專利名稱：產(chǎn)生對多種腫瘤抗原或多種病毒特異的ctl細胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及細胞生物學、免疫學、分子生物學和醫(yī)藥領(lǐng)域。在具體實施方式
中，本發(fā)明一般涉及癌癥免疫治療。
背景技術(shù)：
預防和/或治療免疫受損宿主中的病毒感染的多病毒特異T細胞病毒感染造成所述免疫受損宿主如接受異源干細胞移植(SCT)的患者的顯著發(fā)病率和死亡率。由持續(xù)性皰疹病毒如EB病毒(EBV)、巨細胞病毒(CMV)和單純皰疹病毒，以及由呼吸道病毒如呼吸道合胞病毒、副流感病毒和流感病毒引起的感染已熟知，而近期更理解了由腺病毒(Adv)、BK病毒和人皰疹病毒6引起的感染的重要性(Kim等，2007 ；Myers等,2007 ;Kadakia 等，1996 ;Comoli 等，2006 ；de Pagter 等,2008)。盡管藥物試劑是一些感染的標準療法，但其有顯著的毒性、生成抗性變體且經(jīng)常無效。恢復病毒特異性免疫的免疫治療策略提供了有吸引力的治療替代法。已用EBV轉(zhuǎn)化的類淋巴細胞系(EBVLCL)作為抗原來源制備了源于供體的EBV特異細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，且異基因造血 SCT (HSCT) (Heslop 等，1996 ;Comoli 等，2007) (Heslop 等，2010)后輸注這些細胞系以最小的毒性阻止并治療了 EBV驅(qū)動的B細胞淋巴增殖性疾病(EBV-LPD)(Cruz 等，2010) ο相似地，用CMV肽、裂解物或載體轉(zhuǎn)導的抗原呈遞細胞(APC)生成的過繼轉(zhuǎn)移性供體衍生CMV特異CTL能重建針對該病毒的免疫應答并保護患者抵御CMV疾病的發(fā)展或之后復發(fā)(Riddell 等，1992 ；ffalter 等，1995 ；Einsele 等，2002a ；Einsele 等，2002b ；Peggs 等，2003 ；Micklethwaite 等，2008 ；Micklethwaite 等，2007)。最近,通過用表達 CMV_pp65 的嵌合腺病毒載體作為轉(zhuǎn)基因遺傳修飾單核細胞和EBV-LCL來生成靶向EBV、CMV和Adv的三病毒(trivirus)反應性 CTL。輸注到HSCT受體中后，少至2X105/kg的三病毒特異CTL增殖數(shù)個數(shù)量級且看來會保護所述受體抵御由所有三種病毒產(chǎn)生的疾病(Leen等，2006)。雖然有這些振奮人心的臨床結(jié)果，T細胞免疫治療的廣泛實施受到以下限制(i)生成CTL通常需要的所述感染性病毒材料(EBV/CMV/Adv)，(ii)制造用于抗原呈遞的臨床級別載體的成本，和(iii)消除同種異源反應性T細胞需要的長時間培養(yǎng)(10-12周制造過程)，和其隨之對技術(shù)技能和時間的需求。為了解決所述后期問題，一些小組評價了更快速的選擇抗原特異性T細胞的方法。使用人白細胞抗原(HLA)肽四聚體然后用磁珠選擇，Cobbold和同事選擇了來自干細胞移植供體血液的CMV特異CD8+T細胞，并觀察到將極少數(shù)量的所選細胞輸注后給人深刻印象的臨床反應，9個治療患者中有8個清除了感染(中值8. 6 X 103/kg) (Cobbold等，2005)。暴露于抗原后選擇分泌干擾素Y (IFN-Y)的T細胞(IFN-Y捕獲試驗)也用于臨床,Feuchtinger和同事在用病毒肽體外刺激后直接從外周血中具體選擇了 Adv特異T細胞并表明少量細胞(1.2-50 X 103/kg)在體內(nèi)安全、有保護性且有效(Feuchtinger等，2004 ;Feuchtinger等,2006)。然而,這些方法都昂貴且需要大體積的起始血液,其通常難以獲取，特別是在非血緣關(guān)系匹配供體的設(shè)定中。四聚體試劑受到已知的表位和CD8選擇的限制。Y捕獲限制分泌Y干擾素的T細胞的輸注?？?能缺失具有其他功能的抗原特異T細胞。迄今為止，其使用受到緊急醫(yī)療需求的約束情況的限制。本領(lǐng)域需要替代的符合實施的良好制造方法，其能克服所有三種限制(體積、時間和感染性試劑)以從少量血液體積中快速生成多病毒特異CTL用于免疫治療目的。本發(fā)明提供如何用編碼免疫優(yōu)勢和次優(yōu)勢病毒抗原的DNA質(zhì)粒核轉(zhuǎn)染樹突細胞(DC)以及將其用作體外T細胞刺激物以生成多病毒反應性CTL，所述CTL在10天內(nèi)靶向來自多種常見病毒的抗原中的多種不同表位(Gerdemann等,2009)。用于呈遞和/或治療癌癥的多腫瘤相關(guān)抗原(TAA)T細胞例如，EBV與霍奇金和非霍奇金淋巴瘤和鼻咽癌相關(guān)。在這些情況下，所述腫瘤細胞表達約90種EB病毒抗原之中的三種。為了優(yōu)化CTL的抗原靶向，我們小組通過依次使用樹突細胞(DC)和EBV-LCL制備了特異性指向所述三種表達病毒抗原的CTL，所述EBV-LCL經(jīng)遺傳修飾以過表達LMPl和LMP2 (所述三種抗原之二)來再激活并擴增來自患者或其HLA匹配的異源供體的LMP特異CTL。所述LMP抗原從腺病毒載體表達。HL和NHL中的臨床結(jié)果振奮人心，17個緩解的高風險HL患者中16個仍然處于緩解中，而15個活動性復發(fā)疾病的患者中12個發(fā)生腫瘤響應。然而，涉及我們研究的> 70%的患者具有EBV陰性淋巴瘤且不適合EBV抗原特異T細胞。過繼免疫治療非病毒癌癥的挑戰(zhàn)之一仍是強免疫原性靶向抗原的鑒定。模式腫瘤抗原需在腫瘤細胞上特異并普遍表達以限制附帶損傷，且理想地應對維持所述腫瘤的致癌表型很重要。然而，大多數(shù)抗原不滿足這些標準，因為其不一定是獨立存在于癌癥細胞中的新抗原(neo-antigens),而是在正常細胞中也表達的抗原，且外周血T細胞對其耐受或缺失。然而已鑒定本質(zhì)上腫瘤特異的抗原，但腫瘤抗原的表達形式是高度依賴腫瘤類型。這強調(diào)了鑒定在正常組織中不表達或表達很少的合適抗原的重要性，以及優(yōu)化腫瘤特異性CTL生產(chǎn)的細胞培養(yǎng)條件的重要性，從而克服建立T細胞耐受“自身”抗原的機制。一些研究中已描述具有希望的臨床結(jié)果的非病毒腫瘤抗原的T細胞免疫治療。Rosenberg和同事報道了黑素瘤特異性腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)和高劑量干擾素2 (IL-2)的共同輸注使約35%的轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者產(chǎn)生臨床響應。沒有分析所述輸注細胞的特異性但可能其靶向多種表位/腫瘤相關(guān)抗原。用改良的治療方案隨后獲得了更有希望的結(jié)果，所述方案包括CTL輸注前的淋巴消耗步驟，從而改善了過繼轉(zhuǎn)移細胞的擴增和持續(xù)存在。標準治療法難以治療的93個轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者接受免疫消耗化療_/+全身輻射，然后過繼轉(zhuǎn)移高度選擇的、TIL源的腫瘤反應性T細胞和高劑量IL-2 (每8小時720，000IU/kg用以耐受)。93患者中有52個對治療(39PR，12CR)有客觀的臨床響應，包括大量腫瘤的消退。然而，大多數(shù)腫瘤不可能收集到自體同源的TIL。而且，大量腫瘤特異T細胞的體外擴增(> 1010CTL)是復雜且昂貴的過程。同一組還將輸注了直接靶向黑色素瘤相關(guān)抗原中的單一表位的T細胞克隆，gpl00+/-IL-2，但報道了較差的臨床響應，僅有一較小響應和一混合響應，表明所述細胞沒有在體內(nèi)植入或保留。這些研究證明過繼轉(zhuǎn)移抗原特異T細胞消除癌癥的可能，但強調(diào)了靶向多表位/抗原對產(chǎn)生最優(yōu)臨床結(jié)果的重要性。發(fā)明概述本發(fā)明涉及生產(chǎn)CTL，所述CTL為多腫瘤抗原或靶向靶標多病原體(包括例如病毒或細菌)。由于本文提供的新的改善，與常規(guī)方法相比CTL生成更快。所述改善至少包括使用來自具體類型載體(例如質(zhì)粒)或具體肽文庫的抗原來源。其他改善包括在細胞增殖培養(yǎng)基中使用某些細胞因子和細胞培養(yǎng)環(huán)境。 在具體實施方式
中，本發(fā)明提供產(chǎn)生多病毒特異CTL的方法，所述CTL用于治療被多病毒感染的個體(如異基因干細胞移植后感染多病毒的個體)或患具有特定腫瘤相關(guān)抗原的癌癥的個體。在多病毒和腫瘤相關(guān)抗原的實施方式中，所述抗原的來源可為質(zhì)?；螂奈膸?。在多病毒和腫瘤相關(guān)抗原的實施方式中，所述CTL可在具有透氣膜的容器中培養(yǎng)。在多病毒實施方式的具體實施方式
中，所述培養(yǎng)基含IL4和IL7。在所述腫瘤相關(guān)抗原實施方式的具體實施方式
中，所述培養(yǎng)基含IL-7、IL12、IL15和IL6或IL27。在某些實施方式中，本發(fā)明描述多病毒CTL系或多TAA CTL系的生成。對于多病毒CTL的生成，樹突細胞可用覆蓋所述病毒抗原的肽混物(pepmixes)脈沖處理或DC可用編碼所述病毒抗原的質(zhì)粒核轉(zhuǎn)染以產(chǎn)生抗原呈遞細胞(APC)。或者PBMC可用肽混物直接刺激以激活抗原特異細胞。這些策略避免了使用腺病毒載體和EBV轉(zhuǎn)化APC(LCL)的需要。對于多TAA CTL生成，DC可用覆蓋所述靶抗原的肽混物脈沖處理或DC可用編碼至少部分所述腫瘤抗原的質(zhì)粒核轉(zhuǎn)染。額外的實施方式包括使用某些能促進所述激活的T細胞群體的增殖并降低細胞死亡的細胞因子和使用生物反應器如G-Rex生物反應器來培養(yǎng)細胞以促進體外T細胞的優(yōu)化擴增。用于病毒感染的多病毒特異T細胞本發(fā)明的具體方面中包括快速并有效的生成具有廣泛表位反應性的多病毒特異CTL的方法。具體情況中可用本發(fā)明生成具有“廣譜”特異性的CTL，其可用編碼優(yōu)勢免疫和保護性抗原的質(zhì)粒生成，所述抗原衍生自各種病毒或其他病原體。在本發(fā)明的一些實施方式中，制備和/或給予多病毒特異CTL用于預防和/或治療免疫受損個體(實體器官移植、HIV感染、化療、遺傳免疫缺陷)中的感染。盡管所述個體可由于任何原因而免疫受損，但具體情況中所述個體是在異基因干細胞移植后。所述病毒感染可為任何形式，盡管具體實施方式
中其為EBV、CMV、腺病毒(Adenovirus)、BK、HHV6、RSV、流感病毒(Influenza)、副流感病毒(Parainfluenza)、博卡病毒(Bocavirus)、冠狀病毒(Coronavirus)、LCMV、腿腺炎病毒(Mumps)、麻疫病毒(Measles)、偏肺病毒(Metapneumovirus)、細小病毒B (Parvovirus B)、輪狀病毒(Rotavirus)和西尼羅河病毒(West Nile Virus)。在某些涉及多病毒特異CTL的實施方式中，本發(fā)明采用IL-4和IL_7的某個細胞因子組合用于促進所述激活的T細胞群體的增殖并降低細胞死亡。在某些方面，用表達示例性病毒蛋白的下述質(zhì)粒開發(fā)多病毒特異CTL (i)腺病毒六鄰體和/或五鄰體；(ii)巨細胞病毒(CMV)立即早期中間體I (IEl)和/或pp65 ;和(iii)EB病毒(EBV) EBNAl、LMP2和/或BZLFl。在具體實施方式
中，所述廣譜CTL納入所有用于制作三病毒特異細胞的表達載體，以及在具體實施方式
