專利名稱：：與多種cc趨化因子結合的抗因子抗體的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及抗因子抗體(antikineantibody)或者與2、3、4、5種或更多種CC趨化因子(CC趨化因子也被稱為“￠-趨化因子”)相結合的抗體，特別是與選自RANTES/CCL5、MIP-Ia/CCL3、MIP-I^/CCL4和MCP-1/CCL2之至少2種趨化因子相結合的那些抗體。與僅跟一種CC趨化因子結合的抗體不同，抗因子抗體通過一次結合、檢測和/或中和多于一種CC趨化因子，從而在實踐中解決了CC趨化因子之間功能冗余的問題。本發(fā)明的另一些方面包括抗因子抗體的診斷和治療用途，包括治療由CC趨化因子介導的病癥、功能異?；蚣膊?；產生抗因子抗體的雜交瘤細胞系以及通過序貫免疫產生雜交瘤的方法；使抗因子抗體人源化的方法；以及通過親和力成熟來改善抗因子抗體的方法。相關技術描述趨化因子是炎癥的關鍵介導物，并且參與自身免疫病的發(fā)生(Viola和Luster，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.48:171-197(2008))。它們在炎癥或感染部位產生，并誘導白細胞從循環(huán)遷移到組織中。長久以來一直在尋找對于由趨化因子介導之炎癥或免疫過程進行調節(jié)的簡單且有效的方法。大量不同的趨化因子及其受體在功能上的冗余和重疊使這些嘗試變得復雜。例如，已在臨床前動物模型中使用趨化因子抑制劑來治療自身免疫性病癥，但是尚未在臨床上成功地用于治療自身免疫性適應癥。已提出，這種效力缺乏可能是由于趨化因子功能冗余所致。已鑒定出超過50種不同的趨化因子，每種都具有不同的結構和功能特性。一些趨化因子的特異性發(fā)生重疊，也就是說，它們與同一類型的受體結合或者作用于相似類型的細胞(Vergunst等人,ArthritisRheum.58:1931-1939(2008))。特定的趨化因子可以與多于一種趨化因子受體類型結合，給定的趨化因子受體可以與多于一種趨化因子類型結合。因此，非常期望開發(fā)出能夠結合趨化因子、阻斷趨化因子與受體結合或者中和多于一種趨化因子之活性的單一試劑。趨化因子(由趨化性細胞因子而得名)是小的分泌型多肽，其調節(jié)免疫細胞向組織中的移動(Baggiolini等人,Adv.Tmmuno1.55:97-179(1994);0ppenheim等人,Ann.Rev.Immunol.9:617-648(1991))。所有趨化因子都具有由保守性半胱氨酸殘基之間的二硫鍵穩(wěn)定的希臘鑰匙(Greekkey)結構。然而，基于這些保守性半胱氨酸殘基的數目和位置，趨化因子進一步分成4個不同的家族。a-和￠-趨化因子各自包含4個保守性半胱氨酸殘基。a-趨化因子的前兩個半胱氨酸被單個氨基酸分隔開，因而形成特征性的CXC氨基酸基序?！?趨化因子的前兩個保守性半胱氨酸是相鄰的。因此，￠-趨化因子也被稱為CC趨化因子。與之不同地，淋巴細胞趨化因子(Iymphotactin)是第三類XC趨化因子的唯一成員，其僅含有第二和第四個保守性半胱氨酸殘基。第四類趨化因子(唯一成員是fractalkine)是CXXXC(或CX3C)類型，其中由3個氨基酸將前兩個保守性半胱氨酸分隔開。在人類中，a-趨化因子主要由第4號染色體上的基因簇編碼，￠-趨化因子主要由第17號染色體上的基因編碼。淋巴細胞趨化因子編碼于第I號染色體上，fractalkine編碼于第16號染色體上。趨化因子形成梯度，其用作免疫細胞以及其它細胞(例如單核細胞、巨噬細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、T淋巴細胞和成纖維細胞)的化學引誘物和潛在增殖信號。CC趨化因子通過形成由趨化性細胞所識別的濃度梯度而表現出化學引誘物性質；CC趨化因子還是特定細胞類型包括成纖維細胞和免疫細胞(例如單核細胞、巨噬細胞、T淋巴細胞、嗜堿性粒細胞和嗜酸性粒細胞)的增殖信號。趨化因子(包括CC趨化因子)的靶受體和革巴細胞由Viola等人,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.48171-197(2008)描述(參見圖I)，該文獻中關于CC趨化因子的化學引誘物和信號傳導功能的教導通過引用并入本文。趨化因子共有與特定趨化因子功能(例如與趨化因子受體結合)相關的結構性征。共同的結構包括位于第一個半胱氨酸殘基之前的延長的N末端區(qū)段(N末端結構域)，N環(huán)，31(|螺旋，P鏈(M、@2和33)，30’s、40’s、50s環(huán)；二硫鍵位置以及C-末端a-螺旋區(qū)段。這些以及其它CC趨化因子結構(包括不同CC趨化因子之間的保守性或同源性氨基酸殘基，以及CC趨化因子中的溶劑可及的(solvent-accessible)、部分溶劑可及的和掩蔽的氨基酸)通過引用Fernandez等人，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.42:469-99(2002)(參見圖I和2)而并入。完整、未變性的趨化因子中的掩蔽氨基酸殘基不太可能形成趨化因子與抗體接觸的表位或抗原決定簇。相比之下，暴露于溶劑或表面的CC趨化因子殘基更易于與抗體結合。與CCL3/MIP-1a的趨化因子受體結合相關的CC趨化因子殘基包括SEQIDNO71的殘基11-15(CCFSY),殘基17-24(SRQIPQNF)、殘基34-35(QC)和殘基57-67(EffVQKYVSDLE)；與CCL4/MIP-1P的趨化因子受體結合相關的殘基包括SEQIDNO:72的殘基11-15(CCFSY)、殘基17-24(ARKLPHNF)、殘基34-35(LC)或殘基57-67(SffVQEYVYDLE)；與CCL5/RANTES的結合相關的殘基包括SEQIDNO:73的殘基10-14(CCFAY)、殘基16-23(ARPLPRAH)、殘基33-34(KC)或殘基56-66(KffVREYINSLE)；與CCL23/MPIF-1的結合相關的殘基包括SEQIDNO:81的殘基9-13(CCISY)、殘基15-22(PRSIPCSL)、殘基32-33(EC)或殘基55-65(KQVQVCMRMLK)；以及與CCL15/HCC-2相關的殘基包括SEQIDNO79的殘基8-12(CCTSY)、殘基14-21(SQSIPCSL)、殘基31-32(EC)或殘基54-64(PGVQDCMKKLK)。其它CC趨化因子的相應氨基酸殘基由例如Fernandez等人,2002(同上)的圖I所示。CC趨化因子的保守性結構域公開于http://www.ncbi.nlm.nih.rov/0該結構數據通過引用在2010年8月24日最后一次登錄時上述網站上的蛋白質和保守性結構域數據庫信息而并入。CC趨化因子類型中的趨化因子與稱作“CC趨化因子受體”或“CCR”的七次跨膜G蛋白偶聯受體相互作用(Rossi和Zlotnik,Ann.Rev.Immunol.18:217-242(2002))。趨化因子與其受體的相互作用調節(jié)粘附分子的活化，并且影響免疫細胞從循環(huán)滲出和溢出進入組織中。已顯示，趨化因子參與多種炎性和免疫學病癥、功能異常和疾病的發(fā)生和維持。這些包括類風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、動脈粥樣硬化癥、銀屑病、炎性腸病(包括克羅恩病(Crohn’sdisease)、潰瘍性結腸炎、乳糜瀉)、血管再狹窄、狼瘡腎炎、腎小球腎炎、移植排異、硬皮癥、纖維化疾病、哮喘(和其它肺部炎性病癥)。例如，在患有類風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥(multiplesclerosis,MS)、動脈粥樣硬化癥等的患者的受影響組織中,CC趨化因子的水平升高。這些疾病的臨床前動物模型顯示，抑制個體趨化因子可以至少部分地改善疾病癥狀。例如，Kasama等人，J.Clin.Invest.95:2868-2876(1995)表明，在類風濕性關節(jié)炎的嚙齒類動物模型中，施用抑制MIP-Ia/CCL3的抗體能夠使關節(jié)炎的臨床評分降低約50%。類似地，Ogata等人，J.Pathol.182:106-114(1997)顯示，抗MCP-1/CCL2抗體能夠使關節(jié)腫脹減少約30%。MIP-Ia/CCL3的受體(包括CCRl和CCR5)和MCP-1/CCL2的受體(CCR2)在白細胞中以重疊模式表達，因此針對MIP-Ia/CCL3和MCP-1/CCL2兩者的抑制劑有可能比針對單獨每種趨化因子的個體抑制劑更加有效。Viola等人,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.48:171-197(2008)公開了與此類CC趨化因子相關或由其介導之特定疾病和病癥的種類或類型，其通過引用并入本文。趨化因子活性的天然抑制劑是已知的，并且已開發(fā)了特異性藥劑(例如與特定趨化因子結合或干擾其活性的抗體或小分子抑制劑)，參見Fernandez等人，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.42:469-99(2002)，這些抑制劑和藥劑通過引用上述文獻(參見例如第482-488頁)而并入。牛痘和相關痘病毒產生稱為“vCCI”(SEQIDN0:117)的可溶性35kD蛋白，其結合并抑制CC型趨化因子中的多種趨化因子。CC型趨化因子一般作用于白細胞，包括T細胞和單核細胞(Smith等人，Virology236:316-327(1997);Burns等人，J.Biol.Chem.277:2785-2789(2002))。已顯示，在慢性炎性疾病的幾種模型(包括實驗性自身免疫性腦炎(Jones等人，Cytokine43:220-228(2008))和哮喘(Dabbagh等人，J.Immunol.165=3418-3422(2000)))中，重組vCCI可以有效地減少白細胞浸潤。然而，使用對于對象免疫系統(tǒng)來說是外來性的天然物質(例如病毒蛋白，如vCCI)產生了安全問題。施用諸如vCCI的物質可引起不期望的生理或免疫應答，并且這些物質可作為外來物被宿主的清除或防御機制中和、去除或破壞?；谶@一考慮，本發(fā)明人關注于開發(fā)生產如下抗體(尤其是人源化抗體)的方法，所述抗體能夠特異性地結合以及中和多于一種趨化因子，但不會引起與例如vCCI分子相關的風險?，F有技術中的趨化因子抑制劑(例如與單一CC趨化因子結合的抗體)受制于CC趨化因子受體的冗余問題。例如，CCL3/MIP-la和CCL5/RANTES均與趨化因子受體I(CCRl)和5(CCR5)結合(參見Viola，2008(同上)的圖I)。僅僅抑制與這些趨化因子受體結合之CCL3的抗體不能阻止由其它CC趨化因子(例如CCL5)之結合引起的受體活化。本發(fā)明人最初將構成趨化因子受體CCRl和CCR5之主要配體的CC趨化因子MIP-Ia/CCL3、MIP-I^/CCL4和RANTES/CCL5作為目標。還將作為CCR2之配體的CCL2/MCP-I作為目標。如Viola等人,2008(同上)的圖I所示,這些受體廣泛表達于單核細胞和T細胞上，以及表達于其它白細胞亞群上。已顯示它們參與臨床前動物疾病模型和人類疾病中的多種炎性疾病狀態(tài)。發(fā)明簡述本發(fā)明的一個方面是可與至少2、3、4、5、6或7種或者更多種不同的CC趨化因子結合的分離的抗因子抗體或其抗原結合片段?？挂蜃涌贵w的一個實例是可與2種或更多種CC趨化因子(包括與趨化因子受體CCRl、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9或CCRlO相互作用的至少一種CC趨化因子)結合的抗因子抗體。在另一個實施方案中，抗因子抗體將與和CCR1、CCR2和CCR5相互作用之CCL3/MIP-1a、CCL4/MIP_1^、CCL5/RANTE和CCL2/MCP-1中的至少2種或3種相結合?？挂蜃涌贵w或抗因子抗體之抗原結合片段的另一些實例包括與選自CCL2/MCP-1、CCL3/MIP-1a、CCL4/MIP-1^、CCL5/RANTES、CCL14/HCC-UCCL15/HCC-2、CCL18/PARC和CCL23/MPIF-1的至少3種不同CC趨化因子相結合的那些。通過抗因子抗體與CC趨化因子之至少一個決定簇相接觸而發(fā)生結合。例如，結合可發(fā)生在抗體與CCL2/MCP-1、CCL3/MIP-1a、CCL4/MIP-1^、CCL5/RANTES、CCL14/HCC-1、CCL15/HCC-2、CCL18/PARC或CCL23/MPIF-1的決定簇之間，所述決定簇位于CC趨化因子的CC殘基與CC趨化因子的最后一個C殘基之間。CC趨化因子中相鄰CC(半胱氨酸-半胱氨酸)和最后一個半胱氨酸殘基的位置是本領域公知的，其可在序列表中所示的CC趨化因子序列中容易地識別。抗因子抗體及其抗原結合片段還可以與CC趨化因子(包括CCL2/MCP-1、CCL3/MIP-Ia、CCL4/MIP-1^、CCL5/RANTES、CCL14/HCC-1、CCL15/HCC-2、CCL18/PARC和CCL23/MPIF-1)的至少一個決定簇結合，所述決定簇位于所述CC趨化因子的N環(huán)、30’s環(huán)或40’s環(huán)中?？挂蜃涌贵w還可以表征為其能夠與一些CC趨化因子(而非另一些)相結合。例如，抗因子抗體可以與CCL3/MIP-1a和CCL4/MIP-1P結合，但不與CCL5/RANTES、CCL2/MCP-UCCL8/MCP-2或CCL7/MCP-3結合。另一些則不與附圖中列舉之趨化因子和其它生物學活性分子(包括MIP-Ia、MIP-IP、RANTES、MPIF-I、HCC-I、HCC-2、HCC-4、Parc、MCP-2、MCP-3、MCP-4、Eotaxin、MDC、ELC、1-309、IL-8、SDF或Fractalkine)中的一些或全部相結合，以及與其它趨化因子相結合。例如，本文中示例了不與MCP-l、MCP-2或MCP-3中至少一種結合的抗因子抗體。抗因子抗體還可表征為其能夠與一個物種的2種或更多種CC趨化因子結合，但不與另一物種的相應CC趨化因子結合。例如，抗因子抗體可以與人CCL3結合，但基本上不與鼠CCL3結合。抗因子抗體之結合特異性的具體實例示于圖8-12中。一些抗因子抗體和其抗原結合片段還能夠抑制CC趨化因子與相應受體的相互作用。這樣的抑制可具有功能性作用，例如抑制趨化性或由趨化因子與受體結合所活化的其它作用?？挂蜃涌贵w可以與CC趨化因子中CC受體結合殘基內的至少一個決定簇結合?，F有技術中記載了CC趨化因子中被認為或已知與CC趨化因子受體結合相關的受體結合氨基酸殘基和區(qū)段。一般認為N末端、N環(huán)、30s環(huán)以及與二硫鍵相鄰的和a螺旋中的殘基參與CC趨化因子家族的受體結合。對與趨化因子之多種功能相關的其特定結構特征的描述通過引用如下兩篇出版物而并入Baysal等人，Proteins43(2):150-60(2001)以及Kuloglu等人,Biochemistry,40(42):12486-96(2001)。參見NCBI“保守性結構域數據庫(ConservedDomainDatabase,CDD)”29111中指出的CC趨化因子的功能性結構域。本發(fā)明人生產并鑒定了特異性抗因子單克隆抗體3C12F、7D1G、7D12A、18V4F和18P7E。利用本領域已知的競爭性抑制測定，可使用這些抗因子抗體對另一些抗體或物質進行鑒定，所述另一些抗體或物質競爭性阻斷這些抗因子單克隆抗體與其所識別的一種或更多種CC趨化因子的結合。本發(fā)明還包括抑制抗因子抗體結合的競爭性抑制劑(例如抗體)，以及利用抗因子單克隆抗體3C12F、7D1G、7D12A、18V4F和18P7E對這些競爭性抑制劑進行檢測的方法?？挂蜃涌贵w可以是人抗體、人源化抗體、嵌合的人-鼠抗體、鼠或其它脊椎動物、鳥類或哺乳動物的抗體，或者其抗原結合片段。本發(fā)明一種類型的抗因子抗體具有與單克隆抗體3C12F相同或相似的結合特異性，并且可以與選自CCL3/MIP-1a、CCL4/MIP-1^、CCL5/RANTES、CCL15/HCC-2和CCL23/MPIF-I的至少2、3、4或5種CC趨化因子相結合。它們可以表現出不與其它趨化因子結合或基本上不與其它趨化因子結合，所述其它趨化因子包括圖8中所示的其它趨化因子(例如HCC-1、PARC或者MCP1、2或3)。這種類型的抗體可以與對與趨化因子受體結合來說重要的結構域相結合，所述結構域包括CC趨化因子的N環(huán)、30s環(huán)或40’s環(huán)中的決定簇；CCL3/MIP-1a的至少一個抗原決定簇，其位于SEQIDNO71的殘基11-15(CCFSY)、殘基17-24(SRQIPQNF)、殘基34-35(QC)或殘基57-67(EWVQKYVSDLE)內；CCL4/MIP-1^的至少一個抗原決定簇，其位于SEQIDNO72的殘基11-15(CCFSY)、殘基17-24(ARKLPHNF)、殘基34-35(LC)或殘基57-67(SffVQEYVYDLE)內；CCL5/RANTES的至少一個抗原決定簇，其位于SEQIDNO:73的殘基10-14(CCFAY)、殘基16-23(ARPLPRAH)、殘基33-34(KC)或殘基56-66(KWVREHNSLE)內；CCL23/MPIF-1的至少一個抗原決定簇，其位于SEQIDNO81的殘基9-13(CCISY)、殘基15-22(PRSIPCSL)、殘基32-33(EC)或殘基55-65(KQVQVCMRMLK)內；或CCL15/HCC-2的至少一個抗原決定簇，其位于SEQIDNO79的殘基8-12(CCTSY)、殘基14-21(SQSIPCSL)、殘基31-32(EC)或殘基54-64(PGVQDCMKKLK)內。該類型的抗體可以包含MAb3C12F的至少一個互補決定區(qū)(⑶R)，其選自SEQIDNO:3、4、5、8、9或10或SEQIDNO:53、54、55、58、59或60，或者可以包含競爭性抑制或阻斷MAb3C12F與其所結合之CC趨化因子結合或者阻斷RANTES與vCCI結合之抗體的至少一個⑶R(參見圖2)。該類型的抗因子抗體可以含有MAb3C12F的1、2、3、4、5或6個⑶R，或者SEQIDNO:3、4、5、8、9和/或10或SEQIDNO:53、54、55、58、59和/或60中的1、2、3、4、5、6、7、8或更多個氨基酸殘基已缺失、插入或替換的⑶R。因此，⑶R序列可以與由雜交瘤細胞系3C12F或由其繼代培養(yǎng)物所產生抗體的CDR序列相同；可以與3C12F之抗因子抗體類似物的CDR序列相對應，或者與競爭性阻斷或抑制MAb3C12F與其所結合之兩種或更多種CC趨化因子結合的抗因子單克隆抗體的CDR序列相對應。這種抗體可以采用如下形式人抗體，人源化抗體，嵌合的人-鼠抗體，鼠、鳥類或其它脊椎動物的抗體；或其抗原結合片段。第二類型的抗體具有與7D1G相似或相同的結合特異性，并與選自CCL3/MIP-1a、CCL4/MIP-1^、CCL5/RANTES、CCL14/HCC-1、CCL23/MPIF-1和CCL18/PARC的至少2、3、4、5或6種CC趨化因子結合。該類型的抗體可以表現出不與其它趨化因子結合或基本上不與其它趨化因子結合，所述其它趨化因子例如圖10所示的其它趨化因子(例如HCC-2、Eotaxin或MCP1、2、3或4)。