專利名稱：癌癥治療和診斷的靶基因ercc6l的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
優(yōu)先權(quán)本申請要求2009年8月25日提交的美國臨時(shí)申請No. 61/275，198的權(quán)益，通過述及將其完整內(nèi)容收入本文。摶術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及檢測和診斷癌癥的方法以及治療和預(yù)防癌癥，特別是與ERCC6L過表達(dá)有關(guān)的癌癥諸如肺癌的方法。本發(fā)明還涉及篩選用于治療和預(yù)防ERCC6L相關(guān)癌癥的候選物質(zhì)的方法。此外，本發(fā)明涉及降低ERCC6L基因表達(dá)的雙鏈分子及其用途。
背景技術(shù)：
肺癌是癌癥的最常見形式，占每年1090萬新癌癥病例中的135萬。它還是癌癥相關(guān)疾病所致死亡的首要原因，占全世界670萬癌癥相關(guān)死亡中的118萬(NPL I)。在最近十年里，新開發(fā)的細(xì)胞毒劑包括帕利他賽、多西他賽、吉西他濱、和長春瑞濱已開始為具有晚期NSCLC (非小細(xì)胞肺癌)的患者提供多種治療選項(xiàng)；然而，每種新方案僅能提供與基于順鉬的療法相比適度的存活好處(NPL 2)。最近,分子祀向劑,包括抗EGFR或抗VEGF單克隆抗體,西妥昔單抗(Erbitux)或貝伐單抗(Avastin),和EGFR酪氨酸激酶的小分子抑制劑,諸如吉非替尼(Iressa)和埃羅替尼(Tarceva)，已經(jīng)進(jìn)行了臨床應(yīng)用考察和/或被批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床(NPL 3,4) 0這些作用劑對復(fù)發(fā)性NSCLC表現(xiàn)出一定程度的活性，但是能收到存活效益的患者的數(shù)目仍然有限。 同時(shí)，SCLC(小細(xì)胞肺癌)患者對一線多藥化療相應(yīng)良好，盡管他們常常在短時(shí)間里復(fù)發(fā)。 只有20%具有局限階段疾病(LD)的患者能用聯(lián)合用藥療法治愈，而具有廣泛疾病(ED)的患者能在初始診斷之后實(shí)現(xiàn)5年存活的不到5% (NPL 5)。因此，迫切需要新的治療策略， 諸如開發(fā)更加選擇性的且有效的針對肺癌的分子靶向劑。在篩選用于診斷、治療和預(yù)防人癌癥的新穎分子靶的過程中，本發(fā)明人使用含有 27，648種基因或表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)的cDNA微陣列，偶聯(lián)激光顯微解剖，實(shí)施了 101例肺癌的基因組范圍表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)了用于肺癌治療的數(shù)種候選分子靶和生物標(biāo)志物(PTL 1-2，NPL 6-9)。在這些中，ERCC6L (切除修復(fù)交叉互補(bǔ)嚙齒動物修復(fù)缺陷，互補(bǔ)組6樣；也稱作"PICH")特別值得注意。ERCC6L已鑒定為SNF2ATP酶家族的一個成員，它是Plkl的相互作用配偶和底物 (NPLlO)。一項(xiàng)最近的報(bào)告證明ERCC6L是檢查點(diǎn)信號傳導(dǎo)的一個至關(guān)重要的成分，而且結(jié)合鏈接著絲粒相關(guān)DNA以監(jiān)測姐妹動粒之間發(fā)生的張力(NPLlO)。然而，至今，尚未建立 ERCC6L和癌發(fā)生之間的關(guān)系。引用表專利文獻(xiàn)[PTL 1]W02004/031413[PTL 2]W02007/013665
非專利文獻(xiàn)[NPL I] Jemal A, Siegel R, Ward E, et al. CA Cancer J Clin. 2008 ；58 :71-96.[NPL 2]Schiller JH, Harrington D, Belani CP, et al. Eastern Cooperative Oncology Group. N Engl J Med 2002 ；346 :92-8.[NPL 3]DowelI J,Minna JD,Kirkpatrick P. Nat Rev Drug Discov2005 ;4 :13-4.[NPL 4] Pal SK, Pegram M. Anti cancer Drugs 2005 ；16 :483-94.[NPL 5]Chute JP, Chen T, Feigal E, Simon R, Johnson BE J Clin Oncol1999 ； 17 :1794-801.[NPL 6]Daigo Y, Nakamura Y. Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008 ；56 :43-53.[NPL 7]Kikuchi T，Daigo Y, Katagiri T，et al. Oncogene 2003 ；22 :2192-205.[NPL 8]Kakiuchi S,Daigo Y,Tsunoda T,Yano S,Sone S,Nakamura Y. Mol Cancer Res 2003 ；1 :485-99.[NPL 9]Taniwaki M，Daigo Y,Ishikawa N，et al. Int J 0ncol2006 ;29 :567-75.[NPL 10]Baumann C，et al. Cell 2007 ；128 :101-114.發(fā)明概述本發(fā)明涉及經(jīng)由微陣列分析和RT-PCR的下述發(fā)現(xiàn)，即ERCC6L在臨床肺癌組織中過表達(dá)。如本文中證明的，通過siRNA對癌細(xì)胞系中內(nèi)源ERCC6L的功能性敲低導(dǎo)致癌細(xì)胞生長的顯著阻抑，提示ERCC6L在維持癌細(xì)胞的存活力中至關(guān)重要的作用。由于ERCC6L在成體正常器官中僅極少表達(dá)，因此ERCC6L似乎是用于不良效應(yīng)最小的新治療途徑的一種適宜且有前景的分子靶。因而，本發(fā)明的一個目的是提供一種通過測定源自受試者的生物樣品中ERCC6L 的表達(dá)水平來在受試者中診斷或確定癌癥、特別是肺癌傾向性的方法。ERCC6L的表達(dá)水平與正常對照水平相比的升高指示該受試者罹患或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生癌癥，特別是肺癌。在本發(fā)明的方法中，可通過適宜的探針或引物集來檢測ERCC6L基因，或者，可通過抗ERCC6L抗體來檢測ERCC6L蛋白。本發(fā)明的又一個目的是提供一種試劑盒，其包括用于檢測ERCC6L基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物的試劑。本發(fā)明的又一個目的是提供用于診斷或檢測癌癥的試劑，其包含結(jié)合ERCC6L基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核酸或結(jié)合ERCC6L基因的翻譯產(chǎn)物的抗體。本發(fā)明的又一個目的是提供結(jié)合ERCC6L基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核酸或結(jié)合ERCC6L基因的翻譯產(chǎn)物的抗體制造用于診斷或檢測癌癥的試劑的用途。本發(fā)明的又一個目的是提供鑒定用于抑制過表達(dá)ERCC6L基因的細(xì)胞生長的候選物質(zhì)的方法，此類物質(zhì)可用于治療和/或預(yù)防ERCC6L相關(guān)疾病，諸如癌癥。本發(fā)明的方法可在體外或在體內(nèi)進(jìn)行，而且使用對ERCC6L多肽的結(jié)合活性、ERCC6L基因的表達(dá)水平、 ERCC6L多肽的生物學(xué)活性、或在該基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制下的報(bào)告基因的表達(dá)水平或報(bào)告基因的活性作為指標(biāo)。結(jié)合ERCC6L多肽或阻抑ERCC6L表達(dá)或活性或報(bào)告基因表達(dá)或活性的物質(zhì)可鑒定為用于治療和/或預(yù)防癌癥或抑制癌細(xì)胞生長的候選物質(zhì)。要檢測的 ERCC6L多肽的生物學(xué)活性優(yōu)選為細(xì)胞增殖活性(細(xì)胞增殖增強(qiáng)活性)。ERCC6L多肽的生物學(xué)活性與在測試物質(zhì)不存在時(shí)的對照水平相比的降低指示該測試物質(zhì)可用于減輕/減少肺癌的癥狀，或治療和/或預(yù)防肺癌癌癥。本發(fā)明的又一個目的是提供一種通過施用抑制ERCC6L基因的表達(dá)和/或ERCC6L 蛋白的功能的作用劑來治療和/或預(yù)防癌癥或抑制過表達(dá)ERCC6L的癌性細(xì)胞生長的方法。 優(yōu)選地，該作用劑為抑制性核酸(例如反義、核酶、雙鏈分子、適體)。該作用劑可以為用于提供雙鏈分子的核酸分子或載體?？赏ㄟ^以足以抑制ERCC6L基因表達(dá)的量將雙鏈分子導(dǎo)入靶細(xì)胞中來抑制該基因的表達(dá)。因此，在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法包括對受試者施用藥學(xué)有效量的針對ERCC6L基因的雙鏈分子或編碼此類分子的載體的步驟， 其中該雙鏈分子在導(dǎo)入表達(dá)ERCC6L基因的細(xì)胞中時(shí)抑制ERCC6L基因的表達(dá)以及細(xì)胞增殖。本發(fā)明的又一個目的是提供一種藥物組合物，其適合于治療和/或預(yù)防ERCC6L相關(guān)癌癥，其包括可藥用的擔(dān)載體和活性劑，包括一種或多種針對ERCC6L基因的雙鏈分子或編碼此類分子的載體。在本發(fā)明的背景中，針對ERCC6L的雙鏈分子能夠在導(dǎo)入表達(dá)ERCC6L 基因的細(xì)胞中時(shí)抑制ERCC6L基因的表達(dá)以及抑制由此誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所治療和/或預(yù)防的癌癥為肺癌，包括NSCLC和SCLC。NSCLC的例子包括肺腺癌(ADC) 和肺的鱗狀細(xì)胞癌(SCC)。本發(fā)明的雙鏈分子優(yōu)選包含有義鏈和反義鏈，其中該有義鏈包括與選自SEQ ID NO 7和8的靶序列對應(yīng)的核苷酸序列，且該反義鏈包括與該有義鏈互補(bǔ)的序列。該分子的有義和反義鏈彼此雜交以形成雙鏈分子。在導(dǎo)入表達(dá)ERCC6L基因的細(xì)胞中時(shí)，本發(fā)明的雙鏈分子抑制ERCC6L基因的表達(dá)以及細(xì)胞增殖。本發(fā)明的方法和材料能夠在檢測到癌癥的明顯臨床癥狀之前就鑒定出癌癥，而且可在癌癥治療的背景下使用而沒有不良效應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，本發(fā)明的一個或多個方面能符合某些目的，而一個或多個其它方面能符合某些其它目的。每個目的可以不是在它的所有方面同等適用于本發(fā)明的每一個方面。因此，前述目的可視為關(guān)于本發(fā)明的任何一個的備選。本發(fā)明的這些和其它目的和特征在閱讀下面的詳細(xì)描述連同附圖和實(shí)施例之后會變得更加清楚明白。然而，要理解，上面的發(fā)明概述和下面的詳細(xì)描述都是優(yōu)選實(shí)施方案，而非對本發(fā)明或本發(fā)明其它備選實(shí)施方案的限制。附圖簡述在考慮下面的附圖簡要描述和發(fā)明詳細(xì)描述及其優(yōu)選實(shí)施方案之后，本發(fā)明的各個方面和應(yīng)用對熟練技術(shù)人員會變得明顯[圖I]圖I展現(xiàn)肺癌和正常組織中的ERCC6L表達(dá)。部分A描繪半定量RT-PCR 的結(jié)果，證實(shí)了 NSCLC(ADC和SCC)和SCLC的臨床樣品中與正常肺組織相比的ERCC6L的過表達(dá)。制備每種自肺癌樣品的mRNA制備的單鏈cDNA的適宜稀釋液，使用β -肌動蛋白 (ACTB)表達(dá)的水平作為數(shù)量對照。部分B描繪半定量RT-PCR的結(jié)果，證實(shí)了肺癌細(xì)胞系中 ERCC6L的表達(dá)。部分C描繪ERCC6L的Northern印跡分析的結(jié)果，證明數(shù)種肺癌細(xì)胞系強(qiáng)表達(dá)ERCC6 :而大多數(shù)正常人組織不然。部分D描繪通過抗myc檢測的C0S-7細(xì)胞中外源 ERCC6L蛋白的亞細(xì)胞定位。細(xì)胞用DAPI共染色。[圖2]圖2證明針對ERCC6L的siRNA對過表達(dá)ERCC6L的肺癌細(xì)胞的生長的影響。部分A描繪半定量RT-PCR分析的結(jié)果，確認(rèn)SBC-5細(xì)胞中響應(yīng)si_ERCC6L (si_#A或 si-#B)但不響應(yīng)對照siRNA (LUC或EGFP)而發(fā)生ERCC6L表達(dá)的敲低效應(yīng)。部分B描繪用特異性siRNA或?qū)φ召|(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SBC-5細(xì)胞的集落形成測定的結(jié)果。部分C描繪SBC-5細(xì)胞響應(yīng)于si-ERCC6L(si-#A或si_#B)、si-LUC、或si-EGFP的MTT測定的結(jié)果。所有測定在一式三份的孔中實(shí)施三次。[圖3]圖3證明ERCC6L導(dǎo)入C0S-7細(xì)胞對細(xì)胞生長的增強(qiáng)。部分A描繪Western 印跡分析的結(jié)果，確認(rèn)C0S-7細(xì)胞中ERCC6L的瞬時(shí)表達(dá)。部分B描繪C0S-7細(xì)胞中ERCC6L 的瞬時(shí)表達(dá)中的生長促進(jìn)效應(yīng)。測定在一式三份的孔中實(shí)施三次。發(fā)明詳述雖然任何與本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于實(shí)施或測試本發(fā)明的實(shí)施方案，但是現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法、裝置、和材料。然而，在描述本發(fā)明的材料和方法之前，要理解，本發(fā)明不限于本文中描述的特定大小、形狀、尺度、材料、方法、方案、 等，因?yàn)檫@些可依照常規(guī)實(shí)驗(yàn)和優(yōu)化而變化。還要理解，該描述中使用的術(shù)語只是出于描述特定樣式或?qū)嵤┓桨傅哪康?，而非意圖限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍只會由所附權(quán)利要求來限制。通過述及明確地將此說明書中提到的每一篇出版物、專利或?qū)＠暾埖墓_內(nèi)容完整收入本文。然而，本文中無一處可解釋為承認(rèn)本發(fā)明沒有資格憑借發(fā)明在先而早于此類公開。如果有沖突，當(dāng)以本說明書，包括定義為準(zhǔn)。另外，該等材料、方法、和實(shí)施例只是例示性的，而非意圖限制。定義如本文中使用的，詞語“一個/種”、“該”、和“所述”意味著“至少一個/種”，除非
另有明確說明。在本文中與物質(zhì)(例如多肽、抗體、多核苷酸、等)聯(lián)用時(shí)，術(shù)語“分離的”和 “純化的”表示該物質(zhì)基本上不含至少一種也可包括于天然來源中的物質(zhì)。如此，分離的或純化的抗體指基本上不含細(xì)胞材料諸如碳水化合物、脂質(zhì)、或其它來自該蛋白質(zhì)(抗體)所由來的細(xì)胞或組織源的污染性蛋白質(zhì)的抗體，或當(dāng)化學(xué)合成時(shí)基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品的抗體。術(shù)語“基本上不含細(xì)胞材料”包括其中多肽與用于分離或重組生產(chǎn)它的細(xì)胞的細(xì)胞成分分開的多肽制備物。如此，基本上不含細(xì)胞材料的多肽包括具有少于約30 %、 20%、10%、或5% (按干重計(jì))的異源蛋白質(zhì)(在本文中也稱作“污染性蛋白質(zhì)”)的多肽制備物。當(dāng)多肽重組產(chǎn)生時(shí)，其還優(yōu)選基本上不含培養(yǎng)基，包括具有少于約20%、10%、或 5%的蛋白質(zhì)制備物體積的培養(yǎng)基的多肽制備物。當(dāng)多肽通過化學(xué)合成產(chǎn)生時(shí)，其優(yōu)選基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品，包括具有少于約30%、20%、10%、5% (按干重計(jì))的蛋白質(zhì)制備物體積的與該蛋白質(zhì)合成有關(guān)的化學(xué)前體或其它化學(xué)品的多肽制備物?？衫缤ㄟ^在蛋白質(zhì)制備物的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳及凝膠的考馬斯亮藍(lán)染色等等之后單一條帶的出現(xiàn)來顯示特定蛋白質(zhì)制備物含有分離的或純化的多肽。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是分離的或純化的?！胺蛛x的”或“純化的”核酸分子，諸如cDNA分子，當(dāng)通過重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)可基本上不含其它細(xì)胞材料或培養(yǎng)基，或當(dāng)化學(xué)合成時(shí)可基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品。術(shù)語“多肽”、“肽”、和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該等術(shù)語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是經(jīng)過修飾的殘基或非天然存在的殘基(諸如相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)模擬物)的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。
術(shù)語“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及與天然存在的氨基酸發(fā)揮相似功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸指由遺傳密碼編碼的氨基酸，以及在細(xì)胞中在翻譯后經(jīng)過修飾的氨基酸(例如羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、和O-磷酸絲氨酸)。短語“氨基酸類似物”指與天然存在的氨基酸具有相同的基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)(α碳與氫、 羧基、氨基、和R基團(tuán)結(jié)合)但具有經(jīng)過修飾的R基團(tuán)或經(jīng)過修飾的主鏈的化合物(例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍)。短語“氨基酸模擬物”指與具有與一般氨基酸不同的結(jié)構(gòu)但發(fā)揮與一般氨基酸相似的功能的化學(xué)化合物。氨基酸在本文中可以通過它們公知的由IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會推薦的三字母符號或單字母符號來指稱。除非另有明確陳述，術(shù)語“基因”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子” 可交換使用，并且與氨基酸類似，以普遍接受的單字母代碼來表示。類似于氨基酸，它們涵蓋天然存在的和非天然存在的核酸聚合物。多核苷酸、寡核苷酸、核酸、或核酸分子可包含 DNA、RNA或其組合。除非另有定義，術(shù)語“癌癥”指過表達(dá)ERCC6L基因的癌癥。過表達(dá)ERCC6L的癌癥的例子包括但不限于肺癌，包括SCLC和NSCLC。NSCLC包括但不限于腺癌(ADC)和鱗狀細(xì)胞癌(SCC)。如本文中使用的，術(shù)語“雙鏈分子”指抑制靶基因表達(dá)的核酸分子，包括例如短干擾RNA (siRNA ；例如雙鏈核糖核苷酸(dsRNA)或小發(fā)夾RNA (shRNA))和短干擾DNA/ RNA(siD/R-NA ;例如DNA和RNA的雙鏈嵌合物(dsD/R-NA)或DNA和RNA的小發(fā)夾嵌合物 (shD/R-NA))。在本文中，“雙鏈分子”也稱作“雙鏈核酸”、“雙鏈核酸分子”、“雙鏈多核苷酸” 和“雙鏈多核苷酸分子”。ERCC6L 基因或 ERCC6L 蛋白本發(fā)明部分基于下述發(fā)現(xiàn)，編碼ERCC6L的基因在癌癥中與非癌性組織相比過表達(dá)。ERCC6L多核苷酸的核苷酸序列和ERCC6L多肽的氨基酸序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的，而且得自例如web網(wǎng)站諸如GenBank 上的基因數(shù)據(jù)庫。ERCC6L多核苷酸的一個例不性核苷酸序列顯不于SEQ ID NO :9，而ERCC6L多肽的一個例不性氨基酸序列顯不于SEQ ID NO =IO0也可例如經(jīng)GenBank登錄號BC11486或ΝΜ_017669獲得序列數(shù)據(jù)。技術(shù)人員會認(rèn)識到，ERCC6L序列不必限于這些序列，而且變體(例如功能性等同物和等位變體)也可用于本發(fā)明，如下所述。依照本發(fā)明的一個方面，認(rèn)為功能性等同物也是“ERCC6L多肽”。在本文中，蛋白 (例如ERCC6L多肽)的“功能性等同物”為具有與該蛋白等同的生物學(xué)活性的多肽。也就是，任何保留ERCC6L蛋白的生物學(xué)能力的多肽可用作本發(fā)明中的此類功能性等同物。此類功能性等同物包括那些對ERCC6L蛋白的天然存在氨基酸序列替代、刪除、添加、或插入一個或多個氨基酸的?；蛘撸嚯目砂c相應(yīng)蛋白的序列具有至少約80%同源性(也稱作序列同一性)，更優(yōu)選至少約90%至95%同一性，常常為約96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，多肽可以由在嚴(yán)格條件下與ERCC6L基因的天然存在核苷酸序列雜交的多核苷酸編碼。本發(fā)明的多肽可在氨基酸序列、分子量、等電點(diǎn)、糖鏈的有無、或形式方面有變化，取決于用于產(chǎn)生它的細(xì)胞或宿主，或使用的純化方法。無論如何，只要它具有與本發(fā)明的人 ERCC6L蛋白的功能等同的功能，它就在本發(fā)明的范圍內(nèi)。短語“嚴(yán)格(雜交)條件”指下述條件，在該條件下，核酸分子會與其靶序列雜交， 通常在核酸復(fù)雜混合物中，但沒有與其它序列的可檢測的雜交。嚴(yán)格條件取決于序列，而且在不同情況中會有所變化。較長的序列在較高的溫度特異性雜交。對于核酸雜交詳盡指導(dǎo)可見于 Ti jssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Probes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays”(1993)。一般地,嚴(yán)格條件選擇為在限定的離子強(qiáng)度和pH,比特定序列的熱熔點(diǎn)(Tm)低約5-10°C。Tm是如下的溫度(在限定的離子強(qiáng)度、pH、和核酸濃度下)，其中50%的與靶互補(bǔ)的探針在平衡時(shí)與靶序列雜交(因?yàn)榘行蛄羞^量存在，所以在 Tm，在平衡時(shí)50%的探針被占據(jù))。嚴(yán)格條件也可以通過添加去穩(wěn)定劑(諸如甲酰胺)來實(shí)現(xiàn)。對于選擇性或特異性雜交，陽性信號是背景的至少兩倍，優(yōu)選背景雜交的10倍。例示性的嚴(yán)格雜交條件包括如下50%甲酰胺、5x SSC、和1% SDS，在42°C溫育，或5x SSCU% SDS、在 65°C溫育，用 0. 2x SSC 和 0. 1% SDS 在 50°C清洗。在本發(fā)明的背景中，用于分離編碼與人ERCC6L蛋白在功能上等同的多肽的 DNA的雜交條件可由本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)選擇。例如，可如下進(jìn)行雜交在68攝氏度用 “Rapid-hyb buffer”(Amersham LIFE SCIENCE)進(jìn)行30分鐘或更長的預(yù)雜交,添加經(jīng)過標(biāo)記的探針，并在68攝氏度溫育I小時(shí)或更長。下面的清洗步驟可在例如低嚴(yán)格度條件中進(jìn)行。一種例示性的低嚴(yán)格度條件可包括42°C、2x SSC、0. 1% SDS，優(yōu)選50°C、2x SSC.0. 1% SDS。常常優(yōu)選使用高嚴(yán)格條件。一種例示性的高嚴(yán)格條件可包括在室溫在2x SSC.0. 1% SDS中清洗3次各20分鐘，然后在Ix SSC、0. 1% SDS中在37攝氏度清洗3次各20分鐘， 并在Ix SSC、0. I % SDS中在50攝氏度清洗2次各20分鐘。然而，數(shù)種因素，諸如溫度和鹽濃度，可影響雜交的嚴(yán)格度，而且本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇合適的因素以達(dá)到所需的嚴(yán)格度。