專利名稱：用于急性腎損傷的診斷和/或預后的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般意義上屬于生物醫(yī)學領(lǐng)域，且尤其涉及用于急性腎損傷 (dano renal aguda)的診斷和/或預后的方法。
背景技術(shù)：
在腎移植中，急性腎小管壞死(necrosis tubular aguda，TNA)是移植后移植物功能延遲的主要原因。此外，TNA導致急性排斥反應發(fā)病率的升高、慢性排斥反應的發(fā)生以及移植物存活的降低(Parmu et al.，2008)。近年來對器官需求的增加使得需要使用來自亞最佳供體(包括心搏停止的供體和老年的供體)的器官，這使得發(fā)生移植后TNA的百分率、移植物的發(fā)病率及其功能恢復的延遲顯著升高。這推高了腎移植對于公共衛(wèi)生的總經(jīng)濟成本。注意到國家移植中心(National Transplant Organization, ΝΤΟ)最近的統(tǒng)計數(shù)字表明，在西班牙每年實現(xiàn)約2，200例腎移植，而超過4，000位患者仍然在等候者名單中 (Dominguez-Gil y Pascual. 2008)。另一方面，TNA (包括源自缺血的TNA)是急性腎功能衰竭(Fracaso Renal Agudo, FRA)最常見的形態(tài)表現(xiàn)形式(Kellum et al.，2008)。因為約50%的高死亡率，F(xiàn)RA代表了發(fā)達國家中腎疾病中最嚴重問題之一。全部FRA事件的約 30%發(fā)生在因多器官功能衰竭而進入I⑶的患者中。在后一種情況下，死亡率升高至80% (Chertow et al.，2005)。FRA的發(fā)生還是心臟介入之后最常見的并發(fā)癥，其中在西班牙每年進行的約30，000例心臟介入，而其中超過是在我們醫(yī)院進行的。幾乎全部手術(shù)過的患者均發(fā)生一定程度的FRA(Yates and StafforcHchmit，2006)。手術(shù)后FRA的嚴重程度取決于患者的長期進展，在心臟手術(shù)后需要透析的那些情況中，導致接近60%的死亡率 (Takar et al. ,2005 ；Candela-Toha et al. ,2008) 腎移植和心臟手術(shù)是人 TNA 的兩種 “準”實驗研究的情況，因為已知缺血刺激的時刻和持續(xù)時間，并且還可對它們進行監(jiān)測。近幾十年來，且迄今為止，所有發(fā)病率-死亡率的這些統(tǒng)計數(shù)據(jù)沒有顯著改變，在所有這些情況中不存在用于預防和/或降低TNA的有效治療。這很大程度上歸因于缺乏比使用至今的血清肌酸酐和尿素的測定更準確的腎損傷標志物。這些經(jīng)典的標志物不直接反映細胞損傷或在腎組織(小管或內(nèi)皮)的隔室中產(chǎn)生的細胞損傷；它們僅是損傷所引起的腎功能改變的指示參數(shù)(Vaidya et al.，2008)。事實上，這樣可能無法鑒定出具有亞臨床腎損傷的患者，因為尚未產(chǎn)生血清中肌酸酐和尿素水平的顯著改變。因此，最近幾年，正在進行很多試圖鑒定和確證新的FRA標志物(例如，NGAL、IL18、KIM、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C(ciStatina C)、VEGF或CXCL10)的研究，所述標志物在沒有顯著附加病理狀況的嬰兒人群中(而非在成年人群中)似乎是良好標志物(Vaidya et al.，2008)。腎缺血、血容量減少和毒性物質(zhì)是最常見的發(fā)生TNA的原因。血流減少和因此所造成的組織缺氧導致在近端小管上皮水平上的損傷，引起腎小球濾液的迅速減少，改變血管通透性，并且激起放大組織損傷的炎癥反應(Thurman et al.，2007)。缺血損傷的程度和范圍取決于缺血的嚴重程度和持續(xù)時間。在亞致死的缺血中，可見到近端上皮細胞脫離至小管腔，其中很多細胞是有活力的。在長時間的缺血中，持續(xù)的組織缺氧和炎癥反應等增加上皮和血管的損失，伴有腎皮質(zhì)-髓質(zhì)區(qū)中細胞的死亡。另一方面，缺血之后，血管腔隙也被損傷。事實上，內(nèi)皮損傷顯著地促進并維持急性腎損傷。缺血期間，小管周流量(flujo peritubular)的早期改變和早期再灌注與內(nèi)皮的形態(tài)和功能的喪失相關(guān)，導致屏障功能的喪失、炎癥和促凝血劑活性。中長期，已將有利于慢性腎損傷之進展的微血管密度之喪失描述為初始缺血的直接結(jié)果(Basile 2007)。為了解決TNA，啟動促進組織修復的機制從未損傷的上皮小管細胞啟動細胞分裂和分化。