該第二類型的抗體可以與趨化因子或CC趨化因子的結構決定簇結合，包括與MAb7D1G結合之至少一種CC趨化因子的N環(huán)或40’s環(huán)中的決定簇；CCL3/MIP-1a的至少一個抗原決定簇，其位于SEQIDNO71的殘基11-15(CCFSY)、殘基17-24(SRQIPQNF)、殘基34-35(QC)或殘基57-67(EWVQKYVSDLE)內；CCL4/MIP-1^的至少一個抗原決定簇，其位于SEQIDNO72的殘基11-15(CCFSY)、殘基17-24(ARKLPHNF)、殘基34-35(LC)或殘基57-67(SffVQEYVYDLE)內；CCL5/RANTES的至少一個抗原決定簇，其位于SEQIDNO:73的殘基10-14(CCFAY)、殘基16-23(ARPLPRAH)、殘基33-34(KC)或殘基56-66(KWVREHNSLE)內；CCL23/MPIF-1的至少一個抗原決定簇，其位于SEQIDNO81的殘基9-13(CCISY)、殘基15-22(PRSIPCSL)、殘基32-33(EC)或殘基55-65(KQVQVCMRMLK)內；或CCL14/HCC-1的至少一個抗原決定簇，其位于SEQIDNO78的殘基8-12(CCFTY)、殘基14-21(TYKIPRQR)、殘基31-32(QC)或殘基54-64(KWVQDHKDMK)內；或CCL18/PARC的至少一個抗原決定簇，其位于SEQIDNO82的殘基10-14(CCLVY)、殘基16-23(SffQIPQKF)、殘基33-34(QC)或殘基56-66(KffVQKYISDLK)內。從結構上講，這些抗體可以包含MAb7D1G的一個或更多個⑶R，其選自SEQIDNO:23、24、25、28、29或30，或者來自競爭性抑制或阻斷MAb7D1G與其所結合之CC趨化因子結合的抗體的⑶R。該類型的一種抗因子抗體將含有MAb7D1G的1、2、3、4、5或6個⑶R，或者SEQIDNO:23、24、25、28、29和/或30中1、2、3、4、5、6、7、8或更多個氨基酸殘基已缺失、插入或替換的CDR。因此，CDR序列可以與由雜交瘤細胞系7D1G或由其繼代培養(yǎng)物所產生抗體的CDR序列相同；可以與7D1G之抗因子抗體類似物的CDR序列相對應，或者與競爭性阻斷或抑制MAb7D1G與其所結合之兩種或更多種CC趨化因子結合的抗因子單克隆抗體的CDR序列相對應。這種抗體可以采用如下形式人抗體，人源化抗體，嵌合的人-鼠抗體，鼠、鳥類或其它脊椎動物的抗體；或其抗原結合片段。第三類型的抗因子抗體具有與7D12A相似或相同的結合特異性，并與選自CCL3/MIP-Ia、CCL4/MIP-1^、CCL5/RANTES和CCL23/MPIF-1的至少2、3或4種CC趨化因子結合。這些可以表現出不與其它趨化因子結合或基本上不與其它趨化因子結合，所述其它趨化因子包括圖9所示的其它趨化因子(例如CCL2/MCP-1)。這種抗體產品可以與至少一種所述CC趨化因子的N環(huán)或40’s環(huán)中的決定簇結合；其可以與如下抗原決定簇結合CCL3/MIP-1a的至少一個抗原決定簇，其位于SEQIDNO71的殘基11-15(CCFSY)、殘基17-24(SRQIPQNF)、殘基34-35(QC)或殘基57-67(EWVQKYVSDLE)內；CCL4/MIP-1^的至少一個抗原決定簇，其位于SEQIDNO72的殘基11-15(CCFSY)、殘基17-24(ARKLPHNF)、殘基34-35(LC)或殘基57-67(SffVQEYVYDLE)內；CCL5/RANTES的至少一個抗原決定簇，其位于SEQIDNO:73的殘基10-14(CCFAY)、殘基16-23(ARPLPRAH)、殘基33-34(KC)或殘基56-66(KffVREYINSLE)內；或CCL23/MPIF-1的至少一個抗原決定簇，其位于SEQIDNO81的殘基9-13(CCISY)、殘基15-22(PRSIPCSL)、殘基32-33(EC)或殘基55-65(KQVQVCMRMLK)內。從結構上講，這些第三類型的抗體可以包含MAb7D12A的至少一個⑶R，其選自SEQIDNO:13、14、15、18、19或20，或者競爭性抑制MAb7D12A與其所結合之CC趨化因子結合的抗體的至少一個⑶R。該類型的抗因子抗體可含有MAb7D12A的1、2、3、4、5或6個CDR，或SEQIDNO:13、14、15、18、19和/或20中的1、2、3、4、5、6、7、8或更多個氨基酸殘基已缺失、插入或替換的CDR。因此，CDR序列可以與由雜交瘤細胞系7D12A或由其繼代培養(yǎng)物所產生抗體的CDR序列相同；可以與7D12A之抗因子抗體類似物的CDR序列相對應，或者與競爭性阻斷或抑制MAb7D12A與其所結合之兩種或更多種CC趨化因子結合的抗因子單克隆抗體的CDR序列相對應。這種抗體可以采用如下形式人抗體，人源化抗體，嵌合的人-鼠抗體，鼠、鳥類或其它脊椎動物的抗體；或其抗原結合片段。第四類型的抗因子抗體具有與18V4F相似或相同的結合特異性，并與選自CCL3/MIP-Ia、CCL4/MIP-1^和CCL5/RANTES的至少2種或3種CC趨化因子結合。這些可以表現出不與其它趨化因子結合或基本上不與其它趨化因子結合，所述其它趨化因子包括圖11所示的其它趨化因子(例如CCL2/MCP-1)。這種抗體產品可以與至少一種所述CC趨化因子的N環(huán)或40’s環(huán)中的決定簇結合；可以與如下決定簇結合CCL3/MIP-1a的至少一個抗原決定簇，其位于SEQIDNO71的殘基11-15(CCFSY)、殘基17-24(SRQIPQNF)、殘基34-35(QC)或殘基57-67(EWVQKYVSDLE)內；CCL4/MIP-1P的至少一個抗原決定簇，其位于SEQIDNO72的殘基11-15(CCFSY)、殘基17-24(ARKLPHNF)、殘基34-35(LC)或殘基57-67(SffVQEYVYDLE)內；CCL5/RANTES的至少一個抗原決定簇，其位于SEQIDNO:73的殘基10-14(CCFAY)、殘基16-23(ARPLPRAH)、殘基33-34(KC)或殘基56-66(KffVREYINSLE)內。從結構上講，該第四類型的抗體可以包含MAb18V4F的至少一個⑶R，其選自SEQIDNO:33、34、35、38、39或40或SEQIDNO:63、64、65、68、69或70，或者競爭性抑制MAb18V4F與其所結合之CC趨化因子結合的抗體的至少一個CDR。該類型的抗因子抗體可含有MAbl8V4F的1、2、3、4、5或6個CDR，或SEQIDNO:33、34、35、38、39和/或40或者SEQIDNO=63,64,65,68,69和/或70中1、2、3、4、5、6、7、8或更多個氨基酸殘基已缺失、插入或被其它氨基酸殘基替換的CDR。因此，CDR序列可以與由雜交瘤細胞系18V4F或由其繼代培養(yǎng)物所產生抗體的CDR序列相同；可以與18V4F之抗因子抗體類似物的CDR序列相對應，或者與競爭性阻斷或抑制MAb18V4F與其所結合之兩種或更多種CC趨化因子結合的抗因子單克隆抗體的CDR序列相對應。這種抗體可以采用如下形式人抗體，人源化抗體，嵌合的人-鼠抗體，鼠、鳥類或其它脊椎動物的抗體；或其抗原結合片段。第五類型的抗因子抗體具有與18P7E相似或相同的結合特異性，并與選自CCL3/MIP-Ia、CCL4/MIP-1^和CCL5/RANTES的至少2種或3種CC趨化因子結合。這些可以表現出不與其它趨化因子結合或基本上不與其它趨化因子結合，所述其它趨化因子包括圖12所示的其它趨化因子(例如CCL2/MCP-1)。這種抗體產品可以與上述3種CC趨化因子中至少一種的N環(huán)或40’s環(huán)中的決定簇相結合。這種抗體產品可以與至少一種所述CC趨化因子的N環(huán)或40’s環(huán)中的決定簇結合；可以與如下決定簇結合CCL3/MIP-1a的至少一個抗原決定簇，其位于SEQIDNO71的殘基11-15(CCFSY)、殘基17-24(SRQIPQNF)、殘基34-35(QC)或殘基57-67(EffVQKYVSDLE)內；CCL4/MIP-1^的至少一個抗原決定簇，其位于SEQIDNO72的殘基11-15(CCFSY)、殘基17-24(ARKLPHNF)、殘基34-35(LC)或殘基57-67(SffVQEYVYDLE)內；CCL5/RANTES的至少一個抗原決定簇，其位于SEQIDNO:73的殘基10-14(CCFAY)、殘基16-23(ARPLPRAH)、殘基33-34(KC)或殘基56-66(KffVREYINSLE)內。從結構上講，該第五類型的抗體可以包含MAb18P7E的至少一個⑶R，其選自SEQIDN0:43、44、45、48、49或50，或者競爭性抑制MAb18P7E與其所結合之CC趨化因子結合的抗體的至少一個⑶R。該類型的抗因子抗體可含有MAb18P7E的1、2、3、4、5或6個⑶R，或SEQIDN0:43、44、45、48、49和/或50中1、2、3、4、5、6、7、8或更多個氨基酸殘基已缺失、插入或被其它氨基酸殘基替換的CDR。因此，CDR序列可以與由雜交瘤細胞系18P7E或由其繼代培養(yǎng)物所產生抗體的CDR序列相同；可以與18P7E之抗因子抗體類似物的CDR序列相對應，或者與競爭性阻斷或抑制MAb18P7E與其所結合之兩種、三種或更多種CC趨化因子結合的抗因子單克隆抗體的CDR序列相對應。這種抗體可以采用如下形式人抗體，人源化抗體，嵌合的人-鼠抗體，鼠、鳥類或其它脊椎動物的抗體；或其抗原結合片段。輕鏈和重鏈可變結構域序列(包括3C12F、7D1G、7D12A、18V4F、18P7E及其類似物或其它抗因子抗體的每個CDR的那些序列)可以用作抗體模擬物藥物設計中的核心結構，可以用作干擾CC趨化因子-受體結合的競爭性抑制劑，可以用作分離或鑒定趨化因子的配體或針對CC趨化因子抗體的抗獨特型(anti-idiotypic)抗體,或者可以用作免疫原以誘導針對CC趨化因子抗體的抗獨特型抗體。這種肽包括經修飾或穩(wěn)定化的肽或者構象限制性肽，例如包含抗因子抗體之CDR的圓形或環(huán)形肽。利用抗體CDR進行肽設計的方法是本領域已知的，其通過引用Takahashi等人，Chem.Eur.J.6(17):3196-3203或者Feng等人，Cell.Host.Microb.98(2):311-316而并入。這些CDR包括SEQIDNO:3-5、8_10、13-15、18-20、23-25、28-30、33-35、38-40、43-45、48-50、53-55、58-60、63-65和68-70的那些以及通過親和力成熟產生的這些肽序列的類似物?？梢允褂貌煌珻DR的組合以調節(jié)或抑制CC趨化因子的結合或活性，抑制趨化因子二聚化或多聚化，或誘導有用的生理或免疫應答，所述不同CDR的組合可作為包含不同CDR的單獨肽的組合，或者可作為兩個或更多個CDR肽序列的綴合物、雜合物或融合物以形成單個肽產物。本發(fā)明的抗因子抗體可以制備成組合物，其包含抗因子抗體或其抗原結合片段以及如下更詳細描述的載體、賦形劑或緩沖劑。制備產生抗因子抗體之雜交瘤細胞系的方法包括用特定的CC趨化因子對哺乳動物(例如小鼠)進行序貫免疫，隨后用一種或更多種不同的CC趨化因子加強免疫，接著從所述哺乳動物得到雜交瘤細胞系(例如通過使其脾細胞與骨髓瘤或永生化B細胞系融合來實現)，以及將產生與兩種或更多種趨化因子或CC趨化因子相結合之抗因子抗體的雜交瘤細胞系分離出來。治療由一種或更多種CC趨化因子介導的疾病、功能異?；虿“Y(特別是由被抗因子抗體識別的至少兩種或三種CC趨化因子介導的那些)的方法包括對有此需要的對象施用抗因子抗體或其抗原結合片段。這些疾病、功能異?；虿“Y可以表征為炎癥或自身免疫。通過以下的附圖和對實施方案的詳細描述，本發(fā)明的其它方面將是顯而易見的。附圖簡述圖I示意利用ELISA得到的經純化之3C12F與趨化因子的結合。圖2顯示3C12F阻斷vCCI與RANTES/CCL5的結合。圖3顯示趨化性測定中經純化之3C12F的抑制活性的濃度分析。圖4顯示趨化性測定中經純化之7D12A的抑制活性的濃度分析。圖5顯示趨化性測定中經純化之7D1G的抑制活性的濃度分析。圖6顯示趨化性測定中經純化之18V4F的抑制活性的濃度分析。圖7顯示趨化性測定中經純化之18P7E的抑制活性的濃度分析。圖8示意利用MSD平臺得到的3C12F的趨化因子結合特異性。圖9示意利用MSD平臺得到的7D12A的趨化因子結合特異性。圖10示意利用MSD平臺得到的7D1G的趨化因子結合特異性。圖11示意利用MSD平臺得到的18V4F的趨化因子結合特異性。圖12示意利用MSD平臺得到的18P7E的趨化因子結合特異性。圖13a、b、c和d顯示被5種抗因子抗體識別之趨化因子序列的比對。發(fā)明詳述術語“抗體”廣義地理解為描述單個單克隆抗體、具有多表位特異性的抗體組合物以及抗體片段(例如Fab、F(ab')2、scFv和Fv)，只要其表現出期望的生物學活性(例如能夠與特定抗原、表位或抗原決定簇結合)即可。該術語包括完整的抗體、全長或未截短的抗體，以及抗體片段和抗體衍生物、變體和類似物?？贵w(包括下述抗因子抗體)可具有不同的同種型——例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM和IgY，以及多種同種型亞型——例如人IgG亞型1、2、3和4或者IgA亞型I和2。多價抗體可以用其對多價抗原的親和力來表征。親和力使得與具有重復性相同表位的抗原的結合增強，一些趨化因子表征為二聚或四聚結構。個體抗體分子具有越多的抗原結合位點，則其與抗原的親和力越高?？贵w可以獲得自或來源于不同的脊椎動物(包括哺乳動物和鳥類的抗體)。本文使用的術語“單克隆抗體”是指從基本上同源的抗體群中獲得的抗體，S卩，除了可能以微量存在的可能之天然突變以外，所述群中包含的各抗體是相同的。單克隆抗體是高度特異性的，其針對單個抗原位點。此外，與通常包括針對不同決定簇(表位)之不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制備物不同，每個單克隆抗體針對抗原上的單個決定簇。除了其特異性之外，單克隆抗體的優(yōu)勢還在于其由雜交瘤培養(yǎng)物合成，不會污染有其它免疫球蛋白。修飾語“單克隆”表示抗體從基本上均質的抗體群獲得的特征，其不應被理解為需要通過任何特定方法來產生抗體。例如，根據本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過由KShler和Milstein,Nature,256:495(1975)首次描述的雜交瘤方法制備，或者可以通過重組DNA方法(參見例如Cabilly等人，美國專利No.4，816，567)制備?！扒逗峡贵w”是指含有來自兩個不同來源之氨基酸序列的抗體，例如含有與已知結合特定表位或抗原之鼠抗體的可變區(qū)段剪接而成的保守性人抗體區(qū)段的抗體。每條重鏈和輕鏈氨基酸序列的一部分與來源于特定物種或屬于特定類型的抗體中的序列相同或同源，而鏈的其余區(qū)段與來自另一物種的序列同源或相同。在一個實施方案中，本發(fā)明表征了一種嵌合抗體或抗原結合片段，其中輕鏈和重鏈的可變區(qū)模擬來源于一個哺乳動物物種的抗體可變區(qū)，而恒定部分與來源于另一物種的抗體中的序列同源。在本發(fā)明的一個實施方案中，通過將小鼠抗體CDR移至人抗體框架區(qū)來制備嵌合抗體。因此，本發(fā)明的單克隆抗體包括“嵌合”抗體以及這種抗體中保留與CC趨化因子結合能力的片段，所述“嵌合”抗體中重鏈和/或輕鏈的一部分與來源于特定物種或屬于特定抗體類型或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，而鏈的其余部分與來源于另一物種或屬于另一抗體類型或亞類的抗體中的相應序列相同或同源。嵌合抗體的特性及其制備方法通過引用Cabilly等人，美國專利No.4，816，567以及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)而并入?！盎パa決定區(qū)(⑶R)”構成免疫球蛋白分子輕鏈或重鏈可變區(qū)的一部分?？贵w鏈的這些部分構成決定抗體對于抗原上特定表位之特異性的區(qū)域的一部分，并且構成抗體分子中可與表位直接結合的部分。在構成抗體的不同CDR中，CDR3顯示出最高的可變性。CDR介導抗體與其所識別之表位之間的接觸。包含CDR序列或類似于CDR序列的分離肽可表現出額外的功能活性Polonelli等人，PLoSOne3e2371(2008)?！叭嗽椿贵w”是指包含含有基本上來自人抗體鏈(稱為“接受體免疫球蛋白(或抗體)”)之可變區(qū)框架殘基以及基本上來自非人抗體(例如小鼠)之至少一個互補決定區(qū)(OTR)的至少一條鏈的抗體。除了⑶R移植之外，通常對人源化抗體進行進一步改變，以提高親和力和/或減少免疫原性。“人源化抗體”不完全是人的抗體，其是含有來源于非人免疫球蛋白之盡可能少的序列的嵌合抗體。人源化抗體的大部分是人免疫球蛋白(受者抗體)，其中受者的高變區(qū)殘基被具有期望特異性、親和力和能力的來自非人物種(供者抗體)(例如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類)的高變區(qū)殘基所取代。在一些情況下，人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基被相應的非人殘基所取代。此外，人源化抗體可以包含在受者抗體或供者抗體中不存在的殘基。進行這些修飾以進一步完善抗體性能。一般地，人源化抗體包含至少一個(通常兩個)可變結構域的基本上全部，其中全部或基本上全部的高變區(qū)對應于非人免疫球蛋白的那些區(qū)域，全部或基本上全部的FR是人免疫球蛋白序列的那些序列。人源化抗體任選地還包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)的至少一部分，所述Fe通常是與兩種或更多種CC趨化因子免疫特異性結合的人免疫球蛋白的Fe，其已通過引入氨基酸殘基的替換、缺失或添加(即突變)而改變。在一些實施方案中，人源化抗體是衍生物。這種人源化抗體在一個或更多個非人CDR中包含氨基酸殘基的替換、缺失或添加。當與非衍生的人源化抗體相比時，人源化抗體衍生物可具有基本上相同的結合、更好的結合或更差的結合。在一些特定的實施方案中，CDR的1、2、3、4或5個氨基酸殘基已被替換、缺失或添加(即突變)。產生人源化抗體的方法通過引用歐洲專利No.EP239，400、EP592，106和EP519,596;國際公開No.WO91/09967和WO93/17105;美國專利No.5,225,539,5,530,101、5,565,332、5，585,089、5，766,886和6,407,213；以及Padlan,MolecularImmunology28(4/5):489-498(1991);Studnicka等人，ProteinEngineering7(6):805-814(1994)；Roguska等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:969-973(1994)；Tan,等人，J.Immunol.1691119-25(2002)；Caldas等人，ProteinEng.13:353-60(2000);Morea等人，Methods20267-79(2000)；Baca等人，J.Biol.Chem.272:10678-84(1997)；Roguska等人，ProteinEng.9:895-904(1996);Couto等人，CancerRes.55(23Supp):5973s_5977s(1995)；Couto等人，CancerRes.55:1717-22(1995)；Sandhu,Gene150:409-10(1994);Pedersen等人，J.Mol.Biol.235:959-73(1994)Jones等人，Nature321:522-525(1986)；Reichmann等人，Nature332:323-329(1988);和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)而并入。