專利名稱：水凝膠成圖與細(xì)胞培養(yǎng)制品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使水凝膠，特別是聚糖基水凝膠成圖的方法，還涉及含有圖案化水凝膠的制品，如細(xì)胞培養(yǎng)制品。
背景技術(shù)：
圖案化水凝膠已用于許多應(yīng)用，包括傳感器、細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程。由于水凝膠具有溶脹特性，所述溶脹特性能響應(yīng)諸如溫度、pH、鹽度和葡萄糖濃度這樣的刺激，發(fā)生可逆 變化，所以水凝膠可用作傳感器或傳感器部件。水凝膠在細(xì)胞培養(yǎng)和分析以及組織工程中受到關(guān)注，因為它們的模量和親水性比塑料更接近于組織。生產(chǎn)圖案化水凝膠的方法有很多。這些方法中，多數(shù)包括利用引發(fā)劑并借助光掩模使單體發(fā)生光固化，然后洗去未反應(yīng)的單體和引發(fā)劑，以及制備水凝膠聚合物時可能用到的聚合抑制劑或者其它組分或試劑。

發(fā)明內(nèi)容
本文描述了由可交聯(lián)聚合物形成的圖案化水凝膠及其它內(nèi)容。在多個實施方式中，在不使用光引發(fā)劑、可固化單體以及有害或有毒的溶劑或材料的情況下使聚合物如聚糖基聚合物發(fā)生光交聯(lián)。因此，可減少或者完全省去用來清除這種組分或試劑的洗滌步驟。在多個實施方式中，本發(fā)明提供了形成涂有圖案的基板的方法。所述方法包括將包含聚糖基聚合物的組合物置于基板上，形成涂覆基板。聚糖基聚合物組合物基本上不含交聯(lián)單體。所述方法還包括使涂覆基板的一部分受第一劑量的UV輻射作用，促使聚糖基聚合物發(fā)生交聯(lián)，其中基板的一部分受到屏蔽，不遭受電離輻射?？蓪κ躑V作用的涂覆基板進(jìn)行洗滌或水合，除去未交聯(lián)的聚糖基聚合物。所述方法還可包括使交聯(lián)的聚糖基聚合物的至少一部分和起初受到屏蔽的涂覆基板的至少一部分受到第二劑量的UV輻射作用，形成具有交聯(lián)密度較高的區(qū)域和交聯(lián)密度較低的區(qū)域的涂覆基板。作為替代或除此之外，所述方法還可包括使后面受到第一劑量的電離輻射作用的至少一部分涂覆基板和后面因屏蔽而不受第一劑量的電離輻射作用的至少一部分涂覆基板預(yù)先受到UV輻射作用，形成具有交聯(lián)密度較高的區(qū)域和交聯(lián)密度較低的區(qū)域的涂覆基板。所述方法可用于制備各種具有圖案化水凝膠層的制品。在一些實施方式中，所述方法用于制備具有圖案化水凝膠層的細(xì)胞培養(yǎng)制品。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在結(jié)合附圖閱讀以下詳述的基礎(chǔ)上，很容易看出本文所述各種實施方式中的一種或多種實施方式相比于使水凝膠成圖的現(xiàn)有方法的優(yōu)點。


圖1-3是制備圖案化水凝膠層的方法的示意圖。圖4是一種細(xì)胞培養(yǎng)制品的截面示意圖，該制品的孔具有涂覆了圖案化水凝膠層的表面。在圖4A中，孔未經(jīng)涂覆，而在圖4B-C中，孔或其一部分經(jīng)過涂覆。圖5A-C是根據(jù)本文所述的方法制備的圖案化水凝膠表面的例子的光學(xué)顯微圖。在圖5A和5C中，用結(jié)晶紫染色法顯示交聯(lián)區(qū)。圖是用來形成圖5C所不圖案化表面的光掩模的光學(xué)顯微圖。圖6A-B提供了根據(jù)本文所述的方法制備的圖案化水凝膠表面的例子的原子力顯 微圖像。圖7A是根據(jù)本文所述的方法制備的圖案化表面的光學(xué)顯微圖，用結(jié)晶紫染色法顯示交聯(lián)區(qū)。圖7B是用來形成圖7A所示的圖案化表面的圖案化網(wǎng)印設(shè)備的示意性繪圖，并展示了圖案是如何形成的。圖8A是包含圖7A所示圖案的所有高度的橫斷面的光學(xué)顯微圖。圖8B是利用原子力顯微鏡得到的包含圖7A所示圖案的所有高度的橫斷面的圖像。圖9是根據(jù)本文所述的方法制備的圖案化表面的光學(xué)顯微圖，用結(jié)晶紫染色法顯示交聯(lián)區(qū)。圖10提供了根據(jù)本文所述的方法制備的圖案化表面的原子力顯微圖像。上面兩幅圖像顯示了用UV處理3分鐘的羥乙基纖維素(HEC)層的水合圖像(A)和干態(tài)圖像⑶，顯示出10倍的高度差(溶脹時7. 3 ii m，干燥時700nm)。下面3幅圖顯示了 HEC樣品經(jīng)UV處理10分鐘(C)、5分鐘(D)和3分鐘(E)之后的高度分布。圖11是通過乳酸脫氫酶(LDH)分析法測定的附著24小時的相對細(xì)胞數(shù)的柱狀圖。附圖不一定是按比例繪制的。圖中所用的相同的附圖標(biāo)記表示相同的部分、步驟等。但應(yīng)理解，在特定的附圖中使用附圖標(biāo)記表示一個部分并不會是用來對另一附圖中用相同附圖標(biāo)記標(biāo)出的部分構(gòu)成限制。此外，用不同的附圖標(biāo)記表示各部分并不表明附圖標(biāo)記不同的部分不能相同或相似。
具體實施例方式在以下詳述中，參照構(gòu)成說明書的一部分的附圖，以示意性方式描述本發(fā)明的裝置、系統(tǒng)和方法的幾種具體實施方式