中納入表達例如下述病毒蛋白的額外質(zhì)粒(i)BK多瘤病毒大T抗原和/或VPl ;和/或(ii)人皰疹病毒-6(HHV-6)立即早期中間體I(IEl)和/或內(nèi)膜蛋白U90、U11、U14和/或U71 ;和/或(iii)呼吸道合胞病毒(RSV)F、M和/或N蛋白；和/或(iv)副流感病毒(PIV)F、HN和/或NP蛋白。本發(fā)明的一些實施方式中包括生成供體來源的多病毒特異細胞毒性T細胞以治療和/或預防需要該治療的對象中的病毒感染和/或再激活的方法，所述方法包括至少一個或多個以下步驟(i)從供體中分離外周血單核細胞(PBMC) ；(ii)通過選擇粘附細胞培養(yǎng)底物的能力和隨后在含GM-CSF和IL4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從所述PBMC中生成稱為樹突細胞的抗原呈遞細胞(APC) ；(ii)用編碼至少一種來自至少兩種病毒的病毒蛋白的質(zhì)粒DNA表達載體獨立核轉(zhuǎn)染DC，如下(a)編碼所述免疫優(yōu)勢腺病毒抗原六鄰體和五鄰體的表達質(zhì)粒；(b)巨細胞病毒(CMV)立即早期中間體1(IEl)和pp65 ;(c)EB病毒(EBV)EBNAULMPl和BZFLl ； (d)BK多瘤病毒大T抗原和VPl ； (e)人皰疹病毒-6 (HHV-6)立即早期中間體I (IEl)和/或內(nèi)膜蛋白U90、U11、U14和/或U71 ； (f)呼吸道合胞病毒(RSV)F、M和/或N蛋白；(g)副流感病毒(PIV)F、HN和NP蛋白；(iii)將所述核轉(zhuǎn)染的DC和所述非貼壁PBMC組分中保留的T細胞共培養(yǎng)；(iv)在含添加的IL7+IL4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述刺激的T細胞9-12天；(V)在所述G-Rex設(shè)備中擴增所述CTL以維持最優(yōu)擴增；和(vi)驗證所述刺激T細胞的抗原特異性和同種異源反應性缺失。為了使用T細胞靶向非病毒相關(guān)且在免疫競爭個體中產(chǎn)生的腫瘤，可靶向非病毒腫瘤表達的抗原。在腫瘤細胞中表達或過表達的這些抗原包括(例如)生存素、PRAME(黑色素瘤優(yōu)先表達抗原)、NY-ES0-1、MAGE-A4、SSX2和SSX4，其通常在HL和NHL中表達且在具體實施方式
中靶向抗原特異T細胞。為此，本發(fā)明人開發(fā)了生成對多腫瘤抗原具有同時特異性的多克隆CTL系的方案，用覆蓋例如SSX2、生存素和MAGEA4的肽混物的主混物脈沖處理DC以初免CD4+和CD8+T細胞腫瘤特異性T細胞。靶向多抗原的該策略同時需最大化CTL功效并最小化腫瘤免疫逃逸。對于體外擴增，本發(fā)明定義了優(yōu)化的細胞因子混合物以促進最大特異性增殖而保持所述細胞系的多特異性。所得CTL體外具有功能且在酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELIspot)和胞內(nèi)細胞因子試驗中用TAA肽混物刺激時產(chǎn)生IFNy和TNF α，并在Cr51傳統(tǒng)釋放試驗中特異性裂解肽混物脈沖的和完整的抗原表達靶向細胞。本發(fā)明人成功從分離自大量預處理的HL患者的PBMC生成TAA-CTL，其能裂解自體腫瘤材料。用于癌癥的多腫瘤相關(guān)抗原特異T細胞本發(fā)明的某些實施方式中，開發(fā)了靶向TAA的CTL，所述TAA在腫瘤細胞上高度表達,包括例如 MAGE1、3、PRAME 和 NY-ES0-1 (見下)。在某些實施方式中，本發(fā)明涉及用于治療包括EBV陰性腫瘤在內(nèi)的具體腫瘤的CTL治療。在具體實施方式
中，本發(fā)明涉及用于多腫瘤抗原的CTL的生成。盡管本發(fā)明可用于任何癌癥包括肺癌、乳腺癌、腦癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、腎癌、肝癌、骨癌、頸椎癌、子宮癌、睪丸癌、前列腺癌、頭頸部腫瘤等，但本發(fā)明在某些實施方式中用于有關(guān)血液和骨髓的癌癥。在本發(fā)明的具體實施方式
中，設(shè)計所述CTL產(chǎn)品以特異對應所述個體的腫瘤所展現(xiàn)的抗原表達形式。因此，現(xiàn)在 將多抗原表達載體核轉(zhuǎn)染入DC提供了一種生成單CTL產(chǎn)品的途徑，所述產(chǎn)品響應個體腫瘤的獨立抗原特征。為此本發(fā)明人開發(fā)了生成同時針對多腫瘤抗原有反應性的CTL細胞系的方法，通過在細胞因子混合物IL7、12、15和IL6或IL27存在下用覆蓋感興趣抗原的肽混物脈沖處理的樹突細胞作為刺激物首先刺激9天，本發(fā)明人顯示其對產(chǎn)生具有多抗原特異性的CTL細胞系很重要(圖14)。隨后，用相同肽混物脈沖處理的DC重刺激所述CTL并培養(yǎng)在IL7和IL2中。在本發(fā)明的某些實施方式中包括生成細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的方法，所述細胞靶向來自兩種或更多病毒的至少一種抗原，所述方法包括步驟用多種質(zhì)粒核轉(zhuǎn)染個體的樹突細胞(DC)群，其中所述多種質(zhì)粒中的各質(zhì)粒編碼來自所述兩種或更多病毒之一的至少一種抗原，并從而產(chǎn)生表達并呈遞來自兩種或更多病毒的至少一種抗原的樹突細胞群；將所述個體的外周血單核細胞(PBMC)與所述核轉(zhuǎn)染DC(APC)接觸以產(chǎn)生抗原特異T淋巴細胞群，所述淋巴細胞能響應來自兩種或更多病毒的至少一種抗原；和在具有透氣膜的容器中的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)所述抗原特異T淋巴細胞，其中培養(yǎng)基組分包括IL-4和IL-7以產(chǎn)生靶向來自兩種或更多病毒的至少一種抗原的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。在具體實施方式
中，將所述CTL給予免疫受損的個體。在一些情況中，所述個體接受過異基因干細胞移植。在具體情況中，所述病毒可選自下組EBV、CMV、腺病毒(Adenovirus)、BK、HHV6、RSV、流感病毒(Inf luenza)、副流感病毒(Parainf luenza)、博卡病毒(Bocavirus)、冠狀病毒(Coronavirus)、LCMV、腿腺炎病毒(Mumps)、麻疫病毒(Measles)、偏肺病毒(Metapneumovirus)、細小病毒 B (Parvovirus B)、輪狀病毒(Rotavirus)、西尼羅河病毒(West Nile Virus)和其組合。在具體實施方式
中，所述細胞通過注射給予，如靜脈注射。在某些實施方式中包括生成細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的方法，所述細胞靶向來自兩種或更多病毒的至少一種抗原，所述方法包括步驟(1)用多種質(zhì)粒核轉(zhuǎn)染個體的樹突細胞(DC)群，其中所述多種質(zhì)粒中的各質(zhì)粒編碼來自所述兩種或更多病毒之一的至少一種抗原，和從而產(chǎn)生表達并呈遞來自兩種或更多病毒的至少一種抗原的樹突細胞群；或
(2)將來自個體的DC群體與肽文庫接觸，其中所述肽序列重疊以覆蓋部分或全部的整個病毒抗原，從而產(chǎn)生呈遞來自兩種或更多不同抗原的至少一種表位的DC群體(APC);和將所述個體的外周血單核細胞(PBMC)與所述核轉(zhuǎn)染DC(APC)接觸以產(chǎn)生抗原特異T淋巴細胞群，所述淋巴細胞能響應來自兩種或更多病毒的至少一種抗原；和在具有透氣膜的容器中的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)所述抗原特異T淋巴細胞，其中培養(yǎng)基組分包括IL-4和IL-7以產(chǎn)生靶向來自兩種或更多病毒的至少一種抗原的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。在一些實施方式中包括生成靶向兩種或更多腫瘤抗原的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的方法，所述方法包括步驟(I)用多種質(zhì)粒核轉(zhuǎn)染個體的DC群體，其中所述多種質(zhì)粒中的各質(zhì)粒編碼所述一種或多種腫瘤抗原的至少一種表位，從而產(chǎn)生表達并呈遞來自兩種或更多腫瘤抗原的至少一種表位的DC群體(APC);或(2)將來自個體的DC群體與肽文庫接觸，其中所述肽序列重疊以覆蓋部分或全部的完整抗原，從而產(chǎn)生呈遞來自兩種或更多不同抗原的至少一種表位的DC群體(APC);和將所述個體的外周血單核細胞(PBMC)與所述APC接觸以產(chǎn)生抗原特異T淋巴細胞群，所述淋巴細胞能響應來自兩種或更多腫瘤抗原的至少一種表位；和在具有透氣膜的容器中的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)所述T淋巴細胞，其中培養(yǎng)基組分包括IL-7、IL12、IL15和IL6或IL27。在具體實施方式
中，所述個體患有淋巴瘤或白血病。在某些實施方式中，所述T淋巴細胞通過例如注射給予對象，包括通過靜脈注射。


圖1A-1C顯示健康供體中TA特異CTL細胞系的產(chǎn)生。(A)用肽混物脈沖或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的DC作為APC生成CTL，且CTL在增加的細胞因子組合(如表I所示)存在下培養(yǎng)。(B)用肽混物(左圖)或DNA質(zhì)粒(右圖)作為抗原來源生成的CTl細胞系的IFN- Y酶聯(lián)免疫斑點分析。(C)所述細胞因子組合IL7、IL12、IL15和IL6生成的多病毒特異CTL對例如SSX2、生存素(Survivin)和MAGE-A4具有同時特異性，如IFN-Y酶聯(lián)免疫斑點所測。圖2顯不健康供體中功能性的TA特異CTL細胞系的生成。在4小時絡(luò)釋放試驗中，對生存素和SSX具有特異性的TAA-CTL能殺死肽混物脈沖的自體APC。圖3顯示通過本領(lǐng)域現(xiàn)有方法生產(chǎn)三病毒特異CTL。圖4顯示依照本發(fā)明至少某些方法的多病毒特異CTL的示例性生成。圖5顯示生成多病毒CTL的新方案的實施方式，使用質(zhì)粒作為抗原來源以及其他示例性改良例如添加細胞因子IL4和IL7以及在G-Rex生物反應器中培養(yǎng)。圖6顯示添加IL4和IL7的較高CTL特異性。圖7說明起始刺激時DC PBMC的接種密度的優(yōu)化，并顯示最優(yōu)激活需要至少I 20的比例。圖8顯示rCTL的特異性與用常規(guī)方案生成的相當。圖9顯示采用質(zhì)?；螂幕煳锷蒀TL的對比。圖10顯示質(zhì)粒與肽混物的CTL特異性對比。圖11說明肽混物的表位范圍更廣。圖12顯示用肽混物/生物反應器生成CTL。圖13說明細胞因子混合物例如IL7、IL12、IL15和IL27擴展了多腫瘤CTL的抗原特異性范圍。圖14說明CTL細胞系顯示出對兩種或更多抗原的同時特異性。圖15顯示腫瘤CTL可用轉(zhuǎn)基因IL7受體轉(zhuǎn)導。圖16說明所述轉(zhuǎn)基因IL7受體是有功能的。圖17說明圖17中的腫瘤CTL保持抗原特異性。圖18顯示臨床rCTL生成方法的結(jié)果，包括本發(fā)明系統(tǒng)的實施方式的多種組分。圖19顯示對5種示例性病毒的響應(CMV、EBV、Ads、BK和流感病毒)。所用的各病毒的抗原示于圖例中，其中柱從左到右的順序?qū)獔D例從上到下。
具體實施例方式與長期存在的專利法慣例一致，本說明書(包括權(quán)利要求)中使用的單詞“一”和“一個”與單詞包括一致，表不“一種或多種”。本發(fā)明的一些實施方式可由或主要由一種或多種元件、方法步驟和/或本發(fā)明的方法組成。預期本文所述任何方法或組合物可相對于本文所述任何其他方法或組合物實現(xiàn)。2009年12月8日提交的美國臨時專利申請61/267，761，" Culture Method forMore Efficient Production of Cells (《更有效生產(chǎn)細胞的培養(yǎng)方法》)"和2004年10月8日提交的美國專利申請?zhí)?0/961，814都通過引用全文納入本文。I.本發(fā)明大體實施方式本發(fā)明涉及生成CTL，所述CTL靶向多病原體(包括例如病毒或細菌)或靶向多腫瘤抗原。通過使用本發(fā)明提供的改良，所述CTL的生成比常規(guī)方法更快。所述改良包括具體類型的載體或具體肽文庫作為抗原來源的應用，和在細胞增殖培養(yǎng)基中某些細胞因子的應用，和特定細胞培養(yǎng)儀器的應用 以支持優(yōu)化細胞培養(yǎng)物的增殖和擴增。具體說，本發(fā)明提供產(chǎn)生多病毒特異CTL的方法，所述CTL用于治療被多病毒感染的個體(如異基因干細胞移植后感染多病毒的個體)或患具有特定腫瘤相關(guān)抗原的癌癥的個體。在多病毒和腫瘤相關(guān)抗原的實施方式中，所述抗原的來源可為質(zhì)?；螂奈膸?。在兩種情況的實施方式中，所述CTL可在具有透氣膜的容器中培養(yǎng)。在多病毒實施方式的具體實施方式
