專(zhuān)利名稱：定量目標(biāo)生物體和產(chǎn)生腎形線蟲(chóng)抗性棉花植物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開(kāi)了對(duì)存在于特定位置的植物病原體、尤其是在農(nóng)作物的根圍中度過(guò)其生活周期的至少一部分的植物病原體進(jìn)行定量的方法。本發(fā)明的實(shí)施方式包括將對(duì)于物質(zhì)樣品中目標(biāo)生物體特異性的DNA序列的量與物質(zhì)樣品中DNA的總量相比較以定量物質(zhì)樣品中存在的目標(biāo)生物體的相對(duì)量的方法。提供的非限制性例子公開(kāi)了定量存在于物質(zhì)樣品如土壤中的腎形線蟲(chóng)(腎形腎狀線蟲(chóng)(Rotylenchulus reniformis))和/或根結(jié)線蟲(chóng)((南方根結(jié)線蟲(chóng))Meloidogyne incognita)的絕對(duì)數(shù)和相對(duì)數(shù)的新方法。本發(fā)明通過(guò)使得使用者能夠快速評(píng)估在特定地點(diǎn)種植作物的風(fēng)險(xiǎn)、確定如何最好地處理已在特定地點(diǎn)生長(zhǎng)的作物以應(yīng)對(duì)感染、預(yù)測(cè)和追蹤在地點(diǎn)內(nèi)或之間感染的發(fā)生以及研究植物或植物種群對(duì)抗腎形線蟲(chóng)感染的變異性而幫助疾病控制和研究。本發(fā)明的其它實(shí)施方式包括可用于檢測(cè)棉花植物中與腎形線蟲(chóng)抗性相關(guān)的核苷酸序列的分子標(biāo)志物和將這些序列從一種植物滲入另一種植物以產(chǎn)生包含一個(gè)或多個(gè)腎形線蟲(chóng)抗性基因座的新種質(zhì)的方法。

發(fā)明內(nèi)容
這里公開(kāi)的本發(fā)明包括一種測(cè)定物質(zhì)樣品中目標(biāo)生物體水平的快速方法。這種感染指數(shù)方法包括得出樣品中檢測(cè)的DNA總量與通過(guò)PCR擴(kuò)增對(duì)目標(biāo)生物體特異性的序列檢測(cè)的樣品中的DNA量的關(guān)系，和利用該關(guān)系或該關(guān)系的任何數(shù)學(xué)排列來(lái)定量樣品中目標(biāo)生物體的量。本發(fā)明也提供了感染指數(shù)方法如何可以用來(lái)監(jiān)測(cè)一個(gè)或多個(gè)地點(diǎn)的腎形線蟲(chóng)感染以便可以對(duì)一個(gè)或多個(gè)生長(zhǎng)地點(diǎn)進(jìn)行更有效種植、腎形線蟲(chóng)處理和資源分配規(guī)劃的描述。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一個(gè)地點(diǎn)的感染指數(shù)如何可以用來(lái)評(píng)估植物抵抗疾病感染的能力的描述。而且，本發(fā)明描述了感染指數(shù)方法如何可以用來(lái)幫助鑒定棉花基因組DNA中的疾病抗性等位基因、幫助相對(duì)于這些等位基因的存在或不存在對(duì)棉花植物進(jìn)行基因分型，幫助育種者在棉花植物從一代遺傳至另一代時(shí)在種群中追蹤這些等位基因，并且為決定選擇哪個(gè)個(gè)體用于推進(jìn)育種程序提供信息。本發(fā)明的某些方面進(jìn)一步包括作為分子輔助育種計(jì)劃的一部分的可用于檢測(cè)植物中或植物群體中腎形線蟲(chóng)抗性等位基因的存在的新的單核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)志物。本發(fā)明公開(kāi)的SNP標(biāo)志物允許育種者針對(duì)與腎形線蟲(chóng)抗性相關(guān)的核苷酸序列的存在而對(duì)植物進(jìn)行基因分型，從而簡(jiǎn)化或者甚至繞過(guò)低效的表型分型過(guò)程。發(fā)明詳沭這里公開(kāi)的本發(fā)明包括一種確定給定位置的目標(biāo)生物體的量的新型且高通量的方法。與本領(lǐng)域現(xiàn)在或以前公開(kāi)的方法相比，本方法高效且準(zhǔn)確得多。這種感染指數(shù)方法包括通過(guò)將用目標(biāo)生物體特異性的序列檢測(cè)的DNA的量與樣品物質(zhì)中檢測(cè)的DNA總量進(jìn)行比較而對(duì)樣品物質(zhì)中目標(biāo)生物體數(shù)量定量的方法。在感染指數(shù)方法的一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)目標(biāo)生物體特異性的DNA序列是腎形線蟲(chóng)腎形腎狀線蟲(chóng)ITSl (內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔子I)區(qū)域5.8S rRNA基因。在另一個(gè)實(shí)施方式中，檢測(cè)的害蟲(chóng)特異性核酸序列是根結(jié)線蟲(chóng)南方根結(jié)線蟲(chóng)的ITSl區(qū)域5. 8 S rRNA基因。在其它實(shí)施方式中，檢測(cè)的害蟲(chóng)特異性核酸序列對(duì)其它生物體是特異性的。公開(kāi)的本發(fā)明的額外實(shí)施方式包括基于用感染指數(shù)方法在植物的根圍中檢測(cè)的線蟲(chóng)感染水平針對(duì)植物對(duì)線蟲(chóng)的易感性或抗性對(duì)植物進(jìn)行表型分型。本領(lǐng)域中描述的先前方法如貝爾曼漏斗提取技術(shù)(Baermann Funnel Extraction Technique) (BFET)通常導(dǎo)致為了收集土壤而將生長(zhǎng)地點(diǎn)的植物完全去除。