專利名稱：豬細(xì)環(huán)病毒的疫苗和診斷的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于對豬細(xì)環(huán)病毒(Torque teno virus, TTV)感染提供保護(hù)的疫苗，以及豬TTV(porcine TTV，PTTV)的感染性DNA克隆及其 應(yīng)用。本發(fā)明還涉及豬細(xì)環(huán)病毒(porcine Torque teno virus,PTTV)感染的診斷,尤其是種特異性的或類型特異性的PTTV感染的診斷和來自不同基因型的多種毒株同時(shí)感染的診斷。
背景技術(shù)：
細(xì)環(huán)病毒(TTV)于1997年首次在患有輸血后非甲 戊肝炎的日本患者中被發(fā)現(xiàn)(Nishizawa, T. , Okamoto, H. , Konishi, K. , Yoshizawa, H. , Miyakawa, Y. , and Mayumi,M. (1997). A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levelsin posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Biochem Biophys Res Commun24 1(1)，92-7.)。從那時(shí)起，已在高比例的來自健康人的血清和其他組織中鑒定出大量人TTV毒株以及隨后定名為小細(xì)環(huán)病毒(Torque teno mini virus, TTMV)和Torque tenomidi virus (TTMDV)的兩組 TTV 相關(guān)病毒(Hino, S.，and Miyata, H. (2007). Torque tenovirus (TTV) current status. Rev Med Viroll7(I),45-57 ；Okamoto, H. (2009a). Historyof discoveries and pathogenicity of TT viruses. Curr Top Microbiol Immunol 331,1-20)。人TTV、TTMV和TTMDV是具有長度分別為3. 6 3. 9,2. 8 2. 9和3. 2 kb的環(huán)狀單鏈DNA(single-stranded DNA, ssDNA)基因組的無包膜的球狀病毒，并且其當(dāng)前被國際病毒分類學(xué)委員會(huì)(International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV ；http: //www. ictvonline. org/virusTaxonomy. asp bhcp = I)分類為新設(shè)立的指環(huán)病毒科(family Anelloviridae) (Biagini, P. (2009). Classification of TTV and relatedviruses (anelloviruses). Curr Top Microbiol Immunol 331,21-33)。這三組 TTV 相關(guān)病毒表現(xiàn)出高度的遺傳異質(zhì)性，每組由很多基因群(genogroup)和基因型組成(Biagini,P.,Gallian, P. , Cantaloube,J. F. ,Attoui,H. ,de Micco, P. , and de Lamballerie, X. (2006).Distribution and genetic analysis of TTV and TTMV major phylogenetic groups inFrench blood donors. J Med Virol 78(2),298-304 ；Jelcic, I. , Hotz-ffagenblatt, A.,Hunziker,A. ,Zur Hausen, H. , and de Villiers,E. M. (2004). Isolation of multiple TTvirus genotypes from spleen biopsy tissue from a Hodgkin' s disease patient genome reorganization and diversity in the hypervariable region. J Virol 78(14),7498-507)。已證實(shí)在人中經(jīng)常有不同基因型的TTV的多重感染以及TTV、TTMV和TTMDV的雙重或三重感染的患病率,并且這被認(rèn)為是健康成年人中常見的事件(Niel，C.，Saback,F. L.，and Lampe, E. (2000). Coinfection with multiple TT virus strains belongingto different genotypes is a common event in healthy Brazilian adults. J ClinMicrobiol38(5)，1926-30 ;Ninomiya， M. ， Takahashi, M. ， Hoshino， Y. ， Ichiyama， K.，Simmonds，P.，and Okamoto, H. (2009). Analysis ofthe entire genomes of torque tenomidi virus variants in chimpanzees infrequent cross-species infection betweenhumans and chimpanzees. J Gen Virol 90 (Pt 2)，347-58 ;0kamoto，H. (2009a). Historyof discoveries and pathogenicity of TT viruses. Curr Top Microbiol Immunol 331，1-20 ；Takayama, S.，Miura，T. ,Matsuo, S.，Taki，M. , and Sugii, S. (1999). Prevalence andpersistence of a novel DNA TT virus(TTV)infection in Japanese haemophiliacs. BrJ Haematol104(3)，626-9) TTV不僅感染人，而且還感染多種其他動(dòng)物物種，包括非人靈長類、樹鼠句(tupaias)、豬、牛、貓、狗和海獅(Biagini，P.，Uch，R.，Belhouchet，M.，Attoui, H.，Cantaloube，J. F.，Brisbarre，N.，and de Micco, P. (2007). Circular genomes relatedto anelloviruses identified in human and animal samples by using a combinedrolIing-circleamplification/sequence-independent single primer amplificationapproach. J Gen Virol 88 (PtlO)，2696-701 ；Inami,T.，0bara，T. ,Moriyama,M. ,Arakawa,Y.，and Abe，K. (2000). Full-length nucleotide sequence of a simian TT virusisolate obtained from a chimpanzee !evidence for a newTT virus-like species.Virology 277 (2)，330-5 ;Ng，T. F.，Suedmeyer, W. K.，Wheeler, E.，Gulland，F(xiàn).，andBreitbart, M. (2009). Novel anellovirus discovered from a mortality event ofcaptive California sea lions. J Gen Virol 90 (Pt 5)，1256-61 ；Okamoto,H. (2009b). TTviruses in animals. Curr Top Microbiol Immunol 331，35—52 ;0kamoto，H.，Nishizawa，T. , Takahashi, M. , Tawara, A.，Peng，Y.，Kishimoto，J.，and Wang, Y. (2001). Genomic andevolutionary characterization of TT virus (TTV)in tupaias and comparison withspecies-specific TTVs in humans and non-human primates. J Gen Virol 82 (Pt 9)，2041—50 ；Okamoto, H.，Nishizawa, T.，Tawara, A.，Peng, Y.，Takahashi，M.，Kishimoto，J.，Tanaka，T.，Miyakawa, Y.，and Mayumi, M. (2000a). Species-specific TT virusesin humans and nonhuman primates and their phylogenetic relatedness. Virology277 (2)，368-78 ;0kamoto，H.