,Cell,131:861-872(2007)。去分化還可以通過(guò)給予一些化合物或暴露于在體內(nèi)或體外可以引起去分化的物理環(huán)境而引起。干細(xì)胞還可以來(lái)自異常組織,例如畸胎癌和一些其他來(lái)源,例如胚狀體(但是這些可被認(rèn)為是胚胎干細(xì)胞,因?yàn)樗鼈儊?lái)自胚胎組織,盡管不是直接來(lái)自于內(nèi)細(xì)胞團(tuán))。干細(xì)胞還可以通過(guò)將與干細(xì)胞功能相關(guān)的基因?qū)敕歉杉?xì)胞中而產(chǎn)生,例如,誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞?!笆茉囌摺笔侵讣棺祫?dòng)物,例如哺乳動(dòng)物,例如人。哺乳動(dòng)物包括但不限于人、狗、貓、馬、牛和豬。術(shù)語(yǔ)“治療有效量”是指確定可在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生任何治療反應(yīng)的試劑量。例如,有效的抗炎治療劑可以延長(zhǎng)患者的存活,并且/或者抑制明顯的臨床癥狀。在本文使用的術(shù)語(yǔ)的含義范圍內(nèi),治療有效的治療包括改善患者的生活質(zhì)量的治療,即使它們沒(méi)有改善疾病結(jié)果本身。這樣的治療有效量很容易地由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定。因此,“治療”是指送遞這樣的量。因此,治療可以防止或改善炎癥的任意病理癥狀。本發(fā)明中廣泛使用術(shù)語(yǔ)“治療(“Treat”、“treating”或“treatment,,)”,其主要涵蓋防止、改善、抑制或者治愈缺陷、機(jī)能障礙、疾病或其他有害的過(guò)程,包括干擾治療的和/或由治療導(dǎo)致的那些。干細(xì)胞本發(fā)明可以優(yōu)選地使用脊椎動(dòng)物物種的干細(xì)胞進(jìn)行,所述脊椎動(dòng)物物種例如人、非人靈長(zhǎng)類、馴養(yǎng)動(dòng)物、家畜和其他非人哺乳動(dòng)物。這些包括但不限于下文描述的那些細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞研究最透徹的干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞(ESC),因?yàn)樗哂袩o(wú)限的自我更新和多能分化潛能。這些細(xì)胞可以源自胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán),或者可以源自植入后胚胎的原始生殖細(xì)胞(胚胎生殖細(xì)胞或EG細(xì)胞)。ES和EG細(xì)胞最初是從小鼠中得到,之后從很多不同的動(dòng)物中得到,最近還從非人靈長(zhǎng)類和人中得到。當(dāng)ESC被導(dǎo)入小鼠胚泡或者其他動(dòng)物的胚泡中時(shí),ESC可以成為所述動(dòng)物的所有組織。ES和EG細(xì)胞可通過(guò)用抗SSEAl (小鼠)和SSEA4 (人)的抗體陽(yáng)性染色來(lái)鑒別。參見(jiàn),例如,美國(guó)專利 No. 5,453,357,5, 656,479,5, 670,372,5, 843,780、5,874,301、5,914,268、6,110,739、6,190,910、6,200,806、6,432,711,6, 436,701、6,500,668,6, 703,279,6, 875,607,7, 029,913,7, 112,437,7, 145,057,7, 153,684 和7,294,508,各自因其對(duì)胚胎干細(xì)胞以及制備和擴(kuò)增所述胚胎干細(xì)胞的方法的教導(dǎo)而通過(guò)引用的方式納入本文。因此,ESC及其分離和制備方法是本領(lǐng)域中公知的。已經(jīng)鑒定了許多影響胚胎干細(xì)胞在體內(nèi)的效能狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄因子和外源性細(xì)胞因子。被描述涉及干細(xì)胞多能性的首個(gè)轉(zhuǎn)錄因子是0ct4。0ct4屬于POU (Pit-Oct-Unc)轉(zhuǎn)錄因子家族,是能夠活化基因轉(zhuǎn)錄的DNA結(jié)合蛋白,在啟動(dòng)子或增強(qiáng)子區(qū)域內(nèi)包含被稱為“八聚體基序”的八聚序列。0ct4在受精卵的分裂期時(shí)表達(dá),直到卵圓柱形成。0ct3/4的功能是抑制分化誘導(dǎo)基因(即,F(xiàn)oxaD3、hCG)并且活化促進(jìn)多能性的基因(FGF4、UtfU Rexl)0Sox2-高遷移率族(high mobility group,HMG)框轉(zhuǎn)錄因子(box transcription
factor)的一個(gè)成員-與0ct4協(xié)作活化內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中表達(dá)的基因的轉(zhuǎn)錄。0ct3/4在胚胎
干細(xì)胞中的表達(dá)維持在某些水平之間是必要的。0ct4表達(dá)水平>50%的過(guò)表達(dá)或者下調(diào)將改變胚胎干細(xì)胞命運(yùn),分別為形成原始內(nèi)胚層/中胚層或滋養(yǎng)外胚層。在體內(nèi),0ct4缺陷的胚胎可發(fā)育至胚泡期,但是內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞不是多能的。相反,它們沿著胚胎外滋養(yǎng)層譜系分化。Sall4——一種哺乳動(dòng)物Spalt轉(zhuǎn)錄因子——是0ct4的上調(diào)調(diào)節(jié)子,因此對(duì)于在胚胎早期維持合適的0ct4水平是重要的。當(dāng)Sall4水平下降至低于某一闕值時(shí),滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞將異位擴(kuò)增至內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中。多能性所需要的另一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子是Nanog,是以Celtic部族“Tir Nan 0g”:永遠(yuǎn)年輕的土地,命名的。在體內(nèi),Nanog從致密桑葚胚期表達(dá),之后被限制在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中,并且在植入期下調(diào)。Nanog的下調(diào)對(duì)于在原腸胚形成過(guò)程中避免多能細(xì)胞的不受控?cái)U(kuò)增和允許多向分化可能是重要的。第5. 5天分離的Nanog無(wú)效胚胎由無(wú)序胚泡構(gòu)成,主要包含胚胎外內(nèi)胚層和無(wú)法辨認(rèn)的上胚層。非胚胎干細(xì)胞已在大部分組織中鑒別到干細(xì)胞??赡茏钋宄碚鞯氖窃煅杉?xì)胞(HSC)。HSC是來(lái)自中胚層的細(xì)胞,其可以使用細(xì)胞表面標(biāo)記物和功能特性來(lái)純化。它們已經(jīng)被從骨髓、外周血、臍帶血、胎肝和卵黃囊中分離到。它們起始造血作用并且產(chǎn)生多種造血譜系。當(dāng)它們被移植進(jìn)入致死量放射線照射的動(dòng)物中時(shí),它們能夠再造紅系嗜中性粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞(erythroid neutrophiΙ-macrophage)>巨核細(xì)胞和淋巴造血細(xì)胞庫(kù)。它們還能被誘導(dǎo)進(jìn)行一些自我更新的細(xì)胞分裂。參見(jiàn),例如,美國(guó)專利No. 5,635,387,5, 460,964,5, 677,136、5,750,397,5, 681,599和5,716,827。美國(guó)專利No. 5,192,553報(bào)道了用于分離人新生兒或胎兒造血細(xì)胞或祖細(xì)胞的方法。美國(guó)專利No. 5,716,827報(bào)道了作為Thy-Γ祖細(xì)胞的人造血細(xì)胞,以及在體外再生它們的合適生長(zhǎng)培養(yǎng)基。美國(guó)專利No. 5,635,387報(bào)道了用于培養(yǎng)人造血細(xì)胞和它們的前體的方法和裝置。美國(guó)專利No. 6,015,554描述了重建人淋巴和樹(shù)突細(xì)胞的方法。因此,HSC及其分離和擴(kuò)增方法是本領(lǐng)域中公知的。本領(lǐng)域中公知的另一種干細(xì)胞是神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)。這些細(xì)胞可在體內(nèi)增殖并且連續(xù)地再生至少一些神經(jīng)細(xì)胞。當(dāng)離體培養(yǎng)時(shí),神經(jīng)干細(xì)胞可被誘導(dǎo)增殖以及分化為不同類型的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。當(dāng)神經(jīng)干細(xì)胞被移植至腦中時(shí),其能夠植入并且產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。參見(jiàn),例如Gage F. H.,Science, 287:1433-1438(2000),Svendsen S. N. et al, Brain Pathology, 9:499-513 (1999)和 Okabe S. et al. , MechDevelopment, 59:89-102(1996)。美國(guó)專利No. 5,851,832報(bào)道了從腦組織中得到的多能神經(jīng)干細(xì)胞。美國(guó)專利No. 5,766,948報(bào)道了由新生兒大腦半球產(chǎn)生神經(jīng)母細(xì)胞。美國(guó)專利No. 5,564,183和5,849,553報(bào)道了哺乳動(dòng)物神經(jīng)嵴干細(xì)胞的用途。美國(guó)專利No. 6,040, 180報(bào)道了在體外由哺乳動(dòng)物多能CNS干細(xì)胞的培養(yǎng)物中產(chǎn)生分化的神經(jīng)元。WO 98/50526和WO 99/01159報(bào)道了神經(jīng)上皮干細(xì)胞、少突星型膠質(zhì)細(xì)胞前體和譜系受限的神經(jīng)元前體的產(chǎn)生和分離。美國(guó)專利No. 5,968,829報(bào)道了從胚胎前腦得到的神經(jīng)干細(xì)胞。因此,神經(jīng)干細(xì)胞以及制備和擴(kuò)增它們的方法是本領(lǐng)域中公知的。本領(lǐng)域中已經(jīng)大量研究的另一種干細(xì)胞是間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)。MSC來(lái)自于胚胎 中胚層,可從多種來(lái)源分離到,主要包括成體骨髓、外周血、脂肪、胎盤(pán)和臍帶血。MSC能夠分化成為很多中胚層組織,包括肌肉、骨、軟骨、脂肪和腱。關(guān)于這些細(xì)胞有大量的文獻(xiàn)。參見(jiàn),例如,美國(guó)專利 No. 5,486,389,5, 827,735,5, 811,094,5, 736,396,5, 837,539,5, 837,670和 5,827,740。還可見(jiàn)于 PUtenger,M. et al, Science, 284:143-147 (1999)。成體干細(xì)胞的另一個(gè)實(shí)例是脂肪來(lái)源的成體干細(xì)胞(ADSC),其通常已被通過(guò)以下方式從脂肪分離吸脂術(shù),之后使用膠原酶釋放ADSC。ADSC在很多方面類似于源自骨髓的MSC,不同的是能夠從脂肪中分離更多細(xì)胞。已經(jīng)報(bào)道這些細(xì)胞可以分化成為骨、脂肪、肌肉、軟骨和神經(jīng)元。U. S. 2005/0153442描述了一種分離方法。本領(lǐng)域中已知的其他干細(xì)胞包括胃腸干細(xì)胞、表皮干細(xì)胞和肝臟干細(xì)胞,其也被稱作“卵形細(xì)胞”(Potten, C.,et al. , Trans R Soc Lond B Biol Sci, 353:821-830 (1998)
,Watt, F., Trans R Soc Lond B Biol Sci, 353:831 (1997);Alison et al., Hepatology, 29:678-683(1998))。據(jù)報(bào)道能夠分化成為超過(guò)一種胚胎胚層的細(xì)胞類型的其他非胚胎細(xì)胞包括但不限于來(lái)自臍帶血的細(xì)胞(參見(jiàn)美國(guó)公布文本No. 2002/0164794)、來(lái)自胎盤(pán)的細(xì)胞(參見(jiàn)美國(guó)公布文本No. 2003/0181269)、來(lái)自臍帶基質(zhì)的細(xì)胞(Mitchell, K. E. et al. , StemCells,21:50-60(2003))、來(lái)自小胚胎樣干細(xì)胞的細(xì)胞(Kucia,M. et al. , J PhysiolPharmacol, 57 Suppl 5:5-18 (2006))、來(lái)自羊水干細(xì)胞的細(xì)胞(Atala, A.,J TissueRegen Med, 1:83-96 (2007))、來(lái)自皮膚來(lái)源的前體的細(xì)胞(Toma et al. , Nat CellBiol, 3:778-784 (2001))和來(lái)自骨髓的細(xì)胞(參見(jiàn)美國(guó)公布文本No. 2003/0059414和2006/0147246),其各自因?qū)@些細(xì)胞的教導(dǎo)而以引用的方式納入本文。重編稈體細(xì)胞的方法已經(jīng)使用了一些不同的方法(例如核移植、細(xì)胞融合和培養(yǎng)誘導(dǎo)的重編程)來(lái)誘導(dǎo)分化的細(xì)胞轉(zhuǎn)化為胚胎狀態(tài)。核轉(zhuǎn)移包括將體細(xì)胞核注射進(jìn)入去核卵母細(xì)胞,當(dāng)所述卵母細(xì)胞被轉(zhuǎn)移進(jìn)入代理母親中時(shí),可以形成克隆(“生殖性克隆”),或者當(dāng)所述卵母細(xì)胞在培 養(yǎng)中外植時(shí),可以形成遺傳匹配的胚胎干(ES)細(xì)胞(“體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移”,SCNT)。體細(xì)胞與ES細(xì)胞的細(xì)胞融合致使產(chǎn)生顯示多能ES細(xì)胞的全部特性的雜合體。培養(yǎng)中的體細(xì)胞的外植可選擇用于可以是多能(pluripotent or multipotent)的無(wú)限增殖細(xì)胞系。目前,精原細(xì)胞干細(xì)胞是來(lái)源自出生后動(dòng)物的多能細(xì)胞的唯一來(lái)源。用規(guī)定的因子轉(zhuǎn)導(dǎo)體細(xì)胞可以啟動(dòng)重編程至多能狀態(tài)。對(duì)這些試驗(yàn)方法有大量綜述(Hochedlinger and Jaenisch, Nature, 441:1061-1067(2006)和 Yamanaka, S.,Cell Stem Cell,1:39-49 (2007))。核轉(zhuǎn)移
