專利名稱：纖維二糖水解酶變體及編碼其的多核苷酸的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及纖維二糖水解酶II的變體，編碼所述變體的多核苷酸，產(chǎn)生所述變體的方法和使用所述變體的方法。
背景技術：
纖維素是單糖葡萄糖通過β-1，4-鍵共價連接的聚合物。許多微生物產(chǎn)生水解 β-連接的葡聚糖的酶。這些酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶。內(nèi)切葡聚糖酶在隨機位置消化纖維素聚合物，使其暴露于纖維二糖水解酶攻擊(attack)。纖維二糖水解酶繼而從纖維素聚合物的末端釋放纖維二糖的分子。纖維二糖是水溶性的β-ι， 4-連接的葡萄糖二聚體。β -葡糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖。將含木素纖維素原料(lignocellulosic feedstock)轉(zhuǎn)化為乙醇具有以下優(yōu)勢 大量原料現(xiàn)成可用，避免燃燒或填埋材料的合意性和乙醇燃料的清潔性。木材、農(nóng)業(yè)殘余物、草本作物和城市固體廢物被認為是用于乙醇生產(chǎn)的原料。這些材料主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。一旦將纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖，葡萄糖容易地由酵母發(fā)酵成乙醇。WO 2006/074005 公開了紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina)纖維二糖水解酶 II 的變體。Heinzelman 等，2009, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 106 :5610-5615公開了由結構導向的重組所構建的熱穩(wěn)定性真菌纖維素酶的家族。 Heinzelman等，2009，Journal of Biological Chemistry 284，262四_26233 公開了有助于真菌纖維素酶穩(wěn)定性的單個突變。在本領域中，提高具有纖維二糖水解酶活性的多肽改善木素纖維素原料的酶降解的能力是有利的。本發(fā)明提供了與其親本相比具有增加的熱穩(wěn)定性的親本纖維二糖水解酶II的變體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及親本纖維二糖水解酶II的分離的變體，其在一個或多個(幾個)對應于SEQ ID NO 2的成熟多肽的位置272、287、325、347、357、363、409、464和476的位置處包含取代，其中所述變體具有纖維二糖水解酶Π活性。在一個方面，所述分離的變體進一步在對應于SEQ ID NO 2的成熟多肽的位置435的位置包含取代。
本發(fā)明還涉及編碼所述變體的分離的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸構建體、載體和宿主細胞；和產(chǎn)生所述變體的方法。本發(fā)明還涉及降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，包括在本發(fā)明的具有纖維二糖水解酶II的變體的存在下用酶組合物處理纖維素材料。在一個方面，所述方法進一步包括回收經(jīng)降解或轉(zhuǎn)化的纖維素材料。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括(a)在本發(fā)明的具有纖維二糖水解酶 II活性的變體的存在下用酶組合物糖化纖維素材料；(b)用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵經(jīng)糖化的纖維素材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(C)從所述發(fā)酵回收發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及發(fā)酵纖維素材料的方法，包括用一種或多種(幾種)發(fā)酵微生物發(fā)酵纖維素材料，其中將所述纖維素材料在本發(fā)明的具有纖維二糖水解酶活性II的變體的存在下用酶組合物糖化。


圖1顯示了野生型土生梭孢霉(Thielavia terrestris)家族GH6A纖維二糖水解酶II和土生梭孢霉家族GH6A纖維二糖水解酶II的幾種變體在100mMNaCl-50mM乙酸鈉pH 5. 0中在67°C進行20分鐘后的殘余活性的比較。定義纖維二糖水解酶術語“纖維二糖水解酶”意指l，4-i3_D-葡聚糖纖維二糖水解酶(l，4-beta-D-glucan cellobiohydrolase) (Ε. C. No. 3. 2. 1. 91)，其催化纖維素、纖維素寡糖，或任何包含β-1，4-連接的葡萄糖的聚合物中的1，4-β-D-糖苷鍵的水解，從鏈的還原或非還原末端釋放纖維二糖(Teeri，1997，Crystalline cellulose degradation :New insight into the function of ce1lobiohydrolases, Trends in Biotechnology 15 160-167 ;Teeri 等，1998, Trichoderma reesei cellobiohydrolases :why so efficient on crystalline cellulose ？ , Biochem. Soc. Trans. 26 :173-178)。就本發(fā)明而言，根據(jù) Lever 等，1972, Anal. Biochem. 47 :273-279 ；van Tilbeurgh 等，1982, FEBS Letters, 149 152-156 ；van Tilbeurgh^PClaeyssens, 1985,FEBS Letters, 187 :283-288 ；以及iTomme等， 1988，Eur. J. Biochem. 170 :575-581 ；以及 van Tilbeurgh 等，1985，Eur. J. Biochem. 148 329-334描述的方法確定纖維二糖水解酶活性。可采用Lever等的方法來評價玉米秸稈中的纖維素水解，而van Tilbeurgh等和Tomme等的方法可用于確定對4-甲基傘形基- β -D-乳糖吡喃糖苷 G-methylumbelIiferyl-β -D-Iactopyranoside)的纖維二糖水解酶I活性。在本發(fā)明中，描述于實施例5的測定法可用于測量纖維二糖水解酶II活性。變體術語“變體”意指纖維二糖水解酶活性II，其在一個或多個(幾個)位置包含改變，即取代、插入和/或缺失。取代意指用不同的氨基酸替代占據(jù)某位置的氨基酸；缺失意指去除占據(jù)某位置的氨基酸；而插入意指鄰接于占據(jù)某位置的氨基酸添加1-5個氨基酸。突變體術語“突變體”意指編碼變體的多核苷酸。野生型纖維二糖水解酶II 術語“野生型纖維二糖水解酶II”意指由天然存在的微生物，如見于自然界的細菌、酵母或絲狀真菌表達的纖維二糖水解酶II。親本或親本纖維二糖水解酶II 術語“親本”或“親本纖維二糖水解酶II”意指對
6其進行了改變以產(chǎn)生本發(fā)明的酶變體的纖維二糖水解酶II。所述親本可為天然存在的(野生型)多肽或其變體。分離的或純化的術語“分離的，，和“純化的，，意指從與其天然相關的至少一種組分移出的多肽或多核苷酸。例如，如變體通過SDS-PAGE測定的，可為至少1 %純，例如至少 5%純，至少10%純，至少20%純，至少40%純，至少60%純，至少80%純，至少90%純，或至少95%純；而多核苷酸如通過瓊脂糖電泳測定的，可為至少純，例如至少5%純，至少 10 %純，至少20 %純，至少40 %純，至少60 %純，至少80 %純，至少90 %純，或至少95 %純。纖維素分解酶或纖維素酶術語“纖維素分解酶”或“纖維素酶”意指一種或多種 (幾種)水解纖維素材料的酶。此類酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、葡糖苷酶或其組合。測量纖維素分解活性的兩種基本方法包括(1)測量總纖維素分解活性，和(2) 測量單獨的纖維素分解活性(內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和葡糖苷酶)，如^iang 等，Outlook for cellulase improvement-Screening and selection strategies,2006, Biotechnology Advances M :452-481所綜述的?？偫w維素分解活性通常是使用不溶性底物來測定的，所述底物包括Whatman No. 1濾紙、微晶纖維素、細菌纖維素、藻類纖維素、 棉花、經(jīng)預處理的木素纖維素等。