。應(yīng)理解，可以在不偏離本發(fā)明的范圍或精神的范圍內(nèi)預(yù)想和實現(xiàn)其它的實施方式。因此，以下發(fā)明詳述不應(yīng)理解為限制性的。除非另外說明，本文使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語的含義是本領(lǐng)域通用的含義。本文提供的定義是用來幫助理解本文常用的某些術(shù)語，不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制。在本說明書和權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式“一個”、“一種”和“該”包括具有多個所指對象的實施方式，除非文中有明顯的相反表示。
如本說明書和所附權(quán)利要求書所用，“或”字通常在其包括“和/或”的含義上使用，除非文中有明顯的相反表示。在本文中，“具有”、“含有”、“包括”、“包含”、“含”、“擁有”等在其開放含義上使用，
通常表示“包括但不限干”。應(yīng)當(dāng)理解，“主要由……組成”、“由……組成”等涵蓋在術(shù)語“包括”等的范圍之內(nèi)。因此，包含聚糖基聚合物的組合物可以是由聚糖基聚合物組成或者主要由聚糖基聚合物組成的組合物。本文所用的“水凝膠”是指吸水量可大于或等于其干重30%的聚合物。在許多實施方式中，水凝膠的吸水量可大于或等于其干重的100%。應(yīng)當(dāng)理解，水凝膠聚合物的吸水量可隨該聚合物的交聯(lián)度變化，交聯(lián)度越大往往導(dǎo)致吸水量或溶脹程度越小。 本文所用的“圖案化水凝膠”是指表面上具有目標(biāo)形貌特征的水凝膠層。本文所用的“聚糖基聚合物”是指具有相連單糖単元主鏈的聚合物。例如，聚葡 萄糖基聚合物是具有相連葡萄糖単元主鏈的聚合物。再舉一例，纖維素基聚合物是具有β (I — 4)相連葡萄糖単元主鏈的聚合物。應(yīng)當(dāng)理解，聚糖基聚合物的側(cè)基部分可根據(jù)需要相對于天然單糖發(fā)生取代。例如，羥こ基纖維素(HEC)、羥丙基纖維素(HPC)、甲基纖維素(MC)和羥丙基甲基纖維素(HPMC)均視為纖維素基聚合物。本文描述了由可交聯(lián)聚合物形成的圖案化水凝膠及其它內(nèi)容。圖案化水凝膠ー般這樣形成利用引發(fā)劑并借助光掩模使單體發(fā)生光固化，然后洗去未反應(yīng)的單體和引發(fā)劑以及制備水凝膠聚合物時可能用到的聚合抑制劑或者其它的組分或試劑。但如本文所述，研究發(fā)現(xiàn)聚合物如水溶性聚糖基聚合物可發(fā)生光交聯(lián)，形成圖案化水凝膠表面。水溶性聚糖基聚合物受到UV輻射作用時可發(fā)生交聯(lián)，而不需要使用光引發(fā)劑，也不用加入交聯(lián)單體。因此，在一些實施方式中，可減少或完全省去用來清除諸如未固化単體和引發(fā)劑這樣的組分或試劑的洗滌步驟。任何合適的水溶性可交聯(lián)聚糖基聚合物均可用來按照本文所述制備圖案化水凝膠。在多個實施方式中，聚糖基聚合物是聚葡萄糖基聚合物如纖維素基聚合物、右旋糖酐基聚合物、直鏈淀粉基聚合物或淀粉基聚合物如羥こ基淀粉。在一些實施方式中，聚糖基聚合物是聚木糖基聚合物，如木聚糖基聚合物。在多個實施方式中，聚葡萄糖基聚合物具有化學(xué)式I所示的結(jié)構(gòu)
々為
9其中R各自獨立地為⑴0Χ，其中X是H、C1-C3直鏈或支化烷基、C1-C5直鏈或支化烷氧基；或者(ii) Υ0Χ，其中X如上所述，Y是C1-C3烷基。例如，R可以是 OH、OCH3、CH2OCH2CH2OH, OCH2CH2OH, CH2OCH(CH3) OCH2CH(CH3) OH 、OCH2CH (CH3) OH 、CH2OCH3 或 CH2OCH2CH (CH3) OH。
在多個實施方式中，上述聚葡萄糖基聚合物可經(jīng)過疏水改性，其中Cltl或更大的烷基如C16或C18烷基通過醚連接基在一個或多個可用的羥基處上發(fā)生取代。應(yīng)當(dāng)理解，其它的聚糖基聚合物可發(fā)生類似的取代。例如，聚木糖基單體可由下面的化學(xué)式II所示的木糖單元形成，其中不是聚合物主鏈一部分的R各自獨立地如上文就化學(xué)式I所示的聚葡萄糖基聚合物所述。
OOR
I I
RO八
ROJJ聚糖基聚合物可按照本領(lǐng)域熟知的方法合成，或者可從合適的銷售商如西格瑪-阿爾德里奇公司(Sigma-Aldrich)、陶氏公司(Dow)或亞跨龍公司(Aqualon)購得。在多個實施方式中，聚糖基聚合物是中性聚合物。據(jù)信，帶電荷的聚糖的水溶性太強，即使交聯(lián)后也難以形成合適的水凝膠；也就是說，為除去未交聯(lián)的聚合物而進(jìn)行的洗滌或水合也會除去帶電荷的交聯(lián)聚合物。 可以理解，交聯(lián)密度受所用聚合物的分子量影響。例如，據(jù)信分子量更高的聚合物可比分子量更低的聚合物得到更高的交聯(lián)密度。在一些實施方式中，聚糖基聚合物是選自下組的纖維素基聚合物羥乙基纖維素(HEC)、羥丙基纖維素(HPC)、甲基纖維素(MC)和羥丙基甲基纖維素(HPMC)或它們的疏水改性衍生物。目前，包括西格瑪-阿爾德里奇公司、陶氏公司和亞跨龍公司在內(nèi)的銷售商供應(yīng)各種纖維素聚合物。以ffiC為例，(i)西格瑪-阿爾德里奇公司供應(yīng)平均分子量約為90kDa、250kDa、720kDa或1300kDa的HEC ;(ii)陶氏公司供應(yīng)I %布魯克菲爾德黏度(Brookfield Viscosity)約為 1100-6000 厘泊的各種 HEC 產(chǎn)品，并供應(yīng) HMHEC，一種在 HEC主鏈上具有疏水性側(cè)基的疏水改性ffiC(CELLOSIZE HMHEC 500);以及(iii)亞跨龍公司以商品名Natrosol 250供應(yīng)HEC和以商品名PolySurf 67供應(yīng)具有十六烷基側(cè)基的HMHEC?