，Takahashi，M.，Nishizawa, T.，Tawara, A.，F(xiàn)ukai，K.，Muramatsu, U.，Naito，Y.，and Yoshikawa，A. (2002). Genomic characterization of TTviruses (TTVs) in pigs，cats and dogs and their relatedness with species-specificTTVs in primates and tupaias. J Gen Virol83(Pt 6)，1291_7)。此外，TTMV 和 TTMDV還感染黑猩猩(Ninomiya，M.，Takahashi，M.，Hoshino, Y.，Ichiyama, K.，Simmonds，P.，and Okamoto, H. (2009). Analysis of the entire genomesoftorque teno midi virusvariants in chimpanzees infrequent cross-species infection between humans and chimpanzees. J Gen Virol90 (Pt 2)，347-58 ;0kamoto et al.，2000a，見上文)。盡管所鑒定的動(dòng)物TTV毒株(尤其是非靈長類動(dòng)物TTV)的基因組大小與人TTV的相比相對較小，但它們共有相同的基因組結(jié)構(gòu)，至少有從負(fù)ssDNA翻譯的兩個(gè)部分重疊的開放讀碼框(0RF1和0RF2)和短段的具有高GC含量( 90% )的非翻譯區(qū)(untranslated region, UTR)(Okamoto，2009b，見上文)。TTV ORF 的排列與屬于圓環(huán)病毒科(family Circoviridae)的雞貧血病毒屬(genus Gyrovirus)的雞貧血病毒(chicken anemia virus，CAV)的排列十分相似，但與分類為同一科的豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus，PCV)類型I(PCVl)和類型 2(PCV2)不同(Davidson，I.，and ShuIman, L M. (2008). Unraveling the puzzleof human anellovirus infections by comparison with avian infections with thechicken anemia virus. Virus Res 137(I), 1-15 ;Hino，S.，and Prasetyo，A. A. (2009).Relationship of Torque teno virus to chicken anemia virus. Curr Top MicrobiolImmunol 331,117-30)。PCVl 和 PCV2 的基因組是雙義的(ambisense)，其中 ORFl 是由基因組鏈(genomic strand)編碼的，而0RF2是由反基因組鏈(antigenomic strand)編碼的(Hino and Miyata，2007，見上文)。最近，已通過將各自的TTV感染性DNA克隆轉(zhuǎn)染進(jìn)入培養(yǎng)的細(xì)胞而鑒定人TTV基因型I和6的轉(zhuǎn)錄模式(transcription pattern)和翻譯產(chǎn)物(MuellellB.，Maerz, A.，Doberstein, K.，F(xiàn)insterbusch, T.，and Mankertz, A. (2008).Gene expression of the human Torque Teno Virus isolate P/1C1. Virology 381(1)， 36-45 ;Qiu，J.，Kakkola, L，Cheng, F.，Ye, C.，Soderlund-Venermo, M.，Hedman，K.，andPintel，D. J. (2005). Human circovirus TT virus genotype 6 expresses six proteinsfollowing transfection of a full-length clone. J Virol 79 (10)，6505—10)。已手艮道從三種或更多種經(jīng)剪接的mRNA表達(dá)至少6種蛋白質(zhì)，其定名為0RF1、0RF2、0RF1/1、0RF2/2、0RF1/2 和 0RF2/3 (Kakkola，L，Hedman, K.，Qiu, J.，Pintel, D.，and Soderlund-Venermo,M. (2009). Replication of and protein synthesis by TT viruses. Curr Top MicrobiolImmunol 331，53-64 ;Mueller et al.，2008，見上文；Qiu et al.，2005，見上文)。因此，當(dāng)與動(dòng)物TTV相關(guān)的更多數(shù)據(jù)變得可獲得時(shí)，將很可能需要修改所推定的動(dòng)物TTV的基因組結(jié)構(gòu)。 盡管TTV是最先在隱源性肝炎患者中鑒定的，但隨后的研究未能產(chǎn)生TTV在肝炎或其他疾病的發(fā)病機(jī)制中之顯著作用的證據(jù)(Hino and Miyata，2007，見上文；Maggi，
F.，and Bendinelli, M. (2009). Immunobiology of the Torque teno viruses and otheranelloviruses. Curr Top Microbiol Immunol 331,65-90 ;0kamoto，2009a，見上文雖然不認(rèn)為人TTV與疾病直接相關(guān)，但最近證明，在定菌豬(gnotobiotic pig)模型中，豬 TTV(PTTV)聯(lián)合豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratorysyndrome virus, PRRSV)感染部分地有助于實(shí)驗(yàn)性誘導(dǎo)豬皮炎與腎病綜合征(porcinedermatitis and nephropathy syndrome, PDNS)(Krakowka, S. ， Hartunian, C. ， Hamberg，A.，Shoup, D.，Rings，M.，Zhang, Y.，Allan，G.，and Ellis, J. A. (2008). Evaluationof induction of porcine dermatitis and nephropathy syndrome in gnotobioticpigs with negative results for porcine circovirus type 2. Am J Vet Res69(12)，1615-22)，并且，豬TTV聯(lián)合PCV2感染還有助于實(shí)驗(yàn)性誘導(dǎo)斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥(postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)(Ellis, J. A.，Allan，G.，andKrakowka, S. (2008). Effect of coinfection with genogroup I porcine torque tenovirus on porcinecircovirus type 2-associated postweaning multisystemic wastingsyndrome in gnotobiotic pigs. Am J Vet Res 69 (12)，1608-14)。這些數(shù)據(jù)表明豬TTV在豬中是致病的。然而，需要使用生物純形式的PTTV病毒進(jìn)一步深入研究以明確表征與PTTV感染相關(guān)的疾病和病變。與人TTV相比，PTTV的基因組信息是非常有限的。目前，僅報(bào)道了來自日本與巴西的豬的一個(gè)全長的和兩個(gè)接近全長的PTTV基因組序列(Niel，C.，Diniz-Mendes, L.，and Devalle, S. (2005). Rolling-circle amplification of Torque teno virus(TTV)complete genomes from human and swine sera and identification of a novel swineTTV genogroup. J Gen Virol86 (Pt 5), 1343-7 ；0kamoto et al. , 2002,見上文)。在三種已知的PTTV毒株中，Sd-ITV31和ITV-Ip毒株聚類形成基因群l(genogroup 1，PITV1)，而TTV-2p 是分類為基因群 2 (genogroup 2，PTTV2)的唯一毒株(Niel et al.，2005，見上文)。然而，在病毒學(xué)的分類學(xué)中，基因群分類是模糊的概念，需要進(jìn)一步的和更準(zhǔn)確的PTTV分類，但這只是在代表多基因型的新PTTV毒株的更多全長基因組序列變得可獲得時(shí)才能進(jìn)行。