最常見的總纖維素分解活性測定法是使用Whatman No. 1 濾紙作為底物的濾紙測定法。該測定法是由hternational Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) (Ghose,1987, Measurement of cellulase activities, Pure App1. Chem. 59 :257-68)確立的。就本發(fā)明而言，纖維素分解酶活性通過測量在下述條件下由纖維素分解酶進行的纖維素材料水解的增加來確定l_20mg的纖維素分解酶蛋白/g的PCS中纖維素在50°C 進行3-7日，與未添加纖維素分解酶蛋白的對照水解相比較。典型條件為1ml反應液，經(jīng)洗滌或未洗滌的PCS，5%不溶性固形物，50mM乙酸鈉pH 5，ImM MnSO4, 50°C，72小時，通過 AMINEX HPX-87H 柱(Bio-Rad Laboratories, Inc.，Hercules, CA, USA)進行糖分析。內(nèi)切葡聚糖酶術語“內(nèi)切葡聚糖酶”意指內(nèi)切-1，4-(1，3;1，4)-3-0-葡聚糖 4-葡聚糖水解酶(endo-l，4-0 -D-glucan 4-glucanohydrolase) (Ε. C. 3. 2. 1. 4)，其催化纖維素、纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣淀粉(Iichenin)中的 l，4-i3-D-糖苷鍵、混合的β_1，3葡聚糖例如谷類β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纖維素組分的其它植物材料中的β_1，4鍵的內(nèi)水解(endohydrolysis)。內(nèi)切葡聚糖酶活性可通過測量底物粘度的減少或由還原糖測定法Oiang等，2006，Biotechnology Advances 24: 452-481)確定的還原端增加來確定。就本發(fā)明而言，根據(jù)(ihose，1987，Pure and App 1. Chem. 59 :257-268的方法，在pH 5，40°C，使用羧甲基纖維素(CMC)作為底物來確定內(nèi)切葡聚糖酶活性。β -葡糖苷酶術語“ β -葡糖苷酶”意指β -D-葡糖苷葡糖水解酶 (beta-D-glucoside glucohydrolase) (Ε. C. 3. 2. 1. 21)，其催化末端非還原 β -D-葡萄糖殘基的水解，并釋放β-D-葡萄糖。就本發(fā)明而言，根據(jù)Venturi等，2002，Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var. coprophilum !production, purification and some biochemical properties, J. Basic Microbiol. 42 :55-66^基本方法確定葡糖苷酶活性。一個單位的葡糖苷酶活性定義為在25°C，pH 4.8， 在含有0. 01 % TffEEN 20的50mM檸檬酸鈉中從ImM對硝基苯基-β -D-葡糖吡喃糖苷每分鐘產(chǎn)生1. 0微摩爾對硝基苯酚陰離子。具有纖維素分解增強活性的多肽術語“具有纖維素分解增強活性的多肽”意指增強具有纖維素分解活性的酶對纖維素材料的水解的GH61多肽。就本發(fā)明而言，通過測量由纖維素分解酶在下述條件下水解纖維素材料所導致的還原糖增加或纖維二糖與葡萄糖的總量增加來確定纖維素分解增強活性l_50mg總蛋白/g PCS中纖維素，其中總蛋白包含 50-99. 5% w/w的纖維素分解酶蛋白，及0. 5-50% w/w的具有纖維素分解增強活性的GH61 多肽的蛋白質(zhì)，在50°C進行1-7天，與用等量的總蛋白加載量而無纖維素分解增強活性 (l-50mg纖維素分解蛋白/g PCS中纖維素)所進行的對照水解相比。在一個優(yōu)選的方面，使用在總蛋白重量的2-3%的米曲霉(Aspergillus oryzae) β -葡糖苷酶(根據(jù)W002/095014 在米曲霉中重組產(chǎn)生)或者總蛋白重量的2-3%的煙曲霉(Aspergillus fumigatus) β-葡糖苷酶(如WO 2002/095014所述在米曲霉中重組產(chǎn)生)的纖維素酶蛋白加載量存在下的 CELLUCLAST ⑧ 1. 5L (Novozymes A/S, BagSV^rd, Denmark)的混合物作為纖維素分解活性的來源。具有纖維素分解增強活性的GH61多肽通過降低達到相同水解程度所需的纖維素分解酶的量而增強由具有纖維素分解活性的酶催化的纖維素材料的水解，優(yōu)選降低至少 1. 01倍，更優(yōu)選至少1. 05倍，更優(yōu)選至少1. 10倍，更優(yōu)選至少1. 25倍，更優(yōu)選至少1. 5倍， 更優(yōu)選至少2倍，更優(yōu)選至少3倍，更優(yōu)選至少4倍，更優(yōu)選至少5倍，甚至更優(yōu)選至少10 倍，并且最優(yōu)選至少20倍。家族61糖苷水解酶術語“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”意指根據(jù)Henrissat B. ,1991,A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities，Biochem. J. 280 :309_316，及Henrissat B. JfIBairoch A. , 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316 :695-696屬于糖苷水解酶家族61的多肽。半纖維素分解酶或半纖維素酶術語“半纖維素分解酶”或“半纖維素酶”意指一種或多種(幾種)水解半纖維素材料的酶。參見，例如Siallom，D.和Sioham，Y. Microbial hemicellulases. Current Opinion In Microbiology, 2003,6 (3) :219-228)。半纖維素酶是植物生物質(zhì)降解中的關鍵成分。半纖維素酶的實例包括但不限于乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、 葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。這些酶的底物，半纖維素，是支化和直鏈多糖的混雜基團，這些多糖通過氫鍵鍵合于植物細胞壁中的纖維素微纖維，將其交聯(lián)為魯棒(robust)的網(wǎng)絡。半纖維素亦共價地附接于木質(zhì)素， 與纖維素一起形成高度復雜的結構。半纖維素的可變的結構和組織形式需要許多酶的協(xié)同作用使其完全降解。半纖維素酶的催化模塊為水解糖苷鍵的糖苷水解酶(GH)，或水解乙酸或阿魏酸側(cè)基酯鍵的糖酯酶(CE)。這些催化模塊，基于其一級結構的同源性，可指定為以數(shù)字標記的GH和CE家族。一些家族，具有總體上類似的折疊，可進一步歸類為宗族 (clan)，以字母標記(例如，GH-A)。這些和其他糖活性酶的最具信息性和最新的分類可在 Carbohydrate-Active Enzymes (CAZy)數(shù)據(jù)庫獲得。半纖維素分解酶活性可根據(jù)(ihose和 Bisaria, 1987，Pure&Appl. Chem. 59 :1739-1752 測量。木聚糖降解活性或木聚糖分解活性術語“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解含木聚糖材料的生物學活性。兩種測定木聚糖分解活性的基礎方法包括(1)測定總木聚糖分解活性，和( 測定單獨的木聚糖分解活性(例如，內(nèi)切木聚糖酶、β -木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α -葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α -葡糖醛酸酯酶(α-glucuronyl esterase)).最近在木聚糖分解酶測定法的進展總結于幾個公開文獻中，包括Biely禾口Puchard，Recent progress in the assays of xylanolytic enzymes, 2006,Journal of the Science of Food and Agriculture 86(11) :1636-1647 ；Spanikova 禾口 Biely，2006， Glucuronoyl esterase-Novel carbohydrate esterase produced by Schizophyllum commune，F(xiàn)EBS Letters 580(19) :4597-4601 ；Herrmann，Vrsanska， Jurickova， Hirsch， Biely 禾口 Kubicek，1997， The beta-D-xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctional beta-D-xylan xylohydroIase， Biochemical Journal 321 :375-381o總木聚糖降解活性可通過確定從多種類型的木聚糖形成的還原糖來測量，所述木聚糖包括例如燕麥小麥(oat spelt)、山毛櫸木(beechwood)和落葉松木(Iarchwood)木聚糖，或者可通過光度法確定從多種共價染色的木聚糖釋放出的染色的木聚糖片段來測量。 