中，所述培養(yǎng)基含IL4和IL7。在所述腫瘤相關(guān)抗原實施方式的具體實施方式
中，所述培養(yǎng)基含IL-7、IL12、IL15和IL6或IL27。II.示例性細胞培養(yǎng)儀器和試劑本發(fā)明的某些實施方式中，任何細胞都在促進所需細胞增殖的條件下培養(yǎng)。具體情況中，所述細胞的培養(yǎng)條件描述于2009年12月8日提交的美國臨時專利申請61/267, 761, " Culture Method for More Efficient Production of Cells (更有效生產(chǎn)細胞的培養(yǎng)方法)"和2004年10月8日提交的美國專利申請?zhí)?0/961，814，其通過引用全文納入本文。在本發(fā)明具體實施方式
中，細胞在透氣細胞培養(yǎng)設(shè)備中培養(yǎng)。在某些情況中，所述細胞培養(yǎng)儀器使T細胞增殖到較高密度，而顯著降低細胞培養(yǎng)技術(shù)人員部分的操作。在一些實施方式中，所述設(shè)備具有透氣底部，其允許細胞下沉到底部以通過所述透氣底部獲取氧氣。在本發(fā)明的某些實施方式中，使用包括由多側(cè)面連接的頂部和底部的透氣細胞培養(yǎng)設(shè)備，其中所述底部包括透氣材料且至少部分側(cè)面包括透氣材料，從而可在所述裝置取至少兩種方向即垂直(certically)和水平時培養(yǎng)細胞。在具體實施方式
中有透氣設(shè)備且公開用于細胞培養(yǎng)的方法，所含細胞培養(yǎng)設(shè)備和方法包括米用一定高度和某個透氣表面積與培養(yǎng)基體積之比的培養(yǎng)基。這些設(shè)備和方法使細胞培養(yǎng)效率和規(guī)模放大效率得到改良。本文公開的某些實施方式提供更有效的細胞培養(yǎng)設(shè)備和方法，其通過產(chǎn)生可整合各種新特性的透氣設(shè)備來克服現(xiàn)有設(shè)備和方法的限制。這些不同特性包括不依賴氣/液界面的的氣體交換、增加的培養(yǎng)基高度、減少的透氣表面積與培養(yǎng)基體積比，透過所述設(shè)備的氣體交換、側(cè)面壁、包括傳統(tǒng)材料的細胞支持支架、和增加的透氣材料厚度。在具有包括較低透氣材料的透氣設(shè)備的具體實施方式
中，增加培養(yǎng)基高度超出常規(guī)所定或市售設(shè)備所允許的高度是有利的，從而細胞培養(yǎng)基中底物的轉(zhuǎn)送起作用。將透氣表面積與培養(yǎng)基體積之比降到現(xiàn)有細胞培養(yǎng)基設(shè)備或方法所未預期的比例也能提高培養(yǎng)效率。其使培養(yǎng)基高度提高而不相應增加設(shè)備長度或?qū)挾?。在?yōu)選的實施方式中，使培養(yǎng)基高度增加或透氣表面積與培養(yǎng)基體積之比降低。也可使培養(yǎng)基高度增加且透氣表面積與培養(yǎng)基體積之比降低。若設(shè)計目標是相對于常規(guī)降低透氣表面積與培養(yǎng)基體積之比，則可采用各種用于透氣設(shè)備和方法的實施方式。其可用現(xiàn)有設(shè)備的形式，或完全為新形式。若所述形式為直徑至多小于50mm的透氣皮氏培養(yǎng)皿，則所述透氣表面積與培養(yǎng)基體積之比優(yōu)選小于2. 74cm2/ml。若所述形式為直徑50mm或更大的透氣皮氏培養(yǎng)皿，則所述透氣表面積與培養(yǎng)基體積之比優(yōu)選小于I. 96cm2/mL·若所述形式為384孔或更多的多孔組織培養(yǎng)板，則所述透氣表面積與培養(yǎng)基體積之比優(yōu)選小于I. IOcmVml ;少于24孔-少于384孔，則所述透氣表面積與培養(yǎng)基體積之比優(yōu)選小于I. 03cm2/ml ；24孔或更少，則所述透氣表面積與培養(yǎng)基體積之比優(yōu)選小于O. 97cm2/ml。若所述形式為兩側(cè)可透氣的透氣筒，則所述表面積與培養(yǎng)基體積之比優(yōu)選小于O. 79cm2/mL·若所述形式為細胞培養(yǎng)袋，則所述透氣表面積與培養(yǎng)基體積之比優(yōu)選小于l.OcmVml。若所述形式為分隔設(shè)備且設(shè)備中的所有培養(yǎng)基完全處于所述半透膜之上，則所述透氣表面積與培養(yǎng)基體積之比優(yōu)選小于1.74cm2/ml。若所述形式為分隔設(shè)備且設(shè)備中的所有培養(yǎng)基未完全處于所述半透膜之上，則所述透氣表面積與培養(yǎng)基體積之比優(yōu)選小于O. 3 lcm2/mlo所述較低的透氣材料可為任何膜、膜片，或用于透氣細胞培養(yǎng)設(shè)備的材料如硅、氟代乙烯聚丙烯、聚烯烴和乙烯乙酸乙烯酯共聚物。了解透氣材料及其在細胞培養(yǎng)中的應用的大量來源可用于額外的指導，包括共同待審的美國專利申請?zhí)?0/460，850，其全文納入本文。單詞膜片和膜的使用表示穿過所述透氣材料的距離非常薄，且本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當所述設(shè)備和方法的透氣材料超出膜片和膜的相關(guān)厚度時，本發(fā)明的實施方式起作用。因此，有助于所述培養(yǎng)物的氣體交換的所述設(shè)備部分在本文中稱為透氣材料。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到所述透氣材料應基于各種特性選擇，所述特性包括透氣性、濕氣滲透性、根據(jù)所需的細胞和細胞相互作用而改變的能力、光學凈度、物理強度等。存在各種資料描述已成功用于細胞培養(yǎng)的透氣材料的類型。通常優(yōu)選娃。其具有優(yōu)良的氧滲透性，可光學觀測，不易刺破，通常不結(jié)合細胞，且可容易的制成各種形狀。若用硅，需要氣體轉(zhuǎn)移的區(qū)域可薄于約O. 2英寸、約O. I英寸、約O. 05英寸或約O. 030英寸。所述設(shè)備的壁高度在設(shè)備規(guī)模放大效率上起重要作用。本發(fā)明的目的是提供增加的培養(yǎng)基高度，從而增加設(shè)備效率。所述壁的高度確定設(shè)備中能存在多少培養(yǎng)基。添加培養(yǎng)基會提供更大的底物源和更大的廢品池。規(guī)模放大期間需要更多培養(yǎng)基時通過增加壁高度，所述設(shè)備的幾何結(jié)構(gòu)與培養(yǎng)器、無菌操作臺和生物危險品垃圾袋的形狀更相容。此外，體積相對于細胞駐留的表面積的增長可使每細胞存在更多的培養(yǎng)基。這可產(chǎn)生降低加料頻率的作用，從而減少工作和污染風險。其還可具有增加設(shè)備覆蓋面積的每平方厘米存在的細胞數(shù)量的作用。結(jié)構(gòu)化壁以使培養(yǎng)基體積增長還可具有消除培養(yǎng)基蒸發(fā)影響的有利作用。在某個實施方式中，壁能依賴于氣/液界面使培養(yǎng)基駐留高度超過設(shè)備高度且更優(yōu)選地超過常規(guī)靜態(tài)透氣設(shè)備。例如，壁的高度超出3_，且在一些情況中超出2. Ocm,因此會提供優(yōu)勢。通過給設(shè)備用戶提供選擇為設(shè)備添加比現(xiàn)有透氣設(shè)備更多培養(yǎng)基可產(chǎn)生許多優(yōu)勢，包括每設(shè)備存放更多細胞的能力、更低頻率給所述設(shè)備加料和將所述設(shè)備規(guī)模放大而不增加覆蓋面積。壁可包括任何生物相容性材料且需以形成液體密封的方式配備低透氣性材料。給壁配備低透氣性材料的方法包括粘合劑結(jié)合、熱密封、壓縮擠壓和任何通常用于生成部件之間密封的其他方法。作為選擇，壁和低透氣性材料可由相同材料形成并制造為 單一整體。在某些實施方式中有多孔組織培養(yǎng)設(shè)備如板，所述多孔各由含透氣材料的孔底組成且孔側(cè)壁超過某一高度如超過5謹、7謹、9謹、10mm、10. 5謹、10. 7謹、10. 9mm. 11mm、11. 1mm. 11. 5mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、16. 5mm、17mm、18mm等。在具體實施方式
中，透氣材料的表面積與細胞培養(yǎng)隔室(如孔底和側(cè)壁)體積之比小于特定大小，例如小于3、2、
1、0·58、0· 94、0· 91cm2/ml。在具體實施方式
中，本發(fā)明使用透氣筒，其中所述筒包括含透氣材料的較低的壁和較高的壁，其中所述較低和較高的壁粘連中間側(cè)壁形成細胞培養(yǎng)隔室，其中所述中間側(cè)壁高度超過 O. 5cm、0. 75cm、0. 9cm、I. Ocm、I. 2cm、I. 27cm、I. 3cm、I. 4cm、I. 5cm 和 I. 6cm。在某些情況中，本發(fā)明所用的透氣細胞培養(yǎng)設(shè)備基本由靜態(tài)細胞培養(yǎng)容器組成，其中所述細胞培養(yǎng)容器包括頂部、底部和側(cè)壁，其 中至少所述底部包括至少部分無孔透氣材料(所述底部不是弧形)、所述細胞培養(yǎng)容器的接入孔和至少部分側(cè)壁，所述側(cè)壁所處高度大于某一到所述底部表面的量，如大于3cm、4cm、5cm、5. 2cm、6cm、7cm等。在一些實施方式中，透氣細胞培養(yǎng)設(shè)備包括靜態(tài)細胞培養(yǎng)容器，其中所述細胞培養(yǎng)容器包括頂部、底部和側(cè)壁，其中至少所述底部包括至少部分無孔透氣材料(所述底部不是弧形)、所述細胞培養(yǎng)容器的接入孔且不包括混合儀器，其中所述側(cè)壁未被所述接入孔中斷，當所述頂部未完全包含透氣材料時至少低于某一到所述底部的量(如lcm、l. 5cm、
2.0cm、2. 5cm、2. 6cm、2. 7cm、2. 8cm、3. Ocm等)或所述頂部完全包含透氣材料時至少超出某一到所述底部的量(如 I. 5cm、I. 7cm、I. 8cm、I. 9cm、2. 0cm、2. lcm、2. 2cm、2. 3cm 等)。在本發(fā)明的一些實施方式中包括培養(yǎng)細胞的方法，所述方法包括形成含透氣底部的細胞培養(yǎng)容器；和添加細胞培養(yǎng)基并將預定細胞類型和預定量的細胞接種到細胞培養(yǎng)容器中，從而所述細胞類型和細胞培養(yǎng)基駐留于所述細胞培養(yǎng)容器中；和使所述預定量的細胞下沉到透氣底部以建立第一細胞表面密度，所述第一細胞表面密度定義為細胞培養(yǎng)的接種期駐留于容器表面積的細胞/每平方厘米；和所述第一細胞表面密度歸一化為細胞/平方厘米后低于常規(guī)方法建立的第一細胞表面密度，從而在燒瓶或多孔板上培養(yǎng)給定的細胞類型，且不混合所述細胞培養(yǎng)基并使所述細胞類型生長到第二細胞表面密度；和所述第二細胞表面密度高于常規(guī)方法可得到的最大細胞表面密度。對于多病毒CTL的生成，可采用I : 10-20的DC PBMC比。細胞可以30ml培養(yǎng)基+IL4+IL7的體積在G-Rex40中培養(yǎng)。在第5_7天計數(shù)細胞，在一些實施方式中，若細胞多于5xl07則所述培養(yǎng)物會分成I : I且少數(shù)具有新鮮培養(yǎng)基。III.腫瘤抗原將多TAA特異性CTL用于治療和/或預防癌癥的實施方式中，可靶向各種TAA。腫瘤抗原為腫瘤細胞產(chǎn)生的物質(zhì),其引起宿主免疫應答。示例性的腫瘤抗原至少包括下述腸癌癌胚抗原(CEA);卵巢癌CA-125 ;乳腺癌MUC-I或上皮腫瘤抗原(ETA)或CA15-3 ;惡性黑色素瘤的酪氨酸酶或黑色素瘤相關(guān)抗原(MAGE);和各種類型腫瘤的ras、p53的異常產(chǎn)物；肝細胞瘤、卵巢癌或睪丸癌的α-胎甲球蛋白；睪丸癌男性患者的hCG的β亞基；前列腺癌的前列腺特異抗原；多發(fā)性骨髓瘤或一些淋巴瘤中的β 2微球蛋白；結(jié)腸直腸癌、膽管癌和胰腺癌的CA19-9 ;肺癌和前列腺癌的嗜鉻粒蛋白A ;黑素瘤、軟組織肉瘤和乳腺癌、結(jié)腸癌和肺癌的ΤΑ90。本領(lǐng)域已知腫瘤抗原的例子,例如Cheever等，2009中所述，其通過引用全文納入本文。腫瘤抗原的具體例子至少包括例如CEA、MHC、CTLA-4、gpl00、間皮素、PD-LUTRP1、CD40、EGFP、Her2、TCR α、trp2、TCR、MUCl、cdr2、ras、4-1BB、CT26、GITR、0X40、TGF-β · WTI、MUC1、LMP2、HPV E6 E7、EGFRvIII、HER_2/neu、MAGE A3、p53 非突變體、NY_ES0_1、PSMA、⑶2、Melan A/MART I、Ras突變體、gp 100、p53突變體、蛋白酶3 (PRl)、bcr-abl、釀氛酸酶、生存素、PSA、hTERT、EphA2、PAP、ML-IAP、AFP、EpCAM、ERG(TMPRSS2 ETS 融合基因)、NA17、PAX3、ALK、雄激素受體、細胞周期蛋白81、多聚唾液酸、1^0隊1^0(、了1^-2、0)3、海藻糖611、間皮素、PSCA、MAGE Al、sLe (a)、CYPlBl、PLACl、GM3、BORIS、Τη、GloboH、ETV6-AML、NY-BR-URGS5、SART3、STn、碳酸酐酶 IX、PAX5、0Y-TES1、精液蛋白 17、LCK, HMWMAA, ΑΚΑΡ-4、SSX2、XAGEl、Β7Η3、豆莢蛋白、Tie 2、Page4、VEGFR2、MAD-CT-U FAP, PDGFR- β、MAD-CT-2 和 Fos相關(guān)抗原I。