以前已經(jīng)證明PTTV感染普遍存在于來自6個(gè)不同國家(包括美國、加拿大、西班牙、中國、韓國和泰國)的豬中(McKeown, N. E. , Fenaux, M. , Halbur, P. G. , and Meng,、X. J. (2004). Molecular characterization of porcine TT virus, an orphan virus, inpigs from six different countries. Vet Microbiol 104 (1-2),113-7)。豬TTV在具體豬疾病的發(fā)病機(jī)制中是否發(fā)揮重要的作用仍是有爭議的。在定菌豬模型中，已證明單獨(dú)PTTVl感染不發(fā)生任何臨床疾病，但誘導(dǎo)輕微的組織學(xué)損害(Krakowka, S. and Ellis,J. A. ,2008. Evaluation of the effects of porcine genogroupltorque teno virus in gnotobiotic swine. Am J Vet Res 69,1623-9)。同時(shí)實(shí)驗(yàn)性接種PTTVl和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的定菌豬發(fā)生臨床的豬皮炎與腎病綜合征(PDNS)(Krakowka, S. , Hartunian, C. , Hamberg, A. , Shoup, D. , Rings, M. , Zhang, Y.,Allan, G. and Ellis, J. A. ,2008. Evaluation of induction of porcine dermatitis andnephropathy syndrome in gnotobiotic pigs with negative results for porcinecircovirus type 2. Am J Vet Res 69，1615-22)，而接種 PTTVl 和豬圓環(huán)病毒類型 2 (PCV2)的豬發(fā)生急性斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥(PMWS) (Ellis et al.，2008，見上文)。盡管PCV2被認(rèn)為是臨床PMWS或PCV相關(guān)疾病(PCVAD)的主要病原體，但在西班牙，在具有低PCV2或沒有PCV2的受PMWS侵襲的豬中觀察到了比在未受P麗S侵襲的豬中更高的PTTV2感染的患病率(Kekarainen et al.，2006，見上文)。這些數(shù)據(jù)共同表明豬TTV可充當(dāng)參與觸發(fā)或加重豬中疾病的輔因子。已在被感染豬的豬血清、糞便、唾液、精液和組織樣品中檢測到豬TTV，表明其多樣的傳播途徑，包括水平和垂直傳遞(Kekarainen et al. ,2007,見上文；Pozzuto, T.,Mueller, B. , Meehan, B. , Ringler, S. S. , McIntosh, K. A. , Ellis, J. A. , Mankertz, A. andKrakowka, S. ,2009. In utero transmission of porcine torque teno viruses.VetMicrobiol 137,375-9 ；Sibila, M. , Martinez-Guino, L. , Huerta, E. , Llorens, A. , Mora,M. , Grau-Roma, L. ,Kekaraihen,T. and Segales,J. ,2009. Swine torque teno virus (TTV)infection and excretion dynamics in conventional pig farms. Vet Microbiol 139,213-8)。然而，當(dāng)前對豬TTV感染的檢測主要是基于常規(guī)的PCR測定。到目前為止，尚未建立血清學(xué)測定或病毒培養(yǎng)系統(tǒng)。尤其是已經(jīng)廣泛使用一個(gè)西班牙小組所開發(fā)的分別對PTTVl和PTTV2的UTR中保守區(qū)的嵌套式PCR擴(kuò)增(Kekarainen et al.，2006，見上文)。因?yàn)椴《镜牧亢芸赡芘c臨床疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，如PCV2誘導(dǎo)的PCVAD所證明的那樣(Opriessnig，T. ,Meng,X. J. and Halbur, P. G. , 2007. Porcine circovirus type 2 associated disease update on current terminology,clinical manifestations，pathogenesis，diagnosis，and intervention strategies. J Vet Diagn Invest 19，591-615)，因此與通過常規(guī) PCR測定TTV DNA的存在相比，通過定量實(shí)時(shí)PCR測定豬TTV的病毒負(fù)荷將是重要的。此外，實(shí)時(shí)PCR比常規(guī)PCR更可靠、更迅速并且更廉價(jià)。最近，描述了用于對兩個(gè)豬TTV種進(jìn)行檢測和定量的兩種基于TaqMan探針的實(shí)時(shí)PCR測定(Brassard，J.，Gagne, M. J.，Houde,A.，Poitras，E. and Ward,P.,2009. Development of a real-time TaqMan PCR assay forthe detection of porcine and bovine Torque teno virus. J ApplMicrobiol. Nov 14，2009，印刷版之前的電子版;Gallei，A.，Pesch，S.，Esking, W. S. , Keller, C. and Ohlinger,V. F. ,2009. Porcine Torque teno virus !Determination of viral genomic loads bygenogroup-specific multiplex rt—PCR， detection of frequent multiple infectionswith genogroups I or 2， and establishment of viral full- length sequences.VetMicrobiol. Dec 21，2009，印刷版之前的電子版)?；谔结樀臏y定的主要缺點(diǎn)是，如果探針結(jié)合序列含有突變，則可能獲得假陰性結(jié)果(Anderson，T. P.，Werno, A.M.，Beynon，K. A. and Murdoch,D. R. ,2003. Failure to genotype herpes simplex virus by real-timePCR assay and melting curve analysis due to sequence variation within probebinding sites. J Clin Microbiol 41，2135_7)。鑒于已知的豬TTV毒株之序列之間的高度異質(zhì)性，預(yù)計(jì)PTTV的野生株(field strain)的探針結(jié)合序列中存在變異。盡管特異性相對較低，但基于SYBR green的實(shí)時(shí)PCR是避免這種潛在問題的替代方法，這提供對潛在的豬TTV變體進(jìn)行檢測和定量的通用方法。此外，SYBR green實(shí)時(shí)PCR之后的解鏈曲線分析(melting curve analysis，MCA)確保反應(yīng)的特異性，并且還允許不同類型病毒的多重檢測(Ririe，K. M.，Rasmussen，R. P. and Wittwer, C. T. , 1997. Product differentiationby analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. AnalBiochem 245，154_60)?；贛CA的SYBR green實(shí)時(shí)PCR法已被成功地應(yīng)用于多種人病毒和獸醫(yī)病毒(Gibellini，D.，Gardini, F.，Vitone, F.，Schiavone, P.，F(xiàn)urlini，