最常見的總木聚糖分解活性測定法基于從多聚的4-0-甲基葡糖醛酸木聚糖產(chǎn)生還原糖， 如 Bailey, Biely, Poutanen,1992, Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity, Journal of Biotechnology 23(3) :257-270 中所述。木聚糖酶活性亦可用0. 2% AZCL-阿拉伯木聚糖作為底物在0. 01% TRITON X-100和200mM磷酸緩沖液 PH 6中在37°C確定。一個單位的木聚糖酶活性定義為在37°C，pH 6，在200mM磷酸鈉pH 6 緩沖液中每分鐘從作為底物的AZCL-阿拉伯木聚糖產(chǎn)生1. O微摩爾的天青精(azurine)。就本發(fā)明而言，木聚糖降解活性是通過測量由木聚糖降解酶在下述典型條件下造成的樺木木聚糖(Sigma Chemical Co.，Inc.，St. Louis, MO, USA)水解的增加來確定的1ml反應，5mg/ml底物(總固形物)，5mg木聚糖分解蛋白/g底物，50mM乙酸鈉，pH 5， 50 °C, 24 小時，如 Lever, 1972, A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates, Anal. Biochem 47 :273-279所述使用對羥基苯甲酸酰胼(PHBAH)測定法進行糖分析。木聚糖酶術語“木聚糖酶”意指催化木聚糖中1，4_β -D-木糖苷鍵的內(nèi)水解的1， 4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(Ε. C. 3. 2. 1. 8)。就本發(fā)明而言，木聚糖酶活性是使用0. 2% AZCL-阿拉伯木聚糖作為底物在37°C在0. 01 % TRITON X-IOO和200mM磷酸鈉緩沖液pH 6中進行確定的。一個單位的木聚糖酶活性定義為在37°C，pH 6從200mM磷酸鈉pH 6緩沖液中的0. 2% AZCL-阿拉伯木聚糖作為底物每分鐘產(chǎn)生1. O微摩爾的天青精(azurine)。β -木糖苷酶術語“ β -木糖苷酶”意指β -D木糖苷木糖水解酶(β -D-xyloside xylohydrolase) (Ε. C. 3. 2. 1. 37)，其催化短 β (1 — 4)木寡糖(xylooligosaccharide) 的外水解以從非還原端去除連續(xù)的D-木糖殘基。就本發(fā)明而言，一個單位的木糖苷酶定義為在40°C，pH 5從含有0.01% TWEEN 20的IOOmM檸檬酸鈉中的ImM對硝基苯基- β -D-木糖苷作為底物每分鐘產(chǎn)生1. O微摩爾對硝基苯酚陰離子。乙酰木聚糖酯酶術語“乙酰木聚糖酯酶”意指羧基酯酶(EC 3. 1.1. 72)，其催化乙?；鶑木酆夏揪厶恰⒁阴；咎恰⒁阴；咸烟恰⒁宜幡?萘酯(alpha-napthyl acetate)和乙酸對硝基苯酯(p-nitrophenyl acetate)的水解。就本發(fā)明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用0. 5mM乙酸對硝基苯酯作為底物，在含有0. 01% TWEEN 20的50mM乙酸鈉PH 5.0中確定的。一個單位的乙酰木聚糖酯酶定義為能夠在pH 5，25°C每分鐘釋放1 微摩爾對硝基苯酚陰離子(p-nitrophenolate anion)的酶量。阿魏酸酯酶術語“阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)，，意指4_羥基_3_甲氧基肉桂酰-糖水解酶(EC 3. 1. 1.73)，其催化4-羥基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基團從酯化的糖(其在“天然”底物中通常為阿拉伯糖)的水解，以產(chǎn)生阿魏酸(4-羥基-3-甲氧基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也稱作阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、羥基肉桂酰酯酶 (hydroxycinnamoyl esterase)、FAE_III、肉桂酸酉旨水解酶、FAEA、cinnAE、FAE_I 或FAE-II。 就本發(fā)明而言，阿魏酸酯酶是使用50mM乙酸鈉pH 5. 0中的0. 5mM阿魏酸對硝基苯酯作為底物確定的。一個單位的阿魏酸酯酶等于能夠在PH 5，25°C每分鐘釋放出1微摩爾對硝基苯酚陰離子的酶量。α -葡糖醛酸糖苷酶術語“ α -葡糖醛酸糖苷酶”意指α _D_葡糖苷酸葡糖醛酸水角軍_ (alpha-D-glucosiduronate glucuronohydrolase)(EC 3. 2. 1. 139)，其催化 α-D-葡糖醛酸糖苷水解為D-葡糖醛酸和醇。就本發(fā)明而言，α -葡糖醛酸糖苷酶活性是根據(jù)de Vries, 1998，J. Bacteriol. 180 :243-249確定的。一個單位的α -葡糖醛酸糖苷酶等于能夠在pH 5，40°C每分鐘釋放出1微摩爾葡糖醛酸或4-0-甲基葡糖醛酸的酶量。α -L-阿拉伯呋喃糖苷酶術語“ α _L_阿拉伯呋喃糖苷酶活性”意指α _L_阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC 3. 2. 1. 55)，其催化對α -L-阿拉伯糖苷中的末端非還原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷殘基的水解。該酶對α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1，3)_和 /或(1，5)_鍵的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也稱為阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α -L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α -L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或α-L-阿拉伯聚糖酶。就本發(fā)明而言，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用總體積 200 μ 1中的每ml的IOOmM乙酸鈉pH 5中5mg的中等粘度小麥阿拉伯木聚糖(Megazyme International Ireland, Ltd.，Bray, Co. Wicklow，Ireland)在 40°C進行 30 分鐘，接著通過 AMINEX HPX-87H 柱層析(Bio-I ad Laboratories, Inc. , Hercules, CA, USA)的阿拉伯糖分析來確定的。纖維素材料術語“纖維素材料”意指包含纖維素的任何材料。生物質(zhì)的初生細胞壁(primary cell wall)中的主要多糖是纖維素，其次最豐富的是半纖維素，而第三是果膠。次生細胞壁(secondary cell wall)在細胞停止生長后產(chǎn)生，其同樣含有多糖并通過共價交聯(lián)至半纖維素的聚合木質(zhì)素而加強。纖維素是脫水纖維二糖的均聚物，并且因此是直鏈β _(l-4)-D-葡聚糖，而半纖維素包括多種化合物，例如木聚糖、木葡聚糖 (xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有系列取代基的復雜分支結構。盡管通常是多形的，存在于植物組織中的纖維素主要是平行葡聚糖鏈的不溶晶體基質(zhì)。半纖維素通常與纖維素以及其它半纖維素以氫鍵鍵合，其幫助穩(wěn)定細胞壁基質(zhì)。纖維素通常見于例如植物的莖、葉、殼、皮和穗軸，或樹的葉、枝和木材。