近年來，很多研究已證明，不僅表皮的去分化并增殖的本身未損傷的細胞，而且腎多能細胞以及甚至腎外的多能細胞(例如，來自骨髓的多能細胞)可貢獻于修復缺血后的小管損傷(Lin 2008)。然而，干細胞對修復缺血損傷的貢獻是受到質(zhì)疑的，盡管公認其對未損傷的近端小管細胞和實質(zhì)(padnquima)的再血管化有根本性貢獻。在后一過程中，已提出缺血之后動員的內(nèi)皮親本也可參與(Becherucci et al. ，2009)。 miRNA是大小(22 25個核苷酸)很小的、內(nèi)源性編碼的RNA，能夠在誘導的沉默復合物(RISK)內(nèi)通過與其靶mRNA全部或部分互補來識別信使RNA，并因此負性調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(Chang and Mendel 1，2007)。在人中已經(jīng)克隆了超過700種，并且生物信息學的預測表明它們總共可控制總蛋白質(zhì)中超過30%的表達(Filipowicz et al.，2008)。 多數(shù)是通過RNA Pol II從單個基因轉(zhuǎn)錄的，或者它們中的多個來自同時轉(zhuǎn)錄的多順反子 (policistr0nico)。他們作為較長的pre-miR而產(chǎn)生，在細胞核中被核酸酶III (Drosha)加工，通過核輸出蛋白(Exportina) -5依賴性的機制和Ran-GTP依賴性的機制進入細胞質(zhì)，并且它們在那里被另一種核酸酶III (Dicer)最終加工成為其成熟的形式(Rana 2007)。其功能在廣泛多樣的過程(包括胚胎發(fā)育、對于應激的應答或者生理過程的嚴格調(diào)節(jié)以及因此在生物中維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài))中是至關(guān)重要的。需要強調(diào)的是miRNA的表達譜是細胞類型特異性的并且可根據(jù)刺激而改變，因此，同一 miRNA的具體細胞環(huán)境將決定其在具體細胞類型中的功能(Bartel2009)。出于這個原因，已從導致了病理狀況(例如，癌癥(Bartels and jTsongalisJOOg)、自身免疫(Sonkoly and Pivarcsi 2008)、糖尿病(Zhou et al. ,2008) 或血管病理狀況⑴rbich et al.，2008))之發(fā)生的多種機制中指出了某些miRNA的失調(diào)， 并且將它們作為很多所述病理狀況之進展的精確生物標志物。最近已證明，miRNA還是任何類型的刺激(包括缺乏營養(yǎng)或缺氧)之前迅速和準確的細胞應答中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物(Ivan et al.，2008)。另一方面，已證明這些miRNA可與mRNA —起以微顆粒(血小板的微泡；腫瘤細胞中的外來體(exosoma)；中性粒細胞的核外粒體(ectosoma))的形式被細胞分泌或交換(Valadi et al.，2007)。因此，可在體液(例如，血液、尿或胸膜液)中檢測它們。事實上，據(jù)估計健康個體的外周血液可含有濃度在5 50mg/ml之間的微顆粒，在患有多種病理狀況之患者的情況中，所述濃度可升高(Hunter et al.，2008)。這可允許使用通過最小侵襲性的方法(抽血和收集尿)所獲得的樣品對這些病理狀況的進展進行非常可靠的監(jiān)測 (Gilad 2008)。在尿中，所檢測的miRNA(其中包括miR-127)顯示出了很高的穩(wěn)定性，即便是在高度侵蝕性的條件下也是這樣(Melkonyan et al.，2008)。鑒于miRNA的失調(diào)可導致多種病理狀況，它們開始被認為是治療作用的新靶點。事實上，已開發(fā)了用于調(diào)節(jié)其表達的工具pre-mir用于其過表達，而antagomir(anti-mir)用于其抑制，在多種體外和體內(nèi)實驗模型中具有非常有希望的結(jié)果(Krutzfeld et al.，2006 ；Care et al.，2007 ；Van Rooij et al.，2008)，盡管仍需確定其在人中作為治療策略的有效性。