一般而言，蛋白中一個、兩個或更多個氨基酸的修飾不會影響蛋白的功能。事實(shí)上，已知突變的或經(jīng)過修飾的蛋白(即包含通過替代、刪除、插入和/或添加而修飾一個、兩個或更多個氨基酸殘基的氨基酸序列的肽)保留原始的生物學(xué)活性(Mark et al. , Proc Natl Acad Sci USA 81 :5662-6 (1984) ；ZoIIer and Smith, Nucleic Acids Res 10 :6487-500(1982) ；Dalbadie-McFarland et al. , Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13(1982))。因而，本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，對氨基酸序列進(jìn)行個別添加、刪除、插入、或替代，這改變單個氨基酸或少數(shù)氨基酸，或者被認(rèn)為是“保守修飾”的那些修飾——其中蛋白的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白，這些都是本發(fā)明的背景中可接受的。因此，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽可具有在ERCC6L序列中添加、插入、刪除、和/或替代一個、兩個或甚至更多個氨基酸的氨基酸序列。只要保持蛋白的活性，氨基酸突變的數(shù)目不受特別限制。然而，一般優(yōu)選改變氨基酸序列的5%或更少。因而，在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，在此類突變體中要突變的氨基酸數(shù)目一般為30個氨基酸或更少，優(yōu)選20個氨基酸或更少，更優(yōu)選10個氨基酸或更少，更優(yōu)選 6個氨基酸或更少，更優(yōu)選3個或4個氨基酸或更少。要突變的氨基酸殘基優(yōu)選突變?yōu)榘被醾?cè)鏈特性保持的另一種氨基酸(稱為保守性氨基酸替代的過程)。氨基酸側(cè)鏈特性的例子有疏水性氨基酸(A，I，L，M，F(xiàn)，P，W，Y，V)、親水性氨基酸(R，D，N, C，E，Q，G，H，K，S，T)、和具有下列共同官能團(tuán)或特征的側(cè)鏈脂肪族側(cè)鏈(G，A，V，L，I，P);含有羥基基團(tuán)的側(cè)鏈(S，T，Y);含有硫原子的側(cè)鏈(C，M);含有羧酸和酰胺的側(cè)鏈(D，N，E，Q);含有堿的側(cè)鏈(R，K，H);和含有芳香族的側(cè)鏈(H，F(xiàn)，Y，W)。 提供功能相似氨基酸的保守性替代表在本領(lǐng)域是公知的。例如，下列8個組各種包含彼此構(gòu)成保守性替代的氨基酸I)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(參見例如 Creighton, Proteins 1984)。此類保守性修飾多肽包括在本發(fā)明的ERCC6L蛋白中。然而，本發(fā)明并不僅限于此，而且ERCC6L蛋白包括非保守性修飾，只要ERCC6L蛋白的至少一種生物學(xué)活性得以保留即可。另外，經(jīng)過修飾的蛋白并不排除多態(tài)變體、種間同源物、和那些由這些蛋白的等位基因編碼者。此外，本發(fā)明的ERCC6L基因涵蓋編碼ERCC6L蛋白的此類功能性等同物的多核苷酸。在雜交之外，可以利用基因擴(kuò)增方法來分離編碼與ERCC6L蛋白功能等同的多肽的多核苷酸，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法，使用基于蛋白編碼DNA的序列信息(SEQ ID NO 9) 合成的引物。分別構(gòu)成人類ERCC6L基因和蛋白的功能性等同物的多核苷酸和多肽通常與其原始核苷酸或氨基酸序列具有高同源性。“高同源性”通常指40%或更高的同源性，優(yōu)選 60 %或更高，更優(yōu)選80 %或更高，甚至更優(yōu)選90 %至95 %或更高，甚至更優(yōu)選96 %、97 %、 98%、99%或更高。特定多核苷酸或多肽的同源性可遵循“Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80 :726-30 (1983) ” 中的算法來確定。診斷癌癥的方法:發(fā)現(xiàn)ERCC6L基因的表達(dá)在肺癌中特異性的提高(

圖1A、B)。Northern印跡分析顯示了 ERCC6L在正常組織中不表達(dá)，但是在肺癌細(xì)胞系中強(qiáng)表達(dá)(圖1C)。因而，本文鑒定出的ERCC6L基因及其轉(zhuǎn)錄與翻譯產(chǎn)物可以作為標(biāo)志用于診斷癌癥諸如肺癌，而且，通過測量樣品中ERCC6L的表達(dá)進(jìn)行?？赏ㄟ^在源自受試者的樣品與正常樣品之間比較ERCC6L基因的表達(dá)水平來診斷或檢測癌癥。更特別地，本發(fā)明提供了通過確定受試者中ERCC6L表達(dá)水平檢測、診斷和/或確定癌癥，更特別的是ERCC6L相關(guān)癌癥的存在或其發(fā)生的傾向性的方法。因而，本發(fā)明提供了一種用于檢測或診斷受試者中癌癥的方法，所述方法包括測定源自受試者的生物樣品中ERCC6L基因表達(dá)水平的步驟，其中所述水平與所述基因的正常對照水平相比的升高指示樣品中存在或懷疑存在癌細(xì)胞，繼而提示受試者患有或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生癌癥。ERCC6L基因的表達(dá)水平可通過任何已知方法來測定，其例子包括(a)檢測 ERCC6L 基因的 mRNA ；
(b)檢測由ERCC6L基因編碼的蛋白質(zhì)；和(c)檢測由ERCC6L基因編碼的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，要通過本方法診斷的癌癥是肺癌，包括NSCLC和SCLC。 NSCLC包括肺的腺癌(ADC)和肺的鱗狀細(xì)胞癌(SCC)。依照本發(fā)明，可以提供用于檢查受試者狀況的中間結(jié)果。此類中間結(jié)果可以與別的信息組合來幫助醫(yī)生、護(hù)士、或其它從業(yè)人員診斷受試者患有疾病。因此，本發(fā)明考慮 ERCC6L作為用于癌癥的診斷標(biāo)志物的用途?；蛘撸景l(fā)明可用于檢測或鑒定源自受試者的組織中的癌性細(xì)胞，此類細(xì)胞特征在于所述表達(dá)水平與所述基因的正常對照水平相比的升高指示組織中癌細(xì)胞的存在或懷疑。ERCC6L表達(dá)結(jié)果可以與別的信息組合來幫助醫(yī)生、護(hù)士、或其它保健從業(yè)人員診斷受試者患有疾病。換言之，本發(fā)明可以給醫(yī)生提供有用信息來診斷受試者患有疾病。例如，依照本發(fā)明，當(dāng)關(guān)于自受試者獲得的組織中癌細(xì)胞的存在有疑問時(shí)，通過考慮ERCC6L基因的表達(dá)水平，加上疾病的不同方面，包括組織病理學(xué)、血液中的已知腫瘤標(biāo)志物的水平、和受試者的臨床過程等，能做出臨床決策。例如，一些公知的血液中的診斷性肺腫瘤標(biāo)志物為IAP、 ACT、BFP、CA19-9、CA50、CA72-4、CA130、CEA、KMO-1、NSE、SCC、SPI、Span-1、TPA、CSLEX、SLX、 STN和CYFRA。就是說，在本發(fā)明的這個具體實(shí)施方案中，基因表達(dá)分析的結(jié)果作為中間結(jié)果，用于進(jìn)一步診斷受試者的疾病狀態(tài)。本發(fā)明特別感興趣的是了下述[I]到[10]的方法[I] 一種在受試者中檢測或診斷癌癥的方法，包括測定源自受試者的生物樣品中 ERCC6L基因的表達(dá)水平，其中所述水平較之所述基因正常對照水平的提高指示所述受試者患有或有風(fēng)險(xiǎn)形成癌癥；[2] [I]的方法，其中所述表達(dá)水平比正常對照水平高至少10% ；[3] [I]的方法，其中所述表達(dá)水平通過選自下組的方法檢測(a)檢測 ERCC6L 基因的 mRNA ；(b)檢測由ERCC6L基因編碼的蛋白質(zhì)；(c)檢測由ERCC6L基因編碼的蛋白質(zhì)的活性；[4] [I]的方法，其中所述癌癥為肺癌。[5] [3]的方法，其中所述表達(dá)水平是通過檢測探針與基因的基因轉(zhuǎn)錄物雜交來確定的；[6] [3]的方法，其中所述表達(dá)水平是通過檢測抗體與基因編碼的蛋白的結(jié)合作為所述基因的表達(dá)水平來確定的；[7] [I]的方法，其中所述生物樣品包括活檢樣品、痰或血液。[8] [I]的方法，其中所述源自患者的生物樣品包含上皮細(xì)胞。[9] [I]的方法，其中所述源自患者的生物樣品包含癌細(xì)胞。[10] [I]的方法，其中所述源自患者的生物樣品包含癌性上皮細(xì)胞。本發(fā)明的診斷癌癥的方法在下面更加詳細(xì)的加以敘述。需用本方法診斷的患者優(yōu)選為哺乳動物。哺乳動物的例子包括但不僅限于，例如，人類，非人靈長類、小鼠、大鼠、犬、 貓、馬以及牛。為實(shí)施診斷，優(yōu)選從要診斷的受試者采集生物樣品。任何生物學(xué)材料均可作為生物樣品用于測定，只要其包括目標(biāo)的ERCC6L轉(zhuǎn)錄或翻譯產(chǎn)物。所述生物樣品包括，但不僅限于，想要診斷或懷疑患有癌癥的身體組織與體液，例如活檢樣品，血液，痰與尿液。生物樣品優(yōu)選含有這樣的細(xì)胞群體，該群體包括上皮細(xì)胞，較優(yōu)選癌性上皮細(xì)胞或源自懷疑為腫瘤的組織的上皮細(xì)胞。進(jìn)一步，如果必要，可從所得的身體組織或體液中純化所述細(xì)胞，并將其用為生物樣品。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物樣品可包括自要診斷的受試者獲得的肺細(xì)胞或肺組織。根據(jù)本發(fā)明，測定在所述源自患者的生物樣品中ERCC6L的表達(dá)水平。表達(dá)水平可在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(核酸)水平確定，使用本領(lǐng)域熟知的方法。舉例而言，ERCC6L的mRNA可通過雜交方法(例如，Northern雜交)使用探針定量?？稍谛酒蜿嚵猩蠈?shí)施所述檢測。對檢測包括ERCC6L在內(nèi)的多個基因(例如，多種癌癥特異性基因)的表達(dá)水平而言，優(yōu)選使用陣列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用ERCC6L的序列信息制備上述探針。舉例而言，ERCC6L的cDNA 可用作探針。如需要，所述探針可用合適的標(biāo)記物來標(biāo)記，例如染料、熒光或同位素，且所述基因的表達(dá)水平可以作為發(fā)生了雜交的標(biāo)記物的強(qiáng)度來檢測。進(jìn)一步，ERCC6L的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可通過基于擴(kuò)增的檢測技術(shù)(例如，RT-PCR)使用引物定量。上述引物亦可基于所述基因已知的序列信息制備。舉例而言，用于實(shí)施例的引物 (SEQ ID NO 1和2)可用于通過RT-PCR或Northern印跡的檢測，但本發(fā)明并不僅限于此。具體而言，本方法所用的探針或引物在嚴(yán)格條件、中等嚴(yán)格條件與低嚴(yán)格條件下與ERCC6L的mRNA雜交。如本文中所使用的，短語“嚴(yán)格(雜交)條件”是指這樣的條件， 在該條件下，探針或引物將與其靶序列雜交，但不與其它序列雜交。嚴(yán)格條件是依賴于序列的，在不同的環(huán)境下會不同。較長序列的特異雜交與較短序列相比在較高溫度下發(fā)生。一般地，嚴(yán)格條件的溫度應(yīng)選擇比特定序列在限定的離子強(qiáng)度和PH下的熔點(diǎn)(Tm)低大約5°C。 Tm是(在限定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)平衡狀態(tài)下有50%的與靶序列互補(bǔ)的探針與靶序列雜交的溫度。因?yàn)榘行蛄幸话氵^量存在，因此在Tm下，平衡時(shí)50%的探針被占據(jù)。 典型地，嚴(yán)格條件是這樣的其中鹽濃度小于大約I. OM鈉離子，典型地大約O. 01-1. OM鈉離子(或其它鹽)，ρΗ7· 0-8. 3，溫度對于較短的探針或引物(例如10-50個核苷酸)是至少大約30°C，用于較長的探針或引物是至少大約60°C。嚴(yán)格條件也可以通過添加去穩(wěn)定劑， 例如甲酰胺，來實(shí)現(xiàn)?；蛘撸梢詸z測翻譯產(chǎn)物以進(jìn)行本發(fā)明的診斷。例如，可以測定ERCC6L蛋白的量。 測定作為翻譯產(chǎn)物的蛋白量的方法包括免疫測定法，此類方法使用特異識別所述蛋白的抗體。抗體可以是單克隆或多克隆的。而且，抗體的任何片段或修飾(例如嵌合抗體、scFv、 Fab、F(ab’)2、Fv等)均可用于檢測，只要該片段保留對ERCC6L蛋白的結(jié)合能力即可。制備這些類型的用于檢測蛋白的抗體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且在本發(fā)明中可以使用任何方法制備這些抗體和它們的等價(jià)物。作為另一種基于ERCC6L的翻譯產(chǎn)物檢測其基因的方法，可利用針對ERCC6L蛋白的抗體通過免疫組織化學(xué)分析觀察其染色的強(qiáng)度。意即，觀察到強(qiáng)染色表明所述蛋白質(zhì)存在量增加，且同時(shí)表明ERCC6L的高表達(dá)水平。另外，除ERCC6L基因的表達(dá)水平外,還可測定其它癌相關(guān)基因，例如，已知在癌癥中有差異表達(dá)的基因的表達(dá)水平，以提高所述診斷的可靠性。對于包括ERCC6L基因的癌標(biāo)志基因而言，如果該癌標(biāo)志基因在生物樣品中的表達(dá)水平較其相應(yīng)的癌標(biāo)志基因的對照水平增加了例如10%，25%或50%的話，或增加到超過I. I倍，超過I. 5倍，超過2. O倍，超過
5.O倍，超過10倍或者更多，則認(rèn)為其表達(dá)水平增加。對照水平可以與測試生物樣品同時(shí)確定，使用先前從疾病狀態(tài)(患癌或未患癌) 已知的患者收集和保存的樣品?；蛘撸瑢φ账娇梢越柚y(tǒng)計(jì)方法，根據(jù)通過分析先前測定的來自疾病狀態(tài)已知的受試者的樣品的ERCC6L基因表達(dá)水平獲得的結(jié)果加以確定。進(jìn)一步，對照水平可以是來自先前測試過的細(xì)胞的表達(dá)模式數(shù)據(jù)庫。而且，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，可以將生物樣品中ERCC6L基因的表達(dá)水平與從多個參考樣品確定的多個對照水平比較。優(yōu)選地使用從來自與源自受試者的樣品組織類型相似的組織類型的參考樣品確定的對照水平。而且，優(yōu)選地，使用具有已知的疾病狀態(tài)的群體中ERCC6L基因表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)值。 標(biāo)準(zhǔn)值可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法獲得。例如,平均值±2S. D.或平均值±3S. D.的范圍可以用作標(biāo)準(zhǔn)值。在本發(fā)明的背景中，從已知非癌性的生物樣品確定的對照水平稱作“正常對照水平”。另一方面，如果對照水平是從癌性生物樣品確定的，則稱作“癌對照水平”。當(dāng)ERCC6L基因的表達(dá)水平相比正常表達(dá)水平有所提高或與癌性對照水平相似， 則受試者可診斷為正罹患或有危險(xiǎn)罹患癌癥。進(jìn)一步，當(dāng)比較多種癌相關(guān)基因的表達(dá)水平時(shí)，樣品與癌性參照之間基因表達(dá)模式的相似性表明受試者正罹患或有危險(xiǎn)罹患癌癥。測試生物樣品的表達(dá)水平與對照水平間的差異可以相對已知表達(dá)水平不會隨著細(xì)胞的癌或非癌狀態(tài)改變的對照核酸(例如管家基因)的表達(dá)水平加以標(biāo)準(zhǔn)化。示例對照基因包括，但不僅限于，β -肌動蛋白、甘油醛_3磷酸脫氫酶和核糖體蛋白Pl。在本發(fā)明中，揭示了 ERCC6L不僅是有用的診斷標(biāo)志物，而且還是癌癥治療的合適靶物。因此，可通過本發(fā)明來實(shí)現(xiàn)靶向ERCC6L的癌癥治療。在本發(fā)明中，靶向ERCC6L的癌癥治療指阻抑或抑制癌細(xì)胞中的ERCC6L活性和/或表達(dá)。任何抗ERCC6L劑可用于靶向 ERCC6L的癌癥治療。在本發(fā)明中，抗ERCC6L劑包括下述物質(zhì)或活性組分(a)本發(fā)明的雙鏈分子，(b)編碼它的DNA，和(C)編碼它的載體。因而，在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供下述方法(i)診斷受試者是否具有要用抗ERCC6L劑治療的癌癥，和/或(ii)為靶向ERCC6L的癌癥治療選擇受試者，該方法包括下述步驟(a)測定自懷疑具有要治療的癌癥的受試者獲得的癌細(xì)胞或組織中ERCC6L的表達(dá)水平；(b)將ERCC6L的表達(dá)水平與正常對照水平比較；(c)如果ERCC6L的表達(dá)水平與正常對照水平相比升高的話，將該受試者診斷為具有要治療的癌癥；并(d)如果在步驟(C)中將該受試者診斷為具有要治療的癌癥的話，選擇該受試者進(jìn)行癌癥治療。或者，此類方法包括下述步驟(a)測定自懷疑具有要治療的癌癥的受試者獲得的癌細(xì)胞或組織中ERCC6L的表達(dá)水平；
(b)將ERCC6L的表達(dá)水平與癌性對照水平比較；(c)如果ERCC6L的表達(dá)水平與癌性對照水平相似或等同的話，將該受試者診斷為具有要治療的癌癥；并(d)如果在步驟(C)中將該受試者診斷為具有要治療的癌癥的話，選擇該受試者進(jìn)行癌癥治療。診斷癌癥的試劑盒:本發(fā)明還提供了診斷癌癥的試劑盒，其亦可用于評價(jià)和/或監(jiān)測癌癥療法功效。 本發(fā)明還提供用于確定罹患可用本發(fā)明雙鏈分子或編碼它的載體來治療的癌癥的受試者的試劑盒，其也可用于評估和/或監(jiān)測此類癌癥治療的效果。優(yōu)選地，要用本試劑盒診斷癌癥是肺癌，包括NSCLC和SCLC。更優(yōu)選地，所述試劑盒包含至少一種在源自受試者的生物樣品中檢測ERCC6L基因表達(dá)的試劑，所述試劑可選自下組(a)檢測ERCC6L基因的mRNA的試劑；(b)檢測ERCC6L的蛋白質(zhì)的試劑；(c)檢測ERCC6L的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的試劑。適于檢測ERCC6L基因mRNA的試劑包括特異性結(jié)合或識別ERCC6LmRNA的核酸，諸如具有與ERCC6L mRNA的一部分互補(bǔ)的序列的寡核苷酸。這類寡核苷酸的例子有對ERCC6L mRNA特異性的引物與探針。可基于本領(lǐng)域眾所周知的方法制備這類寡核苷酸。如果需要， 檢測ERCC6L mRNA的試劑可固定化在固體基質(zhì)上。另外，在所述試劑盒中可包括多于一種檢測ERCC6L mRNA的試劑。另一方面，適于檢測ERCC6L蛋白質(zhì)的試劑包括針對ERCC6L蛋白質(zhì)的抗體。所述抗體可為單克隆的或多克隆的。進(jìn)一步，任何所述抗體的片段或修飾(例如，嵌合抗體、scFv、 Fab、F(ab’)2、Fv等等)均可用于檢測，只要所述片段保留與ERCC6L蛋白的結(jié)合能力。為檢測蛋白制備此類抗體的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，且可在本發(fā)明中使用任何方法制備上述抗體及其等價(jià)物。進(jìn)一步，所述抗體可用能產(chǎn)生信號的分子通過直接連接或間接標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記物與標(biāo)記抗體以及抗體與其靶結(jié)合的檢測在本領(lǐng)域是眾所周知的，且本發(fā)明可使用任何標(biāo)記物與方法。另外，在所述試劑盒中可包括多于一種檢測ERCC6L蛋白質(zhì)的試劑。進(jìn)一步，所述生物學(xué)活性可通過，例如，測量所述生物樣品中由于ERCC6L蛋白質(zhì)表達(dá)而導(dǎo)致的細(xì)胞增殖活性來確定。舉例而言，可在源自受試者的生物樣品的存在下培養(yǎng)所述細(xì)胞，然后通過檢測增殖的速度，或測量細(xì)胞周期或集落形成活性，可確定所述生物樣品的生物學(xué)活性。如需要，檢測ERCC6L mRNA的試劑可固定化在固體基質(zhì)上。另外，在所述試劑盒中可包括多于一種檢測ERCC6L蛋白質(zhì)生物學(xué)活性的試劑。所述試劑盒可包含多于一種前述的試劑。進(jìn)一步，所述試劑盒可包括固體基質(zhì)以及用于將探針與ERCC6L基因結(jié)合的試劑或針對ERCC6L蛋白質(zhì)的抗體，用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基與容器，陽性與陰性對照試劑，以及用于檢測針對ERCC6L蛋白質(zhì)的抗體的第二抗體。 舉例而言，從患有或沒有癌癥的受試者獲取的組織樣品可用作有用的對照試劑。本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)一步包括其它從商業(yè)或用戶角度而言期望的材料，包括緩沖液、稀釋液、濾紙、 針頭、注射器和帶有使用說明書的裝箱單(例如，書面的、磁帶、⑶_R0M、URL等等)。這些試劑之類的可在標(biāo)上標(biāo)簽的容器中提供。合適的容器包括瓶、管狀瓶(vials)和試管。所述容器可從多種材料制得，例如玻璃或塑料。作為本發(fā)明的一個實(shí)施方案，當(dāng)所述試劑是針對ERCC6L mRNA的探針時(shí)，所述試劑可固定化于固體基質(zhì)上，例如多孔條，以形成至少一個檢測位置。所述多孔條的測量或檢測區(qū)域可包含多個位置，每個都包含核酸(探針)。測試條亦可包含陰性和/或陽性對照的位置。此外，對照位置可位于與測試條不同的條上。任選地，不同的檢測位置可包含不同量的固定化核酸，即，在第一個檢測位置上量較大而在接下來的位置上量較小。在加入樣品之后，顯示可檢測信號位置的數(shù)量提供了在樣品中存在的ERCC6L mRNA量的定量指征。所述檢測位置可具有任何合適可檢測的形狀，并通常是橫跨測試條寬度的條狀或點(diǎn)狀。本發(fā)明所述試劑盒可進(jìn)一步包括陽性對照和/或陰性對照樣品，和/或ERCC6L 標(biāo)準(zhǔn)樣品。本發(fā)明的所述陽性對照樣品可通過收集ERCC6L陽性樣品來制備。此類 ERCC6L陽性樣品可例如自已建立的肺癌細(xì)胞系獲得，包括肺的腺癌細(xì)胞(ADC)系諸如 A427、NCI-H1781、A549、LC319 等等；肺的鱗狀細(xì)胞癌(SCC)細(xì)胞系諸如 NCI-H26、EBC-U NCI-H520、NCI-H2170 等等；和 SCLC 細(xì)胞系諸如 DMSl 14、DMS273、SBC-3、SBC-5、H196、H446 等等。或者，ERCC6L陽性樣品可自臨床肺癌組織獲得，包括肺的腺癌組織、肺的鱗狀細(xì)胞癌組織和SCLC組織?；蛘?，陽性對照樣品可通過確定截留值并制備含有量超過截留值的 ERCC6L mRNA或蛋白的樣品來制備。在本文中，短語“截留值”指在正常范圍和癌性范圍之間區(qū)分的值。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用接受者運(yùn)行特征(ROC)曲線來確定截留值。本試劑盒可包括含有截留值量的ERCC6L mRNA或多肽的ERCC6L標(biāo)準(zhǔn)樣品。相反，陰性對照樣品可自非癌性細(xì)胞系或非癌性組織諸如正常肺組織制備，或者可以通過制備含有少于截留值的ERCC6L mRNA或蛋白的樣品來制備?；蛘?，本發(fā)明提供試劑制備用于診斷癌癥的診斷試劑的用途。在一些實(shí)施方案中， 該試劑可選自下組(a)用于檢測ERCC6L基因的mRNA的試劑；(b)用于檢測ERCC6L蛋白的試劑；和(c)用于檢測ERCC6L蛋白的生物學(xué)活性的試劑。具體地，此類試劑是與ERCC6L多核苷酸雜交的寡核苷酸或與ERCC6L多肽結(jié)合的抗體?？拱┪镔|(zhì)的篩詵:通過本發(fā)明，證明了 ERCC6L涉及癌細(xì)胞生長。因而，阻抑ERCC6L基因的表達(dá)水平和/或ERCC6L多肽的生物學(xué)活性的物質(zhì)預(yù)期可用于治療和/或預(yù)防癌癥?？墒褂肊RCC6L 基因、由該基因編碼的多肽、或該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)來篩選此類物質(zhì)。如此，本發(fā)明還提供使用ERCC6L基因、ERCC6L多肽、或該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)篩選用于治療和/或預(yù)防癌癥的候選物質(zhì)的方法。在本發(fā)明的背景中，待通過本篩選方法鑒定的物質(zhì)可以是任何化合物或包含數(shù)種化合物的組合物。而且，根據(jù)本發(fā)明篩選方法暴露于細(xì)胞或蛋白的測試物質(zhì)可以是單種物質(zhì)或多種物質(zhì)的組合。當(dāng)在方法中使用物質(zhì)組合時(shí)，各物質(zhì)可以順次或同時(shí)加以接觸。通過本篩選方法篩選的物質(zhì)可以是用于治療和/或預(yù)防癌癥和/或抑制癌細(xì)胞生長的合適候選物質(zhì)。