G.and Re，M. C.，2006. Simultaneous detection of HCV and HIV-I by SYBR Green realtime multiplex RT—PCR technique in plasma samples. Mol Cell Probes 20，223—9;Martinez, E.，Riera，P.，Sit ja, M.，F(xiàn)ang，Y.，Oliveira, S. and Maldonado，J. , 2008.Simultaneous detection and genotyping of porcine reproductive and respiratorysyndrome virus (PRRSV)by real-time RT-PCR and ampI icon melting curve analysisusing SYBR Green. Res Vet SCi 85，184-93 ；Mouillesseaux, K. P.，Klimpel，K. R. andDhar,A. K. ,2003. Inprovement in the specificity and sensitivity of detection forthe Taura syndrome virus and yellow head virus of penaeid shrimp by increasingthe ampI icon size in SYBR Green real-time RT-PCR. J VirolMethods 111，121-7;Wilhelm,S.，Zimmermann，P.，Selbitz，H. J. and Truyen,U.，2006. Real-time PCR protocolfor the detection of porcine parvovirus in field samples. J Virol Methods 134，257-60)。目前，對PTTV特異性的體液應(yīng)答知之甚少。因?yàn)榛赑CR的測定無法反映豬中PTTV感染的過程，用于測定PTTV血清抗體的高效的酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA)是評價(jià)PTTV的血清陽性率所需的，并幫助表征PTTV在豬疾病中的作用。到目前為止，沒有可用的豬TTV的亞單位疫苗、死疫苗和活疫苗。從不同基因型中表達(dá)重組的PTTV衣殼蛋白用于開發(fā)PTTV亞單位疫苗，以及從不同的基因型構(gòu)建感染性PTTV分子DNA克隆用于在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(該系統(tǒng)用于開發(fā)死疫苗和活疫苗)中繁殖生物純形式的PTTV將是理想的和有利的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供豬細(xì)環(huán)病毒(PTTV)的感染性核酸分子(“感染性DNA克隆”)，其包含編碼感染性PTTV的核酸分子，所述編碼感染性PTTV的核酸分子含有至少一個(gè)拷貝的與選 自PTTVla-VA、PTTVlb-VA, PTTV2b_VA和PTTV2c_VA基因型的基因組序列具有至少80%同源性的基因組序列。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，權(quán)利要求I中所述PTTV的感染性DNA克隆，其中基因組序列選自 SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12 所示序列。本發(fā)明提供含有感染性PTTV基因組的生物功能性質(zhì)?；虿《据d體。本發(fā)明提供以感染性克隆DNA質(zhì)?；虿《据d體轉(zhuǎn)染的合適的宿主細(xì)胞。本發(fā)明提供由以PTTV感染性DNA克隆轉(zhuǎn)染的細(xì)胞所產(chǎn)生的感染性PTTV。本發(fā)明還提供病毒疫苗，其包含非毒性的、生理學(xué)上可接受的載劑(carrier)和免疫原性量的選自以下的成員(a)核酸分子，其含有至少一個(gè)拷貝的與選自PTTV基因型或亞型PTTVla-VA、PTTVlb-VA, PTTV2b_VA和PTTV2c_VA的基因組序列或其互補(bǔ)鏈具有至少80%同源性的基因組序列，(b)含有核酸分子的生物功能性質(zhì)?；虿《据d體，所述核酸分子含有至少一個(gè)拷貝的與選自PTTV基因型或亞型PTTVla-VA、PTTVlb-VA, PTTV2b_VA和PTTV2C-VA的基因組序列或其互補(bǔ)鏈具有至少80%同源性的基因組序列，(c)無毒力的、感染性的非致病性豬細(xì)環(huán)病毒，其含有與選自PTTV基因型或亞型PTTVla-VA、PTTVlb-VA,PTTV2b-VA和PTTV2c-VA的基因組序列具有至少80%同源性的基因組序列。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述疫苗含有源自PTTV感染性克隆的活PTTV病毒。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，所述疫苗含有源自PTTV感染性克隆的死PTTV病毒。本發(fā)明提供在細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中從PTTV基因型或亞型PTTVla-VA、PTTVlb-VA和PTTV2C-VA的ORFl衣殼基因表達(dá)的純化的重組蛋白質(zhì)，以及這些重組衣殼蛋白作為對抗PTTV感染的亞單位疫苗的應(yīng)用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)和其他表達(dá)載體系統(tǒng)中表達(dá)用作亞單位疫苗的重組衣殼蛋白。 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，還含有佐劑。本發(fā)明還提供針對PTTV病毒感染對豬進(jìn)行免疫的方法，其包括向豬施用免疫有效量的病毒疫苗。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述方法包括向豬施用重組的亞單位衣殼蛋白、感染性核酸分子或活PTTV病毒。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述方法包括腸胃外、鼻內(nèi)、皮內(nèi)或經(jīng)皮向豬施用所述疫苗。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述方法包括淋巴內(nèi)或肌內(nèi)向豬施用所述疫苗。
本發(fā)明還提供分離的多核苷酸，其是由SEQ ID NO 9所示PTTVla-VA的核苷酸序列的序列組成的。本發(fā)明還提供分離的多核苷酸，其是由SEQ ID NO: 10所示PTTVlb-VA的核苷酸序列的序列組成的。本發(fā)明還提供分離的多核苷酸，其是由SEQ ID勵(lì)11所示？11^213-￥4的核苷酸序列的序列組成的。本發(fā)明還提供分離的多核苷酸，其是由SEQ ID勵(lì)12所示？!1^2^4的核苷酸序列的序列組成的。本發(fā)明還提供亞單位疫苗，其包含根據(jù)從選自PTTV的基因型或亞型PTTVla-VA、PTTVlb-VA, PTTV2b-VA 和 PTTV2c_VA 的 0RF1、0RF2、0RF1/1 和 0RF2/2 (尤其是編碼衣殼蛋白的0RF1)的多核苷酸序列翻譯的多肽序列的免疫原性片段或完全蛋白質(zhì)(complete protein)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述多核苷酸序列選自PTTV基因型或亞型PTTVla-VA、PTTVlb-VA, PTTV2b-VA 和 PTTV2c_VA 的 ORFl。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述多核苷酸序列是PTTV基因型PTTVla-VA的0RF1。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述多核苷酸序列是PTTV基因型PTTVlb-VA的ORFl。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述多核苷酸序列是PTTV亞型PTTV2C-VA的ORFl。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述多肽序列選自SEQ ID No : 13、SEQ IDNo : 14、SEQ IDNo :15、SEQ ID No :16、SEQ ID No :17、SEQ ID No :18、SEQ ID No :19、SEQ ID No :20、SEQID No :21、SEQ ID No :22、SEQ IDNo 23,SEQ ID No 24,SEQ ID No 25,SEQ ID No 26,SEQID No 27 和 SEQ ID No :28 所示序列。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述多肽序列示于SEQ ID No :13中。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述多肽序列示于SEQ ID No:14中。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述多肽序列示于SEQ ID No:16中。在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述多肽序列是SEQ ID No:16的C-末端區(qū)域(aa(氨基酸)310 625)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，SEQ ID No :20中列出所述多肽序列。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述疫苗還含有佐劑。