核移植(NT),也被稱作體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移(SCNT),是指將來(lái)自供體體細(xì)胞的核導(dǎo)入去核卵母細(xì)胞以產(chǎn)生克隆動(dòng)物,例如多莉羊(ffilmut et al.,Nature, 385:810-813 (1997))。通過(guò)NT產(chǎn)生活的動(dòng)物證明了體細(xì)胞的表觀遺傳狀態(tài)(epigenetic state)(包括終末分化的細(xì)胞的表觀遺傳狀態(tài)),盡管是穩(wěn)定的,但也不是不可逆地固定的,而是可以重編程至胚胎狀態(tài),其能夠指導(dǎo)新生物體的發(fā)育。除了為闡釋胚胎發(fā)育和疾病中涉及的基本表觀遺傳機(jī)制提供令人興奮的實(shí)驗(yàn)方法外,核克隆技術(shù)具有用于患者特異性移植醫(yī)學(xué)的潛在益處。體細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的融合將體細(xì)胞核表觀遺傳重編程至未分化狀態(tài),已經(jīng)在通過(guò)胚胎細(xì)胞和體細(xì)胞融合產(chǎn)生的小鼠雜合體中被證明。多種體細(xì)胞與胚胎癌細(xì)胞(Solter, D.,Nat Rev Genet,7:319-327 (2006))、胚胎生殖細(xì)胞(EG)或 ES 細(xì)胞(Zwaka and Thomson, Development,132:227-233(2005))之間的雜合體有很多與親本胚胎細(xì)胞相同的特性,表明多能表型在這樣的融合產(chǎn)物中是主要的。對(duì)于小鼠(Tada et al. , Curr Biol, 11:1553-1558 (2001)),人ES細(xì)胞具有在融合之后重編程體細(xì)胞核的潛能(Cowan et al.,Science, 309:1369-1373 (2005) ;Yu et al.,Science, 318:1917-1920 (2006))。沉默多能標(biāo)記物例如 0ct4 的活化,或者失活體細(xì)胞X染色體的再活化為所述雜合細(xì)胞中體細(xì)胞基因組的重編程提供了分子證據(jù)。已經(jīng)提出DNA復(fù)制對(duì)于在融合后2天首次觀察到的多能標(biāo)記物的活化是必要的(Doand Scholer, Stem Cells, 22:941-949 (2004)),以及當(dāng)與神經(jīng)干細(xì)胞融合時(shí),Nanog 在 ES細(xì)胞中的強(qiáng)制過(guò)表達(dá)可促進(jìn)多能性(Silva et al. , Nature, 441:997-1001 (2006)) 培養(yǎng)誘導(dǎo)的重編稈已經(jīng)從胚胎源得到了多能細(xì)胞,所述胚胎源例如卵裂球和胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM) (ES細(xì)胞)、上胚層(EpiSC細(xì)胞)、原始生殖細(xì)胞(EG細(xì)胞)和出生后精原細(xì)胞干細(xì)胞(“maGSCsm”,“ES-樣”細(xì)胞)。以下的多能細(xì)胞,與它們的供體細(xì)胞/組織一起,描述如下單性生殖ES細(xì)胞(parthogenetic ES cell)來(lái)自小鼠卵母細(xì)胞(Narasimha et al. , Curr Biol,7:881-884(1997));胚胎干細(xì)胞來(lái)自卵裂球(Wakayama et al. , Stem Cells, 25:986-993 (2007));內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞(來(lái)源不適用)(Eggan et al.,Nature, 428:44-49 (2004));胚胎生殖細(xì)胞和胚胎癌細(xì)胞來(lái)自原始生殖細(xì)胞(Matsui et al.,Cell,70:841-847 (1992)) ;GMCS、maSSC 和 MASC 來(lái)自精原細(xì)胞干細(xì)胞(Guan et al. , Nature, 440:1199-1203(2006);Kanatsu-Shinohara etal. , Cell,119:1001-1012(2004);和 Seandel et al. , Nature, 449:346-350 (2007));EpiSC 細(xì)胞來(lái)自上胚層(Brons et al. , Nature, 448:191-195(2007);Tesar etal. , Nature, 448:196-199 (2007));單性生殖 ES 細(xì)胞來(lái)自人卵母細(xì)胞(Cibelli et al.
,Science, 295L819(2002);Revazova et al. , Cloning Stem Cells, 9:432-449 (2007));人 ES 細(xì)胞來(lái)自人胚泡(Thomson et al.,Science, 282:1145-1147(1998)) ;MAPC 來(lái)自骨髓(Jiang et al. , Nature, 418:41-49(2002);Phinney and Prockop,StemCells, 25:2896-2902(2007));臍帶血細(xì)胞(來(lái)自臍帶血)(an de Ven et al. , ExpHematoI, 35:1753-1765 (2007));神經(jīng)球(neurosphere)衍生的細(xì)胞來(lái)自神經(jīng)細(xì)胞(Clarkeet al.,Science, 288:1660-1663 (2000))。來(lái)自生殖細(xì)胞譜系的供體細(xì)胞(例如PGC或精原細(xì)胞干細(xì)胞)已知在體外是單能性的,但是已證明多能ES樣細(xì)胞(Kanatsu-Shinohara etal. ,Cell,119:1001-1012(2004))或 maGSC(Guan et al. , Nature, 440:1199-1203 (2006))在體外長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)后可被分離。盡管大部分這些多能細(xì)胞類型能夠在體外分化和形成畸胎瘤,但依據(jù)更嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn),僅ES、EG、EC和精原細(xì)胞干細(xì)胞衍生的maGCS或ES樣細(xì)胞是多能的,因?yàn)樗鼈兡軌蛐纬沙錾笄逗象w并且成為生殖種系。最近,多能成體精原細(xì)胞干細(xì)胞(MASC)可從成體小鼠的睪丸精原細(xì)胞干細(xì)胞中得到,并且這些細(xì)胞具有與 ES 細(xì)胞不同(Seandel et al.,Nature, 449:346-350 (2007))但是與 EpiSC細(xì)胞類似的表達(dá)譜,所述EpiSC細(xì)胞來(lái)自植入后小鼠胚胎的上胚層(Bixms et al.,Nature, 448:191-195 (2007);Tesar et al. , Nature, 448:196-199(2007))。 通過(guò)規(guī)定的轉(zhuǎn)錄因子重編程Takahashi和Yamanaka已經(jīng)報(bào)道了將體細(xì)胞重編程回ES樣狀態(tài)(Takahashi andYamanaka, Cell, 126:663-676 (2006))。在將 4 種轉(zhuǎn)錄因子 0ct4、Sox2、c-myc 和 Klf4 進(jìn)行病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo),之后針對(duì)0ct4靶基因Fbxl5的活化進(jìn)行選擇之后,他們成功地將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)和成體成纖維細(xì)胞重編程為多能ES樣細(xì)胞(圖2A)。具有活化的Fbxl5的細(xì)胞是制造的iPS (誘導(dǎo)的多能干)細(xì)胞并且通過(guò)它們形成畸胎瘤的能力證明了它們是多能的,但是它們不能產(chǎn)生活的嵌合體。這種多能狀態(tài)依賴于轉(zhuǎn)導(dǎo)的0ct4和Sox2基因的連續(xù)病毒表達(dá),而內(nèi)源0ct4和Nanog基因或者不表達(dá),或者以比ES細(xì)胞中低的水平表達(dá),并且發(fā)現(xiàn)它們各自的啟動(dòng)子大量甲基化。這與以下結(jié)論一致,即雖然Fbxl5-iPS細(xì)胞與ES細(xì)胞并不一樣,但是可能代表了重編程的不完全狀態(tài)。盡管遺傳實(shí)驗(yàn)已經(jīng)確定了 0ct4和Sox2 對(duì)于多能性是必需的(Chambers and Smith, Oncogene, 23:7150-7160 (2004) ; Ivanona et al. , Nature, 442:5330538(2006);Masui et al., Nat Cell Biol,9:625-635(2007)),但是兩種癌基因c-myc和Klf4在重編程中的作用仍較不清晰。這些癌基因中的一些實(shí)際上對(duì)于重編程來(lái)說(shuō)是可省去的,因?yàn)橐呀?jīng)在不存在c-myc轉(zhuǎn)導(dǎo)的情況下得到了小鼠和人的iPS 細(xì)胞,盡管效率較低(Nakagawa et al. , Nat Biotechnol, 26:191-106 (2008) ;fferninget al. , Nature, 448:318-324(2008);Yu et al.,Science, 318:1917-1920 (2007))。MAPCMAPC是“多能成體祖細(xì)胞”的首字母縮略詞(非-ES,非-EG,非生殖細(xì)胞)。MAPC具有分化為至少兩種(例如所有三種)原胚層(外胚層、中胚層和內(nèi)胚層)的細(xì)胞類型的能力。存在于ES細(xì)胞中的基因也可存在于MAPC中(例如,端粒酶、Oct 3/4、rex-1、rox-1、sox-2)。Oct 3/4 (人中Oct 3A)看起來(lái)是ES和生殖細(xì)胞特異性的。MAPC代表比MSC更原始的祖細(xì)胞群(Verfaillie,C.M.,Trends Cell Biol 12:502-8(2002) ;Jahagirdar,B. N. , et al. , Exp Hematol, 29:543-56(2001);Reyes, M. and CM. VerfaiIlie, Ann N YAcadSci, 938:231-233 (2001) ; Jiang, Y. et al. , Exp Hematol, 30896-904(2002);和(Jiang, Y.et al. , Nature, 418:41-9. (2002))。人MAPC記載于美國(guó)專利7,015,037和美國(guó)申請(qǐng)No. 10/467,963。已經(jīng)在其他哺乳動(dòng)物中鑒定了 MAPC。例如,鼠MAPC也記載于美國(guó)專利7,015,037和美國(guó)申請(qǐng)No. 10/467,963。大鼠 MAPC 還描述于美國(guó)申請(qǐng) No. 10/467,963。