本發(fā)明提供了在不在其生長(zhǎng)處干擾植物的情況下測(cè)定植物抗特定害蟲(chóng)感染的能力的新型高通量和準(zhǔn)確的方法。因此可以通過(guò)連續(xù)土壤采樣在生長(zhǎng)期內(nèi)多次測(cè)定植物抗感染的能力，且感染的傳播也可以隨時(shí)間進(jìn)行監(jiān)測(cè)。本發(fā)明也提供了將感染指數(shù)方法整合到常規(guī)育種工作中以幫助有利的等位基因從一個(gè)植物滲入另一個(gè)植物的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法包括如下步驟1)在親本家系間進(jìn)行雜交；2)用感染指數(shù)方法對(duì)從這些雜交產(chǎn)生的后代進(jìn)行表型分型；和3)基于這些表型分?jǐn)?shù)對(duì)親本和/或后代進(jìn)行選擇。而且，本發(fā)明提供了將與疾病抗性相關(guān)的等位基因滲入植物家系的方法，包括如下步驟1)提供植物群體；2)相對(duì)于選自SEQ ID NO :1-112的至少一種基因組核酸標(biāo)志物在群體中對(duì)至少一個(gè)植物進(jìn)行基因分型；和3)從群體中選擇至少一個(gè)包含至少一種與疾病抗性相關(guān)的等位基因的植物。提供的群體可以通過(guò)將至少一種疾病抗性植物與至少一種疾病敏感植物雜交以形成群體而獲得。本發(fā)明也提供了通過(guò)以下步驟產(chǎn)生的優(yōu)良植物1)提供植物群體；2)相對(duì)于選自 SEQ ID NO 1-112的棉花基因組核酸標(biāo)志物在群體中對(duì)至少一個(gè)植物進(jìn)行基因分型；和3) 從群體中選擇至少一個(gè)包含至少一種與疾病抗性相關(guān)的等位基因的植物。本發(fā)明的優(yōu)良棉花植物可以表現(xiàn)出轉(zhuǎn)基因性狀。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于檢測(cè)與疾病抗性相關(guān)的基因座的基本上純化的核酸分子，其包括選自SEQ ID NO :1-112及其互補(bǔ)序列的核酸分子。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于檢測(cè)代表棉花DNA中的多態(tài)性的分子標(biāo)志物的分尚的核酸分子,其中該核酸分子包含包括或相鄰于多態(tài)性的至少15個(gè)核苷酸，其中該核酸分子與包括或相鄰于多態(tài)性的任一 DNA鏈中相同數(shù)目的連續(xù)核苷酸的序列至少90%相同，且其中分子標(biāo)志物選自于SEQ ID NO :1-112. 在一個(gè)方面，分離的核酸進(jìn)一步包含可檢測(cè)標(biāo)記或可用于引入可檢測(cè)標(biāo)記。在另一個(gè)方面， 可檢測(cè)標(biāo)記選自于同位素、熒光團(tuán)、氧化劑、還原劑、核苷酸和半抗原。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一組寡核苷酸，包括a)寡核苷酸引物對(duì)，其中各引物包含至少12個(gè)連續(xù)核苷酸，且其中引物對(duì)允許PCR擴(kuò)增包含選自SEQ ID NO :1-112的分子標(biāo)志物的DNA片段，和b)至少一種允許檢測(cè)擴(kuò)增片段中的多態(tài)性的檢測(cè)寡核苷酸，其中該檢測(cè)寡核苷酸的序列與包括或相鄰于步驟(a)中多態(tài)性的棉花DNA片段的任一鏈中相同數(shù)目的連續(xù)核苷酸的序列至少95%相同。除非另有注明，根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的常規(guī)用法來(lái)理解術(shù)語(yǔ)。分子生物學(xué)中常用術(shù)語(yǔ)的定義也可參見(jiàn)Alberts等人，Molecular Biology of The Cell, 第 5 版，Garland Science Publishing, Inc. New York,2007 ；Rieger 等人，Glossary of Genetics !Classical and Molecular,第 5 版，Springer-Verlag New York,1991 ； King 等人，A Dictionary of Genetics,第 6 版，Oxford University Press New York, 2002 ;和 Lewin, Genes IX, Oxford University Press New York, 2007。本發(fā)明使用了如 37CFR § 1.822所述的DNA堿基命名法。植物的“根圍”是被植物的根部、根分泌物和根相關(guān)的土壤微生物影響的土壤區(qū)域。本發(fā)明所用的“生長(zhǎng)區(qū)域”是植物有目的地生長(zhǎng)的任何區(qū)域或設(shè)施。非限制性實(shí)例包括耕種田地、溫室、生長(zhǎng)室、盆或任何其它工業(yè)、學(xué)術(shù)、公共或私人的場(chǎng)所，其中多種植物生長(zhǎng)用于研究和/或消耗。本發(fā)明所用的“地點(diǎn)”是生長(zhǎng)區(qū)域內(nèi)的特定位點(diǎn)。本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方式描述了在生長(zhǎng)區(qū)域內(nèi)的多個(gè)地點(diǎn)采集土壤。這種地點(diǎn)的非限制性實(shí)例是特定田地中特定的2 英尺*2英尺的地塊，或者是在生長(zhǎng)室中的盆的2英寸*2英寸的地塊中生長(zhǎng)的幼苗。本發(fā)明所用的RKN是指根結(jié)線蟲(chóng)或南方根結(jié)線蟲(chóng)?！