本發(fā)明還提供免疫接種豬以對抗PTTV病毒感染的方法，其包括向豬施用免疫有效量的疫苗，所述疫苗包含根據(jù)從選自PTTV的基因型或亞型PTTVla-VA、PTTVlb-VA,PTTV2b-VA和PTTV2c-VA的0RF1、0RF2、0RF1/1和0RF2/2的多核苷酸序列翻譯的多肽序列的免疫原性片段或完整的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述方法包括向豬施用免疫原性片段或重組的衣殼蛋白。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述方法包括腸胃外、鼻內(nèi)、皮內(nèi)或經(jīng)皮向豬施用所述疫苗。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述方法包括淋巴內(nèi)或肌內(nèi)向豬施用所述疫苗。本發(fā)明還提供用于診斷PTTVl感染和對PTTVl負(fù)荷進(jìn)行定量的方法，其包括從懷疑感染PTTVl的樣品中提取DNA，使用包含SEQ IDNO 29和SEQ ID NO 30所示序列的引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，以及檢測PTTVl特異性擴(kuò)增。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是SYBR green實(shí)時(shí)PCR。
本發(fā)明還提供用于診斷PTTV2感染和對PTTV2負(fù)荷進(jìn)行定量的方法，其包括從懷疑感染PTTV2的樣品中提取DNA，使用包含SEQ IDNO 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO :31和SEQ ID NO 32所示序列的引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，以及檢測PTTV2特異性擴(kuò)增。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是SYBR green實(shí)時(shí)PCR。本發(fā)明還提供用于同時(shí)檢測和診斷PTTVl和PTTV2感染的方法，其包括從懷疑PTTV感染的樣品中提取DNA，使用包含SEQ ID NO :31和SEQ ID NO :32所示序列的引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，以及檢測PTTVl和PTTV2的特異性擴(kuò)增。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是SYBR green實(shí)時(shí)PCR。本發(fā)明還提供用于同時(shí)檢測和診斷PTTVla和PTTVlb感染的方法，其包括從懷疑PTTVl感染的樣品中提取DNA，使用包含SEQ ID N0:33和SEQ ID NO :34所示序列的引物進(jìn)行第一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，使用包含SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO 37和SEQ ID NO 38所示序列的引物進(jìn)行第二 PCR，以及檢測PTTVla和PTTVlb特異性擴(kuò)增。本發(fā)明提供用于診斷PTTV感染的方法，其包括使根據(jù)選自PTTV亞型PTTVIa-VA,PTTVIb-VA,PTTV2b-VA 和 PTTV2c_VA 的 0RF1、0RF2、0RF1/1 和 0RF2/2 的多核苷酸序列翻譯的多肽序列的免疫原性片段固定化，使來自懷疑PTTV感染的豬的血清樣品與所述固定化的免疫原性片段接觸，以及檢測所捕獲的對免疫原性片段特異性的抗體。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述多核苷酸序列選自PTTV基因型或亞型PTTVla-VA、PTTVlb-VA, PTTV2b-VA 和 PTTV2c_VA 的 ORFl。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述多核苷酸序列是PTTV基因型PTTVla-VA的0RF1。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，所述多核苷酸序列是PTTV基因型PTTVlb-VA的0RF1。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，所述多核苷酸序列是PTTV亞型PTTV2C-VA的ORFl。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述多肽序列選自SEQ ID No :13、SEQID No :14、SEQID No :15、SEQ ID No :16、SEQ ID No :17、SEQ ID No :18、SEQ ID No :19、SEQ ID No :20、SEQ ID No :21、SEQ ID No :22、SEQ IDNo :23、SEQ ID No :24、SEQ ID No :25、SEQ ID No 26、SEQ ID No 27 和 SEQ ID No 28 所示序列。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述多肽序列示于SEQ ID No:13中。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述多肽序列示于SEQ ID No:14中。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，所述多肽序列示于SEQ ID No:16中。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，所述免疫原性片段是SEQID No 16的C-末端區(qū)域(aa 310 625)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，所述多肽序列示于 SEQID No 20 中。本發(fā)明提供三種標(biāo)準(zhǔn)化的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)以診斷PTTV感染和檢測被PTTV基因型PTTVla-VA、PTTVlb-VA以及PTTV種2的全部已知的亞型所感染的豬血清中的抗體。ELISA診斷測試是基于細(xì)菌表達(dá)的或桿狀病毒表達(dá)的重組的PTTV基因型PTTVla-VA、PTTVlb-VA 和 PTTV2c_VA 的 ORFl 衣殼蛋白。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，通過Western印記檢測所捕獲的抗體。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測所捕獲的抗體。


通過與附圖一起閱讀以下對本發(fā)明的詳細(xì)描述，將會(huì)更清楚地理解本發(fā)明的上述特征，其中圖IA和IB表示豬TTV病毒的群I (種I)和群2 (種2)毒株的4種原型U. S.毒株之基因組結(jié)構(gòu)、基因組克隆策略和裝配的示意圖；圖2表示GenBank數(shù)據(jù)庫中可獲得的121TTV毒株之核苷酸序列對比的PASC(序列配對比校，Mirwise sequence comparisons)分布。展示了屬、種、類型、亞型和變體及其相應(yīng)的核苷酸序列同一丨I"生的百分率；圖3A圖解通過基于全長基因組核苷酸序列的鄰接法(neighbor-joiningmethod)構(gòu)建的系統(tǒng)樹(phylogenetic tree)；圖3B圖解基于7種豬TTV毒株之中ORFl的推定的氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹；、