本文中的“變體”或“類似物”抗體是指由于“親本”抗體序列中一個或更多個氨基酸殘基的添加、缺失和/或替換而使得氨基酸序列不同于“親本”抗體氨基酸序列的分子。在一個實施方案中，變體包含親本抗體一個或更多個高變區(qū)中的一個或更多個氨基酸替換。例如，變體可以包含親本抗體一個或更多個高變區(qū)中的至少I個(例如約I至約10個，優(yōu)選約2至約5個)替換。通常，變體具有與親本抗體重鏈或輕鏈可變結構域序列至少75%(更優(yōu)選至少80%,更優(yōu)選至少85%,更優(yōu)選至少90%,最優(yōu)選至少95%)氨基酸序列同一性的氨基酸序列。關于該序列的同一性或同源性在本文中定義為對序列進行比對并引入空位(需要時)以實現序列同一性百分比最大化之后，候選序列中與親本抗體殘基相同之氨基酸殘基的百分比。N末端、C末端或內部的延長、缺失或插入抗體序列均不應被理解為影響序列的同一性或同源性。變體保留了與受體結合的能力，并且優(yōu)選具有優(yōu)于親本抗體的特性。例如，變體可以具有更強的結合親和力，增強的活化受體之能力等。為了分析這些特性，例如應當將變體的Fab形式與親本抗體的Fab形式或者將變體的全長形式與親本抗體的全長形式進行比較，因為在本文公開的生物活性測定中已發(fā)現抗體的形式影響其活性。本文特別感興趣的變體抗體是當與親本抗體相比時展示出至少約10倍、優(yōu)選至少約20倍、最優(yōu)選至少約50倍的生物活性增強的抗體。本文中的“親本”抗體是由用于制備變體之氨基酸序列所編碼的抗體。優(yōu)選地，親本抗體具有人框架區(qū)并具有人抗體恒定區(qū)。例如，親本抗體可以是嵌入供者(鼠)抗體CDR的人抗體?！胺蛛x的”抗體是已經鑒定并從其天然環(huán)境組分中分離和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的雜質組分是會干擾抗體之診斷或治療用途的物質，其可以包括酶、激素和其它蛋白質的或非蛋白質的溶質。在一些實施方案中，抗體將被純化(I)至高于約95(重量)％(最優(yōu)選高于99(重量)％)的抗體，如Lowry法所測定地，(2)至利用旋轉杯式測序儀(spinningcupsequenator)足以獲得N末端或內部氨基酸序列中至少15個殘基的程度，或者(3)使用考馬斯藍(或優(yōu)選地，銀染)在還原或非還原條件下通過SDS-PAGE至均質。分離的抗體包括重組細胞內的原位抗體，因為不存在抗體天然環(huán)境中的至少一種組分。然而，通常，分離的抗體將通過至少一個純化步驟來制備。短語“基本上不含細胞物質”包括這樣的抗體或抗體片段制備物，其中抗體或抗體片段與其所分離或重組產生之細胞的細胞組分相分離。因此，基本上不含細胞物質的抗體或抗體片段包括具有少于約30%、20%、10%或5%(干重)異源蛋白質(本文中也稱為“雜質蛋白質”)的抗體或抗體片段制備物。當抗體或抗體片段為重組產生時，還優(yōu)選其不含培養(yǎng)基，g卩，培養(yǎng)基占蛋白制備物體積的小于約20%、10%或5%。當抗因子抗體或其抗體片段通過化學合成產生時，優(yōu)選其產生時不含化學物質前體或其它化學物質，即，其與參與蛋白質合成的化學物質前體或其它化學物質相分離。因此，除了目的抗體或抗體片段之夕卜，抗體或抗體片段的這種制備物具有少于約30%、20%、10%、5%(干重)的化學物質前體或化合物。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體或其片段是分離的或經純化的。術語“抗因子抗體”是指如上文所定義的與兩種或更多種趨化因子結合的抗體，優(yōu)選地，抗因子抗體將與三種或更多種人CC趨化因子結合?？挂蜃涌贵w可以是單克隆或多克隆抗體，優(yōu)選地，其是分離的或經純化的單特異性或單克隆抗體?？挂蜃涌贵w可以是哺乳動物抗體，例如鼠或人的抗體，或者嵌合或人源化抗體。全人抗體可以從人或轉基因動物或噬菌體展不平臺獲得，參見Lonberg,Curr.Opin.Tmmuno1.20(4):450_9(2008),從轉基因動物獲得人抗體的方法通過引用該文獻而并入?？挂蜃涌贵w可以是合成的抗體、單結構域抗體(例如納米抗體(nanobody)(VhH)或駱騎化抗體)、單鏈FV(scFv)、單鏈抗體、Fab片段、F(ab’)片段、二硫鍵連接的Fv、胞內抗體(intrabocy)和抗獨特型(抗Id)抗體(包括針對本發(fā)明抗因子抗體(例如3C12F等)的抗獨特型抗體和抗抗獨特型抗體)、雙特異性抗體以及與CC趨化因子的決定簇或表位結合的上述任何抗體之片段。經改造抗體的多種結構形式通過引用McCafferty等人編的AntibodyEngineeringAPracticalApproach,OxfordUniversityPress(1996)而并入。術語“抗因子抗體”包括免疫球蛋白分子和含有至少一個抗原結合位點(antigenbindingsite,ABS)的免疫球蛋白分子之免疫學活性片段。這些可以是任何同種型，包括IgA、IgD、IgE、IgG、IgM和IgY，其可以來源于產生抗體的脊椎動物(例如哺乳動物和鳥類)。優(yōu)選地，抗因子抗體是人的或人源化的，盡管抗因子抗體可適于向動物(例如家養(yǎng)或商業(yè)化飼養(yǎng)的動物，或野生動物或圈養(yǎng)動物)施用。這些包括伴侶動物(例如狗和貓)、家畜(例如牛、馬、野牛、水牛、豬、山羊、綿羊、駱駝、美洲駝等)以及家禽(例如雞、火雞、鵝、獵鷹等)。本領域技術人員將理解如何得到抗因子抗體以及如何使其適用于非人用途，例如通過誘導由特定類型的動物表達針對CC趨化因子的抗體和/或通過類似于人源化的抗體改造方法來實現。抗因子抗體或其片段將與特定的CC趨化因子結合，并且不與其它趨化因子或多肽非特異性結合。與CC趨化因子或CC趨化因子之片段免疫特異性結合的抗因子抗體或其片段可以與其它抗原發(fā)生交叉反應。然而，可以選擇不與其它抗原發(fā)生交叉反應的、與CC趨化因子或其片段免疫特異性結合的抗因子抗體或片段?？梢岳缤ㄟ^免疫測定或本領域技術人員已知的其它技術對與特定CC趨化因子免疫特異性結合的抗因子抗體或其片段進行鑒定?！捌巍泵枋鐾暾嚯姆肿?例如CC趨化因子或抗因子免疫球蛋白)的一部分。“片段”可以包括包含氨基酸序列(例如完整的成熟CC趨化因子或者抗體多肽輕鏈或重鏈的序列)中至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、75、80、90、100、120、130、150、175、200或250個連續(xù)氨基酸殘基之氨基酸序列的肽或多肽。對于CC趨化因子而言，片段是分子的一部分，其短于成熟趨化因子全長，例如包含至少5個連續(xù)氨基酸殘基、至少10個連續(xù)氨基酸殘基、至少15個連續(xù)氨基酸殘基、至少20個連續(xù)氨基酸殘基、至少25個連續(xù)氨基酸殘基、至少40個連續(xù)氨基酸殘基、至少50個連續(xù)氨基酸殘基或任何中間數值(最多但不包括成熟CC趨化因子的全部氨基酸序列)之氨基酸序列的CC趨化因子片段。對于抗因子抗體而言，片段包括包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個連續(xù)氨基酸殘基或者最多但不包括抗體Vh和/或\部分全長之氨基酸的肽或多肽，其與CC趨化因子特異性結合，并且與跟完整抗因子抗體結合的至少兩種或三種CC趨化因子結合。抗因子抗體片段可以是單鏈片段，例如輕鏈或重鏈或者輕鏈或重鏈的一部分，還包括具有多條鏈的片段(例如Fab或F(ab’)2片段)。“親和力成熟的抗體”是通過改變可變區(qū)中一個或更多個殘基的類型或位置從而使其結合親和力和/或生物學活性增加的抗體。改變的一個實例是可以發(fā)生在CDR或框架區(qū)中的突變。親和力成熟的抗體通常具有比分離的或天然的抗體或其片段提高2至500倍的結合親和力。親和力成熟的抗體可具有針對受體抗原的納摩爾或甚至皮摩爾的親和力。親和力成熟的抗體通過本領域已知的方法產生。Marks,J.D.等人,Bio/TechnologylO779-783(1992)(其通過引用而并入)描述了通過Vh和Vl結構域改組(shuffling)使得親和力成熟。⑶R和/或框架殘基的隨機突變通過引用Barbas，C.F.等人，ProcNat.Acad.Sci,USA91:3809-3813(1994)；Schier,R.等人，Gene169:147-155(1995)；Yelton,D.E.等人，J.Tmmun01.155;1994-2004(1995)；Jackson,J.R.等人，J.Tmmuno1.154(7)3310-9(1995)以及Hawkins，R.E.等人，J.Mol.Biol.226:889-896(1992)而并入?！翱挂蜃涌贵w衍生物”是指包含與至少2、3、4種或更多種CC趨化因子結合之抗因子抗體或CC趨化因子結合抗體片段的氨基酸序列的多肽，其已通過引入氨基酸殘基的替換、缺失或添加而改變。本文使用的術語“衍生物”還指經共價修飾(例如糖基化、乙?；⒕垡叶蓟?、磷酸化、酰胺化、利用已知的保護/封閉基團衍生化、蛋白水解切割、與細胞配體或其它蛋白連接等)的抗因子抗體或抗因子抗體片段?？梢岳帽绢I域技術人員已知的技術(包括但不限于特異性化學切割、乙?；⒓柞；?、衣霉素的代謝合成等)進行化學修飾而產生這樣的抗因子抗體衍生物?？挂蜃涌贵w衍生物將保留與兩種或更多種CC趨化因子特異性結合的能力?！翱挂蜃涌贵w類似物”是指包含與已知抗因子抗體基本上類似的氨基酸序列并且保留已知抗因子抗體與兩種或更多種CC趨化因子結合的能力的多肽。類似物還可以含有1、2、3、5或10個或更多個非常規(guī)氨基酸?？赏ㄟ^參考與另一蛋白質的同一性或者通過參考包括如下的編碼多核苷酸序列對與抗因子抗體多肽具有相似之氨基酸序列的多肽進行描述(i)與已知抗因子抗體的至少一條重鏈或輕鏈或者至少一個⑶R的氨基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一性的氨基酸序列的多肽；(ii)由與編碼本文所述之抗因子抗體或抗因子抗體片段的核苷酸序列在嚴格條件下雜交的多核苷酸序列所編碼的多肽，其中所述多肽包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、90、100、125或至少150個氨基酸殘基。溫度和離子強度條件決定雜交的“嚴格度”。低嚴格雜交條件對應于55°C的Tm，其包括例如5XSSC、0.1%SDS,0.25%奶且無甲酰胺；或30%甲酰胺、5XSSC、0.5%SDS0中嚴格雜交條件對應于較高的Tm，例如40%甲酰胺、5X或6XSSC，高嚴格雜交條件對應于最高的1，例如50%甲酰胺、0.1XSSC，以及(iii)由與編碼已知抗因子抗體或抗因子抗體片段的核苷酸序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或至少99%同一性的核苷酸序列所編碼的多肽。與本文所述的抗因子抗體或抗因子抗體片段具有相似結構的多肽是指與已知的抗因子抗體或其片段具有相似的二級、三級或四級結構的多肽?？梢酝ㄟ^本領域技術人員已知的方法(包括但不限于X-射線晶體學、核磁共振和晶體電子顯微鏡)確定多肽和蛋白質的結構。術語“高變區(qū)”是指抗體中負責與抗原結合的氨基酸殘基。高變區(qū)包含來自重鏈和輕鏈可變結構域中“互補決定區(qū)”或“⑶R”的氨基酸殘基(Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991))和/或來自重鏈和輕鏈可變結構域中“高變環(huán)”的那些殘基(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))?！翱蚣軈^(qū)”或“FR”殘基是除了如本文所定義之高變區(qū)殘基之外的那些可變結構域殘基?？贵w的結構特征以及用于確定或分析抗體結構的方法是本領域人員公知的，其通過引用Kabat(同上)，Chothia等人(同上);D6ret等人，Comput.Appl.Biosci.11(4):435-9(1995)；Martin,Protein25(1)130-3(1996);Abhinandan等人，Mol.Immunol.45(14):3832-9(2008)以及Abhinandan等人，J.Mol.Biol.369(3):852-62(2007)而并入?！癈C-趨化因子”是指來自趨化細胞因子家族的多肽，其含有四個保守的半胱氨酸殘基，其中前兩個是相鄰的(例如，如VanCoillie等人，Cytokine&GrowthFactorRev.10:61-86(1999)所述)。CC趨化因子也稱為“P-趨化因子”?；谶@些相鄰的半胱氨酸-半胱氨酸(cys-cys或C-C)殘基，P-趨化因子被稱為“CC”趨化因子，其中“CC”代表相鄰的半胱氨酸殘基。CC趨化因子的實例是與CCRl和CCR5結合的那些，包括CCL3/MIP-Ia、CCL4/MIP-1P和CCL5/RANTES。CC趨化因子存在于哺乳動物和鳥類中。用于人或鼠的特定趨化因子(例如人CCL3/MIP-la)的術語可以用于標識另一物種中的相應分子(例如“鼠MIP-Ia”或“牛MIP-Ia”)，其應當理解為是指所指示物種中的類似的、結構上相似的分子。哺乳動物和鳥類物種之間的類似趨化因子可具有至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%或該范圍內任何中間值的序列同一性，并且其將表現出相同或相似的功能性免疫活性。脊椎動物CC趨化因子(包括哺乳動物和鳥類的那些)的序列通過引用NCBI數據庫而并入，具體參考該數據庫中由最近更新的登記號標識的那些序列(2010年8月9日最后一次登錄)以及Fernandez和Lolis,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.42:469(2002)，其通過引用并入本文。人趨化因子CCL2/MCP-1、CCL3/MIP-1a、CCL4/MIP-1^、CCL5/RANTES、CCL14/HCC-I、CCL15/HCC-2、CCL18/PARC和CCL23/MPIF-1等的多核苷酸和多肽的具體登記號提供于表4中。每個通過引用表4中描述的貨號、供應商或NCBI登記號而具體地并入。這些趨化因子從表4中所述的供應商處有售。本文使用的術語“CC趨化因子決定簇”是指CC趨化因子中與抗體的抗原結合殘基接觸的部分。該術語包括CC趨化因子上由抗因子抗體識別的常規(guī)線性表位以及構象表位(包括非線性表位)。CC趨化因子中被抗因子抗體結合或與其抗原結合氨基酸殘基直接接觸的一個或更多個部分是其決定簇。CC趨化因子抗原性決定簇的去除、取代、破壞或變性可降低或消除抗因子抗體與CC趨化因子結合的能力。確定抗體結合表位的方法是本領域公知的，如Ladner,Biotechnol.Genet.Eng.Rev.24:1-30(2007)所述(其通過引用而并入)。CC趨化因子決定簇包括參與結合趨化因子受體(例如CCRl或CCR5)的區(qū)段或結構域，例如其N環(huán)，P_1、2和3鏈，30’s、40’s和50’s環(huán)以及其C-末端螺旋區(qū)段，這些決定簇通過引用Fernandez和Lolis,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.42:469(2002)；Viola等人，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.48171以及Pakianathan等人，Biochem.36(32):9642(1997)而并入。還通過與來自病原體之蛋白質的結合對CC趨化因子決定簇進行定義，例如與牛痘病毒的vCCI結合的CC趨化因子決定簇，這些決定簇通過引用Zhang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.103(38):13985-13990(2006)而并入。術語“結合”是指兩種不同物質之間的化學或物理接觸或相互作用。這包括抗因子抗體與相應決定簇(例如CC趨化因子分子上的表位)之間的締合。這種接觸或相互作用可以通過一個或更多個離子鍵、非離子鍵、氫鍵、范德華(vanderwaals)鍵、疏水鍵或其它已知類型的分子間鍵來實現。結合可以包括兩個分子之間(例如配體和其相應受體之間)的直接接觸，或經由間隔部分的間接接觸(例如通過接頭或者雙價或多價部分的共價或非共價鍵合)?！敖Y合親和力”由親和力常數Ka描述，其是抗體與抗原結合和解離的速率常數之t匕。IgG抗體通常的親和力是10_510_9摩爾/L。通過本領域已知的許多不同的技術對抗體親和力進行測定，包括平衡透析、表面等離子共振(BIAcore)以及動力學排斥測定(kineticexclusionassay)(KillExA)。已結合和游離抗原與抗體親和力之間的關系表示為Scatchard方程r/c=Kn-Kr,其中r=[已結合抗原]與[總抗體]之比，c=[游離抗原]，K=親和力，n=每個抗體分子的結合位點數(價)。如果所有抗體對抗原具有相同的親和力(例如單克隆抗體)，r/c對r作圖將得到直線，其斜率為-K，截距r接近n。如果抗體是異質的(例如多克隆抗體)，r/c對r作圖將得到曲線，平均親和力可通過當半數結合位點被占據(r=I)時的曲線斜率來確定。短語“與CC趨化因子特異性結合”描述抗體或抗體片段與特定CC趨化因子或一組CC趨化因子之間高于背景的相互作用，而不與其它趨化因子相互作用。CC趨化因子包括但不限于CCL3/MIP-1a、CCL4/MIP-1^和CCL5/RANTES，CC趨化因子區(qū)段或結構域的實例包括其趨化因子受體結合殘基，其N環(huán)，0-1、2和3鏈，30’s、40’s和50’s環(huán)及其C-末端螺旋區(qū)段。與CC趨化因子或其結構域或區(qū)段之一特異性結合的抗體可以以較低親和力(如通過例如免疫測定、表面等離子共振(BIAcore)或本領域已知的其它測定來確定)與其它抗原結合。例如，當在相同濃度和相同條件下進行比較時，與另一抗體或對照抗體相比抗因子抗體與特定CC趨化因子結合的能力高出4倍或更高將被認為與CC趨化因子特異性結合。然而，可以使用其它比較性結合標準，所述標準在結合量或親和力中建立顯著性差異，這些包括抗因子抗體結合量高2、3、4、5、10、20、50、100或1000倍，或者結合親和力強2、5、10、15、20、100或至少1000倍。與2、3、4、5或更多種CC趨化因子特異性結合的抗體或片段不需要與其它非趨化因子抗原或非CC趨化因子發(fā)生交叉反應。