，F(xiàn)在參考圖1-3，它們以示意圖的形式呈現(xiàn)了形成圖案化水凝膠的各種方法。如圖I和2所示，用水溶性聚糖基聚合物20涂覆基板10的至少一部分表面(步驟A)。然后，在聚糖基聚合物層20上設(shè)置圖案化UV屏蔽層30，該屏蔽層具有允許UV光透過的區(qū)域33和阻擋UV光通過的區(qū)域35，使所得組件受UV輻射作用(步驟B)。聚糖基聚合物層20位于圖案化屏蔽層允許UV光透過的區(qū)域33下面的部分受到UV輻射作用，而聚糖基聚合物層20位于圖案化屏蔽層阻擋UV光的區(qū)域35下面的部分受到屏蔽，不受UV輻射作用。層20受到UV輻射作用的那些部分發(fā)生交聯(lián)，而受到屏蔽的部分不發(fā)生UV引發(fā)的交聯(lián)。除去圖案化屏蔽層30(步驟C)，此時圖I和圖2所示的示意性方法有差異。在圖I所示的方法中，除去圖案化屏蔽層30(步驟C)，對所得的具有交聯(lián)區(qū)和非交聯(lián)區(qū)的聚糖基聚合物層20’進(jìn)行水合或洗滌，以除去未交聯(lián)的聚合物，留下具有圖案化特征25的圖案化交聯(lián)聚合物(步驟D)。在圖2所示的方法中，除去圖案化屏蔽層30(步驟C)，然后所得的整個聚糖基聚合物層進(jìn)一步受到UV輻射作用(步驟E)。所得的聚合物層20”具有交聯(lián)量較高的區(qū)域(有屏蔽層時和除去屏蔽層后均受到輻射作用的那些區(qū)域)和交聯(lián)量較低的區(qū)域(僅在除去屏蔽層后受到輻射作用的那些區(qū)域)。水合之后(步驟D)，交聯(lián)密度較高的區(qū)域22的溶脹程度不及交聯(lián)密度較低的那些區(qū)域24，得到圖案化層?？梢岳斫?，圖2所示的方法可按不同順序進(jìn)行。例如，先讓整個聚糖基聚合物層受UV光的作用，然后在該層上設(shè)置圖案化屏蔽層?？梢岳斫?，除使整個層受UV光作用外，或者代替使整個層受UV光作用，可以使用不止ー個屏蔽層，其中屏蔽層具有交疊區(qū)，使得通過UV透射可以得到差別化交聯(lián)密度?，F(xiàn)在參考圖3，該圖呈現(xiàn)了采用包含聚糖基聚合物的兩個層的方法的總體過程。在圖示實施方式中，使設(shè)置在基板10上的聚糖基聚合物水凝膠層20受UV輻射作用，圖案化UV屏蔽層的非UV透射部分35屏蔽層20的一部分，使其不受UV輻射。在受過UV輻射的第ー層20’上設(shè)置第二個聚糖基聚合物水凝膠層40，使第二層40受UV輻射作用，圖案化UV屏蔽層的非UV透射部分35屏蔽層40的一部分，使其不受UV輻射(步驟A)。第二層40可與第一層20具有相同的組成或不同的組成。水合或洗滌(步驟B)之后，所得的具有一定形貌的表面可包含第一層受到輻射作用(其中第二層受到屏蔽，不受UV作用)的區(qū)域28、基板10受到輻射作用(其中第一層和第二層受到屏蔽，不受UV作用)的區(qū)域18和第二層受到輻射作用(其中第二層受到UV作用)的區(qū)域45。第一水凝膠層可具有交聯(lián)密度較高的區(qū)域28和較低的區(qū)域27，具體取決于該區(qū)域是被屏蔽還是受到第一劑量的UV輻射的作用。因此，所得表面水合時可具有各種高度和受過輻射的材料。可以理解，通過采用更多的聚糖基聚合物層，通過使ー個或多個層接觸圖案不同的屏蔽層因而受到不同量的UV輻射，等等，可以得到各種其它的表面形貌和特性。此外，層的組成、層的厚度、層或其一部分接受的UV光的量，會影響表面形貌或性質(zhì)。聚糖基聚合物層可通過任何合適的方式置于基板表面上或者聚糖基聚合物底層上。例如，可以干粉形式將聚糖基聚合物置于基板上，可以溶液、凝膠或懸浮液的形式將聚糖基聚合物傾倒或流延到基板上，等等。由于形成水凝膠的聚糖基聚合物易溶于水，可用水作溶劑形成置于基板表面上的溶液、凝膠或懸浮液。當(dāng)然，也可采用其它溶剤。聚糖基聚合物組合物可以任何合適的濃度懸浮或溶解在溶劑中。較佳的是，所述組合物均勻涂覆或覆蓋基板或底層或其所需部分?？梢岳斫?，可改變濃度和聚糖基聚合物層的厚度，使所得圖案化水凝膠層獲得所需的性質(zhì)。在多個實施方式中，聚糖基聚合物以O(shè). 005重量％ -20重量％的濃度懸浮或溶解在溶劑中。例如，聚糖基聚合物的濃度可以是
O.01重量％ -10重量％，0. I重量％ -I重量％，0. I重量％ -O. 5重量％，約O. 2重量％，等等。
聚糖基聚合物組合物基本上不含交聯(lián)單體。例如，含有約少于I重量％、少于O. 5重量％、少于O. I重量％、少于O. 05重量％或少于O. 01重量％的交聯(lián)單體的聚糖基聚合物組合物可視為基本上不含交聯(lián)單體。類似地，聚糖基聚合物組合物可基本上不含光引發(fā)劑。在多個實施方式中，在UV處理之前將溶液、懸浮液或凝膠蒸發(fā)至干。在一些實施方式中，干燥溶液、懸浮液、凝膠等，使其包含少于5重量％、少于2重量％或少于I重量％的水?？衫眉訜峄蛘婵蛰o助蒸發(fā)。例如，可將涂覆基板置于約40-70°C之間或者約60°C的溫度下?？衫帽人讚]發(fā)的溶劑加速蒸發(fā)過程。 可利用任何合適的圖案化UV網(wǎng)(screen)將聚糖基聚合物層的ー些部分置于UV輻射之下。圖案化UV網(wǎng)可以是具有孔或透明度的光掩?；蚱渌煌该靼?，使UV光可以按限定的圖案透過。例如，光掩?？