在本發(fā)明中，所述癌癥優(yōu)選特征在于與ERCC6L過表達(dá)的關(guān)聯(lián)。因而， 所篩選的物質(zhì)可優(yōu)選應(yīng)用于與ERCC6L過表達(dá)有關(guān)或有關(guān)聯(lián)的癌癥。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述與ERCC6L過表達(dá)有關(guān)或有關(guān)聯(lián)的癌癥是肺癌，包括NSCLC和SCLC。NSCLC包括但不限于肺的腺癌(ADC)和肺的鱗狀細(xì)胞癌(SCC)。任何測試物質(zhì)，例如，細(xì)胞提取物、細(xì)胞培養(yǎng)上清、發(fā)酵微生物產(chǎn)物、海洋生物提取物、植物提取物、純化或粗蛋白質(zhì)、肽、非肽化合物、合成微分子化合物(包括核酸構(gòu)建體， 例如反義RNA、siRNA、核酶以及適體等等)以及天然化合物，均可用于本發(fā)明的篩選方法中。也可使用本領(lǐng)域熟知的很多組合文庫方法中的任何途徑來獲得本發(fā)明的測試物質(zhì)，包括(I)生物文庫，(2)空間可尋址平行固相或液相文庫(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), (3)需要解卷積(deconvolution)的合成文庫法，⑷“一珠一化合物”(“one-bead one-compound”)文庫法，以及(5)使用親和色譜選擇的合成文庫法。使用親和色譜選擇的生物文庫法限于肽文庫，而其它四種途徑適用于肽、非肽寡聚物或化合物小分子文庫(Lam,Anticancer Drug Des 1997,12:145-67)。合成分子文庫方法的例子可在現(xiàn)有技術(shù)中找到(DeWitt et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1993,90 :6909-13 ；Erb et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1994,91 :11422-6 ；Zuckermann et al. , J Med Chem 37 :2678-85,1994 ；Cho et al. , Science 1993,261 :1303-5 ；Care11 et al. , Angew Chem Int Ed Engl 1994,33 :2059 ； Care 11 et al. , Angew Chem Int Ed Engl 1994,33 :2061 ；Gallop et al.，J Med Chem 1994,37 :1233-51)。化合物文庫可提供于溶液中(參見 Houghten, Bio/Techniques 1992,13 :412-21)或珠子上(Lam, Nature 1991,354: 82-4)、芯片上(Fodor, Nature 1993，364 :555-6)、細(xì)菌上(美國專利 5，223，409)、孢子上 (美國專利 5，571，698 ;5，403，484 與 5，223，409)、質(zhì)粒上(Cull et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1992，89 :1865-9)或噬菌體上(Scott and Smith, Science 1990，249 :386-90 ; Devlin, Science 1990,249 :404-6 ；Cwirla et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1990,87 6378-82 ；Felici, J Mol Biol 1991，222 :301-10 ;美國專利申請 2002103360)。通過本發(fā)明任一篩選方法篩選到的化合物的一部分結(jié)構(gòu)通過添加、刪除、和/或置換方式被轉(zhuǎn)換而得到的物質(zhì)，包括在通過本發(fā)明篩選方法鑒定的物質(zhì)之內(nèi)。此外，當(dāng)通過本篩選方法獲得的候選物質(zhì)是蛋白質(zhì)時(shí)，為了獲得編碼該蛋白的 DNA，可以確定蛋白的全部氨基酸序列，以此推定該編碼蛋白的核酸序列，或者可以分析所得蛋白的部分氨基酸序列，根據(jù)該序列制備寡DNA作為探針，并用該探針篩選cDNA文庫，以獲得編碼該蛋白的DNA?？梢詫λ玫腄NA確認(rèn)其在制備治療或預(yù)防癌癥的候選物質(zhì)中的有用性。在本文描述篩選中使用的測試樣品亦可為特異性結(jié)合ERCC6L蛋白或其缺乏原蛋白的體內(nèi)生物學(xué)活性的部分肽的抗體。盡管測試物質(zhì)文庫的構(gòu)建是本領(lǐng)域眾所周知的，在下文中還是進(jìn)一步提供了鑒定測試物質(zhì)和構(gòu)建用于本篩選方法的這些測試物質(zhì)的文庫的指導(dǎo)。(i)分子建模:對具有目標(biāo)性質(zhì)的物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和/或?qū)RCC6L蛋白的分子結(jié)構(gòu)的知識為人們構(gòu)建測試物質(zhì)文庫提供了便利。預(yù)篩選適于進(jìn)一步評估的受試物質(zhì)的方法之一，利用對受試物質(zhì)與其靶標(biāo)的相互作用進(jìn)行計(jì)算機(jī)建模。計(jì)算機(jī)建模技術(shù)為選定分子的三維原子結(jié)構(gòu)的可視化以及會與該分子相互作用的新物質(zhì)的合理設(shè)計(jì)提供了可能。三維構(gòu)建典型地依賴于來源于選定分子的X-射線晶體分析或NMR成像的數(shù)據(jù)。分子動力學(xué)需要力場數(shù)據(jù)。計(jì)算機(jī)圖形系統(tǒng)為預(yù)測新物質(zhì)如何連接靶分子，以及實(shí)驗(yàn)操作物質(zhì)和靶分子的結(jié)構(gòu)以完善結(jié)合特異性提供了可能。為了預(yù)測當(dāng)分子和物質(zhì)之一或二者都發(fā)生細(xì)小改變時(shí)分子-物質(zhì)相互作用是什么樣的，需要分子力學(xué)軟件和計(jì)算密集型計(jì)算機(jī)，它們通常耦聯(lián)著分子設(shè)計(jì)程序和用戶之間的用戶友好的、菜單驅(qū)動的界面。上文一般性描述的分子建模系統(tǒng)的一個實(shí)例包括CHARMm和QUANTA程序，Polygen Corporation, Waltham, Mass。CHARMm執(zhí)行能量最小化和分子動力學(xué)功能。QUANTA執(zhí)行構(gòu)建、圖形建模和分子結(jié)構(gòu)分析。利用QUANTA可進(jìn)行分子相互行為的互動性構(gòu)建、修飾、可視化和分析。關(guān)于與特異蛋白相互作用的藥物的計(jì)算機(jī)建模主題已經(jīng)發(fā)表了多篇文獻(xiàn)，其例子包括 Rotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 1988,97 :159-66 ;Ripka, New Scientist 1988,54-8 ；McKinlay&Rossmann, Annu Rev Pharmacol Toxiciol 1989,29: 111-22 ；Perry&Davies, Prog Clin Biol Res 1989,291 :189-93 ；Lewis&Dean, Proc R Soc Lond 1989,236 :125-40，141-62 ;以及關(guān)于核酸組分模型受體的 Askew et al.，J Am Chem Soc 1989，111 :1082-90。其它可篩選并圖形描述化學(xué)物質(zhì)的計(jì)算機(jī)程序可以從例如Mississauga， Ontario, Canada 的 BioDesign, Inc. , Pasadena, Calif. , Allelix, Inc 公司、Cambridge, Ontario 的 Hypercube, Inc.等公司獲取。見例如 DesJarlais et al. , J Med Cheml988, 31 722-9 ；Meng et al. , J Computer Chem 1992,13 :505-24；Meng et al. , Proteins 1993, 17 :266-78 ；Shoichet et al. , Science 1993,259 :1445_50。一旦鑒定出推定的抑制劑，可使用組合化學(xué)技術(shù)基于鑒定出的推定抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)構(gòu)建任何數(shù)量的變體，如下所述。對于所得的推定抑制劑，或“測試物質(zhì)”文庫，可使用本發(fā)明的方法篩選，以鑒定適于治療和/或預(yù)防癌癥和/或預(yù)防癌癥術(shù)后復(fù)發(fā)的物質(zhì)，特別是所述癌癥是肺癌的情況。(ii)組合化學(xué)合成:測試物質(zhì)的組合文庫可以作為合理藥物設(shè)計(jì)程序的一部分來制備，合理藥物設(shè)計(jì)程序涉及有關(guān)已知抑制劑中存在的核心結(jié)構(gòu)的知識。這種策略使得文庫可以保持合理的規(guī)模，便于進(jìn)行高通量篩選。或者，可通過簡單地合成構(gòu)成文庫的分子家族的所有排列，來構(gòu)建簡單的，特別是短的、聚合物性的分子文庫。后一種方法的一個實(shí)例是由所有長度為6個氨基酸組成的肽文庫。這種肽文庫包含所有6氨基酸序列排列。這種類型的文庫稱作線性組合化學(xué)文庫。組合化學(xué)文庫的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，可以通過化學(xué)或生物合成來產(chǎn)生。組合化學(xué)文庫包括，但不僅限于，肽文庫(見例如美國專利5，010，175 ;Furka, Int J Pept Prot Res 1991,37 :487-93 ；Houghten et al. , Naturel991,354 :84-6)。也可以使用其它用于產(chǎn)生化學(xué)多樣性文庫的化學(xué)。這些化學(xué)包括，但不僅限于，肽(例如PCT公布WO 91/19735)，被編碼的肽(例如W093/20242)，隨機(jī)生物寡聚體(例如WO 92/00091)， 苯并二氮卓(benzodiazepines)(例如美國專利5, 288, 514), diversomer如乙內(nèi)酰脲、苯并二氮卓和二肽(DeWitt et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1993，90 :6909-13)，插烯化 (vinylogous)多妝(Hagihara et al. , J Amer Chem Soc 1992,114 :6568),具有葡萄糖骨架(scaffolding)的非妝類妝模擬物(Hirschmann et al. , J Amer Chem Soc 1992,
17114 :9217-8),小化合物文庫的模擬物有機(jī)合成(analogous organic synthese) (Chen et al. , J. Amer Chem Soc 1994，116 :2661)，寡聚氛基甲酸鹽(Cho et al. , Sciencel993, 261 1303),和 / 或妝酸勝酸酯(peptidylphosphonates) (Campbell et al. ,J Org Chem 1994, 59 :658),核酸文庫(見 Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1995 補(bǔ)充; Sambrook et al. , Molecular Cloning A Laboratory Manual,1989,Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USA),肽核酸文庫(見例如美國專利5，539, 083),抗體文庫(見例如 Vaughan et al. ,Nature Biotechnology 1996,14(3) :309-14和PCT/US96/10287),碳水化合物文庫(見例如 Liang et al.，Sciencel996，274 :1520-22 ;美國專利 5，593，853)，和有機(jī)小分子文庫(見例如苯并二氮卓，Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec I ；6 (6) 624-31 ;類異戍二烯(isoprenoids),美國專利 5, 569, 588 ;噻唑燒酮(thiazoIidinones) 和偏硫雜氮雜環(huán)己燒(metathiazanone)，美國專利5, 549, 974 ;卩比咯燒(pyrrolidines)， 美國專利5，525，735和5，519，134 ;嗎啉代化合物，美國專利5，506, 337 ;苯并二氮卓， 5，288，514 ;等)。用于制備組合文庫的設(shè)備是可商購的(見例如357MPS, 390MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA,433AApplied Biosystems, Foster City, CA,9050 Plus, Millipore, Bedford, MA)。此外，有多種組合文庫本身也是商業(yè)可得的(見例如 ComGenex, Princeton, N. J. , Tripos, Inc. , St. Louis,MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD,等等)。(iii)其它候詵物:另一種手段是使用重組細(xì)菌噬菌體來產(chǎn)生文庫。使用“噬菌體方法”(Scott&Smith，Science 1990, 249 :386-90 ；Cwirla et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1990,87 :6378-82 ；Devlin et al. , Science 1990，249 :404-6)，可以構(gòu)建非常大的文庫 (例如106-108個化學(xué)實(shí)體)。再一種手段主要使用化學(xué)方法，其實(shí)例包括Geysen方法 (Geysen et al.,Molecular Immunology 1986,23 :709-15 ；Geysen et al. ,J Immunologic Method 1987,102 :259-74)和 Fodor 等的方法(Science 1991,251:767-73)。Furka 等 (14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume#5, Abstract FR :013 ； Furka, Int J Peptide Protein Resl991, 37 :487-93) ,Houghten (美國專利 4，631，211)和 Rutter等(美國專利5，010，175)記載了產(chǎn)生肽混合物的方法，可以將這些肽作為激動劑或拮抗劑加以測試。適體是由緊密結(jié)合特定分子祀的核酸構(gòu)成的大分子。Tuerk和Gold(Science. 249 505-510(1990))披露了 SELEX(通過指數(shù)式富集進(jìn)行的配體系統(tǒng)性進(jìn)化)方法來選擇適體。 在SELEX方法中，核酸分子的大型文庫{例如IO15種不同分子)可用于篩選。I.基于蛋白質(zhì)的篩詵方法本發(fā)明提供了使用ERCC6L多肽篩選可用于治療和/或預(yù)防癌癥的候選物質(zhì)的方法。在本篩選方法的背景中，要使用的ERCC6L多肽可以是例如純化的多肽、可溶性蛋白質(zhì)、 結(jié)合至載體的形式或融合有其它多肽的融合蛋白。另外，ERCC6L多肽可以是重組多肽、自然界來源的蛋白質(zhì)或其部分肽。除了天然存在的ERCC6L多肽外，該多肽的功能性等同物可包括在用于本篩選的 ERCC6L多肽中，只要經(jīng)過修飾的肽保留初始多肽的至少一種生物學(xué)活性即可。ERCC6L多肽的生物學(xué)活性的例子包括但不限于細(xì)胞增殖活性、螺旋酶活性、ATP酶活性和Plkl結(jié)合活性。此類功能性等同物的優(yōu)選例描述于上文題為“ERCC6L基因和ERCC6L蛋白”的節(jié)。例如，此類功能性等同物的優(yōu)選例包括含有ERCC6L多肽螺旋酶域的多肽(例如SEQ ID NO 10 的 61 至 631)。所述多肽可進(jìn)一步連接其他物質(zhì)，只要連接工藝和連接的物質(zhì)不干擾初始多肽和 /或片段的生物學(xué)活性即可?？衫玫奈镔|(zhì)包括例如肽、脂質(zhì)、糖和糖鏈、乙?；?、天然和合成聚合物等?？蛇M(jìn)行這些類型的修飾以賦予該多肽及片段別的功能或使其穩(wěn)定。用于本發(fā)明方法的多肽可作為天然存在蛋白質(zhì)通過常規(guī)純化方法獲得自自然界，或基于所選擇的氨基酸序列通過化學(xué)合成獲得。例如，可用于合成的常規(guī)肽合成法包括I)Peptide Synthesis, Interscience, New York,1966 ；2)The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York,1976 ；3)Peptide Synthesis (日語)，Maruzen Co. , 1975 ；4) Basics and Experiment of Peptide Synthesis (日語)，Maruzen Co. , 1985 ；5) Development of Pharmaceuticals (第二 卷)(日語)，Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa,1991 ；6)W099/67288 ;和7) Barany G. &Merrif ield R. B. , Peptides Vol.2, “Solid Phase Peptide Synthesis”，Academic Press, New York,1980，100-118?；蛘撸赏ㄟ^采用用于產(chǎn)生多肽的任何已知基因工程方法來獲得該多肽(例如 Morrison J. , J Bacteriology 1977,132 :349-51 ；CIark-Curtiss&Curtiss, Methods in Enzymology (Wu等人編輯)1983,101 :347-62)。例如，首先制備以可表達(dá)形式(例如位于包含啟動子的調(diào)節(jié)序列的下游)包含編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的多核苷酸的適合的載體，然后轉(zhuǎn)化入合適的宿主細(xì)胞，接著培養(yǎng)宿主細(xì)胞以產(chǎn)生蛋白質(zhì)。更具體的說，通過將編碼ERCC6L多肽的基因插入用于表達(dá)外來基因的載體諸如pSV2neo、pcDNAI、pcDNA3. I、pCAGGS或pCD8， 在宿主(例如動物)細(xì)胞等中表達(dá)該基因。啟動子可用于表達(dá)?？墒褂萌魏纬Ｓ玫膯幼?，包括例如 SV40 早期啟動子(Rigby in Williamson(編)，Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 1982,83-141)、EF_ α 啟動子(Kim et al. ,Gene 1990,91 217-23)、CAG啟動子(Niwa et al. ,Gene 1991，108 :193)、RSV LTR啟動子(Cullen，Methods in Enzymology 1987，152 :684-704)、SR α 啟動子(Takebe et al. ,Mol Cell Biol 1988， 8 :466)、CMV 立即早期啟動子(Seed et al. ,Proc Natl Acad Sci USA 1987,84:3365-9)、 SV40 晚期啟動子(Gheysen et al.，J Mol Appl Genet 1982，I :385-94)、腺病毒晚期啟動子(Kaufman et al. ,Mol Cell Biol 1989，9 :946)、HSV TK 啟動子等?？筛鶕?jù)任何常規(guī)方法將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞以表達(dá)ERCC6L多肽，例如電穿孔法(Chu et al.，Nucleic Acids Resl987，15 :1311-26)、磷酸鈣法(Chen et al. , Mol Cell Biol 1987，7 :2745-52)、DEAE 右旋糖苷法(Lopata et al. ,Nucleic Acids Res 1984,12 :5707-17 ；Sussman et al. ,Mol Cell Biol 1985，4 :1641-3)、脂轉(zhuǎn)染法(Deri jard B，Cell 1994，7 :1025-37 ;Lamb et al.， Nature Genetics 1993,5 :22-30 ；Rabindran et al. , Sciencel993,259 :230-4)等。還可使用體外翻譯系統(tǒng)在體外產(chǎn)生ERCC6L多肽。(i)ERCC6L結(jié)合物質(zhì)的篩詵:
在本發(fā)明的背景中，在肺癌中檢測出ERCC6L基因的過表達(dá)，盡管在正常器官中沒有表達(dá)(圖I)。因而，本發(fā)明提供了使用ERCC6L基因和由其編碼的蛋白來篩選結(jié)合ERCC6L 多肽的物質(zhì)的方法。由于癌癥中ERCC6L的表達(dá)，與ERCC6L多肽結(jié)合的物質(zhì)期待可阻抑癌細(xì)胞的增殖，并因此對治療和/或預(yù)防癌癥是有用的。因此，本發(fā)明亦提供了使用ERCC6L多肽篩選阻抑癌細(xì)胞增殖的候選物質(zhì)的方法，以及篩選治療或預(yù)防癌癥的候選物質(zhì)的方法。特別地，此篩選方法的一個實(shí)施方案包括以下步驟(a)將測試物質(zhì)與ERCC6L多肽接觸；(b)檢測所述多肽與所述測試物質(zhì)之間的結(jié)合活性；和(c)選擇結(jié)合所述多肽的測試物質(zhì)?；蛘撸勒毡景l(fā)明，也可評估或估計(jì)測試物質(zhì)對治療和/或預(yù)防癌癥的潛在治療效果。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于評估或估計(jì)測試物質(zhì)對治療和/或預(yù)防癌癥和 /或抑制與ERCC6L過表達(dá)相關(guān)的癌癥的治療效果的方法，該方法包括下述步驟(a)使測試物質(zhì)與由ERCC6L多核苷酸編碼的多肽接觸；(b)檢測所述多肽和所述測試物質(zhì)之間的結(jié)合活性；并(C)將潛在治療效果與測試物質(zhì)關(guān)聯(lián)起來，其中當(dāng)物質(zhì)結(jié)合所述多肽時(shí)顯示潛在治療效果。在本發(fā)明的背景中，治療效果可以與測試物質(zhì)和ERCC6L蛋白的結(jié)合活性關(guān)聯(lián)起來。例如，當(dāng)某種測試物質(zhì)結(jié)合ERCC6L蛋白時(shí)，可將所述測試物質(zhì)鑒定或選擇為具有要求的治療效果的候選物質(zhì)?；蛘撸?dāng)某種測試物質(zhì)不結(jié)合ERCC6L蛋白時(shí)，可將所述測試藥劑鑒定為沒有顯著治療效果。本發(fā)明的方法將在下面更加詳細(xì)的加以描述。需用于篩選的ERCC6L多肽可為重組多肽，或者是來自自然界的蛋白質(zhì)，或其部分肽。與測試物質(zhì)接觸的多肽可以是，例如，純化的多肽、可溶蛋白質(zhì)、與載體結(jié)合的形式、或者與其它多肽融合的融合蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明使用的測試物質(zhì)可以是蛋白質(zhì)，諸如抗體或合成化學(xué)化合物。作為篩選與ERCC6L多肽結(jié)合的物質(zhì)的方法，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種方法。上述篩選可通過，例如，免疫沉淀方法進(jìn)行。在使用免疫沉淀方法時(shí)，優(yōu)選ERCC6L多肽包含抗體識別位點(diǎn)。要用于本篩選方法的ERCC6L多肽可如上所述來制備?；蛘?，對于由ERCC6L基因編碼的多肽，可以把特異性已知的單克隆抗體的識別位點(diǎn)(表位)導(dǎo)入該多肽的N或C端，從而將該多肽表達(dá)為包含該表位的融合蛋白。可以使用商品化的表位-抗體系統(tǒng)(Experimental Medicine 13:85-90(1995))。能夠利用其多克隆位點(diǎn)表達(dá)與例如β-半乳糖苷酶、麥芽糖結(jié)合蛋白、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶和綠色熒光蛋白 (GFP)形成的融合蛋白的載體是可商購的。另外，還報(bào)道了如下的融合蛋白，其通過導(dǎo)入僅由數(shù)個到十二個(adozen)氨基酸構(gòu)成的小型表位加以制備,使融合不會改變ERCC6L多肽的性質(zhì)?？梢允褂美缍嘟M氨酸(His-標(biāo)簽)、流感凝集素HA、人c-myc、FLAG、水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7-標(biāo)簽)、人單純皰疹病毒糖蛋白(HSV-標(biāo)簽)、 E-標(biāo)簽(單克隆噬菌體上的表位)等表位，和識別它們的單克隆抗體作為篩選與ERCC6L多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的表位-抗體系統(tǒng)(!Experimental Medicine 13 :85-90 (1995))