纖維素材料可以是，但不限于，草本材料、農(nóng)業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物、城市固體廢物、廢紙和紙漿與造紙廠殘余物(參見，例如，Wiselogel 等，1995，于 Handbook on Bioethanol (Charles Ε. Wyman 編),pp. 105-118, Taylor&Francis, Washington D. C. ；ffyman,1994, BioresourceTechnology 50 :3-16 ；Lynd,1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25 695-719 ;Mosier 等，，1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, 于 Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper 主編，Volume 65, pp. 23-40，Springer-Verlag，New York)。在本文中應理解的是，纖維素可以是任何形式的木素纖維素，在混合基質(zhì)中包含木質(zhì)素、纖維素和半纖維素的植物細胞壁材料。在一個優(yōu)選的方面，纖維素材料是木素纖維素，其包含纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。在一個方面，纖維素材料是草本材料。在另一個方面，纖維素材料是農(nóng)業(yè)殘余物。 在另一個方面，纖維素材料是林業(yè)殘余物。在另一個方面，纖維素材料是城市固體廢物。在另一個方面，纖維素材料是廢紙。在另一個方面，纖維素材料是紙漿和造紙廠殘余物。在另一個方面，纖維素材料是玉米秸稈。在另一個方面，纖維素材料是玉米纖維。 在另一個方面，纖維素材料是玉米穗軸。在另一個方面，纖維素材料是橙皮。在另一個方面， 纖維素材料是稻桿。在另一個方面，纖維素材料是麥桿。在另一個方面，纖維素材料是柳枝稷(switch grass)。在另一個方面，纖維素材料是芒草屬(miscanthus)。在另一個方面， 纖維素材料是甘蔗渣。在另一個方面，纖維素材料是微晶纖維素。在另一個方面，纖維素材料是細菌纖維素。在另一個方面，纖維素材料是藻類纖維素。在另一個方面，纖維素材料是棉線頭(cotton 1 inter) 0在另一個方面，纖維素材料是無定形的經(jīng)磷酸處理的纖維素。在另一個方面，纖維素材料是濾紙。纖維素材料可以按原樣(as is)使用或進行預處理，使用本領域已知的常規(guī)方法， 如本文所述。在一個優(yōu)選的方面，纖維素材料經(jīng)預處理。預處理的玉米秸稈術語“PCS”或“預處理的玉米秸稈”意指通過用熱和稀硫酸處理的源自玉米秸稈的纖維素材料。含木聚糖材料術語“含木聚糖材料”意指任何包含含有β -(1-4)連接木糖殘基骨架的植物細胞壁多肽的材料。陸生植物的木聚糖是具有β-(1-4)-D-吡喃木糖骨架(其由短糖鏈分支)的雜聚物。其包含D-葡糖醛酸或其4-0-甲基醚、L-阿拉伯糖和/或多種寡糖，由D-木糖、L-阿拉伯糖，D-或L-半乳糖和D-葡萄糖組成。木聚糖類型的多糖可分為同木聚糖(homoxylan)和雜木聚糖(heteroxylan)，其包括葡糖醛酸木聚糖，(阿拉伯)葡糖醛酸木聚糖，(葡糖醛酸)阿拉伯木聚糖，阿拉伯木聚糖和復合雜木聚糖(complex heteroxylan)。參見例如 Ebringerova 等，2005，Adv. Polym. Sci. 186 :1_67。在本發(fā)明的方法中，可使用任何含木聚糖材料。在一個優(yōu)選的方面，所述含木聚糖材料是木素纖維素。成熟多肽術語“成熟多肽”意指以其在翻譯和任何翻譯后修飾之后的最終形式存在的多肽，所述修飾例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一個方面，根據(jù)預測SEQ ID NO 2的氨基酸1至17是信號肽的SignalP程序(Nielsen等，1997，Protein Engineering 10 1_6)，成熟多肽是SEQ ID NO :2的氨基酸18至481。本領域中已知宿主細胞可產(chǎn)生兩種或更多種由相同多核苷酸表達的不同成熟多肽(即，具有不同的C端和/ 或N端氨基酸)的混合物。成熟多肽編碼序列術語“成熟多肽編碼序列”意指編碼具有纖維二糖水解酶活性 II的成熟多肽的多核苷酸。在一個方面，根據(jù)預測SEQ ID NO 1的核苷酸1至51編碼信號肽的 SignalP[程序，例如(Nielsen 等，1997 Jrotein Engineering 10:1-6)，成熟多肽編碼序列是SEQ ID NO :1的核苷酸52至1433。在另一個方面，所述成熟多肽編碼序列是包含于SEQ ID NO 1的核苷酸52至1433中的cDNA序列。序列同一性參數(shù)“序列同一性”描述兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關性。就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000， Trends Genet. 16 :276-277)，優(yōu)選3. 0. 0版或更高版本的Needle程序中所執(zhí)行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch，1970，J. Mol. Biol. 48 :443-453)來測定。 使用的可選參數(shù)為缺口開放罰分(gap open penalty) 10，缺口延伸罰分(gap extension penalty) 0. 5 和 EBL0SUM62 (BL0SUM62 的 EMBOSS 版)取代矩陣。使用 Needle 標記為“最高同一性(longest identity)”的輸出結果(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性， 并計算如下(同樣的殘基X100)/(比對長度-比對中缺口的總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個脫氧核苷酸序列之間的序列同一性程度使用如EMBOSS軟件包(EMBOSS The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000， 見上文)，優(yōu)選3. 0. 0版或更高版本的Needle程序中所執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法 (Needleman和mmsch，1970，見上文)來測定。使用的可選參數(shù)為缺口開放罰分10，缺口延伸罰分0. 5和EDNAFULL(NCBINUC4. 4的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標記為“最高同一性”的輸出結果(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性，并計算如下(同樣的脫氧核糖核苷酸X100)/(比對長度-比對中缺口的總數(shù))片段術語“片段”意指從成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個(幾個)氨基酸的多肽；其中所述片段具有纖維二糖水解酶II活性。在一個方面，片段含有SEQ ID NO 2的成熟多肽的至少390個氨基酸殘基，例如至少415個氨基酸殘基，或至少440個氨基酸殘基。亞序列術語“亞序列(subsequence) ”意指從成熟多肽編碼序列的5’和/或3’ 端缺失一個或多個(幾個)核苷酸的多核苷酸；其中所述亞序列編碼具有纖維二糖水解酶 II活性的片段。在一個方面，亞序列含有SEQ ID NO :1的成熟多肽編碼序列的至少1170個核苷酸，例如至少1245個核苷酸，或至少1320個核苷酸。等位變體(allelic variant)術語“等位變體”在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或更多種可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導致種群內(nèi)的多態(tài)性。基因突變可以是沉默的(在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。編碼序列術語“編碼序列”意指直接指定其多肽產(chǎn)物氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或其他起始密碼子例如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子例如TAA、TAG和TGA結束。編碼序列可以是DNA、 cDNA、合成的或重組的多核苷酸。cDNA 術語“cDNA”意指能夠通過反轉(zhuǎn)錄從得自真核細胞的成熟的、已剪接的mRNA 分子制備的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相應基因組DNA中的內(nèi)含子序列。