對于miRNA在對缺血的應答中的作用，已測定了其在大鼠局灶性腦缺血中的表達，建立了 miR-145的表達與腦損傷之間的關(guān)聯(lián)(Dharap et al.，2009)。在人的心臟缺血中，miR-100和miR-133似乎參與心臟損傷的機制(Sucharov C，et al. ,2008) 在亦為人的肝缺血中，miR-223已被確立為損傷的中介物(Yu et al.，2008)。相反，miR_U6和 miR-210已被描述為對多種刺激(包括缺氧)作出響應的血管發(fā)生、新血管形成和組織修復的關(guān)鍵發(fā)起物(Suarez and Sessa,2009 ；Fasanaro et al. , 2008 ；van Solingen et al.， 2008)。到目前為止，文獻中尚未描述過腎的I/R中被調(diào)節(jié)的miRNA，但是當然已經(jīng)開始推測其作為腎病理狀況(包括與血壓調(diào)節(jié)紊亂相關(guān)的那些病理狀況)的生物標志物的潛力 (Liang M et al.，2009)。在另一種情況下，已經(jīng)鑒定出一些與腎移植中的免疫排斥反應相關(guān)的 miRNA (Sui et al. ,2008) 所有上文所述內(nèi)容均證明需要鑒定和確證新的腎損傷之發(fā)展的生物標志物，其更準確并且指示何種組織隔室以及以何種程度損傷和/或恢復，其檢測更加迅速、簡便并且不需要對患者進行活組織檢查。

發(fā)明內(nèi)容
因此，在第一方面中，本發(fā)明提供用于急性腎損傷的診斷和/或預后的方法，其包括分析患者的樣品以測定選自miR-127、miR-126、miR-210和miR-101的至少一種微 RNA(micro-RNA)的表達水平，并且將所述表達水平與對照值比較，其中所述水平的改變指示腎損傷。在本發(fā)明的一個更具體的方面中，要分析的患者樣品是血液。在本發(fā)明的另一個具體方面中，所述樣品是血清。在本發(fā)明的另一個方面中，所述樣品是尿。在一個更具體的方面中，通過測定miR-127的表達水平單獨或與選自miR-126、 miR-210和miR-101的至少一種微RNA聯(lián)合來進行急性腎損傷的診斷和/或預后。在一個更具體的方面中，血清miR-127表達水平相對于對照值的降低指示急性腎損傷。 在一個更具體的方面中，尿miR-127的表達水平相對于對照值的升高指示急性腎損傷。在一個更具體的方面中，通過測定miR-126的表達水平單獨或與選自miR-127、 miR-210和miR-101的至少一種微RNA之聯(lián)合來進行急性腎損傷的診斷和/或預后。在一個更具體的方面中，血清miR-126的表達水平相對于對照值的降低指示急性腎損傷。在一個更具體的方面中，通過測定miR-210的表達水平單獨或與選自miR-127、 miR-126和miR-101的至少一種微RNA聯(lián)合來進行急性腎損傷的診斷和/或預后。在一個更具體的方面中，血清miR-210的表達水平相對于對照值的升高指示急性腎損傷。在一個更具體的方面中，尿miR-210表達水平相對于對照值的降低指示急性腎損傷。在一個更具體的方面中，通過測定miR-101的表達水平單獨或與選自miR-127、 miR-126和miR-210的至少一種微RNA聯(lián)合來進行急性腎損傷的診斷和/或預后。
在一個更具體的方面中，血清miR-101的表達水平相對于對照值的升高指示急性腎損傷。在本發(fā)明中，急性腎損傷是指具有缺血病因的原發(fā)或繼發(fā)(例如，毒性物質(zhì)或通過造影(radiocontraste)所引起的腎損傷的情況)的腎損傷，，并且在任何情況下，不包括慢性腎損傷。在本發(fā)明的一個更具體的方面中，通過PCR測定微RNA的表達。在一個更具體的方面中，通過定量PCR測定微RNA的表達。在一個更具體的方面中，通過多重PCR測定微RNA 的表達。在本發(fā)明的另一個更具體的方面中，通過總RNA微陣列測定微RNA的表達。在第二個方面中，本發(fā)明涉及用于急性腎損傷的診斷和/或預后的試劑盒，其包含實施本發(fā)明的方法所需的探針和引物。在本發(fā)明的一個更具體的方面中，所述試劑盒包含用于測定選自miR-127、 miR-126、miR-210和miR-101的至少一種微RNA之表達水平所需的探針和引物。在本發(fā)明的另一個更具體的方面中，所述試劑盒包含RNA微陣列。


圖 1 顯示遭受缺氧/再充氧方案(protocol。de Hipoxia/Reoxigenaci0n)的HK-2 人近端小管細胞中miR-U6的表達。NX:在氧可獲得性(含氧量正常，21%)和營養(yǎng)物可獲得性(含有10% FBS的完全培養(yǎng)基)的正常條件下的細胞CC 遭受營養(yǎng)物限制的對照細胞 (其處于無營養(yǎng)物的培養(yǎng)基中)。Hyp 在他期間遭受營養(yǎng)物和氧限制的細胞(1%氧的無營養(yǎng)物的培養(yǎng)基)；R-3、R-6、R-24h :6h的缺氧之后的細胞再次處于正常的氧和營養(yǎng)物可獲得性的條件下。圖2顯示經(jīng)歷了缺氧/再充氧方案的HK-2人近端小管細胞中miR-210的表達。 