在免疫沉淀中，將這些抗體添加到用合適去垢劑制備的細(xì)胞裂解物中而形成免疫復(fù)合體。免疫復(fù)合體由ERCC6L多肽、包含與該多肽結(jié)合的能力的多肽、和抗體組成。除了使用針對上述表位的抗體之外，還可以使用針對ERCC6L多肽的抗體進(jìn)行免疫沉淀，這樣的抗體可以如上文所述制備。免疫復(fù)合體可以被沉淀，例如當(dāng)抗體是小鼠IgG抗體時(shí)，可以通過蛋白A sepharose或蛋白G sepharose將其沉淀。如果將由ERCC6L基因編碼的多肽制備成與表位(例如GST)的融合蛋白，則可以使用特異結(jié)合這些表位的物質(zhì)，例如谷胱甘肽-sepharose 4B,按照與使用針對ERCC6L多肽的抗體的相同的方式來形成免疫復(fù)合體。可遵循或根據(jù)，例如，文獻(xiàn)中的方法來實(shí)施免疫沉淀(Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York(1988))。普遍使用SDS-PAGE分析經(jīng)免疫沉淀的蛋白，使用合適濃度的凝膠,可以利用結(jié)合蛋白的分子量來分析該蛋白。由于與ERCC6L多肽結(jié)合的蛋白難以通過考馬斯蘭染色或銀染色等普通染色方法檢測到，可以通過如下的方法提高蛋白的檢測靈敏度在含有放射性同位素35S-甲硫氨酸或35S-半胱氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，標(biāo)記細(xì)胞中的蛋白，并檢測該蛋白。當(dāng)?shù)鞍椎姆肿恿恳阎獣r(shí)，可以直接從SDS-聚丙烯酰胺凝膠上純化出靶蛋白并測定其序列。作為利用ERCC6L多肽來篩選結(jié)合該多肽的蛋白的方法，可以使用例如 West-Western 印跡分析法(Skolnik et al. , Cell 65:83-90(1991))。特別地，與 ERCC6L 多肽結(jié)合的蛋白可以通過如下方法獲得，從預(yù)期表達(dá)結(jié)合ERCC6L多肽的蛋白質(zhì)的培養(yǎng)細(xì)胞利用噬菌體載體(例如ZAP)制備cDNA文庫，在LB瓊脂糖上表達(dá)蛋白，將表達(dá)出的蛋白固定在濾膜上，使純化并且標(biāo)記的ERCC6L多肽與上述濾膜反應(yīng)，并依照標(biāo)記物來檢測表達(dá)與ERCC6L多肽結(jié)合的蛋白的噬菌斑。本發(fā)明的多肽可以利用生物素與抗生物素蛋白間的結(jié)合，或者利用特異結(jié)合ERCC6L多肽或與ERCC6L多肽融合的肽或多肽(例如GST)的抗體， 來進(jìn)行標(biāo)記。也可以使用利用放射性同位素或熒光等的方法?；蛘?，在本發(fā)明篩選方法的另一個實(shí)施方案中，可以使用利用細(xì)胞的雙雜交系統(tǒng)(“MATCHMAKER Two-Hybrid system”，“Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit”，“MATCHMAKER one-Hybrid system” (Clontech) ;“HybriZAP Two-Hybrid Vector System”(Stratagene);參考文獻(xiàn)見“Dalton and Treisman, Cell 68:597-612(1992)”, “Fields and Sternglanz, Trends Genet 10:286-92(1994)，，)。在雙雜交系統(tǒng)中，使本發(fā)明的多肽與SRF結(jié)合區(qū)或GAL4結(jié)合區(qū)融合，并在酵母細(xì)胞中表達(dá)。從預(yù)期表達(dá)與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白的細(xì)胞制備cDNA文庫，使該文庫在被表達(dá)時(shí)與VP16或GAL4轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合。然后，將cDNA文庫導(dǎo)入到上述酵母細(xì)胞中，并從檢測到的陽性克隆(當(dāng)酵母細(xì)胞中表達(dá)出可與本發(fā)明多肽結(jié)合的蛋白時(shí)，兩者的結(jié)合激活報(bào)告基因，使陽性克隆可檢測)分離源自該文庫的cDNA。通過將上面分離的cDNA導(dǎo)入到大腸桿菌中并表達(dá)該蛋白，可制備由該cDNA編碼的蛋白。作為報(bào)告基因，除了 HIS3基因之外，還可以使用例如Me2基因、IacZ基因、CAT基因、螢光素酶基因等。也可以用親和色譜來篩選與ERCC6L多肽結(jié)合的物質(zhì)。例如，可以把ERCC6L多肽固定在親和柱的載體上，而將含有測試物質(zhì)的組合物施加到該柱上。這里的組合物可以是例如細(xì)胞提取物、細(xì)胞裂解物、抗體文庫等。在加載測試物質(zhì)之后，沖洗柱子，從而可以收集得到結(jié)合于ERCC6L多肽的物質(zhì)。當(dāng)測試物質(zhì)是蛋白質(zhì)時(shí)，對所得蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行分析，根據(jù)該序列合成寡DNA，并用該寡DNA作為探針篩選cDNA文庫，從而獲得編碼該蛋白的 DNA。利用表面等離子體共振現(xiàn)象的生物傳感器可以在本發(fā)明中用作檢測或定量結(jié)合物質(zhì)的裝置。當(dāng)使用這種生物傳感器時(shí)，可以僅使用微量并且沒有標(biāo)記的多肽(例如 BIAcore, Pharmacia),以表面等離子體共振信號的形式對ERCC6L多肽與測試物質(zhì)間的相互作用進(jìn)行實(shí)時(shí)的觀察。因此，使用生物傳感器，例如BIAcore，就有可能對ERCC6L多肽與測試物質(zhì)間的結(jié)合進(jìn)行評估。用于篩選當(dāng)固定的ERCC6L多肽暴露于合成化學(xué)物質(zhì)或天然物質(zhì)文庫或隨機(jī)噬菌體肽展示文庫時(shí)發(fā)生結(jié)合的分子的方法，以及使用基于組合化學(xué)技術(shù)的高通量篩選方法(ffrighton et al.，Science 273 :458-64(1996) ；Verdine, Nature 384:11-13(1996)； Hogan, Nature 384 :17-9(1996)),以不僅分離與ERCC6L蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)，而且分離與 ERCC6L蛋白結(jié)合的物質(zhì)(包括激動劑和拮抗劑)的方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。(ii)陽抑ERCC6L牛物學(xué)活件的物質(zhì)的篩詵:在本發(fā)明的背景中，ERCC6L蛋白特征在于具有促進(jìn)癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖的活性(圖 3)。本發(fā)明提供了利用此生物學(xué)活性作為指標(biāo)，篩選可阻抑表達(dá)ERCC6L的癌細(xì)胞增殖的物質(zhì)的方法，以及篩選用于治療和/或預(yù)防癌癥，特別是ERCC6-L相關(guān)癌癥，諸如肺癌的物質(zhì)的方法。因此，本發(fā)明提供了使用由ERCC6L基因編碼的多肽來篩選治療和/或預(yù)防癌癥的候選物質(zhì)的方法，其包括下列步驟(a)將測試物質(zhì)與由ERCC6L多核苷酸編碼的多肽(ERCC6L多肽)或其片段接觸；(b)檢測步驟(a)所述多肽或片段的生物學(xué)活性；并(c)選擇與測試物質(zhì)不存在時(shí)該多肽的生物學(xué)活性相比，阻抑由ERCC6L多核苷酸編碼的多肽(ERCC6L多肽)或片段的生物學(xué)活性的測試物質(zhì)。依照本發(fā)明，可評估測試物質(zhì)阻抑ERCC6L的生物學(xué)活性(例如細(xì)胞增殖活性)或候選物質(zhì)治療和/或預(yù)防癌癥的治療效果。因此，本發(fā)明亦提供了使用ERCC6L多肽或其片段來篩選阻抑ERCC6L的生物學(xué)活性的候選物質(zhì)或用于治療和/或預(yù)防癌癥的候選物質(zhì)的方法，其包括以下步驟a)將測試物質(zhì)與ERCC6L多肽或其功能性片段接觸；并b)檢測步驟a)的所述多肽或片段的生物學(xué)活性；并c)將b)的生物學(xué)活性與所述測試物質(zhì)的治療效果關(guān)聯(lián)起來。或者，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于評估或估計(jì)測試物質(zhì)治療和/或預(yù)防癌癥和/或抑制與ERCC6L過表達(dá)有關(guān)的癌癥生長的治療效果的方法，該方法包括以下步驟(a)將測試物質(zhì)與ERCC6L多肽或其功能性片段接觸；(b)檢測步驟(a)所述多肽或片段的生物學(xué)活性；并(c)將潛在治療效果與測試物質(zhì)關(guān)聯(lián)起來，其中當(dāng)較之測試物質(zhì)不存在下檢測到的由ERCC6L基因的多核苷酸編碼的多肽的生物學(xué)活性，該物質(zhì)阻抑所述多肽的生物學(xué)活性時(shí)顯示潛在治療效果。此類癌癥包括肺癌。在本發(fā)明的背景中，治療效果可以與ERCC6L多肽或其功能性片段的生物學(xué)活性
22關(guān)聯(lián)起來。例如，當(dāng)與某種測試物質(zhì)不存在下檢測到的水平相比該測試物質(zhì)阻抑或抑制 ERCC6L多肽或其功能性片段的生物學(xué)活性時(shí)，可將所述測試物質(zhì)鑒定或選擇為具有治療效果的候選物質(zhì)?；蛘?，當(dāng)與某種測試物質(zhì)不存在時(shí)檢測到的水平相比該測試藥劑或化合物不阻抑或抑制ERCC6L多肽或其功能性片段的生物學(xué)活性時(shí)，可將所述測試物質(zhì)鑒定為沒有顯著治療效果的物質(zhì)。本發(fā)明所述方法將在下面更加詳細(xì)的加以描述。任何ERCC6L多肽均可用于篩選，只要它們阻抑ERCC6L蛋白的生物學(xué)活性即可。 這樣的生物學(xué)活性包括ERCC6L蛋白的細(xì)胞增殖活性(在本文中也稱作“細(xì)胞增殖增強(qiáng)活性”或“細(xì)胞增殖促進(jìn)活性”)、螺旋酶活性、ATP酶活性和Plkl結(jié)合活性。舉例而言，可使用ERCC6L蛋白，亦可使用與這些蛋白功能上等價(jià)的多肽。上述多肽可由細(xì)胞內(nèi)源或外源地表達(dá)。在另一個方面，本發(fā)明還提供遵循上文“篩選”一節(jié)中描述的方法進(jìn)行的篩選方法，此類方法包括下述步驟a)使測試物質(zhì)與ERCC6L多肽或其片段接觸；b)檢測所述多肽或片段和所述測試物質(zhì)之間的結(jié)合；c)選擇與所述多肽結(jié)合的測試物質(zhì)；d)使步驟c)中選擇的測試物質(zhì)與ERCC6L多肽或其片段接觸；e)將所述多肽或片段的生物學(xué)活性與在所述物質(zhì)不存在下檢測到的生物學(xué)活性比較；并f)選擇阻抑所述多肽的生物學(xué)活性的物質(zhì)作為用于治療或預(yù)防肺癌的候選物質(zhì)。通過本篩選分離的物質(zhì)是ERCC6L基因編碼的多肽的拮抗劑的候選者。術(shù)語“拮抗劑”是指通過結(jié)合多肽而抑制多肽功能的分子。該術(shù)語還指可降低或抑制編碼ERCC6L的基因的表達(dá)的分子。而且，通過本篩選分離的物質(zhì)是如下物質(zhì)的候選物，所述物質(zhì)抑制ERCC6L 多肽與分子(包括DNA和蛋白)的體內(nèi)相互作用。當(dāng)本方法中要檢測的生物學(xué)活性是細(xì)胞增殖時(shí)，可以通過例如如下方法進(jìn)行檢測制備表達(dá)ERCC6L多肽的細(xì)胞，在測試物質(zhì)的存在下培養(yǎng)細(xì)胞，確定細(xì)胞增殖速度，測量細(xì)胞周期等，以及通過測量存活細(xì)胞或集落形成能力，例如圖3所示。選擇降低表達(dá)ERCC6L 的細(xì)胞的增殖速度的物質(zhì)作為治療或預(yù)防癌癥的候選物質(zhì)。更具體而言，該方法包括以下步驟(a)使測試物質(zhì)與過表達(dá)ERCC6L的細(xì)胞接觸；(b)測量細(xì)胞增殖活性；并(C)選擇與測試物質(zhì)不存在下的細(xì)胞增殖活性相比降低細(xì)胞增殖活性的測試物質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可進(jìn)一步包括以下步驟(d)選擇對很少或不表達(dá)ERCC6L的細(xì)胞沒有影響的測試物質(zhì)。短語“阻抑生物學(xué)活性”在此定義為較之不存在所述物質(zhì)時(shí)，對ERCC6L生物學(xué)活性的優(yōu)選至少10%的阻抑，更優(yōu)選至少25%、50%或75%的阻抑，且最優(yōu)選至少90%的阻抑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用不表達(dá)ERCC6L多肽的對照細(xì)胞。因而，本發(fā)明還提供了使用ERCC6L多肽或其片段來篩選抑制細(xì)胞生長的候選物質(zhì)或用于治療和/或預(yù)防ERCC6L相關(guān)疾病的候選物質(zhì)的方法，包括下列步驟a)在測試物質(zhì)存在下培養(yǎng)表達(dá)ERCC6L多肽或其功能性片段的細(xì)胞和不表達(dá) ERCC6L多肽或其功能性片段的對照細(xì)胞；b)檢測表達(dá)所述蛋白的細(xì)胞和對照細(xì)胞的生物學(xué)活性；并c)選擇與對照細(xì)胞中及所述測試物質(zhì)不存在下檢出的增殖相比抑制表達(dá)所述蛋白的細(xì)胞中的生物學(xué)活性的測試物質(zhì)。如本文中揭示的，阻抑ERCC6L的生物學(xué)活性則降低細(xì)胞生長。如此，通過篩選抑制ERCC6L生物學(xué)活性的候選物質(zhì)，可鑒定出可用于治療和/或預(yù)防癌癥的候選物質(zhì)。可通過二次和/或更進(jìn)一步篩選來評估這些候選物質(zhì)治療或預(yù)防癌癥的潛力以鑒定用于癌癥的治療性物質(zhì)、化合物或作用劑。例如，當(dāng)抑制ERCC6L蛋白生物學(xué)活性的物質(zhì)也抑制癌癥的活性時(shí)，可得出此類物質(zhì)具有ERCC6L特異性治療效果的結(jié)論。II.改奪ERCC6L表汰的物質(zhì)的篩詵在本發(fā)明的背景中，通過siRNA降低ERCC6L表達(dá)導(dǎo)致對癌細(xì)胞增殖的抑制(圖 2ABC)。因而，本發(fā)明提供了篩選抑制ERCC6L表達(dá)的物質(zhì)的方法。抑制ERCC6L表達(dá)的物質(zhì)可望能夠阻抑癌細(xì)胞增殖，并因此對治療或預(yù)防癌癥，特別是ERCC6L相關(guān)癌癥，諸如肺癌有用。因此，本發(fā)明亦提供了篩選阻抑癌細(xì)胞增殖的物質(zhì)的方法，以及篩選治療或預(yù)防癌癥的候選物質(zhì)的方法。在本發(fā)明的背景中，上述篩選可包括，例如，下列步驟(a)將測試物質(zhì)與表達(dá)ERCC6L的細(xì)胞接觸；(b)選擇與對照相比降低ERCC6L表達(dá)水平的測試物質(zhì)。在本發(fā)明的背景中，此類篩選方法可包括例如下述步驟a)將測試物質(zhì)與表達(dá)ERCC6L基因的細(xì)胞接觸；b)檢測ERCC6L基因的表達(dá)水平；并c)將b)的表達(dá)水平與所述測試物質(zhì)的治療效果關(guān)聯(lián)起來。在本發(fā)明的背景中，治療效果可以與ERCC6L基因表達(dá)水平關(guān)聯(lián)起來。例如，當(dāng)與某種測試物質(zhì)不存在下檢測到的水平相比該測試物質(zhì)降低ERCC6L基因的表達(dá)水平時(shí)，可將所述測試物質(zhì)鑒定或選擇為具有治療效果的候選物質(zhì)?；蛘?，當(dāng)與某種測試物質(zhì)不存在下檢測到的水平相比該測試物質(zhì)不降低ERCC6L基因表達(dá)水平時(shí)，可將所述測試物質(zhì)鑒定為沒有顯著治療效果的物質(zhì)。下面將更加詳細(xì)地描述本發(fā)明的方法。表達(dá)ERCC6L的細(xì)胞包括，例如，自肺癌建立的細(xì)胞系或經(jīng)ERCC6L表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系；任何這樣的細(xì)胞可用于上述本發(fā)明的篩選?？捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法， 例如，RT-PCR> Northern印跡分析、Western印跡分析、免疫染色與流式細(xì)胞分析來估計(jì)表達(dá)水平。在此定義的短語“降低表達(dá)水平”優(yōu)選為較之在所述物質(zhì)不存在時(shí)的表達(dá)水平，至少使ERCC6L表達(dá)水平降低至少10%，更優(yōu)選降低至少25%、50%或75%，最優(yōu)選降低至少 95%的水平。本文中的物質(zhì)包括化學(xué)化合物、雙鏈核苷酸等等。下面會描述雙鏈核苷酸的制備。在篩選方法中，可選擇降低ERCC6L表達(dá)水平的物質(zhì)作為候選物質(zhì)用來治療或預(yù)防癌癥?；蛘?，本發(fā)明的所述篩選方法可包括下列步驟(a)將測試物質(zhì)與導(dǎo)入了包含ERCC6L轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域與在該轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域控制下表達(dá)的報(bào)道基因的載體的細(xì)胞接觸；
(b)測量所述報(bào)道基因的表達(dá)或活性；并(C)選擇降低所述報(bào)道基因的表達(dá)或活性的測試物質(zhì)。合適的報(bào)道基因和宿主細(xì)胞在本領(lǐng)域是眾所周知的。例示性報(bào)道基因包括但不限于螢光素酶、綠色突光蛋白(GFP)、香燕珊瑚(Discosoma sp.)紅色突光蛋白(DsRed)、 氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)、Laz與beta-葡萄糖醛酸糖苷酶(⑶S)，而宿主細(xì)胞為C0S7、 HEK293、HeLa等。所述篩選所需的報(bào)道構(gòu)建體可通過將報(bào)道基因序列與ERCC6L基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域連接來制備。本文所述的ERCC6L基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域是從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)至至少500bp 上游的區(qū)域，優(yōu)選lOOObp，更優(yōu)選5000或IOOOObp上游。含有所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的核苷酸片段可從基因組文庫中分離出來，或可通過PCR擴(kuò)增。所述篩選所需的報(bào)道構(gòu)建體可通過將報(bào)道基因序列與所述基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域連接來制備。鑒別轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的方法，以及其測定法規(guī)程都是眾所周知的(Molecular Cloning,第三版,第17章,2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press)。將含有所述報(bào)道構(gòu)建體的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主細(xì)胞，且用本領(lǐng)域眾所周知的方法檢測報(bào)道基因的表達(dá)或活性(例如，使用照度計(jì)(luminometer)、吸收光譜儀、流式細(xì)胞儀等等)。在此定義的“降低表達(dá)或活性”優(yōu)選較之在所述測試物質(zhì)不存在時(shí)，報(bào)道基因的表達(dá)或活性優(yōu)選地被降低至少10 %，更優(yōu)選地，降低25 %、50 %或75 %，最優(yōu)選地，降低至少95 %?；蛘?，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供一種用于評估或估計(jì)測試物質(zhì)治療或預(yù)防癌癥或抑制與ERCC6L過表達(dá)有關(guān)的癌癥的治療效果的方法，該方法包括以下步驟(a)使測試物質(zhì)與其中導(dǎo)入了載體的細(xì)胞接觸，該載體包含ERCC6L的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和在該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制下表達(dá)的報(bào)道基因；(b)測量所述報(bào)道基因的表達(dá)水平或活性；并(C)將潛在治療效果與測試物質(zhì)關(guān)聯(lián)起來，其中當(dāng)測試物質(zhì)降低所述報(bào)道基因的表達(dá)水平或活性時(shí)顯示潛在治療效果。依照本發(fā)明，可評估測試物質(zhì)抑制細(xì)胞生長或候選物質(zhì)治療或預(yù)防ERCC6L相關(guān)疾病的治療效果。因此，本發(fā)明還提供用于篩選阻抑癌細(xì)胞增殖的候選物質(zhì)的方法，及篩選用于治療或預(yù)防ERCC6L相關(guān)疾病的候選物質(zhì)的方法。依照另一個方面，本發(fā)明提供了一種方法，其包括以下步驟(a)使測試物質(zhì)與其中導(dǎo)入了載體的細(xì)胞接觸，該載體包含ERCC6L基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和在該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制下表達(dá)的報(bào)道基因；(b)檢測所述報(bào)道基因的表達(dá)水平或活性；并(C)將(b)的表達(dá)水平與測試物質(zhì)的治療效果關(guān)聯(lián)起來。在本發(fā)明中，治療效果可以與所述報(bào)道基因的表達(dá)水平或活性關(guān)聯(lián)起來。例如，當(dāng)與某種測試物質(zhì)不存在下檢測到的水平相比該測試物質(zhì)降低所述報(bào)道基因的表達(dá)水平或活性時(shí)，可將所述測試物質(zhì)鑒定或選擇為具有治療效果的候選物質(zhì)?；蛘撸?dāng)與某種測試物質(zhì)不存在下檢測到的水平相比該測試物質(zhì)不降低所述報(bào)道基因的表達(dá)水平或活性時(shí)，可將所述測試物質(zhì)鑒定為沒有顯著治療效果的物質(zhì)。通過篩選⑴結(jié)合ERCC6L多肽；(ii)阻抑/降低ERCC6L多肽的生物學(xué)活性(例如細(xì)胞增殖活性)；或(iii)降低ERCC6L基因的表達(dá)水平的候選物質(zhì)，可鑒定出有可能治療或預(yù)防癌癥(例如肺癌)的候選物質(zhì)?？赏ㄟ^二次和/或更進(jìn)一步篩選這些候選物質(zhì)來評估治療效果以鑒定用于癌癥的治療性物質(zhì)。例如，當(dāng)與ERCC6L多肽結(jié)合的物質(zhì)抑制癌癥的上述活性時(shí)，可得出此類物質(zhì)具有ERCC6L特異性治療效果的結(jié)論。雙鏈分子:如本文中使用的，術(shù)語“分離的雙鏈分子”指抑制靶基因表達(dá)的核酸分子，而且包括例如短干擾RNA (siRNA ;例如雙鏈核糖核酸(dsRNA)或小發(fā)夾RNA (shRNA))和短干擾 DNA/RNA (siD/R-NA ;例如DNA和RNA的雙鏈嵌合物(dsD/R-NA)或DNA和RNA的小發(fā)夾嵌合物(shD/R-NA))。如本文中使用的靶序列”是基因的mRNA或cDNA序列內(nèi)的下述核苷酸序列，如果將本發(fā)明的雙鏈核酸分子導(dǎo)入表達(dá)該基因的細(xì)胞內(nèi)的話，會導(dǎo)致整個mRNA的翻譯受到阻抑。對于基因的mRNA或cDNA序列內(nèi)的某個核苷酸序列，若包含與靶序列對應(yīng)的序列的雙鏈多核苷酸抑制表達(dá)該基因的細(xì)胞中該基因的表達(dá)，則可確定為靶序列。阻抑基因表達(dá)的雙鏈多核苷酸可以由靶序列和長度為2至5個核苷酸的3’突出端(例如im)的組成。當(dāng)靶序列通過cDNA序列來顯示時(shí)，使用雙鏈cDNA的有義鏈序列(即將mRNA序列轉(zhuǎn)換成DNA序列而得到的序列)來限定靶序列。雙鏈分子包含有義鏈(其具有與靶序列對應(yīng)的序列)和反義鏈(具有與靶序列互補(bǔ)的序列)，而且該反義鏈與該有義鏈在互補(bǔ)序列處雜交以形成雙鏈分子。在本文中，短語“與…對應(yīng)”表示依照構(gòu)成雙鏈分子有義鏈的核酸的種類來轉(zhuǎn)換靶序列。例如，當(dāng)靶序列以DNA序列顯示且雙鏈分子的有義鏈具有RNA區(qū)時(shí)，將該RNA區(qū)內(nèi)的堿基“t”替換為堿基“U”。