可以通過免疫測定、BIAcore或本領域技術人員已知的其它技術對與CC趨化因子或其片段特異性結合的抗因子抗體或片段進行鑒定。抗體或其片段以高于任何交叉反應性抗原的親和力(如利用實驗技術所測定地，例如Western印跡、放射免疫測定(RIA)和酶聯免疫吸附測定(ELISA))與CC趨化因子抗原或其片段特異性結合。參見，例如Paul編，FundamentalImmunology,第2版，RavenPress,NewYork(1989)第332-336頁針對抗體特異性的論述。術語“抑制性濃度”是指與對照相比使CC趨化因子活性降低例如5%、10%、20%、30%、50%、80%、90%、95%、99%或多至100%之抗體(例如抗因子抗體或其CC趨化因子結合片段)的濃度?？梢栽隗w內或體外確定CC趨化因子活性，包括測定CC趨化因子活性(例如趨化性)。這些測定包括鈣流量或整聯蛋白活化。還可以在體內動物模型中確定抗因子抗體或其CC趨化因子結合片段以及對照抗體(例如那些不與CC趨化因子結合的抗體或與一種趨化因子結合的抗體)的調節(jié)作用，包括測定免疫現象(例如炎癥和自身免疫)中CC趨化因子活化的那些。抑制趨化因子的活性是指，與抑制劑不存在時相比，在該試劑存在下導致趨化因子的至少一種活性相對減少。抑制可包括趨化因子活性的拮抗或中和，例如通過抗體與趨化因子上的活性位點結合來實現，或通過導致趨化因子的有效去除、固定或失活的結合來實現。術語“趨化性抑制”是指，與抗體或其抗原結合片段不存在時觀察到的趨化活性相比，在抗體或其抗原結合片段存在下細胞的趨化活性的相對量減少。可以利用測定特定細胞類型(包括不同的白細胞類型)的趨化性抑制的公知方法，其通過引用ChemokineProtocols,Meth.inMol.Biol.138(2000),HumanaPress,Eds.AEIProudfoot,TNCWells,andCAPower而并入?！胺蛛x的”或“經純化的”產物或組分基本上不含該產物或組分所來源之細胞或組織來源的細胞物質或其它雜質蛋白，或者當通過化學方法合成時基本上不含化學物前體或其它化學物質。分離或經純化的組分、分子或其它物質(包括肽、多肽、抗體、趨化因子、多聚核酸或細胞)是從其通常的或天然的或固有的環(huán)境中回收或單獨合成的。分離的或經純化的產物或組分還可以物理方式或化學方式從與其締合的混合物或成分(包括不期望的生物雜質)中回收或分離，或者，如果合成時，從與其合成相關的底物或副產物中回收或分離。純化可擴展至任何程度，包括去除其它組分的1%、5%、10%、50%、75%、90%、95%或100%。在抗體情形中，分離可從血液或血清中回收，或者對于單克隆抗體來說，分離可從腹水或組織培養(yǎng)液中回收。術語“核酸”和“核苷酸序列”包括DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)、RNA分子(例如mRNA)、DNA和RNA分子的組合或DNA/RNA雜合分子以及DNA或RNA分子的類似物。本發(fā)明的核酸序列可以編碼抗因子抗體類似物或變體的部分。這樣的類似物可使用例如核苷酸類似物(包括但不限于次黃嘌呤核苷或三苯甲基化的堿基)來制備。這樣的類似物還可包括包含經修飾骨架的DNA或RNA分子，所述經修飾骨架賦予分子以有益性質(例如核酸酶抗性或提高的穿過細胞膜的能力)。核酸或核苷酸序列可以是單鏈的、雙鏈的，其可以同時包含單鏈和雙鏈部分，并且可以含有三鏈部分，但優(yōu)選為雙鏈DNA?！胺蛛x的”核酸分子是與核酸分子天然來源中存在的其它核酸分子相分尚的分子?！胺稚械摹焙怂岱肿?例如cDNA分子)可以基本上不含其它細胞物質，或者當通過重組技術產生時基本上不含培養(yǎng)基，或者當通過化學合成時基本上不含化學物質前體或其它化學物質。在一個實施方案中，編碼本發(fā)明之抗體或其片段的核酸分子是分離的或經純化的。本文中使用的術語“宿主細胞”是指經核酸分子轉染的特定對象細胞以及該細胞的后代細胞或潛在后代細胞。因為在連續(xù)傳代或核酸分子整合進宿主細胞基因組中時可能發(fā)生突變或環(huán)境影響，所以這種細胞的后代細胞可能與經核酸分子轉染的親本細胞不一致。宿主細胞可以用于重組表達抗因子抗體或其組分之一，例如輕鏈或重鏈或其片段。為了確定兩個核酸或氨基酸序列的“同一性百分比”，首先出于最佳比較的目的進行序列比對(例如，可將空位引入第一氨基酸或核酸序列中，以與第二氨基酸或核酸序列進行最佳比對)。接著對相應氨基酸位置或核苷酸位置處的氨基酸殘基或核苷酸進行比較。當第一序列中的位置被第二序列中相應位置處相同的氨基酸殘基或核苷酸占據時，則分子在該位置是一致的。兩個序列之間的同一性百分比是序列共有之相同位置的數目的函數(即，同一性％=相同的重疊位置的數目/總位置數X100%)。在一個實施方案中，兩個序列長度相同。還可以利用數學算法來確定兩個序列之間的同一性百分比。用于比較兩個序列的數學算法的優(yōu)選、非限制性實例有Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:2264-2268(1990)的算法，如Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5873-5877(1993)中所改良。將這種算法與Altschul等人，J.Mol.Biol.215403(1990)的NBLAST和XBLAST程序相聯合。可以利用NBLAST核苷酸程序參數設定(例如分值=100，字長=12)進行BLAST核苷酸檢索，以獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列?？梢岳肵BLAST程序參數設定(例如分值=50，字長=3)進行BLAST蛋白質檢索，以獲得與本發(fā)明的蛋白質分子同源的氨基酸序列。為了比較目的獲得空位比對，可以如Altschul等人，NucleicAcidsRes.25:3389-3402(1997)所述利用GappedBLAST。又或者，可以利用PSI-BLAST進行迭代檢索(iteratedsearch)，其檢測分子之間的遠源關系(同上)。當利用BLAST、GappedBLAST和PSI-Blast程序時，可以使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省參數。用于比較序列的數學算法的另一優(yōu)選、非限制性實例是Myers和Miller,CABIOS4:11-17(1988)的算法。將這種算法與ALIGN程序(2.0版)相聯合，所述ALIGH程序是GCG序列比對軟件包的一部分。當利用ALIGN程序比較氨基酸序列時，可以使用PAM120權重殘基表(weightresiduetable)、空位長度罰分12以及空位罰分4?？梢岳门c上述類似的技術確定兩個序列之間的同一性百分比，其中允許或不允許具有空位。在計算同一性百分比時，通常僅計數精確配對。“保守性變化”是指在構象或抗原性方面基本上不變的變化，與親本或本源肽或多肽相比，其產生肽或多肽變體三級結構的最小變化，或產生肽或多肽變體或類似物抗原決定簇的最小變化。在趨化因子的情形中，保守性變化包括基本上不影響所得趨化因子變體或類似物之特異性和/或親和力(例如，如通過其表現出親本趨化因子的至少一種功能的能力所確定地，所述功能包括例如誘導趨化現象、參與細胞因子網絡或者誘導酶或細胞因子的產生，或者與親本或天然趨化因子的受體相結合)的氨基酸替換。當應用于抗體的變體或類似物、抗體片段(包括CDR區(qū)段)時，保守性變化是指產生能夠與相應未經修飾之抗體產物的相同表位或抗原結合之抗體產物的氨基酸替換。預測哪種氨基酸替換使分子在構象和抗原性方面保持不變在本領域的范疇之內，如由Berzofsky,Science229932-940(1985)以及Bowie等人，Science247:1306-1310(1990)所述。對于哪種替換最有可能在構象和抗原性方面保持不變的指導包括(a)由于疏水性殘基更可能位于蛋白質內部，因此對疏水性氨基酸的替換較少可能影響抗原性，(b)用生化性質相似的氨基酸進行替換較少可能影響構象，這是因為經替換的氨基酸在結構上模擬天然氨基酸；和(C)改變進化上保守的序列可能對構象產生不利影響，因為這種保守性表明這些氨基酸序列在功能上可能具有重要性。“組合物”或“藥物或治療性組合物”是指含有抗因子抗體或其CC趨化因子結合片段或其另外之片段的載體、賦形劑或溶液的組合，其直接地或間接地治療由CC趨化因子介導的病癥、功能異常或疾病或其至少一種癥狀，或者降低其嚴重性。術語“可藥用載體“包括與本發(fā)明的分子相容并且適于藥物施用的任何以及所有的載體和賦形劑，例如稀釋劑、溶劑、分散劑、乳化劑、脂質雙分子層、脂質體、包衣、防腐劑(包括抗細菌劑或抗真菌劑)、等滲劑、PH緩沖劑以及吸收調節(jié)劑等。使用這些載體、崩解劑、賦形劑和試劑用于施用藥學活性物質是本領域公知的，參見HandbookofPharmaceuticalExcipients,第3版，Am.Pharm.Assoc.(2000),其通過引用而并入。本發(fā)明的藥物組合物通常制備為與預期施用途徑(例如腸胃外、經口或表面施用)相容。本發(fā)明的治療性組合物包括在可藥用載體中的本發(fā)明至少一種抗體或抗體片段?！翱伤幱幂d體”是常規(guī)地與活性成分、生物學產物或藥物相混合并適于施用的至少一種組分。載體可以含有本領域中使用的任何藥物賦形劑以及任何形式的施用載劑。組合物可以例如是注射用溶液、含水混懸液或溶液、非含水懸液或溶液、噴霧、固體和液體口服制劑、藥膏、凝膠、軟膏、皮內貼劑、霜劑、洗劑、片劑、膠囊、持續(xù)釋放制劑等。另外的賦形劑可以包括例如著色劑、遮味劑、助溶劑、助懸劑、壓縮劑、腸溶衣、持續(xù)釋放助劑等。本領域技術人員可以根據例如u.S.FDACDERDataStandardsManualC-DRG-00201，Version08所述的劑型或FDA網站http://www.fda.gov/Forlndustry/DataStandards/StructuredProductLabeling/ucml62038.htm(2010年8月9日最后一次登錄)上列出的劑型來選擇適宜的劑型，二者通過引用并入本文。經口施用的組合物可包括固體載體或賦形劑，或者可以制備成液體或凝膠制備物，可以包括可食用的或惰性的載體，并且可以包封于膠囊中、壓制成片劑或制備成錠劑。經口施用的組合物可以制備成延時釋放或包封形式，從而防止在胃中降解并優(yōu)化分子吸收。注射用組合物可通過本領域公知的方法制備，其可包含治療性分子的無菌溶液或分散劑體系。這常常包括無菌稀釋劑(例如水、生理鹽水)或與本發(fā)明分子相容的其它緩沖劑。注射用組合物可制備成單位劑量或者制備在單位劑量容器(例如小管、安瓿瓶或注射器)中?？梢允褂贸Ｒ?guī)的緩沖劑和等滲劑，并且可以利用公知的試劑(例如HCl或NaOH或緩沖劑)調節(jié)PH值?？梢源嬖诳刮⑸飫┗蛞志鷦?、螯合劑(例如EDTA或EGTA)和抗氧化劑以及防腐劑。本發(fā)明的治療性組合物可以通過任何可接受的施用途徑施用，包括表面、粘膜上、經口或經腸或腸胃外施用。這些途徑包括但不限于表面、透粘膜、經口(包括含服、舌下)、粘膜(結膜、鼻、竇、尿道、陰道、腸、直腸)、經腸、透皮、皮內、皮下(s.C.)、肌內、腹膜內、靜脈內(i.V.)、心臟內、關節(jié)或骨內、器官(腦、脊柱、眼、耳、肝、脾、腎、膽囊、膀胱)內、骨內、軟骨內或關節(jié)組織內、經吸入(例如鼻內、氣管內、肺內或支氣管內)、口服、經頰(subuccal)。本領域技術人員可以根據U.S.FDA,CDER,DataStandardsManual“RoutesofAdministration”，CDRG-00301,004版列出的那些或根據http://www.fda.gov/Drugs/GuidanceCompIianceRegulatoryInformation/DrugRegistrationandListing/ucm084039.htm(2010年8月9日最后一次登錄)(通過引用并入本文)表2中的那些對途徑進行選擇?！爸委熡行Я俊笔侵缸阋灾委熡蒀C趨化因子介導的病癥、功能異常或疾病或者降低其嚴重性、增強所述病癥、功能異常或疾病之另一療法的療效或者防止所述病癥、功能異常或疾病或其至少一種癥狀復發(fā)或嚴重性增加的治療劑的量。治療有效量可以指足以延緩疾病發(fā)作或使其降至最低的治療劑的量。治療有效量還可以指在疾病的治療或控制中提供治療益處的治療劑的量。此外，本發(fā)明治療劑的治療有效量是指在疾病的治療或控制中提供治療益處(例如足以增強足以治療或管理疾病之治療性抗體的治療效力)的治療劑單獨的量或者與其它療法聯用時的量。涉及本發(fā)明抗體的量時，該術語可以包括改善總體治療、減少或避免不期望的作用或者額外地增強或協同增強另一治療劑之治療效力的量。本文中使用的術語“對象”或“患者”是指表達CC趨化因子的脊椎動物，包括鳥類和哺乳動物(例如牛、馬、豬、山羊、綿羊、犬科動物或貓科動物)，優(yōu)選是人。對象或患者可以是需要用有效量的抗因子抗體進行治療的，所述抗因子抗體調節(jié)其所識別之CC趨化因子的CC趨化因子活性?！把仔圆“Y、功能異?；蚣膊　笔侵该黠@的或可定量的生理現象，其包括但不限于浮腫、發(fā)熱、白細胞的趨化或遷移、血管增殖、結締組織增殖、發(fā)紅、局部熱、滲液以及如Robbins,ThePathologicalBasisofDisease,第6版，Cotran等人編，W.B.Saunders,Co.(1999)(特別是第3、7和15章)中所描述的其它指征。在CC趨化因子之抗因子抗體的背景下，該術語是指與CC趨化因子(例如MIP-Ia、MIP-I^、RANTES、MCP-I或其它趨化因子)有關或由其直接或間接介導的現象。“免疫親和樹脂”是指結合至少一種免疫配體或受體的固體基質。例如，抗因子抗體可以通過其除抗原結合位點以外的區(qū)域與樹脂結合，從而使得抗體與CC趨化因子上的抗原決定簇結合。類似地，CC趨化因子可以有效地結合到樹脂上，同時允許其與抗因子抗體結合。可用于固定免疫配體或受體的許多樹脂是本領域已知的，其常規(guī)地用于形成免疫親和樹脂。這種樹脂可以用于分析被特定配體或受體結合的組分、用于免疫測定中或用于純化方法中?？梢允褂萌魏芜@種樹脂形成本發(fā)明的免疫親和樹脂。本發(fā)明人試圖尋找解決現有技術中與施用多種CC趨化因子抗體相關的難題。出人意料地，他們發(fā)現了能夠與多于一種類型之CC趨化因子結合的抗體一抗因子抗體。這些抗因子抗體提供了對于在炎性疾病情形中抑制單種趨化因子或單種趨化因子受體的改進，因為僅需要一種抗體即可阻斷多種趨化因子的功能。本發(fā)明的抗因子抗體還避免了施用具有不同藥代動力學性質之兩種或更多種抗體的缺點，例如針對每種抗體使用不方便的、單獨的給藥方案?？挂蜃涌贵w避免了雙特異性抗體的劣勢，所述雙特異性抗體與特定趨化因子抗原結合的效率較低并且形成更易于與Fe受體結合從而被細胞攝入并在溶酶體中降解的復合物。如本文所述，本發(fā)明人提供了幾種抗因子抗體，其可簡化對由多種趨化因子介導之人炎性和免疫學病癥、功能異常和疾病的治療。這些抗因子抗體將用作結構和功能原型，以通過例如親和力成熟和抗體人源化方法產生更有效和安全的抗因子抗體。抗因子抗體與兩種或更多種CC趨化因子結合并抑制其活性。通過靶向CC趨化因子(包括MIP-Ia、MIP-IP、RANTES和MCP-1)，本發(fā)明人鑒定出可用于調節(jié)趨化因子的抗體，所述趨化因子活化相同或不同的趨化因子受體(包括CCR1、CCR2、CCR3和CCR5)。例如，由于MIP-Ia、MIP-I^和RANTES均與趨化因子受體CCR5結合，因此識別這三種CC趨化因子的抗因子抗體比針對一種CC趨化因子的抗體能夠更全面地調節(jié)CCR5的活性。CCR5的活化靶向未成熟的骨髓樹突細胞、單核細胞、Thl、TMg、NK和漿細胞樣樹突細胞。類似地，MIP-Ia、RANTES、MPIF-1和HCC-I均與CCRl結合，其活化靶向單核細胞、記憶性T細胞和NK細胞。與這些CCRl結合之趨化因子中的兩種或更多種結合的抗因子抗體更全面地調節(jié)受體的活化。因而，能夠同時結合并抑制MIP-Ia和RANTES的抗體有效地阻斷CCRl和CCR5兩者的兩種主要配體。因此，本發(fā)明人已鑒定出抑制不同趨化因子受體之主要配體的抗因子抗體，所述受體在白細胞(包括參與炎性疾病的單核細胞和T細胞)上表達。針對這些趨化因子組合之任一種的抑制劑提供了對在炎性疾病情形中抑制一種趨化因子(或抗體阻斷與單種趨化因子受體的結合)的改進，因為僅需要一種抗體即可阻斷單個受體上多種趨化因子的功能或多種受體上趨化因子的活性。抗因子抗體具有不同的特異性和功能活性，這取決于其所結合的趨化因子。本發(fā)明提供了與多種CC趨化因子特異性結合并且有利地與RANTES、MIP-Ia、MIP-IP和/或MCP-I中至少兩種結合的抗因子抗體。本發(fā)明進一步提供了與RANTES和MIP-Ia、與RANTES和MIP-IP、與RANTES和MCP-I、與MIP-Ia和MIP-1^、與MIP-1a和MCP-1或與MIP-13和MCP-I特異性結合的抗體。類似地，本發(fā)明提供了與RANTES、MIP-1a、MIP-1P和/或MCP-I中至少三種或四種以及與其它緊密相關的CC趨化因子結合的抗因子抗體?？贵w或結合抗原之抗體片段與趨化因子的結合通過抗體的抗原結合位點(ABS)中的氨基酸殘基與趨化因子抗原決定簇或表位之間的接觸而發(fā)生。公知的是，表位可以是包含多個抗原決定簇的線性肽序列或構象表位，甚至是不構成線性連續(xù)氨基酸序列之一部分的單個氨基酸或氨基酸側鏈。例如，位于a-螺旋一面上的殘基可以與抗體的ABS接觸，而相反面上的那些則不能。本發(fā)明的抗體和結合抗原之抗體片段可以與不含信號肽之成熟CC趨化因子的N末端或C末端一半相結合。例如，人RANTES的成熟形式缺少信號肽殘基1-23。因此，其N末端部分的范圍是殘基1-35，其C-末端的范圍是36-68(SEQIDNO:73)。本發(fā)明的抗體和結合抗原之抗體片段可以通過與跟趨化因子結合其受體相關的CC趨化因子殘基結合而阻斷CC趨化因子的結合。有關所提出的CC趨化因子功能性結構域，參見NCBI保守性結構域數據庫(ConservedDomainDatabase)CDD29111,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez(2010年8月9日最后一次登錄)。每種CC趨化因子的潛在結合位點殘基顯示如下CCL3/MIP-1aSEQIDNO:71的殘基11-15(CCFSY)、殘基17-24(SRQIPQNF)、殘基34-35(QC)和殘基57-67(EffVQKYVSDLE)；CCL4/MIP-1PSEQIDNO:72的殘基11-15(CCFSY)、殘基17-24(ARKIPHNF)、殘基34-35(LC)或殘基57-67(SffVQEYVYDLE)；CCL5/RANTESSEQIDNO:73的殘基10-14(CCFAY)、殘基16-23(ARPLPRAH)、殘基33-34(KC)或殘基56-66(KffVREYINSLE)。CCL14/HCC-1SEQIDNO:78的殘基8-12(CCFTY)、殘基14-21(TYKIPRQR)、殘基31-32(QC)或殘基54-64(KWVQDHKDMK)。CCL15/HCC-2SEQIDNO:79的殘基8-12(CCTSY)、殘基14-21(SQSIPCSL)、殘基31-32(EC)或殘基54-64(PGVQDCMKKLK)。