圖3C圖解基于7種豬TTV毒株之中0RF1/1的推定的氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹；圖3D圖解基于7種豬TTV毒株之中0RF2的推定的氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹；圖3E圖解基于7種豬TTV毒株之中0RF2/2的推定的氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹；圖4表示I種PTTV毒株之中ORFl的全長氨基酸序列的比對；圖5表示7種PTTV毒株之中0RF2的全長氨基酸序列的比對；圖6A圖解各自的標(biāo)準(zhǔn)模板(以藍(lán)色表示)和20個(gè)豬血清樣品經(jīng)40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增之后的PTTVl實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)物的解鏈曲線；圖6B圖解各自的標(biāo)準(zhǔn)模板和20個(gè)豬血清樣品經(jīng)40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增之后的PTTV2實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)物的解鏈曲線；圖7A 7E圖解PTTV1/PTTV2基于SYBR green的雙鏈體實(shí)時(shí)RCR的解鏈曲線分析(melting curve analysis, MCA)。圖8表示位于7種PTTV毒株之中推定的ORFl的N-末端部分之核苷酸序列的比對；圖9A和9B表示4種已知的豬TTV2的親水性分布圖和保守區(qū)；圖10A 10C圖解重組PTTV2c ORFl衣殼蛋白的表達(dá)和純化；圖IlA IlC顯示所選擇的豬血清樣品之Western印記分析的代表性結(jié)果；圖12圖解基于PTTV2C-0RF1的Wentern印記與ELISA的一致性；圖13顯示PTTV2血清抗體水平相對于來自不同來源的138只豬中病毒負(fù)荷的盒須圖(Box-and-Whisker-plot)。圖14A圖解PTTV2病毒負(fù)荷的回顧性評價(jià)；圖14B圖解從到達(dá)養(yǎng)至到達(dá)之后2個(gè)月的10只豬中PTTV2 ORFl衣殼蛋白的抗體水平；圖15A 15C圖解PTTVla和PTTVlb重組ORFl衣殼蛋白的表達(dá)和純化；以及圖16顯示從威斯康星的農(nóng)場所選擇的豬血清樣品的基于PTTVla-ORFl的Western印記分析的實(shí)例。
具體實(shí)施例方式根據(jù)本發(fā)明，在一個(gè)具體的實(shí)例中，前述4種新的豬TTV亞型是從弗吉尼亞的個(gè)體公豬(boar)中分離的。
在圖IA中，以粗體顯示PTTVl和PTTV2的基因組，并以箭頭指示4種推定的0RF(0RF1、0RF2、0RF1/1和0RF2/2)的大小和方向。還顯示了富含GC的區(qū)域。虛線弧A和D分別表示用于通過嵌套式PCR從血清和精液樣品中檢測PTTVl和PTTV2的區(qū)域。虛線弧B和C表示用于PTTVl之基因組克隆的兩個(gè)重疊的PCR片段，而虛線弧E和F表示用于PTTV2之基因組克隆的兩個(gè)重疊的PCR片段。還在相應(yīng)的位置顯示用于研究之引物(見表I)的位置。將第一輪PCR中表現(xiàn)出PTTVl與PTTV2陽性(因此，指示較高的病毒負(fù)荷)的一個(gè)公豬血清樣品(SR#5)用于隨后PTTV的全長基因組克隆。出人意料地是，應(yīng)用設(shè)計(jì)用于克隆第一 PTTV毒株Sd-TTV31以擴(kuò)增病毒基因組DNA的反向PCR(Okamoto et al. ,2002,見上文)的兩組引物(NG372/NG373和NG384/NG385)以擴(kuò)增病毒基因組DNA的初始嘗試并不成功。多次試驗(yàn)之后，未獲得PCR產(chǎn)物?；赑TTVl的區(qū)域A和PTTV2的區(qū)域D的初始序列，隨后分別設(shè)計(jì)兩對新引物(TTVl-If (SEQID NO :1)/TTV1-2340R(SEQ ID NO 2) 和 ITV1-2311F(SEQ IDNO 3)/TTVl-IR(SEQ ID NO :4))以擴(kuò)增跨越推測的 PTTVl 基因組的區(qū)域 B 和 C，以及其他兩對引物(TTV2-IF(SEQ ID NO 5)/TTV2-2316R(SEQID NO :6)和TTV2-GCF(SEQ ID NO 7)/TTV2-IR(SEQ ID NO :8))以擴(kuò)增跨越推測的PTTV2基因組的區(qū)域E 和 F(圖 IA 和表 I)。引物 TTV1-2340R(SEQ ID NO 2)和 ITV1-2311F(SEQ ID NO 3)是從PITVl 毒株 Sd-TTV31 (Okamoto et al.，2002，見上文)和 TTV-lp (Niel et al. ,2005)的共有序列(在PTTV2毒株TTV-2p(Niel et al.，2005，見上文)中不存在)中推出的，而引物TTV2-2316R(SEQ ID NO 6)和 TTV2-GCF (SEQ IDNO 7)是從毒株 TTV_2p 的序列(在這兩種PTTVl毒株中不存在)中推出的。將具有預(yù)期大小的所產(chǎn)生的4種不同的PCR產(chǎn)物各自插入平端克隆載體，并且將所產(chǎn)生的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌(Escherichia coli)。為代表片段B、C、E和F的每種構(gòu)建體鑒定8至15個(gè)陽性(具有白顏色)細(xì)菌克隆，并隨后測序。表I.用于擴(kuò)增豬TT病毒的嵌套式PCR和基因組PCR的寡核苷酸引物引抽ID序列(5，至3，)用于
^SEQIDNOiag) TACACTTCCGGGTTCAGGAGGCT檢測豬 TTVl
SsQSDNO^d) ACTCAGCCATTCGGAACCTCAC檢測豬丁TVl
S^QIIDHO-^) CAATTTGGCTCGCTTCGCTCGC檢'測豬 TTVl
TACTTATATTCGCTTTCGTGGGAAC檢測豬 TTVl
(SEQ ID NO:4B)
SqIIDNO^ ) AGTTACACATAACCACCAAACC檢測豬 TTV2 (SEQIDNOrSO) ATTACCGCCTGCCCGATAGGC檢^!豬 TTV2
CCAAACCACAGGAAACTGTGC檢測豬 TTV2
(SLQ ID NO:51}
,、CTTOACTCCGCTCTCAGGAG檢測豬 TTV2(SEQ ID NO:52)
(SEQ IDNO'l) CATAGGGTGTAACCAATCAGATTTAAGGCGTT 基因組克隆(片段B)
GGTCATCAGACGATCCATCTCCCTCAG基因組克隆(片段B)
(SEQ ID >40:2)
^seq^dnoo) cttctgacjggagatggatcgtctcatga基因組克隆(片段 C)
JpN0;4) TTGAGCTCCCGACCAATCAGAATTGACT基因組克隆(片段C)
Seqid no5) ttgtgccggagctcctgagagc基因組克隆(片段 E)出人意料地是，鑒定到了來自每種構(gòu)建體的兩組序列數(shù)據(jù)，表明同一豬中存在基因群I和基因群2的兩種類型的PTTV。為了區(qū)分和裝配4種PTTV毒株，與三種已知的PTTV毒株(Sd-TTV31、TTV-Ip和TTV_2p) —起進(jìn)行序列對比(圖IB和1C)。圖IB圖解隨后克隆的具有PCR片段B和C的PTTVl毒株P(guān)TTVla-VA和PTTVlb-VA之全長基因組序列的區(qū)分和裝配。以或標(biāo)記片段B中ORFl和0RF2的起始密碼子以及片段C中ORFl的終止密碼子。還顯示了兩種已知的PTTVl毒株(Sd-TTV31和TTV-lp)的相應(yīng)的序列。陰影部分是保守序列，且虛線表示核苷酸缺失。對于PTTVl，推定的ORFl的起始密碼子ATG和終止密碼子TGA分別位于片段B和C(圖1B)。所述密碼子的位置在兩個(gè)PTTVl組中有所不同，第一個(gè)與Sd-TTV31相同，而第二個(gè)與TTV-Ip相同(圖1B)。此外，0RF2起始密碼子在所述兩個(gè)群中也位于與ORFl的相一致的不同位置。此外，使用區(qū)域B的4種不同序列(兩種來自測序數(shù)據(jù)，兩種來自毒株Sd-TTV31和TTV-lp)和區(qū)域C的4種不同序列的系統(tǒng)發(fā)生分析(phylogenetic analysis)支持第一序列與Sd-TTV31類聚，以及第二序列與TTV-Ip類聚(未顯示數(shù)據(jù))。因此，我們能夠從片段B和C區(qū)分和裝配兩組序列數(shù)據(jù)成為兩個(gè)分別作為毒株P(guān)TTVla-VA (SEQ ID NO9)和PTTVlb-VA (SEQ ID NO 10)而設(shè)計(jì)的全長PTTVl基因組(圖1B)。圖IC圖解區(qū)分和裝配隨后克隆的具有PCR片段E和F的PTTV2毒株P(guān)TTV2b-VA和PTTV2c-Va的全長基因組序列。包括TTV_2p毒株的相應(yīng)序列，且陰影部分是保守序列。虛線表示核苷酸缺失。分別顯示了每種毒株的重疊區(qū)域(用虛線框出)內(nèi)的獨(dú)特核苷酸(對于 PTTV2b-VA (SEQ ID NO :11)是連續(xù)的 “AG” 核苷酸，而對于 PITV2c-VA (SEQ IDNO :12)是兩個(gè)單獨(dú)的“A”和“G”核苷酸)。區(qū)分兩種PTTV2毒株是較容易的。分別來自片段E和F的兩組序列數(shù)據(jù)共有位于兩個(gè)PCR片段之重疊區(qū)域的獨(dú)特的連續(xù)“AG”核苷酸(圖1C)。所裝配的全長基因組序列代表 PTTV2 毒株，命名為 PTTV2b-VA (SEQ ID NO : 11)。類似地，命名為 PTTV2c_VA (SEQ IDNO 12)的第二毒株的完整基因組序列是基于分別來自片段E和F的另一套序列數(shù)據(jù)在重疊區(qū)域中所共有的兩個(gè)獨(dú)特的單個(gè)“A”和“G”核苷酸而裝配的(圖1C)。使用來自片段E和F的4種序列以及來自TTV-2p的兩個(gè)相應(yīng)序列的系統(tǒng)發(fā)生分析也支持該定位(未顯示數(shù)據(jù))。本發(fā)明提供與豬中病毒感染相關(guān)的4種分離的豬TTV病毒基因型或亞型。