另一方面，當(dāng)靶序列以RNA序列顯示且雙鏈分子的有義鏈具有 DNA區(qū)時(shí)，將該DNA區(qū)內(nèi)的堿基“u”替換為“t”。在本發(fā)明的背景中，靶序列主要以DNA顯示。換言之，本發(fā)明還提供如下的雙鏈分子，其靶序列包括或限于以DNA顯示的SEQ ID NO 7或SEQ ID NO :8，但可以替換為RNA。還有，對于雙鏈分子的反義鏈，與靶序列互補(bǔ)的序列可依照構(gòu)成反義鏈的核酸的種類來限定。除與靶序列對應(yīng)的序列及其互補(bǔ)序列之外，雙鏈分子還可具有一個或兩個長度為 2至5個核苷酸的3’突出端(例如im)和/或連接有義鏈和反義鏈的環(huán)序列以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。本文中使用的術(shù)語“siRNA “指阻止靶mRNA翻譯的雙鏈RNA分子。使用將siRNA 導(dǎo)入細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，包括其中以DNA為模板轉(zhuǎn)錄RNA的那些。所述siRNA包括ERCC6L有義核酸序列(亦用“有義鏈”指代)、ERCC6L反義核酸序列(亦用“反義鏈”指代)或兩者。 所述siRNA可如此構(gòu)建使得單個轉(zhuǎn)錄物具有靶基因的有義核酸序列與其互補(bǔ)的反義核酸序列，例如，發(fā)夾結(jié)構(gòu)。所述siRNA可為dsRNA或shRNA。本文中使用的術(shù)語“dsRNA”指包含相互互補(bǔ)序列的兩個RNA分子的構(gòu)建體，所述兩個RNA分子通過所述互補(bǔ)序列退火以形成雙鏈RNA分子。所述兩條鏈的核苷酸序列可不僅包含選自靶基因序列中蛋白質(zhì)編碼序列的“有義”或“反義” RNA，亦可包括具有選自所述靶基因非編碼區(qū)域的核苷酸序列的RNA分子。在本說明書中使用的術(shù)語“shRNA”是指具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的siRNA，其包含彼此互補(bǔ)的第一區(qū)和第二區(qū)(即有義鏈和反義鏈)。兩個區(qū)的互補(bǔ)程度和方向足以使兩個區(qū)之間發(fā)生堿基配對，所述第一區(qū)和第二區(qū)通過環(huán)區(qū)連接在一起，而所述環(huán)是因?yàn)榄h(huán)區(qū)內(nèi)的核苷酸(或核苷酸類似物)之間缺乏堿基配對而形成的。shRNA的環(huán)區(qū)是介于有義鏈和反義鏈之間的單鏈區(qū)，也可以稱作“間插單鏈.ntervening single-strand) ”在本說明書中使用的術(shù)語“siD/R-NA”是指包含RNA和DNA 二者的雙鏈多核苷酸分子，包括RNA和DNA的雜合體和嵌合體，其阻止靶mRNA的翻譯。在本說明書中，雜合體表示這樣的分子，其中由DNA組成的多核苷酸和由RNA組成的多核苷酸相互雜交形成雙鏈分子；而嵌合體表示組成所述雙鏈分子的鏈中的一條或兩條可以同時(shí)含有RNA和DNA。使用將siD/R-NA導(dǎo)入細(xì)胞的常規(guī)技術(shù)。所述siD/R-NA包括ERCC6L有義核酸序列(亦用“有義鏈”指代)、ERCC6L反義核酸序列(亦用“反義鏈”指代)或兩者。siD/R-NA可以這樣構(gòu)建， 使單個轉(zhuǎn)錄物同時(shí)具有來自靶基因的有義核酸序列和互補(bǔ)反義核酸序列，例如發(fā)夾。siD/ R-NA 可以是 dsD/R-NA 或 shD/R-NA。在本文中使用的術(shù)語“dsD/R-NA”是指這樣兩個分子的構(gòu)建體，所述兩個分子包含彼此互補(bǔ)的序列并且已經(jīng)藉由所述互補(bǔ)序列退火在一起而形成雙鏈多核苷酸分子。兩條鏈的核苷酸序列可以不僅僅包含選自靶基因序列的蛋白編碼序列的“有義”或“反義”多核苷酸序列，還可以包含具有選自靶基因非編碼區(qū)的核苷酸序列的多核苷酸。組成dsD/R-NA的兩個分子中的一個或兩個由RNA和DNA 二者組成(嵌合體分子)，或者一個分子由RNA組成而另一個由DNA組成(雜合雙鏈)。在本文中使用的術(shù)語“shD/R-NA”是指具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的siD/R-NA，其包含彼此互補(bǔ)的第一區(qū)和第二區(qū)，即有義鏈和反義鏈。所述區(qū)的互補(bǔ)程度和方向足以使它們之間發(fā)生堿基配對，第一區(qū)和第二區(qū)通過環(huán)區(qū)連接，所述環(huán)是因?yàn)樵诃h(huán)區(qū)內(nèi)的核苷酸(或核苷酸類似物)之間缺乏堿基配對而形成的。shD/R-NA的環(huán)區(qū)是介于有義鏈和反義鏈之間的單鏈區(qū)，也可以稱作“間插單鏈”。本說明書中使用的“分離的核酸”是指從本來的環(huán)境(例如自然出現(xiàn)時(shí)的自然環(huán)境)中被取出，與其自然狀態(tài)相比發(fā)生了合成性的改變的核酸。在本發(fā)明的背景中，分離的核酸包括DNA、RNA和它們的衍生物。與靶mRNA雜交的針對ERCC6L的雙鏈分子通過與正常單鏈mRNA基因轉(zhuǎn)錄物結(jié)合， 干擾其翻譯，抑制蛋白質(zhì)表達(dá)，來降低或抑制由ERCC6L基因編碼的ERCC6L蛋白的產(chǎn)生。如本文中證明的，數(shù)種癌細(xì)胞系中ERCC6L的表達(dá)通過dsRNA得到抑制(圖2)。因此，本發(fā)明提供了能夠在導(dǎo)入表達(dá)ERCC6L基因的細(xì)胞后抑制該基因表達(dá)的分離雙鏈分子。所述雙鏈分子的靶序列可通過siRNA設(shè)計(jì)算法來設(shè)計(jì)，例如下述的。ERCC6L靶序列的例子包括例如SEQ ID NO 7和8的核苷酸。本發(fā)明中特別感興趣的是下列雙鏈分子[I]至[18][I] 一種分離的雙鏈分子，它當(dāng)被導(dǎo)入細(xì)胞后，抑制ERCC6L的體內(nèi)表達(dá)和細(xì)胞增殖，所述分子包括有義鏈以及與之互補(bǔ)的反義鏈，二者彼此雜交形成所述雙鏈分子；[2] [I]中所述的雙鏈分子，其中所述雙鏈分子對mRNA作用，所述mRNA與靶序列 SEQ ID NO :7 或 8 匹配；[3] [2]中所述的雙鏈分子，其中所述有義鏈包括對應(yīng)于靶序列SEQ ID NO :7或8 的核苷酸序列；[4] [3]中所述的雙鏈分子，其中有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子具有少于約100個核苷酸對的長度；[5] [4]中所述的雙鏈分子，其中有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子具有少于約75個核苷酸對的長度；[6] [5]中所述的雙鏈分子，其中有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子具有少于約50個核苷酸對的長度；[7] [6]中所述的雙鏈分子，其中有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子具有少于約25個核苷酸對的長度；[8] [7]中所述的雙鏈分子，其中有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子具有約19到約25個核苷酸對的長度；[9] [I]中所述的雙鏈分子，其由單一多核苷酸構(gòu)成，所述多核苷酸包含通過間插單鏈連接在一起的有義鏈和反義鏈；[10] [9]中所述的雙鏈分子，其具有通式5' -[A]-[B]-[A, ]_3'，其中，[A]為包含與靶序列SEQ ID NO :7或8對應(yīng)的序列的有義鏈，[B]為由3個 23個核苷酸構(gòu)成的間插單鏈，W ]為包含與靶序列互補(bǔ)的序列的反義鏈；[11] [I]中所述的雙鏈分子，其由RNA構(gòu)成；[12] [I]中所述的雙鏈分子，其由DNA和RNA構(gòu)成；[13] [12]中所述的雙鏈分子，其中所述分子是DNA多核苷酸與RNA多核苷酸的雜合體；[14] [13]中所述的雙鏈分子，其中所述有義鏈與反義鏈分別由DNA與RNA構(gòu)成；[15] [12]中所述的雙鏈分子，其中所述分子為DNA與RNA的嵌合體；[16] [15]中所述的雙鏈分子，其中反義鏈3’端側(cè)翼的區(qū)域?yàn)镽NA，或者有義鏈5’ 端側(cè)翼的區(qū)域與反義鏈3’端側(cè)翼的區(qū)域均為RNA ；[17] [16]中所述的雙鏈分子，其中所述側(cè)翼區(qū)域由9到13個核苷酸組成；[18] [2]中所述的雙鏈分子，其中所述分子包含3’突出端。本發(fā)明所述的雙鏈分子將在下面更詳細(xì)描述。設(shè)計(jì)具有抑制細(xì)胞內(nèi)靶基因表達(dá)能力的雙鏈分子的方法是已知的(見例如，美國專利No. 6，506，559，本文通過提述并入其全部內(nèi)容)。例如，可以從 Ambion 網(wǎng)站(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_ finder, html)訪問用于設(shè)計(jì)siRNA的計(jì)算機(jī)程序。該計(jì)算機(jī)程序可以根據(jù)如下的規(guī)程選擇雙鏈分子的靶核苷酸序列。靶點(diǎn)的詵擇:I.從轉(zhuǎn)錄物的AUG起始密碼子開始向下游掃描搜尋AA雙核苷酸序列。記錄每個 AA的出現(xiàn)及其3’側(cè)相鄰的19個核苷酸作為潛在siRNA靶點(diǎn)。Tuschl等不建議針對5’和 3’非翻譯區(qū)(UTR)以及鄰近起始密碼子的區(qū)域(75個堿基之內(nèi))設(shè)計(jì)siRNA，因?yàn)檫@些區(qū)域可能更富含調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)，而UTR結(jié)合蛋白和/或翻譯起始復(fù)合物可能干擾s i RNA 核酸內(nèi)切酶復(fù)合物的結(jié)合。2.將潛在靶點(diǎn)與合適的基因組數(shù)據(jù)庫(人、小鼠、大鼠等)進(jìn)行比較，將任何與其他編碼序列具有顯著同源性的靶序列排除在考慮之外。主要使用BLAST(Altschul SF等， Nucleic Acids Res 1997 Sep 1,25(17) :3389-402)，其可見于 NCBI 服務(wù)器www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/。3.選擇合格的靶序列用于合成。通常沿著待評估的基因的長度選擇幾個靶序列。使用上述規(guī)程，設(shè)計(jì)本發(fā)明的用于ERCC6L基因的分離的雙鏈分子的靶序列為SEQID NO 7 和 8。分別對以上述靶序列為目標(biāo)的雙鏈分子檢查其阻抑表達(dá)靶基因細(xì)胞生長的能力。 因此，本發(fā)明提供用于ERCC6L基因的以SEQ ID NO :7和8的序列為靶標(biāo)的雙鏈分子。本發(fā)明的雙鏈分子可以針對一種靶ERCC6L基因序列或者可以針對多種靶ERCC6L基因序列。靶向上文所述ERCC6L基因靶序列的本發(fā)明雙鏈分子包括含有靶序列的核酸序列和/或與靶序列互補(bǔ)的序列的分離的多核苷酸。靶向ERCC6L基因的多核苷酸的例子包括含有SEQ ID NO :7或8的序列和/或與這些核苷酸互補(bǔ)的序列的多核苷酸；然而，本發(fā)明并不僅限于這個例子，且上述核酸序列中次要修飾是可以接受的，只要所述經(jīng)修飾分子保留阻抑ERCC6L基因表達(dá)的能力。本文中，短語“次要修飾”當(dāng)用于和核酸序列相關(guān)時(shí)表示對所述序列替換、缺失、添加或插入一個、兩個或數(shù)個核酸。在一個實(shí)施方案中，雙鏈分子由兩條多核苷酸構(gòu)成，一條多核苷酸具有與祀序列對應(yīng)的序列，即有義鏈，而另一條多核苷酸具有與靶序列互補(bǔ)的序列，即反義鏈。有義鏈多核苷酸和反義鏈多核苷酸彼此雜交以形成雙鏈分子。此類雙鏈分子的例子包括dsRNA和 dsD/R-NA。在另一個實(shí)施方案中，雙鏈分子由一條多核苷酸構(gòu)成，其具有與祀序列對應(yīng)的序列(即有義鏈)和與靶序列互補(bǔ)的序列(即反義鏈)二者。一般地，有義鏈和反義鏈通過間插鏈連接，且彼此雜交以形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。此類雙鏈分子的例子包括shRNA和shD/R-NA。換言之，本發(fā)明的雙鏈分子包含有義鏈多核苷酸(其具有靶序列的核苷酸序列) 和反義鏈多核苷酸(其具有與靶序列互補(bǔ)的核苷酸序列)，而且這兩種多核苷酸彼此雜交以形成雙鏈分子。在包含所述各多核苷酸的雙鏈分子中，兩條鏈任一或二者的多核苷酸的一部分可以是RNA，而且當(dāng)靶序列用DNA序列來限定時(shí)，靶序列及其互補(bǔ)序列內(nèi)的核苷酸 “t”用“u”替換。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的此類雙鏈分子包含莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，其由有義鏈和反義鏈構(gòu)成。有義鏈和反義鏈可通過環(huán)連接。因而，本發(fā)明還提供包含單一多核苷酸的雙鏈分子，該多核苷酸含有有義鏈和反義鏈二者，該有義鏈和反義鏈通過間插單鏈連接或側(cè)翼為間插單鏈。在本發(fā)明中，靶向ERCC6L基因的雙鏈分子可具有選自SEQ ID NO :7或8的序列作為靶序列。因而，本發(fā)明的雙鏈分子的優(yōu)選例包括多核苷酸及其互補(bǔ)序列，和具有與SEQ ID NO 7和8對應(yīng)的序列及其互補(bǔ)序列的多核苷酸。在本發(fā)明的背景中，術(shù)語“數(shù)個”當(dāng)用于核酸替換、缺失、添加和/或插入時(shí)可意指 3-7個，優(yōu)選3-5個，更優(yōu)選3-4個，進(jìn)一步更優(yōu)選是3個核酸殘基。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的雙鏈分子可用實(shí)施例中使用的方法檢測其能力。在本文中下述的實(shí)施例中，在體外對包含ERCC6L基因的mRNA不同部分的有義鏈或其互補(bǔ)的反義鏈的雙鏈分子測驗(yàn)其在癌細(xì)胞系中降低ERCC6L基因產(chǎn)物產(chǎn)生的能力。進(jìn)一步，例如，較之在沒有候選分子情況下培養(yǎng)的細(xì)胞，在與候選雙鏈分子接觸的細(xì)胞中ERCC6L基因產(chǎn)物的減少可由，例如，使用在實(shí)施例I “半定量逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR”項(xiàng)中的針對ERCC6L mRNA的引物的 RT-PCR來加以檢測。然后，可對在體外基于細(xì)胞的分析中減少ERCC6L基因產(chǎn)物的序列檢測其針對細(xì)胞生長的抑制作用。然后可對在體外基于細(xì)胞的分析中抑制細(xì)胞生長的序列使用患癌癥動物檢測其體內(nèi)的相應(yīng)能力，以證實(shí)ERCC6L基因產(chǎn)物的產(chǎn)生降低與癌細(xì)胞生長降低，所述動物的例子包括裸小鼠異種移植模型。當(dāng)所述分離多核苷酸是RNA及其衍生物時(shí)，核苷酸序列中的“t”應(yīng)替換為“U”。本文中使用的術(shù)語“互補(bǔ)”指多核苷酸中核苷酸單元之間的Watson-Crick或Hoogsteen堿基配對，且術(shù)語結(jié)合意指兩個多核苷酸間物理的或化學(xué)的相互作用。當(dāng)所述多核苷酸包含修飾的核苷酸和/或非磷酸二酯酶聯(lián)接時(shí)，這些多核苷酸亦可以同樣地發(fā)生相互結(jié)合。一般而言，互補(bǔ)多核苷酸序列在合適條件下雜交以形成包含很少或沒有錯配的穩(wěn)定雙鏈體。進(jìn)一步，本發(fā)明中所述分離多核苷酸的有義鏈與反義鏈可通過雜交形成雙鏈分子或發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，上述雙鏈體在每10個匹配中包含不超過一個錯配。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，雙鏈體的鏈完全互補(bǔ)，這樣的雙鏈體不包含錯配。對ERCC6L所述多核苷酸長度優(yōu)選少于7006個核苷酸。舉例而言，對所述的基因， 多核苷酸長度小于500、200、100、75、50或25個核苷酸。本發(fā)明中所述分離多核苷酸對形成針對ERCC6L基因的雙鏈分子，或制備編碼雙鏈分子的模板DNA是有用的。當(dāng)所述多核苷酸用于形成雙鏈分子時(shí)，所述多核苷酸可長于19個核苷酸，優(yōu)選長于21個核苷酸，且更加優(yōu)選長度在約19與25個核苷酸之間。因而，本發(fā)明提供了包含有義鏈和反義鏈的雙鏈分子，其中有義鏈?zhǔn)桥c靶序列對應(yīng)的核苷酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成長度為19 至25個核苷酸對的雙鏈分子。當(dāng)將雙鏈分子導(dǎo)入細(xì)胞中時(shí)，雙鏈分子充當(dāng)RISC復(fù)合物識別mRNA中同源序列的向?qū)?。被識別的靶RNA受到Dicer核酸酶活性切割和降解，由此雙鏈分子最終降低或抑制由該RNA編碼的多肽的生成(表達(dá))。因此，本發(fā)明的雙鏈分子可通過其生成在嚴(yán)格條件下與ERCC6L基因的mRNA特異性雜交單鏈的能力來定義。在本文中，mRNA中與自雙鏈分子生成的單鏈雜交的部分稱作“靶序列”或“靶核酸”或“靶核苷酸”。在本發(fā)明的背景中，“靶序列”的核苷酸序列不僅可使用mRNA的RNA序列來顯示,而且還可以使用自mRNA合成的cDNA 的DNA序列來顯示。本發(fā)明中所述雙鏈分子可包含一個或更多修飾核苷酸和/或非磷酸二酯連接。本領(lǐng)域眾所周知的化學(xué)修飾具有增加所述雙鏈分子的穩(wěn)定性、可用性和/或細(xì)胞攝入的能力。一般技術(shù)人員明白本發(fā)明分子可包含的其它類型的化學(xué)修飾(W003/070744 ; W02005/045037)。在一個實(shí)施方案中，可使用修飾以提供改善的抗降解性或改善的攝入。 上述修飾的例子包括但不僅限于，硫代磷酸酯聯(lián)接、2’-0_甲基核糖核苷酸(特別是在雙鏈分子的有義鏈上)、2’ -脫氧-氟代核糖核苷酸、2’ -脫氧核糖核苷酸、“通用堿基”核苷酸、 5’ -C-甲基核苷酸以及倒轉(zhuǎn)脫氧脫堿基殘基的摻入(US20060122137)。另一個實(shí)施方案中，可以使用修飾來增強(qiáng)雙鏈分子的穩(wěn)定性或增加尋靶效率。這樣的修飾包括但不限于雙鏈分子兩條互補(bǔ)鏈之間的化學(xué)交聯(lián)、雙鏈分子一條鏈的3’或5’ 末端的化學(xué)修飾、糖修飾、核堿基修飾和/或骨架修飾、2-氟代修飾的核糖核苷酸和2’-脫氧核糖核苷酸(W02004/029212)。在另一個實(shí)施方案中，修飾可以用于增加或減少針對靶 mRNA中和/或互補(bǔ)雙鏈分子鏈中互補(bǔ)核苷酸的親和力(W02005/044976)。例如，未修飾的喃唳核苷酸可以用2-硫、5-炔基(5-alkynyl)、5_甲基或5-丙炔基(5-propynyl)喃唳替代。另外，未修飾的嘌呤可以用7-脫氮(7-deza)、7-烷基或7-烯基嘌呤取代。在另一個實(shí)施方案中，當(dāng)雙鏈分子是具有3’突出端的雙鏈分子時(shí)，可以把3’ -末端核苷酸的突出核苷酸替換成脫氧核糖核苷酸(Elbashir SM 等，Genes Dev 2001 Jan 15，15(2) :188-200)。 關(guān)于進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，可以利用公開文獻(xiàn)如US20060234970。本發(fā)明不限于這些實(shí)例，可以將任何已知化學(xué)修飾應(yīng)用于本發(fā)明的雙鏈分子，只要所得分子保留抑制靶基因表達(dá)的能力。此外，本發(fā)明的雙鏈分子可以包含DNA和RNA 二者，例如dsD/R-NA或shD/R-NA。 具體而言，由DNA鏈與RNA鏈形成的雜合多核苷酸或DNA-RNA嵌合體多核苷酸表現(xiàn)出提高的穩(wěn)定性?？梢孕纬蒁NA和RNA的混合，即由DNA鏈(多核苷酸)和RNA鏈(多核苷酸) 組成的雜合型雙鏈分子、或在任一單鏈(多核苷酸)或兩條單鏈(多核苷酸)上同時(shí)包含 DNA和RNA的嵌合型雙鏈分子，諸如此類，來增強(qiáng)所述雙鏈分子的穩(wěn)定性。DNA鏈和RNA鏈的雜合體可以是這樣的，其中有義鏈?zhǔn)荄NA而反義鏈?zhǔn)荝NA，或者相反，只要它在導(dǎo)入表達(dá)靶基因的細(xì)胞中后能夠抑制該基因表達(dá)。優(yōu)選地，有義鏈多核苷酸是DNA而反義鏈多核苷酸是RNA。同樣，嵌合型雙鏈分子可以是這樣的，其中有義鏈和反義鏈均由DNA和RNA組成，或者有義鏈或反義鏈中的任一條由DNA和RNA組成，只要在導(dǎo)入表達(dá)靶基因的細(xì)胞中時(shí)，所述雙鏈分子具有抑制該基因表達(dá)的活性即可。為了提高雙鏈分子的穩(wěn)定性，分子中優(yōu)選包含盡可能多的DNA ;而為了誘導(dǎo)靶基因的表達(dá)抑制，要求分子在一定范圍內(nèi)是RNA，以充分地誘導(dǎo)表達(dá)抑制。作為嵌合型雙鏈分子的一個優(yōu)選實(shí)例，雙鏈分子的上游部分區(qū)域(即位于有義鏈或反義鏈內(nèi)的靶序列或其互補(bǔ)序列之側(cè)翼的區(qū)域)為RNA。優(yōu)選地，所述上游部分區(qū)表示有義鏈的5’側(cè)(5，端)和反義鏈的3’側(cè)(3’端)?；蛘撸瑢⑽挥谟辛x鏈5’末端側(cè)翼或者反義鏈3’末端側(cè)翼的區(qū)域稱為上游部分區(qū)域。就是說，在優(yōu)選實(shí)施方案中，反義鏈3’末端側(cè)翼的區(qū)域由RNA組成，或者有義鏈5’末端側(cè)翼的區(qū)域和反義鏈3’末端側(cè)翼的區(qū)域均由 RNA組成。例如，本發(fā)明的嵌合型或雜合型雙鏈分子包含以下組合。有義鏈
5，-[DNA]-3，
3， -(RNA)-[DNA]-5’
:反義鏈，
有義鏈
5， -(RNA)-[DNA]-3’
3， -(RNA)-[DNA]-5’
:反義鏈，和
有義鏈
5， -(RNA)-[DNA]-3’
3，-(RNA)-5，
:反義鏈。
上游部分區(qū)優(yōu)選是由9-13個核苷酸組成的域，從雙鏈分子的有義鏈或反義鏈內(nèi)
的靶序列或其互補(bǔ)序列的末端算起。此外，這種嵌合型雙鏈分子的優(yōu)選實(shí)例包括這樣的實(shí)例鏈長為19-21個核苷酸，其中多核苷酸的至少上游的半?yún)^(qū)(對于有義鏈為5’側(cè)區(qū)域而對于反義鏈為3’側(cè)區(qū)域)是RNA，而另一半是DNA。在這樣的嵌合型雙鏈分子中，抑制靶基因表達(dá)的效果比反義鏈整體為RNA時(shí)強(qiáng)得多(US20050004064)。 在本發(fā)明的背景中，雙鏈分子可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，例如短發(fā)夾RNA(ShRNA)以及由