CCL23/MPIF-1SEQIDNO81的殘基9-13(CCISY)、殘基15-22(PRSIPCSL)、殘基32-33(EC)或殘基55-65(KQVQVCMRMLK)。CCL18/PARCSEQIDNO:82的殘基10-14(CCLVY)、殘基16-23(SWQIPQKF)、殘基33-34(QC)或殘基56-66(KWVQKYISDLK)。這樣的抗體或抗原結合片段可以與MCP-1、MIP-1a、MIP-1P和RANTES以及其它相關CC趨化因子(其參與所述趨化因子與其受體的結合)中至少兩種的區(qū)段結合。抗因子抗體(例如3C12F)可以與結合趨化因子之病毒蛋白(例如vCCI)的相同決定簇結合，或可以抑制這些病毒蛋白與趨化因子的結合。本發(fā)明人已產生并表征了與CC趨化因子RANTES、MIP_la和/或MIP-1P結合的單克隆抗體3C12F、7D1G、7D12A、18V4F和18P7E。這些抗體提供必要的信息，包括高變區(qū)以及輕鏈和重鏈CDR的結構信息，以開發(fā)能夠同時調節(jié)多種CC趨化因子活性的人源化抗體以及治療由CC趨化因子介導的炎性疾病。上述三種MAb的高變序列和CDR序列如下所示3C12F-SEQIDNO:2_5和7_10；人源化3C12F-SEQIDNO:52-55和57-60；7D12A-SEQIDNO:12-15和17-20；7D1G-SEQIDNO:22-25和27-30；18V4F-SEQIDNO:32-35和37-40;人源化18V4F-SEQIDNO:62-65和67-70;以及18P7E-SEQIDNO:42-45和47-50。公開了五種特定類型的抗因子抗體，表征為特定抗因子抗體3C12F、7D1G、7D12A、18V4F和18P7E。此外，公開了人源化形式的3C12F和18V4F。第一類型的抗體通過由雜交瘤細胞系3C12F或其繼代培養(yǎng)物產生之單克隆抗體的結合特異性來表征。該類型的單克隆抗體(MAb)的典型抗體是3C12F。因此該類型包括MAb3C12F，以及其類似物和衍生物，包括通過親和力成熟或通過人源化方法產生的抗體。3C12F類型的抗體可以含有SEQIDNO:2或52所示的重鏈可變區(qū)或含有3C12F重鏈的CDRl(SEQIDNO:3或53)、CDR2(SEQIDNO:4或54)和CDR3(SEQIDNO:5或55)中至少一個的重鏈。這種抗體可以含有包含SEQIDNO:7或57或含有如SEQIDNO:8或58所示的CDRUnSEQIDNO9或59所示的CDR2和如SEQIDNO:10或60所示的CDR3中至少一個的輕鏈可變區(qū)。SEQIDNO:2-5和7-10描述非人源化3C12F，而SEQIDNO:52-55和57-60描述人源化3C12F。人源化3C12F含有SEQIDNO52所示的重鏈可變區(qū)，或含有3C12F重鏈的CDRl(SEQIDNO:53)、CDR2(SEQIDNO54)和CDR3(SEQIDNO55)中至少一個的重鏈。這種抗體可以包含含有SEQIDNO:57或含有如SEQIDN0:58所示的⑶R1、如SEQIDNO59所示的CDR2和如SEQIDNO60所示的CDR3中至少一個的輕鏈可變區(qū)。第二類型的抗體通過由雜交瘤細胞系7D12A或其繼代培養(yǎng)物產生之單克隆抗體的結合特異性來表征。該類型的單克隆抗體(MAb)的典型抗體是7D12A。因此該類型包括MAb7D12A，以及其類似物和衍生物，包括通過親和力成熟或通過人源化方法產生的那些抗體。7D12A抗體類型的抗體可以含有SEQIDNO:12所示的重鏈可變區(qū)或含有7D12A重鏈的CDRl(SEQIDNO:13)、CDR2(SEQIDNO:14)和CDR3(SEQIDNO:15)中至少一個的重鏈。其還可以包含含有SEQIDNO:17或含有如SEQIDNO:18所示的CDRl、如SEQIDNO19所示的⑶R2和如SEQIDNO20所示的⑶R3中至少一個的輕鏈可變區(qū)。第三類型的抗體通過由雜交瘤細胞系7D1G或其繼代培養(yǎng)物產生之單克隆抗體的結合特異性來表征。該類型的單克隆抗體(MAb)的典型抗體是7D1G。該類型包括MAb7D1G以及其類似物和衍生物，包括通過親和力成熟或通過人源化方法產生的那些抗體。7D1G類型的抗體可以含有SEQIDN0:22所示的重鏈可變區(qū)或含有7D1G重鏈的CDR1(SEQIDNO:23)、CDR2(SEQIDNO:24)和CDR3(SEQIDNO:25)中至少一個的重鏈。其還可以包含含有SEQIDNO:27或含有如SEQIDNO:28所示的CDRl、如SEQIDNO:29所示的CDR2和如SEQIDNO30所示的⑶R3中至少一個的輕鏈可變區(qū)。第四類型的抗體通過由雜交瘤細胞系18V4F或其繼代培養(yǎng)物產生之單克隆抗體的結合特異性來表征。該類型的單克隆抗體(MAb)的典型抗體是18V4F。該類型包括MAb18V4F以及其類似物和衍生物，包括通過親和力成熟或通過人源化方法產生的那些抗體。18V4F類型的抗體可以含有SEQIDNO32或62所示的重鏈可變區(qū)或含有18V4F重鏈的CDRl(SEQIDNO:33或63)、CDR2(SEQIDNO:34或64)和CDR3(SEQIDNO:35或65)中至少一個的重鏈。其還可以含有包含SEQIDNO:37或67或含有如SEQIDN0:38或68所示的CDRUnSEQIDNO:39或69所示的CDR2和如SEQIDNO40或70所示的CDR3中至少一個的輕鏈可變區(qū)。SEQIDNO:32-35和37-40描述非人源化18V4F，而SEQIDNO:62-65和67-70描述人源化18V4F。人源化18V4F含有SEQIDNO:62所示的重鏈可變區(qū)或含有18V4F重鏈的CDRl(SEQIDNO:63)、CDR2(SEQIDNO64)和CDR3(SEQIDNO65)中至少一個的重鏈。這種抗體可以包含含有SEQIDNO:67或含有如SEQIDNO:68所示的⑶R1、如SEQIDNO69所示的CDR2和如SEQIDNO70所示的CDR3中至少一個的輕鏈可變區(qū)。第五類型的抗體通過由雜交瘤細胞系18P7E或其繼代培養(yǎng)物產生之單克隆抗體的結合特異性來表征。該類型的單克隆抗體(MAb)的典型抗體是18P7E。該類型包括MAb18P7E以及其類似物和衍生物，包括通過親和力成熟或通過人源化方法產生的那些抗體。18P7E類型的抗體可以含有SEQIDN0:42所示的重鏈可變區(qū)或含有18P7E重鏈的CDRl(SEQIDNO:43)、CDR2(SEQIDNO:44)和CDR3(SEQIDNO:45)中至少一個的重鏈。其還可以包含含有SEQIDNO:47或含有如SEQIDNO:48所示的CDRl、如SEQIDNO:49所示的⑶R2和如SEQIDNO50所示的⑶R3中至少一個的輕鏈可變區(qū)。除了上述特定類型的抗因子抗體之外，本發(fā)明還包括與3、4、5或更多種趨化因子結合的抗因子抗體，例如與MIP-1a、MIP-1^、RANTES和/或其它相關CC趨化因子結合的抗因子抗體(例如MAb3C12F以及上面描述的其它抗體)。有利地，抗因子抗體可以針對與特定CCR結合的所有CC趨化因子而產生，或者其可以靶向參與特定病癥、功能異常或疾病的那些CC趨化因子?？挂蜃涌贵w具有足以允許其與CC趨化因子結合的結合親和力。與其所結合之CC趨化因子的示例性結合親和力包括1，000、900、800、400、200、150、100、75、50、40、30、20、10、5、I、0.InM或更少。然而，如附圖所示，不同的CC趨化因子可以具有不同的結合親和力。本領域技術人員有能力選擇具有適當結合親和力的抗體。出于許多治療目的，具有高親和力的抗體比具有低親和力的抗體更為理想，例如已表明被動施用的高親和力抗體比低親和力抗體能夠更有效地去除體內抗原,較高親和力的抗體產生較低水平的循環(huán)免疫復合物，并且對腎小球功能損害較小(Steward,AntibodiesTheirStructureandFunction,TaylorandFrancis(1984),參見表4、5),確定抗體親和力的方法以及低和高親和力抗體的特性和功能通過引用上述文獻而并入。另一方面，抗體的中和能力不僅取決于其親和力，還取決于其濃度、價數和分子構型以及其所施用的位點，對于一些應用來說，較高濃度的較低親和力之抗體可以是理想的。用于產生抗因子抗體的免疫原可以包括分離的天然CC趨化因子制備物、重組表達的CC趨化因子或化學合成的CC趨化因子以及任選地佐劑。用于增強免疫應答的各種佐劑包括但不限于弗氏(Freund’s)(完全和不完全)、礦物凝膠(例如氫氧化鋁)、表面活性物質(例如溶血卵磷脂、聚醚多元醇(pluronicpolyol)、聚陰離子、肽、油乳齊[I、二硝基苯酹等)、人佐劑(例如卡介苗(BacilleCalmette-Guerin)和短小棒狀桿菌(corynebacteriumparvum))或類似的免疫刺激劑。MIP-1a、MIP-1^、RANTES和MCP_1蛋白的序列以及編碼這些蛋白的多核苷酸序列是已知的，其可見于例如公眾可獲得的序列數據庫(例如GenBank中或參考表4中的登記號。除非另有說明，這些序列的適當版本是本申請臨申請前進入這些數據庫的那些序列。此外，各種CC趨化因子(包括MIP-1a、MIP-1@、RANTES和MCP-1)的序列已公開，其可見于例如Furutani等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.159:249_255(1989)(MCP-1),Obaru等人，J.Biochem.99:885-894(1986)(MIP-1a);Lipes等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA859704-9708(1988)(MIP-lW;SchalI等人，Immunol.141:1018-1025(1988)(RANTES)中，每篇公開內容均作為整體通過引用并入本文。公知地，一些或所有這些趨化因子存在等位基因變體。SEQIDNO:71-74示出用于免疫以及篩選針對MIP-1a、RANTES和MCP-I之抗因子抗體的人序列。為了生產單克隆抗體，可以通過注射CC趨化因子的天然蛋白或其合成的變體或衍生物或多于一種CC趨化因子的組合，對多種合適的宿主動物(例如兔、山羊、小鼠或其它哺乳動物)進行免疫。例如，可以用MIP-1a,MIP-1^>RANTES和MCP-I的混合物作為免疫原來誘導針對這些CC趨化因子的免疫應答。如果需要，可以從哺乳動物中(例如從血液中)分離出針對CC趨化因子的多克隆抗體分子，并通過公知技術(例如，蛋白A色譜)進行進一步純化，以獲得免疫球蛋白級分，以及進行免疫親和純化以選擇與兩種或更多種CC趨化因子結合的抗因子抗體。對于許多應用而言，優(yōu)選產生單克隆抗體形式的抗因子抗體?？梢允褂脼榱送ㄟ^連續(xù)細胞系培養(yǎng)產生抗體分子而提供的任何技術。這些技術包括但不限于雜交瘤技術(參見Kiihler■和Milstein,Nature256:495-497(1975))、三體雜交瘤(trioma)技術、人B細胞雜交瘤技術(參見Kozbor等人,Immunol.Today4:72(1983))以及EBV雜交瘤技術以產生人單克隆抗體(參見Cole等人，In:MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss，Inc.，77-96頁(1985))?？梢岳萌藛慰寺】贵w實施本發(fā)明，其可以通過如Cote等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80=2026-2030(1983)所述利用人雜交瘤產生，或通過用EB病毒體外轉化人B細胞而產生，參見Cole等人，In:MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,Inc.,77-96頁(1985)。本段中引用的所有文獻通過引用而并入。除了這些產生單克隆抗體的常規(guī)方式以外，本發(fā)明人發(fā)現，就抗原原罪(antigenicsin)(Hoskins效應)的問題而言,序貫免疫方法出人意料地產生識別多于一種CC趨化因子的抗因子抗體。發(fā)現免疫的順序影響所得抗體的特異性。發(fā)現這些方法可以產生與特定CC趨化因子結合的抗體以及阻斷痘病毒vCCI蛋白與CC趨化因子(RANTES/CCL5)結合的一些抗體。通過例如用合適佐劑中的第一趨化因子對動物進行免疫，數周后用第二趨化因子加強免疫，最后用第三趨化因子進行二次加強免疫，從而用不同的趨化因子對脊椎動物(優(yōu)選小鼠)進行序貫免疫。然而，可以通過涉及多次免疫和加強免疫的方法(例如利用2、3、4或更多種不同趨化因子的不同組合)產生抗因子抗體?？梢赃M行基于蛋白質和DNA的趨化因子免疫。DNA免疫是本領域公知的,其通過引用AntibodiesALaboratoryManual(E.Harlow和D.Lane編，1988)而并入。趨化因子的多核苷酸序列是本領域公知的，其也通過引用Yoshie等人，Adv.Immunol.78:57-110(2001)而并入?？梢岳米魟┗蜈吇蜃优c載體蛋白的綴合物進行免疫，例如由AntibodiesALaboratoryManual,E.Harlow和D.Lane編(1988)(通過引用而并入)所述的那些。優(yōu)選地，向每只小鼠施用約500yg/kg體重或約IOug的趨化因子，并且優(yōu)選的初次免疫的佐劑是完全弗氏佐劑，隨后加強免疫的佐劑是不完全弗氏佐劑。用作免疫原的示例性CC趨化因子包括CCL2/MCP-1、CCL3/MIP-1a、CCL4/MIP-1^和CCL5/RANTES中的至少兩種。在序貫免疫的一個實施方案中，首先用MIP-1a對小鼠進行免疫，隨后用RANTES和/或MCP-I進行加強免疫，或者，使用CC趨化因子RANTES、MIP-la、MIP-1@和/或MCP-1的任何其它順序。通過ELISA對小鼠血清進行針對RANTES、MIP-1a、MIP-1^和MCP-I的反應性測試。接著用具有合適血清應答之小鼠的脾臟進行雜交瘤生產?？梢酝ㄟ^ELISA對由雜交瘤細胞系產生的抗體進行識別CC趨化因子之能力的測試以及在體外趨化測定中或在vCCI/趨化因子結合測定中進行阻斷活性的測試。利用這種策略，鑒定出結合并抑制多種CC趨化因子的幾種獨特的單克隆抗體。這些抗體被命名為“抗因子抗體”。還可以在其它功能性測定中對雜交瘤產生的抗體進行測試。接著對產生具有多種CC趨化因子反應性之抗體的雜交瘤細胞系進行克隆和擴增，以產生抗體并進行純化。確定抗體結合特異性的篩選測定是本領域公知且常規(guī)實施的。對于這些測定的全面論述，參見Harlow等人編，AntibodiesALaboratoryManual；ColdSpringHarborLaboratory；ColdSpringHarbor,N.Y.,第6章(1988)。初始鑒定后，可以例如通過親和力成熟或通過改造其⑶R或框架序列對抗因子抗體進行親和力增強，或者其可以被人源化。對于人類治療中的用途，優(yōu)選地，抗因子抗體完全是人的或是人源化的，并識別2、3、4或更多種CC趨化因子。在一個實施方案中，篩選具有期望特異性之抗體的方法包括但不限于酶聯免疫吸附測定(ELISA)和本領域已知的其它免疫學介導的技術。在一個特定的實施方案中，通過產生與具有CC趨化因子特定結構域的CC趨化因子片段結合的雜交瘤，從而有利于對特異性針對該結構域的抗體進行選擇。本文中還提供了特異性針對CC趨化因子內一個或更多個結構域(例如CC趨化因子家族蛋白的保守性結構域或其衍生物、片段、類似物或同源物)的抗體?？梢栽诟偁幮院头歉偁幮越Y合免疫測定中測試本發(fā)明的抗因子抗體和其片段與CC趨化因子(特別是MIP-1a、MIP-1P、RANTES、MCP-I和/或其它趨化因子)的特異性結合。免疫測定的公知方法通過引用Stites和Terr編，BasicandClinicalImmunology,第7版(1991);Maggio編EnzymeImmunoassay,CRCPress,BocaRaton,Fla.(1980)；Tijan,PracticeandTheoryofEnzymeImmunoassays,LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,ElsevierSciencePublishersB.V.,Amsterdam(1985);Harlow和Lane編，Antibodies,aLaboratoryManual,ColdSpringHarbor,N.Y.(1988);Chan編，Immunoassay:APracticeGuide,AcademicPress,Orlando,Fla.(1987);Price和Newman編，PrinciplesandPracticeofImmunoassays,StocktonPress,N.Y.(1991)以及Ngo編(1988)Non-isotopicImmunoassays,PlenumPress,N.Y.(1988)而并入。測定抗體結合的免疫測定可以是競爭性或非競爭性的。一般地，在抗體的情況下，競爭性測定涉及兩個抗體之間競爭性結合配體。例如，可以使用經標記的MCP-I評估一種抗體是否可與另一抗體競爭結合經標記的MCP-1。測定可以基于例如酶聯免疫吸附測定(ELISA)或例如放射性免疫測試(RIA)的標準測定?；蛘撸梢栽诜歉偁幮詼y定中測試本發(fā)明的抗體和抗體片段與底物的結合。例如，可以利用標準ELISA，其中將配體(例如MCP-1)固定于ELISA板上。使測試抗體與配體孵育并使其結合。對板進行清洗，其后如果測試抗體與配體結合，則經酶綴合的第二抗體(例如小鼠抗人Fe抗體)與測試抗體結合。清洗后，加入酶的底物，并使其與酶反應。一般地，顏色的變化表示存在與配體反應的抗體?？舍槍Σ煌腃C趨化因子重復進行ELISA，以確定測試抗體識別哪些趨化因子。免疫測定中常常使用經標記的測定組分。標記物可采用多種形式，其可以依照本領域公知的方法直接或間接地偶聯至期望的測定組分。測定組分的常用標記物包括放射性同位素(包括3h、125i、35s、14c和32P)、熒光團、化學發(fā)光試劑和酶。具體標記物的選擇將取決于所需靈敏度、與化合物綴合的容易程度、穩(wěn)定性要求以及可利用的儀器，并且其可以由本領域普通技術人員容易地確定。評估本發(fā)明的抗體是否抑制CC趨化因子(特別是MIP-1a、MIP-1^、RANTES、MCP-I和/或其它趨化因子)活性的測定可以利用針對趨化性、胞內鈣增加等已知測定容易地進行。例如但不限于，可以在96孔塑料腔室中進行趨化因子趨化性測定。所述孔通過濾器分為兩個區(qū)室。濾器允許細胞響應于化學物梯度從一個區(qū)室穿過進入另一區(qū)室。將測試細胞放置于腔室的一個區(qū)室中的培養(yǎng)基中，CC趨化因子例如放置于另一區(qū)室中的培養(yǎng)基中。對穿過濾器的細胞進行計數。在其它孔中，將CC趨化因子與測試抗體混合，以確定抗體是否能夠阻斷細胞遷移。為了對通過如上篩選方法鑒定出的抗因子單克隆抗體進行進一步抗體改造，如實施例7中所述地確定抗體的DNA序列?？