暗任换颉笔侵冈谔囟ɑ蜃目蛇x擇的序列；等位基因的長(zhǎng)度可以小到I個(gè)核苷酸堿基，但通常要比這個(gè)大。“基因座”是通常通過(guò)參照點(diǎn)找到的基因組序列上的位置，例如，作為基因或者基因或基因間區(qū)域的部分的DNA序列。本發(fā)明的基因座包括在群體中的一種或多種多態(tài)性； 即存在于一些個(gè)體中的可選擇的等位基因。本發(fā)明所用的“多態(tài)性”是指在一個(gè)或多個(gè)個(gè)體的群體中一個(gè)或多個(gè)基因座處存在核酸序列或核酸特征的兩種或更多種變異。變異可以包括，但不限于，一個(gè)或多個(gè)堿基的改變、一個(gè)或多個(gè)核苷酸的插入或一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失。多態(tài)性可以來(lái)自于作為可動(dòng)基因組元件的結(jié)果通過(guò)突變產(chǎn)生的核酸復(fù)制中的隨機(jī)過(guò)程、來(lái)自于拷貝數(shù)變異和在有絲分裂過(guò)程中，如不等交換、基因組重復(fù)及染色體斷裂和融合。這種變異可以在群體中常見(jiàn)或者可能以低頻率存在，前者在通常植物育種中具有更大作用而后者可能與稀有但重要的表型變異相關(guān)。有用的多態(tài)性可以包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)、DNA序列的插入或缺失 (Indels)、DNA序列的簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性和標(biāo)簽SNP。遺傳標(biāo)志物、基因、DNA衍生序列、單倍體型、RNA衍生序列、啟動(dòng)子、基因的5'非翻譯區(qū)、基因的3' 非翻譯區(qū)、微RNA、siRNA, QTL、衛(wèi)星標(biāo)志物、轉(zhuǎn)基因、mRNA、ds mRNA、轉(zhuǎn)錄譜和甲基化模式也可以包含多態(tài)性。此外，前述情況的存在、缺失或拷貝數(shù)的變異可以包含多態(tài)性。本發(fā)明所用的“標(biāo)志物”是指可用于生物體間進(jìn)行區(qū)分的可檢測(cè)的特征。這種特征的實(shí)例可以包括遺傳標(biāo)志物、蛋白質(zhì)組成、蛋白質(zhì)水平、油組成、油水平、碳水化合物組成、碳水化合物水平、脂肪酸組成、脂肪酸水平、氨基酸組成、氨基酸水平、生物聚合物、藥物、淀粉組成、淀粉水平、可發(fā)酵淀粉、發(fā)酵產(chǎn)量、發(fā)酵效率、能量產(chǎn)量、次生化合物、代謝物、形態(tài)學(xué)特征和農(nóng)藝特征。本發(fā)明所用的“遺傳標(biāo)志物”是指多態(tài)性核酸序列或核酸特征。遺傳標(biāo)志物可以用一種或多種特定的變異序列或通過(guò)共有序列代表。在另一種意義中，“遺傳標(biāo)志物”是這種序列的分離的變異體或共有序列。本發(fā)明所用的“標(biāo)志物分析”是用于使用特定方法檢測(cè)特定基因座的多態(tài)性的方法，例如測(cè)定至少一種表型(如種子顏色、花的顏色或其它視覺(jué)可檢測(cè)的性狀)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、單堿基延伸、電泳、序列比對(duì)、等位基因特異性寡核苷酸雜交(ASO)、 隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA(RAPD)、基于微陣列的技術(shù)和核酸測(cè)序技術(shù)等等。本發(fā)明所用的“分型”是指用來(lái)測(cè)定給定棉花基因組多態(tài)性的特定等位基因形式的任何方法。例如，單核苷酸多態(tài)性(SNP)通過(guò)測(cè)定存在哪種核苷酸(即A、G、T或C)而分型。插入/缺失(Indel)通過(guò)測(cè)定是否存在Indel而確定。Indel可以通過(guò)多種分析方法而分型，包括，但不限于，標(biāo)志物分析。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“鄰近”當(dāng)用來(lái)描述與含多態(tài)性的DNA雜交的核酸分子時(shí)，是指與直接鄰近多態(tài)性核苷酸堿基位置的DNA序列雜交的核酸。例如，可在單堿基延伸分析中使用的核酸分子“鄰近”于多態(tài)性。本發(fā)明所用的“共有序列”是指鑒別基因座的等位基因中的SNP和Indel多態(tài)性的構(gòu)成性DNA序列。共有序列可以基于該基因座處任一 DNA鏈，且表示基因座中各SNP中任一的核苷酸堿基和基因座中所有Indel的核苷酸堿基。因此，盡管共有序列可以不是實(shí)際 DNA序列的拷貝，但是共有序列可用于精確設(shè)計(jì)用于基因座中實(shí)際多態(tài)性的引物和探針。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“單核苷酸多態(tài)性”也用縮寫(xiě)“SNP”表示，是指單一位點(diǎn)的多態(tài)性，其中該多態(tài)性構(gòu)成單堿基對(duì)改變、一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)的插入或一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)的缺失。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“單倍體型”是指用至少一個(gè)多態(tài)性分子標(biāo)志物限定的單倍體型窗口(haplotype window)內(nèi)的染色體區(qū)域。