31DNA與RNA組成的短發(fā)夾(shD/R-NA)。shRNA或shD/R-NA是RNA序列或RNA和DNA的混合序列，其形成緊密的發(fā)夾轉(zhuǎn)彎，可以用來通過RNA干擾來沉默基因表達(dá)。shRNA或shD/R-NA 在單一鏈上包含有義靶標(biāo)序列和反義靶標(biāo)序列，其中所述序列被環(huán)序列隔開。通常，發(fā)夾結(jié)構(gòu)被細(xì)胞機(jī)制切割成dsRNA或dsD/R-NA，所述dsRNA或dsD/R-NA進(jìn)一步與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)結(jié)合。這種復(fù)合物結(jié)合并切割與所述dsRNA或dsD/R-NA的靶標(biāo)序列匹配的 mRNA ο為了形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)，可以在有義序列與反義序列之間設(shè)置由任意核苷酸序列構(gòu)成的環(huán)序列。因此，本發(fā)明還提供具有通式5’ _[A]-[B]-[A’ ]-3’的雙鏈分子。式中，[A] 為有義鏈，包含與靶序列對應(yīng)的核苷酸序列；[B]為間插單鏈；W ]為反義鏈，包含與靶序列互補(bǔ)的序列。靶序列可以選自例如用于ERCC6L的SEQ ID NO 7和8。本發(fā)明不限于這些實(shí)例，在雙鏈分子保持抑制作為靶標(biāo)的ERCC6L基因的表達(dá)的能力的前提下，[A]中的靶序列可以是在這些實(shí)例的基礎(chǔ)上修飾而得到的序列。區(qū)域[A] 與[A']雜交而形成由區(qū)域[B]構(gòu)成的環(huán)。間插單鏈部分[B]、即環(huán)序列，長度優(yōu)選可以為 3 23個核苷酸。例如,環(huán)序列可以選自由以下的序列組成的組(http://www. ambion. com/ techlib/tb/tb_506. html)。此外，由23個核苷酸組成的環(huán)序列也提供活性siRNA(Jacque JM et al. , Nature 2002Jul 25,418 (6896) :435-8, Epub 2002 Jun 26)CCC、CCACC 或 CCACACC Jacque JM et al. , Nature 2002 Jul 25,418(6896) 435-8, Epub 2002 Jun 26 ；UUCG Lee NS et al. ,Nat Biotechnol 2002 May, 20 (5) :500-5 ；Fruscoloni P et al. , Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18,100(4) :1639-44，Epub 2003 FeblO -MUUCAAGAGA =Dykxhoorn DM et al.，Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun，4(6) 457-67。優(yōu)選的具有本發(fā)明的發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的雙鏈分子實(shí)例如下所示。在下面的結(jié)構(gòu)中，環(huán)序列可以選自由 AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC 和 UUCAAGAGA 組成的組； 但本發(fā)明不限于此CUGCACAACCAACUCUUUG- [B] -CAAAGA ⑶ UG ⑶腳 GCAG(對于靶序列SEQ ID NO :7)。AUGUUAAUCAAUAACUGGC-[B]-GCCAGUUAUUGAUUAACAU(對于革巴序列SEQID NO :8)。此外，為了增強(qiáng)雙鏈分子的抑制活性，可以將數(shù)個核苷酸添加到靶序列的有義鏈和/或反義鏈的3’末端，作為3’突出端。構(gòu)成3’突出端的核苷酸的優(yōu)選例包括但不限于 “t”和“U”。添加的核苷酸的數(shù)目為至少2個，通常為2-10個，優(yōu)選為2-5個。添加的核苷酸在雙鏈分子的反義鏈的3’末端形成單鏈。在雙鏈分子由單一多核苷酸組成以形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的情況中，可以將3’突出端添加至單一多核苷酸的3’末端。對于雙鏈分子的制備方法沒有特殊限制，但優(yōu)選采用本技術(shù)領(lǐng)域公知的化學(xué)合成方法。根據(jù)化學(xué)合成方法，分別合成有義和反義單鏈多核苷酸，然后采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ顾鼈兺嘶鸬揭黄?，來獲得雙鏈分子。退火的具體例子包括其中將合成的單鏈多核苷酸以優(yōu)選至少約3 7、更優(yōu)選約4 6、最優(yōu)選基本上等摩爾量(即約5 5的摩爾比)的摩爾比混合。然后，將混合物加熱到雙鏈分子解離的溫度，再緩慢冷卻。經(jīng)退火的雙鏈多核苷酸可以采用本技術(shù)領(lǐng)域公知的常用方法來純化。純化方法的例子包括利用瓊脂糖凝膠電泳的方法，或者其中任選地除去剩余的單鏈多核苷酸(例如利用適當(dāng)?shù)拿高M(jìn)行降解)的方法。所述位于ERCC6L序列側(cè)翼的調(diào)控序列可為相同或不同的，以使得它們的表達(dá)能夠獨(dú)立地，或者以時(shí)間性或空間性方式被調(diào)控。所述雙鏈分子可通過將ERCC6L基因模板克隆入載體(例如含有來自小核RNA(snRNA)U6的RNA多聚酶III轉(zhuǎn)錄單元或人類HlRNA啟動子的載體)以在胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄?；蛘?，雙鏈分子可在胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄，即將其編碼序列克隆入含有與編碼區(qū)相鄰的指導(dǎo)雙鏈分子在適當(dāng)細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列(例如來自小核RNA(snRNA) U6的RNA poly III轉(zhuǎn)錄單元或人HlRNA啟動子)的載體中。雙鏈分子的編碼序列側(cè)翼的調(diào)節(jié)序列可以相同或不同，使得它們的表達(dá)可獨(dú)立調(diào)控，或者以時(shí)間或空間方式調(diào)控。下面會描述能夠生成雙鏈分子的載體的詳情。含有本發(fā)明雙鏈分子的載體:如上所述，本發(fā)明包括含有一種或多種本文所述的雙鏈分子的載體、以及包含該載體的細(xì)胞。本發(fā)明中特別感興趣的是下列載體[I]至[10]。[I] 一種載體，它編碼當(dāng)被導(dǎo)入細(xì)胞后，抑制ERCC6L的體內(nèi)表達(dá)和細(xì)胞增殖的雙鏈分子，其中所述分子包含有義鏈以及與之互補(bǔ)的反義鏈，二者彼此雜交形成所述雙鏈分子。[2] [I]中所述的載體，它編碼對mRNA作用的雙鏈分子，所述mRNA與靶序列SEQ ID NO :7或8匹配；[3] [I]中所述的載體，其中有義鏈包括對應(yīng)于靶序列SEQ ID NO :7或8的序列；[4] [3]中所述的載體，它編碼雙鏈分子，其中雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成長度小于約100個核苷酸對的雙鏈分子；[5] [4]中所述的載體，它編碼雙鏈分子，其中雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成長度小于約75個核苷酸對的雙鏈分子；[6] [5]中所述的載體，它編碼雙鏈分子，其中雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成長度小于約50個核苷酸對的雙鏈分子；[7] [6]中所述的載體，它編碼雙鏈分子，其中雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成長度小于約25個核苷酸對的雙鏈分子；[8] [7]中所述的載體，它編碼雙鏈分子，其中雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成長度為約19個至約25個核苷酸對的雙鏈分子；[9] [I]中所述的載體，其中所述雙鏈分子由單一多核苷酸構(gòu)成，所述多核苷酸包含通過間插單鏈連接在一起的有義鏈和反義鏈；和[10] [9]中所述的載體，它編碼具有通式5' -[A]-[B]-[A, ]_3'的雙鏈分子，其中，[A]為包含與靶序列SEQ ID NO :7或8對應(yīng)的序列的有義鏈，[B]為由3個至23個核苷酸構(gòu)成的間插單鏈，W ]為包含與靶序列互補(bǔ)的序列的反義鏈；本發(fā)明的載體優(yōu)選編碼處于可表達(dá)的形式的本發(fā)明的雙鏈分子。在本說明書中， 術(shù)語“處于可表達(dá)的形式”，是指該載體當(dāng)被導(dǎo)入細(xì)胞中時(shí)，將表達(dá)該分子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體包含雙鏈分子表達(dá)所必需的調(diào)節(jié)元件。本發(fā)明的這種載體可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的雙鏈分子，也可以直接用作癌癥治療的活性成分。
本發(fā)明的載體可通過下述方法生成例如，將ERCC6L序列克隆入表達(dá)載體中，使調(diào)控序列可操作性地連接于ERCC6L序列，以允許兩條鏈的表達(dá)(通過DNA分子的轉(zhuǎn)錄) (Lee NS et al.，Nat Biotechnol 2002 May, 20 (5) :500-5)。例如，與 mRNA 反義的 RNA 分子由第一啟動子(例如位于克隆DNA的3’末端側(cè)翼的啟動子序列)轉(zhuǎn)錄，對mRNA而言為有義鏈RNA分子由第二啟動子(例如位于克隆DNA的5’末端側(cè)翼的啟動子序列)轉(zhuǎn)錄。有義和反義鏈在體內(nèi)雜交，產(chǎn)生用于沉默該基因的雙鏈分子構(gòu)建體?；蛘撸褂梅謩e編碼雙鏈分子之有義鏈和反義鏈的兩個載體構(gòu)建體來分別表達(dá)有義鏈和反義鏈，隨后形成雙鏈分子構(gòu)建體。而且，克隆的序列可編碼具有二級結(jié)構(gòu)(例如發(fā)夾)的構(gòu)建體，即，載體的單一轉(zhuǎn)錄物同時(shí)包含靶基因的有義序列和互補(bǔ)反義序列二者。也可以配置本發(fā)明的載體使得其實(shí)現(xiàn)在靶細(xì)胞的基因組中的穩(wěn)定插入(關(guān)于同源重組盒載體的說明，參見Thomas KR&Capecchi MR7Cell 1987,51:503-12)?？梢詤⒖祭?Wolff 等，Science 1990,247 :1465-8 ;美國專利第 5，580，859 號、第 5，589，466 號、第 5，804，566 號、第 5，739，118 號、第 5，736，524 號、第 5，679，647 號和 WO 98/04720?；?DNA的輸送技術(shù)的例子包括“裸DNA”、輔助(布比卡因(bupivicaine)、聚合物、肽介導(dǎo)型) 輸送、陽離子脂質(zhì)復(fù)合體、和粒子介導(dǎo)型投遞(“基因槍”)或壓力介導(dǎo)型輸送(例如參照美國專利第5，922，687號)。本發(fā)明的載體包括，例如，病毒載體或細(xì)菌載體。表達(dá)載體的例子包括牛痘或雞痘等減毒病毒宿主(參照美國專利第4，722，848號)。該策略涉及例如使用牛痘病毒作為載體來表達(dá)編碼雙鏈分子的核苷酸序列。重組牛痘病毒在被導(dǎo)入表達(dá)靶基因的細(xì)胞時(shí)即表達(dá)該分子并由此抑制細(xì)胞的增殖?？墒褂玫妮d體的其它例子包括卡介苗(BCG)。BCG載體在 Stover等，Nature 1991, 351 :456-60中有記載。其它多種多樣的載體可用于雙鏈分子的治療性施用與生產(chǎn)，例子包括腺病毒載體和腺隨伴病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)載體、脫毒的炭疽毒素載體等?？梢詤⒄绽鏢hata等，Mol Med Today 2000，6 :66-71 ;Shedlock 等，J Leukoc Biol 2000，68 :793-806 ;以及 Hipp 等，In Vivo 2000，14 :571-85。使用本發(fā)明雙鏈分子抑制或降低癌細(xì)胞生長及治療癌癥的方法:在本發(fā)明中，測試針對ERCC6L的dsRNA抑制細(xì)胞生長的能力。針對ERCC6L的 dsRNA(圖2B，C)有效敲低了該基因在數(shù)種癌細(xì)胞系中的表達(dá)，這與對細(xì)胞增殖的阻抑一致。因而，本發(fā)明提供了抑制癌細(xì)胞生長的方法，所述方法通過抑制ERCC6L的表達(dá)來誘導(dǎo)ERCC6L基因的功能障礙。ERCC6L基因表達(dá)可通過任何上文所述特異性靶向ERCC6L基因的本發(fā)明雙鏈分子來抑制。上述本發(fā)明雙鏈分子及載體抑制癌性細(xì)胞的細(xì)胞生長的能力提示其可用于治療癌癥，諸如肺癌的方法。因此，發(fā)明提供通過施用針對ERCC6L基因的雙鏈分子或表達(dá)所述分子的載體來治療罹患癌癥患者而無不良作用的方法，因?yàn)檎Ｆ鞴僦袔缀鯔z測不到 ERCC6L 基因(圖 1C)。本發(fā)明中特別感興趣的是下列[I]至[32]的方法[I] 一種用于抑制癌細(xì)胞生長或治療癌癥的方法，其中所述癌細(xì)胞或癌癥表達(dá)至少一種ERCC6L基因，該方法包括施用至少一種抑制過表達(dá)ERCC6L基因的細(xì)胞中該基因表達(dá)和細(xì)胞增殖的分離的雙鏈分子或編碼該雙鏈分子的載體的步驟，其中該雙鏈分子包含有義鏈及其互補(bǔ)反義鏈，它們彼此雜交以形成該雙鏈分子；[2] [I]的方法，其中所述雙鏈分子對mRNA作用，所述mRNA與靶序列SEQ ID NO 7或8匹配；[3] [2]的方法，其中有義鏈包含與靶序列SEQ ID NO :7或8對應(yīng)的序列；[4] [I]的方法，其中要治療的癌癥是肺癌；[5] [3]的方法，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長度小于大約100個核苷酸對；[6] [5]的方法，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長度小于大約75個核苷酸對；[7] [6]的方法，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長度小于大約50個核苷酸對；[8] [7]的方法，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長度小于大約25個核苷酸對；[9] [8]的方法，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長度為大約19個至大約25個核苷酸對；[10] [I]的方法，其中所述雙鏈分子由單一多核苷酸構(gòu)成，所述多核苷酸包含通過間插單鏈連接在一起的有義鏈和反義鏈；[11] [10]的方法，其中所述雙鏈分子具有通式5' _[A]-[B]-[A' ]_3'，其中， [A]為包含與靶序列SEQ ID NO :7或8對應(yīng)的序列的有義鏈，[B]為由3個 23個核苷酸構(gòu)成的間插單鏈，W ]為包含與靶序列互補(bǔ)的序列的反義鏈；[12] [I]的方法，其中所述雙鏈分子是RNA ；[13] [I]的方法，其中所述雙鏈分子包含DNA和RNA ；[14] [13]的方法，其中所述雙鏈分子是DNA多核苷酸與RNA多核苷酸的雜合體；[15] [14]的方法，其中所述有義與反義鏈多核苷酸分別由DNA與RNA構(gòu)成；[16] [13]的方法，其中所述雙鏈分子是DNA與RNA的嵌合體；[17] [16]的方法，其中反義鏈3’端側(cè)翼的區(qū)域由RNA構(gòu)成，或者有義鏈5’端側(cè)翼的區(qū)域與反義鏈3’端側(cè)翼的區(qū)域均由RNA構(gòu)成；[18] [17]的方法，其中所述側(cè)翼區(qū)域由9到13個核苷酸組成；[19] [I]的方法，其中所述雙鏈分子包含3’突出端；[20] [I]的方法，其中所述雙鏈分子包含于組合物中，所述組合物除所述分子外還包括轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑和可藥用的擔(dān)載體。[21] [I]的方法，其中所述雙鏈分子由載體編碼；[22] [21]的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子對mRNA作用，所述mRNA與革巴序列SEQ ID NO :7或8匹配；[23] [22]的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子的有義鏈包含與選自SEQ ID NO 7和8的靶序列對應(yīng)的序列；[24] [23]的方法，其中要治療的癌癥是肺癌；[25] [23]的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子長度小于大約100個核苷酸對；[26] [25]的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子長度小于大約75個核苷 酸對；[27] [26]的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子長度小于大約50個核苷 酸對；[28] [27]的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子長度小于大約25個核苷 酸對；[29] [28]的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子長度為大約19個至大約 25個核苷酸對；[30] [21]的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子由單一多核苷酸構(gòu)成，所 述多核苷酸包含通過間插單鏈連接在一起的有義鏈和反義鏈；[31] [30]的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子具有通式 5' -[A]-[B]-[A/ ]-3/，其中，[A]為包含與靶序列SEQ ID N0 :7或8對應(yīng)的序列的有義 鏈，[B]為由3個至23個核苷酸構(gòu)成的間插單鏈，[A']為包含與靶序列互補(bǔ)的序列的反 乂鏈；[32] [21]的方法，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子包含于組合物中，所述組 合物除所述分子外還包括轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑和可藥用的擔(dān)載體。本發(fā)明方法將在下面更加詳細(xì)的加以描述?？赏ㄟ^將細(xì)胞與針對ERCC6L基因的雙鏈分子、表達(dá)該分子的載體或包含同樣分 子的組合物接觸來抑制表達(dá)ERCC6L基因的細(xì)胞的生長?？蛇M(jìn)一步將所述細(xì)胞與轉(zhuǎn)染劑接 觸。合適的轉(zhuǎn)染劑在本領(lǐng)域是已知的。短語“抑制細(xì)胞生長”表示所述細(xì)胞較之未暴露于 所述分子的細(xì)胞，以較低速率增殖或具有降低的存活力。細(xì)胞生長可通過本領(lǐng)域已知技術(shù) 測定，例如使用MTT細(xì)胞增殖測定。任何種類的細(xì)胞的生長均可根據(jù)本方法進(jìn)行阻抑，只要 所述細(xì)胞表達(dá)或過表達(dá)本發(fā)明所述雙鏈分子的靶基因?？勺鳛槔拥募?xì)胞包括肺癌細(xì)胞。因此，對于正罹患或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生與ERCC6L有關(guān)的疾病的患者，可通過施用本發(fā)明 的雙鏈分子、表達(dá)所述分子的至少一種載體或包含所述分子的組合物進(jìn)行治療。舉例而言， 罹患癌癥的患者可根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行治療。癌癥類型可通過根據(jù)所診斷的特定類型腫 瘤的標(biāo)準(zhǔn)方法來進(jìn)行鑒定。更優(yōu)選地，用本發(fā)明所述方法治療的患者是用這樣的方法選出 的在來自患者的活檢中通過RT-PCR或免疫測定法檢測ERCC6L的表達(dá)。優(yōu)選地，在本發(fā)明 的治療之前，對于來自受試者的所述活檢標(biāo)本通過本領(lǐng)域所知的方法，例如，免疫組織化學(xué) 分析或RT-PCR，證實(shí)ERCC6L基因的過表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的方法，為抑制細(xì)胞生長并藉此治療癌癥，通過施用多種所述雙鏈分 子(或表達(dá)多種所述雙鏈分子的載體或含有多種所述雙鏈分子的組合物)，每個所述分子 可具有不同結(jié)構(gòu)，但作用于與相同ERCC6L靶序列匹配的mRNA?；蛘撸喾N雙鏈分子可作用 于與相同基因的不同靶序列匹配的mRNA?；蛘?，例如，本方法可利用針對ERCC6L的一種、兩 種或更多種靶序列的雙鏈分子。為抑制細(xì)胞生長，本發(fā)明的雙鏈分子可直接以可實(shí)現(xiàn)該分子與對應(yīng)mRNA轉(zhuǎn)錄物 結(jié)合的形式導(dǎo)入細(xì)胞。另外，如上所述，編碼雙鏈分子的DNA可作為載體導(dǎo)入細(xì)胞。為 將雙鏈分子和載體導(dǎo)入細(xì)胞，可使用轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑，例如FuGENE (Roche diagnostics)、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)、Oligofectamine (Invitrogen)與 Nucleofector (Wako pure Chemical)。當(dāng)治療導(dǎo)致臨床效益，諸如ERCC6L基因表達(dá)的減少、受試者中癌癥的尺寸、患病率(prevalence)、或轉(zhuǎn)移潛力的降低，可以認(rèn)為該治療是“有效”的。當(dāng)預(yù)防性地適用治療時(shí)，“有效”是指其延遲或防止癌癥形成，或者預(yù)防或緩解癌癥的臨床癥狀。有效性結(jié)合特定腫瘤類型的任何公知的診斷或治療方法來加以確定。就本發(fā)明的方法和組合物可用于“預(yù)防”和“防范”的背景而言，此類術(shù)語在本文中可互換使用，指降低緣于疾病的死亡率或發(fā)病率負(fù)擔(dān)的任何活動。預(yù)防和防范可發(fā)生于 “一級、二級和三級預(yù)防水平”。一級預(yù)防和防范避免疾病的發(fā)生，而二級和三級預(yù)防和防范水平涵蓋旨在預(yù)防和防范疾病的進(jìn)展與癥狀的出現(xiàn)、以及通過恢復(fù)功能和減輕疾病相關(guān)并發(fā)癥來降低已建立的疾病的負(fù)面影響的活動。或者，預(yù)防和防范可包括旨在減輕特定病癥的嚴(yán)重性(例如降低腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移等)的廣泛的預(yù)防性療法。治療和/或預(yù)防癌癥和/或預(yù)防其手術(shù)后復(fù)發(fā)包括任何下述步驟，諸如手術(shù)去除癌細(xì)胞、抑制癌性細(xì)胞生長、腫瘤衰退或消退、誘導(dǎo)癌癥減退和阻抑癌癥發(fā)生、腫瘤消退、及降低或抑制轉(zhuǎn)移。癌癥的有效治療和/或預(yù)防可降低患癌個體死亡率及改善其預(yù)后，降低其血液中腫瘤標(biāo)志物的水平，及減輕其伴隨癌癥的可檢測癥狀。例如，癥狀的減輕或改善構(gòu)成有效治療和/或預(yù)防，包括10 %、20 %、30 %或更多降低，或病情穩(wěn)定。應(yīng)理解，本發(fā)明的所述雙鏈分子降解亞化學(xué)計(jì)量的ERCC6L mRNA。雖不愿拘于任何理論，認(rèn)為本發(fā)明的所述雙鏈分子以催化方式造成靶mRNA的降解。因此，與常規(guī)的癌癥療法相比，本發(fā)明中為實(shí)施治療效應(yīng)而需要輸送到癌癥的位置或其附近的雙鏈分子要少得多。本領(lǐng)域技術(shù)人員在考慮了受試者的體重、年齡、性別、疾病類型、癥狀及其它條件、 施用途徑、以及是局部施用還是全身施用等因素的基礎(chǔ)上，能夠容易地確定本發(fā)明的雙鏈分子的有效量。一般而言，本發(fā)明雙鏈分子的有效量是在癌癥部位或其附近胞間濃度為大約I納摩爾(nM)到約ΙΟΟηΜ，優(yōu)選大約2nM到大約50nM，更優(yōu)選大約2. 5nM到大約ΙΟηΜ。 考慮可使用更多或更少量的雙鏈分子。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可方便地及常規(guī)地確定特定情況下所需的確切劑量。本發(fā)明的方法可用于抑制表達(dá)ERCC6L基因的癌癥，例如肺癌的生長或轉(zhuǎn)移。具體而言，含有ERCC6L基因的靶序列(例如SEQ ID NO 7和8)的雙鏈分子特別優(yōu)選用來治療癌癥。為了治療癌癥，還可以將本發(fā)明的雙鏈分子與不同于所述雙鏈分子的藥物組合物組合來施用于受試者。或者，本發(fā)明的雙鏈分子還可以與其它旨在用于癌癥治療的治療方法組合來施用于受試者。舉例而言，本發(fā)明所述雙鏈分子可與現(xiàn)在用于治療癌癥或預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移的治療方法(例如，放射療法，外科手術(shù)，以及使用化療劑，如順鉬、卡鉬、環(huán)磷酰胺、 5_氟尿喃唳、阿霉素、柔紅霉素(daunorubicin)或他莫昔芬(tamoxifen)等的治療)組合施用。在本發(fā)明的方法中，雙鏈分子可以裸雙鏈分子的形式、以與投遞試劑相組合的形式，或者以表達(dá)雙鏈分子的重組質(zhì)粒或者病毒載體的形式施用于受試者。用于與本發(fā)明的雙鏈分子組合施用的合適的投遞試劑包括Mirus Transit TKO親脂性試劑、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin、或聚陽離子(例如聚賴氨酸)、或脂質(zhì)體。一種優(yōu)選的投遞試劑是脂質(zhì)體。脂質(zhì)體能夠幫助將雙鏈分子投遞至特定的組織如肺腫瘤組織中，還能夠增加雙鏈分子的血中半衰期。適合在本發(fā)明的背景中使用的脂質(zhì)體可以是由常規(guī)的囊泡形成性脂質(zhì) (vesile-forming lipids)形成的,囊泡形成性脂質(zhì)通常包括中性或帶負(fù)電荷的磷脂，以及甾醇，諸如膽固醇。對一些因素的考慮通?？梢詾橹|(zhì)的選擇提供指導(dǎo)，如期望的脂質(zhì)體大小以及在血流中的脂質(zhì)體的半衰期等。有多種制備脂質(zhì)體的方法是公知的，例如Szoka 等，Ann Rev Biophys Bioeng 1980，9 :467 ;美國專利第 4，235，871 號；第 4，501，728 號；第 4，837，028號；第5，019，369號；將上述文獻(xiàn)的全部內(nèi)容援引并入本說明書。優(yōu)選地，封裝本發(fā)明的雙鏈分子的脂質(zhì)體包含能夠?qū)⒅|(zhì)體輸送至癌癥部位的配體分子。優(yōu)選的配體是與腫瘤或血管內(nèi)皮細(xì)胞中常見的受體結(jié)合的配體，例如與腫瘤抗原或內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原結(jié)合的單克隆抗體。特別優(yōu)選地，封裝本發(fā)明的雙鏈分子的脂質(zhì)體經(jīng)過了修飾以免被單核巨噬細(xì)胞和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，例如，由于其結(jié)構(gòu)的表面結(jié)合有調(diào)理作用抑制部分(opsonization inhibition moities)。