NX 在氧可獲得性(含氧量正常，21% )和營養(yǎng)物可獲得性(含有10% FBS的完全培養(yǎng)基) 的正常條件下的細胞CC 經(jīng)歷了營養(yǎng)物限制的對照細胞(其處于無營養(yǎng)物的培養(yǎng)基中)。 Hyp 經(jīng)歷了營養(yǎng)物和氧限制的細胞(1%氧的無營養(yǎng)物的培養(yǎng)基)；R-3、R-6、R-24h 再次處于正常的氧和營養(yǎng)物可獲得性的條件下的細胞。圖3顯示經(jīng)歷了缺氧/再充氧方案的HK-2人近端小管細胞中miR-101的表達。 NX 在氧可獲得性(含氧量正常，21% )和營養(yǎng)物可獲得性(含有10% FBS的完全培養(yǎng)基) 的正常條件下的細胞CC 經(jīng)歷了營養(yǎng)物限制的對照細胞(其處于無營養(yǎng)物的培養(yǎng)基中)。 Hyp 經(jīng)歷了營養(yǎng)物和氧限制的細胞(1%氧的無營養(yǎng)物的培養(yǎng)基)；R-3、R-6、R-Mh 再次處于正常的氧和營養(yǎng)物可獲得性的條件下的細胞。圖4顯示經(jīng)歷了缺氧/再充氧方案的HK-2人近端小管細胞中miR-127的表達。 NX 在氧可獲得性(含氧量正常，21% )和營養(yǎng)物可獲得性(含有10% FBS的完全培養(yǎng)基) 的正常條件下的細胞CC 經(jīng)歷了營養(yǎng)物限制的對照細胞(其處于無營養(yǎng)物的培養(yǎng)基中)。 Hyp 經(jīng)歷了營養(yǎng)物和氧限制的細胞(1%氧的無營養(yǎng)物的培養(yǎng)基)；R-3、R-6、R-24h 再次處于正常的氧和營養(yǎng)物可獲得性的條件下的細胞。圖5顯示經(jīng)歷了缺氧/再充氧方案的NRK-52E大鼠近端小管細胞中miR-101的表達。NX:在氧可獲得性(含氧量正常，21%)和營養(yǎng)物可獲得性(含有10% FBS的完全培養(yǎng)基)的正常條件下的細胞CC:經(jīng)歷了營養(yǎng)物限制的對照細胞(其處于無營養(yǎng)物的培養(yǎng)基中)。Hyp 經(jīng)歷了營養(yǎng)物和氧限制的細胞(1%氧的無營養(yǎng)物的培養(yǎng)基)；R-15min、R-30min、 R-lh, R-3h, R-6h, R-24h :再次處于正常的氧和營養(yǎng)物可獲得性的條件下的細胞。圖6顯示經(jīng)歷了缺氧/再充氧方案的NRK-52E大鼠近端小管細胞中miR-127的表達。NX:在氧可獲得性(含氧量正常，21%)和營養(yǎng)物可獲得性(含有10% FBS的完全培養(yǎng)基)的正常條件下的細胞CC:經(jīng)歷了營養(yǎng)物限制的對照細胞(其處于無營養(yǎng)物的培養(yǎng)基中)。Hyp 經(jīng)歷了營養(yǎng)物和氧限制的細胞(1%氧的無營養(yǎng)物的培養(yǎng)基)；R-15min、R-30min、 R-lh, R-3h, R-6h, R-24h :再次處于正常的氧和營養(yǎng)物可獲得性的條件下的細胞。圖7顯示經(jīng)歷了缺氧/再充氧方案的HMEC人內(nèi)皮細胞中miR-101的表達。NX 在氧可獲得性(含氧量正常，21%)和營養(yǎng)物可獲得性(含有10% FBS的完全培養(yǎng)基)的正常條件下的細胞CC 經(jīng)歷了營養(yǎng)物限制的對照細胞(其處于無營養(yǎng)物的培養(yǎng)基中)。Hyp 經(jīng)歷了營養(yǎng)物和氧限制的細胞(1%氧的無營養(yǎng)物的培養(yǎng)基)；R-15min、R-30min、R-lh、R-;3h、 R-Mh 再次處于正常的氧和營養(yǎng)物可獲得性的條件下的細胞。圖8顯示經(jīng)歷了缺氧/再充氧方案的HMEC人內(nèi)皮細胞中miR-127的表達。NX 在氧可獲得性(含氧量正常，21%)和營養(yǎng)物可獲得性(含有10% FBS的完全培養(yǎng)基)的正常條件下的細胞CC 經(jīng)歷了營養(yǎng)物限制的對照細胞(其處于無營養(yǎng)物的培養(yǎng)基中)。Hyp 經(jīng)歷了營養(yǎng)物和氧限制的細胞(1%氧的無營養(yǎng)物的培養(yǎng)基)；R-15min、R-30min、R-lh、R-;3h、 R-Mh 再次處于正常的氧和營養(yǎng)物可獲得性的條件下的細胞。圖9顯示經(jīng)歷了缺氧/再充氧方案的HMEC人內(nèi)皮細胞中miR-210的表達。NX 在氧可獲得性(含氧量正常，21%)和營養(yǎng)物可獲得性(含有10% FBS的完全培養(yǎng)基)的正常條件下的細胞CC 經(jīng)歷了營養(yǎng)物限制的對照細胞(其處于無營養(yǎng)物的培養(yǎng)基中)。