這些參考文 獻(xiàn)因記載了由Catherine Verfaillie首次分離的MAPC而以引用的方式納入本文。MAPC的分離和培養(yǎng)MAPC分離方法是本領(lǐng)域中已知的。參見(jiàn),例如,美國(guó)專利7,015,037和美國(guó)申請(qǐng)No. 10/467,963,這些方法連同MAPC的特征(表型)以引用的方法納入本文。MAPC可從多個(gè)源分離,所述源包括但不限于骨髓、胎盤(pán)、臍帶和臍帶血、肌肉、腦、肝臟、脊髓、血液或皮膚。因此,可能獲得骨髓抽吸物、腦或肝臟活檢樣品和其他器官,并且使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的陽(yáng)性或隱性選擇技術(shù),依賴這些細(xì)胞表達(dá)(或者不表達(dá))的基因(例如,通過(guò)功能性或形態(tài)學(xué)測(cè)定,例如上文引用的申請(qǐng)中公開(kāi)的那些,所述申請(qǐng)以引用的方式納入本文)分離所述細(xì)胞。美國(guó)專利7.015. 037中描沭的來(lái)自人骨髓的MAPCMAPC不表達(dá)共有的白細(xì)胞抗原⑶45或成紅細(xì)胞特異的血型糖蛋白_A (Gly-A)0將細(xì)胞的混合群進(jìn)行Ficoll Hypaque分離。然后以使用抗⑶45的抗體和抗Gly-A的抗體的陰性選擇對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理,耗盡CD45+和Gly-A+細(xì)胞的群,然后回收剩余的約0. 1%的骨髓單核細(xì)胞。還可將細(xì)胞鋪板于纖連蛋白包被的孔中,并且如下文所述培養(yǎng)2-4周以耗盡⑶45+和Gly-A+細(xì)胞。在貼壁骨髓細(xì)胞(adherent bone marrow cell)的培養(yǎng)物中,很多貼壁基質(zhì)細(xì)胞在細(xì)胞倍增約30次時(shí)發(fā)生復(fù)制性衰老,更同質(zhì)的細(xì)胞群繼續(xù)擴(kuò)增并且保持長(zhǎng)的端粒?;蛘撸梢允褂藐?yáng)性選擇與細(xì)胞特異性標(biāo)記物來(lái)分離細(xì)胞。陽(yáng)性和陰性選擇技術(shù)都是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以得到的,并且本領(lǐng)域中可得到很多適于陰性選擇目的的單克隆和多克隆抗體(參見(jiàn),例如,Leukocyte Typing V, Schlossman, et al. , Eds. (1995) OxfordUniversity Press),其可從許多來(lái)源市購(gòu)得到。從細(xì)胞群混合物中分離哺乳細(xì)胞的技術(shù)也已經(jīng)記載于Schwartz et al.,inU. S. Patent No. 5, 759, 793 (磁性分離),Basch et al. , 1983 (免疫親和層析)和 Wysockiand Sato et al.,1978 (熒光激活細(xì)胞分選)中。U. S. 7, 015, 037 中描沭的培養(yǎng) MAPC如本文描述分離的MAPC可以使用本文和美國(guó)專利7,015,037中描述的方法培養(yǎng),所述專利因這些方法而以引用的方式納入本文。細(xì)胞可在低血清或無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用于培養(yǎng)MAPC的無(wú)血清培養(yǎng)基記載于美國(guó)專利7,015,037中。已經(jīng)在無(wú)血清和低血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)了很多細(xì)胞。在這種情況下,所述培養(yǎng)基補(bǔ)充了一種或多種生長(zhǎng)因子。通常使用的生長(zhǎng)因子包括但不限于骨形態(tài)發(fā)生蛋白、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板衍生的生長(zhǎng)因子和表皮生長(zhǎng)因子。參見(jiàn),例如,美國(guó)專利 No. 7,169,610,7, 109,032,7, 037,721,6, 617,161,6, 617,159,6, 372,210,6, 224,860、6,037,174,5, 908,782,5, 766,951,5, 397,706 和 4,657,866 ;全部都因?qū)υ跓o(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞的教導(dǎo)而以引用的方式納入本文。另外的培養(yǎng)方法在另外的實(shí)驗(yàn)中,培養(yǎng)MAPC的密度可以是從約100個(gè)細(xì)胞/cm2或約150個(gè)細(xì)胞/cm2至約10000個(gè)細(xì)胞/cm2變化,包括約200個(gè)細(xì)胞/cm2至約1500個(gè)細(xì)胞/cm2至約2000個(gè)細(xì)胞/cm2。所述密度可隨種的不同而變化。此外,最佳密度可依賴于培養(yǎng)條件和細(xì)胞來(lái)源而變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定對(duì)于給定培養(yǎng)條件和細(xì)胞組的最佳密度。同樣,在培養(yǎng)的MAPC的分離、生長(zhǎng)和分化期間的任何時(shí)間都可以使用低于約10%,包括約1_5%,尤其是3-5%的有效大氣氧濃度。 可在多種血清濃度下(例如約2-20%)培養(yǎng)細(xì)胞。可以使用胎牛血清。更高的血清濃度可以與更低的氧張力結(jié)合使用,例如,約15-20%。不必在貼壁至培養(yǎng)皿之前選擇細(xì)胞。例如,在Ficoll梯度離心之后,將細(xì)胞以例如250,000-500, 000/cm2直接鋪板??梢蕴舫鲑N壁集落,可以合并并且擴(kuò)增。在一個(gè)實(shí)施方案中,在實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)方法中使用的高血清(約15-20%)和低氧(約3-5%)條件被用于細(xì)胞培養(yǎng)。具體地,將來(lái)自集落的貼壁細(xì)胞以約1700-2300個(gè)細(xì)胞/cm2的密度在18%血清和3%氧下(具有TOGF和EGF)中鋪板并傳代。在特異針對(duì)MAPC的一個(gè)實(shí)施方案中,補(bǔ)充物是允許MAPC保持分化為所有三個(gè)譜系的能力的細(xì)胞因子或組分。這可以通過(guò)未分化狀態(tài)的特定標(biāo)記物的表達(dá)來(lái)指示。例如,MAPC組成型表達(dá)Oct 3/4 (Oct 3A)并且維持高水平的端粒酶。細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)于下文列出的全部組分,參見(jiàn)U. S. 7,015,037,其因?qū)@些組分的教導(dǎo)而以引用的方式納入本文??偟膩?lái)說(shuō),可以在本領(lǐng)域中公知并且可以得到的培養(yǎng)基中維持并且擴(kuò)增可用于本發(fā)明的細(xì)胞。還考慮到了給細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)充哺乳動(dòng)物血清。還可以有利地使用其他補(bǔ)充物來(lái)為細(xì)胞提供必需微量元素以實(shí)現(xiàn)最佳生長(zhǎng)和擴(kuò)增。還可以有利地將激素用于細(xì)胞培養(yǎng)。還可以根據(jù)細(xì)胞類型和分化細(xì)胞的命運(yùn)來(lái)使用脂質(zhì)和脂質(zhì)載體以補(bǔ)充細(xì)胞培養(yǎng)基。還考慮到了使用飼養(yǎng)細(xì)胞層。還可在“3D”(聚集的)培養(yǎng)物中培養(yǎng)細(xì)胞。一個(gè)實(shí)例是2009年I月21日提交的PCT/US2009/31528。—旦在培養(yǎng)中建立,細(xì)胞可被新鮮使用,或者使用例如含40%FCS和10%DMS0的DMEM冷凍并以冷凍儲(chǔ)液形式儲(chǔ)存。對(duì)于用于制備所培養(yǎng)的細(xì)胞的冷凍儲(chǔ)液的其他方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的。藥物制劑U.S. 7,015,037因?yàn)閷?duì)藥物制劑的教導(dǎo)而以引用的方式納入本文。在一些實(shí)施方案中,所述細(xì)胞群存在于組合物中,所述組合物被改造為適于遞送,即是生理學(xué)相容的。在一些實(shí)施方案中,用于給予受試者的細(xì)胞(或條件化培養(yǎng)基)的純度是約100%(基本同質(zhì))。在其他實(shí)施方案中,純度是95%至100%。在一些實(shí)施方案中,純度是85%至95%。具體地,對(duì)于與其他細(xì)胞的混合物的情況,所述百分比可以是約10%-15%、15%-20%、20%-25%、25%-30%、30%-35%、35%-40%、40%-45%、45%-50%、60%-70%、70%-80%、80%-90% 或90%-95%?;蛘?,分離/純度可以細(xì)胞倍增的方式表達(dá),其中所述細(xì)胞已經(jīng)經(jīng)歷了例如10-20、20-30、30-40、40-50或更多次的細(xì)胞倍增。對(duì)于給定應(yīng)用,用于給予所述細(xì)胞的制劑的選擇將依賴于多種因素。其中主要的因素是受試者的種類;待治療的病癥的性質(zhì),它的狀態(tài)和在所述受試者中的分布;所給予的其他療法和試劑的性質(zhì);給藥的最佳途徑;經(jīng)所述途徑的殘存性(survivability);給藥方案和對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)明顯的其他因素。例如,合適載體和其他添加劑的選擇會(huì)依賴于給藥的確切路徑和具體劑型的性質(zhì)。細(xì)胞/培養(yǎng)基的水性懸液的最終配制一般包括將所述懸液的離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)至等滲(即,約0. I至0.2)并且調(diào)節(jié)至生理pH (8卩,約??jī)?cè).8至7.5)。最終制劑一般還會(huì)包含流體潤(rùn)滑劑。
在一些實(shí)施方案中,細(xì)胞/培養(yǎng)基被配制為可注射的單位劑型,例如溶液劑、懸液劑或乳劑。適于注射細(xì)胞/培養(yǎng)基的藥物制劑一般是無(wú)菌的水性溶液和分散液。用于可注射制劑的載體可以是包含例如以下物質(zhì)的溶劑或分散介質(zhì)水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液態(tài)聚乙二醇等)及其合適的混合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定本發(fā)明方法中給予的組合物中的細(xì)胞和任選的添加劑、賦形物和/或載體的量。一般地,任意添加劑(除所述細(xì)胞之外)的存在量為在溶液中(例如在磷酸鹽緩沖鹽水中)0. 001至50wt%。活性成分以毫克至微克的量級(jí)存在,例如為約0. 001至約5wt%,優(yōu)選約0. 0001至約lwt%,最優(yōu)選為約0. 0001至約0. 05wt%或者約0. 001至約20wt%,優(yōu)選約0. 01至約10wt%,最優(yōu)選為約0. 05至5wt%。細(xì)胞的劑量可在很大范圍內(nèi)變化,并且在每種具體情況下均會(huì)適合個(gè)體需求。一般地,腸胃外給藥的情況下,常規(guī)地給予約I萬(wàn)個(gè)至約2千萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/kg受體體重。細(xì)胞的數(shù)量將根據(jù)以下因素變化受體的體重和病癥、給藥的次數(shù)或頻率以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他可變因素??赏ㄟ^(guò)適于所述組織或器官的途徑給予所述細(xì)胞。例如,它們可被全身給予,即,通過(guò)靜脈給予來(lái)腸胃外給予;或者可以被靶向具體的組織或器官;它們可被通過(guò)皮下給藥或通過(guò)向具體的所需組織中的給藥而被給予。所述細(xì)胞可以約0.01 X IO6個(gè)至約5 X IO6個(gè)細(xì)胞/ml的濃度懸浮于合適的賦形劑中。對(duì)于注射溶液適合的賦形劑是與細(xì)胞和受體在生物學(xué)和生理學(xué)上相容的那些賦形劑,例如緩沖的鹽水溶液或其他合適的賦形劑。用于給藥的所述組合物可根據(jù)符合適當(dāng)?shù)臒o(wú)菌性和穩(wěn)定性的標(biāo)準(zhǔn)方法而配制、生產(chǎn)和存儲(chǔ)。對(duì)淋巴造血組織中的給藥用于向這些組織中給藥的技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的。例如,骨髓內(nèi)注射可以包括將細(xì)胞直接注射進(jìn)入(一般為)髂后嵴的骨髓腔中,但是還可以包括髂嵴、股骨、脛骨、肱骨或尺骨中的其他位點(diǎn);脾臟注射可以包括在射線拍照指導(dǎo)下注射進(jìn)入脾臟,或者通過(guò)腹腔鏡或剖腹術(shù)手術(shù)暴露脾臟;派伊爾氏淋巴集結(jié)(peyer' s patch)、GALT或BALT注射可以要求剖腹術(shù)或腹腔鏡注射過(guò)程。MS用于人或其他哺乳動(dòng)物的劑量可無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)即由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容、本文引用的文獻(xiàn)和本領(lǐng)域中的知識(shí)確定。適合用于本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方案的細(xì)胞/培養(yǎng)基的劑量會(huì)依賴于許多因素。確定主要和輔助療法所給予的最佳劑量的參數(shù)一般會(huì)包括以下中的一些和全部待治療的疾病及其階段;受試者的種類、其健康情況、性別、年齡、體重和代謝速率;受試者的免疫活性;給予的其他治療法;和根據(jù)所述受試者的病史或基因型預(yù)測(cè)的可能并發(fā)癥。所述參數(shù)還包括所述細(xì)胞是否是同基因、自體同源、同種異體或者異種的;它們的效能(具體活性);所述細(xì)胞/培養(yǎng)基若要有效則必須靶向的位點(diǎn)和/或分布;以及所述位點(diǎn)的如下特性,例如細(xì)胞/培養(yǎng)基的可及性(accessibility)和/或細(xì)胞的植入。其他參數(shù)包括與其他因子(例如生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子)的共給予。給定情況的最佳劑量還將考慮制備所述細(xì)胞/培養(yǎng)基的方式,給予所述細(xì)胞/培養(yǎng)基的方式,以及所述細(xì)胞/培養(yǎng)基在給藥之后在所述祀位點(diǎn)處集中(localize)的程度。細(xì)胞的最佳劑量可以在用于自體同源單核骨髓移植的劑量范圍內(nèi)。對(duì)于細(xì)胞的完全純的制品,多個(gè)實(shí)施方案中的最佳劑量的范圍是每次給藥IO4至IO8個(gè)細(xì)胞/kg受體體重。在一些實(shí)施方案中,每次給藥的最佳劑量為IO5至IO7個(gè)細(xì)胞/kg。在很多實(shí)施方案中,每次給藥的最佳劑量為5X IO5至5X IO6個(gè)細(xì)胞/kg。作為參考,前述的較高劑量類似于自體同源單核細(xì)胞骨髓移植中使用的有核細(xì)胞的劑量。