各個(gè)單倍體型窗口中的獨(dú)特標(biāo)志物指紋組合限定了該窗口的單個(gè)單倍體型。而且，單倍體的改變，例如由重組引起的，可以導(dǎo)致單倍體型的改變以至于它僅包含例如，通過(guò)與基因、QTL或轉(zhuǎn)基因的物理連接而可操作地與該性狀連鎖的原始(親本)單倍體型的一部分。只要該基因組區(qū)域的功能完整性未改變或得到改善，單倍體型中的任何這種改變都被包括我們關(guān)于什么構(gòu)成單倍體型的定義中。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“單倍體型窗口 ”是指用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法建立的且處于連鎖不平衡的染色體區(qū)域。因此，在位于該區(qū)域內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)分子標(biāo)志物基因座處兩個(gè)近交個(gè)體(或兩個(gè)配子)之間的狀態(tài)的確認(rèn)被用作整個(gè)區(qū)域的來(lái)源同一 (identity-by-descent)的證據(jù)。各個(gè)單倍體型窗口包括至少一個(gè)多態(tài)性分子標(biāo)志物。單倍體型窗口可以沿基因組中各染色體作圖。單倍體型窗口本身不固定，且考慮到持續(xù)增加的分子標(biāo)志物密度，本發(fā)明預(yù)計(jì)單倍體型窗口的數(shù)目和大小將繼續(xù)演變，使窗口的數(shù)目增加而它們相應(yīng)的大小減小，因此導(dǎo)致在根據(jù)標(biāo)志物基因座的狀態(tài)的同一性確定來(lái)源同一性時(shí)持續(xù)提高的置信度。本發(fā)明所用的“基因型”是與可觀察的性狀(該表型)相對(duì)的個(gè)體(或個(gè)體組)在一個(gè)或多個(gè)遺傳位點(diǎn)處的遺傳構(gòu)成。基因型可以，例如，通過(guò)使用遺傳標(biāo)志物間接表征，或者，例如，通過(guò)核酸測(cè)序直接表征。合適的標(biāo)志物包括表型特征、代謝譜、遺傳標(biāo)志物或一些其它類(lèi)型的標(biāo)志物?；蛐陀蓚€(gè)體從其親本遺傳而來(lái)或能夠傳遞給其后代的一個(gè)或多個(gè)已知基因座的等位基因限定。術(shù)語(yǔ)基因型可以用于指在單一基因座、多個(gè)基因座、染色體的部分、整個(gè)染色體、基因組的部分、整個(gè)基因組的個(gè)體遺傳構(gòu)成，更通常，術(shù)語(yǔ)基因型可用于指其基因組中所有基因的個(gè)體遺傳組成?；蛐涂梢詷?gòu)成對(duì)于至少一個(gè)遺傳標(biāo)志物基因座的等位基因或?qū)τ谥辽僖粋€(gè)單倍體型窗口的單倍體型。“種質(zhì)”是指?jìng)€(gè)體(例如植物)、個(gè)體組(例如植物家系、品種或科)或源自系、品種、種屬或培養(yǎng)物的克隆的遺傳物質(zhì)或來(lái)自以上的遺傳物質(zhì)。種質(zhì)可以是生物體或細(xì)胞的部分，或可以從生物體或細(xì)胞分離。通常，種質(zhì)提供了具有特定分子構(gòu)成的遺傳物質(zhì)，其為生物體或細(xì)胞培養(yǎng)物的一些或所有遺傳品質(zhì)提供了物理基礎(chǔ)。如本發(fā)明所用的，種質(zhì)包括細(xì)胞、種子或組織(新的植物可以由其生長(zhǎng))，或者可以培養(yǎng)為完整植株的植物部分，如葉、 莖、花粉或細(xì)胞。本發(fā)明所用的“表型”是指可以被基因型影響的細(xì)胞或生物體的可檢測(cè)的特征。本發(fā)明所用的“連鎖”是指雜交中產(chǎn)生的配子類(lèi)型的相對(duì)頻率。例如，如果基因座 A具有基因”A”或"a"和基因座B具有基因"B"或"b"，且AABB的親本I和aabb的親本B的雜交將產(chǎn)生四種可能的配子，其中基因被分隔成AB、Ab、aB和ab。空預(yù)期是獨(dú)立平均分隔成4種可能的基因型中的每一種，也就是各種基因型具有無(wú)連鎖的1/4的配子。配子分隔進(jìn)入不等于1/4的基因型是由于連鎖。本發(fā)明所用的“連鎖不平衡”在單代中許多個(gè)體的群中配子類(lèi)型的相對(duì)頻率的情況中定義。如果等位基因A的頻率為p，等位基因a的頻率為p'，等位基因B的頻率為q和等位基因b的頻率為q'，那么基因型AB的預(yù)期頻率(沒(méi)有連鎖不平衡)為pq，Ab為pq'， aB為p' q和ab為p' q'。與預(yù)期頻率的任何偏離被稱為連鎖不平衡。當(dāng)兩個(gè)基因座處于連鎖不平衡時(shí)，它們被稱為“遺傳連鎖的”。本發(fā)明所用的“數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL) ”是指在某種程度上控制通常連續(xù)分布的可數(shù)值表示性狀的基因座。本發(fā)明所用的“抗性等位基因”是指包括與對(duì)疾病的抗性相關(guān)的多態(tài)性等位基因的核酸序列。本發(fā)明所用的“棉花”是指陸地棉(Gossypium hirsutum),且包括可用棉花育種的所有植物種類(lèi)，包括野生棉花品種。更具體地，來(lái)自陸地棉品種和陸地棉亞種(Gossypium hirsutum L.)的棉花植物可以用這些組合物和方法進(jìn)行基因分型。在另外的方面，棉花植物來(lái)自于亞洲樹(shù)棉Gossypium arboreum L.類(lèi),另外稱為木棉。另一方面中，棉花植物來(lái)自于海島棉(Gossypium barbadense L.)類(lèi),另外稱為美洲皮馬棉或埃及棉。另一方面中，棉花植物來(lái)自于草本棉(Gossypium herbaceum L.)類(lèi)，另外稱為草棉。棉屬或棉花植物可以包括雜交種、近交系、部分近交系或者定義的或未定義的種群的成員。