起始的(initial)、初級的RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，其通過一系列的包括剪接的步驟加工然后作為成熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。核酸構建體術語“核酸構建體”意指單鏈或雙鏈的核酸分子，其分離自天然存在的基因，或受修飾以本來不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式含有核酸的區(qū)段，或是合成的。當所述核酸構建體含有表達本發(fā)明的編碼序列所需的調(diào)控序列時，術語核酸構建體與術語“表達盒”同義。調(diào)控序列(control sequence)術語“調(diào)控序列”意指對編碼本發(fā)明變體的多核苷酸表達是必需的所有成分。各個調(diào)控序列對于編碼所述變體的多核苷酸可以是天然的或外源的，或各個調(diào)控序列對于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進調(diào)控序列與編碼變體的多核苷酸編碼區(qū)的連接。可操作地連接術語“可操作地連接”意指這樣的構型，其中將調(diào)控序列置于相對于多核苷酸的編碼序列的適當位置，使得調(diào)控序列指導編碼序列的表達。表達術語“表達”包括涉及本發(fā)明的變體產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、 轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達載體術語“表達載體”意指線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼本發(fā)明的變體的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達的額外核苷酸可操作地連接。宿主細胞“宿主細胞”意指任何細胞類型，所述細胞類型對于使用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構建體或表達載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導等是易感的(susceptible)。術語“宿主細胞”涵蓋親本細胞的任何后代，所述后代由于在復制中發(fā)生的突變與親本細胞不完全相同。增加的熱穩(wěn)定性術語“增加的熱穩(wěn)定性”意指相對于親本在一定溫度一段時間的溫育之后，變體保留了較高的纖維二糖水解酶II活性。所述變體相對于親本的增加的熱穩(wěn)定性可例如在一個或多個(幾個)溫度條件下進行評價。例如，所述一個或多個(幾個) 溫度可為任何45°c至95°C的范圍的溫度，例如45、50、55、60、65、70、75、80、85或95°C (或其間溫度例如 670C )，在 3 至 8 范圍的 pH，例如 3. 0,3. 5,4. 0,4. 5,5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0、 7. 5或8. 0(或其間)進行合適期間的溫育，例如1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、 45分鐘或60分鐘，從而使得所述變體相對于親本保留殘余活性。在一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 3.0和50°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 3.0和55°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 3. 0和60°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 3. 0和65°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 3.0和70°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 3.0 和75°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 3.0和80°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 3.0和85°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 3. 0和90°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 3.5和501確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 3.5和551確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 3.5和601確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 3.5和651確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 3.5和701確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 3.5和751確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 3. 5和 80°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 3.5和851確定的。 在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 3. 5和90°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 4.0和50°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 4.0和55°C確定的。在另一個方面， 所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 4.0和60°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 4.0和65°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 4.0和70°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 4.0和75°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 4. 0和 80°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 4.0和85°C確定的。 在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 4. 0和90°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 4.5和501確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 4.5和551確定的。在另一個方面， 所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 4.5和601確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 4.5和651確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 4.5和701確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 4.5和751確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 4. 5和 80°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 4.5和851確定的。 在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 4. 5和90°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 5.0和50°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 5.0和55°C確定的。