在一個實(shí)施方案中,本發(fā)明的脂質(zhì)體可以同時(shí)包括調(diào)理作用抑制部分和配體。用于制備本發(fā)明的脂質(zhì)體的調(diào)理作用抑制部分通常是與脂質(zhì)體膜結(jié)合的大型親水性聚合物。如在本說明書中所使用的，例如，當(dāng)調(diào)理作用抑制部分化學(xué)地或物理地搭接在脂質(zhì)體膜上時(shí)，例如通過脂溶性錨(anchor)插入膜本身，或者通過與膜脂質(zhì)的活性基團(tuán)直接結(jié)合，則調(diào)理作用抑制部分與脂質(zhì)體膜“結(jié)合”。這些調(diào)理作用抑制性親水性聚合物形成保護(hù)性表層，該表層顯著地減少巨噬-單核細(xì)胞系統(tǒng)(“MMS”)和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(”RES”) 對脂質(zhì)體的攝入；在例如美國專利第4，920，016號中對此有記載，后者的全部公開內(nèi)容援引并入本說明書。因此，與未修飾的脂質(zhì)體相比，被調(diào)理作用抑制部分修飾過的脂質(zhì)體能夠保留在血液循環(huán)中的時(shí)間顯著更長。出于以上理由，這樣的脂質(zhì)體有時(shí)也被稱為“隱形”(stealth)脂質(zhì)體。已知隱形脂質(zhì)體蓄積在依靠多孔性或“滲漏性”微血管系統(tǒng)供給的組織中。因此， 在以這樣的微血管系統(tǒng)缺損為特征的靶組織，例如實(shí)體瘤中，這些脂質(zhì)體會高效率地蓄積。 參見 Gabizon 等，Proc Natl Acad Sci USA 1988,18:6949-53。此外，RES 的攝入的減少阻止隱形脂質(zhì)體在肝臟和脾臟中的顯著蓄積，從而降低隱形脂質(zhì)體的毒性。因此，用調(diào)理作用抑制部分修飾的本發(fā)明的脂質(zhì)體能夠?qū)⒈景l(fā)明的雙鏈分子輸送至腫瘤細(xì)胞。適用于修飾脂質(zhì)體的調(diào)理作用抑制部分優(yōu)選為分子量約500 約40，000道爾頓、更優(yōu)選約2,000 約20,000道爾頓的水溶性聚合物。這樣的聚合物中包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如，甲氧基PEG或PPG、和PEG或PPG硬脂酸酯； 合成聚合物如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；直鏈狀、分枝狀或者樹狀聚酰胺胺 (polyamidoamine);聚丙烯酸；聚醇(polyalchohols),諸如化學(xué)結(jié)合有羧基或氨基的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神經(jīng)節(jié)苷脂，諸如神經(jīng)節(jié)苷脂GM115 PEG、甲氧基PEG、或甲氧基PPG或其衍生物的共聚體也是適合的。此外，抑制調(diào)理作用的聚合物可以是PEG與聚氨基酸、多糖、聚酰胺胺、聚亞乙基胺或者多核苷酸中的任何一種的嵌段共聚物。抑制調(diào)理作用的聚合物也可以是含有氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明質(zhì)酸、果膠酸、神經(jīng)氨酸、海藻酸、角叉膠；氨基化多糖類或寡糖(直鏈狀或者分枝狀)；或者羧基化的多糖或寡糖，例如，通過與碳酸的衍生物反應(yīng)而生成了羧基結(jié)合的羧基化多糖類或寡糖。優(yōu)選地，調(diào)理作用抑制部分為PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG衍生物修飾的脂質(zhì)體有時(shí)稱為“PEG化脂質(zhì)體”。調(diào)理作用抑制部分可以通過許多公知技術(shù)中的任何一種結(jié)合到脂質(zhì)體膜上。例如，PEG的N-羥基琥珀酰亞胺酯能夠與磷脂酰乙醇胺脂溶性錨 (lipid-soluble anchor)結(jié)合,然后再結(jié)合到膜上。相似地,可以通過還原性氨基化,用硬脂酰胺脂溶性錨來將右旋糖酐聚合物衍生化，所述還原性氨基化中使用Na(CN)BH3和混合溶劑，如60°C的四氫呋喃與水的30 12比例混合物。上文討論了表達(dá)本發(fā)明的雙鏈分子的載體。這樣的表達(dá)至少一種本發(fā)明的雙鏈分子的載體也可以直接施用或者與合適的投遞試劑組合施用，所述合適的投遞試劑包括 Mirus Transit LTl 親脂性試劑、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin、聚陽離子(例如聚賴氨酸)或脂質(zhì)體。將表達(dá)本發(fā)明的雙鏈分子的重組病毒載體輸送到患者的癌癥區(qū)域的方法在本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。本發(fā)明的雙鏈分子可以通過適于將雙鏈分子遞送到癌癥部位的任何手段來施用給受試者。例如，雙鏈分子可以通過基因槍、電穿孔、或者其它合適的非消化道或腸內(nèi)施用途徑來施用。合適的腸內(nèi)施用途徑包括口腔、直腸、或鼻內(nèi)遞送。合適的非消化道施用途徑包括膀胱內(nèi)和血管內(nèi)施用(例如靜脈內(nèi)推注、靜脈內(nèi)輸注、動脈內(nèi)推注、動脈內(nèi)輸注和針對血管網(wǎng)絡(luò)的導(dǎo)管滴注)，組織周圍和組織內(nèi)注射(例如腫瘤周圍和腫瘤內(nèi)注射)，皮下注射或沉積，包括皮下輸注(例如利用浸透壓泵)，直接施加到癌癥部位或其附近的區(qū)域，例如借助導(dǎo)管或其它放置裝置(例如，包含多孔性、非多孔性或明膠狀材料的栓劑或植入物)，和吸入。優(yōu)選通過注射或輸注將雙鏈分子或載體施用到癌癥部位或其附近。本發(fā)明的雙鏈分子可以以單一劑量或分多個劑量來施用。當(dāng)本發(fā)明的雙鏈分子的施用為輸注方式時(shí)，輸注可以是單個持續(xù)劑量，或者通過多次輸注來施用。優(yōu)選的是將雙鏈分子直接注射到癌癥部位或其附近的組織中。特別優(yōu)選的是將雙鏈分子多次注射到癌癥部位或其附近的組織中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定用于對給定受試者施用本發(fā)明雙鏈分子的合適劑量方案。例如，雙鏈分子可以一次性施用給受試者，例如以單次注射或者沉積的形式施用到癌癥部位或其附近?；蛘撸p鏈分子可以在約3 約28日、更優(yōu)選約7 約10日的期間內(nèi)每日一次或二次地施用給受試者。在優(yōu)選的劑量方案中，雙鏈分子可以在7日期間內(nèi)一日一次地注射到癌癥部位或其附近。當(dāng)劑量方案要求多次施用時(shí)，應(yīng)該理解的是，給受試者施用的雙鏈分子的有效量，可以包含在整個劑量方案中施用的該雙鏈分子的總量。在本發(fā)明中，可以用至少一種選自下組的活性成分來治療過表達(dá)ERCC6L的癌癥(a)本發(fā)明的雙鏈分子，(b)編碼它們的DNA，和(c)編碼它們的載體。所述癌癥包括但不限于肺癌。因而，在施用本發(fā)明的雙鏈分子作為活性成分之前， 優(yōu)選確認(rèn)要治療的癌細(xì)胞或組織中ERCC6L的表達(dá)水平是否與相同器官的正常細(xì)胞相比升
39高。如此，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療(過)表達(dá)ERCC6L的癌癥的方法，該方法包括下列步驟i)檢測自具有要治療的癌癥的受試者獲得的癌細(xì)胞或組織中ERCC6L的表達(dá)水平；ii)將所述ERCC6L表達(dá)水平與正常對照比較；并iii)對具有與正常對照相比過表達(dá)ERCC6L的癌癥的受試者施用至少一種選自下組的成分(a)本發(fā)明的雙鏈分子，(b)編碼它們的DNA，和(c)編碼它們的載體?；蛘?，本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其包含至少一種選自下組的成分，用于施用于具有過表達(dá)ERCC6L的癌癥的受試者(a)本發(fā)明的雙鏈分子，(b)編碼它們的DNA，和(c)編碼它們的載體。換言之，本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種用于鑒定要用下述各項(xiàng)治療的受試者的方法(a)本發(fā)明的雙鏈分子，(b)編碼它們的DNA，或(C)編碼它們的載體，該方法可包括測定源自受試者的癌細(xì)胞或組織中ERCC6L的表達(dá)水平的步驟，其中所述水平與該基因正常對照相比的升高指示該受試者具有可治療的癌癥。下面會更加詳細(xì)地描述本發(fā)明治療癌癥的方法。要用本方法治療的受試者優(yōu)選為哺乳動物。例示性的哺乳動物包括但不僅限于例如人類、非人靈長類、小鼠、大鼠、犬、貓、馬、和牛。根據(jù)本發(fā)明，測定在自受試者獲得的癌細(xì)胞或組織中ERCC6L的表達(dá)水平。使用本領(lǐng)域已知方法，可在轉(zhuǎn)錄(核酸)產(chǎn)物水平上確定表達(dá)水平。舉例而言，ERCC6L的mRNA可通過雜交方法(例如，Northern雜交)使用探針定量?？稍谛酒蜿嚵猩蠈?shí)施所述檢測。 對檢測ERCC6L的表達(dá)水平而言，優(yōu)選使用陣列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用ERCC6L的序列信息制備上述探針。舉例而言，ERCC6L的cDNA可用作探針。如需要，所述探針可用合適的標(biāo)記物來標(biāo)記，例如染料、熒光物質(zhì)和同位素，且所述基因的表達(dá)水平可以作為發(fā)生了雜交的標(biāo)記物的強(qiáng)度檢測。進(jìn)一步，ERCC6L的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(例如SEQ ID NO 9)可通過基于擴(kuò)增的檢測方法(例如，RT-PCR)使用引物定量。上述引物可基于所述基因的可得序列信息制備。 具體而言，本方法所用的探針或引物在嚴(yán)格條件、中等嚴(yán)格條件或低嚴(yán)格條件下與ERCC6L的mRNA雜交。如本文中所使用的，短語“嚴(yán)格(雜交)條件”是指這樣的條件， 在該條件下，探針或引物將與其靶序列雜交，但不與其它序列雜交。嚴(yán)格條件是依賴于序列的，而且在不同的環(huán)境下會不同。較長序列的特異雜交與較短序列相比在較高溫度下觀察到。一般地，嚴(yán)格條件的溫度選擇比特定序列在限定的離子強(qiáng)度和PH下的熱熔點(diǎn)(Tm)低大約5°C。Tm是(在限定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)平衡狀態(tài)下有50%的與其靶序列互補(bǔ)的探針與靶序列雜交的溫度。因?yàn)榘行蛄幸话氵^量存在，因此在Tm，平衡時(shí)50%的探針被占據(jù)。典型地，嚴(yán)格條件會是這樣的其中鹽濃度小于大約I. OM鈉離子，典型地大約 O. 01-1. OM鈉離子(或其它鹽)，ρΗ7· 0-8. 3，溫度對于較短的探針或引物(例如10-50個核苷酸)是至少大約30°C，對于較長的探針或引物是至少大約60°C。嚴(yán)格條件也可以通過添加去穩(wěn)定劑，例如甲酰胺，來實(shí)現(xiàn)?；蛘?，可以檢測翻譯產(chǎn)物以進(jìn)行本發(fā)明的診斷。例如，可以確定觀察到的蛋白(SEQ ID NO 10)的量。測定作為翻譯產(chǎn)物的蛋白量的方法包括免疫測定法，其使用特異識別所述蛋白的抗體?？贵w可以是單克隆或多克隆的。而且，抗體的任何片段或修飾(例如嵌合抗體、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)均可用于檢測,只要該片段或經(jīng)修飾抗體保留對ERCC6L 蛋白的結(jié)合能力即可。制備這些種類的用于檢測蛋白的抗體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的， 并且在本發(fā)明中可以使用任何方法制備這些抗體和它們的等價(jià)物。作為另一種基于ERCC6L的翻譯產(chǎn)物檢測ERCC6L基因表達(dá)水平的方法，可利用針對ERCC6L蛋白的抗體通過免疫組織化學(xué)分析測量染色的強(qiáng)度。意即，在此測量中，強(qiáng)染色表明所述蛋白質(zhì)的存在/水平增加，且同時(shí)表明ERCC6L基因的高表達(dá)水平。對于靶基因(例如ERCC6L基因)在癌細(xì)胞中的表達(dá)水平而言，如果該水平較之靶基因的對照水平(例如在正常細(xì)胞中的水平)增加了例如10%、25%或50%，或增加到超過I. I倍、超過I. 5倍、超過2. O倍、超過5. O倍、超過10. O倍或者更多的話，可以確定該水平是增加的。對照水平可以與癌細(xì)胞同時(shí)確定，使用先前從疾病狀態(tài)(癌性或非癌性)已知的受試者收集和保存的樣品。另外，自具有要治療的癌癥的器官的非癌性區(qū)獲得的正常細(xì)胞可用作正常對照?；蛘撸瑢φ账娇梢越柚y(tǒng)計(jì)方法，基于通過分析先前測定的來自疾病狀態(tài)已知的受試者的樣品的ERCC6L基因表達(dá)水平獲得的結(jié)果加以確定。進(jìn)一步，對照水平可以是來自先前測試過的細(xì)胞的表達(dá)樣式數(shù)據(jù)庫。而且，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，可以將生物樣品中ERCC6L基因的表達(dá)水平與從多個參考樣品確定的多個對照水平比較。優(yōu)選地使用從來自與源自受試者的生物樣品組織類型相似的組織類型的參考樣品確定的對照水平。而且，優(yōu)選地，使用具有已知的疾病狀態(tài)的群體中ERCC6L基因表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)值。標(biāo)準(zhǔn)值可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法獲得。例如,平均值±2S. D.或平均值±3S. D.的范圍可以用作標(biāo)準(zhǔn)值。在本發(fā)明的背景中，從已知非癌性的生物樣品確定的對照水平稱作“正常對照水平”。另一方面，若對照水平從癌性生物樣品確定，則它稱作“癌性對照水平”。若ERCC6L基因的表達(dá)水平相比于正常對照水平提高了或與癌性對照水平相似/ 等同，則可診斷受試者為具有要治療的癌癥。包含本發(fā)明雙鏈分子的組合物:除上述外，本發(fā)明亦提供了包含本發(fā)明的雙鏈分子或編碼該分子的載體的藥物組合物。本發(fā)明中特別感興趣的是下述[I]至[32]的組合物[I] 一種用于抑制癌細(xì)胞生長或治療癌癥的組合物，其中所述癌癥和癌細(xì)胞表達(dá) ERCC6L基因，該組合物包括至少一種抑制ERCC6L基因表達(dá)和細(xì)胞增殖的分離的雙鏈分子或編碼該雙鏈分子的載體，且其中該分子包含有義鏈及其互補(bǔ)反義鏈，它們彼此雜交以形成該雙鏈分子；
[2] [I]中的組合物，其中所述雙鏈分子作用于mRNA，所述mRNA與靶序列SEQ ID NO :7或8匹配；[3] [2]的組合物，其中所述雙鏈分子，其中有義鏈包含與靶序列SEQ ID NO :7或8 相應(yīng)的序列。[4] [I]的組合物，其中要治療的癌癥是肺癌；[5] [3]的組合物，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長度小于大約100個核苷酸對；[6] [5]的組合物，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長度小于大約75個核苷酸對；[7] [6]的組合物，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長度小于大約50個核苷酸對；[8] [7]的組合物，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長度小于大約25個核苷酸對；[9] [8]的組合物，其中所述雙鏈分子的有義鏈與反義鏈在靶序列處雜交以形成雙鏈分子，該雙鏈分子長度為大約19個到大約25個核苷酸對；[10] [I]的組合物，其中所述雙鏈分子由單一多核苷酸構(gòu)成，所述多核苷酸包含通過間插單鏈連接在一起的有義鏈和反義鏈；[11] [10]的組合物，其中所述雙鏈分子具有通式5' -[A]-[B]-[A/ ]_3'，其中， [A]為包含與靶序列SEQ ID NO :7或8對應(yīng)的序列的有義鏈序列，[B]為由3個 23個核苷酸構(gòu)成的間插單鏈，W ]為包含與靶序列互補(bǔ)的序列的反義鏈；
體；
RNA組成[I]的組合物，其中所述雙鏈分子是RNA ;[I]的組合物，其中所述雙鏈分子是DNA和/或RNA ；[13]的組合物，其中所述雙鏈分子是DNA多核苷酸與RNA多核苷酸的雜合[14]的組合物，其中所述有義鏈多核苷酸與反義鏈多核苷酸分別由DNA與[13]的組合物，其中所述雙鏈分子是DNA與RNA的嵌合體；[14]的組合物，其中反義鏈3’端側(cè)翼的區(qū)域由RNA組成，或者有義鏈5’端側(cè)翼的區(qū)域與反義鏈3’端側(cè)翼的區(qū)域均由RNA組成；[18] [17]的組合物，其中所述側(cè)翼區(qū)域由9到13個核苷酸組成；[19] [I]的組合物，其中所述雙鏈分子包含3’突出端；[20] [I]的組合物，其中所述組合物包括轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑和可藥用的擔(dān)載體。[21] [I]的組合物，其中所述雙鏈分子由載體編碼并包含于組合物中；[22] [21]中的組合物，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子作用于mRNA，所述 mRNA與靶序列SEQ ID NO :7或8匹配；[23] [22]的組合物，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子的有義鏈包含與靶序列 SEQ ID NO :7或8相應(yīng)的序列；[24] [21]至[23]任一的組合物，其中要治療的癌癥是肺癌；[25] [23]的組合物，其中由所述載體編碼的雙鏈分子長度小于大約100個核苷
[26] [25]的組合物，其中由所述載體編碼的雙鏈分子長度小于大約75個核苷酸；[27] [26]的組合物，其中由所述載體編碼的雙鏈分子長度小于大約50個核苷酸；[28] [27]的組合物，其中由所述載體編碼的雙鏈分子長度小于大約25個核苷酸；[29] [28]的組合物，其中由所述載體編碼的雙鏈分子長度為大約19個至大約25 個核苷酸；[30] [21]的組合物，其中由所述載體編碼的所述雙鏈分子由單一多核苷酸構(gòu)成， 所述多核苷酸包含通過間插單鏈連接在一起的有義鏈和反義鏈二者；[31] [30]的組合物，其中所述雙鏈分子具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]_3'，其中， [A]為包含與靶序列SEQ ID NO :7或8對應(yīng)的序列的有義鏈，[B]為由3個 23個核苷酸構(gòu)成的間插單鏈，[A']為包含與靶序列互補(bǔ)的序列的反義鏈；和[32] [21]的組合物，其中所述組合物包含轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑和可藥用的擔(dān)載體。本發(fā)明合適的組合物將在下面更加詳述地加以描述。本發(fā)明的所述雙鏈分子優(yōu)選在施用于受試者之前根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)配制為藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物特征為至少是無菌且不含熱原的。本文中所使用的“藥物組合物”包括適用于人類與獸醫(yī)用的組合物。制備本發(fā)明藥物組合物的方法屬于本領(lǐng)域一般技術(shù)，例如，描述于 Remington’ s Pharmaceutical Science, 17th ed. ，Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)，其全部公開內(nèi)容通過引用包含于本文中。本發(fā)明的藥物組合物包含本發(fā)明的雙鏈分子或編碼它的載體(例如，以重量計(jì)為 0. 到90% )，或所述分子的可藥用鹽，與生理上可接受的載體介質(zhì)混合。制藥學(xué)上可接受的載體介質(zhì)優(yōu)選水、緩沖水、生理鹽水、0. 4%鹽水、0. 3%甘氨酸、透明質(zhì)酸及類似物。根據(jù)本發(fā)明，所述組合物可包含多種雙鏈分子，其中每一種分子可針對相同靶序列或ERCC6L的不同靶序列。舉例而言，所述組合物可包含針對ERCC6L的雙鏈分子?；蛘撸?例如，所述組合物可包含針對ERCC6L的一種、兩種或更多種靶序列的雙鏈分子。而且，本組合物可以包含編碼1個或多個雙鏈分子的載體。例如，所述載體可以編碼1種、2種或數(shù)種本雙鏈分子?；蛘?，本組合物可以包含多種載體，而各載體編碼不同的雙鏈分子。而且，本雙鏈分子可以作為脂質(zhì)體的形式包含在本組合物中。脂質(zhì)體的詳細(xì)內(nèi)容可以參照題為“使用雙鏈分子治療癌癥的方法”的小節(jié)。本發(fā)明的藥物組合物中還可以包含傳統(tǒng)的藥用賦形劑和/或添加劑。合適的藥用賦形劑包括穩(wěn)定化劑、抗氧化劑、浸透壓調(diào)節(jié)劑、緩沖劑、和PH調(diào)節(jié)劑。合適的添加劑包括 生理學(xué)生物相容性的緩沖劑(例如氨基丁三醇鹽酸鹽)、補(bǔ)加螯合劑(例如DTPA或DTPA-雙酰胺等)，或鈣螯合劑復(fù)合物(例如、鈣DTPA、CaNaDTPA-雙酰胺)，或者，任選地，補(bǔ)加鈣或鈉鹽(例如氯化鈣、抗壞血酸酸鈣、葡糖酸鈣或乳酸鈣)。本發(fā)明的藥物組合物可以進(jìn)行包裝以便作為液體使用，或者也可以加以冷凍干燥。對于固體組合物，可以使用常規(guī)的無毒固態(tài)載體；例如，藥物級的甘露醇、乳酸、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、 碳酸鎂等。例如，用于口服施用的固體藥物組合物中可以包含上述列舉的任意載體和賦形劑，以及10-95%，優(yōu)選25-75%的本發(fā)明的一種或多種雙鏈分子。用于氣霧劑(吸入)施用的藥物組合物可以包含0.01-20重量％、優(yōu)選1-10重量％的包被于上述脂質(zhì)體中的一種或多種本發(fā)明的雙鏈分子，以及推進(jìn)劑。還可以根據(jù)需要包含載體，例如用于鼻內(nèi)投遞的卵磷脂等。除上述之外，本組合物中還可以包含其它藥學(xué)活性成分，只要它們不抑制本發(fā)明雙鏈分子的體內(nèi)功能。例如，上述組合物中可以包含常規(guī)用于癌癥治療的化療藥物。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的雙鏈核酸分子在制備用于治療以表達(dá)ERCC6L基因?yàn)樘卣鞯陌┌Y的藥物組合物中的用途。例如，本發(fā)明涉及下述雙鏈核酸分子在制備用于治療表達(dá)ERCC6L基因的癌癥的藥物組合物中的用途該分子在細(xì)胞內(nèi)抑制 ERCC6L基因的表達(dá)，且該分子包含有義鏈和與之互補(bǔ)的反義鏈，二者彼此雜交而形成該雙鏈核酸分子，且該分子以序列SEQ ID NO :7或8為靶標(biāo)。本發(fā)明進(jìn)一步提供在治療表達(dá)ERCC6L基因的癌癥中使用的本發(fā)明雙鏈核酸分子。或者，本發(fā)明還提供生產(chǎn)用于治療以表達(dá)ERCC6L基因?yàn)樘卣鞯陌┌Y的藥物組合物的方法或工藝，其中該方法或工藝包括將藥學(xué)或者生理學(xué)可接受的載體與作為活性成分的下述雙鏈核酸分子一起制劑化的步驟，其中所述雙鏈核酸分子抑制過表達(dá)ERCC6L基因的細(xì)胞內(nèi)該基因的表達(dá)，且該分子包含有義鏈和與之互補(bǔ)的反義鏈，二者彼此雜交而形成該雙鏈核酸分子，且該分子以序列SEQ ID NO :7或8為靶標(biāo)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供生產(chǎn)用于治療以表達(dá)ERCC6L基因?yàn)樘卣鞯陌┌Y的藥物組合物的方法或工藝，其中所述方法或工藝包括將活性成分與藥學(xué)上或生理學(xué)上可接受的載體混合的步驟，其中所述活性成分是這樣的雙鏈核酸分子，其在過表達(dá)ERCC6L 基因的細(xì)胞中抑制ERCC6L的表達(dá)，該分子包含有義鏈與與其互補(bǔ)的反義鏈，二者相互雜交以形成雙鏈核酸分子，并以序列SEQ ID NO :7或8為靶標(biāo)。下面，本發(fā)明將參考實(shí)施例進(jìn)行更加詳細(xì)的介紹。然而，下面的材料、方法和實(shí)施例僅僅是舉例說明本發(fā)明的多個方面，并不意圖對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。因此，與這里所述相似或等價(jià)的方法和材料也可以用于實(shí)施或測試本發(fā)明。除非特別定義，否則這里使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所共同理解的相同的意思。下面描述了合適的方法和材料，雖然與在此描述的相似或等同的方法和材料亦可用于實(shí)踐或測試本發(fā)明。本文通過提述并入本文中提及的所有出版物、專利申請、專利及其他參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容。如果有沖突，當(dāng)以本說明書包括定義在內(nèi)為準(zhǔn)。此外，所述材料、方法和實(shí)施例均只是例示的目的，而不意在構(gòu)成限制。