IV.生成肽混物文庫在某些方面，本文所用的肽混物可來自由15個氨基酸長度且彼此重疊11個氨基酸的肽組成的市售肽文庫。例子包括來自JPT技術(shù)公司(JPT technologies)或美天旎(Miltenyi)公司的那些。在具體實施方式
中，所述肽為例如7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34 或 35 或更多個氨基酸長度，且有 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34個氨基酸長度的重疊。V.聯(lián)合治療本發(fā)明的某些實施方式中，本發(fā)明臨床方面的方法和過度增殖性疾病治療中有效的其他試劑如抗癌試劑結(jié)合。“抗癌”試劑能對對象的癌癥產(chǎn)生不利影響，例如通過殺死癌細胞、誘導癌細胞凋亡、降低癌細胞生長速率、降低轉(zhuǎn)移的發(fā)生率或數(shù)量、降低腫瘤尺寸、抑制腫瘤生長、減少對腫瘤或癌細胞的血液供給、促進對癌細胞或腫瘤的免疫應答、阻止或抑制癌癥發(fā)展、或延長患癌對象的壽命。更一般地，這些其他組合物會以有效殺死或抑制細胞增殖的組合量提供。該過程可涉及用表達構(gòu)建體和試劑或多種因子同時接觸所述癌細胞。這可通過用單一組合物或包括兩種試劑的藥物制劑接觸所述細胞，或者通過用兩種不同組合物或制劑同時接觸所述細胞來實現(xiàn)，其中一種組合物包括所述表達構(gòu)建體而另一種包括所述第二試劑。耐受化療和放療試劑的腫瘤細胞是臨床腫瘤學中的主要問題。當前癌癥研究的一個目的是通過結(jié)合基因治療發(fā)現(xiàn)改善化療和放療效力的方法。例如，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)遞送單純皰疹胸苷激酶(HS-tK)基因到腦腫瘤時，其成功誘導了對抗病毒試劑更昔洛韋的易感性(Culver，等，1992)。本發(fā)明的內(nèi)容中，除了其他促調(diào)亡或細胞周期調(diào)控試劑外，預期細胞治療可相似地與化療、放療或免疫治療介入聯(lián)用?；蛘?，本發(fā)明治療可先于或在其他試劑治療之后，間隔數(shù)分鐘到數(shù)周。在所述其他試劑和本發(fā)明對所述個體分別應用的實施方式中，一般需保證各遞送的時間之間沒有顯著的時間段，從而所述試劑和發(fā)明治療法仍可在細胞上產(chǎn)生有利的組合效果。在該情況下，預期可用兩種形式在彼此約12-24小時內(nèi)接觸所述細胞，更優(yōu)選地在彼此約6-12小時內(nèi)。然而在一些情況中，可能需要顯著延長治療時間，其中各給藥之間間隔數(shù)天(2、3、4、5、6或7)到數(shù)周(1、2、3、4、5、6、7 或 8)?？墒褂酶鞣N組合，本發(fā)明為“A”，所述第二試劑如放療或化療為“B”。A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/AB/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A預期所述治療循環(huán)在需要時重復。還預期各種標準治療法以及外科手術(shù)介入可與本發(fā)明細胞治療法聯(lián)用。A.化療癌癥治療還包 括基于化學和放射治療的各種組合治療。組合化療包括例如，凱素(abraxane)、六甲蜜胺、多西他賽、赫賽汀、甲氨蝶呤、諾肖林、以諾雷德、順鉬(CDDP)、卡鉬、丙卡巴肼、氮芥、環(huán)磷酰胺、喜樹堿、異環(huán)磷酰胺、美法侖、苯丁酸氮芥、白消安、亞硝基脲(nitrosurea)、更生霉素、柔紅霉素、阿霉素、博來霉素、普卡霉素、絲裂霉素、依托泊苷(VP16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受體結(jié)合試劑、紫杉醇、吉西他濱、諾維本、法尼基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑、反鉬(transplatinum)、5_氟尿喃唳、長春新堿、長春堿和甲氨蝶呤、或上述任何類似物或衍生變體。B.放療造成DNA損傷并已廣泛使用的其他因素包括通常稱為Y射線、X射線和/或?qū)⒎派湫酝凰刂苯舆f送給腫瘤細胞。還包括其它形式的DNA損傷因素，如微波和紫外線輻射。所有這些因素很有可能會對DNA、DNA前體、DNA復制和修復、染色體裝配和維持造成較寬范圍的損傷。X射線的劑量范圍為從長時間的每日劑量50-200倫琴(3-4周)到單次劑量2000-6000倫琴。放射性同位素的劑量范圍差異很大，取決于所述同位素的半衰期、發(fā)射輻射的強度和類型、以及腫瘤細胞的攝入。本文所用術(shù)語“接觸”和“暴露”用于細胞時，描述治療構(gòu)建體和化療或放療試劑遞送給靶細胞或放置成與所述靶細胞直接并置所用的方法。為了實現(xiàn)細胞殺死或靜止，以有效殺死所述細胞或阻止其分裂的結(jié)合量將兩種試劑遞送給細胞。C.免疫治療一般免疫治療法依賴于使用免疫效應細胞和分子靶向并破壞癌細胞。所述免疫效應物可為例如對腫瘤細胞表面的一些標記特異的抗體。抗體本身可用作治療效應物或其可招募其他細胞以實際影響細胞殺死。所述抗體還可結(jié)合藥物或毒素(化療、放射性核素、蓖麻毒蛋白A鏈、霍亂毒素、百日咳毒素等)并僅作為祀向試劑?；蛘咚鲂锟蔀閿y帶表面分子的淋巴細胞，所述分子直接或間接與腫瘤細胞靶標相互作用。各種效應細胞包括細胞毒性T細胞和NK細胞。因此，免疫治療可用作組合治療的部分，與本細胞治療聯(lián)用。下面討論組合治療的一般方法。通常，所述腫瘤細胞必須帶有一些可靶向的標記，即不在大多數(shù)其他細胞上存在。存在許多腫瘤標記且任何這些可適于在本發(fā)明的內(nèi)容中靶向。常見的腫瘤標記包括癌胚抗原、前列腺特異抗原、泌尿系統(tǒng)腫瘤相關(guān)抗原、致死抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸路易斯抗原、MucA, MucB, PLAP、雌激素受體、層連蛋白受體、erb B和pl55。D.基因在另一實施方式中，所述弟_■治療為基因治療，其中在本發(fā)明臨床實施方式之iu、之后或同時給予治療性多核苷酸。本發(fā)明涵蓋各種表達產(chǎn)物，包括細胞增殖誘導劑、細胞增殖抑制劑或細胞程序性死亡調(diào)節(jié)劑。
E.外科手術(shù)約60%的癌癥患者會經(jīng)歷一些類型的外科手術(shù)，包括預防性、診斷性或分期、治愈性和緩解性外科手術(shù)。治愈性外科手術(shù)是可與其他治療法聯(lián)用的癌癥治療，所述治療法如本發(fā)明的治療、化療、放療、激素治療、基因治療、免疫治療和/或其他治療。治愈性外科手術(shù)包括切除術(shù)，其中所有或部分癌組織被物理移除、切割和/或破壞。腫瘤切除術(shù)指物理移除至少部分腫瘤。除了腫瘤切除術(shù)，外科手術(shù)治療包括激光手術(shù)、冷凍手術(shù)、電外科手術(shù)和顯微鏡控 制手術(shù)(莫氏(Mohs)手術(shù))。還預期本發(fā)明可與淺表性癌、初癌或附帶量的正常組織移除聯(lián)用。所有癌細胞、組織或腫瘤的部分切割后，可在體內(nèi)形成空腔。治療可通過灌注、直接注射或局部區(qū)域應用其他抗癌治療來實現(xiàn)。該治療可例如每1、2、3、4、5、6或7天或每I、
2、3、4和5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月重復。這些治療也可用不同的劑量。F.其他試劑預期其他試劑可與本發(fā)明聯(lián)用以改進治療的治療效力。這些其他試劑包括免疫調(diào)節(jié)劑、影響細胞表面受體和GAP連接上調(diào)的試劑、細胞抑制和分化試劑、細胞粘附抑制齊U、或增加所述過度增殖性細胞對凋亡誘導物的敏感性的試劑。免疫調(diào)節(jié)劑包括腫瘤壞死因子；干擾素α、β和Y ;IL-2和其他細胞因子；F42K和其他細胞因子類似物；或ΜΙΡ-1、MIP-I β、MCP-U RANTES和其他趨化因子。還預期通過在過度增殖性細胞上建立自分泌或旁分泌效應，細胞表面受體或其配體如Fas/Fas配體、DR4或DR5/TRAIL的上調(diào)會增強本發(fā)明的凋亡誘導能力。通過提高GAP連接的數(shù)量來增加細胞間信號傳導會增加對鄰近過度增殖性細胞群體的抗過度增殖效應。在其他實施方式中，細胞抑制或分化試劑可與本發(fā)明聯(lián)用以改進所述治療的抗過度增殖效力。細胞粘附抑制劑預期可改善本發(fā)明的效力。細胞粘附抑制劑的例子為粘著斑激酶(FAK)抑制劑和洛伐他汀。還預期其他增加過度增殖細胞對凋亡敏感性的試劑如抗體c225可與本發(fā)明聯(lián)用以改善治療效力。激素治療也可與本發(fā)明聯(lián)用或與前述任何其他癌癥治療聯(lián)用。所述激素的應用可在某些癌癥如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或?qū)m頸癌的治療中采用以降低某些激素如睪丸激素或雌激素的水平或阻礙其效應。該治療常與至少一種其他癌癥治療聯(lián)用作為治療選擇或降低轉(zhuǎn)移的風險。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑和/或組氨酸脫乙酰基酶抑制劑。示例性的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑包括例如5-氮雜胞苷、5-氮雜-2'-脫氧胞苷、I-β -D-阿糖胞苷-5-氮雜胞嘧啶和二氫-5-氮雜胞苷。示例性的HDAC抑制劑包括異羥肟酸、如曲古抑菌素A ;環(huán)四肽(如曲潑素(trapoxin)B)和縮肽類(depsipeptides);苯酰胺類；親電酮；和脂族酸化合物如丁酸苯酯和丙戊酸。VI.實施例提供下述實施例是為了更完整地說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。然而其決不構(gòu)成對本發(fā)明廣泛范圍的限制。A.多病毒特異CTL圖3提供生成用于過繼轉(zhuǎn)移的病毒特異性(例如)CTL的常規(guī)方法。供體來源的B細胞先轉(zhuǎn)化入EBV轉(zhuǎn)化的淋巴母細胞系(LCL)以用作抗原呈遞細胞。一旦建立(可花費4-6周)，用表達來自CMV的免疫優(yōu)勢pp65抗原的腺病毒載體轉(zhuǎn)導供體PBMC。PBMC中的單核細胞優(yōu)選進行轉(zhuǎn)導并刺激病毒特異性T細胞，然后所述細胞在額外刺激循環(huán)中擴增，用轉(zhuǎn)導有相同載體的LCL作為APC(Leen等，2006)。所述方法耗時且昂貴(生成臨床級別的Ad載體和EBV病毒)。本發(fā)明的一些實施方式中生成多病毒特異性CTL(圖4)以替代使用Ad載體和EBV病毒作為用于T細胞刺激的抗原來源。生成編碼來自EBV、CMV和Ad (例如)的病毒抗原的DNA質(zhì)粒。這些可通過核轉(zhuǎn)染在APC中表達，然后可收集所述APC并用于刺激T細胞(Gerdemann等,2009)。