在另一個方面， 所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 5.0和60°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 5.0和65°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 5.0和70°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 5.0和75°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 5. 0和 80°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 5.0和85°C確定的。 在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 5. 0和90°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 5.5和501確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 5.5和551確定的。在另一個方面， 所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 5.5和601確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 5.5和651確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 5.5和701確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 5.5和751確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 5. 5和 80°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 5.5和851確定的。 在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 5. 5和90°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 6.0和50°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 6.0和55°C確定的。在另一個方面， 所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 6.0和60°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 6.0和65°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 6.0和70°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 6.0和75°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 6. 0和 80°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 6.0和85°C確定的。 在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 6. 0和90°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 6.5和501確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 6.5和551確定的。在另一個方面， 所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 6.5和601確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 6.5和651確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 6.5和701確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 6.5和751確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 6. 5和 80°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 6.5和851確定的。 在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 6. 5和90°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 7.0和50°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 7.0和55°C確定的。在另一個方面， 所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 7.0和60°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 7.0和65°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 7.0和70°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 7.0和75°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 7. 0和 80°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 7.0和85°C確定的。 在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 7. 0和90°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 7.5和501確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 7.5和551確定的。在另一個方面， 所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 7.5和601確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 7.5和651確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 7.5和701確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 7.5和751確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 7. 5和 80°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 7.5和851確定的。 在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 7. 5和90°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 8.0和50°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 8.0和55°C確定的。在另一個方面， 所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 8.0和60°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 8.0和65°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 8.0和70°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 8.0和75°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 8. 0和 80°C確定的。在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在pH 8.0和85°C確定的。 在另一個方面，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是在PH 8. 0和90°C確定的。