Hyp 經(jīng)歷了營養(yǎng)物和氧限制的細胞(1%氧的無營養(yǎng)物的培養(yǎng)基)；R-15min、R-30min、R-lh、R-;3h、 R-Mh 再次處于正常的氧和營養(yǎng)物可獲得性的條件下的細胞。圖10顯示經(jīng)歷了缺氧/再充氧方案的HMEC人內(nèi)皮細胞中miR_U6的表達。NX 在氧可獲得性(含氧量正常，21% )和營養(yǎng)物可獲得性(含有10% FBS的完全培養(yǎng)基)的正常條件下的細胞CC 經(jīng)歷了營養(yǎng)物限制的對照細胞(其處于無營養(yǎng)物的培養(yǎng)基中)。Hyp 經(jīng)歷了營養(yǎng)物和氧限制的細胞(1%氧的無營養(yǎng)物的培養(yǎng)基)；R-15min、R-30min、R-lh、R-;3h、 R-Mh 再次處于正常的氧和營養(yǎng)物可獲得性的條件下的細胞。圖11顯示診斷為缺血病因的急性腎功能衰竭(FRA)患者的血清miR-127的表達。 對照健康對照中miRNA的表達等于1。將患者中的表達數(shù)據(jù)以該數(shù)據(jù)歸一化。Oh和3天 取患者樣品的時間，因FRA進入時(Oh)和隨后在其進展中(3天)。圖12顯示診斷為缺血病因的急性腎功能衰竭(FRA)患者的尿miR-127的表達。對照健康對照中miRNA的表達等于1。將患者中的表達數(shù)據(jù)以該數(shù)據(jù)歸一化。Oh和3天取患者樣品的時間，因FRA進入時(Oh)和隨后在其進展中(3天)。圖13顯示診斷為缺血病因的急性腎功能衰竭(FRA)患者的血清miR_U6的表達。 對照健康對照中miRNA的表達等于1。將患者中的表達數(shù)據(jù)以該數(shù)據(jù)歸一化。Oh和3天 取患者樣品的時間，因FRA進入時(Oh)和隨后在其進展中(3天)。圖14顯示診斷為缺血病因的急性腎功能衰竭(FRA)患者的血清miR-210的表達。 對照健康對照中miRNA的表達等于1。將患者中的表達數(shù)據(jù)以該數(shù)據(jù)歸一化。第0天、第1天、第2天、第3天、第7天取患者樣品的時間，因FRA進入時(第0天)和隨后在其進展中。圖15顯示診斷為缺血病因的急性腎功能衰竭(FRA)患者的尿miR-210的表達。對照健康對照中miRNA的表達等于1。將患者中的表達數(shù)據(jù)以該數(shù)據(jù)歸一化。第0天、第1 天、第2天、第3天、第7天取患者樣品的時間，因FRA進入時(第0天)和隨后在其進展中。圖16顯示診斷為缺血病因的急性腎功能衰竭(FRA)患者的血清miR-101的表達。 對照健康對照中miRNA的表達等于1。將患者中的表達數(shù)據(jù)以該數(shù)據(jù)歸一化。第0天、第 1天、第2天、第3天、第7天取患者樣品的時間，因FRA進入時(Od)和隨后在其進展中。圖17顯示血清樣品中miR-101的表達a 在屬于組IA的患者中，b 在屬于組IB 的患者中，以及c 在屬于組II的患者中。圖18顯示血清樣品中miR-127的表達a 在屬于組IA的患者中，b 在屬于組IB 的患者中，以及c 在屬于組II的患者中。圖19顯示血清樣品中miR-126的表達a 在屬于組IA的患者中，b 在屬于組IB 的患者中，以及c 在屬于組II的患者中。圖20顯示血清樣品中miR-210的表達a 在屬于組IA的患者中，b 在屬于組IB 的患者中，以及c 在屬于組II的患者中。
具體實施例方式通過使用陣列，在模擬I/R的H/R模型中鑒定出以差別方式表達的微RNA: miR-127、miR-126、miR-210和miR-101，因此，這些微RNA的每一種單獨或組合充當腎損傷的生物標志物。實施例1 經(jīng)歷了缺氧/再充氧的細胞系中miRNA的表達在含有特定的血清、抗生素和生長因子的合適培養(yǎng)基中進行以下細胞的培養(yǎng) (HK2 人近端小管細胞，NRK-52E 大鼠近端小管細胞，以及HMEC 人微血管內(nèi)皮細胞)。在 37°C下，將所述細胞保持在具有5% C02的潮濕氣氛中。使上文中描述的細胞系經(jīng)歷低氧/再充氧方案。即，使細胞系經(jīng)歷氧張力和營養(yǎng)物可獲得性的改變。為了該目的，使用了兩種不同的培養(yǎng)箱37 °C下在灌注了 5 % CO2、1 % 02>94% N2之混合物的封閉培養(yǎng)箱中缺氧；37°C下在含有5% CO2的標準培養(yǎng)箱中再充氧。 細胞生長至匯合，在缺氧之前M小時剝奪血清。在缺氧的過程中，將細胞保持在具有低濃度葡萄糖或衍生物的無血清的基本培養(yǎng)基(HBSQ中。在再充氧的過程中，使用完全培養(yǎng)基 (Saenz-Morales et al.，2006)。