在本發(fā)明中，發(fā)明人現(xiàn)已開發(fā)用質(zhì)?；螂幕煳镒鳛榭乖瓉碓春湍承嵤┓绞街械钠渌牧既缭谂囵B(yǎng)CTL的細胞培養(yǎng)基中添加細胞因子IL4和IL7來生成多病毒CTL的新方案。所述實施方式用于維持CTL細胞系中反應性的廣度，且在所述G-Rex生物反應器中培養(yǎng)能最大化T細胞擴增(圖5)。 存在IL4和IL7時生成的CTL能識別來自所述靶抗原/病毒的廣泛肽庫(圖9、10、11)，且具有最小的同種異源反應性即不識別來自潛在接受者的正常細胞(圖12)。因此，本發(fā)明產(chǎn)生的CTL具有高度病毒特異性且不識別預期接受者的未感染細胞并因此在輸注后不誘導移植物抗宿主病(GVHD)。對于多病毒特異性CTL的示例性質(zhì)粒，可使用表達(例如)來自所述靶病毒Ad、EBV和CMV的2或3或更多種免疫原性基因的多順反子質(zhì)粒(例如)。一個示例性腺病毒構(gòu)建體(7970bp)含六鄰體IRES 五鄰體(2858bp六鄰體和1715bp五鄰體)。一個示例性 EBV 構(gòu)建體(6641bp)包括 EBNAl Λ GALMP2: IRES:BZLFl (1926bp EBNAl Δ ；1493bp LMP2 ;和 737bp BZLFI) 一個示例性 CMV 構(gòu)建體(6583bp)包括 IEl: IRES:pp65 (1471bp IEl 和1686bp pp65)。所述雙順反子質(zhì)粒在激活T細胞上有效。為了生成所述質(zhì)粒,在某些方面一種或多種下述特性有用主鏈盡可能小(例如，2.8-3kbp);優(yōu)化的啟動子，如CMV啟動子(SV40增強子)；沒有抗生素抗性基因；且與人基因組DNA不同源。在一些情況中，所述質(zhì)粒不含抗生素抗性基因，而是含通過蔗糖(果糖基轉(zhuǎn)移酶(SacB)在細菌中條件致死)(自然科技公司(Nature Technology Corporation))的細菌選擇。在本發(fā)明的某些實施方式中，所述CTL細胞系是⑶4+和⑶8+T細胞的混合物。在一些情況中，再激活的細胞針對不同靶抗原的預期分布如下抗原主要T細胞限制IE1CD8pp65CD8EBNAICD4LMP2CD4+CD8BZLF1CD8六鄰體CD4五鄰體CD4對于圖6的細胞因子，IL4和/或IL7至少在某些培養(yǎng)中提高病毒反應性細胞的頻率。圖7說明起始刺激時DC PBMC的接種密度的優(yōu)化，并顯示最優(yōu)激活需要至少I : 20的比例。圖18顯示臨床rCTL生成過程的結(jié)果，包括本發(fā)明系統(tǒng)的實施方式的多種組成，例如下述I)DC核轉(zhuǎn)染；2)EBV、CMV、Adv-Ag質(zhì)粒；3)添加細胞因子IL4/IL7 ；4)G-Rex中的Tcell擴增；和5)DC的生成。圖8顯示本發(fā)明人生成的CTL與用常規(guī)方案生成的CTL有相似特性，但只用了部分時間。這些細胞體內(nèi)應安全且與最小的同種異源反應性相關(guān)，如鉻釋放試驗所評估。對于快速多病毒rCTL的生成，可用本領(lǐng)域任何有用的方法核轉(zhuǎn)染所述DC，包括例如Amaxa 核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)或InVitrogen 核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。多病毒CTL也可通過用覆蓋所述革巴抗原的肽混物脈沖處理DC或通過用感興趣的抗原直接刺激PBMC而快速生成。淋巴瘤表達的模式抗原包括例如SSX2、生存素、MAGE-4、PRAME和NY-ES0-1。白血病表達的模式抗原包括例如生存素、WT1、蛋白酶3和PRAME。在某些實施方式中，完整抗原來源包括肽混物(P印Mix)，其為肽的重疊文庫，例如15聚體肽(且具有不賦予HLA限制的優(yōu)點)。
實施例I用于CTL刺激的樹突細胞的生成和DNA核轉(zhuǎn)染樹突細胞是已知的最有力的抗原呈遞細胞。用表達抗原的成熟樹突細胞(DC)刺激外周血(PB) T細胞可導致抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的再激活。DC可通過在GM-CSF和IL-4中培養(yǎng)而從粘附性PB單核細胞(PBMC)分化?？乖赏ㄟ^用DNA質(zhì)粒核轉(zhuǎn)染而導入DC，然后所述DC可通過在含ILl β、IL6、TNFa和PGE-2的細胞因子混合物中培養(yǎng)而成熟。在本實施例中，提供示例性方法用于制備和核轉(zhuǎn)染樹突細胞，作為生成治療性T細胞所需的組分。某些實施方式中的測試樣可含來自患者或供體的肝素化外周血(或預先冷凍的PBMC)。感染性疾病測試可在血液收集7天內(nèi)進行。制備來自新鮮血液的PBMC (若使用凍存血液，則如下所述進行)。環(huán)境溫度下(室溫)在等體積D-PBS或RPMI 1640中稀釋肝素化的外周血(理想上60ml)。在50ml離心管中小心地用約20ml稀釋的血液覆蓋約IOml淋巴細胞分離劑。根據(jù)需要調(diào)整以采用所有可用細胞。環(huán)境溫度下400 X G離心40分鐘。保存3 X Iml等分血漿并存于-80°C。收獲PBMC界面到等體積D-PBS或RPMI 1640中。環(huán)境溫度下450 x G離心10分鐘。吸出上清?！拜p彈手指”松動團塊并在20ml D-PBS或RPMI 1640中重懸。移出20 μ I細胞。添加20 μ 150%紅細胞裂解緩沖液并用血球計計數(shù)。對于制備預先冷凍的PBMC，37°C解凍細胞，每Iml冷凍細胞在IOml溫熱CellGenixDC培養(yǎng)基中稀釋并計數(shù)。對于初始DC，按如下進行。計算每板接種了約10 X IO6PBMC(7-14X IO6的范圍)的6孔板的35mm孔的數(shù)量以使用所有可用的PBMC。環(huán)境溫度下400 x G離心5分鐘。每板重懸2mL細胞用于接種。轉(zhuǎn)移到37°C/5% CO2孵育器中持續(xù)2小時以粘附DC前體。用IOml D-PBS或RPMI沖洗孔3次，合并含所述PBMC非粘附部分的上清液。對于剩余的粘附細胞，每孔添加2ml含1000單位/毫升IL-4和800單位/毫升GM-CSF的DC培養(yǎng)基。將燒瓶/板放回37°C，5% CO2的孵育器。若沒有預先凍存，可凍存非粘附細胞以將來使用應答T細胞。添加未成熟DC。第3或4天，補充IL-4到1000單位/毫升和GM-CSF到800單位/毫升。制作含20X GM-CSF和IL-4的CellGenix培養(yǎng)基并每孔添加100 μ I。DC成熟時，第5或6天通過溫和重懸收獲未成熟DC (此時應僅有很少細胞粘附所述燒瓶)。為了移除剩余的粘附細胞，添加5ml冷D-PBS持續(xù)約I分鐘并溫和重懸且結(jié)合未成熟DC。用血球計計數(shù)細胞。僅計 數(shù)大樹突細胞。以每mL 2xl06在CellGenix培養(yǎng)基中重懸DC并在24孔板上每孔等分1ml。在未使用的孔中添加無菌水。添加含所述細胞因子成熟混合物的Iml DC培養(yǎng)基。細胞因子終濃度GM-CSF800U/mlIL-41000U/mlTNF- a 10ng/mlPGE-II g/mlIL-I β lOng/mlIL-6100ng/ml在37°C，5% CO2孵育器中孵育DC 20-28小時。20-28小時后用3ml轉(zhuǎn)移液管通過溫和重懸收獲24小時成熟DC。用血球計計數(shù)細胞。僅計數(shù)大樹突細胞。對于樹突細胞的核轉(zhuǎn)染，于37°C /5% CO2孵育器內(nèi)的6孔板中預熱4ml Cell Genix培養(yǎng)基。將收獲的樹突細胞分裝于3個(管1-3) 15ml離心管中。DC細胞數(shù)/管應不低于O. 5xl06且不高于2xl06。以200g離心DC 10分鐘。吸出上清并在DC團塊中添加DNA質(zhì)粒至終濃度為每管5 μ g。在管 I 中添加 DNA 質(zhì)粒 NTC ΙΕ1-ρρ65,管 2 中添加 DNA 質(zhì)粒 NTC EldGALMP2_BZLFl和管3中添加DNA質(zhì)粒NTC六鄰體-五鄰體。用100 μ I核轉(zhuǎn)染溶液重懸DC和DNA，混合良好并轉(zhuǎn)移到核轉(zhuǎn)染小試管中。將所述小試管置于核轉(zhuǎn)染儀(Nucleofector)中，選擇程序U2，按開始按鈕開始核轉(zhuǎn)染。核轉(zhuǎn)染后立即添加500 μ I所述預熱的培養(yǎng)基到所述小試管中并將該小試管轉(zhuǎn)移到37°C /5% CO2孵育器中。10分鐘后將核轉(zhuǎn)染的DC轉(zhuǎn)移到12孔組織培養(yǎng)處理的板中并添加I. 5ml含所述細胞因子成熟混合物的DC培養(yǎng)基。細胞因子終濃度GM-CSF800U/mlIL-41000U/mlTNF- a 10ng/mlPGE-II g/mlIL-I β lOng/mlIL_6100ng/ml在37°C，5% CO2孵育器中孵育12-18小時。收獲DC并輻照以用作APC。收獲并計數(shù)。用30Gy輻照DC以用作APC。用IOml培養(yǎng)基清洗一次。用CTL培養(yǎng)基以每毫升2或Ix IO5重懸。DC現(xiàn)在即可用作PBMC或CTL的刺激物。實施例2用質(zhì)粒核轉(zhuǎn)染的樹突細胞生成抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)本實施例涉及抗原特異性細胞毒性淋巴細胞的示例性加工。可采用本過程制備細胞用于將質(zhì)粒核轉(zhuǎn)染的DC用作抗原呈遞細胞的方案。在某些情況中，用編碼例如六鄰體-IRES-五鄰體、IEl-IRES-pp65 和 EldGALMP2-IRES_BZLFl 的質(zhì)粒核轉(zhuǎn)染 DC?？乖禺愋约毎拘訲細胞系(CTL)可通過用表達來自DNA質(zhì)粒的抗原的自體抗原呈遞細胞(APC)刺激外周血單核細胞(PBMC)來生成。在本發(fā)明的某些實施方式中，所述APC為所述樹突細胞(DC)。樹突細胞是可被有效核轉(zhuǎn)染并用于生成來自患者的病毒特異T細胞的有效APC。在某些實施方式中，質(zhì)粒核轉(zhuǎn)染的樹突細胞可用于第二或隨后刺激。在所用的培養(yǎng)條件下，過快生長的T細胞系應含有對感興趣抗原(CMV-IE1和pp65，腺病毒抗原和EBV抗原)特異的T細胞。第一次刺激時添加細胞因子(IL-4和IL-7)。可使用來自所述患者的肝素化外周血，或預先冷凍的患者PBMC。感染性疾病測試可在血液收集7天內(nèi)(取決于具體方案)進行。制備來自所述患者或供體的質(zhì)粒核轉(zhuǎn)染的樹突細胞(DC)?？捎嬎闼璧淖罱K擴增的T細胞數(shù)量。根據(jù)該患者的體表面積、預測的劑量水平和是否允許額外劑量，需要足夠的細胞用于患者劑量和QC檢測。在某些實施方式中，允許所述患者可以比預期更高劑量水平參與。DC應在CellGenix培養(yǎng)基中制備以確保其在具體情況中不呈遞胎牛血清抗原。存在FCS時進行初始CTL。從新鮮血液中制備單核“應答”細胞(對于冷凍血液見下)。環(huán)境溫度下(室溫)在等體積D-PBS或RPMI 1640中稀釋肝素化的外周血(例如，60ml)。在50ml離心管中小心地用約20ml稀釋的血液覆蓋約IOml淋巴細胞分離劑。根據(jù)需要調(diào)整以采用所有可用細胞。環(huán)境溫度下400 X G離心40分鐘。保存3 X Iml等分血漿并存于-80°C。收獲PBMC界面到等體積D-PBS或RPMI 1640中。室溫下450 x G離心10分鐘。吸出上清?！拜p彈手指”松動團塊并在20ml D-PBS或RPMI 1640中重懸。移出20 μ I細胞。添加20 μ I 50%紅細胞裂解緩沖液并用血球計計數(shù)。若合適，然后可通過樹突細胞在板或生物反應器中進行PBMC刺激。若需要，可從預冷凍的PBMC或非粘附單核細胞中制備應答細胞。37°C解凍細胞，每Iml冷凍細胞用IOml溫熱培養(yǎng)基稀釋。計數(shù)細胞。在合適的條件中，可通過樹突細胞在例如板或生物反應器中進行PBMC刺激。室溫下400 X G離心PBMC 5分鐘。移除上清并以每毫升2 x IO6細胞在CTL培養(yǎng)基+IL4 (終濃度1000U/ml)和IL7(終濃度10ng/ml)中重懸。24孔的每孔等分Iml細胞并將板放回孵育器中，或在GP40生物反應器中等分5-7. 5ml(10-15 x IO6) PBMC并放回孵育器。獲得制備的質(zhì)粒核轉(zhuǎn)染的DC，用30Gy輻照并清洗4次。以2xl05_l x IO5(DC)細胞/毫升重懸抗原呈遞細胞，產(chǎn)生PBMC與DC之比為10 I或20 I。在PBMC孔中等分Iml DC或在生物反應器中等分7.5ml DC并加入培養(yǎng)基至30ml。37°C，5% CO2下空氣培養(yǎng)7天。第7天若每孔含< 3xl06細胞，則更換二分之一培養(yǎng)基。每孔移除約Iml培養(yǎng)基并用約Iml新鮮CTL培養(yǎng)基+細胞因子替換。在第7天若每孔> 3xl06細胞，則分割并添加CTL ;轉(zhuǎn)移約Iml CTL到新孔中；添加約Iml新鮮CTL培養(yǎng)基+細胞因子。在第7天若生物反應器中< 50xl06細胞則移除IOml培養(yǎng)基并補充新鮮培養(yǎng)基+細胞因子。在第7天若生物反應器中> 50xl06細胞則轉(zhuǎn)移15ml CTL到新的生物反應器中并補充新鮮培養(yǎng)基+細胞因子。再培養(yǎng)4-6天。對于臨床凍存，獲得足夠的細胞時凍存并鑒定細胞。冷凍CTL 一周內(nèi)，按照具體方案要求需用5 X IO6-IxIO7細胞進行細胞毒性試驗并需用另外2 x IO6細胞確定表型。在某些實施方式中，所述細胞可具有下述特性，在某些實施方式中1)足夠的CTL數(shù)量用于以合適的劑量水平給患者輸注(當時確定)和用于所有QC需求；以20 I殺死的受體PHA母細胞(PHA blasts) < 10% (若為異源)；和3) < 2% CD 83+/CD]細胞(不包括DC)。