在上述每一個方面中，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是通過溫育所述變體和親本1分鐘而確定的。在上述每一個方面中，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是通過溫育所述變體和親本5分鐘而確定的。在上述每一個方面中，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是通過溫育所述變體和親本10分鐘而確定的。在上述每一個方面中，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是通過溫育所述變體和親本15分鐘而確定的。在上述每一個方面中，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是通過溫育所述變體和親本30分鐘而確定的。在上述每一個方面中， 所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是通過溫育所述變體和親本45分鐘而確定的。在上述每一個方面中，所述變體相對于親本的熱穩(wěn)定性是通過溫育所述變體和親本60分鐘而確定的。然而，可使用任何時間期間以說明本發(fā)明的變體相對于親本的增加的熱穩(wěn)定性。變體相對于親本的增加的熱穩(wěn)定性可通過使用本領域標準方法的差示掃描量熱法(DSC)(參見，例如 Sturtevant，1987，Annual Review of Physical Chemistry 38: 463-488)來確定。變體相對于親本的增加的熱穩(wěn)定性亦可使用本領域已知的任何對于纖維二糖水解酶II的酶測定法來確定。變體相對于親本的增加的熱穩(wěn)定性亦可使用實施例 5中所述的測定法來確定。在一個方面，具有纖維二糖水解酶II活性的變體的熱穩(wěn)定性與親本相比，為至少 1. 05倍，例如至少1. 5倍，至少1. 8倍，至少2倍，至少5倍，至少10倍，至少15倍，至少20 倍，至少25倍和至少50倍更加穩(wěn)定。發(fā)明的具體描述本發(fā)明涉及親本纖維二糖水解酶II的分離的變體，其在一個或多個(幾個)對應于SEQ ID NO 2的成熟多肽的位置272、287、325、347、357、363、409、464和476的位置處包含取代，其中所述變體具有纖維二糖水解酶Π活性。本發(fā)明的變體與親本相比具有增加的熱穩(wěn)定性。變體命名規(guī)則就本發(fā)明而言，使用公開于SEQ ID NO 2中的成熟多肽以確定在其他纖維二糖水解酶II中對應的氨基酸殘基。將其他纖維二糖水解酶II的氨基酸序列與公開于SEQ ID NO :2中的成熟多肽進行比對，并基于該比對，可以使用Needleman-Wunsch算法(Needleman 和 Wunsch, 1970，J. Mol. Biol. 48 :443-453)(如用 EMBOSS 軟件包(EMBOSS 歐洲分子生物開放軟件組(The European Molecular Biology Open Software Suite), Rice 等，2000， Trends in Genetics 16 :276-277 ;http://emboss, org)的Needle程序執(zhí)行，優(yōu)選為 3. 0. 0 版或之后的版本)確定SEQ ID NO :2所公開的成熟多肽中任何氨基酸殘基對應的氨基酸位置編號。在另一個纖維二糖水解酶II中對應氨基酸殘基的鑒定可通過使用 "Clustalff" (Larkin 等，2007，Bioinformatics 23 :2947-2948)進行的多個多肽序列的比對來確證。當其他酶與SEQ ID NO :2的成熟多肽歧異到傳統(tǒng)的基于序列的比較無法檢測出其關系時(Lindahl 和 Elofsson，2000, J. Mol. Biol. 295 :613-615)，可使用其他配對序列比較算法。在基于序列的搜索中較高的敏感度可使用采用多肽家族的概率表現(xiàn)(probabilistic r印resentation)(序型)搜索數(shù)據(jù)庫的搜索程序來獲得。例如，PSI-BLAST程序通過迭代的(iterative)數(shù)據(jù)庫搜索過程來產(chǎn)生序型，并能夠檢測出較遠的同源物(Atschul等，1997, Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402)。當多肽的家族或超家族在蛋白質(zhì)結構數(shù)據(jù)庫中具有一個或多個代表時，甚至可達成更高的敏感度。程序如GenTHR ADER(Jones 1999， J. Mol. Biol. 287 :797-815 ；McGuffin 和 Jones, 2003，Bioinformatics 19 :874-881)使用來自不同來源(PSI-BLAST、二級結構預測(secondary structure prediction)、結構比對 j^M (structural alignment profile) URMM^1 (solvation potential))白勺預測所查詢序列(query sequence)結構折疊(structural fold)的神經(jīng)網(wǎng)絡的輸入。類似地，Gough等，2000, J. Mol. Biol. 313 :903-919的方法可用于將未知結構的序列與存在于 SCOP數(shù)據(jù)庫中的超家族模型進行比對。這些比對可接著用于生成所述多肽的同源性模型， 且上述模型可就其準確度使用多種為此目的開發(fā)的工具加以評價。對于已知結構的蛋白質(zhì)，可獲取數(shù)種工具和資源以供找回(retrieve)和生成結構比對。例如，已將SCOP超家族的蛋白質(zhì)進行了結構比對，且這些比對是可獲取并可下載的。兩個或更多蛋白質(zhì)結構可使用多種算法，如距離比對矩陣(distance alignment matrix)(Holm 禾口 Sander,1998, Proteins 33 :88-96)或組合延伸(combinatorial extension) (Shindyalov 禾口 Bourne, 1998, Protein Engineering. 11 :739-747)進對亍比對， 且這些算法的實施可另外用于查詢具有目標結構的結構數(shù)據(jù)庫，以發(fā)現(xiàn)可能的結構同源物 (例如 Holm 禾口 Park，2000，Bioinformatics 16 :566-567)。在描述本發(fā)明的不同變體時，為了參照方便起見，采用了下面所述的命名法。在所有情況下，使用通用的IUPAC單字母或三字母氨基酸縮寫。_。對于氨基酸取代，使用下述命名法初始氨基酸，位置，取代氨基酸。相應地，在2 位用丙氨酸取代蘇氨酸命名為“Thr226Ala”或“T226A”。多重突變可以用加號 (“ + ”)分開，例如，“Gly205Arg+kr411Phe” 或 “G205R+S411F”，分別代表 205 和 411 位用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)，以及用苯丙氨酸(F)取代絲氨酸(S)。跡失。對于氨基酸缺失，使用了如下命名法初始氨基酸，位置*。相應地，在位置 195缺失甘氨酸命名為“Glyl95*”或“G195*”。多個缺失通過加法符(“ + ”)分開，例如， "Glyl95*+Ser4ir” 或 “G195*+S411*，，。ΜΑ。對于氨基酸插入，使用了如下的命名法初始氨基酸，位置，初始氨基酸， 插入的氨基酸。因此，在位置195的甘氨酸之后插入賴氨酸命名為“Glyl95GlyLys”或 “G195GK”。多個氨基酸的插入命名為[初始氨基酸，位置，初始氨基酸，插入的氨基酸 #1，插入的氨基酸#2 ；等等]。例如，在位置195的甘氨酸之后插入賴氨酸和丙氨酸記為 "Glyl95GlyLysAla” 或 “G195GKA，，。在此情況下，通過在插入的氨基酸殘基前的氨基酸殘基的位置號添加小寫字母而對插入的氨基酸殘基進行編號。因此，在上一例子中序列為
權利要求
1.一種親本纖維二糖水解酶II的分離的變體，其在一個或多個(幾個)對應于SEQ ID NO 2的成熟多肽的位置272、沘7、325、；347、；357、363、409、464和476的位置包含取代，其中所述變體具有纖維二糖水解酶II活性。
2.權利要求1的變體，其在對應于SEQID NO 2的成熟多肽的位置272的位置包含用 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp 或 Tyr，優(yōu)選用kr的取代。
3.權利要求1或2的變體，其在對應于SEQID NO 2的成熟多肽的位置觀7的位置包含用 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys> Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys> Met、Phe> Pro、Ser> Thr> Trp或Tyr，優(yōu)選用Lys的取代。