本發(fā)明包括但不限于豬TTV病毒基因型或亞型PTTVla-VA、PTTVlb-VA, PTTV2b_VA和PTTV2c_VA，所述病毒基因型或亞型具有 SEQ ID NO 9 (PTTVla-VA), SEQ ID NO : 10 (PTTVlb-VA)、SEQIDNO ll(PTTV2b-VA)和SEQ ID NO : 12 (PTTV2c_VA)所示核苷酸序列、其功能等同物或互補(bǔ)、鏈。要理解的是，源自任何豬TTV的具體的核苷酸序列將具有天然存在于個(gè)體病毒之間的輕度變異。序列中的這些變異可見于缺失、替換、插入等。詳細(xì)地分析了 4種PTTV毒株中每一種的所提出的基因組結(jié)構(gòu)，并與3種已知的PTTV毒株(Sd-TTV31、TTV-lp和TTV-2p) —起總結(jié)在表2中。所有這4種PTTV的U. S.毒株均具有類似的基因組大小，分別為 2，878bp (PTTVla-VA SEQ ID NO :9)、2，875bp (PTTVlb-VASEQ IDNO :10)、2，750bp(PTTV2b-VA SEQ ID NO :11)和2，803bp (PTTV2c_VASEQ ID NO :12)。PTTVla-VA (SEQ ID NO :9)和Sd_TTV31均具有相同的基因組長度。所發(fā)表的毒株TTV-lp和TTV-2p的序列在UTR的富含GC的區(qū)域中均具有很多未確定的核苷酸。用對應(yīng)于PTTVl和PTTV2的共有序列人工填充這些核苷酸之后，分別表明，在基因組長度上，TTV-Ip與PTTVlb-VA (SEQ ID NO 10)更緊密地相關(guān)，且 ITV-2p 與 PTTV2b_VA (SEQ ID NO :11)更緊密地相關(guān)(未顯示數(shù)據(jù))。分別以登陸號⑶456383、⑶456384、⑶456385和⑶456386將所裝配的豬TTV病毒基因型或亞型 PTTVla-VA (SEQ ID NO :9)、PTTVlb-VA (SEQ ID NO 10), PTTV2b-VA (SEQ IDNO :11)和 PTTV2c-VA(SEQ ID NO :12)的基因組序列提交至Genbank (Nucleic AcidsResearch,2008 Jan ；36 (Database issue) :D25_30)。表2. 7種豬TTV毒株之基因組組織和ORF的比較
權(quán)利要求
1.豬細(xì)環(huán)病毒(PTTV)的感染性核酸分子，其包含編碼感染性PTTV的核酸分子，所述編碼感染性PTTV的核酸分子含有至少一個(gè)拷貝的與選自PTTVla-VA、PTTVlb-VA, PTTV2b_VA和PTTV2c-VA的基因組序列具有至少85%同源性的基因組序列。
2.權(quán)利要求I的感染性核酸分子，其中所述至少一個(gè)拷貝的基因組序列與選自PTTVla-VA、PTTVlb-VA, PTTV2b_VA和PTTV2c_VA的基因組序列具有至少95%的同源性。
3.權(quán)利要求I的感染性核酸分子，其中所述基因組序列選自SEQIDNO :9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO : 11 和 SEQ ID NO 12 所示序列。
4.生物功能性質(zhì)粒或病毒載體,其含有根據(jù)權(quán)利要求3的感染性核酸分子。
5.權(quán)利要求4的生物功能性質(zhì)粒或病毒載體，其含有超過一個(gè)拷貝的所述感染性核酸分子。
6.以根據(jù)權(quán)利要求4的包含感染性核酸分子的載體轉(zhuǎn)染的合適的宿主細(xì)胞。
7.無毒力的感染性PTTV，其是由根據(jù)權(quán)利要求6的含有感染性核酸分子的細(xì)胞所產(chǎn)生的。
8.疫苗，其包含無毒性的、生理學(xué)上可接受的載體和免疫原性量的選自以下的成員 (a)核酸分子，其含有至少一個(gè)拷貝的與選自PTTV基因型或亞型PTTVla-VA、PTTVlb-VA、PTTV2b-VA和PTTV2c_VA的基因組序列或其互補(bǔ)鏈具有至少80%同源性的基因組序列； (b)含有核酸分子的生物功能性質(zhì)?；虿《据d體，所述核酸分子含有至少一個(gè)拷貝的與選自PTTV基因型或亞型PTTVla-VA、PTTVlb-VA, PTTV2b_VA和PTTV2c_VA的基因組序列或其互補(bǔ)鏈具有至少80%同源性的基因組序列； (c)無毒力的、感染性的非致病性豬細(xì)環(huán)病毒，其來源于與選自PTTV基因型或亞型PTTVla-VA、PTTVlb-VA、PTTV2b-VA和PTTV2c_VA的基因組序列具有至少85%同源性的基因組序列，并含有該序列；以及 (d)根據(jù)選自PTTV 基因型或亞型 PTTVla-VA、PTTVlb-VA, PTTV2b-VA 和 PTTV2c_VA 的0RF1、0RF2、0RF1/1和0RF2/2的多核苷酸序列翻譯的多肽序列的免疫原性片段或完全蛋白質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的疫苗，其中所述疫苗含有活PTTV病毒。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的疫苗，其中所述疫苗含有死PTTV病毒。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的疫苗，其中所述多肽序列的免疫原性片段或完全蛋白質(zhì)包含純化的細(xì)囷表達(dá)的或桿狀病毒表達(dá)的重組蛋白質(zhì)，所述重組蛋白質(zhì)表達(dá)自PTTV基因型或亞型 PTTVla-VA、PTTVlb-VA, PTTV2b-VA 和 PTTV2c_VA 的 0RF1、0RF2、0RF1/1 和 0RF2/2。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的疫苗，其中所述多肽序列的免疫原性片段或完全蛋白質(zhì)包含純化的細(xì)囷表達(dá)的或桿狀病毒表達(dá)的重組蛋白質(zhì)，所述重組蛋白質(zhì)表達(dá)自PTTV基因型或亞型 PTTVla-VA、PTTVlb-VA, PTTV2b-VA 和 PTTV2c_VA 的 ORFl。
13.根據(jù)權(quán)利要求8的疫苗，其還含有佐劑。
14.針對PTTV病毒感染對豬進(jìn)行免疫的方法，其包括向豬施用免疫有效量的根據(jù)權(quán)利要求8的疫苗。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其包括腸胃外、鼻內(nèi)、皮內(nèi)或經(jīng)皮向豬施用所述疫苗。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其包括淋巴內(nèi)或肌內(nèi)向豬施用所述疫苗。
17.分離的多核苷酸，其是由與SEQID NO :9所示PTTVla-VA的核苷酸序列具有85%同源性的多核酸序列組成的。
18.權(quán)利要求17的分離的多核苷酸，其中所述多核酸序列與SEQIDNO :9所示PTTVla-VA的核苷酸序列具有95%的同源性。
19.權(quán)利要求17的分離的多核苷酸，其中所述多核酸序列是由SEQIDN0:9所示PTTVla-VA的核苷酸序列組成的。
20.分離的多核苷酸，其是由與SEQID NO : 10所示PTTVlb-VA的核苷酸序列具有85%同源性的多核酸序列組成的。
21.權(quán)利要求20的分離的多核苷酸，其中所述多核酸序列與SEQIDN0:10所示PTTVlb-VA的核苷酸序列具有95%的同源性。
22.權(quán)利要求20的分離的多核苷酸，其中所述多核酸序列是由SEQIDN0:10所示PTTVlb-VA的核苷酸序列組成的。
23.分離的多核苷酸，其是由與SEQID勵(lì)11所示？117213-￥4的核苷酸序列具有85%同源性的多核酸序列組成的。
24.權(quán)利要求23的分離的多核苷酸，其中所述多核酸序列與SEQIDN0:11所示PTTV2b-VA的核苷酸序列具有95%的同源性。
25.權(quán)利要求23的分離的多核苷酸，其中所述多核酸序列是由SEQIDNO :11所示PTTV2b-VA的核苷酸序列組成的。
26.分離的多核苷酸，其是由與SEQID NO :12所示PTTV2C-VA的核苷酸序列具有85%同源性的多核酸序列組成的。
27.權(quán)利要求23的分離的多核苷酸，其中所述多核酸序列與SEQIDN0:12所示PTTV2C-VA的核苷酸序列具有95%的同源性。
28.權(quán)利要求23的分離的多核苷酸，其中所述多核酸序列是由SEQIDN0:12所示PTTV2C-VA的核苷酸序列組成的。
29.疫苗，其包含根據(jù)選自PTTV基因型或亞型PTTVla-VA、PTTVlb-VA,PTTV2b_VA和PTTV2c-VA的0RF1、0RF2、0RF1/1和0RF2/2的多核苷酸序列翻譯的多肽序列的免疫原性片段或完全蛋白質(zhì)。
30.權(quán)利要求29的疫苗，其中所述免疫原性片段或完全蛋白質(zhì)是PTTV基因型或亞型PTTVla-VA、PTTVlb-VA, PTTV2b-VA 和 PTTV2c_VA 的衣殼蛋白。
31.權(quán)利要求29的疫苗，其中所述多核苷酸序列選自PTTV基因型或亞型PTTVla-VA、PTTVlb-VA, PTTV2b-VA 和 PTTV2c_VA 的 ORFl。