所有樣品的缺氧時間為6h，而再充氧的時間可變(15min 72h)。所有體外實驗均重復至少3次。隨后，通過PCR測定細胞系中不同微RNA的表達，為了該目的，從流體樣品(血清或尿)中提取總RNA并對其進行定量，將它們每一種50納克用于15微升中的逆轉(zhuǎn)錄 (retrotranscripcion, RT)反應。在該步驟中使用特定的商業(yè)化的引物(莖環(huán)引物)。這些引物對每種miRNA是特異性的。RT之后，以定量的方式(qPCR)進行擴增反應。在10微升總體積中進行的該反應中，使用了 1微升RT總反應物和對每種miRNA特異性的引物，以及具有熒光捕捉劑(atrapador de fluorescencia) Wl^qman探針。所有試劑，引物以及含有用于RT和PCR之酶和核苷酸的反應混合物均來自Applied Biosystems0結(jié)果如下如圖1所示，miR-126的表達水平嚴重依賴于營養(yǎng)物和氧的可獲得性，因為相對于正常條件，對這二者的限制非常顯著地降低miR-U6的表達。再充氧時，miRNA的表達恢復， 這時細胞恢復對氧和營養(yǎng)物的處置。因此，miR-U6表達的降低表明近端小管細胞中缺乏營養(yǎng)物和氧，這指示腎缺血。另一方面，鑒于再充氧池時記錄到對體外上皮的重大損傷，該 miRNA的低表達表明缺血之后近端小管上皮的損傷。如圖2所示，就像miR-U6那樣，miR-210的表達水平嚴重依賴營養(yǎng)物和氧的可獲得性，因為相對于正常條件，對這二者的限制非常顯著地降低miR-210的表達。再充氧時， miRNA的表達恢復，這時細胞恢復對氧和營養(yǎng)物的處置。因此，miR-126的降低表明近端小管細胞中缺乏營養(yǎng)物和氧，就像miR-126的情況中那樣，這指示腎缺血。另一方面，鑒于再充氧池時記錄到對體外上皮的損傷，miR-210的低表達表明缺血之后近端小管上皮的損傷。如圖3所示，與含氧量正常的條件相比，在缺氧條件下，miR-101的表達升高。在氧和營養(yǎng)物的可獲得性再次正?；脑俪溲踔校搈iRNA的表達再次正?；?。缺氧條件的過程中，近端細胞中該miRNA之表達的升高指示腎缺血。如圖4所述，與含氧量正常的條件相比，在缺氧條件下，miR-127的表達升高。在再充氧下，該miRNA的表達顯著降低，再充氧Mh，當表皮單層恢復時，表達再次升高。因此， 缺氧條件的過程中，近端細胞中miR-127表達的升高指示腎缺血。在再充氧下，其早期表達的降低表明缺血損傷，而其隨后的升高表明內(nèi)皮的恢復。如圖5所示，在該大鼠細胞中，在氧和營養(yǎng)物的可獲得性再次正?；脑俪溲跸?， miR-101的表達迅速正?；?，盡管與在含氧量正常的條件下相比，其仍保持更高的表達水平。在缺氧條件的過程中，近端細胞中該miRNA表達的升高指示腎缺血。再充氧24h時，其新的升高表明表皮單層的恢復。如圖6所示，就像在Hk_2(人小管)細胞中那樣，與含氧量正常的條件相比，在營養(yǎng)物和氧的可獲得性受限的低氧條件下，miR-127的表達升高。在再次可獲得氧和營養(yǎng)物的再充氧條件下，該miRNA的表達迅速正?；?。缺氧條件的過程中，近端細胞中該miRNA表達的升高指示腎缺血。如圖7所示，就像近端小管細胞中那樣，與含氧量正常的條件相比，在缺氧條件下，miR-101的表達升高。在氧和營養(yǎng)物的可獲得性再次恢復正?；脑俪溲醯臈l件下，該 miRNA的表達維持在高水平，并在再充氧24h時開始正常化。在缺氧條件的過程中，內(nèi)皮細胞中該miRNA表達的升高指示腎缺血。在再充氧下，其高表達與內(nèi)皮的激活(促炎的)狀態(tài)相關(guān)，在24h時開始正常化。如圖8所示，就像近端小管細胞中那樣，與含氧量正常的條件相比，在營養(yǎng)物和氧的可獲得性受限的缺氧條件下，miR-127的表達升高。在可獲得氧和營養(yǎng)物的再充氧下，該 miRNA的表達維持在高水平，并在再充氧24h時開始正?；Ｔ谌毖鯒l件的過程中，內(nèi)皮細胞中該miRNA表達的升高指示腎缺血。在再充氧下，其高表達與內(nèi)皮的激活(促炎的)狀態(tài)相關(guān)，在24h時會開始正常化。如圖9所示，不像近端小管細胞中的miRNA那樣，與含氧量正常的條件相比，在缺氧條件下，miR-210的表達不顯著地升高。在再充氧的條件下，該miRNA的表達維持在高水平，并且在再充氧24h時，其表達迅速降低。在低氧條件的過程中，內(nèi)皮細胞中該miRNA表達的升高指示腎缺血。就像miR-127和miR-101那樣，在再充氧下，miR-210的表達與內(nèi)皮激活(促炎的)狀態(tài)相關(guān)，在24h時開始正?；Ｈ鐖D10所示，與含氧量正常的條件相比，在營養(yǎng)物和氧的可獲得性受限的缺氧條件下，miR-126的表達不顯著地升高。