捎娩撔纬桑瑤в心芡高^UV的開口或圖案化空隙；或者可用石英形成，帶有不能透過UV的Ni或Fe圖案?？墒箞D案化UV網(wǎng)直接接觸可交聯(lián)的聚糖層，或者緊鄰該層。一般地，UV網(wǎng)越靠近可交聯(lián)的聚糖基聚合物，所得圖案的分辨率越好。不管有否放置圖案化UV網(wǎng)，可交聯(lián)的聚糖基聚合物層可受任何合適量的UV光的作用?？筛淖僓V光的強度或者受UV作用的時間，以獲得所需的交聯(lián)量。在許多實施方式中，可交聯(lián)的聚糖基聚合物層受到約50-300mJ/cm2的UV輻射的作用，時間約為1_20分鐘?？山宦?lián)的聚糖基聚合物層可設(shè)置在任何合適的基板上?？梢岳斫?，基板可根據(jù)涂覆有圖案化水凝膠的裝置的最終用途變化。合適的基板的例子包括陶瓷基板、玻璃基板、塑料或其它聚合物基板、或者它們的組合。在一些實施方式中，基板是玻璃材料，如鈉鈣玻璃、 派萊克斯(pyrex)玻璃、維克(vycor)玻璃、石英玻璃；娃。在一些實施方式中，基板是塑料或聚合物，包括樹枝狀聚合物，如聚氯乙烯、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲酯、乙酸乙烯酯-馬來酸酐共聚物、聚(二甲基硅氧烷)單甲基丙烯酸酯、環(huán)烯烴聚合物、碳氟聚合物、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯亞胺；共聚物如乙酸乙烯酯-馬來酸酐共聚物、苯乙烯-馬來酸酐共聚物、乙烯-丙烯酸共聚物或者它們的衍生物等。可對基板進(jìn)行處理或涂覆，以提高基板表面與涂覆的聚糖基聚合物層之間的相互作用，或者賦予表面所需的特性。例如，可通過電離、加熱、光化學(xué)活化、氧化酸、燒結(jié)、物理氣相沉積、化學(xué)氣相沉積以及用強有機溶劑蝕刻來活化基板表面。在一些實施方式中，對基板表面進(jìn)行等離子體或電暈處理。任何采用圖案化水凝膠的制品(即設(shè)備或裝置)均可按照本文所作的介紹進(jìn)行涂覆。在多個實施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)制品包含本文所述的圖案化聚糖基水凝膠層?？墒┘訄D案化水凝膠層的細(xì)胞培養(yǎng)制品的例子包括單孔板和多孔板，如6孔板、12孔板、96孔板、384孔板和1536孔板,罐子,陪替氏培養(yǎng)皿,燒瓶,多層燒瓶,燒杯,板,滾瓶,載玻片(如分室和多室培養(yǎng)載玻片)，試管，蓋玻片，袋子，膜，空心纖維，珠粒和微載體，杯子，轉(zhuǎn)瓶，灌流室，生物反應(yīng)器，CellSTACK ，以及發(fā)酵器。在多個實施方式中，施加圖案化水凝膠層的細(xì)胞培養(yǎng)制品表面是孔內(nèi)的表面。帶孔的細(xì)胞培養(yǎng)制品的例子包括板、燒瓶、燒杯、瓶子、袋子、腔室、發(fā)酵器等?，F(xiàn)在參考圖4，用基板或基底材料10形成的細(xì)胞培養(yǎng)制品100可包含一個或多個孔50。孔50包含側(cè)壁18和表面15。參考圖4B-C，可將圖案化水凝膠涂層20置于表面15或側(cè)壁18或其一部分上。具有上述圖案化水凝膠層的細(xì)胞培養(yǎng)制品可用細(xì)胞接種。細(xì)胞可以是任何類型的細(xì)胞。例如，細(xì)胞可以是結(jié)締組織細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、骨骼肌或平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腸細(xì)胞、腎細(xì)胞或者來自其它器官的細(xì)胞，干細(xì)胞、胰島細(xì)胞、血管細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、癌細(xì)胞、原代細(xì)胞、細(xì)胞系等。所述細(xì)胞可以是哺乳動物細(xì)胞，優(yōu)選是人細(xì)胞，但還可以是非哺乳動物細(xì)胞，例如細(xì)菌、酵母菌或者植物的細(xì)胞。水凝膠圖案化表面特別適合培養(yǎng)黏附細(xì)胞。一方面(I)，提供了一種形成涂有圖案的基板的方法，所述方法包括將包含聚糖基聚合物的組合物置于基板上，形成涂覆基板，其中所述組合物基本上不含交聯(lián)單體；使涂覆基板的一部分受第一劑量的紫外輻射作用，引發(fā)聚糖基聚合物交聯(lián)，其中一部分基板受到屏蔽，不受電離輻射。一方面(2)，提供了第I方面所述的方法，它還包括洗滌涂覆基板，以除去未交聯(lián)的聚糖基聚合物。一方面(3)，提供了第I或2方面所述的方法，它還包括使交聯(lián)的聚糖基聚合物的至少一部分和起初受屏蔽的涂覆基板的至少一部分受第二劑量的紫外輻射作用，形成具有交聯(lián)密度較高的區(qū)域和交聯(lián)密度較低的區(qū)域的涂覆基板。ー個方面(4)，提供了第1-3方面中任一方面所述的方法，它還包括使后面受第一劑量的紫外輻射作用的涂覆基板的至少一部分和后面因屏蔽而不受第一劑量的紫外輻射作用的涂覆基板的至少一部分預(yù)先受電離輻射作用，形成具有交聯(lián)密度較高的區(qū)域和交聯(lián)密度較低的區(qū)域的涂覆基板。一方面(5)，提供了第1-4方面中任一方面所述的方法，其中所述聚糖基聚合物是聚葡萄糖基聚合物或聚木糖基聚合物。一方面(6)，提供了第1-5方面中任一方面所述的方法，其中所述聚葡萄糖基聚合物選自纖維素基聚合物、右旋糖酐基聚合物或直鏈淀粉基聚合物。