32.權(quán)利要求31的疫苗，其中所述多核苷酸序列是PTTV基因型PTTVla-VA的ORFl。
33.權(quán)利要求31的疫苗，其中所述多核苷酸序列是PTTV基因型PTTVlb-VA的ORFl。
34.權(quán)利要求31的疫苗，其中所述多核苷酸序列是PTTV亞型PTTV2C-VA的ORFl。
35.權(quán)利要求29的疫苗，其中所述多肽序列選自SEQID No :13、SEQID No :14、SEQ IDNo 15, SEQ ID No :16、SEQ ID No :17、SEQ ID No :18、SEQ ID No :19、SEQ ID No :20、SEQID No :21、SEQ ID No :22、SEQ IDNo 23,SEQ ID No 24,SEQ ID No 25,SEQ ID No 26,SEQID No 27 和 SEQ ID No :28 所示序列。
36.權(quán)利要求35的疫苗，其中所述多肽序列示于SEQID No :13中。
37.權(quán)利要求36的疫苗，其中所述多肽序列是SEQID No : 13的C-末端區(qū)域(aa 317 635)。
38.權(quán)利要求35的疫苗，其中所述多肽序列示于SEQID No : 14中。
39.權(quán)利要求38的疫苗，其中所述多肽序列是SEQID No : 14的C-末端區(qū)域(aa 322 639)。
40.權(quán)利要求35的疫苗，其中所述多肽序列示于SEQID No 16中。
41.權(quán)利要求40的疫苗，其中所述多肽序列是SEQID No : 16的C-末端區(qū)域(aa 310 625)。
42.權(quán)利要求35的疫苗，其中所述多肽序列示于SEQID No 20中。
43.根據(jù)權(quán)利要求29的疫苗，其還含有佐劑。
44.免疫接種豬以對抗PTTV病毒感染的方法，其包括向豬施用免疫有效量的根據(jù)權(quán)利要求29的疫苗。
45.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其包括向豬施用所述免疫原性片段或完整的蛋白質(zhì)。
46.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其包括腸胃外、鼻內(nèi)、皮內(nèi)或經(jīng)皮向豬施用所述疫苗。
47.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其包括淋巴內(nèi)或肌內(nèi)向豬施用所述疫苗。
48.用于診斷PTTVl感染和對PTTVl負(fù)荷進(jìn)行定量的方法，其包括 從懷疑PTTVl感染的樣品中提取DNA ； 使用包含SEQ ID NO:29和SEQ ID NO :30所示序列的引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)；以及 檢測PTTVl特異性的擴(kuò)增。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是SYBRgreen實(shí)時(shí)PCR。
50.用于診斷PTTV2感染和對PTTV2負(fù)荷進(jìn)行定量的方法，其包括 從懷疑PTTV2感染的樣品中提取DNA ； 使用包含 SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO 31 和 SEQ ID NO 32 所示序列的引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR);以及檢測PTTV2特異性的擴(kuò)增。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是SYBRgreen實(shí)時(shí)PCR。
52.用于同時(shí)檢測和診斷PTTVl和PTTV2感染的方法，其包括 從懷疑PTTV感染的樣品中提取DNA ； 使用包含SEQ ID NO:31和SEQ ID NO :32所示序列的引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)；以及 檢測PTTVl和PTTV2特異性的擴(kuò)增。
53.權(quán)利要求52的方法，其中所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是SYBRgreen實(shí)時(shí)PCR。
54.用于同時(shí)檢測和診斷PTTVla和PTTVlb感染的方法，其包括 從懷疑PTTVl感染的樣品中提取DNA ； 使用包含SEQ ID NO:33和SEQ ID NO :34所示序列的引物進(jìn)行第一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)； 使用包含 SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO 37 和 SEQ ID NO 38 所示序列的引物進(jìn)行第二 PCR;以及檢測PTTVla和PTTVlb特異性的擴(kuò)增。
55.用于診斷PTTV感染的方法，其包括 使根據(jù)選自 PTTV 亞型 PTTVla-VA、PTTVlb-VA、PTTV2b-VA 和 PTTV2c_VA 的 0RF1、0RF2、0RF1/1和0RF2/2的多核苷酸序列翻譯的多肽序列的免疫原性片段或完全蛋白質(zhì)固定化； 使來自懷疑PTTV感染的豬的血清樣品與所述固定化的免疫原性片段或完全蛋白質(zhì)接觸；以及 檢測所捕獲的對所述免疫原性片段具有特異性的抗體。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所述多核苷酸序列選自PTTV基因型或亞型PTTVla-VA、PTTVlb-VA, PTTV2b-VA 和 PTTV2c_VA 的 ORFl。
57.權(quán)利要求56的疫苗，其中所述多核苷酸序列是PTTV基因型PTTVla-VA的ORFl。
58.權(quán)利要求56的方法，其中所述多核苷酸序列是PTTV基因型PTTVlb-VA的ORFl。
59.權(quán)利要求56的方法，其中所述多核苷酸序列是PTTV亞型PTTV2C-VA的ORFl。
60.權(quán)利要求55的方法，其中所述多肽序列選自SEQID No :13、SEQ ID No :14、SEQID No 15,SEQ ID No :16、SEQ ID No :17、SEQ IDNo :18、SEQ ID No :19、SEQ ID No 20,SEQID No 2U SEQ ID No :22、SEQ ID No :23、SEQ ID No :24、SEQ ID No :25、SEQ ID No :26、SEQ IDNo 27 和 SEQ ID No :28 所示序列。
61.權(quán)利要求60的方法，其中所述多肽序列示于SEQID No : 13中。
62.權(quán)利要求60的疫苗，其中所述多肽序列示于SEQID No : 16中。
63.權(quán)利要求62的疫苗，其中所述免疫原性片段是SEQID No : 13 (aa317 635)、SEQID No 14(aa 322 639)或 SEQ ID No 16(aa 310 625)的 C-末端區(qū)域。
64.權(quán)利要求60的疫苗，其中所述多肽序列示于SEQID No:20中。
65.權(quán)利要求55的方法，其中通過Western印記檢測所捕獲的抗體。
66.權(quán)利要求55的方法，其中通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測所捕獲的抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供4種純化的制品，所述制品含有編碼豬細(xì)環(huán)病毒(PTTV)基因型或亞型PTTV1a-VA、PTTV1b-VA、PTTV2b-VA和PTTV2c-VA的多核酸分子。本發(fā)明還提供含有這種感染性核酸基因組分子的感染性DNA克隆、生物功能性質(zhì)?；虿《据d體。本發(fā)明還提供用于防止PTTV感染的活疫苗、減毒疫苗、載體表達(dá)的和純化的重組衣殼亞單位疫苗或者死病毒疫苗。本發(fā)明還提供用于防止PTTV感染的包含PTTV特異性基因產(chǎn)物(尤其是ORF1衣殼基因產(chǎn)物)的亞單位疫苗。此外，本發(fā)明提供通過使用PTTV1、PTTV2和個(gè)體PTTV1基因型之特異性引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來診斷PTTV感染的方法。最后，本發(fā)明提供通過免疫學(xué)方法(例如，用于檢測血清PTTV特異性抗體的使用PTTV特異性抗原的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)和Western印記)來診斷PTTV感染的方法。
文檔編號C12Q1/68GK102712930SQ201080047299
公開日2012年10月3日 申請日期2010年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月21日
發(fā)明者孟祥錦, 黃耀偉 申請人:弗吉尼亞理工大學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)公司