一些較低的劑量類似于自體同源單核骨髓移植中使用的CD34+個(gè)細(xì)胞/kg的數(shù)目。在多個(gè)實(shí)施方案中,可以以初 始劑量給予細(xì)胞/培養(yǎng)基,之后通過(guò)進(jìn)一步給藥來(lái)維持。初始可用一種方法給予細(xì)胞/培養(yǎng)基,之后通過(guò)相同的方法或者一種或多種不同的方法給予??赏ㄟ^(guò)所述細(xì)胞/培養(yǎng)基的持續(xù)給藥來(lái)維持所述水平。多個(gè)實(shí)施方案通過(guò)靜脈注射來(lái)初始給予所述細(xì)胞/培養(yǎng)基并且/或者在所述受試者中維持其水平。在多個(gè)實(shí)施方案中,根據(jù)患者的病癥和其他因素(在本文他處描述)可使用其他形式的給藥。細(xì)胞/培養(yǎng)基可以多種頻率在很寬時(shí)間范圍內(nèi)給予。一般地,治療的長(zhǎng)度會(huì)與所述疾病過(guò)程的長(zhǎng)度、實(shí)行的治療的效力以及接受治療的受試者的病癥和反應(yīng)成比例。由于本發(fā)明的細(xì)胞分泌一種或多種因子,所述因子通過(guò)本申請(qǐng)中描述的多種生物學(xué)機(jī)制最終減少炎癥,因此所述細(xì)胞的給藥可用于減少如上所列的任意數(shù)目病狀中的不想要的炎癥。此外,由本申請(qǐng)描述的生物學(xué)機(jī)制提供了其他用途。這些用途中的一種包括藥物發(fā)現(xiàn)。該方面包括就調(diào)節(jié)所述細(xì)胞的抗炎效應(yīng)的能力篩選一種或多種化合物。這將包括,首先,針對(duì)細(xì)胞減少以下任一情況的能力開(kāi)發(fā)測(cè)定法(I)炎癥,⑵外滲,⑶內(nèi)皮細(xì)胞-白細(xì)胞結(jié)合,(4)粘附分子在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)(RNA和/或蛋白質(zhì)),(5)與所述粘附細(xì)胞分子結(jié)合的相關(guān)配體(cognate ligand)(位于白細(xì)胞上)的表達(dá),前提是該配體的表達(dá)受到內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)節(jié),和出)內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生。因此,該測(cè)定法可被設(shè)計(jì)為在體內(nèi)或在體外進(jìn)行。調(diào)節(jié)測(cè)定法可評(píng)估任意所需水平上的活化狀態(tài),例如形態(tài)學(xué)、基因表達(dá)、功能等。它可能包括分離的血管內(nèi)皮?;蛘撸赡馨◤膬?nèi)皮部分地或者完全地移出的血管內(nèi)皮細(xì)胞,包括內(nèi)皮細(xì)胞株(strain)和內(nèi)皮細(xì)胞系(line),可以是天然的或重組的。但是,它還可以包括已知具有結(jié)合親和性的分離的細(xì)胞組分,例如內(nèi)皮上表達(dá)的粘附分子和存在于白細(xì)胞上的它們的相關(guān)結(jié)合配體。因此,表達(dá)或分泌所述細(xì)胞粘附分子的重組細(xì)胞和相關(guān)的白細(xì)胞配體可被用于測(cè)定結(jié)合?;蛘撸龇蛛x的淋巴細(xì)胞結(jié)合伴侶(binding partner)可與表達(dá)內(nèi)皮粘附分子的細(xì)胞一起使用,所述內(nèi)皮粘附分子例如P-選擇蛋白或E-選擇蛋白和 CD 15s ; I CAM-1 或 I CAM-2 和 LFA-1 ;ICAM 和 Mac-1 ; VCAM-1 和 VLA-4。所述測(cè)定可以包含活性細(xì)胞因子,例如TNF-a或IL_1 P。僅所述細(xì)胞因子即可構(gòu)成所述測(cè)定的基礎(chǔ)。例如,可測(cè)定所述細(xì)胞/培養(yǎng)基在基于細(xì)胞的受體測(cè)定或可溶性受體測(cè)定中結(jié)合TNF-a的能力,或者作為TNF-a受體的競(jìng)爭(zhēng)抑制劑起作用的能力。非結(jié)合的TNF-a可被直接檢測(cè),或者用于非結(jié)合TNF-a的測(cè)定可以包括針對(duì)TNF-a的任意生物學(xué)效應(yīng)的測(cè)定。這還可以適用于其他活性細(xì)胞因子,例如IL-1?;蛘撸鰷y(cè)定可以涉及所述細(xì)胞/培養(yǎng)基在基于受體的測(cè)定中調(diào)節(jié)(增加、降低)NFkB的能力,所述基于受體的測(cè)定使用與由NFk B控制的啟動(dòng)子可操作地連接的報(bào)告基因。然后所述測(cè)定可被用于篩選增加或者降低所述細(xì)胞/培養(yǎng)基的效應(yīng)的化合物/試劑??梢酝ㄟ^(guò)直接測(cè)定蛋白質(zhì)或DNA來(lái)估計(jì)基因表達(dá)。這可以通過(guò)本領(lǐng)域中公知的任意技術(shù)進(jìn)行,例如通過(guò)FACS、其他基于抗體的檢測(cè)方法、PCR以及其他基于雜交的檢測(cè)方法進(jìn)行。間接檢測(cè)也可以用于表達(dá),例如結(jié)合至任意已知的結(jié)合伴侶。用于表達(dá)/分泌的測(cè)定包括但不限于對(duì)組織樣本或細(xì)胞ELISA、Luminex、qRT-PCR、抗因子蛋白質(zhì)印跡(anti-facto r western blot)和因子免疫組織化學(xué)。對(duì)細(xì)胞和條件化培養(yǎng)基中的調(diào)節(jié)因子的定量確定可以使用市售測(cè)定試劑盒(例如,依賴兩步驟消減的基于抗體的測(cè)定(two - step subtractive antibody-based assay)的R&D系統(tǒng))來(lái)進(jìn)行。本發(fā)明涵蓋用于產(chǎn)生具有本文描述的增加的效應(yīng)的細(xì)胞的方法。因此,本發(fā)明涵蓋鑒別化合物的方法,所述化合物增加所述細(xì)胞具有本文描述任意效應(yīng)的能力,所述方法是通過(guò)將所述細(xì)胞暴露于化合物并且檢測(cè)所述細(xì)胞在任意需要水平上達(dá)到所述效應(yīng)的能力來(lái)進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中,一些細(xì)胞可能需要在產(chǎn)生具有本文描述的效應(yīng)的因子之前與活化的內(nèi)皮細(xì)胞接觸。這樣的細(xì)胞可被指定為“原初”。因此,在一個(gè)實(shí)施方案中,可能通過(guò)使用適合于本文描述的藥物發(fā)現(xiàn)的化合物來(lái)代替活化的內(nèi)皮細(xì)胞的作用。在一個(gè)實(shí)施方案中,例如,發(fā)明人發(fā)現(xiàn)IL-I @、TNF-a和IFN-Y的結(jié)合物可以代替與活化的內(nèi)皮細(xì)胞的接觸,這在實(shí)施例部分簡(jiǎn)要地描述。因此,可用任意數(shù)目的化合物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選以鑒定允許該代替的化合物。然后,對(duì)于本申請(qǐng)中描述的任何治療用途,以及對(duì)于產(chǎn)生可用于臨床、治療和診斷應(yīng)用的組合物和細(xì)胞建庫(kù),可將這些化合物用于預(yù)處理原初細(xì)胞。具體測(cè)定的實(shí)例I.內(nèi)皮細(xì)胞的FACS分析以在與MAPC共培養(yǎng)或者以來(lái)自MAPC的條件化培養(yǎng)基孵育之后檢測(cè)粘附分子的存在情況。2.對(duì)結(jié)合至與MAPC共培養(yǎng)或者以來(lái)自MAPC的條件化培養(yǎng)基孵育的內(nèi)皮細(xì)胞的嗜中性粒細(xì)胞定量。3.在與MAPC共培養(yǎng)或者以來(lái)自MAPC的條件化培養(yǎng)基孵育之后使用基于啟動(dòng)子的系統(tǒng)對(duì)NF- K B活性定量。4.在已將內(nèi)皮層與MAPC共培養(yǎng)或者以來(lái)自MAPC的條件化培養(yǎng)基孵育之后,使用基于ECIS的系統(tǒng)或類似系統(tǒng)對(duì)穿過(guò)所述內(nèi)皮層的白細(xì)胞外滲定量。還可以通過(guò)檢測(cè)由所述細(xì)胞分泌的活性因子來(lái)進(jìn)行效能測(cè)定。所述活性分子包括糖皮質(zhì)激素、HB-EGF, IL-10、前列腺素 Al、IL-13、IL-1R、IL-18R、IFN-R、TNF-RU TNF-R2、IL-4、IL-II、IFN-P、TGF-3 I、3 2、3 3、前列腺素 E2、SPP1、CYLD、彈性蛋白酶、VEGF、IL_33、胸腺素B4和TGF-3腎上腺髓質(zhì)素。檢測(cè)可以是直接的,例如通過(guò)RNA或蛋白質(zhì)測(cè)定;或者是間接的,例如,對(duì)這些因子的一種或多種生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行生物學(xué)測(cè)定。本發(fā)明的另一個(gè)用途是建立細(xì)胞庫(kù)以提供用于臨床給藥的細(xì)胞。一般地,該方法的一個(gè)基本部分是提供具有所需效能的用于在多種治療臨床情況下給藥的細(xì)胞??捎糜谒幬锇l(fā)現(xiàn)的任意相同測(cè)定法還可被應(yīng)用于為所述庫(kù)選擇細(xì)胞以及從所述庫(kù)中選擇細(xì)胞來(lái)用于給藥。因此,在建庫(kù)過(guò)程中,將檢測(cè)所述細(xì)胞(或培養(yǎng)基)實(shí)現(xiàn)任意上述效應(yīng)的能力。然后,將選擇具有用于任意上述效應(yīng)的所需效能的細(xì)胞,這些細(xì)胞將形成用于產(chǎn)生細(xì)胞庫(kù)的基礎(chǔ)。還考慮到了通過(guò)用外源化合物處理來(lái)增加效能,所述化合物例如通過(guò)用大的組合文庫(kù)篩選細(xì)胞而發(fā)現(xiàn)的化合物。這些化合物文庫(kù)可以是試劑文庫(kù),所述試劑包括但不限于小的有機(jī)分子、反義核酸、siRNA DNA適體、肽、抗體、非抗體蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子、趨化因子和趨化物。例如,細(xì)胞可在培養(yǎng)和制備過(guò)程中的任意時(shí)間暴露于這類試劑。唯一的需求是有足夠數(shù)目使得所需測(cè)定得以進(jìn)行以評(píng)估所述試劑是否增加效能。在上文描述的一般藥物發(fā)現(xiàn)方法中發(fā)現(xiàn),在建庫(kù)前的最后傳代過(guò)程中,可以更有利地應(yīng)用這類試劑。從合格的骨髓供體中分離細(xì)胞,所述合格的骨髓供體已經(jīng)接受了特定的測(cè)試要求以確定從該供體得到的細(xì)胞產(chǎn)物可安全地在臨床情況下使用。使用手工或自動(dòng)化方法分離所述單核細(xì)胞。將這些單核細(xì)胞置于培養(yǎng)中,使得這些細(xì)胞貼壁至經(jīng)處理的細(xì)胞培養(yǎng)容器 表面??墒筂APC細(xì)胞在經(jīng)處理的表面擴(kuò)增,在第2天和第4天更換培養(yǎng)基。在第6天,通過(guò)機(jī)械方法或酶學(xué)方法將細(xì)胞從所述經(jīng)處理的基質(zhì)中移除,并且重鋪于細(xì)胞培養(yǎng)容器的另一個(gè)經(jīng)處理的表面。在第8天和第10天,如前所述將所述細(xì)胞從所述經(jīng)處理的表面移除并且進(jìn)行重鋪。在第13天,將所述細(xì)胞從所述經(jīng)處理的表面移除,洗滌并且與冷凍保護(hù)材料結(jié)合,并且最后在液氮中冷凍。在所述細(xì)胞已經(jīng)冷凍至少I周之后,取出細(xì)胞的等分試樣并用于效能、類型、無(wú)菌性測(cè)試以及其他測(cè)試以確定所述細(xì)胞庫(kù)的可用性。然后,可通過(guò)解凍該庫(kù)中的這些細(xì)胞、將它們置于培養(yǎng)中來(lái)使用這些細(xì)胞,或者在解凍之后使用它們來(lái)治療可能的適應(yīng)癥。另一個(gè)用途是針對(duì)給予所述細(xì)胞之后的效能和有益的臨床效應(yīng)的診斷測(cè)定。根據(jù)所述適應(yīng)癥,可能有可用于評(píng)估的生物標(biāo)記物。例如,高水平的C-反應(yīng)蛋白與急性炎癥應(yīng)答有關(guān)。人們可以監(jiān)測(cè)CRP的水平來(lái)確定有益的臨床效應(yīng)。另一個(gè)用途是評(píng)估細(xì)胞達(dá)到上述任意結(jié)果的功效,所述評(píng)估作為將所述細(xì)胞給予受試者之前的治療前診斷。組合物本發(fā)明還涉及細(xì)胞群,其具有實(shí)現(xiàn)本文描述的任意效應(yīng)的具體效能(S卩,炎癥、夕卜滲、粘附、減少內(nèi)皮活化等)。如上所述,這些群是通過(guò)選擇具有所需效能的細(xì)胞建立的。這些群被用于制備其他組合物,例如,包含具有具體所需效能的群的細(xì)胞庫(kù)和包含具有具體所需效能的細(xì)胞群的藥物組合物。實(shí)施例實(shí)施例IMu丨tiStem 是在本文實(shí)施例中描述的實(shí)驗(yàn)方法中使用的MAPC細(xì)胞制品的商標(biāo)名稱。多能成體祖細(xì)胞在活化后調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子表面表達(dá)并且在AMI之后減少爐依據(jù)/背景免疫細(xì)胞向炎癥位點(diǎn)的定位是對(duì)損傷和感染的免疫應(yīng)答的重要部分。在對(duì)炎癥的應(yīng)答中,免疫細(xì)胞(包括白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞)結(jié)合至內(nèi)皮細(xì)胞層并且變移穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞層到達(dá)損傷位點(diǎn)1’2。內(nèi)皮細(xì)胞可被凝血酶、組胺和促炎細(xì)胞因子(例如,TNF-a和白細(xì)胞介素I P )以及氧自由基活化,這可導(dǎo)致粘附分子(包括E-選擇蛋白、V-CAM和I-CAM-I)的上調(diào)3_5。內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞表面上細(xì)胞粘附分子的上調(diào)可使活化的免疫細(xì)胞粘附、滾動(dòng)并且變移穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞屏障4。