實(shí)施例本發(fā)明將于下列實(shí)施例中進(jìn)一步加以描述，其并不對權(quán)利要求中描述的本發(fā)明范圍進(jìn)行限定。實(shí)施例1 通用方法肺癌細(xì)胞系和組織樣品。此項(xiàng)研究中使用的人肺癌細(xì)胞系如下肺腺癌A427，NCI-H1781, AM9，和LC319 ； 肺鱗狀細(xì)胞癌(SCC) NCI-H226，EBC-I, NCI-H520，和 NCI-H2170 ；和 SCLC DMS114, DMS273, SBC-3，SBC-5, H196，和H446。所有細(xì)胞在補(bǔ)充有10% FCS的適宜培養(yǎng)基中以單層培養(yǎng)并在含5% CO2的增濕空氣的氣氛中于37°C維持。人小氣道上皮細(xì)胞(SAEC)在購自Cambrex Bio Science, Inc的經(jīng)過優(yōu)化的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。原發(fā)性肺癌組織樣品在知情同意下獲得， 如先前所述(Kikuchi T, et al. Oncogene 2003 ；22 :2192-205. , Taniwaki M et al. Int J Oncol 2006 ；29 :567-75.)。此項(xiàng)研究和所有臨床材料的使用得到了各個科研倫理委員會批準(zhǔn)。半定量逆轉(zhuǎn)錄-PCR。使用該TRIzol試劑(Life Technologies, Inc.)依照制造商的方案自培養(yǎng)的細(xì)胞提取總RNA。用DNA酶I (Nippon Gene)處理提取的RNA并使用寡(dT)引物和 superscript II進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。用下述合成ERCC6L特異性引物或作為內(nèi)部對照的β -肌動蛋白(ACTB)特異性引物進(jìn)行半定量逆轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)實(shí)驗(yàn)ERCC6L，5，-AAAAATCCAG GAGGCCCTAA-3'(SEQ ID NO 1)和 5，-AGATCTTTCTTGCCTTAAGCCTG-3，(SEQ ID NO 2) ；ACTB, 5，-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3，(SEQ ID NO 3)和 5，-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3，(SEQ ID NO :4)。優(yōu)化PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)以確保產(chǎn)物強(qiáng)度在擴(kuò)增的線性期內(nèi)。Northern 印跡分析。將人多組織印跡(BD Biosciences Clontech)與ERCC6L的32P標(biāo)記的PCR產(chǎn)物雜交。使用上文所述引物通過RT-PCR制備ERCC6L的cDNA探針。預(yù)雜交、雜交、和清洗依照供應(yīng)商的推薦進(jìn)行。將印跡于室溫用增強(qiáng)BAS屏(Bio-Rad)放射自顯影30小時(shí)。免疫熒光分析。將細(xì)胞涂布在玻璃蓋玻片(Becton Dickinson Labware)上，用4%低聚甲醛固定，并通過用含0.1 ^Triton X-100的PBS于室溫處理3分鐘使得其可通透。用 CASBL0CK(ZYMED)于室溫封閉非特異性結(jié)合10分鐘。然后把細(xì)胞與作為一抗的在含有3% BSA的PBS中稀釋的小鼠單克隆抗myc抗體一起于室溫溫育60分鐘。用PBS清洗后，細(xì)胞用 Alexa Fluor 488綴合的二抗(Molecular Probes)于室溫染色60分鐘。再次用PBS清洗后，每個標(biāo)本用含有4’，6’ -二脒-2’ -苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)的Vectashield(Vector Laboratories, Inc.)豸固并用 Spectral Confocal Scanning Systems (TSC SP2A0BS Leica Microsystems)顯現(xiàn)。RNA干擾測定法。本發(fā)明人先前建立了基于載體的RNA干擾系統(tǒng)，psiHlBX3.0，其設(shè)計(jì)成在哺乳動物細(xì)胞中合成小干擾 RNA(siRNA) (Suzuki C et al. Cancer Res2003 ;63 :7038-41.)。使用30微升LipofectAMINE 2000 (Invitrogen)將10微克siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入肺癌細(xì)胞系SBC-5中。將經(jīng)過轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在適宜濃度的遺傳霉素(G418)存在下培養(yǎng)7天；通過吉姆薩染色對集落數(shù)目計(jì)數(shù)；并在處理后7天通過溴化3- (4，5- 二甲基噻唑-2-基)-2， 5-二苯基四唑測定法評估細(xì)胞存活力。簡言之，將細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8溶液(Doiindo) 以1/10體積的濃度添加至每個盤，并將平板于37°C再溫育2小時(shí)。然后用Microplate Reader 550 (Bio-Rad)測量490nm的和作為參照的630nm的吸光度。為了確認(rèn)對ERCC6L mRNA表達(dá)的阻抑，依照標(biāo)準(zhǔn)方案用下述合成ERCC6L特異性引物進(jìn)行半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)。 用于RNA干擾的合成寡核苷酸的靶序列如下對照1 (螢光素酶/LUC 螢火蟲(W1Otinus pyralis)螢光素酶基因)，5，-CGTACGCGGAATACTTCGA-3，(SEQ ID NO 5)；對照 2(EGFP:基因，水母(Aequorea victoria)GFP 的突變體)，5，-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3，(SEQ ID N0:6) ;siRNA-ERCC6L-#A，5，-CTGCACAACCAACTCTTTG-3，(SEQ ID NO 7) ；siRNA_ERCC6L_#B， 5，-ATGTTAATCAATAACTGGC-3，(SEQ ID NO :8)。Western 印跡。細(xì)胞用含有蛋白酶抑制劑混合物組III (Calbiochem)的放射免疫沉淀測定緩沖液[50mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0), 150mmol/L NaCl，1 % NP40，0· 5%脫氧膽酸鈉，0· 1 % SDS] 裂解。將蛋白質(zhì)樣品通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠來分開并電印跡到Hybond-ECL硝酸纖維素膜(GE Healthcare Bio-Sciences)上。將印跡與小鼠單克隆抗myc抗體一起溫育。使用綴合有辣根過氧化物酶的二抗(GE Healthcare Bio-Sciences)來檢測抗原-抗體復(fù)合物。 通過增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光Astern印跡檢測試劑(GE Healthcare Bio-Sciences)來顯現(xiàn)蛋白質(zhì)條帶。細(xì)胞生長測定。將ERCC6L的完整編碼序列克隆入pcDNA3. Imyc-His質(zhì)粒載體(Invitrogen)的適宜位點(diǎn)。將用表達(dá)帶myc-His標(biāo)簽的ERCC6L的質(zhì)?；蛴媚M質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的C0S-7細(xì)胞在含有10% FCS的DMEM中在適宜濃度的遺傳霉素(G418)存在下培養(yǎng)8天。通過MTT測定來評價(jià)細(xì)胞存活力；簡言之，將細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8溶液(D0JIND0)以1/10體積的濃度添加至每個盤，并將平板于37°C再溫育12小時(shí)。然后用Microplate Reader 550 (BIO-RAD)測量作為參照的450nm的吸光度。實(shí)施例2 肺腫瘤和正常組織中的ERCC6L表達(dá)。為了搜索用于開發(fā)肺癌的治療劑和/或診斷性生物標(biāo)志物的新靶分子，首先通過cDNA微陣列分析篩選在101份肺癌樣品的過半數(shù)中顯示3倍或更高的表達(dá)水平的基因(Daigo Y, et al. Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008 ；56 :43-53. ；Kikuchi T, et al.Oncogene 2003 ；22 :2192-205. ；Kakiuchi S，et al. Mol Cancer Res 2003 ； 1 :485-99.； Kakiuchi S, et al. Hum Mol Genet 2004 ； 13 :3029-43. ；Kikuchi Τ, et al. Int J Oncol 2006；28 :799-805. ；Taniwaki Μ, et al. Int J 0ncol2006 ；29 :567-75.)。在篩選的27，648種基因中，在絕大多數(shù)檢查的肺癌中鑒定出ERCC6L過表達(dá)，并通過半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了它在10/15份另外的肺癌組織中和13/14種肺癌細(xì)胞系中的的反式激活(圖IA和IB)。Northern印跡分析顯示了 ERCC6L在正常組織中不表達(dá)，但是在肺癌細(xì)胞系中強(qiáng)表達(dá)(圖1C)。實(shí)施了免疫熒光分析來檢查外源ERCC6L在C0S-7細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。ERCC6L主要在細(xì)胞質(zhì)中檢測到，而在細(xì)胞核中微弱檢出(圖1D)。實(shí)施例3 針對ERCC6L的siRNA對肺癌細(xì)胞生長的抑制。為了評估ERCC6L對于肺癌細(xì)胞的生長或存活是否是必需的，構(gòu)建了表達(dá)針對 ERCC6L的siRNA的質(zhì)粒(si_ERCC6L-#A和-#B)以及對照質(zhì)粒(用于螢光素酶(LUC)和 EGFP的siRNA)并將它們轉(zhuǎn)染入強(qiáng)表達(dá)ERCC6L的SBC-5和A549細(xì)胞中。用si_ERCC6L_#A 或_#B轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的ERCC6L-mRNA水平與用任一對照siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比顯著降低 (圖2A)。觀察到可存活細(xì)胞數(shù)的顯著降低(圖2B和2C)。實(shí)施例4 :ERCC6L的生長促進(jìn)效應(yīng)。為了披露ERCC6L在腫瘤發(fā)生中的潛在作用，制備了設(shè)計(jì)成表達(dá)ERCC6L的質(zhì)粒 (pcDNA3. 1/myc-His A載體)或模擬載體來測定ERCC6L對哺乳動物細(xì)胞生長的影響，使用幾乎不表達(dá)內(nèi)源ERCC6L的C0S-7細(xì)胞生成了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染子。瞬時(shí)表達(dá)外源ERCC6L的細(xì)胞揭示了與模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比顯著的生長促進(jìn)(圖3A和3B)。討論近來，用于癌癥治療的新分子靶的鑒定和表征的加快使相當(dāng)大的興趣聚焦于新型抗癌劑的開發(fā)(Daigo Y, et al. Gen Thorac Cardiovasc Surg2008 ；56 :43-53. ；Kikuchi T, et al.Oncogene 2003；22 :2192-205. ；Kakiuchi S, et al. Mol Cancer Res 2003 ； 1 485-99. ；Kakiuchi S, et al. Hum Mol Genet2004 ； 13 :3029-43. ；Kikuchi T, et al. Int J Oncol 2006 ；28 :799-805. ；Taniwaki M, et al. Int J Oncol 2006 ；29 :567-75.)。迄今，眾多靶向療法正在對肺癌進(jìn)行調(diào)查，但是有響應(yīng)的腫瘤類型的范圍以及治療的有效性仍然非常有限。由于它的作用機(jī)制明確，分子靶向性藥物預(yù)期對惡性細(xì)胞具有高度的特異性，而且不良效應(yīng)最低。作為針對該目的的一種途徑，一種有希望的策略是將在癌細(xì)胞中過表達(dá)的有效鑒定基因的基因組范圍表達(dá)分析的力量與借助RNAi技術(shù)的功能喪失效應(yīng)高通量篩選結(jié)合起來(Suzuki C, et al. Cancer Res 2003 ；63 :7038-41.； Ishikawa N, et al. Clin Cancer Res 2004 ； 10 :8363-70. ；Kato Τ, et al. Cancer Res 2005 ；65 :5638-46. ；Furukawa C, et al. Cancer Res 2005 ；65 :7102-10. ；Ishikawa N, et al.Cancer Res2005 ；65 :9176-84. ；Suzuki C, et al. Cancer Res 2005 ；65 :11314-25.； Ishikawa N, et al.Cancer Sci 2006 ；97 :737-45. ；Takahashi K, et al.Cancer Res2006 ； 66 :9408-19. ；Hayama S, et al. Cancer Res 2006 ；66 :10339-48.)。使用這種組合手段，已經(jīng)證明ERCC6L在臨床肺癌癥樣品和細(xì)胞系中頻繁過表達(dá)， 且其基因產(chǎn)物在肺癌細(xì)胞的生長和進(jìn)展中發(fā)揮不可缺少的作用。在本發(fā)明中，用特異性SiRNA處理肺癌細(xì)胞以敲低ERCC6L表達(dá)，導(dǎo)致對癌細(xì)胞生長的阻抑。本發(fā)明人還顯示了別的證據(jù)來支持這種途徑在癌發(fā)生中的意義；例如，在體外， ERCC6L的表達(dá)導(dǎo)致對細(xì)胞生長的顯著促進(jìn)。獲得的結(jié)果強(qiáng)烈提示ERCC6L有可能是肺癌細(xì)胞的重要生長因子，盡管許多癌細(xì)胞中ERCC6L表達(dá)水平升高背后的分子機(jī)制仍然有待澄清。因?yàn)镋RCC6L應(yīng)當(dāng)歸類為癌癥特異性抗原之一，所以通過分子靶向劑選擇性抑制ERCC6L 活性將會是一種有希望的治療策略，預(yù)期其可具有強(qiáng)的抗癌癥生物學(xué)活性，并且不良事件的風(fēng)險(xiǎn)最低?？傊?，ERCC6L的激活對癌細(xì)胞的生長具有特異性的功能作用。數(shù)據(jù)強(qiáng)烈暗示設(shè)計(jì)特異性靶向ERCC6L的致瘤活性的新抗癌藥物用于治療肺癌患者的可能性。工業(yè)應(yīng)用性本文中提供的數(shù)據(jù)增加對癌癥的綜合理解，便于開發(fā)新穎診斷策略，并為鑒定治療藥和預(yù)防劑的分子靶提供線索。此類信息有助于更加深刻地理解腫瘤發(fā)生，并為開發(fā)用于診斷、治療、和最終預(yù)防癌癥的新穎策略提供指標(biāo)。特別地，本文中描述的使用激光捕捉解剖和基因組范圍cDNA微陣列的組合的癌癥的基因表達(dá)分析鑒定出ERCC6L為在癌癥中與正常器官相比顯著升高的基因。因此，它可用于癌癥預(yù)防和治療的背景。例如，鑒于它的差異表達(dá)，ERCC6L可方便地作為分子診斷標(biāo)志物用于鑒定和檢測癌癥，特別是肺癌。因而，ERCC6L基因及由其編碼的蛋白可用于癌癥的診斷試劑盒和測定法。本發(fā)明進(jìn)一步證明細(xì)胞生長可受到特異性靶向ERCC6L基因的雙鏈核酸分子阻抑。因此，該雙鏈核酸分子可用于開發(fā)抗癌藥物。另外，ERCC6L多肽是用于開發(fā)抗癌藥物的有用靶標(biāo)。例如，阻斷ERCC6L蛋白的表達(dá)或阻止其活性的物質(zhì)可在治療上用作抗癌劑， 特別是用于治療肺癌的抗癌劑。通過述及將本文中引用的所有出版物、數(shù)據(jù)庫、序列、專利、和專利申請收入本文。雖然已經(jīng)詳細(xì)地且參照其具體實(shí)施方案描述本發(fā)明，要理解，前面的描述在性質(zhì)上是例示性的和解釋性的，而且意圖例示本發(fā)明及其優(yōu)選實(shí)施方案。通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會容易地認(rèn)識到可以在其中進(jìn)行各種改變和修改，不偏離本發(fā)明的精神和范圍。 如此，本發(fā)明意圖不受上文描述限定，而是由所附權(quán)利要求及其等同方案限定。
權(quán)利要求
1.一種在受試者中檢測或診斷癌癥或發(fā)生癌癥的傾向性的方法，包括測定源自受試者的生物樣品中ERCC6L基因的表達(dá)水平的步驟，其中所述水平與所述基因的正常對照水平相比的升高指示所述受試者罹患或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生癌癥，其中該表達(dá)水平是通過選自下組的任何一種方法測定的(a)檢測ERCC6L基因的mRNA；(b)檢測由ERCC6L基因編碼的蛋白質(zhì)；和(c)檢測由ERCC6L基因編碼的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述升高比所述正常對照水平高至少10%。
3.權(quán)利要求I的方法，其中所述源自受試者的生物樣品為活檢樣品。
4.權(quán)利要求I的方法，其中所述癌癥為肺癌。
5.一種用于診斷癌癥的試劑盒，其包含選自下組的試劑(a)用于檢測ERCC6L基因的mRNA的試劑；(b)用于檢測由ERCC6L基因編碼的蛋白質(zhì)的試劑；和(c)用于檢測由ERCC6L基因編碼的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的試劑。
6.權(quán)利要求5的試劑盒，其中該試劑為針對ERCC6L的基因轉(zhuǎn)錄物的探針或引物組，或針對由ERCC6L基因編碼的蛋白質(zhì)的抗體。
7.一種篩選用于治療和/或預(yù)防癌癥或抑制癌細(xì)胞生長的候選物質(zhì)的方法，所述方法包括下述步驟(a)使測試物質(zhì)與ERCC6L多肽或其片段接觸；(b)檢測該多肽或該片段和該測試物質(zhì)之間的結(jié)合活性；并(c)選擇結(jié)合該多肽或該片段的測試物質(zhì)作為用于治療或預(yù)防癌癥的候選物質(zhì)。
8.一種篩選用于治療和/或預(yù)防癌癥或抑制癌細(xì)胞生長的候選物質(zhì)的方法，所述方法包括下述步驟(a)使測試物質(zhì)與表達(dá)ERCC6L基因的細(xì)胞接觸；(b)檢測步驟(a)的細(xì)胞中ERCC6L基因的表達(dá)水平；并(c)選擇與在該測試物質(zhì)不存在時(shí)檢測到的ERCC6L基因的表達(dá)水平相比降低步驟(b) 中檢測到的表達(dá)水平的測試物質(zhì)。
9.一種篩選用于治療和/或預(yù)防癌癥或抑制癌細(xì)胞生長的候選物質(zhì)的方法，所述方法包括下述步驟(a)使測試物質(zhì)與ERCC6L多肽或其片段接觸；(b)檢測步驟(a)的該多肽或該片段的生物學(xué)活性；并(C)選擇與在該測試物質(zhì)不存在時(shí)檢測到的生物學(xué)活性相比阻抑步驟(b)中檢測到的該多肽或該片段的生物學(xué)活性的測試物質(zhì)。
10.權(quán)利要求9的方法，其中該生物學(xué)活性為細(xì)胞增殖活性。
11.一種篩選用于治療和/或預(yù)防癌癥或抑制癌細(xì)胞生長的候選物質(zhì)的方法，所述方法包括下述步驟a)使測試物質(zhì)與其中導(dǎo)入有載體的細(xì)胞接觸，該載體包含ERCC6L基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和在該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制下表達(dá)的報(bào)告基因，b)測量步驟(a)中所述報(bào)告基因的表達(dá)或活性；并c)選擇與在該測試物質(zhì)不存在時(shí)的表達(dá)和/或活性水平相比降低步驟(b)中檢測到的所述報(bào)告基因的表達(dá)和/或活性水平的物質(zhì)。
12.權(quán)利要求7、8、9和11中任一項(xiàng)的方法，其中所述癌癥為肺癌。
13.一種分離的雙鏈分子，其包含有義鏈及與之互補(bǔ)的反義鏈，其中所述鏈彼此雜交以形成該雙鏈分子，其中該有義鏈包含與選自SEQ ID NO 7和8的靶序列對應(yīng)的核苷酸序列，且其中所述雙鏈分子在導(dǎo)入表達(dá)ERCC6L基因的細(xì)胞中時(shí)抑制該基因的表達(dá)以及細(xì)胞增殖。
14.權(quán)利要求13的雙鏈分子，其中所述有義鏈與反義鏈在所述靶序列處雜交以形成該雙鏈分子，該雙鏈分子的長度為19-25個堿基對。
15.權(quán)利要求13的雙鏈分子，其中該雙鏈分子在所述有義鏈和/或所述反義鏈的3’端具有一個或兩個3’突出端。
16.權(quán)利要求13的雙鏈分子,其中所述雙鏈分子為單一多核苷酸,該單一多核苷酸包含經(jīng)由單鏈核苷酸序列連接的所述有義鏈和所述反義鏈。
17.權(quán)利要求16的雙鏈分子，其中所述多核苷酸具有通式5’-[幻-[8]-[么’]-3’，其中 [A]為有義鏈；[B]為由約3至約23個核苷酸組成的核苷酸序列；且[A’ ]為反義鏈。
18.權(quán)利要求17的雙鏈分子，其中[A]包含與選自SEQID NO 7和8的核苷酸序列對應(yīng)的核苷酸序列。
19.一種載體，其編碼權(quán)利要求13至18中任一項(xiàng)的雙鏈分子。
20.一種在受試者中治療和/或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括對所述受試者施用藥學(xué)有效量的針對ERCC6L基因的雙鏈分子或編碼該雙鏈分子的載體、以及可藥用的擔(dān)載體的步驟，其中該雙鏈分子在導(dǎo)入表達(dá)ERCC6L基因的細(xì)胞中時(shí)抑制ERCC6L基因的表達(dá)以及細(xì)胞增殖。
21.權(quán)利要求20的方法，其中該雙鏈分子為權(quán)利要求13的雙鏈分子。
22.權(quán)利要求20的方法，其中該載體為權(quán)利要求19的載體。
23.權(quán)利要求20的方法，其中要治療的癌癥為肺癌。
24.一種用于治療和/或預(yù)防癌癥的組合物，所述組合物包含藥學(xué)有效量的針對 ERCC6L基因的雙鏈分子或編碼該雙鏈分子的載體，以及可藥用的擔(dān)載體，其中該雙鏈分子在導(dǎo)入表達(dá)ERCC6L基因的細(xì)胞中時(shí)抑制ERCC6L基因的表達(dá)以及細(xì)胞增殖。
25.權(quán)利要求24的組合物，其中該雙鏈分子為權(quán)利要求13的雙鏈分子。
26.權(quán)利要求24的組合物，其中所述載體為權(quán)利要求19的載體。
27.權(quán)利要求24的組合物，其中要治療的癌癥為肺癌。
全文摘要
本文中描述用于診斷癌癥，特別是肺癌發(fā)生傾向性的客觀方法。本發(fā)明提供利用ERCC6L的表達(dá)水平作為癌癥的指標(biāo)的診斷方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供篩選可用于治療ERCC6L相關(guān)疾病，諸如癌癥，例如肺癌的治療性物質(zhì)的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供抑制細(xì)胞生長和治療或緩解ERCC6L相關(guān)疾病的一種或多種癥狀的方法。本發(fā)明的特征還在于雙鏈分子，以及含有該雙鏈分子的載體和組合物。
文檔編號C12N15/113GK102597236SQ20108004821
公開日2012年7月18日 申請日期2010年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月25日
發(fā)明者中村佑輔, 角田卓也, 醍醐彌太郎 申請人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司