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“包括”是指“包括但不限于”。本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“優(yōu)良家系”是指由育種和選擇優(yōu)良農(nóng)藝性能所得到的任何家系。市場(chǎng)上可得到的優(yōu)良家系的非限制性例子包括DP 555BG/RR, DP 445BG/ RR, DP 444BG/RR, DP 454BG/RR, DP 161 B2RF, DP 141 B2RF, DP 0924 B2RF, DP 0935 B2RF, DP 121RF, DP 174 RF(岱字棉)！ST5599BR, ST5242BR, ST4554B2RF,ST4498B2RF, ST5458B2RF (Stoneville) ；FM9058F, FM9180B2F, FM1880B2F, FM1740B2F (FiberMax) ；PHY485WRF, PHY375WRF, PHY745WRF(Acala)(PhytoGen)；和 MCS0423B2RF, MCS0508B2RF(Cotton States)。在本發(fā)明中，疾病抗性基因座位于染色體All上。用于檢測(cè)腎形線蟲(chóng)抗性存在和監(jiān)測(cè)疾病抗性基因座滲入的SNP標(biāo)志物包括選自于SEQ ID NO :1-112的那些標(biāo)志物。用于擴(kuò)增SEQ ID NO :1-68中的SNP的正向引物在序列表中以SEQ ID NO 113-180提供。用于擴(kuò)增SEQ ID NO :1-68中的SNP的反向引物在序列表中按相同順序以SEQ ID N0181-248 提供。用于檢測(cè)SEQ ID NO 1-68中的SNP的探針組也以同樣的順序分別作為SEQ ID NO 249-316 和 SEQ ID NO :317-384 列出。例如，標(biāo)志物DNA序列SEQ ID NO 3可以用SEQ ID NO :115和183所示的引物進(jìn)行擴(kuò)增并用SEQ ID NO :251和319所示的探針進(jìn)行檢測(cè)。說(shuō)明性的示例標(biāo)志物DNA序列 SEQ ID NO 12可以用SEQ ID NO :124和192所示的引物進(jìn)行擴(kuò)增并用SEQ ID NO :260和 328所示的探針進(jìn)行檢測(cè)。說(shuō)明性示例標(biāo)志物DNA序列SEQ ID N0:13可以用SEQ ID NO: 125和193所示的引物進(jìn)行擴(kuò)增并用SEQ ID NO :261和329所示的探針進(jìn)行檢測(cè)。此外，SEQ ID NO :69-112是可用于檢測(cè)腎形線蟲(chóng)抗性存在和用于監(jiān)測(cè)疾病抗性基因座滲入的額外SNP標(biāo)志物?；谶@些序列，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以從專(zhuān)門(mén)從事該服務(wù)的供應(yīng)商的一些選項(xiàng)中預(yù)訂檢測(cè)公開(kāi)的SNP必需的反應(yīng)組分，或使用需要本領(lǐng)域普通技術(shù)的方法來(lái)制備合適的引物和探針。本發(fā)明也提供了包含選自SEQ ID NO :1_112其片段及兩者的互補(bǔ)序列的核酸分子、的棉花植物。本發(fā)明也提供了包含選自SEQ ID N0:l-112、其片段及兩者的互補(bǔ)序列的核酸分子的優(yōu)良棉花植物。本發(fā)明也提供了包含疾病抗性基因座的植物。這些等位基因可以是純合的或雜合的。如本發(fā)明所用的，腎形線蟲(chóng)是指任何腎形線蟲(chóng)變異體或分離物。本發(fā)明的棉花植物可以對(duì)能引起疾病的與腎形線蟲(chóng)相似的一種或多種線蟲(chóng)具有抗性。一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了抗腎形線蟲(chóng)的植物以及用于篩選對(duì)腎形屬(Rotylenchulus)導(dǎo)致的腎形線蟲(chóng)病有抗性或易感性的棉花植物的方法和組合物。在優(yōu)選的方面中，本發(fā)明提供了用于篩選對(duì)腎形腎狀線蟲(chóng)有抗性或易感性的棉花植物的方法和組合物。一個(gè)方面，本發(fā)明可用于任何植物。另一個(gè)方面，植物選自于棉屬。另一個(gè)方面，植物選自于陸地棉種。在進(jìn)一步的方面，植物選自于陸地棉亞種(Gossypium hirsutum L.)。 在另外的方面，植物來(lái)自于亞洲樹(shù)棉(Gossypium arboreum L)類(lèi),另外也稱為木棉。另一個(gè)方面，植物來(lái)自于海島棉(Gossypium barbadense L)類(lèi),另外也稱為美洲皮馬棉或埃及棉。另一個(gè)方面，棉花植物來(lái)自于草本棉(Gossypium herbaceum L)類(lèi),另外也稱為草棉。 棉屬或棉花植物可以包括雜交種、近交系、部分近交系或者定義的或未定義的種群的成員。本發(fā)明的植物可以對(duì)給定疾病具有非常高的抗性、有抗性、基本上有抗性、有適度抗性、有相對(duì)抗性、有部分抗性、的適度易感性或有易感性，或者顯示出在抗性或易感性程度上的其它變異。在優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供了被測(cè)試對(duì)疾病的抗性或易感性的植物，所用測(cè)試方法為感染指數(shù)方法或者用來(lái)確定植物是否對(duì)給定疾病有非常高的抗性、有抗性、基本上有抗性、有適度抗性、有相對(duì)抗性、有部分抗性、有適度易感性或有易感性或者顯示出在抗性或易感性程度上的其它變異的任何方法。