盡管免疫系統(tǒng)的動(dòng)員是對(duì)感染和對(duì)傷口愈合的免疫應(yīng)答的關(guān)鍵部分,缺血性損傷后的炎癥可促使細(xì)胞毒性和死亡。例如,在急性心肌梗死之后,嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的增加與用溶血栓療法和初級(jí)血管形成術(shù)治療的患者中有害事件的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)6_8。對(duì)心肌梗死的炎癥應(yīng)答程度在確定梗死大小以及之后的左心室(LV)重塑過(guò)程中具有重要作用9’1(1。嗜中性粒細(xì)胞至心臟的定位通過(guò)釋放蛋白酶和活性氧簇(ROS)促使心肌損傷,所述蛋白酶和活性氧簇可促使左心室重塑。此外,嗜中性粒細(xì)胞通過(guò)在被描述為“無(wú)再流(no reflow)”的現(xiàn)象中阻斷毛細(xì)血管而促使微血管和毛細(xì)血管損傷n。朝向T輔助I (Thl)細(xì)胞的促炎失衡可促使左心室膨脹、心臟收縮機(jī)能障礙和功能降低12。因此,AMI之后調(diào)節(jié)嗜中性粒細(xì)胞和炎性細(xì)胞應(yīng)答會(huì)幫助減少對(duì)心肌膜的損傷。Mu丨tiStein'1'是已證明在臨床如fe型中以及現(xiàn)在在I期臨床試驗(yàn)中,在AMl之后改善心肌功能的擴(kuò)增的人臨床級(jí)同種異體多能成體祖細(xì)胞13_15。在動(dòng)物模型中通過(guò)直接左前降支結(jié)扎(left anterior descending ligation)誘導(dǎo)心肌梗死之后將MultiStem遞送至梗死附近位點(diǎn)致使心臟功能改善。與賦形物對(duì)照相比,這些研究中MultiStem處理的動(dòng)物顯示出左心室收縮性能改善,傷痕區(qū)域減小、血管密度增加和心肌能量特征改善14,16,17。由于MultiStem植入水平低并且MultiStem分化為心肌和內(nèi)皮細(xì)胞的程度最低,在AMI期間MultiStem的益處被認(rèn)為來(lái)自于旁分泌效應(yīng)。先前的研究已經(jīng)記錄了嚙齒動(dòng)物和人MultiStem顯示出強(qiáng)效的免疫抑制特性,并且證明了 MultiStem培養(yǎng)物在體外是非免疫原性的并且能夠抑制抗體激活的T-細(xì)胞增殖13,15o曾猜測(cè)MultiStem的免疫抑制或抗炎特性可擴(kuò)展至內(nèi)皮細(xì)胞,并且MultiStem可在AMI期間部分地通過(guò)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活化和免疫細(xì)胞粘附的免疫調(diào)節(jié)而提供益處,所述對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活化和免疫細(xì)胞粘附的免疫調(diào)節(jié)導(dǎo)致嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少。在該研究中,通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞粘附分子在細(xì)胞表面上的上調(diào)來(lái)檢測(cè)MultiStem以確定它是否能夠調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞活化。發(fā)現(xiàn)將MultiStem與主動(dòng)脈或肺部的上皮細(xì)胞共培養(yǎng)可以防止用TNF-a活化后內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞表面上E-選擇蛋白、V-CAM和I-CAM的上調(diào),其中對(duì)I-CAM上調(diào)的防止作用程度較低。E-選擇蛋白的上調(diào)看起來(lái)并不是因?yàn)閷⑵鋸募?xì)胞表面的切割增加。相反,MultiStem通過(guò)降低V-CAM、I-CAM和E-選擇蛋白的轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞表面上調(diào)。與未處理對(duì)照相比,在與MultiStem共培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)的細(xì)胞表面粘附分子表達(dá)的減少可導(dǎo)致結(jié)合至內(nèi)皮細(xì)胞的嗜中性粒細(xì)胞減少。該活性并不是所有骨髓來(lái)源的粘附干細(xì)胞所共有的,因?yàn)镸SC不能夠調(diào)節(jié)用TNF- a活化后V-CAM、E-選擇蛋白或I-CAM細(xì)胞表面上調(diào)。這些結(jié)果表明MSC和MultiStem響應(yīng)于炎性信號(hào)時(shí)具有不同的分泌譜。為了確定降低的內(nèi)皮細(xì)胞活化是否能夠減少急性心肌梗死之后的炎癥和嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),在AMI大鼠模型中檢測(cè)了 MultiStem在減少由缺血事件誘導(dǎo)的炎性應(yīng)答方面的效應(yīng)。發(fā)現(xiàn)嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)水平降低,這與以下現(xiàn)象一致與賦形物對(duì)照相比,永久性LAD結(jié)扎之后,在MultiStem處理的心臟中嗜中性粒細(xì)胞組織彈性蛋白酶水平下降。材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)
從Lonza (Walkersville, MD, http://www. lonza. com)購(gòu)買了人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC),并且根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)培養(yǎng)至第7代,使用來(lái)自Lonza的內(nèi)皮生長(zhǎng)培養(yǎng)基_2(EGM-2)。從 ScienCelKCarlsbad, CA, www. sciencellonline. com)購(gòu)買了人肺微動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HPMEC)并且根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)培養(yǎng)至第4代,使用來(lái)自ScienCell的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(ECM)。從Lonza購(gòu)買了人間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)并且根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)培養(yǎng)至第6代,使用來(lái)自Lonza的間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(MSCGM)。如參考文獻(xiàn)所述培養(yǎng)人MultiStem18。內(nèi)皮共培養(yǎng)測(cè)定
在加濕的、5%C02和37 V的環(huán)境下,將HAEC或HPMEC使用各自的培養(yǎng)基以 IXlO5 個(gè)細(xì)胞 /cm2 鋪板于 6 孔 0. 4 u m 膜 Transwell 板(Thermo FisherScientific, Waltham, MA, http://www. fishersci. com)的底部,孵育 3 天。吸去培養(yǎng)基,用PBS清洗所述細(xì)胞。每孔加入2ml的MultiStem 培養(yǎng)基,添入物包含I:i、i:4、i: 10或1:20 (HAECiMultiStem)o 將 Iml 的 MultiStem 培養(yǎng)基中的 MultiStem 置于所述孔中。向每孔加入來(lái)自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, http://www. sigmaaldrich. com)的 lOng/ml重組人腫瘤壞死因子a (rhTNFa )0還設(shè)置僅由內(nèi)皮細(xì)胞(-rhTNF a )組成的對(duì)照、由單獨(dú)的內(nèi)皮細(xì)胞+10ng/ml rhTNFa組成的對(duì)照和I: I共培養(yǎng)物(-rhTNF a )對(duì)照。對(duì)照是在3ml MultiStem培養(yǎng)基中制備的。然后在加濕的、5%C02和37°C的環(huán)境中孵育所述樣本?;蛘?,對(duì)于對(duì)照研究,可以使用MSC和MSCGM代替MultiStem和MultiStem培養(yǎng)基。還可以使用來(lái)自Sigma-Aldrich的10ng/ml的重組人白細(xì)胞介素10 (rhIL-1 ^ )代替rhTNF a來(lái)進(jìn)行所述測(cè)定。流式細(xì)胞術(shù)分析使用50/50PBS/Enzyme FreeCMillipore, Billerica, MA, http://www. millipore.com)使細(xì)胞從所述6孔板中脫附,以1600rpm短暫離心5分鐘,重懸浮于600 y I的PBS中。將每個(gè)樣本等分至3管用于流式細(xì)胞術(shù)染色。在黑暗中將所述細(xì)胞與來(lái)自BD Pharmingen(San Jose, CA, http://www. bdbiosciences. com)的 20 U I 的針對(duì) CD 106FITC 綴合的(V-CAMl)的抗體、針對(duì)⑶54PE綴合的(I-CAMl)的抗體或針對(duì)⑶62E PE綴合的(E-選擇蛋白)的抗體在4°C下孵育40分鐘。此外,使用FITC小鼠IgGlK或PE小鼠IgGlK (BDPharmingen)進(jìn)行同種型對(duì)照。將所述細(xì)胞用2ml的PBS清洗,以1600rpm短暫離心5分鐘。棄去上清液,將所述細(xì)胞重懸浮于200 ii I的PBS+1%多聚甲醒(Electron MicroscopySciences, Hatfield, PA,http: //www. electronmicroscopysciences. com)中。在裝配有 488-nm 気激光的 FACSV antage SE 流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson ImmunocytometrySystems, San Jose, California)上進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。使用585/42帶通濾波器檢測(cè)PE(FL2)熒光的發(fā)射。使用CellQuestTM軟件(Becton Dickinson)進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取和分析。免疫熒光在為進(jìn)行所述共培養(yǎng)測(cè)定對(duì)HAEC鋪板之前,將12mm的顯微鏡蓋玻片(FisherScientific)放置在6孔Transwell板的底部。在室溫下用10%驢血清(JacksonImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, http://www. jacksonimmuno. com) 封閉所述細(xì)胞I小時(shí),之后在4 °C下用小鼠抗人E-選擇蛋白的單克隆抗體(Santa CruzBiotechnology, Santa Cruz, CA, http: //www. scbt. com)的 1:50 稀釋液孵育過(guò)夜,同時(shí)緩慢攪動(dòng)。然后用PBS-T清洗所述細(xì)胞4次,每次5分鐘,之后在室溫下用驢抗小鼠AlexaFluor488 的抗體(Invitrogen, Carlsbad, CA, http://www. invitrogen. com)的 1:400 稀釋液孵育I小時(shí)。然后用PBS-T將這些細(xì)胞洗滌4次,每次5分鐘。使用Leica顯微鏡(Leica,Microsystems, Bannockburn, IL, http://www. leica-microsystems. com)、Optronics 相機(jī)和Magnafire 軟件(Optronics, Goleta, CA, http: //www. optronics. com)在 100X 放大率下獲取圖像。 ELISA在所述共培養(yǎng)試驗(yàn)后收集所述培養(yǎng)基,并將2倍稀釋的樣本根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)用在用于可溶性 E-選擇蛋白的 ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN, http: //www.rndsvstems. com)中。RT-PCR使用0. 25%胰蛋白酶-EDTA (Invitrogen)使細(xì)胞從所述6孔Transwell板脫附,離心并重懸浮于I. 8ml裂解緩沖液中。使用Absolutely RNA Miniprep試劑盒(Stratagene, La Jolla, CA, http://www. stratagene. com)根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)提取RNA。在65 ii I所提供的洗脫緩沖液中洗脫所述RNA。