實施例3多病毒特異性CTL用于預防和治療異基因干細胞移植后的EBV、CMV和腺病毒感染可用本實施例的方法生成多病毒特異T細胞產(chǎn)物，其還靶向任何病毒組合，不僅是本文說明的那些。本發(fā)明的某些實施方式中含快速生成的供體來源多病毒特異性CTL細胞系，其針對以下三種示例性病毒具有抗病毒活性EBV、CMV和腺病毒。然而，所述多病毒CTL可針對2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種病毒。除了 EBV、CMV和/或腺病毒作為靶標，所述CTL可針對例如一種或多種的HHV-6、BK、RSV、流感病毒或副流感病毒(見圖19)。本實施例描述 評估供體來源的快速生成的多病毒特異性細胞毒性T淋巴細胞(rCTL)在患者中的安全性和毒性的示例性Ι/II期研究，所述患者在異基因干細胞移植后有發(fā)展CMV、腺病毒或EBV感染的風險。首先，進行I期劑量遞增研究以說明四種示例性rCTL劑量水平的安全性并確定最大耐受劑量(MTD)水平。劑量限制毒性定義為任何器官系統(tǒng)中42天內(nèi)發(fā)展III-IV級GVHD或NCI 3-5級輸注相關(guān)的不良事件，其可歸因于rCTL但之前不存在且不是由于CTL給予30天內(nèi)的潛在惡性腫瘤或復發(fā)。
背景技術(shù)：
通過供體來源的CTL重建抗病毒免疫用于阻止和治療移植后的CMV、EBV和腺病毒感染(Leen等，2006)。然而，用常規(guī)方案進行T細胞免疫治療的更廣泛實施受到以下限制(i)生產(chǎn)成本(ii)限制可擴展性的生產(chǎn)復雜性，和(iii)CTL生產(chǎn)所需的時間，其不僅導致成本和復雜性上升還妨礙嚴重疾病患者的緊急治療，除非CTL按預計制備且大大提前。本文提供生成供體來源的多病毒特異性CTL(rCTL)的快速方案，用于異基因造血干細胞移植(HSCT)受體的輸注，所述受體有發(fā)展出感染如CMV、腺病毒或EBV感染或早期感染的風險。在具體實施方式
中，給予快速生成的供體來源的多病毒特異CTL以介導HSCT受體中的抗病毒活性，所述受體有發(fā)展或具有活性病毒再激活或感染的風險?；颊呖山邮芩黾毎鳛槿魏晤愋彤愒匆浦埠蟮脑缙诟腥镜念A防和/或治療。若患者正接受類固醇用于移植物抗宿主病(GVHD)的治療或出于其他原因，則劑量必須減少為彡O. 5mg/kg氯潑尼松(或等價物)。在本發(fā)明的某些方面，患者在之前的28天內(nèi)沒有接受ATG、或坎帕斯或其他免疫抑制單克隆抗體。在本發(fā)明的某些實施方式中，患者在本研究的劑量遞增安全期單次輸注接受5x106-5 X IO7之間的rCTL/m2并將5 x 107rCTL/m2用于固定劑量II期效力成分。例如，如果其發(fā)生部分響應(如定義)或接受可去除輸注T細胞的輸注后治療，其適于接受例如最多2額外劑量。個體可隨后進行病毒負荷的PCR分析且可在給定的間隔記錄GvHD分值。在本實施例中，確定rCTL是否安全和對3種示例性病毒EBV、CMV和腺病毒是否有活性?；颊呖删哂幸环N或多種下述特性1)之前用骨髓或PBSC進行異基因造血干細胞移植；2)卡氏 / 蘭氏(Karnofsky/Lansky)分值彡 50 ；3)ANC 大于 500/ μ L ；4)膽紅素< 2χ,AST < 3x，血清肌酸酐< 2x正常上限，Hgb >8.0 ；6)室內(nèi)空氣下脈沖血氧> 90%;7)妊娠測試陰性(若為有生育能力的女性)；和8)可用的三病毒特異性細胞毒性T淋巴細胞。在示例性臨床方案中，I期組成的主要終點涵蓋安全性，包括42天內(nèi)的急性GvHD和輸注相關(guān)的不良事件或最后CTL輸注30天內(nèi)的非血液學不良事件。II期組成的示例性主要終點包括安全性和抗病毒響應。兩期的示例性次要終點包括rCTL在感染患者中對病毒負荷的影響；1、2、4、6和8周和3個月的抗病毒免疫重建；和/或3個月內(nèi)的病毒再激活。移植后的病毒感染在血液干細胞移植(HSCT)后的免疫恢復期間，通常由T細胞免疫控制的病毒感染是發(fā)病和死亡的重要原因。感染風險的程度由供體和受體之間的組織錯配程度、和得到的免疫抑制程度、以及供體的免疫狀態(tài)確定。例如潛伏病毒如巨細胞病毒(CMV)和EB病毒(EBV)的再激活很常見且常引起全身疾病。例如呼吸道病毒如腺病毒、流感病毒和呼吸道合胞病毒(RSV)也常引起感染?？共《舅幚韺W試劑僅對這些病毒中的一些有效；使用所述試劑成本高且伴有顯著的毒性和藥物抗性變體的過快生長。由于病毒特異的細胞免疫應答的恢復延遲明顯與病毒再激活和這些患者的疾病有關(guān)，所以恢復病毒特異性免疫的細胞免疫治療法用于靶向3種示例性常見病毒；CMV、EBV和腺病毒。CMV巨細胞病毒(CMV)是潛伏β皰疫病毒，其通常引起免疫競爭個體中無臨床癥狀的感染。其存在于約70%的健康成人中并在上皮細胞、成纖維細胞和單核細胞中復制。CMV在所述干細胞受體中的再激活可導致顯著的發(fā)病和致死，臨床表現(xiàn)包括間質(zhì)性肺炎、胃腸炎、發(fā)熱、肝炎、腦炎和視網(wǎng)膜炎(Boeckh等，2003)。細胞介導的免疫被認為是控制CMV感染的最重要因子，且CMV特異⑶4+和⑶8+淋巴細胞在免疫保護初次感染和后續(xù)再激活中有重要作用。預防或事先治療的最常用藥物是更昔洛韋和膦甲酸。這些藥物與靜脈免疫球蛋白聯(lián)用能成功地降低與CMV疾病有關(guān)的發(fā)病率并阻止早期CMV疾病。然而，其都具有明顯的副作用包括嗜中性白血球減少癥和中毒性腎損害。EB 病毒EB病毒(EBV)是Y皰疹病毒，感染95%以上的世界人口。初次感染常產(chǎn)生輕度的自限性疾病，然后在B細胞中潛伏感染并在B細胞和粘膜上皮中大量復制。至少存在4種類型的病毒潛伏1型，僅表達病毒核抗原I(EBNAl) ；2型，除了 ΕΒΝΑ1，還表達潛伏膜蛋白LMPl和LMP2 ;和3型，表達所有7種潛伏相關(guān)蛋白包括免疫優(yōu)勢ΕΒΝΑ3病毒抗原(Young和Rickinson，2004)。這些類型的潛伏中，所述病毒小RNA和EBER都大量表達，以及來自所述病毒基因組的BamHI A區(qū)域的轉(zhuǎn)錄本BART也大量表達。在健康個體的大多數(shù)循環(huán)B細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第4種潛伏中，沒有檢測到病毒RNA表達。在免疫受損宿主中，表達3型潛伏的B細胞(其對病毒特異T細胞高度易感)的過快生長可導致發(fā)生移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)。HSCT后的PTLD總體發(fā)生率低于I %，但在有潛在免疫缺陷診斷的受體中該發(fā)生率上升以及用于來自非血緣關(guān)系或人白細胞抗原(HLA)錯配供體的干細胞的受體，所述受體接受選擇性耗盡T細胞的移植以阻止移植物抗宿主病(GVHD) (Curtis等，1999 ；Cohen等，2007 ；Brunstein 等，2006)。幾乎沒有小分子藥物對已被EBV轉(zhuǎn)化的B細胞有任何影響，盡管核苷類似物如更昔洛韋能抑制所述病毒復制周期?；熜Ч苄∏野橛酗@著毒性。HSCT后預防和治療PTLD的一種選擇是利妥昔單抗，這是一種針對B細胞表型抗原CD20的單克隆抗體。在不同系列中報道了對利妥昔單抗的響應率在55% -100%之間(Brunstein等,2006 ；Keuhnle等， 2000 ；ComoIi等，2007)。然而，不是所有患者有響應且利妥昔單抗會耗盡正常B細胞6個月以上，這對已經(jīng)免疫抑制的患者群來說是一大問題。腺病毒
腺病毒是無包被的裂解性DNA病毒。人類對51種血清型的腺病毒易感，形成6種不同類型(A-F)，在其組織特異性和毒性上不同。盡管腺病毒為急性感染病毒，其可在疾病消除后存在數(shù)月且因此常漏檢地存在于供體或受體的移植物中。雖然在健康成人中急性感染很少致命，但它是免疫受損個體中發(fā)病和致死的重要原因，這些個體中其可產(chǎn)生肺炎、出血性膀胱炎、腎炎、結(jié)腸炎、肝炎和腦炎。腺病毒在兒科HSCT后具有特別高的發(fā)生率(Myers等，2005)。數(shù)個報告已表明清除腺病毒感染伴有檢測到腺病毒特異性T細胞(Feuchtinger等，2005 ;Myers等，2007)且非血緣關(guān)系匹配供體和單倍體相合移植的受體的恢復被顯著延遲，所述受體受到較強的免疫抑制如坎帕斯(Myers等，2007)。用于疾病治療的最常用藥是西多福韋，但主要問題是相關(guān)的中毒性腎損害，且沒有預期的、隨機的、受控的試驗，所述藥物的效力是不確定的。 用病毒特異性CTL進行過繼免疫治療由于病毒特異性T細胞的恢復明顯與保護免受這些病毒中每個的感染有關(guān)(Feuchtinger 等，2005 ；Cwynarski 等，2001 ;Gottschalk 等，2005)，所以減少免疫重建時間的過繼免疫是具有吸引力的方法。通過用表達病毒抗原的抗原呈遞細胞重復刺激生成的病毒特異性T細胞已在臨床試驗中評估以阻止和治療免疫受損宿主的病毒感染(Leen等，2006 ；Leen 等，2009 ；heslop 等，2009 ；ffalter 等，1995 ；Pegs 等，2003)。所述方法消除同種異源反應性T細胞。在開發(fā)離體生成病毒特異CTL的方法中有數(shù)個要考慮的方面。需要免疫優(yōu)勢抗原的知識，所述抗原誘導對靶病毒特異的保護性T細胞，并需要鑒定轉(zhuǎn)移所述抗原到有效抗原呈遞細胞(APC)的遞送系統(tǒng)。所述APC必須自體同源，表達主要組織相容性復合物(MHC)抗原呈遞相關(guān)病毒來源的肽以及足以誘導T細胞活化和擴增的共刺激分子。所有這些試劑需要適用于GMP加工，這限制了一些類型和來源的抗原的使用。CMV的T細胞治療評估過繼轉(zhuǎn)移T細胞能否重建靶向CMV的抗病毒免疫的第一研究。在本研究中，CMV特異T細胞克隆衍生自用CMV脈沖處理的自體同源成纖維細胞刺激后的同胞供體(Walter等，1995)。沒有不良效應且重建了 CMV特異免疫應答，沒有患者發(fā)生CMV疾病或以后復發(fā)。但是沒有發(fā)生CD4+CMV特異T細胞響應的受體中抗CMV活性降低，表明在某些情況中長期留存可能需要⑶4 T細胞。在其他預防研究中，Peggs等，通過用衍生自CMV感染的人肺成纖維細胞系的CMV抗原脈沖處理的樹突細胞刺激外周血單核細胞(PBMC)生成了CMV特異⑶4+和⑶8+T細胞(Peggs等，2003)。小劑量的CTL能重建免疫，且CMV特異CTL有顯著的體內(nèi)擴增。