另一個(gè)方面中，棉花植物可以顯示出相比于非抗性的對(duì)照棉花植物的相對(duì)抗性。 在這個(gè)方面，對(duì)照棉花植物優(yōu)選是除了所述的一種或多種疾病抗性等位基因之外遺傳相似的棉花植物。這種植物在具有等同或近似的病原體暴露的相似條件下生長(zhǎng)。本發(fā)明的疾病抗性QTL可以引入優(yōu)良家系中?！皟?yōu)良家系”是由育種和優(yōu)良農(nóng)藝性能的選擇所得到的任何家系。本發(fā)明的抗性QTL也可以引入包含賦予除草劑耐受性、產(chǎn)量增加、昆蟲(chóng)防治、真菌病抗性、病毒抗性、線蟲(chóng)抗性、細(xì)菌病抗性、支原體病抗性、改變的油產(chǎn)量、高油產(chǎn)量、高蛋白產(chǎn)量、發(fā)芽或幼苗生長(zhǎng)控制、加強(qiáng)的動(dòng)物和人類(lèi)營(yíng)養(yǎng)性、低棉子糖、環(huán)境壓力抗性、增強(qiáng)的消化性、工業(yè)酶、藥用蛋白、肽和小分子、改善的加工特性、改良的口味、固氮作用、雜交種子產(chǎn)生、減輕的變應(yīng)原性、生物聚合物和特別地生物柴油的一種或多種轉(zhuǎn)基因的優(yōu)良棉花植物。 一個(gè)方面中，除草劑耐受性選自草甘膦、麥草畏、草丁膦、磺酰脲、溴苯腈和達(dá)草滅除草劑。 這些性狀可以通過(guò)如植物中的轉(zhuǎn)基因的植物生物技術(shù)方法提供。一種或多種疾病抗性QTL等位基因可以從包含該等位基因的任何植物(供體)引入任何受體植物中。一個(gè)方面中，受體植物可以包含額外的疾病抗性基因座。另一個(gè)方面中，受體植物可以包含轉(zhuǎn)基因。另一個(gè)方面中，在維持引入的QTL的同時(shí)，提供疾病抗性QTL 的植物遺傳貢獻(xiàn)成分可以通過(guò)回交或其它適當(dāng)方式降低。一個(gè)方面中，來(lái)自于植物的供體材料的核遺傳物質(zhì)可以低于或約50%、低于或約25%、低于或約13%、低于或約5%、3%、 2 %或I %，但是該遺傳物質(zhì)包含感興趣的一個(gè)或多個(gè)抗性基因座?？梢赃M(jìn)一步理解，本發(fā)明的植物可以表現(xiàn)出任何相對(duì)成熟期組的特征。一個(gè)方面， 成熟期組選自早熟品種、中早熟品種(mid season maturing variety)和全季節(jié)品種(full season variety)。QTL的等位基因可以包含甚至在連續(xù)基因組區(qū)域或連鎖群如單倍體型中的多個(gè)基因或其它遺傳因子。如本發(fā)明所用的，疾病抗性基因座的等位基因因此可以涵蓋超過(guò)一種基因或其它遺傳因子，其中各單個(gè)基因或遺傳成分也能表現(xiàn)出等位基因變異和其中各基因或遺傳因子也能誘發(fā)對(duì)所述數(shù)量性狀的表型效應(yīng)。本發(fā)明的一個(gè)方面中，QTL的等位基因包含也能夠表現(xiàn)出等位基因變異的一種或多種基因或其它遺傳因子。因此，使用術(shù)語(yǔ)“QTL 的等位基因”并非有意排除包含超過(guò)一種基因或其它遺傳因子的QTL。具體而言，本發(fā)明中出現(xiàn)的“QTL的等位基因”可以表示在其中表型可以是疾病抗性的單倍體型窗口內(nèi)的單倍體型。單倍體型窗口是可以用一個(gè)或多個(gè)多態(tài)性標(biāo)志物的組定義或追蹤的連續(xù)基因組區(qū)域， 其中多態(tài)性表示來(lái)源同一。該窗口內(nèi)的單倍體型可以通過(guò)各標(biāo)志物處的獨(dú)特等位基因指紋來(lái)定義。本發(fā)明所用的等位基因是占據(jù)染色體上的給定基因座的基因的幾種可選形式中的一種。當(dāng)存在于染色體上給定基因座的所有等位基因是相同的，那么該植物在該基因座是純合的。如果存在于染色體上給定基因座的等位基因不同，那么該植物在該基因座是雜合的。本發(fā)明的植物在任何特定疾病基因座或?qū)τ谔囟ǘ鄳B(tài)性標(biāo)志物是純合的或雜合的。本發(fā)明也提供了本發(fā)明植物的部分。植物的部分非限制性地包括種子、胚乳、胚珠和花粉。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的方面中，該植物部分是種子。本文引用了各種專(zhuān)利和非專(zhuān)利文獻(xiàn)，其中各文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容都通過(guò)引用完整地包含在本文中。由于在不偏離本發(fā)明范圍的情況下可以對(duì)本文描述和說(shuō)明的結(jié)構(gòu)和方法進(jìn)行各種修改，前面說(shuō)明中包含或附圖
中所示的所有內(nèi)容應(yīng)當(dāng)被解釋為說(shuō)明性的而非限制性的。 本發(fā)明的廣度和范圍不應(yīng)當(dāng)被上述任何示例性的實(shí)施方式所限制，而應(yīng)當(dāng)僅僅根據(jù)后面隨附的權(quán)利要求及其等同特來(lái)限定。