梢岳帽绢I域已知的方法進一步提高本發(fā)明之抗因子抗體的親和力，例如由Raipal等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.102:8466-8471(2005)；Lippow等人，Nat.Biotechnol.25:1171-1176(2007);Wu等人，J.Mol.Biol.368=652-665(2007);Yang等人，J.Mol.Biol.254:392-403(1995)以及Huse等人，J.Immunol.149:3903-3913(1992)所描述的那些方法，其中每篇均作為教導親和力成熟或抗體增強的方法通過引用而并入。本發(fā)明的抗因子抗體可以具有少于200、IOOnM的親和力(例如最初分離的鼠抗體3C12F對MIP-Ia具有49恤的親和力)，其通過親和力成熟方法可以增強到少于40、30、20、10、5、1、0.5或0.InM。用于單克隆抗體親和力成熟的方法是本領域公知的,其通過引用AntibodyEngineering(HumanaPress,2004)以及PhageDisplay,T.Clackson和H.BLowman,editors(OxfordUniversityPress,2004)而并入。這些方法可以起始于這種抗因子抗體的嵌合形式，其可以單獨地進行人源化或與親和力成熟同時進行人源化。抗體的可變區(qū)可以表示為纖維狀噬菌體表面上的Fab片段。可以實施誘變方案，以改變6個CDR內的任一殘基，以制備噬菌體上表達之Fab片段的組合文庫?？梢詫@些進行趨化因子抗原結合的篩選以及親和力提高的分析。隨后，可以聯合進行優(yōu)選氨基酸替換，以使親和力甚至更大地提高。同時可以對可變結構域框架區(qū)內的突變進行分析，以找到具有改進性質的序列。由于親本抗體序列中一個或更多個氨基酸殘基的添加、缺失和/或替換，上述“變體”或“類似物”抗體的氨基酸序列與親本抗體的氨基酸序列不同。在一個實施方案中，變體包含親本抗體一個或更多個高變區(qū)中的一個或更多個氨基酸替換?？梢酝ㄟ^替換3C12F、7D1G、7D12A、18V4F或18P7E重鏈或輕鏈序列的CDR、高變區(qū)或框架區(qū)中1、2、3、4、5、6、7、8或更多個氨基酸殘基，對抗體類似物進行改造。類似地，可以通過本領域已知的同種型轉換(isotypeswitching)技術或通過基因改造方法(例如⑶R移植、形成嵌合抗體或人源化)改變這種抗體的同種型。可以通過3C12F、7D1G、7D12A、18V4F或18P7E類型的單克隆抗體的親和力成熟方法產生類似物。一般地，選擇具有更高結合親和力或同時可獲得的更寬趨化因子結合譜的類似物?？梢酝ㄟ^例如利用ELISA或其它公知的測定確定類似物是否與親本抗體所結合之相同趨化因子結合，從而容易地對類似物進行鑒定。類似物包括重鏈和輕鏈與3C12F、7D1G、7D12AU8V4F或18P7E的相應重鏈和輕鏈序列共有約90、95、99或100%序列同一性的那些變體?？梢詫τ?C12F、7D1G、7D12A、18V4F或18P7E雜交瘤細胞系或其繼代培養(yǎng)物產生之抗體的經親和力成熟的變體進行選擇，選擇具有I，000、800、400、200、100、75、50、40、30、20、10、5、1或0.InM或更少的親和力。一些類似物或變體將具有1、2、3、4、5、6、7、10或多至20個氨基酸序列修飾，例如缺失、插入或替換，類似物可以在3C12F、7D1G、7D12A、18V4F或18P7E抗體的一個或更多個高變區(qū)或⑶R中具有約2至10個氨基酸替換。類似物可以是如下抗體或其抗原結合片段，其與包含下列CDR組合至少之一的MIP-Ia,MIP-1^,RANTES,MCP-1中兩種或更多種結合3C12F、7D1G、7D12A、18V4F或18P7E重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的CDRl和CDR2,CDRl和CDR3,CDR2和CDR3,以及CDRUCDR2和CDR3。動物的抗原結合可變結構域與人恒定結構域偶聯的嵌合抗體是本領域公知的，其制備方法通過引用Cabilly等人，美國專利No.4，816，567；Morrison,S.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984);Boulianne，G.L.等人，Nature312643-646(1984)以及Neuberger，M.S.等人，Nature314:268-270(1985)而并入。可以選擇人恒定結構域的同種型以使嵌合抗體適于參與抗體依賴的細胞毒性(ADCC)和補體依賴的細胞毒性(參見例如Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.1661351-1361(1987)；Riechmann,L.等人，Nature332:323-327(1988)；Love等人，MethodsinEnzymology178:515-527(1989);Bindon等人，J.Exp.Med.168:127-142(1988)，其通過引用而并入)?？梢酝ㄟ^本領域已知的重組DNA技術產生嵌合的和人源化的單克隆抗體，例如利用PCT國際申請No.PCT/US86/02269;歐洲專利申請No.184，187;歐洲專利申請No.171,496;歐洲專利申請No.173,494；PCT國際公開No.WO86/01533;美國專利No.4，816，567;歐洲專利申請No.125,023;Better等人，Science240:1041-1043(1988)中描述的方法?？梢酝ㄟ^已知方法對本發(fā)明的抗因子抗體進行人源化，包括由Carter，美國專利No.6，719，971，Almagro等人，Front.Biosci.13:1619-1633(2008)；Pini等人，Comb.Chem.HighThroughputScreen.5:503-510(2002)以及Wu等人，J.Mol.Biol.294151-162(1999)公開的那些，其通過引用而并入。人源化產生具有供者動物(鼠)抗體的抗體特異性但是在人中免疫原性降低并且效應物功能更好的免疫球蛋白分子。該方法涉及將已知的抗因子CDR序列嵌入人抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)框架序列中。一般地，人源化抗體通過用小鼠CDR替換到人可變結構域框架中而產生，如果人可變結構域框架采取與CDR所來源之小鼠可變框架相同或相似的構象，這最有可能使得保留CDR的正確空間取向。這通過從人抗體中獲得人可變結構域而實現，所述人抗體的框架序列表現出與CDR所來源之小鼠的可變框架結構域高度的序列同一性。重鏈和輕鏈可變框架區(qū)可以來源于同一或不同的人抗體序列。人抗體序列可以是天然之人抗體的序列，或可以是幾種人抗體的共有序列。參見Kettleborough等人，ProteinEngineering.:773-783(1991);Kolbinger等人，ProteinEngineering6:971-980(1993)以及Carter等人，WO92/22653。鑒定出小鼠供者免疫球蛋白和合適人受者免疫球蛋白的互補決定區(qū)后，下一步是確定應當替換這些組分中的哪些殘基(如果有的話)，以使所得人源化抗體的性質最優(yōu)。一般地，應當將用鼠替換人氨基酸殘基減至最少，因為引入鼠殘基增加了抗體在人體內激發(fā)人抗小鼠抗體(HAMA)應答的風險?；趯DR構象和/或與抗原結合的可能影響，從人可變區(qū)框架殘基中選擇某些氨基酸進行替換。鼠CDR區(qū)與人可變框架區(qū)的非天然并列安置可導致非天然的構象限制，除非通過替換某些氨基酸殘基進行修正，否則這將導致結合親和力損失。可以部分地通過計算機建模來確定對所替換氨基酸殘基的選擇。一般地，分子模型的產生起始于免疫球蛋白鏈或其結構域的經解析結構。對將要建模的鏈與經解析三維結構的鏈或結構域進行氨基酸序列相似性的比較，并選擇顯示最高序列相似性的鏈或結構域作為起點，以構建分子模型。選擇共有至少50%序列同一性的鏈或結構域進行建模，優(yōu)選地，選擇共有至少60%、70%、80%、90%、95%或更高序列同一性的那些進行建模。修改經解析的起始結構，使得對免疫球蛋白鏈或結構域中的實際氨基酸與起始結構之間的差異建模。接著將經修改的結構組裝成復合的免疫球蛋白。最后，通過能量極小化以及通過驗證所有原子均處于相互適宜的距離以及鍵長和鍵角在化學上可接受的范圍內，對模型進行完盡口o還可以部分地通過檢查特定位點處氨基酸的特征或憑經驗觀察特定氨基酸替換或突變的作用，從而確定對所替換氨基酸殘基的選擇。例如，當鼠可變區(qū)框架殘基和所選人可變區(qū)框架殘基之間的氨基酸不同時，人框架氨基酸通常應當被小鼠抗體中的等同框架氨基酸替換，前提是可以合理預期該氨基酸與抗原直接非共價結合，與CDR區(qū)相鄰，以另外方式與⑶R區(qū)相互作用(例如如通過計算機建模所確定地，在⑶R區(qū)的約3-6人內)或參與VL-VH界面。“與抗原直接非共價結合”的殘基包括框架區(qū)位置中很有可能根據例如通過氫鍵、范德華力、疏水相互作用等建立的化學力與抗原上的氨基酸直接相互作用的氨基酸?！芭c⑶R區(qū)相鄰”的殘基包括位于與人源化免疫球蛋白鏈一級序列中一個或更多個CDR緊鄰位置處的氨基酸殘基，例如與如Kabat(Wu和Kabat,J.Exp.Med.132211-250(1970))所定義的CDR或如Chothia(Chothia和LeskJ.Mol.Biol.196901-917(1987))所定義的⑶R緊鄰位置處。這些氨基酸特別可能與⑶R中的氨基酸相互作用，如果其選自受者，則可使供者CDR扭曲并且使親和力降低。此外，相鄰氨基酸可以與抗原直接相互作用(Amit等人，Science233:747-753(1986)，通過引用并入本文)，從供者中選擇這些氨基酸對于保持提供原始抗體中親和力的所有抗原接觸是理想的?！耙粤硗夥绞脚cCDR區(qū)相互作用”的殘基包括通過二級結構分析確定其處于足以影響CDR區(qū)之空間取向的那些殘基?？梢酝ㄟ^分析供者免疫球蛋白的三維模型(例如計算機產生的模型)對“以另外方式與⑶R區(qū)相互作用”的殘基進行鑒定。三維模型(通常是原始供者抗體的三維模型)顯示CDR外部的某些氨基酸與CDR非常靠近，其很有可能通過氫鍵、范德華力、疏水相互作用等與CDR中的氨基酸相互作用。在這些氨基酸位置，可以選擇供者免疫球蛋白氨基酸，而非受者免疫球蛋白氨基酸。依照該標準的氨基酸一般具有在CDR中某個原子的約3人內的側鏈原子，并且必須含有能夠根據建立的化學力(例如上面列出的那些)與⑶R原子相互作用的原子?？梢砸粤硗獾姆绞綄δ軌蚺cCDR中氨基酸相互作用的氨基酸進行鑒定。以兩種方式對每個框架氨基酸的溶劑可及表面區(qū)域進行計算(I)在完整抗體中；(2)在去除了CDR的抗體假定分子中。這些數值之間的顯著差異為約10人2或更大表明，框架氨基酸與溶劑的接近至少部分地被CDR阻斷，因此這些氨基酸與CDR接觸?？梢岳帽绢I域已知的算法(例如Connolly,J.Appl.Cryst.16:548(1983)以及Lee和Richards,J.Mol.Biol.55379(1971)，二者通過引用并入本文)基于抗體的三維模型對氨基酸的溶劑可及表面區(qū)域進行計算。框架氨基酸還偶爾可以通過影響與CDR接觸的另一框架氨基酸的構象而間接地與⑶R相互作用。“參與VL-VH界面”的殘基或“填充(packing)殘基”包括VL和VH之間界面處的那些殘基，例如由Novotny和Haber,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:4592-66(1985)或Chothia和Lesk(前述)所定義的那些。一般地，不常見的填充殘基如果與人框架中的那些不同，則應當保留于人源化抗體中。一般地，滿足以上標準的一個或更多個氨基酸被替換。在一些實施方案中，滿足以上標準的所有或大部分氨基酸被替換。偶爾地，對于特定氨基酸是否符合上面的標準是模糊的，所產生的替代性免疫球蛋白變體中，其一具有該特定替換，而另一個則沒有。可以在本文描述的任何測定中測試由此產生的替代性免疫球蛋白變體是否具有期望活性，并選擇優(yōu)選的免疫球蛋白。通常，人源化抗體中的⑶R區(qū)與供者抗體的相應⑶R區(qū)是基本上一致的，更通常地，其與供者抗體的相應CDR區(qū)相同。盡管通常并非需要地，有時可以在不影響所得人源化免疫球蛋白的結合活性的情況下對CDR殘基進行一個或更多個保守性氨基酸替換。保守性替換意在指例如以下組合甘氨酸(gly)、丙氨酸(ala);纈氨酸(val)、異亮氨酸(ile)、亮氨酸(Ieu);天冬氨酸(asp)、谷氨酸(glu);天冬酰胺(asn)、谷氨酰胺(gin);絲氨酸(ser)、蘇氨酸(thr);賴氨酸(Iys)、精氨酸(arg);以及苯丙氨酸(phe)、酪氨酸(tyr)。其它的候選替換是在人免疫球蛋白的該位置處不常見或“稀有”的受者人框架氨基酸。這些氨基酸可以被小鼠供者抗體等同位置處的氨基酸或更典型之人免疫球蛋白等同位置處的氨基酸所替換。例如，當受者免疫球蛋白的人框架區(qū)中某一位置的氨基酸是稀有的，而供者免疫球蛋白中該位置的相應氨基酸在人免疫球蛋白序列中是常見的時，或者當受者免疫球蛋白中的氨基酸在某一位置是稀有的，而供者免疫球蛋白中該位置的相應氨基酸相對于其它人序列來說也是稀有的時，替換是理想的。這些標準有助于確保人框架中的非典型氨基酸不會破壞抗體結構。此外，通過用供者抗體中對于人抗體來說是典型的氨基酸替換不常見的人受者氨基酸，可以使人源化抗體的免疫原性更低。本文中使用的術語“稀有”表示在序列的代表性樣品中在少于約20%、通常少于10%的序列中出現在該位置的氨基酸，本文中使用的術語“常見”表示在代表性樣品中在多于約25%、通常多于50%的序列中出現的氨基酸。例如，所有的人輕鏈和重鏈可變區(qū)序列分別分為序列“亞組”，其特別是相互同源的并且在某些關鍵位置具有相同的氨基酸(Wu和Kabat，前述)。當確定人受者序列中的氨基酸在人序列中是“稀有”還是“常見”時，常常優(yōu)選僅考慮與受者序列屬于同一亞組的那些人序列。其它的候選替換是由Chothia和Lesk(前述)提出的另一種定義下鑒定為CDR區(qū)一部分的受者人框架氨基酸。其它候選替換是對應于稀有或不常見的供者框架殘基的受者框架殘基。稀有或不常見的供者框架殘基是鼠抗體中在該位置稀有或不常見(如本文中所定義)的那些。對于鼠抗體而言，可以依照Kabat以及經鑒定不同于共有序列的殘基位置來確定亞組。這些供者特異性差異可來自于鼠序列中增強活性的體細胞突變。預測影響結合的不常見的殘基被保留，而預測對于結合不重要的殘基可以被替換。更多候選的替換有受者框架區(qū)出現的非譜系殘基。例如，當受者抗體鏈(即與供者抗體鏈共有顯著序列同一性的人抗體鏈)與譜系抗體鏈(同樣地與供者鏈共有顯著的序列同一性)進行比對時，受者鏈框架和譜系鏈框架之間不匹配的殘基可以被譜系序列中的相應殘基替換。除了上面討論的特定的氨基酸替換之外，人源化免疫球蛋白的框架區(qū)通常與其所來源之人抗體的框架區(qū)是基本相同的，更通常地，其與其所來源之人抗體的框架區(qū)相同。當然，框架區(qū)中的許多氨基酸對抗體的特異性或親和力沒有或幾乎沒有直接貢獻。因此，在所得人源化免疫球蛋白的特異性或親和力無明顯變化的情況下，可以允許框架殘基的多種單個保守性替換。因此，在一個實施方案中，人源化免疫球蛋白的可變框架區(qū)與人可變框架區(qū)序列或該序列的共有序列共享至少85%的序列同一性。在另一實施方案中，人源化免疫球蛋白的可變框架區(qū)與人可變框架區(qū)序列或該序列的共有序列共享至少90%，優(yōu)選95%，更優(yōu)選96%、97%、98%或99%的序列同一性。然而一般地，這些替換是不理想的。在一些實施方案中，優(yōu)選人源化抗體對抗原表現出與構建其所來源之小鼠抗體相似或更高的特異性結合親和力。通常，人源化抗體對抗原之結合親和力的上限在供者免疫球蛋白的3、4或5倍內。通常，結合親和力的下限也在供者免疫球蛋白的3、4或5倍內?；蛘撸梢詫⒔Y合親和力與未經替換的人源化抗體(例如具有供者CDR和受者框架區(qū)但框架區(qū)中無替換的抗體)進行比較。在這種情況下，優(yōu)選抗體(具有替換)的結合比未經替換的抗體高至少2至3倍或3至4倍。為了進行比較，可以例如通過BIAcore(即利用未經標記之試劑的表面等離子共振)或競爭性結合測定確定不同抗體的活性。可以利用標準的親和力成熟技術(例如Wu等人，J.Mol.Biol.350:126-144(2005)(通過引用而并入)所述地)，基于本文公開的單克隆抗體的序列設計改造抗體，以增加抗體與原來識別之趨化因子的親和力和/或將趨化因子靈敏度擴展至免疫疾病中也涉及的其它CC趨化因子。可以選擇類型或同種型或亞類(例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)，特別是對于嵌合、人源化或經改造抗體產物來說，從而將抗體靶向或改造為具有所選類型或亞類公知的特定功能。例如，可以選擇人IgG2，以使抗體產物盡可能少地穿過胎盤或者使Fe受體與對象免疫系統(tǒng)中其它組分的相互作用降至最低；可以選擇亞類IgG4，以使抗體產物活化組分的能力降至最低?？梢赃x擇IgA同種型，以產生分泌型抗體和五聚體型(pentameric)IgM抗體產物，從而與單體型抗體相比增強抗體結合?？贵w分子各種類型和亞類的功能通過引用Kuby，Immunology,WHFreeman(1997)而并入?！皢捂淔v”或“sFV”抗體片段包含抗因子抗體的Vh和\結構域，其中這些結構域存在于單條多肽鏈中。一般地，Fv多肽還包含Vh和\結構域之間的多肽接頭，其使得sFv形成用于抗原結合的期望結構(參見PHickthiminThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,113卷，Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag,NewYork,269-315頁(1994)，其通過引用而并入)?？梢酝ㄟ^已知方法(例如由美國專利No.4，946，778(通過引用而并入)所描述的那些)產生特異性針對CC趨化因子的單鏈抗體?！半p功能抗體(diabody)”是指具有兩個抗原結合位點的小抗體片段，該片段包含與同一多肽鏈(Vh和')中的輕鏈可變結構域(')相連的重鏈可變結構域(Vh)。通過利用接頭(其太小而不能使同一鏈上的兩個結構域之間配對)，使得結構域只能與另一鏈的互補結構域配對，從而產生兩個抗原結合位點。本發(fā)明的抗因子抗體可制備成雙功能抗體，其可以通過引用EP404，097、WO93/11161以及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90=6444-6448(1993)而并入的方法來制備。“線性抗體”是指Zapata等人,ProteinEng.8(10):1057-1062(1995)中描述的抗體。簡言之，這些抗體包含一對串聯的Fd片段(Vh-ChI-Vh-ChI)，其形成一對抗原結合區(qū)。線性抗體可以是雙特異性的或單特異性的。本發(fā)明的抗因子抗體可以依照由Zapata等人(通過引用并入本文)描述的方法制備?？赏ㄟ^其它常規(guī)方法(例如由Huse等人，Science246:1275-1281(1989)(通過引用而并入)公開的那些)構建Fab表達文庫，從而能夠快速有效地鑒定對CC趨化因子或其衍生物、片段、類似物或同源物具有期望特異性的單克隆Fab片段?？梢允褂孟率镜目贵w之獨特部分(例如其⑶R序列和含有⑶R之一部分的序列)產生抗獨特型抗體。