一方面(7)，提供了第1-6方面中任一方面所述的方法，其中所述聚糖基聚合物選自下組羥丙基纖維素、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥こ基纖維素、直鏈淀粉、右旋糖酐和木聚糖，或者它們的疏水改性衍生物。一方面(8)，提供了第1-7方面中任一方面所述的方法，其中用細(xì)胞培養(yǎng)制品提供所述基板。另ー方面(9)，提供了一種對細(xì)胞培養(yǎng)制品表面涂覆圖案的方法，所述方法包括將包含聚糖基聚合物的組合物置于制品表面上，形成涂覆表面，其中所述組合物基本上不 含交聯(lián)單體；使涂覆表面的一部分受紫外輻射作用，引發(fā)聚糖基聚合物交聯(lián)，其中一部分基板受到屏蔽，不受電離輻射。一方面(10)，提供了第9方面所述的方法，它還包括洗滌涂覆基板，以除去未交聯(lián)的聚糖基聚合物。一方面(11)，提供了第9或10方面所述的方法，它還包括使交聯(lián)的聚糖基聚合物的至少一部分和起初受屏蔽的涂覆基板的至少一部分受第二劑量的紫外輻射作用，形成具有交聯(lián)密度較高的區(qū)域和交聯(lián)密度較低的區(qū)域的涂覆基板。ー個方面(12)，提供了第9-11方面中任一方面所述的方法，它還包括使后面受第一劑量的紫外輻射作用的涂覆基板的至少一部分和后面因屏蔽而不受第一劑量的紫外輻射作用的涂覆基板的至少一部分預(yù)先受電離輻射作用，形成具有交聯(lián)密度較高的區(qū)域和交聯(lián)密度較低的區(qū)域的涂覆基板。一方面(13)，提供了第9-12方面中任一方面所述的方法，其中所述聚糖基聚合物是聚葡萄糖基聚合物或聚木糖基聚合物。一方面(14)，提供了第9-13方面中任一方面所述的方法，其中所述聚葡萄糖基聚合物選自纖維素基聚合物、右旋糖酐基聚合物或直鏈淀粉基聚合物。一方面(15)，提供了第9-14方面中任一方面所述的方法，其中所述聚糖基聚合物選自下組羥丙基纖維素、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥こ基纖維素、直鏈淀粉、右旋糖酐和木聚糖，或者它們的疏水改性衍生物。另ー方面(16)，提供了通過第9-15方面中任一方面所述的方法制備的細(xì)胞培養(yǎng)制品。另ー方面(17)，提供了一種細(xì)胞培養(yǎng)制品，所述細(xì)胞培養(yǎng)制品包含用于培養(yǎng)細(xì)胞的圖案化表面，所述表面用主要由交聯(lián)的聚糖基聚合物組成的涂層形成，其中所述涂層不含交聯(lián)單體。一方面(18)，提供了第17方面所述的制品，其中所述聚糖基聚合物是聚葡萄糖基聚合物或聚木糖基聚合物。一方面(19)，提供了第17或18方面所述的制品，其中所述聚葡萄糖基聚合物選自纖維素基聚合物、右旋糖酐基聚合物或直鏈淀粉基聚合物。一方面，提供了第17-19方面中任一方面所述的制品，其中所述聚糖基聚合物選自下組羥丙基纖維素、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥こ基纖維素、直鏈淀粉、右旋糖酐和木聚糖，或者它們的疏水改性衍生物。
下面給出了非限制性實施例，這些實施例描述了用來制備圖案化水凝膠表面的代表性方法和通過所述方法制備的制品的多個實施方式。實施例實施例I :基板上的水凝膠將PolySurf67(亞跨龍公司)[一種具有十六烷基取代基的疏水改性羥乙基纖維素(HMHEC)]或另一種水溶性可交聯(lián)聚合物[羥乙基纖維素(HEC)、右旋糖酐、木聚糖或2-羥乙基纖維素]在水中的溶液(0. 2重量％，l-2mL)流延到6孔聚苯乙烯板上。根據(jù)亞跨龍公司的產(chǎn)品手冊[Polymers for Hair and Skin Care-Aqueous system solutions for
cosmetic and personal care products (頭發(fā)和皮膚護(hù)理用聚合物-用于化妝品和個人
護(hù)理產(chǎn)品的水系溶液)，250-50F, 2008年2月修訂版]，HMHEC通過兩步反應(yīng)制得，第一步是 堿-纖維素與環(huán)氧乙烷的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)，生成HEC，第二步是十六烷基取代反應(yīng)，提供疏水性端基。PolySurf67具有8000-14000的布魯克菲爾德黏度(I %溶液，厘泊)和550000的平均分子量。將PolySurf67或其它水溶性可交聯(lián)聚合物的溶液蒸發(fā)至干(60°C )，在環(huán)境條件下，在距涂層約I. 5英寸的地方用UV臭氧燈(185/254nm)進(jìn)行UV處理，處理時間為10分鐘。去掉光掩模[PPM光掩模公司(PPM Photomask Inc.)，加拿大魁北克省蒙特利爾市費舍爾大街 4950 號，郵編 H4T 1J6 (4950Fisher Street, Montreal, QC. , Canada H4T 1J6)]后，可以看到薄膜經(jīng)UV輻射之后沒有明顯變化。所述特征僅在加水后或者在使薄膜接觸高濕區(qū)域的情況下才出現(xiàn)。當(dāng)加水時，交聯(lián)區(qū)溶脹，未交聯(lián)的部分溶解掉。升高溫度(40-60°C)可促進(jìn)溶解過程。在水存在下，在60°C時僅有交聯(lián)的水凝膠保留在表面上。在另一個例子中，邊攪拌邊將ImL TMOS加入IOOmL 0. 