使用IOOpmol Random Primers(Promega, Madison, WI, http://www. promega. com)進(jìn)行 RT-PCR。在 96 孔板上檢測(cè) RT 陽(yáng)性和RT陰性以及水。嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合測(cè)定從健康志愿者的外周血中分離嗜中性粒細(xì)胞。分離之后,通過(guò)在37°C下加入LPS(0. I u g/ml) 10分鐘使嗜中性粒細(xì)胞活化10分鐘。在TNF- a存在或不存在的情況下,如上文所述將HAEC與MultiStem或MSC孵育72小時(shí)。然后除去培養(yǎng)基,清洗所述細(xì)胞,然后將內(nèi)皮細(xì)胞與活化的嗜中性粒細(xì)胞孵育I分鐘。然后將所述內(nèi)皮細(xì)胞用PBS清洗4次以除去所有未結(jié)合的嗜中性粒細(xì)胞。多次清洗之后,通過(guò)顯微鏡(20 X物鏡)檢查嗜中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合,并且拍照。對(duì)每個(gè)視野中與內(nèi)皮層結(jié)合的嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)。每種情況重復(fù)3次,每孔拍照3個(gè)視野。動(dòng)物研究細(xì)胞制備一在細(xì)胞注射的每一天,將MultiStem解凍并測(cè)試生存力。將顯示>90%生存力的細(xì)胞以5千萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/mL重懸浮于PBS中。先前的解凍實(shí)驗(yàn)表明MultiStem細(xì)胞在這些條件下保持>95%的活性最長(zhǎng)達(dá)8小時(shí)。動(dòng)物手術(shù)——本研究中描述的所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物方法都是根據(jù)Animal ResearchCommittee of the Cleveland Clinic Foundation (Cleveland, Ohio, USA)批準(zhǔn)的方案進(jìn)行的。將體重為150-175g的雄性Lewis大鼠通過(guò)腹膜內(nèi)注射氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)的混合物來(lái)麻醉,并在80次呼吸/min下用室內(nèi)空氣換氣(RSP 1002,KentScientific Corp, Torrington, CT)。在25只大鼠中通過(guò)胸骨切開(kāi)術(shù)和手術(shù)結(jié)扎左前降動(dòng)脈來(lái)誘導(dǎo)前壁心肌梗死。通過(guò)對(duì)所述縫合遠(yuǎn)端的組織的漂白來(lái)確認(rèn)LAD的結(jié)扎。LAD結(jié)扎之后,將I千萬(wàn)Lewis Rat MultiStem細(xì)胞(5千萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/ml)或單獨(dú)的PBS注射至心臟中梗死區(qū)域周圍的區(qū)域。手術(shù)后3天處死動(dòng)物。將來(lái)自10只動(dòng)物(5只為賦形物處理,5只為MultiStem處理)的心臟包埋在OCT中并且用于冷凍薄切片。隨后將切片對(duì)彈性蛋白酶染色(以確定嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù))。統(tǒng)計(jì)學(xué)
使用Student T檢驗(yàn)或ANOVA連同后續(xù)分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,當(dāng)合適時(shí)以p〈0. 05接受為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著。誤差線表示為標(biāo)準(zhǔn)差。MSMultiStem防止活化后細(xì)胞粘附分子上調(diào)當(dāng)暴露于促炎細(xì)胞因子例如TNF-a時(shí),粘附分子在內(nèi)皮細(xì)胞表面上的表達(dá)顯著增加。為了測(cè)試MultiStem是否能夠調(diào)節(jié)該應(yīng)答,在TNF-a存在或不存在的情況下,將MultiStem與人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)在transwell中共培養(yǎng)3天。之后,通過(guò)FAC分析或免疫染色測(cè)量E-選擇蛋白、V-CAM和I-CAM的細(xì)胞表面表達(dá)(圖1A)。72小時(shí)之后,與 未活化對(duì)照相比,TNF-a在MultiStem不存在的情況下誘導(dǎo)了高水平的所有3種標(biāo)記物。然而,發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在存在MultiStem的情況下,具有E-選擇蛋白(圖IB) (p=0. 0149)和V-CAM (p=0. 0037)表面表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量顯著下降(圖1B)。此外,在最高劑量的MultiStem下,I-CAM的細(xì)胞表面表達(dá)水平(p=0. 001)下降(圖1C)。MultiStem對(duì)細(xì)胞表面粘附分子上調(diào)的調(diào)節(jié)是細(xì)胞劑量依賴的,隨著MultiStem濃度的下降而降低,并且用來(lái)自其他供體的MultiStem可以重復(fù)(未顯示數(shù)據(jù))。為了檢查該效應(yīng)是否是TNF-a特異的,使用白細(xì)胞介素IP (11-1 P )重復(fù)該實(shí)驗(yàn)。與使用TNF-a的結(jié)果類似,當(dāng)用Il-IP活化時(shí),與對(duì)照相t匕,與MultiStem的共培養(yǎng)抑制了粘附分子(E-選擇蛋白、V-CAM和I-CAM)在細(xì)胞表面的上調(diào)(圖2B)。接著,測(cè)定在MultiStem存在的情況下細(xì)胞粘附分子的表面表達(dá)的下調(diào)是否是主動(dòng)脈內(nèi)皮特異的應(yīng)答,或者其他內(nèi)皮細(xì)胞系是否也以類似的方式響應(yīng)于MultiStem。測(cè)試了人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HPMEC)以確定這些細(xì)胞是否響應(yīng)于MultiStem而以類似于HAEC的方式下調(diào)TNF-a誘導(dǎo)的細(xì)胞粘附分子細(xì)胞表面表達(dá)(圖2A)。在細(xì)胞表面表達(dá)TNF_a誘導(dǎo)的E-選擇蛋白(p〈0. 0001)和V-CAM (p〈0. 0001)的HPMEC的數(shù)量在與MultiStem共培養(yǎng)之后下降。類似地,在與最高劑量MultiStem共培養(yǎng)的細(xì)胞中I-CAM細(xì)胞表面表達(dá)也顯著下降(p=0. 028)(圖2A)。因?yàn)檫@些實(shí)驗(yàn)是在transwell中進(jìn)行的,MultiStem調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞粘附標(biāo)記物活化時(shí)并不需要MultiStem和內(nèi)皮細(xì)胞之間的直接相互作用。因此,這些數(shù)據(jù)表明,從MultiStem分泌的可溶因子是以旁分泌的方式發(fā)揮作用來(lái)減少內(nèi)皮細(xì)胞表面粘附分子表達(dá)。MultiStem不增加粘附分子的脫落而是通過(guò)防lh對(duì)粘附分子RNA表汰的誘導(dǎo)來(lái)起鍾MultiStem能夠降低粘附分子(例如E-選擇蛋白)細(xì)胞表面表達(dá)的一種可能機(jī)制是增加將這些分子從細(xì)胞表面的切割。將粘附分子從細(xì)胞表面的切割是由不同的蛋白酶(包括金屬蛋白酶,例如TACE/ADAM17)介導(dǎo)的。之前的研究表明,可溶性粘附分子可能是病理性的并且可以促使嗜中性粒細(xì)胞活化19’2°。對(duì)用MultiStem進(jìn)行的處理進(jìn)行檢查以確定它是否通過(guò)增加E-選擇蛋白表面脫落而降低E-選擇蛋白表面表達(dá)。在MultiStem存在或不存在的情況下,通過(guò)ELISA測(cè)量了由內(nèi)皮細(xì)胞分泌到條件化培養(yǎng)基中的可溶性E-選擇蛋白的水平。在從MultiStem與HAEC或HPMECS的共培養(yǎng)物中收集的條件化培養(yǎng)基中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)sE-選擇蛋白濃度增加(圖3A,未顯示數(shù)據(jù))。相反地,發(fā)現(xiàn)在以最高比例與MultiStem共培養(yǎng)的TNF-a活化的HAEC (p〈0. 001)和HPMEC (p〈0. 001)的培養(yǎng)基中可溶性E-選擇蛋白下降,表明E-選擇蛋白的表面表達(dá)下降是因?yàn)楸砻姹磉_(dá)的下降連同之后的可溶性E-選擇蛋白的脫落減少(圖3A)。 因此,E-選擇蛋白的表面表達(dá)降低不是因?yàn)閷⒃摲肿訌募?xì)胞表面的切割增加,說(shuō)明內(nèi)皮細(xì)胞表面上的細(xì)胞粘附分子的減少不是因?yàn)閷?duì)這些分子的蛋白水解切割。由于當(dāng)用例如TNF-a的促炎細(xì)胞因子處理內(nèi)皮細(xì)胞時(shí),其中的細(xì)胞表面粘附分子E-選擇蛋白、V-CAM和I-CAM均被轉(zhuǎn)錄活化,因此測(cè)定了 MultiStem是否能夠在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)這些粘著分子的調(diào)節(jié)(圖3)。將內(nèi)皮細(xì)胞(HAECS)在存在或不存在TNF-a的情況下與MultiStem共培養(yǎng)72小時(shí)。隨后從所述內(nèi)皮細(xì)胞分離RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用針對(duì)E-選擇蛋白、V-CAM和I-CAM和GAPDH的引物進(jìn)行定量PCR。mRNA的表達(dá)水平均被相對(duì)于GAPDH水平標(biāo)準(zhǔn)化(圖3B)。這些結(jié)果表明E-選擇蛋白、V-CAM和I-CAM mRNA水平在MultiStem存在的情況下下降,表明MultiStem可抑制這些基因的TNF-a上調(diào)。類似的結(jié)果可見(jiàn)于當(dāng)MultiStem與肺內(nèi)皮細(xì)胞(HPMEC,未顯示數(shù)據(jù))共培養(yǎng)時(shí)。由TNF-a引起的V-CAM、I-CAM和E-選擇蛋白轉(zhuǎn)錄活化是NF- K B依賴的,表明MultiStem在一定程度上調(diào)節(jié)NF- k B信號(hào)傳遞。不同于MultiStem, MSC不顯著調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附分子表汰其他骨髓來(lái)源干細(xì)胞也已被證明通過(guò)在動(dòng)物模型中防止T細(xì)胞增殖、抑制天然殺傷細(xì)胞功能以及調(diào)節(jié)免疫疾病(例如克羅恩病和GVHD)而調(diào)節(jié)免疫功能。為了評(píng)估MultiStem對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活化的免疫調(diào)節(jié)作用是否也可由其他干細(xì)胞系產(chǎn)生,在TNF-a存在的情況下將內(nèi)皮細(xì)胞與MSC共培養(yǎng)72小時(shí),之后檢查細(xì)胞粘附分子的細(xì)胞表面表達(dá)。令人驚訝的是,與未處理對(duì)照相比,在MSC存在的情況下TNF-a誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子表面表達(dá)沒(méi)有變化,而MultiStem顯著減少粘附分子表達(dá)(圖4A-C)。使用最高劑量的MSC時(shí)觀察到了 E-選擇蛋白表面表達(dá)的微弱減少,然而,該變化顯著小于在MultiStem存在的情況下可觀察到的減少(圖4A)。因此,MSC不調(diào)節(jié)TNF-a引起的粘附分子上調(diào)。這些結(jié)果證明MultiStem具有與MSC在功能上不同的分泌譜,其表現(xiàn)在它們的生物學(xué)活性的差異上?;罨膬?nèi)皮細(xì)胞與MultiStem的共培養(yǎng)防lh嗜中件粒細(xì)胞結(jié)合已經(jīng)證明內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞表面上細(xì)胞粘附分子的上調(diào)對(duì)于例如嗜中性粒細(xì)胞的免疫細(xì)胞的滾動(dòng)和牢固粘附是至關(guān)重要的4。為了確定由MultiStem引起的對(duì)粘附分子在細(xì)胞表面的上調(diào)的調(diào)節(jié)是否足以影響嗜中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合,比較了嗜中性粒細(xì)胞對(duì)MultiStem處理的內(nèi)皮細(xì)胞和未處理內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合。將內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)至匯合單層,在MultiStem存在或不存在的情況下用TNF-a處理72小時(shí)。從至少2個(gè)不同的供體分離嗜中性粒細(xì)胞,通過(guò)加入LPS (0. Iii g/ml)活化,并且與內(nèi)皮細(xì)胞孵育I分鐘。