并且，在可獲得氧和營養(yǎng)物的再充氧Ih時，其非常顯著地升高。隨后，該miRNA的表達正?；?。在缺氧條件的過程中，內(nèi)皮細胞中該miRNA表達的升高指示腎缺血。再充氧Ih時如此顯著的升高清楚明確地與最大內(nèi)皮激活(促炎的) 狀態(tài)相關(guān)。^MM 2 :i金斷為急t牛腎功能衰竭的患、者中miRNA的表汰以前瞻性的方式對患者的樣品進行研究?；颊呋蚱浞ǘù砣送ㄟ^相關(guān)的知情同意而授權(quán)之后并且事先被我們醫(yī)院的臨床研究倫理委員會(Comit6 EtiCO de Investigacion Clinica)批準之后，在下文中描述的患者組中的移植病例中抽血和尿和腎活組織檢查的樣品。腎移植患者的樣品分析了來自50位移植者(從頭腎移植(transplante renal de novo)的并且有不同免疫抑制方案的患者)的樣品，分成兩組I. 25位即時移植物功能的患者II. 25位延遲移植物功能的患者在腎移植后第1、7、15、30天，取血液和尿樣品，并在這些天中通過qRT-PCR測定要研究的miRNA的表達。在移植物無功能的情況下，在第7天時進行活組織檢查，每7 10天重復進行，直至TNA期消退。假如懷疑排斥反應，通過活組織檢查證實之后，將這些患者排除。在移植患者的情況下，收集和確定以下信息-受體特征年齡、性別和透析的時間。-供體特征供體的類型(腦死亡、心搏停止)、年齡、性別、對血管活性藥物的需要和最后肌酸酐。-移植物特征熱、冷缺血的時間和吻合的時間。HLA相容性和免疫抑制。-第2、4和12周時移植物的功能。在 8ml 的 VACUETTE 管(z serum sep clot activator)中收集血液樣品，2500rpm 離心10分鐘。通過離心收集所分離的血清，并根據(jù)Ramon and Cajal Hospital的BioBank的標準(在匿名的管中，具有唯一的代碼，并置于-80°C)分裝和存儲。尿樣品收集在標準尿瓶中，或從探針的沉積中提取，以2500rpm離心所述尿樣品 10分鐘以除去沉淀和其他殘余物，并根據(jù)Ramon and Cajal Hospital的BioBank的標準 (在匿名的管中，具有唯一的代碼，并置于_80°C )分裝和存儲。通過特許權(quán)協(xié)議，由BioBank要求它們?nèi)康奶卦S權(quán)。最大要求500微升，因為我們優(yōu)化了用于在100 200微升的兩種流體樣品中通過定量PCR擴增miRNA的技術(shù)，為了該目的，從流體樣品(血清或尿)中提取總RNA，然后對其進行定量，其中它們每一種50納克用于15微升中的逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應。該步驟中使用特定的商業(yè)化引物(莖環(huán)引物)。這些引物對每種miRNA是特異性的。RT之后，以定量的方式(qPCR)進行擴增反應。在10微升總體積中進行的該反應中，使用了 1微升的RT總反應物和對每種miRNA特異性的引物， 以及具有熒光捕捉劑的Taqman探針。所有試劑，引物以及含有用于RT和PCR之酶和核苷酸的反應混合物均來自Applied Biosystems0在提取總RNA之前對患者的血清和尿樣品進行以下加工在56°C下，用蛋白酶 K(0. 65毫克/毫升)孵育lh，以消化100 200微升的血清或尿等分試樣。隨后，用酚/ 氯仿(5 1)進行第一次提取，并按照制造商的用法說明使用High Pure miRNA isolation Kit(Roche)處理水相。心臟手術(shù)之后患者的樣品分析來自50位患者的樣品，分成以下組-IA 以預定的方式使用體外循環(huán)(circulaci0n extracorporea, CEC)進行手術(shù)， 并且具有低FRA發(fā)生風險的10位成年人患者，即患者以Thakar 5系統(tǒng)的評分為0至2，或者以簡化的SRI 6的評分為0至1。-IB 使用CEC進行第一次手術(shù)的患有先天性心臟病的10位兒科患者。-II 以預定的方式使用CEC進行手術(shù)，具有改變的基礎(chǔ)腎功能，且以Thakar 5系統(tǒng)的評分> 5，或者以SRI 6的評分彡3的15位成年人患者。-III 以預定的方式使用CEC進行手術(shù)，具有正常的基礎(chǔ)腎功能，并且與上一節(jié)具有相同評分的15位成年人患者。對于每位患者，在以下時刻對所列舉的miRNA進行測定-基礎(chǔ)手術(shù)前-進入ICU 2h 時-手術(shù)之后24h、48h 和 72h-第7天時(對于組IA和IB而言是任選的)如圖11所示，與健康對照相比，miR-127的表達極大地降低?；颊哐逯性搈iRNA 表達的降低是腎缺血損傷或FRA的指示物。