這些抗體識別抗因子抗體可變片段上的一個或更多個獨特型，并能夠用于鑒定或純化抗因子抗體或調節(jié)其活性?？梢酝ㄟ^本領域已知的步驟產生這些抗獨特型抗體，例如通過將抗體的可變肽序列綴合到免疫原性載體上以及重復免疫。這些方法還通過引用Cavenaugh,等人，Pharm.Res.21:1480-1488(2004)而并入?？躬毺匦涂贵w是識別另一抗體(靶抗體)之決定簇的抗體。一般地，抗獨特型抗體識別靶抗體之抗原結合位點的決定簇。通常，靶抗體是單克隆抗體。一般地，通過用靶單克隆抗體對與靶單克隆抗體來源同一物種和基因型的動物(特別是小鼠)進行免疫來制備抗獨特型抗體。經免疫的動物對靶單克隆抗體之獨特型決定簇產生免疫應答，并產生針對靶單克隆抗體之獨特型決定簇的抗體?？梢岳媒浢庖邉游锏目贵w產生細胞(例如脾細胞)產生抗獨特型單克隆抗體。此外，還可以用抗獨特型抗體對動物進行免疫，以產生抗抗獨特型抗體?？梢圆捎脴藴始夹g利用這些經免疫的動物產生抗抗獨特型單克隆抗體?？箍躬毺匦涂贵w可以與用于制備抗獨特型抗體的初始靶單克隆抗體結合相同的表位?？箍躬毺匦涂贵w代表了與初始靶單克隆抗體具有相同抗原特異性的其它單克隆抗體。如果抗獨特型抗體與靶抗體的結合被靶抗體的相關抗原抑制，并且如果抗獨特型抗體誘導與靶抗體具有相同特異性的抗體應答，則其模擬靶抗體的抗原。這種抗獨特型抗體是“內部鏡像(internalimage)抗獨特型”,其能夠誘導抗體應答,如同其是初始抗原一樣(參見Bona和Kohler,Anti-idiotypicAntibodiesandInternalImageinMonoclonalandAnti-idiotypicAntibodiesProbesforReceptorStructureandFunction，VenterJ.C.，Frasser,C.M.，Lindstrom，J.編，AlanR.Liss,N.Y.，141-149頁(1984))。已顯示，摻有內部鏡像抗獨特型抗體的疫苗能夠誘導針對病毒、細菌和寄生生物的保護性應答(Kennedy等人，Science232:220-223(1986)；McNamara等人，Science226:1325-1326(1985))。還已顯示，內部鏡像抗獨特型抗體能夠誘導針對腫瘤相關抗原的免疫(Raychauhuri等人，J.Tmmuno1.137:1743-1749(1986)；Raychauhuri等人，J.Tmmun01.139:3902-3910(1987)；Bhattacharya-Chatterjee等人，J.Tmmuno1.1391354-1360(1987)；Bhattacharya-Chatterjee等人，J.Tmmuno1.141:1398-1403(1988))。本段中所引用文獻的教導通過引用而并入?？梢岳缤ㄟ^用免疫原性量的組合物(其包含CC趨化因子或含有CC趨化因子至少一個抗原性表位的CC趨化因子免疫原性片段)對動物(例如小鼠)進行免疫，來制備CC趨化因子的抗獨特型抗體。所述組合物還可以含有合適的佐劑以及提供免疫原性所必需的任何載體。識別CC趨化因子的單克隆抗體可以如上所述從經免疫動物的細胞中制備。然后選擇識別CC趨化因子共有表位的單克隆抗體，并用其制備包含免疫原性量之抗CC趨化因子單克隆抗體的組合物。通常，合適佐劑中25至200i!g劑量的經純化CC趨化因子單克隆抗體是足夠的?？梢砸?4至30天的給藥間隔對小鼠進行2-6次免疫。通常，通過任何合適的施用途徑對動物進行免疫，例如腹膜內、皮下、靜脈內或這些的組合。可以利用標準的免疫測定方法在免疫期間監(jiān)測抗獨特型抗體的產生?？稍谑斋@抗體產生細胞前3天，用單克隆抗體作為免疫原對具有適當效價之與靶單克隆抗體反應的抗體的動物進行再次免疫。優(yōu)選地，采用脾細胞，然而也可以選擇其它抗體產生細胞。收獲抗體產生細胞，并使其與骨髓瘤細胞融合以產生如上所述的雜交瘤，并選擇合適的抗獨特型抗體產生細胞。通過利用抗獨特型單克隆抗體作為免疫原通過再一輪免疫和雜交瘤產生，產生抗抗獨特型抗體。如上所述，抗因子抗體的可變區(qū)段(例如CDR區(qū)段)或可變區(qū)段的肽片段(包括具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多個連續(xù)氨基酸殘基的片段，特別是對趨化因子具有結合活性的那些)可以用于除治療自身免疫病之外的多種應用中，包括作為基于肽的藥劑、疫苗、產生抗獨特型抗體或作為免疫原。本發(fā)明的另一方面涉及通過向哺乳動物施用足以誘導免疫應答之量的多肽制備物而誘導哺乳動物中針對本發(fā)明多肽之免疫應答的方法。所述量將取決于動物物種、動物大小等，然而其可以由本領域技術人員確定。本發(fā)明還包括通過親和力成熟方法從嵌合的或人源化的抗因子抗體得到的抗體或抗體片段。可以對CDR中顯著提高抗體對CC趨化因子之親和力的氨基酸替換進行鑒定，因而其包含于本文中。親和力成熟的方法例如描述于Wu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:6037-6042(1998)以及Clackson和Loman,PhageDisplay,OxfordUniversityPress(2004)中，每篇均通過引用而并入?？笴C趨化因子抗因子抗體可以用于本領域中涉及對CC趨化因子定位和/或定量的已知方法中(例如用于測定適當生理樣品中的CC趨化因子水平、用于診斷方法中、用于使蛋白成像等)。在一個給定的實施方案中，CC趨化因子的抗體或含有抗體來源之結合結構域的其衍生物、片段、類似物或同源物用作藥學活性化合物、藥物或治療性化合物?？笴C趨化因子抗因子抗體(例如單克隆抗體)可以用于通過標準技術(例如親和色譜或免疫沉淀)分離CC趨化因子。抗CC趨化因子抗體可有利于純化細胞中的天然CC趨化因子以及宿主細胞中表達的重組產生之CC趨化因子。此外，抗CC趨化因子廣泛抗體(pan-antibody)可以用于檢測CC趨化因子(例如在細胞裂解液中或細胞上清液中)，以評估CC趨化因子表達的豐度和模式?？笴C趨化因子抗因子抗體可以診斷性地用于監(jiān)測組織中的蛋白質水平，以作為臨床測試方法的一部分，從而例如確定給定治療方案的效力?？梢酝ㄟ^將抗體與可檢出物質偶聯(即物理性連接)而利于進行檢測?？蓹z出物質的實例包括多種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料和放射性材料。合適的酶的實例包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、3-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復合物的實例包括鏈霉親和素/生物素和親和素/生物素；合適的熒光材料的實例包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸突光素、羅丹明、二氯三嗪基氨基(dichlorotriazinylamine)突光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料的實例包括魯米諾(Iuminol);生物發(fā)光材料的實例包括螢光素酶、螢光素(Iuciferin)和水母發(fā)光蛋白，合適的放射性材料的實例包括125I、131I、35S和3H。此外，本發(fā)明的抗體可以與毒素(例如，可以與抗體綴合的放射性同位素、蛋白毒素和化學毒素)相綴合。這樣的毒素包括但不限于鉛-212、鉍-212、砹-211、碘-131、鈧-47、錸-186、錸-188、釔-90、碘-123、碘-125、溴-77、銦-111、硼-10、錒系元素、蓖麻毒素、阿霉素(adriamycin)、刺孢霉素(calicheamicin)、5_氟尿卩密卩定、auristatin和類美坦素(maytansinoid)。嵌合的、人源化和人的抗體以及其抗原結合片段通常通過重組表達產生。將編碼人源化輕鏈和重鏈可變區(qū)(其任選地與恒定區(qū)相連)的核酸插入表達載體中?？梢詫⑤p鏈和重鏈克隆到同一或不同的表達載體中。編碼免疫球蛋白鏈的DNA區(qū)段與表達載體中確保免疫球蛋白多肽表達的調控序列有效連接。表達調控序列包括但不限于啟動子(例如，天然相關的或異源的啟動子)、信號序列、增強子元件和轉錄終止序列。優(yōu)選地，表達調控序列是能夠轉化或轉染真核宿主細胞之載體中的真核啟動子系統(tǒng)。載體一經進入合適的宿主中，在適于高水平表達核苷酸序列以及適于對交叉反應之抗體進行收集和純化的條件下培養(yǎng)宿主。這些表達載體通?？梢宰鳛楦郊芋w或作為宿主染色體DNA的整合部分在宿主生物中復制。表達載體常含有選擇標記(例如氨芐青霉素抗性、潮霉素抗性、四環(huán)素抗性或新霉素抗性)，以允許對經期望DNA序列轉化的細胞進行檢測(參見例如Itakura等人，美國專利No.4，704，362，其通過引用而并入)。大腸桿菌(E.coli)是特別適用于克隆本發(fā)明之多核苷酸(例如DNA序列)的一種原核宿主。適用的其它微生物宿主包括芽孢桿菌(例如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilus))和其它腸桿菌(例如沙門氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia))以及多種假單胞菌(Pseudomonas)菌種。在這些原核宿主中，還可以制備通常含有與宿主細胞相容之表達調控序列(例如復制起點)的表達載體。此外，存在任意數目的多種公知啟動子，例如乳糖啟動子系統(tǒng)、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)、￠-內酰胺酶啟動子系統(tǒng)或來自噬菌體X的啟動子系統(tǒng)。啟動子通常任選地與操縱子序列一起調控表達，并且具有核糖體結合位點序列等，用于起始并完成轉錄和翻譯。另一些微生物(例如酵母)也可以用于表達。具有合適載體的酵母屬(Saccharomyces)是優(yōu)選的酵母宿主,所述載體具有期望的表達調控序列(例如啟動子)、復制起點、終止序列等。典型的啟動子包括3-磷酸甘油酸激酶和其它糖酵解酶。誘導型酵母啟動子包括來自乙醇脫氫酶、異細胞色素C以及負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子。除了微生物之外，還可以利用哺乳動物組織細胞培養(yǎng)物表達和產生本發(fā)明的多肽(例如編碼免疫球蛋白或其片段的多核苷酸)。參見Winnacker,FromGenestoClones,VCHPublishers,N.Y.，N.Y.(1987)。事實上，優(yōu)選真核細胞，因為本領域已開發(fā)了多種能夠分泌異源蛋白質(例如完整的免疫球蛋白)的合適的宿主細胞系，包括CHO細胞系、多種Cos細胞系、HeLa細胞，優(yōu)選骨髓瘤細胞系或經轉化的B細胞或雜交瘤。優(yōu)選地，所述細胞是非人細胞。用于這些細胞的表達載體可包括表達調控序列(例如復制起點、啟動子、增強子(Queen等人,Immunol.Rev.89:49-68(1986)))，以及必要的加工信息位點(例如核糖體結合位點、RNA剪接位點、多聚腺苷酸化位點以及轉錄終止序列)。優(yōu)選的表達調控序列是來源于免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、巨細胞病毒等的啟動子。參見Co等人，J.Immunol.148:1149-1154(1982)，上述每篇文獻均通過引用而并入。或者，可以將編碼抗體的序列整合到轉基因中，從而引入轉基因動物的基因組中并使其隨后在轉基因動物的乳汁中表達，例如由Deboer等人，美國專利No.5，741,957；Rosen，美國專利No.5，304，489以及Meade等人，美國專利No.5，849，992所述地(每篇均通過引用而并入)。合適的轉基因包括與來自乳腺特異性基因(例如酪蛋白或￠-乳球蛋白)的啟動子和增強子有效連接的輕鏈和/或重鏈編碼序列?？赏ㄟ^公知方法(取決于細胞宿主的類型)將含有目的多核苷酸序列(例如重鏈和輕鏈編碼序列或其片段以及表達調控序列)的載體轉移至宿主細胞中。例如，對于原核細胞常使用氯化鈣轉染，而對于其它細胞宿主可以使用磷酸鈣處理、電穿孔、脂質轉染、基因槍法或基于病毒的轉染。用于轉化哺乳動物細胞的其它方法包括使用聚凝胺、原生質體融合、脂質體、電穿孔和顯微注射(一般參見Samtoook等人(前述))。對于產生轉基因動物來說，可以將轉基因顯微注射到已受精的卵母細胞中，或者，將其整合到胚胎干細胞的基因組中，并將這些細胞的細胞核轉移至去核的卵母細胞中。所有這些方法通過引用Sambrook等人，MolecularCloningALaboratoryManual(ColdSpringHarborPress,第2版(1989)而并入。當重鏈和輕鏈克隆到不同表達載體上時，將所述載體共轉染，以使其表達并組裝成完整的免疫球蛋白。一經表達，可以依照本領域標準方法對完整抗體、其二聚體、單條輕鏈和重鏈或其它免疫球蛋白形式進行純化，包括通過利用硫酸銨沉淀、親和柱、柱層析、HPLC純化、凝膠電脈及其它類似方法,包括由Scopes,ProteinPurification,Springer-Verlag,N.Y.(1982)(通過引用而并入)公開的那些。對于藥用而言，使用具有至少9095%或甚至9899%純度和/或勻質度的基本上純的免疫球蛋白是理想的?？挂蜃涌贵w的片段或截短形式(例如Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段和Fv片段)以及包含參與趨化因子結合之單條輕鏈和/或重鏈CDR的單個抗體鏈可用于結合或中和一種或更多種CC趨化因子?？梢詫挂蜃涌贵w進行化學修飾或衍生化，以提供期望作用?？梢岳猛ㄟ^肽鍵與異源蛋白連接的抗因子抗體或其片段制備抗體綴合物或經綴合的抗體。在這些實施方案中，抗體的抗原結合部分與MIP-1a,MIP-1^,RANTES,MCP-1和/或其它相關CC趨化因子結合?？挂蜃涌贵w還可以作為效應部分與酶、毒素或細胞因子綴合。其還可以含有輔助部分(例如化學或放射性標簽、毒素、生物活性部分或靶向性部分，或者例如通過與聚乙二醇或白蛋白綴合而使其生物半衰期或生物學可利用度增加的其它物質)或進一步與其綴合或共價連接。本發(fā)明的抗因子抗體可以含有例如由Carter和Senter,CancerJ.14:154-169(2008)(通過引用而并入)公開的那些輔助部分或與其綴合。本發(fā)明的抗體和抗體產物可以固定到固體基質或免疫親和樹脂(例如由AntibodiesALaboratoryManual；E.Harlow和D.Lane編(1988)(通過引用而并入)描述的那些)上?？赏ㄟ^本領域已知的任何聚乙二醇化反應進行本發(fā)明之抗體和抗體片段的聚乙二醇化，例如如以下參考文獻所描述FocusonGrowthFactors3:4-10(1992)；EP0154316以及EP0401384，每篇均作為整體通過引用并入本文。優(yōu)選地，通過與反應性聚乙二醇(PEG)分子(或類似的反應性水溶性聚合物)發(fā)生?；磻蛲榛磻詫崿F聚乙二醇化。用于本發(fā)明抗體和抗體片段聚乙二醇化的優(yōu)選水溶性聚合物是PEG。本文中使用的“聚乙二醇”意在包括已用于衍生化其它蛋白質的任何形式的PEG，例如單(Cl-ClO)烷氧基聚乙二醇或芳氧基聚乙二醇。本發(fā)明經聚乙二醇化的抗體和抗體片段的制備方法一般地包括如下步驟(a)在使抗體或抗體片段能夠與一個或更多個PEG基團結合的條件下，使抗體或抗體片段與PEG(例如PEG的活性酯或醛衍生物)反應，以及(b)獲得反應產物?；谝阎獏岛推谕Y果選擇最佳的反應條件或酰基化反應對于本領域普通技術人員來說顯見的。經聚乙二醇化的抗體和抗體片段一般可以用于治療通過施用本文所述之抗體和抗體片段能夠得以緩解或調節(jié)的病癥。一般地，與未經聚乙二醇化的抗體和抗體片段相比，經聚乙二醇化的抗體和抗體片段半衰期增長。經聚乙二醇化的抗體和抗體片段可以單獨使用、一起使用或與其它藥物組合物聯合使用。在本發(fā)明的另一些實施方案中，利用本領域認可的技術使抗體或其抗原結合片段與白蛋白綴合。在本發(fā)明的另一實施方案中，對抗體或其片段進行修飾，以減少或消除潛在的糖基化位點。這種經修飾的抗體通常被稱為“去糖基化(aglycosylated)”抗體。為了提高抗體或其抗原結合片段的結合親和力，可以例如通過誘變(例如定點誘變)改變抗體的糖基化位點?！疤腔稽c”是指被真核細胞識別為糖殘基附著位點的氨基酸殘基。碳水化合物(例如寡糖)附著的氨基酸通常有天冬酰胺(N-連接)、絲氨酸(0-連接)和蘇氨酸(0-連接)殘基。為了鑒定抗體或抗原結合片段內的潛在糖基化位點，例如通過利用公眾可獲得的數據庫對抗體序列進行研究，例如由CenterforBiologicalSequenceAnalysis提供的網站(對于預測N-連接的糖基化位點，參見http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/,對于預測0-連接的糖基化位點，參見http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)。用于改變抗體之糖基化位點的額外方法描述于美國專利No.6，350,861和5，714，350中，其通過引用而并入。在本發(fā)明又一實施方案中，可以通過對抗體恒定區(qū)進行修飾來改變抗體或其片段，從而相對于未經修飾的抗體而言使由恒定區(qū)介導的至少一種生物學效應物功能降低。為了對本發(fā)明的抗體進行修飾以使其表現出與Fe受體的結合降低，可以使抗體恒定區(qū)區(qū)段在與Fe受體(FcR)相互作用所必需的特定區(qū)域中發(fā)生突變，參見例如Canfield，S.M.和S.L.Morrison,J.Exp.Med.1731483-1491(1991)以及Lund,J.等人，J.Tmmuno1.1472657-266(1991)，所有均通過引用而并入?？贵w結合FcR的能力降低還可以使依賴于FcR相互作用的另一些效應物功能(例如調理素作用和吞噬作用以及抗原依賴的細胞毒性)降低。增強或降低抗體效應物功能以及減少或延長血清持久性的恒定區(qū)衍生物由Carter，P.J.，Nat.Rev.Immunol.6:343-357(2006)描述，其通過引用而并入。本發(fā)明的抗因子抗體可以摻入到例如上面描述的藥物組合物中或者摻入到用于儲存、保存或向有治療需要之對象施用抗體的組合物中。用于上述治療或診斷應用的試劑盒可以包含一種或更多種抗因子抗體、陽性或陰性對照抗體、與抗因子抗體結合的CC趨化因子、不與抗因子抗體結合的對照趨化因子和其它藥學或診斷用組分，以及試劑盒使用的書面說明。本發(fā)明的抗體或抗原結合片段可以用于例如治療性目的(通過調節(jié)CC趨化因子的活性)、診斷性目的(對CC趨化因子進行檢測或定量)以及純化CC趨化因子。因此，本發(fā)明的范圍囊括了出于本文所述任何目的的包含本發(fā)明抗體的試劑盒。已顯示，CC趨化因子(特別是MIP-1a、MIP_1^,RANTES和/或MCP-1)在與炎癥相關的病理學情形中發(fā)揮作用。還已顯示肩1-10、10-10、狀見^5和/或1^-1對于白等人，TrendsImmunol.26:268-274(2005)(通過引用并入本文)描述的那些。