5% HEC溶液(2-羥乙基纖維素，西格瑪-阿爾德里奇公司，MW= 250kDa)。這個例子記作2X TM0S/HEC。不過，可在ffiC溶液中加入任何合適量的TM0S。例如，若需要，可以很容易地制備0. 05x TM0S-4x TMOSHEC溶液。將2X TM0S/HEC溶液涂覆在干燥的HEC層頂部，受UV光作用10分鐘。光源距離所述6孔板底面約4英寸。可使HEC受UV光作用不同時間，以便在它上面獲得各種圖案。在UV處理過程中，用圖案化掩模阻擋UV光通過，以提供各種圖案。在圖5A和5B所示的圖像中，采用具有圓形開口的光掩模，受UV輻射作用的HEC顯示出交聯(lián)狀態(tài)，這在圖IA中通過結(jié)晶紫染色得到證實。如圖5B中沒有用結(jié)晶紫染色的圖像所示，交聯(lián)區(qū)具有形貌高度，這從陰影可以看出。圖5C和中的圖像是有結(jié)晶紫的圖案化涂覆凝膠(5C)和用來形成所示圖案的光掩模(5D)的圖像。圖5C所示結(jié)果再次證實，聚糖基聚合物受UV輻射作用時能夠發(fā)生交聯(lián)。用其它的水溶性可交聯(lián)聚合物也觀察到類似的結(jié)果，這些聚合物包括羥乙基纖維素(HEC)、右旋糖酐、木糖醇和2-羥乙基纖維素(未呈現(xiàn)相關(guān)信息)?？梢杂^察到，基于多個因素，包括流延膜的質(zhì)量、薄膜與掩模之間的距離以及防止散射的好壞，可得到的橫向特征尺寸受到限制。例如，用線寬為20 的UV掩模得到約50iim的特征(從結(jié)晶紫染色可以看出)。發(fā)明人相信，如果在流延前過濾聚合物溶液，以清除會散射光的任何灰塵或微粒，則可以改善分辨率。此外，薄膜因存在微粒而變得不平坦，這也會增大掩模與薄膜之間的間隙，導(dǎo)致不能完全阻擋UV光，特別是在邊界處，從而降低所得圖案的分辨率。用準(zhǔn)直儀也有可能改善圖案的分辨率。得到圖5A-D所示圖像的實驗是在沒有用準(zhǔn)直儀的情況下進(jìn)行的。為了更容易用光學(xué)顯微鏡觀察，可用結(jié)晶紫對UV交聯(lián)區(qū)進(jìn)行染色(圖5)，或者若特征尺寸太小，可用原子力顯微鏡觀察形貌(圖6)。圖6A-B所示的圖像呈現(xiàn)了用原子力顯微鏡(AFM)拍攝圖像的圖案化水凝膠表面的例子，它們表明，通過對水凝膠聚合物進(jìn)行UV輻射可獲得小特征尺寸。圖6A-B所示的特征尺寸在約50-75 μ m的范圍內(nèi)。實施例2 :水凝膠的形貌實施例I所述的流延膜在光掩模(用PPM光掩模得到的圖案化石英)存在下用UV處理。然后除去光掩模，對所述薄膜進(jìn)行另ー劑量的UV輻射(再輻射1-4分鐘)。對于實施例I中的HEC薄膜，水合后出現(xiàn)特征，其中交聯(lián)程度更大的區(qū)域(除去掩模前后均受UV作用的那些區(qū)域)以凹陷形式出現(xiàn)，因為它們的溶脹程度不及交聯(lián)程度更低的區(qū)域(僅在除去掩模后受UV輻射的那些區(qū)域)。人們可以認(rèn)識到，不同區(qū)域的相對高度可通過改變涂覆材料的量或者UV作用時間來進(jìn)行平衡(參見例如下面實施例4)。 實施例3:多層結(jié)構(gòu)也可以利用實施例I或?qū)嵤├?所述的程序形成多層或多功能結(jié)構(gòu)。例如，可流延第一聚合物薄膜，然后用UV和光掩模處理。但是，可在第一層頂部流延第二層聚合物，而不是對薄膜進(jìn)行洗滌或水合。第二層可用另ー個光掩模處理，在除去掩模、水合和洗滌之后，表面可包括1)第一層和第二層均未受到UV作用時的裸基板；2)第二層受到UV處理時的第二聚合物層(雖然根據(jù)第一層是否受到UV處理可能有高度差)；以及3)在第一聚合物受到UV處理但第二層因未受到UV處理而被洗掉的區(qū)域中，受到輻射作用的第一聚合物層。圖7呈現(xiàn)了按照這種方法制備的圖案化水凝膠的例子。在此情況中，用蓋玻片作為掩模，將其置于HEC聚合物薄膜頂部。蓋玻片放置在(12:00 = 0° )0°、120°和240°的角度，薄膜用UV處理(180mJ/cm2，距網(wǎng)I. 5英寸，10分鐘)。第二 HEC層沉積在第一層頂部，蓋玻片與第一組交錯，置于30°、180°、300°的角度上。對基板進(jìn)行相應(yīng)的UV處理(180mJ/cm2，距網(wǎng)I. 5英寸，10分鐘)，通過浸沒在2_5mL水中進(jìn)行水合，用結(jié)晶紫染色。然后干燥樣品，使其達(dá)到干燥狀態(tài)(甩去過量的水，然后將樣品置于60-70°C的烘箱中，直至干燥)，用Bioscope II原子力顯微鏡[維易科公司(Veeco)]測量形貌。由于涂層因干燥而發(fā)生的收縮不是100%可逆的，它不會變回完全光滑的薄膜，所以AFM分析是可能的。圖7A呈現(xiàn)了所得的AFM圖像。圖7B呈現(xiàn)了幾幅示意圖，說明對底層、頂層和整個涂層進(jìn)行UV輻射成圖的情形；其中UV BL是指底層經(jīng)過UV處理的部分，UV TL是指頂層經(jīng)過UV處理的部分，UV BL/TL是指頂層和底層均受到UV輻射的部分，OUV是指頂層和底層受到屏蔽，不受UV輻射的區(qū)域。通過采用兩個涂層，觀察到具有四種不同高度的區(qū)域(見圖8)。如圖8所示，通過研究4部分邊界的高度差，可以對這幾部分的相對干燥高度差進(jìn)行成像和測量(圖8)。圖8A是包含圖7A和7B所示圖案的所有高度的橫斷面的光學(xué)顯微圖。圖SB是同一區(qū)域的AFM圖像。由于結(jié)晶紫對受UV作用程度更高的區(qū)域的吸收更多，所以光學(xué)圖可以指示4個區(qū)域的相對高度。