4.權利要求1-3任一項的變體，其在對應于SEQID NO 2的成熟多肽的位置325的位置包含用 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys> Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys> Met、Phe> Pro、Ser> Thr、Trp或Tyr，優(yōu)選用Asp的取代。
5.權利要求1-4任一項的變體，其在對應于SEQID NO 2的成熟多肽的位置347的位置包含用 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys> Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys> Met、Phe> Pro、Ser> Thr、Trp或Tyr，優(yōu)選用lie的取代。
6.權利要求1-5任一項的變體，其在對應于SEQID NO :2的成熟多肽的位置357的位置包含用 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys> Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys> Met、Phe> Pro、Ser> Thr、Trp或Tyr，優(yōu)選用Asn的取代。
7.權利要求1-6任一項的變體，其在對應于SEQID NO 2的成熟多肽的位置363的位置包含用 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys> Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys> Met、Phe> Pro、Ser> Thr、Trp或Tyr，優(yōu)選用Lys的取代。
8.權利要求1-7任一項的變體，其在對應于SEQID NO :2的成熟多肽的位置409的位置包含用 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys> Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys> Met、Phe> Pro、Ser> Thr、Trp或Tyr，優(yōu)選用Cys的取代。
9.權利要求1-8任一項的變體，其在對應于SEQID NO :2的成熟多肽的位置464的位置包含用 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys> Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys> Met、Phe> Pro、Ser> Thr、Trp或Tyr，優(yōu)選用Gln的取代。
10.權利要求1-9任一項的變體，其在對應于SEQID NO :2的成熟多肽的位置476的位置包含用 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、 Thr、Trp或Tyr，優(yōu)選用Cys的取代。
11.權利要求1-10任一項的變體，其在對應于位置272、287、325、347、357、363、409、 464 和 476 的位置包含用 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、 Phe、Pro、Ser, Thr、Trp 或 Tyr 的取代。
12.權利要求1-11任一項的變體，其包含一個或多個(幾個)選自下組的取代A272S、 Q287K、S325D、L347I、D357N、S363K、G409C、T464Q 和 N476C。
13.權利要求1 的變體，其包含取代 A272S+Q287K，S325D+L347I+D357N+S363K+G409C+ T464Q+N476C0
14.權利要求1-13任一項的變體，其在對應于位置435的位置進一步包含用Ala、Arg、 Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe> Pro、Ser> Thr> Trp 或 Tyr 的取代。
15.權利要求1-14的變體，其中所述親本纖維二糖水解酶II為(a)多肽，其與SEQID NO :2的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75 %，至少80 %，至少85 %，至少90 %，至少95 %，至少96 %，至少97 %，至少98 %，至少 99%，或100%序列同一性；(b)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在低嚴格條件下、中等嚴格條件下、中-高嚴格條件下、高嚴格條件下或非常高嚴格條件下與以下雜交(i)SEQ ID NO :1的成熟多肽編碼序列，(ii)SEQ ID NO 1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)⑴或( ) 的全長互補鏈；(c)多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQID NO :1的成熟多肽編碼序列或其基因組DNA序列具有至少60 %，例如至少65 %，至少70 %，至少75 %，至少80 %，至少85 %， 至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或100%的同一性；或(d)SEQID NO 2的成熟多肽的片段，其具有纖維二糖水解酶II活性。
16.權利要求1-15任一項的變體，其與親本纖維二糖水解酶II的氨基酸序列具有至少 60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%，但少于100%序列同一性。
17.權利要求1-15任一項的變體，其與SEQID NO :2的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%，但少于100%序列同一性。
18.一種分離的多核苷酸，其編碼權利要求1-17任一項的變體。
19.一種產(chǎn)生親本纖維二糖水解酶II的變體的方法，包括(a)在適于所述變體的表達的條件下培養(yǎng)包含權利要求18的多核苷酸的宿主細胞；和(b)回收所述變體。
20.一種轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細胞，其經(jīng)權利要求18的多核苷酸轉(zhuǎn)化。
21.一種產(chǎn)生權利要求1-17任一項的變體的方法，包括(a)在有助于產(chǎn)生所述變體的條件下培養(yǎng)包含編碼所述變體的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞；和(b)回收所述變體。
22.一種用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料的方法，包括在權利要求1-17任一項的變體存在下用酶組合物處理所述纖維素材料，其中具有纖維素分解增強活性的GH61多肽和液體的組合增強了酶組合物對纖維素材料的水解。
23.權利要求22的方法，進一步包括回收經(jīng)降解的纖維素材料。
24.一種用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包括(a)在權利要求1-17任一項的變體的存在下用酶組合物糖化纖維素材料；(b)用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵經(jīng)糖化的纖維素材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；知(c)從所述發(fā)酵回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。
25.一種發(fā)酵纖維素材料的方法，包括用一種或多種發(fā)酵微生物發(fā)酵所述纖維素材料，其中所述纖維素材料在權利要求1-17任一項的變體的存在下用酶組合物糖化。
26.權利要求25的方法，其中纖維素材料的發(fā)酵產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。
27.權利要求沈的方法，進一步包括從所述發(fā)酵回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及親本纖維二糖水解酶II的變體。本發(fā)明還涉及編碼所述變體的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸構建體、載體和宿主細胞；和使用所述變體的方法。
文檔編號C12N9/42GK102597228SQ201080047933
公開日2012年7月18日 申請日期2010年10月20日 優(yōu)先權日2009年10月23日
發(fā)明者M.沃古利斯 申請人:諾維信股份有限公司