多次清洗之后,通過(guò)顯微鏡(10X物鏡)檢查內(nèi)皮細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的結(jié)合并拍照。對(duì)每個(gè)視野中與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(圖5A)。僅低水平的活化或未活化的嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合至未活化的內(nèi)皮細(xì)胞。然而,當(dāng)用TNF-a活化后,如所預(yù)期的,可見(jiàn)到結(jié)合的嗜中性粒細(xì)胞顯著增加(圖5B)。當(dāng)將內(nèi)皮細(xì)胞與MultiStem預(yù)孵育時(shí),嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合顯著降低(p〈0. 0001)。這些結(jié)果證明內(nèi)皮細(xì)胞上粘附分子表達(dá)的變化足以改變內(nèi)皮細(xì)胞層對(duì)嗜中性粒細(xì)胞的結(jié)合特性。相反,在TNF- a活化期間,MSC與內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)不能改變嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合。此外,當(dāng)單獨(dú)的TNF-a活化的內(nèi)皮細(xì)胞或者與MSC共培養(yǎng)的TNF-a活化的內(nèi)皮細(xì)胞暴露于嗜中性粒細(xì)胞時(shí),內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)會(huì)發(fā)生顯著改變,成為更長(zhǎng)更細(xì)的細(xì)胞型,并且細(xì)胞-細(xì)胞接觸減少(圖5C)。與MultiStem共培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中,當(dāng)用TNF-a活化后,細(xì)胞形態(tài)的沒(méi)有多大變化,并且保持著細(xì)胞-細(xì)胞接觸。這些數(shù)據(jù)表明MultiStem從功能上改變了活化的內(nèi)皮細(xì)胞。因此,檢測(cè)MultiStem以確定它是否能夠在體內(nèi)影響內(nèi)皮細(xì)胞遷移。 用MultiStem講行的處理減小了 LAD-誘導(dǎo)的急件心肌棰死之后的嗜中件粒細(xì)朐浸潤(rùn)先前的動(dòng)物研究已經(jīng)證明在心肌梗死(由直接左前降支結(jié)扎誘導(dǎo))之后將MultiStem直接注射進(jìn)入梗死附近位點(diǎn)導(dǎo)致心臟功能改善14’16。該報(bào)道中的所述結(jié)果證明MultiStem能夠在TNF- a存在的情況下下調(diào)粘附分子(E-選擇蛋白、V-CAM和I-CAM)的細(xì)胞表面表達(dá)。這些分子對(duì)于嗜中性粒細(xì)胞粘附和穿過(guò)內(nèi)皮的外滲是至關(guān)重要的。由于缺血之后嗜中性粒細(xì)胞向心臟中的浸潤(rùn)可能是有害的并且可導(dǎo)致缺血損傷之后的心臟功能下降1(U1,因此猜測(cè)MultiStem處理之后的心臟功能的改善部分地是由于減少了 AMI之后的炎癥和嗜中性白粒細(xì)胞向梗死附近區(qū)域的浸潤(rùn)。為了驗(yàn)證該假設(shè),在大鼠中誘導(dǎo)心肌梗死之后檢查存在于心臟中的嗜中性粒細(xì)胞的水平。在大鼠中通過(guò)結(jié)扎左前降動(dòng)脈(LAD結(jié)扎)誘導(dǎo)前壁心肌梗死。LAD結(jié)扎之后,將I千萬(wàn)Lewis大鼠MultiStem細(xì)胞或單獨(dú)的PBS注射到心臟中梗死區(qū)域周圍的區(qū)域。手術(shù)之后3天一炎癥應(yīng)答在峰值時(shí)一處死動(dòng)物。將來(lái)自10只動(dòng)物(5只為賦形物處理,5只為MultiStem處理)的心臟切片并且對(duì)彈性蛋白酶染色以確定中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度。對(duì)于處理和未處理的動(dòng)物,在梗死周圍區(qū)域(梗死組織的0. 25-0. 5cm之內(nèi))檢查嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(圖6)。AMI和細(xì)胞處理之后3天,與賦形物處理的對(duì)照相比,MultiStem處理的動(dòng)物表現(xiàn)出顯著較少的向梗死周圍區(qū)域中的嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(每個(gè)高倍放大視野(Hpf) 12. 185個(gè)嗜中性粒細(xì)胞對(duì)35. 25個(gè)嗜中性粒細(xì)胞/Hpf,p=0. 005823)(圖6A-C)。在每個(gè)動(dòng)物的4個(gè)高倍放大視野中計(jì)數(shù)彈性蛋白酶陽(yáng)性細(xì)胞并取平均(圖6B、C)。這些結(jié)果證實(shí)了 AMI之后MultiStem對(duì)心臟有抗炎癥效應(yīng)。這些數(shù)據(jù)還表明在MultiStem存在的情況下,在培養(yǎng)物中進(jìn)行TNF-a活化時(shí)觀察到內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子上調(diào)的下降可在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為內(nèi)皮細(xì)胞屏障的功能性變化。結(jié)論在該研究中,對(duì)MultiStem進(jìn)行檢查以確定它是否能夠調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞響應(yīng)于炎性刺激的活化。MultiStem是大規(guī)模擴(kuò)增的臨床級(jí)多能祖細(xì)胞(MAPC)。所述結(jié)果證明,與未處理對(duì)照相比,當(dāng)用TNF-a或IL-IP活化并與MultiStem共培養(yǎng)時(shí),主動(dòng)脈和肺內(nèi)皮細(xì)胞都發(fā)生粘附分子E-選擇蛋白、V-CAM和I-CAM的細(xì)胞表面表達(dá)下降。此外,所述實(shí)驗(yàn)證明E-選擇蛋白表達(dá)下降不是因?yàn)樵摲肿訌募?xì)胞表面的脫落減少。相反,與僅TNF-a處理的內(nèi)皮細(xì)胞相比,V-CAM、E-選擇蛋白和I-CAM mRNA表達(dá)下降,表明MultiStem調(diào)節(jié)的是這些蛋白質(zhì)響應(yīng)于炎性信號(hào)而增加的轉(zhuǎn)錄。此外,觀察到當(dāng)在TNF-a活化期間將內(nèi)皮細(xì)胞與Mu 11 i St em孵育時(shí),嗜中性粒細(xì)胞向活化的內(nèi)皮細(xì)胞的粘附也會(huì)減少。為了研究這些變化是適于體內(nèi),檢查用MultiStem進(jìn)行的處理以確定它是否調(diào)節(jié)缺血損傷之后的炎癥。確實(shí),在大鼠中AMI之后3天,與賦形物對(duì)照相比,MultiStem處理的動(dòng)物的梗死周圍區(qū)域中嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少。在MultiStem存在的情況下活化的內(nèi)皮細(xì)胞上細(xì)胞粘附分子下調(diào)的分子機(jī)制仍不清楚。但是,由于所述共培養(yǎng)研究是在transwell中進(jìn)行的,MultiStem必定將一種或多種可溶性因子分泌進(jìn)入所述培養(yǎng)基,所述可溶性因子隨后作用于內(nèi)皮細(xì)胞以防止或下調(diào)這些整聯(lián)蛋白和選擇蛋白的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)例如TNF-a或IL-I P的細(xì)胞因子結(jié)合至它們的受體后,內(nèi)部信號(hào)傳遞的起始引起NF- K B信號(hào)傳遞依賴的轉(zhuǎn)錄。E-選擇蛋白、I-CAM和V-CAM的轉(zhuǎn)錄全部都是NF- K B依賴的,表明MultiStem可能調(diào)節(jié)NF- k B信號(hào)傳遞。盡管MSC已被證明在其他情況下具有免疫調(diào)節(jié)特性,但是當(dāng)MSC與活化的內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí),MSC并不阻止活化的內(nèi)皮細(xì)胞中的細(xì)胞粘附分子上調(diào)。當(dāng)與任意劑量的MSC共培養(yǎng)時(shí),V-CAM和I-CAM表達(dá)沒(méi)有表現(xiàn)出任何下調(diào)。在最高的MSC劑量下,與未處理對(duì)照相比,E-選擇蛋白從所述細(xì)胞表面適度減少。然而,E-選擇蛋白表面表達(dá)比內(nèi)皮細(xì)胞與MultiStem共培養(yǎng)時(shí)顯著更高。此外,當(dāng)活化的內(nèi)皮細(xì)胞與較低劑量的MSC共培養(yǎng)時(shí),沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)E-選擇蛋白的效應(yīng)。這些結(jié)果有些復(fù)雜。首先,MSC用于調(diào)節(jié)T細(xì)胞增殖的機(jī)制不同于MultiStem用于下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記物的機(jī)制,表明所述干細(xì)胞能夠通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)免疫功能。其次,這些結(jié)果表明MultiStem和MSC具有不同的分泌譜,這體現(xiàn)在這兩種細(xì)胞類型的功能性活性方面的差異。這些差異可以揭示哪種細(xì)胞類型在潛在治療多種臨床 適應(yīng)癥方面可能是最好的,每種細(xì)胞類型最適合用于不同類型的適應(yīng)癥。對(duì)這些干細(xì)胞類型和它們的作用機(jī)制之間的差異的進(jìn)一步研究將幫助澄清這些問(wèn)題。盡管已經(jīng)在AMI背景下研究了 MultiStem對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的效應(yīng),但是淋巴細(xì)胞和白細(xì)胞至內(nèi)皮細(xì)胞的粘附是炎癥過(guò)程的關(guān)鍵部分,并因此在很多疾病中是有害的,所述疾病包括其他缺血損傷,例如中風(fēng);以及免疫疾病,例如GVHD、急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)和多
發(fā)性硬化。所述結(jié)果顯示MultiStem可調(diào)節(jié)至少兩種內(nèi)皮細(xì)胞類型-用兩種不同細(xì)胞因
子TNF-a和11-10活化時(shí)的主動(dòng)脈型和肺型一中的細(xì)胞粘附分子上調(diào)。該研究說(shuō)明MultiStem的免疫調(diào)節(jié)活性可以擴(kuò)展至多種內(nèi)皮細(xì)胞類型和炎癥信號(hào)。因此,用MultiStem進(jìn)行的處理可能對(duì)其中免疫細(xì)胞穿過(guò)內(nèi)皮的浸潤(rùn)會(huì)導(dǎo)致?lián)p傷和破壞增強(qiáng)的疾病有益。參考文獻(xiàn)I. Wagner et al. The vessel wall and its interactions. Blood. Jun I 2008 ;111 (11) :5271-5281.2. Golias C,Tsoutsi E,Matziridis A,Makridis P,Batistatou A,Charalabopoulos K. Review. Leukocyte and endothelial cell adhesion molecules ininflammation focusing on inflammatory heart disease. In vivo (Athens, Greece).Sep-Oct 2007 ;21(5) :757-769.3.Bullard et al. , Infectious susceptibility and severe deficiency ofleukocyte rolling and recruitment in E—selectin and P—selectin double mutantmice.The Journal of experimental medicine. May I 1996; 183 (5) :2329-2336.4. Rao et al.,Endothelial-dependent mechanisms of leukocyte recruitmentto the vascular wall. Circulation research. Aug 3 2007 ;101 (3) :234-247.5. Frenette et al.,Susceptibility to infection and altered hematopoiesisin mice deficient in both P-and E-selectins.Cell. Feb 23 1996 ;84(4) :563-574.6. Furman et al.,Effect of elevated leukocyte count on in-hospitalmortality following acute myocardial infarction. The American journal ofcardiology. Oct 15 1996 ;78 (8) :945-948.7. Menon et al.,Leukocytosis and adverse hospital outcomes after acutemyocardial infarction. The American journal of cardiology. Aug 15 2003 ;92 (4)368-372.