這通過AFM圖像中的高度差得到證實(在邊界標(biāo)記為Λ)。所測的高度差為藍(lán)色，而黑色的Λ值(105nm)是計算的，因為該邊界的分辨率小于其它邊界。人們可以認(rèn)識到，第一層和第二層采用的聚合物可以相同或不同。例如，ー層用HEC,另一層用疏水改性HEC，可以實現(xiàn)疏水性的差異。如圖9所示，此技術(shù)可用于更小的特征尺寸。為制備圖9中的光學(xué)顯微圖所示的兩層圖案，采用的光掩模具有由直線和沿直線按規(guī)則間隔出現(xiàn)的圓圈組成的圖案。將第一HEC水凝膠層涂覆在聚苯乙烯基板上，在設(shè)置光掩模的情況下使之受UV光的作用(180mJ/cm2，距光源I. 5英寸，10分鐘)。然后在第一層上涂覆第二 HEC水凝膠層，按照與第一排布方向大致正交的方向放置光掩模，如上所述，在存在光掩模的情況下使第二層受UV光的作用。得到圖9所示的層。如圖所示，可得到小至20i!m的特征尺寸。當(dāng)然，利用本文所作的介紹，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該容易得到更小的特征尺寸。實施例4 UV處理時間和薄膜厚度通過改變聚合物在基板上的沉積量(改變流延溶液的濃度)以及改變UV作用時間，可以改變薄膜厚度。例如，使材料量相同的樣品(0. 2重量％，lmL， 9. 5cm2)受到2、 3、5和10分鐘的UV處理，然后用原子力顯微鏡測量水合高度(圖10)。測量受到3分鐘處理的樣品的干燥和水合高度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水凝膠水合后溶脹至其高度的10倍(從700nm到7. 3 y m)。我們發(fā)現(xiàn)，受10分鐘和5分鐘處理的樣品在溶脹性質(zhì)上幾乎相同( 3. 5 y m)。受2分鐘處理的樣品的高度超出儀器的可測范圍，其高度> 11 U m。在圖10中，上面兩幅圖像顯示了用UV處理3分鐘的羥乙基纖維素(HEC)層的水合圖像(A)和干態(tài)圖像(B)，顯示出10倍的高度差(溶脹時7. 3 ii m，干燥時700nm)。下面3幅圖顯示了 HEC樣品經(jīng)UV處理10分鐘(C)、5分鐘⑶和3分鐘(E)之后的高度分布。實施例5 :細(xì)胞培養(yǎng)和分析簡而言之，在補充了 10%胎牛血清[英杰公司(Invitrogen), #16000-077]和1%青霉素-鏈霉素(英杰公司，#15140-155)的伊格爾MEM培養(yǎng)基(Eagle，sMinimum Essential Medium) (ATCC 公司，#30-2003)中培養(yǎng) H印G2/C3A 細(xì)胞(ATCC 公司，#CRL-10741)。在37°C、5% CO2和95%相對濕度的條件下孵化細(xì)胞。在96孔微板中，將細(xì)胞接種在改性纖維素涂層上(n = 3)，在每孔的100 u L培養(yǎng)基中接種5000個細(xì)胞。每天更換培養(yǎng)基。進(jìn)行乳酸脫氫酶(LDH)分析[普洛麥格公司(Promega)CytoTox 96 非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒#G1780]，以評定細(xì)胞附著情況。按照制造商的說明溶解細(xì)胞，測量LDH釋放量，在理論上，所述LDH釋放量與存在的細(xì)胞數(shù)成正比。結(jié)果示于圖11。實施例6 :為促進(jìn)細(xì)胞附著而進(jìn)行圖案化我們還證明，圖案化可用來提高細(xì)胞的黏附性。在血清存在下，利用膠原I和Matrigel膠作對照，將H印G2/C3A細(xì)胞接種在HEC/TM0S涂層(加入四甲基原硅酸酯幫助細(xì)胞附著)上。24小時后，用LDH(乳酸脫氫酶)分析法測量相對細(xì)胞數(shù)(圖11)。圖11中的Y軸表示490nm處的平均光密度。在X軸上，I表示膠原_1涂覆表面，2表示Matrigel膠涂覆表面，3表示未圖案化的HEC/TM0S表面，4-6表示圖案化HEC/TM0S表面，其中4、5和6各自形成獨特的圖案。圖11呈現(xiàn)了細(xì)胞附著到圖案化表面(4-6)上的情況，所述圖案處于亞微米范圍。通過圖案化表面(4-6)實現(xiàn)的細(xì)胞附著與Matrigel 膠上顯示的細(xì)胞附著相當(dāng)。但是，未圖案化(經(jīng)UV處理)的基板僅保留1/3的細(xì)胞。雖然本實施例中采用HEC/TMOS涂層，但根據(jù)本文所述的發(fā)現(xiàn)可以預(yù)期，HEC/TE0S涂層也能取得同樣的效果。因此，上面公開了水凝膠成圖的實施方式。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解，本文所述的設(shè)置、組合物、試劑盒和方法可以采用除上述公開之外的其它實施方式實施。本文所述的實施方式是出于說明的目的，而不 構(gòu)成限制。
權(quán)利要求