T細胞加工中為了避免使用活的CMV，最近的研究用衍生自巨細胞病毒PP65蛋白的HLA-A2限制肽NLV脈沖處理的樹突細胞刺激CTL(Micklethwaite等，2007)。雖然此方法看起來也有效，但問題是輸注的CTL的限制特異性，因為靶向單一表位可使變異逃逸且將研究限制在HLA A2陽性的患者中。CMV特異CTL也用于治療CMV感染的患者，所述患者盡管經(jīng)長期抗病毒藥物治療，但所述感染仍留存或復發(fā)(Einsele等，2002)。結(jié)果振奮人心，7個對象中有6個的病毒再激活受到抑制。本研究中，抗原來源是CMV裂解物，其具有產(chǎn)生廣泛免疫應答的優(yōu)勢，但由于所述裂解物中的活病毒的感染風險，其不適于III期研究。所有上述CTL治療使用T細胞生產(chǎn)方法，所述方法需要特殊GMP設(shè)備中的長期激活和擴增和重要的調(diào)控支持。這些需求降低了過繼免疫治療的實用性，因為CTL細胞系必需在疾病很早之前制作，且?guī)缀鯖]有中心有所述設(shè)備或此類細胞加工所需的基礎(chǔ)設(shè)備。最近報道的臨床試驗使用直接來自外周血的CMV肽特異T細胞的四聚物選擇，避免離體擴增和活病毒抗原。盡管僅輸注CD8+T細胞，但輸注后其擴增數(shù)個數(shù)量級，在8/9個案例中清除了感染(Cobbold等，2005)。然而由于非常見HLA型的四聚體供應有限且缺少II類四聚體，此方法受到阻礙。EBV的T細胞治療過快生長的PTLD的EBV感染B細胞與EBV轉(zhuǎn)化的淋巴母細胞系(LCL)有相同的表型和病毒抗原表達，所述細胞系通過用EBV實驗室株系感染外周血B細胞生成。由于LCL可 容易地從任何供體制備，其在評價EBV特異CTL的臨床研究中被用作APC (Comoli等，2007 ；Rooney 等，1995 ；Rooney 等，1998 ；Heslop 等，1996 ;Gustafsoon 等，2000)。用此方法生成的EBV特異CTL是多克隆的，含⑶4+和⑶8+EBV特異T細胞，識別多種潛伏和裂解的病毒抗原。過繼轉(zhuǎn)移的EBV特異CTL可存活至少8年，輸注后擴增最多2-4個數(shù)量級，并降低約20%患者中觀察到的高病毒負荷(Heslop等，2009 ;Rooney等，1995 ;Heslop等，1996)。在靶向高風險患者群的三種研究的近期綜述中，接受EBV CTL作為預防的101個患者都沒有發(fā)展出PTLD (Heslop等，2010)。輸注時有活性PTLD的13個患者中，11個有供體源性EBV特異CTL細胞系誘發(fā)的緩解(Heslop等，2009)，而不響應的患者之一中，腫瘤病毒刪除了EBNA3中作為所輸注效應T細胞靶標的優(yōu)勢免疫表位(Gottschalk等，2001)。其他研究證實了移植后 EBV 特異 CTL 的活性(Comoli 等，2007 ；Gustafsson 等，2000)。腺病毒的T細胞治療Feuchtinger等用腺病毒抗原短暫體外刺激供體后用、干擾素分泌細胞篩選，用分離自所述供體的CD4+和CD8+腺病毒特異T細胞通過腺病毒感染處理患者。將少量的腺病毒特異供體T細胞輸注給9個HSCT后有全身性腺病毒的兒童。6個可評估的患者中5個檢測到腺病毒特異的免疫應答，伴隨有病毒負荷的持續(xù)降低和感染清除(Feuchtinger等，2006)。多病毒特異T細胞上述策略各自僅靶向一種病毒。為了拓寬單一 CTL細胞系的特異性以包括干細胞受體的3種最常見病毒病原體，本發(fā)明人用轉(zhuǎn)導有編碼所述CMV抗原pp65的重組腺病毒載體的單核細胞再激活了 CMV和腺病毒特異T細胞。隨后用轉(zhuǎn)導了相同載體的EBV-LCL刺激，再激活了 EBV-特異T細胞并維持了活化的腺病毒和CMV特異T細胞的擴增。此方法能可靠地生成具有對所有三種病毒特異的細胞毒性功能的CTL，在I期預防研究中將其輸注到14個干細胞受體中。所有患者中都產(chǎn)生對CMV和EBV的免疫恢復，但腺病毒特異T細胞的增加僅在輸注前有腺病毒感染跡象的患者中發(fā)現(xiàn)(Leen等，2006)。輸注的CTL中腺病毒特異T細胞的頻率增加的后續(xù)研究也產(chǎn)生相似的結(jié)果，因此強調(diào)了內(nèi)源抗原對促進輸注的T細胞的體內(nèi)擴增的重要性(Leen等，2009)。然而，兩種臨床試驗中患有輸注前CMV、腺病毒或EBV感染或再激活的所有患者都能清除所述感染,包括一個患有嚴重腺病毒肺炎需要血液充氧支持的患者(Leen等，2006)。因此識別多種抗原的CTL產(chǎn)生針對所有三種病毒的臨床相關(guān)效應?，F(xiàn)有CTL生成方案的局限
現(xiàn)在有證據(jù)表明CTL過繼轉(zhuǎn)移能治療病毒感染和血液惡性腫瘤，常規(guī)治療對這些無法控制。由于益處能持續(xù)較長時間且所述細胞產(chǎn)生最小的毒性，所有該方法具有潛在出色的藥物經(jīng)濟學概況。不幸的是，廣泛的應用受到下述限制(i)生產(chǎn)成本，所述生產(chǎn)包括EBV轉(zhuǎn)化的淋巴母細胞系(EBV-LCL)的起始加工和臨床級腺病毒載體的生產(chǎn)和測試；(ii)CTL生產(chǎn)的復雜性，所述生產(chǎn)要求用于每周CTL刺激的APC的生成和遺傳修飾，開放培養(yǎng)系統(tǒng)的重復添加和多種熟練的“正確判斷”，因此限制了可擴展性，和(iii)CTL生產(chǎn)所需的時間；除了 4-6周的EBV-LCL起始生成，還要加上額外的4_8周CTL活化和擴增期以提高抗原特異T細胞頻率并消除同種異源反應性T細胞。這種延遲不僅導致成本和復雜性上升，還妨礙嚴重疾病患者的緊急治療，除非CTL按預計制備且大大提前。多病毒特異CTL的快速生成
用DNA質(zhì)粒核轉(zhuǎn)染DC作為APC來生成多病毒特異CTL為了更快生產(chǎn)多病毒CTL，本發(fā)明人開發(fā)了用編碼多病毒抗原的DNA質(zhì)粒替代Ad5pp65載體(Adv和CMV特異)和EBV-LCL (EBV特異)的方案?？捎门R床可應用的Lonza/AMAXA核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)將這些DNA質(zhì)粒導入APC如單核細胞或DC的核中。轉(zhuǎn)移后，T細胞活化期間實現(xiàn)了高水平的轉(zhuǎn)基因表達和良好的靶細胞活力(Gerdemann等，2009)。質(zhì)粒為非感染性、非復制性，整合到轉(zhuǎn)染細胞基因組中較弱?？煽焖俨⒏咝詢r比地以可擴展量生產(chǎn)具有優(yōu)良長期穩(wěn)定性的臨床級DNA。通過減少CTL加工時間和免疫測試程度，質(zhì)粒的取代降低了50%以上的加工成本，因為質(zhì)粒測試成本約為腺病毒載體測試成本的十分之一。這些質(zhì)粒DNA編碼的保護性和免疫原性Adv和CMV抗原的評估可基于所述振奮人心的臨床結(jié)果，該結(jié)果表明抵御Adv六鄰體和五鄰體并指向CMVl-El和CMV-pp65的T細胞體內(nèi)具有保護性(Leen等，2009 ；Leen等，2008)。CMV-IE1特異T細胞可靶向?qū)MV從潛伏中再激活的細胞，而PP65特異T細胞靶向新感染的細胞。所述免疫原中包含各病毒的兩種蛋白增加了潛在的靶向表位的數(shù)量，并因此增加了 T細胞被再激活的可能性(不考慮HLA型T細胞供體)。一旦給藥，多表位特異CTL不太可能失效，這是感染細胞中表位突變的免疫逃逸的結(jié)果。對于EBV，EBNAl是優(yōu)勢免疫⑶4+T細胞靶向抗原，在所有EBV相關(guān)惡性腫瘤和正常EBV感染的B細胞中表達，LMP2跨越多種HLA類型中具有免疫原性并在大多數(shù)EBV惡性腫瘤中表達，而BZLFl編碼優(yōu)勢免疫、立即早期裂解周期抗原，其刺激來自大多數(shù)個體的⑶4+和⑶8+T細胞。用生長促進細胞因子生成多病毒特異CTL本發(fā)明人和其他人已證明存在增強細胞因子IL_7(10ng/ml)和IL_4(1，000U/ml)時病毒特異CTL能有效并快速的擴增。與來自相同患者的沒有細胞因子時生成的T細胞相t匕，這些細胞因子降低能激活抗原特異T細胞的誘導細胞死亡，相應地協(xié)助增加響應抗原特異T細胞的頻率和庫。此外，在我們的培養(yǎng)物中添加這些細胞因子產(chǎn)生的CTL細胞系具有可忽略的同種異源反應性，即使是在單一刺激后。因此，通過減少CTL加工時間，用這些可作為臨床級試劑的細胞因子補充我們的CTL培養(yǎng)物降低了> 50%的加工成本。用優(yōu)化的培養(yǎng)設(shè)備生成多病毒特異CTL當前制備CTL需要通過在傳統(tǒng)組織培養(yǎng)處理的24孔板中逐漸擴增和每周的再刺激。此系統(tǒng)會耗費大量勞動力，需要很高的技術(shù)且難以規(guī)模化。即使24孔板中的細胞培養(yǎng)物需要頻繁更換培養(yǎng)基和操作以優(yōu)化營養(yǎng)水平并移除廢品，但T細胞仍產(chǎn)生嚴重的細胞死亡，而由于不使用抗生素，除了最熟練的組織培養(yǎng)技師外所有人都經(jīng)常存在感染的風險。不幸的是，迄今為止對替換這種封閉式、可規(guī)?；脑谄渌愋团R床細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中廣泛使用的生物反應器系統(tǒng)的努力都失敗了。得到的CTL產(chǎn)物沒有功能或沒有特異性。本發(fā)明人采用新的透氣快速擴增設(shè)備(G-Rex)，其顯著減少培養(yǎng)期間T細胞凋亡，產(chǎn)生更有效的體外擴增。穿過所述燒瓶底部的透氣硅膜發(fā)生氣體交換(進O2和出CO2)，防止供氧不足同時使細胞上方有較大深度的培養(yǎng)基，提供更多的營養(yǎng)并稀釋廢品。這些培養(yǎng)條件能使對CTL生產(chǎn)非常關(guān)鍵的細胞和細胞之間的穩(wěn)定相互作用通過物理破碎而無阻礙進行，技師操作時間減少> 10倍，細胞產(chǎn)出增加> 3倍，并加速CTL加工時間> 2倍而不影響所述CTL的表型和功能(Vera等，2010)。總的來說，通過結(jié)合這三種新過程，我們能用 簡單的一步法生產(chǎn)大量沒有同種異源反應性細胞的多病毒CTL，所述方法能顯著降低傳統(tǒng)CTL方案相關(guān)的成本、復雜性和時間。本發(fā)明的某些實施方式設(shè)計在本發(fā)明的某些方面，評估有發(fā)展EBV、CMV或腺病毒感染或早期再激活風險的HSCT患者中快速生成三病毒特異系(rCTL)的可行性、安全性和效力。研究設(shè)計的主要目標和原理 本研究的主要目的是評估將rCTL給予有EBV、CMV或腺病毒感染或早期再激活或感染風險的移植患者的安全性。我們選擇使用4種不同劑量水平，開始為5 X 106、然后IX IO7,2 X IO7和最終劑量5 X 107rCTL/m2。我們先前的方法加工的CTL在最多IO8細胞/kg的劑量時是安全的(Leen等，2006)。然而隨著該加工方法被修改，本發(fā)明人在本研究的一些情況中從較低劑量5 X IO6細胞/m2開始。在某些情況中，對于在一劑量后有部分響應的對象或接受其他可能影響所輸注CTL留存或功能的治療法的對象給予額外劑量(以相同水平)?？尚行?安全性研究中，任何類型的異源移植患者適于接受CTL作為預防或適于本文定義的早期再激活，包括例如1)早期治療可給予患單一或多種感染的合適患者(也包括患多種感染但一種再激活一種受控感染的患者)；2)招募時的臨床狀態(tài)使類固醇減少到每天少于0. 5mg/kg氯潑尼松；3)適當?shù)?接受強度降低的調(diào)節(jié)方案的分娩婦女)女性患者的妊娠測試為陰性；4)先前12個月內(nèi)用骨髓或外周血干細胞進行促骨髓摧毀性或非促骨髓摧毀性異基因血液干細胞移植；5)對有CMV、腺病毒或EBV感染的風險的患者的預防；6)針對下述各病毒的具體實施方式