8.Takahashi et al. , Relationship of admission neutrophil count tomicrovascular injury, left ventricular dilation, and long-term outcome inpatients treated with primary angioplasty for acute myocardial infarction. CircJ. Jun 2008 ;72(6) :867-872.9. Gonon et al.,Limitation of infarct size and attenuation ofmyeloperoxidase activity by an endothelin A receptor antagonist followingischaemia and reperfusion. Basic Res Cardiol. Sep 2001 ;96 (5) :454-462.10.Vasilyev et al. , Myeloperoxidase-generated oxidants modulate leftventricular remodeling but notinfarct size after myocardial infarction.Circulation. Nov I 2005 ;112(18) :2812-2820.11. Vinten-Johansen J.,Involvement of neutrophils in the pathogenesisof lethal myocardial reperfusion injury. Cardiovasc Res. Feb 15 2004 ;61 (3)481-497.12. Cheng et al.,TH1/TH2 functional imbalance after acute myocardialinfarction coronary arterial inflammation or myocardial inflammation. Journalof clinical immunology. May 2005 ;25 (3) :246-253.13. Kovacsovics-Bankowski et al.,Clinical scale expanded adultpluripotent stem cells prevent graft—versus—host disease. Cellularimmunology. 2009 ;255(1_2) :55-60.14. Van f t Hof et al.,Direct delivery of syngeneic and allogeneiclarge-scale expanded multipotentadult progenitor cells improves cardiacfunction after myocardial infarct. Cytotherapy. 2007 ;9(5) :477-487.15. Kovacsovics-Bankowski et al.,Pre-clinical safety testingsupporting clinical use of allogeneic multipotent adult progenitor cells.Cytotherapy. 2008 ;10 (7) :730-742.16.Pelacho et al. , Multipotent adult progenitor cell transplantationincreases vascularity and improves left ventricular function after myocardialinfarction. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. Jan-Feb2007 ;1(1) :51-59.17. Zeng et al. , Bioenergetic and functional consequences of bonemarrow derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts withpostinfarction LV remodeling. Circulation. 2007 ;In press.18.Perry et al. , Clinical Scale Expansion of Human Pluripotent StemCells. ASH Annual Meeting Abstracts. November 16,2005 2005 ;106 (11) :1060-.19.Vainerc et al. , Serum Concentration and Chemotactic Activityof E-selectin(CD62E) in Inflammatory Bowel Disease.Mediators ofinflammation. 1994 ;3(3) :215-218.20.Zeitler et al. , Elevated serum concentrations of soluble adhesionmolecules in coronary arterydisease and acute myocardial infarction. European journal of medicalresearch. Sep 29 1997 ;2 (9) :389-394.21.Lloyd-Jones et al. , Heart Disease and Stroke Statistics—2010Update. A Report From the American Heart Association. Circulation. Dec 17 2009.22. Aranguren et al. ,Multipotent adult progentor cells sustain functionof ischemic limbs by stimulating vessel and muscle regeneration. 2007.23. Wragg et al.,VEGFR1/CXCR4 positive progenitor cells modulate localinflammation and augment tissue perfusion by a SDFl dependent mechanism. TheJournal of clinical investigation. 2006.24. Hare et al.,A randomized, double-blind,placebo-controlled,dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stemcells (prochymal)after acute myocardial infarction. Journal of the AmericanCollege of Cardiology. Dec 8 2009 ;54(24) :2277-2286.25. Brenneman et al., Autologous bone marrow mononuclear cells enhancerecovery after acute ischemic stroke in young and middle-aged rats. J CerebBlood Flow Metab. Jan ;30 (I) :140-149.26. Halkos et al.,Intravenous infusion of mesenchymal stem cellsenhances regional perfusion and improves ventricular function in a porcinemodel of myocardial infarction. Basic Res Cardiol. Nov 2008 ;103 (6) :525-536.27. Tang et al.,Mesenchymal stem cells participate in angiogenesis andimprove heart function in rat model of myocardial ischemia with reperfusion. EurJ Cardiothorac Surg. Aug 2006 ;30 (2) :353-361.28. Ringden et al. , Mesenchymal stem cells for treatment oftherapy-resistant graft-versus-host disease. Transplantation. May 27 2006 ;81 (10) :1390-1397.29. Ringden et al.,Mesenchymal stem cells combined with cyclosporineinhibits cytotoxic T cells.Biol Blood Marrow Transplant. Jun 2006 ;12 (6)693-694.30.Highfill et al.,Multipotent adult progenitor cells (MAPC)cansuppress graft—versus—host disease via prostaglandin E2 synthesis and only iflocalized to sites of allopriming. Blood. May 20 2009.實(shí)施例2提高對(duì)下調(diào)的效能所述內(nèi)皮細(xì)胞測(cè)定已被用于鑒定MultiStem的治療方案,所述方案模擬MultiStem與活化的內(nèi)皮細(xì)胞或活化的T細(xì)胞的共培養(yǎng)。發(fā)明人之前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在所述內(nèi)皮測(cè)定中,MultiStem與活化的內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)是誘導(dǎo)MultiStem的抗炎活性(E-選擇蛋白、I-CAM和V-CAM的下調(diào))所需要的。換言之,從在MultiStem正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)MultiStem得到的條件化培養(yǎng)基不足以下調(diào)用TNF- a或cytomix活化后的內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子。然而,發(fā)明人進(jìn)行了一項(xiàng)試驗(yàn),他們?cè)谄渲杏谩癱yt0miX”(TNF-a、干擾素-Y和白細(xì)胞介素IP均10ng/ml的混合物)處理MultiStem 3天。該處理之后他們收集了 MultiStem的條件化培養(yǎng)基。然后該條件化培養(yǎng)基被用作所述內(nèi)皮細(xì)胞測(cè)定中MultiStem的替代物(它被加入用TNF- a或cytomix活化的內(nèi)皮細(xì)胞中并培養(yǎng)2或3天)。他們發(fā)現(xiàn)不同于未條件化的基礎(chǔ)培養(yǎng)基或從在正常條件下培 養(yǎng)的MultiStem收集的培養(yǎng)基,該“cytomix”處理的培養(yǎng)基足以阻止內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子上調(diào)。該培養(yǎng)基可以代替MultiStem與所述活化的內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)。隨后他們使用該培養(yǎng)基測(cè)試它是否可以在T細(xì)胞增殖測(cè)定中代替MultiStem與T細(xì)胞的共培養(yǎng),并且發(fā)現(xiàn)與從未處理的MultiStem收集的條件化培養(yǎng)基不同,該培養(yǎng)基足以阻止⑶3/⑶28誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖。因此,他們得出這樣的結(jié)論,即用cytomix處理MultiStem足以誘導(dǎo)阻止T細(xì)胞活化和內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子上調(diào)所需要的MultiStem的抗炎活性。這是通過(guò)使用內(nèi)皮細(xì)胞測(cè)定發(fā)現(xiàn)的。
權(quán)利要求
1.一種獲得具有以下一種或多種所需效能的細(xì)胞的方法(I)減少白細(xì)胞外滲,(2)減少白細(xì)胞至血管內(nèi)皮或者分離的內(nèi)皮細(xì)胞的粘附,(3)減少細(xì)胞因子介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的活化,(4)減少ー種或多種細(xì)胞粘附分子在內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá),所述方法包括評(píng)估并選擇具有上述(1)-(4)中ー種或多種所需效能的細(xì)胞,所述細(xì)胞是表達(dá)oct4、端粒酶、rex-Ι或rox-1中的一種或多種并且/或者能夠分化為內(nèi)胚層、外胚層和中胚層胚層中至少兩種的細(xì)胞類型的非胚胎、非生殖細(xì)胞。
2.一種治療受試者的炎癥的方法,所述方法包括將權(quán)利要求I中所選擇的細(xì)胞以治療有效量給予受試者,并持續(xù)足以實(shí)現(xiàn)治療效果的時(shí)間。
3.一種構(gòu)建細(xì)胞庫(kù)的方法,所述方法包括擴(kuò)增并儲(chǔ)存權(quán)利要求I中所選擇的細(xì)胞用于將來(lái)給予受試者。
4.ー種用于藥物發(fā)現(xiàn)方法,所述方法包括使權(quán)利要求I中所選擇的細(xì)胞接觸一種試劑以評(píng)估所述試劑對(duì)所述細(xì)胞影響事件(1)-(4)中任ー項(xiàng)的能力的效應(yīng)。
5.ー種包含細(xì)胞的組合物,對(duì)所述細(xì)胞就實(shí)現(xiàn)以下ー種或多種事件的所需效能進(jìn)行了評(píng)估和選擇(1)減少白細(xì)胞外滲,⑵減少白細(xì)胞至血管內(nèi)皮或者分離的內(nèi)皮細(xì)胞的粘附,(3)減少細(xì)胞因子介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的活化,(4)減少ー種或多種細(xì)胞粘附分子在內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá),并且 所述細(xì)胞是表達(dá)oct4、端粒酶、rex-Ι或;rox_l中的一種或多種并且/或者能夠分化為內(nèi)胚層、外胚層和中胚層胚層中至少兩種的細(xì)胞類型的非胚胎、非生殖細(xì)胞。
6.權(quán)利要求1-5中任ー項(xiàng)的方法,其中所述細(xì)胞因子選自TNF-α和IL-I。
7.權(quán)利要求1-5中任ー項(xiàng)的方法,其中細(xì)胞因子介導(dǎo)的活化使得內(nèi)皮細(xì)胞中E-選擇蛋白、P-選擇蛋白、VCAM-I、ICAM和VCAM-2中ー種或多種的表達(dá)增加。
8.權(quán)利要求1-5中任ー項(xiàng)的方法,其中所述細(xì)胞粘附分子——其表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞中被減少——是E-選擇蛋白、P-選擇蛋白、VCAM-I、ICAM和VCAM-2中的ー種或多種。
9.ー種增加細(xì)胞影響以下ー種或多種事件的效能的方法(I)減少白細(xì)胞外滲,(2)減少白細(xì)胞至血管內(nèi)皮或者分離的內(nèi)皮細(xì)胞的粘附,(3)減少細(xì)胞因子介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的活化,(4)減少ー種或多種細(xì)胞粘附分子在內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá);所述方法包括使細(xì)胞與IFN-Y、IL-I β和TNF-α接觸,以產(chǎn)生實(shí)現(xiàn)(1)-(4)中一種或多種效應(yīng)的細(xì)胞; 所述細(xì)胞是表達(dá)oct4、端粒酶、rex-Ι或;rox_l中的一種或多種并且/或者能夠分化為內(nèi)胚層、外胚層和中胚層胚層中至少兩種的細(xì)胞類型的非胚胎、非生殖細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明總體上涉及借助分泌可減少白細(xì)胞外滲的因子的細(xì)胞來(lái)減少炎癥。具體地,本發(fā)明涉及使用分泌因子的細(xì)胞的方法,所述因子可下調(diào)在血管內(nèi)皮細(xì)胞中細(xì)胞粘附分子的表達(dá)。下調(diào)細(xì)胞粘附分子的表達(dá)可減少白細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的粘附從而減少外滲。結(jié)果是減少了炎癥。所述細(xì)胞是具有多能特性的非胚胎、非生殖細(xì)胞。這些可包括多能標(biāo)記物的表達(dá)和廣泛的分化潛能。
文檔編號(hào)C12N3/00GK102625829SQ201080041878
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2010年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月21日
發(fā)明者J·M·沃達(dá), W·范特霍夫 申請(qǐng)人:Abt控股公司
網(wǎng)友詢問(wèn)留言 已有0條留言
  • 還沒(méi)有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
1
新宁县| 抚松县| 湖南省| 玉门市| 荣昌县| 布拖县| 论坛| 利川市| 松阳县| 龙胜| 剑河县| 威海市| 麦盖提县| 佛坪县| 丰原市| 景洪市| 枝江市| 南川市| 塘沽区| 城固县| 湖北省| 蒲城县| 福鼎市| 乌什县| 奉新县| 江山市| 南郑县| 桂平市| 文昌市| 蓬莱市| 湛江市| 伊宁县| 威远县| 杂多县| 万宁市| 金沙县| 邹城市| 济源市| 山丹县| 黑龙江省| 恩施市|