1.一種形成涂有圖案的基板的方法，所述方法包括 將包含聚糖基聚合物的組合物置于基板上，形成涂覆基板，其中所述組合物基本上不含交聯(lián)單體； 使一部分涂覆基板受第一劑量的UV輻射作用，引發(fā)聚糖基聚合物交聯(lián)，其中一部分基板受到屏蔽，不受電離輻射。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，所述方法還包括洗滌涂覆基板，以除去未交聯(lián)的聚糖基聚合物。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，所述方法還包括使交聯(lián)的聚糖基聚合物的至少一部分和起初受到屏蔽的涂覆基板的至少一部分受到第二劑量的紫外輻射作用，形成具有交聯(lián)密度較高的區(qū)域和交聯(lián)密度較低的區(qū)域的涂覆基板。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，所述方法還包括使后面受到第一劑量的紫外輻射作用的至少一部分涂覆基板和后面因屏蔽而不受第一劑量的紫外輻射作用的至少一部分涂覆基板預(yù)先受到電離輻射作用，形成具有交聯(lián)密度較高的區(qū)域和交聯(lián)密度較低的區(qū)域的涂覆基板。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述聚糖基聚合物是聚葡萄糖基聚合物或聚木糖基聚合物。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述聚葡萄糖基聚合物選自纖維素基聚合物、右旋糖酐基聚合物或直鏈淀粉基聚合物。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述聚糖基聚合物選自下組羥丙基纖維素、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、直鏈淀粉、右旋糖酐、木聚糖或者它們的疏水改性衍生物。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，用細(xì)胞培養(yǎng)制品提供所述基板。
9.一種對細(xì)胞培養(yǎng)制品表面涂覆圖案的方法，所述方法包括 將包含聚糖基聚合物的組合物置于所述制品的表面上，形成涂覆表面，其中所述組合物基本上不含交聯(lián)單體； 使一部分涂覆表面受紫外輻射作用，引發(fā)聚糖基聚合物交聯(lián)，其中一部分基板受到屏蔽，不受電離輻射。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，所述方法還包括洗滌涂覆基板，以除去未交聯(lián)的聚糖基聚合物。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，所述方法還包括使交聯(lián)的聚糖基聚合物的至少一部分和起初受到屏蔽的涂覆基板的至少一部分受到第二劑量的紫外輻射作用，形成具有交聯(lián)密度較高的區(qū)域和交聯(lián)密度較低的區(qū)域的涂覆基板。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，所述方法還包括使后面受到第一劑量的紫外輻射作用的至少一部分涂覆基板和后面因屏蔽而不受第一劑量的紫外輻射作用的至少一部分涂覆基板預(yù)先受到電離輻射作用，形成具有交聯(lián)密度較高的區(qū)域和交聯(lián)密度較低的區(qū)域的涂覆基板。
13.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述聚糖基聚合物是聚葡萄糖基聚合物或聚木糖基聚合物。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述聚葡萄糖基聚合物選自纖維素基聚合物、右旋糖酐基聚合物或直鏈淀粉基聚合物。
15.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述聚糖基聚合物選自下組羥丙基纖維素、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、直鏈淀粉、右旋糖酐、木聚糖或者它們的疏水改性衍生物。
16.一種通過權(quán)利要求9所述的方法制備的細(xì)胞培養(yǎng)制品。
17.—種細(xì)胞培養(yǎng)制品，它包含 用于培養(yǎng)細(xì)胞的圖案化表面，所述表面用主要由交聯(lián)的聚糖基聚合物組成的涂層形成，其中所述涂層不含交聯(lián)單體。
18.如權(quán)利要求17所述的制品，其特征在于，所述聚糖基聚合物是聚葡萄糖基聚合物或聚木糖基聚合物。
19.如權(quán)利要求18所述的制品，其特征在于，所述聚葡萄糖基聚合物選自纖維素基聚合物、右旋糖酐基聚合物或直鏈淀粉基聚合物。
20.如權(quán)利要求17所述的制品，其特征在于，所述聚糖基聚合物選自下組羥丙基纖維素、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、直鏈淀粉、右旋糖酐、木聚糖或者它們的疏水改性衍生物。
全文摘要
一種形成涂有圖案的基板的方法，所述方法包括將包含聚糖基聚合物的組合物置于基板上，形成涂覆基板。所述聚糖基聚合物組合物基本上不含交聯(lián)單體。所述方法還包括使一部分涂覆基板受第一劑量的UV輻射作用，引發(fā)聚糖基聚合物交聯(lián)，其中一部分基板受到屏蔽，不受電離輻射?？蓪κ躑V作用的涂覆基板進(jìn)行洗滌或水合，除去未交聯(lián)的聚糖基聚合物。
文檔編號C12M1/00GK102713755SQ201080044134
公開日2012年10月3日 申請日期2010年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月26日
發(fā)明者M·L·索倫森, R·R·小漢考克, R·揚森通, T·N·赫希, T·常 申請人:康寧股份有限公司