確定的再激活或感染的早期治療CMV (Nichols 等,2001 ;Ljungman 等,2001)移植后至少每周監(jiān)控CMV抗原血癥。在白細胞陽性< 10的CMV抗原血癥時定義早期再激活。若任何患者發(fā)展出CMV抗原血癥(白細胞陽性> 10)或CMV感染的臨床證據(jù)(定義為CTL輸注前或后通過來自內(nèi)臟位置的活檢試樣證明CMV (通過培養(yǎng)物或組織學))，會開始用更昔洛韋、和/或膦甲酸和免疫球蛋白的標準治療。沒有內(nèi)臟感染的患者可接受CTL用于抗原血癥或升高的PCR。腺病毒腺病毒感染定義為通過PCR或來自單一位置如糞便或血液或尿液或鼻咽的培養(yǎng)物中檢測出存在腺病毒陽性。腺病毒疾病定義為在多于兩種位置如糞便或血液或尿液或鼻咽的培養(yǎng)物中檢測出存在腺病毒陽性。滿足疾病標準的患者中可添加西多福韋，除非所述對象由于中毒性腎損害而不能忍受該試劑。患者可接受CTL用于血液或糞便中升高的PCR。EBV按照近期的準則定義EBV-LPD (Styczynski等，2009)，證實的EBV-LPD由活檢定義或可能的EBV-LPD定義為與臨床癥狀(腺病或發(fā)熱或成像有團塊)相關(guān)的EBV DNA水平升高但沒有活檢驗證。EBV DNA再激活的患者在研究中僅可接受CTL。有證實或可能的EBV-LPD的患者還應接受利妥昔。本設(shè)計的某些方面，某些患者 可被排除1)招募篩選的28天內(nèi)接受了 ATG、或坎帕斯或其他免疫抑制T細胞單克隆抗體的患者；2)患有其他不受控制的感染的患者(對細菌感染，患者必須接受明確的治療并在招募前72小時沒有進一步感染的征兆；對于真菌感染，患者必須接受明確的全身抗真菌治療且招募前I周沒有進一步感染的征兆；進一步感染定義為可歸因于敗血癥或新癥狀的血液動力學不穩(wěn)定、更差的體征或可歸因于感染的放射圖像發(fā)現(xiàn)。(沒有其他征兆或癥狀的持續(xù)發(fā)熱不解釋為進一步感染))；3) 28天內(nèi)接受供體淋巴細胞輸注(DLI)的患者；4)活化急性GVHD級為II-IV的患者；5)惡性腫瘤活化和不受控制的復發(fā)。供體可評估異基因(即血緣或非血緣關(guān)系的HLA匹配或錯配)干細胞移植的供體，包括下述完整的歷史和身體檢查；CBC、血小板、差異；電解質(zhì)、BUN、肌酸酐、葡萄糖、總蛋白、白蛋白、總膽紅素、堿性磷酸酶、ALT、AST、LDH、血清蛋白電泳(若有說明)；HIV_1抗體、HIV-2 抗體、HIV NAT、HTLV-l/2 抗體、乙型肝炎表面抗原(Hbsantigen)、HBc 抗體、HCV NAT、CMV抗體、RPR、西尼羅病毒NAT和美洲錐蟲病檢測；AB0和Rh分型；血紅蛋白電泳或SicklePrep檢測(若有說明)；完整的尿分析。治療計劃CTL細胞系三病毒特異CTL細胞系可用快速方案生成，使用例如質(zhì)粒核轉(zhuǎn)染DC，生長促進細胞因子和針對T細胞擴增優(yōu)化的G-Rex培養(yǎng)設(shè)備。為了起始所述三病毒特異CTL細胞系，用塑料粘附2小時、在IL4+GM-CSF中培養(yǎng)5天和用PGE1、TNFa成熟一天來生成單核細胞來源的DC。24小時成熟后，用表達EBV、CMV和腺病毒的保護性和免疫原性病毒抗原的DNA質(zhì)粒核轉(zhuǎn)染DC，使用例如所述GMP相容的Lonza/AMAXA系統(tǒng)。構(gòu)建雙順反子質(zhì)粒，其編碼l)CMV_pp65和IEl以及2) Adv六鄰體和五鄰體，各被IRES序列連接。對于EBV，生成編碼三種EBV抗原EBNA1、LMP2和BZLFl的構(gòu)建體。然后用核轉(zhuǎn)染的DC刺激所述非粘附PBMC組分中保存的病毒特異T細胞，刺激物/響應物比例為I : 10。為了抑制多病毒特異T細胞的凋亡并促進其擴增，刺激當天將細胞因子IL7和IL4分別以10ng/ml和1，000U/ml的濃度加入。在優(yōu)化的GMP相容性G-Rex設(shè)備中進行T細胞刺激和擴增，已驗證其用于生產(chǎn)多病毒特異T細胞(Vera等，出版中)。在CTL培養(yǎng)期(9-12天)結(jié)束時，用例如多聚體試劑檢測對各病毒和抗原特異的T細胞的頻率。為了檢測所述CTL的功能性抗原特異性，可用覆蓋CMV-pp65和IEUAdv六鄰體和五鄰體、和EBV-EBNA1、LMP2和BZLFl的重疊肽文庫(肽混物)作為IFNg酶聯(lián)免疫斑點試驗的刺激物。也可用自體同源和異源的LCL作為檢測EBV反應性的刺激物。用受體PHA母細胞作為剩余同種異體反應性的測量方法進行細胞毒性試驗，且可通過用單獨LCL或與所述三種刺激質(zhì)粒一起核轉(zhuǎn)染來檢測抗原特異T細胞殺死，且可用覆蓋pp65、IE1、六鄰體、五鄰體、EBNAl、LMP2和BZLFl的肽混物脈沖處理的受體PHA母細胞評估共有等位基因產(chǎn)生的抗原殺死。檢查所述CTL細胞系的相同性、表型和不育性，在某些實施方式中根據(jù)S0P，給藥前需將其冷凍保存。將所述CTL給予患者的釋放標準包括活力> 70%、細菌和真菌陰性培養(yǎng)至少7天、內(nèi)毒素檢測彡5EU/ml、支原體檢測結(jié)果陰性、⑶83陽性細胞< 2%、Cr51釋放試驗中以20 I殺死的受體PHA母細胞< 10%和HLA同一性。給藥和監(jiān)控
解凍多病毒特異T細胞并通過例如靜脈內(nèi)注射給予。患者可用苯海拉明(Benadryl) 0. 25-0. 5mg/kg (最大 25mg) IV 和泰諾(Tylenol) 5-lOmg/kg (最大 650mg) PO 作為前驅(qū)用藥。可按照血液產(chǎn)品給藥制度標準監(jiān)控患者且最低程度應按照下述進行監(jiān)控例如，患者可在不斷的脈沖血氧中持續(xù)至少30分鐘。在輸注最后和隨后30和60分鐘監(jiān)控生命征?；颊呖山邮芗毙曰蚵远拘缘闹С肿o理,包括血液組分或抗體和其他合適的介入。若患者具有部分響應(定義為50%落入病毒負荷)或接受可能影響所輸注的CTL留存或功能的藥物(如類固醇)，其適于在相同起始劑量時接受至多額外2齊U。輸注后的6周檢測GVHD的發(fā)作可能。每周記錄GVHD器官階段評分、總體臨床級另|J、GVHD活檢信息和相關(guān)的差異診斷。所述每周評分可包括最后評估以來的所有信息。記錄器官損害、活檢信息、階段、差異診斷和GVHD治療。慢性GVHD的明確表現(xiàn)包括硬皮病(表皮或筋膜炎)、扁平苔蘚、白癲風、疤痕性禿發(fā)、毛發(fā)角化過度癥、皮膚固定攣縮、甲床發(fā)育異常；非感染性潰瘍、角膜腐蝕/非感染性結(jié)膜炎；食道狹窄、脂肪瀉；陰道狹窄，非膿毒性關(guān)節(jié)炎、肌炎、肌無力、多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)固定的攣縮和梗阻性細支氣管炎。慢性GVHD的可能表現(xiàn)包括濕疹皮疹、干性皮膚、斑丘疹皮疹、色素沉著過度、脫發(fā)；口腔干燥、干燥性角結(jié)膜炎；厭食癥、吸收不良、體重減輕、腹瀉、腹痛；堿性磷酸酶升高、轉(zhuǎn)移酶炎、膽管炎，高膽紅素血癥；非傳染性陰道炎，陰道萎縮、關(guān)節(jié)痛；血小板減少癥、嗜酸粒細胞增多、自身免疫性血球減少；有組織肺炎的閉塞性細支氣管炎和間質(zhì)性肺炎。CTL易被l-2mg/kg劑量的類固醇殺死。這是GVHD的標準治療且也可在受體發(fā)展出可能與CTL給藥有關(guān)的其他并發(fā)癥時給予。主要終點所述I期部分的主要目的是可行性和安全性。II期部分的主要終點是抗病毒效果。給予CTL對GVHD的安全性是42天，對于其他毒性為30天。所述安全性終點定義為CTL最后劑量的42天內(nèi)的急性III-IV級GvHD或CTL最后劑量的30天內(nèi)的3_5級輸注相關(guān)不良事件或CTL最后劑量的30天內(nèi)的4-5級非血液學的不良事件，且其不是由于已存在的感染或原始惡性腫瘤或已存在的NCI常見不良事件術(shù)語標準(CTCAE)4. 0版所定義的副發(fā)病變?？紤]的毒性包括GI毒性、腎毒性、出血毒性、心血管毒性(低血壓、心律失常和左心室脈動陣列機能障礙)、神經(jīng)學毒性(嗜睡和發(fā)作)、混凝毒性、血管毒性和肺毒性。急性GVHD的分期和分級可通過共識會議標準(Przepiorka,等，1994)進行急性GVHD分級。
權(quán)利要求
1.一種生成靶向來自兩種或更多病毒的至少一種抗原的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的方法，所述方法包括步驟 (1)用多種質(zhì)粒核轉(zhuǎn)染來自個體的樹突細胞(DC)群，其中所述多種質(zhì)粒中的各質(zhì)粒編碼來自所述兩種或更多病毒之一的至少一種抗原，且因此產(chǎn)生表達和呈遞來自兩種或更多病毒的至少一種抗原的樹突細胞群；或 (2)用肽文庫接觸來自個體的DC群，其中所述肽序列重疊以覆蓋完整病毒抗原的部分或全部，因此產(chǎn)生呈遞來自兩種或更多不同抗原的至少一種表位的DC群(APC);和 用所述核轉(zhuǎn)染的DC(APC)接觸來自所述個體的外周血單核細胞(PBMC)以產(chǎn)生能響應來自兩種或更多病毒的至少一種抗原的抗原特異T淋巴細胞群；和 在有透氣膜的容器中的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)所述抗原特異T淋巴細胞，其中培養(yǎng)基成分包括IL-4和IL-7以產(chǎn)生靶向來自兩種或更多病毒的至少一種抗原的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述CTL給予免疫受損個體。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述個體有異基因干細胞移植。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述病毒選自下組EBV、CMV、腺病毒、BK、HHV6、RSV、流感病毒、副流感病毒、博卡病毒、冠狀病毒、LCMV、腮腺炎病毒、麻疹病毒、偏肺病毒、細小病毒B、輪狀病毒、西尼羅河病毒、和其組合。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述細胞通過注射給予。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述注射為靜脈內(nèi)。
7.一種生成靶向兩種或更多腫瘤抗原的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的方法，所述方法包括步驟 (1)用多種質(zhì)粒核轉(zhuǎn)染來自個體的DC群，其中所述多種質(zhì)粒中的各質(zhì)粒編碼一種或多種腫瘤抗原的至少一種表位，因此產(chǎn)生表達和呈遞兩種或更多腫瘤抗原的的至少一種表位的 DC 群(APC)； 或 (2)用肽文庫接觸來自個體的DC群，其中所述肽序列重疊以覆蓋完整抗原的部分或全部，因此產(chǎn)生呈遞來自兩種或更多不同抗原的至少一種表位的DC群(APC);和 用所述APC接觸來自所述個體的外周血單核細胞(PBMC)以產(chǎn)生能響應來自兩種或更多腫瘤抗原的至少一種表位的抗原特異T淋巴細胞群；和 在有透氣膜的容器中的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)所述T淋巴細胞，其中培養(yǎng)基成分包括IL-7、IL12、IL15 和 IL6 或 IL27。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述個體患有淋巴瘤或白血病。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述T淋巴細胞給予所述個體。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述細胞通過注射給予。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述注射為靜脈內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明包括生成并應用細胞毒性T淋巴細胞的方法和組合物，所述淋巴細胞靶向多種病毒或?qū)Χ喾N腫瘤抗原特異。在具體的實施方式中，所述生成方法使用某些細胞因子在活化T細胞群體中促進增殖并降低細胞死亡和/或使用具有透氣膜的具體生物反應器。
文檔編號C12N5/0783GK102625832SQ201080048157
公開日2012年8月1日 申請日期2010年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月24日
發(fā)明者A·M·李恩, C·魯尼, J·維拉, U·格德曼 申請人:威爾遜伍爾夫制造業(yè)公司, 貝勒醫(yī)學院