實(shí)施例下面包括的實(shí)施例展示了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該能理解， 下面的實(shí)施例公開(kāi)的技術(shù)代表了發(fā)明人在本發(fā)明的實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)效果良好的技術(shù)，因此可以被認(rèn)為構(gòu)成了用于其實(shí)施的優(yōu)選方式。然而，根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解可以在本發(fā)明公開(kāi)的特定實(shí)施方式中進(jìn)行許多變化且在不偏離本發(fā)明的概念、精神和范圍的情況下仍然得到相像或類(lèi)似的結(jié)果。更具體地，顯然，化學(xué)和生理學(xué)相關(guān)的特定試劑可以替代當(dāng)本文所述的試劑而獲得同樣或相似的結(jié)果。所有這種對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的相似的替代和變化被視為在所附的權(quán)利要求定義的本發(fā)明的精神、范圍和概念之內(nèi)。實(shí)施例I :確定感染指數(shù)土壤采樣及DNA提取 為了確保從特定地點(diǎn)采樣的土壤是該地點(diǎn)的代表性土壤，從該地點(diǎn)的各個(gè)不同位置收集了 4份200-300克的土壤樣品，合并，徹底混合以形成“整體樣品”。使用UltraClean Mega Soil DNA分離試劑盒并根據(jù)制造商的方案從整體樣品中取出的一份或多份5_7克的土壤分樣品中提取DNA。總DNA定量在從土壤樣品中提取DNA后，使用Quant-iT PicoGreen 試劑盒并根據(jù)制造商的方案對(duì)土壤樣品中的DNA總量進(jìn)行定量。使用以各種濃度加入40μ I TE緩沖液和 50 μ I PicoGreen 試劑中的 ο μ I鮭魚(yú)精dna獲得四點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線。將土壤樣品中檢測(cè)的DNA量映射到標(biāo)準(zhǔn)曲線中以獲得從土壤樣品中分離的DNA的總量(表I)。表IDNA定量分析的內(nèi)容(μ I)
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定物質(zhì)樣品中目標(biāo)生物體的相對(duì)量的方法，該方法包括a.測(cè)定樣品中DNA的總量；b.分析樣品中針對(duì)目標(biāo)生物體特異性的至少一種DNA序列的存在以定量樣品中目標(biāo)特異性DNA的量；和c.計(jì)算對(duì)應(yīng)于樣品中目標(biāo)生物體的相對(duì)量的目標(biāo)特異性DNA與總DNA的比例。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中所述物質(zhì)樣品是土壤或植物材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其進(jìn)一步包括將所述比例與標(biāo)準(zhǔn)比較以確定所述樣品中目標(biāo)生物體的數(shù)量。
4.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中所述目標(biāo)生物體是植物病原體。
5.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中所述目標(biāo)生物體是線蟲(chóng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中所述目標(biāo)生物體是腎形線蟲(chóng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中所述目標(biāo)生物體是根結(jié)線蟲(chóng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中所述比例用于表示在物質(zhì)樣品取樣地點(diǎn)的植物抗目標(biāo)生物體感染的能力。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述比例用于決定是否在育種程序中使用該植物或其后代。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述植物是棉花植物。
11.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中所述比例用于選擇至少一種處理以應(yīng)用于生長(zhǎng)區(qū)域內(nèi)的至少一個(gè)地點(diǎn)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述至少一種處理選自化學(xué)品、機(jī)械、電子設(shè)備、探針、裝置、灌溉、人、動(dòng)物、肥料、其結(jié)合和其制劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述化學(xué)品是殺線蟲(chóng)劑。
14.一種用殺蟲(chóng)劑處理某地點(diǎn)的方法，包括(a)計(jì)算該地點(diǎn)的害蟲(chóng)特異性核酸的量與收集的核酸總量的比例，和(b)與(a)中計(jì)算的比例成比例地應(yīng)用殺蟲(chóng)劑于該地點(diǎn)。
15.一種檢測(cè)棉花植物中腎形線蟲(chóng)抗性存在或不存在的方法，其通過(guò)進(jìn)行標(biāo)志物檢測(cè)分析以檢測(cè)選自SEQ ID NO 1-112的一種或多種序列的存在或不存在。
16.—種檢測(cè)棉花植物中腎形線蟲(chóng)抗性的存在或不存在的方法，該方法包括檢測(cè)棉花植物中至少一種標(biāo)志物的等位基因，其中該至少一種標(biāo)志物在棉花基因組中CGR6333和 BNL1231 b之間的染色體區(qū)間上或之內(nèi)。
17.一種培育腎形線蟲(chóng)感染抗性的棉花植物的方法，該方法包括a.提供棉花植物的群體；b.對(duì)于在CGR6333和BNL1231b之間的染色體區(qū)間上或之內(nèi)的等位基因?qū)θ后w中的至少一個(gè)棉花植物進(jìn)行基因分型；c.鑒定包含至少一種與腎形線蟲(chóng)抗性相關(guān)的等位基因的至少一個(gè)棉花植物。