這些數(shù)據(jù)與圖18中所示的數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。如圖12所示，與血清降低相關(guān)聯(lián)，與健康對照相比，miR-127的表達顯著升高?；颊哐逯性搈iRNA表達的降低以及其在尿中相應的升高是腎缺血損傷或FRA之早期診斷的指示物。如圖13所示，血清miR-126的表達水平在缺血性腎損傷開始時顯著降低，并且其表達在24h時大幅升高，隨后正常化。這表明患者血清中該miRNA表達的降低是腎缺血損傷或FRA之早期診斷的指示物。如體外模型中討論的那樣，其在24h時的升高表明缺血之后與隨后的炎癥反應相關(guān)的內(nèi)皮激活。這些數(shù)據(jù)與圖19中所示的數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。如圖14所示，血清miR-210的表達在缺血腎損傷開始時顯著升高；其在前Mh中維持，隨后正?；?。這些數(shù)據(jù)表明患者血清中該miRNA表達的升高是腎缺血損傷或FRA的早期診斷標志物。如圖15所示，尿miR-210的表達在48h時顯著升高，隨后正?；?。鑒于HK_2細胞中該miRNA的表達在開始觀察到實驗模型中上皮恢復的時間時升高，這表明患者尿中該 miRNA在4 時表達的升高指示腎缺血損傷之后恢復的開始。這些數(shù)據(jù)與圖20中所示的數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。如圖16所示，在進入的早期，相對于健康對照，miR-101的表達顯著升高，而在進展期間，相對于健康對象，不再檢測到顯著的表達。這表明，患者血清中該miRNA表達的升高是腎缺血損傷的早期診斷標志物。這些數(shù)據(jù)與圖17中所示的數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。
權(quán)利要求
1.用于對急性腎損傷進行診斷和/或預后的方法，其包括分析患者的樣品以測定選自 miR-127、miR-126、miR-210和miR-101中至少一種微RNA的表達水平，并且將所述表達水平與對照值相比較，其中所述水平的改變指示急性腎損傷。
2.權(quán)利要求1的用于對急性腎損傷進行診斷和/或預后的方法，其中要分析的所述樣品選自血液、血清或尿。
3.權(quán)利要求1 2中任一項的用于對急性腎損傷進行診斷和/或預后的方法，其中與對照值相比血清miR-127表達水平的降低指示急性腎損傷。
4.權(quán)利要求1 2中任一項的用于對急性腎損傷進行診斷和/或預后的方法，其中與對照值相比尿miR-127表達水平的升高指示急性腎損傷。
5.權(quán)利要求1 2中任一項的用于對急性腎損傷進行診斷和/或預后的方法，其中與對照值相比血清miR-U6表達水平的降低指示急性腎損傷。
6.權(quán)利要求1 2中任一項的用于對急性腎損傷進行診斷和/或預后的方法，其中與對照值相比血清miR-210表達水平的升高指示急性腎損傷。
7.權(quán)利要求1 2中任一項的用于對急性腎損傷進行診斷和/或預后的方法，其中與對照值相比尿miR-210表達水平的降低指示急性腎損傷。
8.權(quán)利要求1 2中任一項的用于對急性腎損傷進行診斷和/或預后的方法，其中與對照值相比血清miR-101表達水平的升高指示急性腎損傷。
9.前述權(quán)利要求中任一項的用于對急性腎損傷進行診斷和/或預后的方法，其中通過 PCR測定微RNA的表達。
10.前述權(quán)利要求中任一項的用于對急性腎損傷進行診斷和/或預后的方法，其中通過定量PCR測定微RNA的表達。
11.權(quán)利要求1 8中任一項的方法，其中通過RNA微陣列測定微RNA的表達水平。
12.用于對急性腎損傷進行診斷和/或預后的試劑盒，其包含實施權(quán)利要求1 11中任一項的方法所需的探針和引物。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過分析選自miR-127、miR-126、miR-210和miR-101中至少一種微RNA的表達水平來進行急性腎損傷的診斷和/或預后的方法。
文檔編號C12Q1/68GK102575294SQ201080044847
公開日2012年7月11日 申請日期2010年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月4日
發(fā)明者伊萊亞·阿瓜多弗賴萊, 大衛(wèi)·薩恩斯莫拉萊斯, 費爾南多·利亞諾加西亞, 馬里亞·勞拉·加西亞貝爾梅霍 申請人:拉蒙和卡哈爾大學醫(yī)院生物醫(yī)學研究基金會