18.一種培育能夠抗腎形線蟲(chóng)感染的棉花植物的方法，該方法包括a.提供棉花植物的群體；b.相對(duì)于選自SEQID NO :1-112的棉花基因組核酸標(biāo)志物對(duì)群體中的至少一個(gè)棉花植物進(jìn)行基因分型；c.鑒定包含至少一種與腎形線蟲(chóng)抗性相關(guān)的等位基因的至少一個(gè)棉花植物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述群體通過(guò)將至少一種腎形線蟲(chóng)抗性棉花植物與至少一種腎形線蟲(chóng)敏感植物雜交而形成群體而獲得。
20.一種優(yōu)良棉花植物，通過(guò)如下步驟產(chǎn)生a.提供棉花植物的群體；b.相對(duì)于選自SEQID NO :1-112的棉花基因組核酸標(biāo)志物對(duì)群體中的至少一個(gè)棉花植物進(jìn)行基因分型；c.從群體中挑選包含至少一種與腎形線蟲(chóng)抗性相關(guān)的等位基因的至少一個(gè)棉花植物。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的優(yōu)良棉花植物，其中所述優(yōu)良棉花植物表現(xiàn)出轉(zhuǎn)基因性狀。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的優(yōu)良棉花植物，其中所述轉(zhuǎn)基因性狀選自除草劑耐受性、產(chǎn)量增加、昆蟲(chóng)防治、真菌病抗性、病毒抗性、線蟲(chóng)抗性、細(xì)菌病抗性、支原體病抗性、改變的油產(chǎn)量、高油產(chǎn)量、高蛋白產(chǎn)量、發(fā)芽和/或幼苗生長(zhǎng)控制、加強(qiáng)的動(dòng)物和人類(lèi)營(yíng)養(yǎng)性、低棉子糖、環(huán)境壓力抗性、增強(qiáng)的消化性、改進(jìn)的加工特性、改良的口味、固氮作用、雜交種子產(chǎn)生和降低的變應(yīng)原性。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的優(yōu)良棉花植物,其中除草劑耐受性選自草甘膦、麥草畏、草丁膦、磺酰脲、溴苯腈、2，4-二氯苯氧基乙酸和達(dá)草滅除草劑。
24.一種用于檢測(cè)與腎形線蟲(chóng)抗性相關(guān)的基因座的基本上純化的核酸分子，包括選自 SEQ ID NO :1-112及其互補(bǔ)序列的核酸分子。
25.一種用于檢測(cè)代表棉花DNA中的多態(tài)性的分子標(biāo)志物的分離的核酸分子，其中該核酸分子包含包括或相鄰于該多態(tài)性的至少15個(gè)核苷酸，其中該核酸分子與包括或相鄰于該多態(tài)性的任一 DNA鏈中相同數(shù)目連續(xù)核苷酸的序列至少90%相同，且其中該分子標(biāo)志物選自于 SEQ ID NO :1-112。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的分離的核酸分子，其中所述核酸進(jìn)一步包含可檢測(cè)標(biāo)記或可用于引入可檢測(cè)標(biāo)記。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的分離的核酸分子，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記選自于同位素、熒光團(tuán)、 氧化劑、還原劑、核苷酸和半抗原。
28.一組寡核苷酸，包含a.寡核苷酸引物對(duì)，其中各引物包含至少12個(gè)連續(xù)核苷酸，且其中引物對(duì)允許PCR擴(kuò)增包含選自SEQ ID NO 1-112的分子標(biāo)志物的DNA片段；b.至少一種允許檢測(cè)擴(kuò)增片段中的多態(tài)性的檢測(cè)寡核苷酸，其中該檢測(cè)寡核苷酸的序列與包括或相鄰于步驟(a)中多態(tài)性的棉花DNA片段的任一鏈中相同數(shù)目的連續(xù)核苷酸的序列至少95%相同。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物育種和疾病抗性領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明包括測(cè)試地點(diǎn)以確定害蟲(chóng)感染的量或測(cè)試植物的抗感染能力，以及使用該信息作出農(nóng)業(yè)治療和/或育種決定的方法。本發(fā)明也提供了培育包含一個(gè)或多個(gè)與腎形線蟲(chóng)感染的抗性相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)的棉花植物的方法。本發(fā)明進(jìn)一步包括種質(zhì)和使用包含能賦予腎形線蟲(chóng)抗性的數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)的種質(zhì)作為育種程序中用于滲入優(yōu)良種質(zhì)中的腎形線蟲(chóng)抗性等位基因的來(lái)源，因此產(chǎn)生包含一個(gè)或多個(gè)腎形線蟲(chóng)抗性基因座的新型優(yōu)良種質(zhì)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102597263SQ201080045355
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2010年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月9日
發(fā)明者B·L·亨德里克斯, M·巴蒂, P·L·科爾費(fèi)爾德, R·G·坎特雷爾, 吳坤生, 肖金華 申請(qǐng)人:孟山都技術(shù)公司