MIP-1a、MIP-1^、RANTES和/或MCP-1是對于單核細胞和T淋巴細胞具有強效趨化活性的分子。考慮到它們的活性有重疊以及在人類疾病中所有這4種這些趨化因子的表達均增強，預期與僅僅抑制單一CC趨化因子相比，阻斷2、3或4種CC趨化因子分子具有更有益的作用。因此，本發(fā)明的抗體和抗體片段可以用于調節(jié)這些趨化因子的活性，影響與這些趨化因子相關的疾病之病理。所以，這些抗體和片段可以用于治療與CC趨化因子分子表達相關之炎性病癥和病理情形的治療性組合物中。在這些實施方案中，例如通過患者表現出所述疾病或功能異常之至少一個指征或癥狀鑒定患者是否患有待治療的一種疾病。本發(fā)明的至少一種抗體或其抗原結合片段或者包含本發(fā)明之至少一種抗體或其抗原結合片段的組合物以足以緩解所述疾病或功能異常之至少一個癥狀或降低MIP-1a、MIP-1^、RANTES和/或MCP-I中至少一種的活性的量施用?？深A防或治療的病癥。本文使用的術語“CC趨化因子活性導致的病癥”和“CC趨化因子相關病癥”旨在包括這樣的疾病或病癥在患有該病癥的對象中CC趨化因子(包括MIP-1a,MIP-1^,RANTES,MCP-1和其它CC趨化因子)的存在已證明或懷疑是導致該病癥發(fā)病原因或引起該病癥的因素。因此，CC趨化因子活性導致的病癥是這樣的病癥預期抑制CC趨化因子的活性能夠預防或減輕該病癥的癥狀和/或進程。這些病癥可以例如通過患有該病癥之對象的生物學液體中CC趨化因子濃度增加(例如可利用抗RANTES抗體檢測出對象的血清、血漿、滑液、尿等中RANTES濃度增加)來證實。CC趨化因子活性導致的病癥有諸多實例。以下進一步討論本發(fā)明的抗體和抗體部分在預防或治療特定病癥中的用途。類風濕性關節(jié)炎(RA)以白細胞(包括T和B淋巴細胞、巨噬細胞以及中性粒細胞)流入關節(jié)的滑膜襯里層(synoviallining)為特征(參見Koch的綜述，ArthritisRheum.52:710-721(2005))。發(fā)現MIP-1a在RA患者的滑液中水平很高，其水平的增加與疾病的嚴重程度有相關性。類似地，在嚙齒類動物鼠RA模型中，在關節(jié)炎關節(jié)中發(fā)現了高水平的鼠MIP-1a。在膠原誘導的關節(jié)炎模型中，中和性抗體使關節(jié)炎評分減少約50%(Kasama，等人，J.Clin.Invest.95:2868-2876(1995))。在佐劑誘導的嚙齒類動物關節(jié)炎模型中，關節(jié)中的RANTES水平也增加。在該模型中，RANTES抗體使癥狀減輕(Barnes等人，J.Clin.Invest.101:2910-2919(1998))。還顯示，在RA患者中MCP-I由滑膜細胞和浸潤白細胞產生。在關節(jié)炎的嚙齒類動物模型中，MCP-I的中和性抗體也使臨床評分減少(Ogata等人，J.Pathol.182106-114(1997))。多發(fā)性硬化(MS)以神經周圍的髓鞘破壞以及白細胞流入神經組織為特征。發(fā)現在MS患者的腦病變中的趨化因子(包括MIP-1a、RANTES和MCP-1)水平很高(Sorensen等人，J.Clin.Invest.103:807-815(1999))。實驗性自身免疫性腦炎(EAE)是與人MS極其相似的疾病模型。如利用中和性抗體所顯示地，MIP-1a和MCP-I均參與誘導疾病癥狀和復發(fā)(Kennedy等人，J.Neuroimmunol.92:98-108(1998))。纖維化疾病包括以間質纖維性組織增加為標志的任何病癥。已知CC趨化因子與纖維化病癥有關。例如，在患有系統(tǒng)性硬化的患者中，MCP-1、MIP-1a和MIP-1P所有均升高，并且這些患者中CC趨化因子的高水平與肺纖維化的發(fā)生有關(Hasegawa等人，Clin.Exp.TniMiriciI.117:159_165(1999))。動脈粥樣硬化以血管脂質沉積以及巨噬細胞高度浸潤為特征。在動脈粥樣硬化的鼠模型中，MCP-I敲除小鼠顯不巨曬細胞和脂質沉積顯著減少(Gu等人，Mol.Cell2275-281(1998))。哮喘患者的肺部具有顯著的白細胞浸潤以及CC趨化因子水平增加，導致氣道高反應性。在哮喘的嚙齒類動物模型中，MIP-1a、MCP-I或RANTES的中和性抗體使炎癥和/或該疾病典型的氣道高反應性降低(Lukacs等人，J.Immunol.158:4398-4404(1997))。上述文獻中描述的動物模型可以用于評估抗因子抗體在治療相關病癥、功能異?；蚣膊≈械男Я?，這些模型及其使用方法通過弓I用上述文獻而并入。除了上面提到的疾病之外，還有許多其它病癥、功能異?；蚣膊∨c一種或更多種趨化因子的活性相關，這些包括但不限于致癌疾病、炎性腸病、特應性皮炎、銀屑病、中風、器官移植、C0PD、腎小球性腎炎、狼瘡腎炎、硬皮癥、肝硬化、阿爾茨海默病、CHF-缺血、冠狀動脈再狹窄、糖尿病性腎病/神經病變/視網膜病變、骨關節(jié)炎、牙周炎、酵母和病毒感染以及妊娠功能失調。當CC趨化因子在這些病癥中發(fā)揮作用時，可以施用抗因子抗體，以減輕這些病癥的嚴重程度。這種方法一般地涉及向有此需要的對象(例如動物或人)施用通常在可藥用載體中的一定量抗因子抗體。選擇抗因子抗體或其截短形式或片段的量以使其能夠抑制對象中一種或更多種趨化因子的活性。可以對從對象中取出的生物材料(例如血液、骨髓、器官組織)離體進行類似方法，或者對體外維持的生物材料進行類似方法。抗因子抗體可以用于阻斷趨化性。這種方法包括使抗因子抗體與含有抗因子抗體所結合之CC趨化因子的介質或與含有產生這些CC趨化因子之細胞的介質混合或接觸。本發(fā)明的抗因子抗體可以有用地用于診斷性測定中。這種測定涉及使對CC趨化因子具有已知特異性的抗因子抗體與懷疑含有抗因子抗體所結合之至少一種趨化因子的生物樣品接觸，以及例如通過測定復合物形成從而確定結合量。抗因子抗體可以以游離或基質結合形式使用。本發(fā)明進一步提供了用于檢測樣品中CC趨化因子的體外免疫測定。本發(fā)明的抗體和抗體片段可以用于利用多種公知的免疫學測定對樣品中的CC趨化因子進行檢測?？贵w可以用于例如ELISA、Western印跡、放射性免疫測定、免疫沉淀、免疫親和層析、組織切片的免疫染色、利用電子顯微鏡在組織樣品中進行免疫金檢測等。這些測定以及其它測定的方案是本領域公知的，其在技術人員的能力范圍內。利用本發(fā)明的抗體和抗體片段的免疫測定可以用于檢測樣品中CC趨化因子的存在和相對量。樣品可以包括但不限于經勻漿的組織或細胞、用于光學和電子顯微鏡的組織學組織切片、組織或細胞的蛋白提取物、腦脊液、關節(jié)液、血液、血漿、血清、粘膜分泌物、精液、陰道液、淚液、唾液、汗液、尿液、糞便等。例如，相對于正常樣品來說，存在增加量的CC趨化因子可表明存在疾病狀態(tài)，指示可以用本發(fā)明的治療劑進行治療。在一些情況下，CC趨化因子的量相對于正常樣品要低，可以用合適的CC趨化因子或模擬CC趨化因子的內部鏡像抗體進行處理，以刺激免疫功能。在一些實施方案中，可以利用免疫測定來輔助純化CC趨化因子。例如，可以利用免疫親和樹脂，其中本發(fā)明的抗體或抗體片段被固定在基質上。將含有CC趨化因子的樣品加入到免疫親和樹脂中，抗體結合到樹脂上，而樣品中的其它組分保留于溶液中。清洗樹月旨，并隨后將CC趨化因子從樹脂上洗脫，實現基本的純化并分離。優(yōu)選地，用于免疫測定中的抗體將具有如本文中定義的高結合親和力。實施例本發(fā)明通過以下實施例進一步闡述，所述實施例不應被理解為是限制性的。本申請中引用的所有參考文獻、專利和已公開專利申請的內容以及附圖和序列表通過引用并入本文。實施例I-產牛抗因子抗體之雜交瘤的產牛用3種CC趨化因子以隨機次序對小鼠進行序貫免疫，所述3種趨化因子選自初始包括MIP-1a、RANTES和MCP-1(P^roTech)的組。對于產生MAb3C12F的雜交瘤融合物3，用MIP-1a對小鼠進行初次免疫，隨后用RANTES、接著用MCP-1、然后再次用MCP-I進行加強免疫。對于產生MAb7012八和7016的雜交瘤融合物7，用祖-10對小鼠進行初次免疫，隨后用MCP-1、接著用RANTES、然后用MIP-1a和RANTES的組合進行加強免疫。對于產生MAb18V4F和18P7E的雜交瘤融合物18，用MIP-1^對小鼠進行初次免疫，隨后用MIP-1a、接著用RANTES進行加強免疫，然后再次用RANTES進行加強免疫。對于每次免疫,使用10iig蛋白，依照標準的免疫方案(參見CurrentProtocolsinImmunology,JEColigan等人編(2006),第2.I節(jié))進行。初次免疫在完全弗氏佐劑中進行，隨后用不完全弗氏佐劑中的2種不同趨化因子以3周的間隔時間進行加強。末次加強后10天，收集血清并通過ELISA測試其與CC趨化因子MIP-1a,RANTES,MCP-1和MIP-13的反應性，如CurrentProtocolsinImmunology,2006,JEColigan等人編，第2.4節(jié)所描述，其通過引用而并入。對于MIP-1a，將趨化因子包被到96孔ELISA板上(以IUg/mL)，并以I:50至I:6400的稀釋范圍與血清孵育。對于RANTES、MCP_1和MIP-1^，將生物素化的趨化因子(0.5iig/mL)加入到鏈霉親和素包被的板(Pierce)上，接著與稀釋后的血清孵育。利用HRP綴合的抗小鼠Fe第二抗體檢測與所包被趨化因子結合的抗體。用于ELISA測定之趨化因子的生物素化使用磺基-NHS-LC-生物素(Pierce)進行。將PBS中的趨化因子與約2倍摩爾過量的磺基-NHS-LC-生物素混合，并于室溫孵育30分鐘。利用截斷值(cutoff)為3，500MW的Slide-a-lyzer微型透析組件(Pierce)通過在PBS中透析過夜，從而將游離的生物素試劑去除。對來自利用MIP-1a、RANTES和MCP-I進行初始免疫組之血清的ELISA結果顯示多種應答(參見表I)，包括對MIP-1^的一定應答(盡管其未用作直接免疫原)。幾只小鼠對3種甚至4種趨化因子產生應答。這些是尋找與多種趨化因子反應之單個抗體的融合雜交瘤候選物。如下表I所示，經免疫的小鼠產生與多種CC趨化因子反應的多克隆血清。表I.經免疫小鼠的血清反應性I權利要求1.分離的抗體或其抗原結合片段，其與至少3種不同的CC趨化因子結合，其中至少一種CC趨化因子是CCL3/MIP-1a、CCL4/MIP-1β或CCL5/RANTES。2.權利要求I的分離的抗體或其抗原結合片段，其與至少4種不同的CC趨化因子結口ο3.權利要求I的分離的抗體或其抗原結合片段，其不與MCP-l、MCP-2或MCP-3結合。4.權利要求I的分離的抗體或其抗原結合片段，其與選自CCL2/MCP-1、CCL3/MIP-1α、CCL4/MIP-1β、CCL5/RANTES、CCL14/HCC-1、CCL15/HCC-2、CCL18/PARC和CCL23/MPIF-1的至少3種不同的CC趨化因子結合。5.權利要求I的分離的抗體或其抗原結合片段，其與CCL2/MCP-1、CCL3/MIP-1α、CCL4/MIP-1β、CCL5/RANTES、CCL14/HCC-1、CCL15/HCC-2、CCL18/PARC和CCL23/MPIF-1的至少一個決定簇結合，其中所述決定簇位于所述CC趨化因子的CC殘基與所述趨化因子的最后一個C殘基之間。6.權利要求I的分離的抗體或其抗原結合片段，其與CCL2/MCP-1、CCL3/MIP-1α、CCL4/MIP-1β、CCL5/RANTES、CCL14/HCC-1、CCL15/HCC-2、CCL18/PARC和CCL23/MPIF-1的至少一個決定簇結合，其中所述決定簇位于所述CC趨化因子的N環(huán)、30’s環(huán)或40’s環(huán)中。7.權利要求I的分離的抗體或其抗原結合片段，其與CC趨化因子之CC受體結合殘基內的至少一個決定簇結合。8.權利要求I的分離的抗體或其抗原結合片段，其中和其所結合之CC趨化因子的趨化活性。9.權利要求I的分離的抗體或其抗原結合片段，其由雜交瘤細胞系3C12F、7D1G、7D12A、18V4F或18P7E產生，或者其競爭性阻斷由雜交瘤細胞系3C12F、7D1G、7D12A、18V4F或18P7E產生之抗體的結合。10.權利要求I的分離的抗體或其抗原結合片段，其是人抗體、人源化抗體，或嵌合的人-鼠抗體，或其抗原結合片段。11.權利要求I的分離的抗體或其抗原結合片段，其與選自CCL3/MIP-1α、CCL4/MIP-Iβ、CCL5/RANTES、CCL15/HCC-2和CCL23/MPIF-1的至少5種CC趨化因子結合，并且其基本上不與CCL2/MCP-1結合。12.權利要求11的分離的抗體或其抗原結合片段，其與所述CC趨化因子中至少一種的N環(huán)、30’s環(huán)或40’s環(huán)中的決定簇結合。13.權利要求11的分離的抗體或其抗原結合片段，其與CCL3/MIP-1α的至少一個抗原決定簇結合，所述決定簇位于SEQIDNO:71的殘基11-15(CCFSY)、殘基17-24(SRQIPQNF)、殘基34-35(QC)或殘基57-67(EWVQKYVSDLE)內；其與CCL4/MIP-1β的至少一個抗原決定簇結合，所述決定簇位于SEQIDNO:72的殘基11-15(CCFSY)、殘基17-24(ARKLPHNF)、殘基34-35(LC)或殘基57-67(SffVQEYVYDLE)內；其與CCL5/RANTES的至少一個抗原決定簇結合，所述決定簇位于SEQIDNO73的殘基10-14(CCFAY)、殘基16-23(ARPLPRAH)、殘基33-34(KC)或殘基56-66(KffVREYINSLE)內。14.權利要求11的分離的抗體或其抗原結合片段，其包含MAb3C12F的至少一個⑶R，所述CDR選自SEQIDNO:3、4、5、8、9、10、53、54、55、58、59和60。15.權利要求11的分離的抗體或其抗原結合片段，其由產生MAb3C12F的雜交瘤細胞系或其繼代培養(yǎng)物產生，或者其競爭性阻斷由雜交瘤細胞系3C12F產生之抗體的結合。16.權利要求11的分離的抗體或其抗原結合片段，其是人抗體、人源化抗體，或嵌合的人-鼠抗體，或其抗原結合片段。17.權利要求I的分離的抗體或其抗原結合片段，其與選自CCL3/MIP-la、CCL4/MIP-Iβ、CCL5/RANTES、CCL14/HCC-1和CCL18/PARC的至少4種CC趨化因子結合，并且其基本上不與CCL2/MCP-1結合。18.權利要求17的分離的抗體或其抗原結合片段，其與所述CC趨化因子中至少一種的N環(huán)、30’s環(huán)或40’s環(huán)中的決定簇結合。19.權利要求17的分離的抗體或其抗原結合片段，其與CCL3/MIP-1α的至少一個抗原決定簇結合，所述決定簇位于SEQIDNO:71的殘基11-15(CCFSY)、殘基17-24(SRQIPQNF)、殘基34-35(QC)或殘基57-67(EffVQKYVSDLE)內；其與CCL4/MIP-1β的至少一個抗原決定簇結合，所述決定簇位于SEQIDNO:72的殘基11-15(CCFSY)、殘基17-24(ARKLPHNF)、殘基34-35(LC)或殘基57-67(SffVQEYVYDLE)內；其與CCL5/RANTES的至少一個抗原決定簇結合，所述決定簇位于SEQIDNO73的殘基10-14(CCFAY)、殘基16-23(ARPLPRAH)、殘基33-34(KC)或殘基56-66(KffVREYINSLE)內。20.權利要求17的分離的抗體或其抗原結合片段，其包含MAb7D1G的至少一個⑶R，所述CDR選自SEQIDNO:23、24、25、28、29或30。21.權利要求17的分離的抗體或其抗原結合片段，其由產生MAb7DlG的雜交瘤細胞系或其繼代培養(yǎng)物產生，或者其競爭性阻斷由雜交瘤細胞系7D1G產生之抗體的結合。22.權利要求17的分離的抗體或其抗原結合片段，其是人抗體、人源化抗體，或嵌合的人-小鼠抗體，或其抗原結合片段。23.權利要求I的分離的抗體或其抗原結合片段，其與選自CCL3/MIP-la、CCL4/MIP-Iβ、CCL5/RANTES和CCL23/MPIF-1的至少4種CC趨化因子結合，并且其基本上不與CCL2/MCP-1結合。24.權利要求23的分離的抗體或其抗原結合片段，其與所述CC趨化因子中至少一種的N環(huán)、30’s環(huán)或40’s環(huán)中的決定簇結合。25.權利要求23的分離的抗體或其抗原結合片段，其與CCL3/MIP-1α的至少一個抗原決定簇結合，所述決定簇位于SEQIDNO:71的殘基11-15(CCFSY)、殘基17-24(SRQIPQNF)、殘基34-35(QC)或殘基57-67(EWVQKYVSDLE)內；其與CCL4/MIP-1β的至少一個抗原決定簇結合，所述決定簇位于SEQIDNO:72的殘基11-15(CCFSY)、殘基17-24(ARKLPHNF)、殘基34-35(LC)或殘基57-67(SffVQEYVYDLE)內；其與CCL5/RANTES的至少一個抗原決定簇結合，所述決定簇位于SEQIDNO73的殘基10-14(CCFAY)、殘基16-23(ARPLPRAH)、殘基33-34(KC)或殘基56-66(KffVREYINSLE)內。26.權利要求23的分離的抗體或其抗原結合片段，其包含MAB7D12A的至少一個⑶R，所述CDR選自SEQIDNO:13、14、15、18、19或20。27.權利要求23的分離的抗體或其抗原結合片段，其由產生MAb7D12A的雜交瘤細胞系或其繼代培養(yǎng)物產生，或者其競爭性阻斷由雜交瘤細胞系7D12A產生之抗體的結合。28.權利要求23的分離的抗體或其抗原結合片段，其是人抗體、人源化抗體，或嵌合的人-小鼠抗體，或其抗原結合片段。29.權利要求I的分離的抗體或其抗原結合片段，其與選自CCL3/MIP-la、CCL4/MIP-Iβ和CCL5/RANTES的3種CC趨化因子結合，并且其基本上不與CCL2/MCP-1結合。30.權利要求29的分離的抗體或其抗原結合片段，其與所述CC趨化因子中至少一種的N環(huán)、30’s環(huán)或40’s環(huán)中的決定簇結合。31.權利要求29的分離的抗體或其抗原結合片段，其與CCL3/MIP-1α的至少一個抗原決定簇結合，所述決定簇位于SEQIDNO:71的殘基11-15(CCFSY)、殘基17-24(SRQIPQNF)、殘基34-35(QC)或殘基57-67(EffVQKYVSDLE)內；其與CCL4/MIP-1β的至少一個抗原決定簇結合，所述決定簇位于SEQIDNO:72的殘基11-15(CCFSY)、殘基17-24(ARKLPHNF)、殘基34-35(LC)或殘基57-67(SffVQEYVYDLE)內；其與CCL5/RANTES的至少一個抗原決定簇結合，所述決定簇位于SEQIDNO:73的殘基10-14(CCFAY)、殘基16-23(ARPLPRAH)、殘基33-34(KC)或殘基56-66(KffVREYINSLE)內。32.權利要求29的分離的抗體或其抗原結合片段，其包含MAbl8V4F的至少一個⑶R，所述CDR選自SEQIDNO:33、34、35、38、39、40、63、64、65、68、69和70。33.權利要求29的分離的抗體或其抗原結合片段，其由產生MAbl8V4F的雜交瘤細胞系或其繼代培養(yǎng)物產生，或者其競爭性阻斷由雜交瘤細胞系18V4F產生之抗體的結合。34.權利要求29的分離的抗體或其抗原結合片段，其是人抗體、人源化抗體，或嵌合的人-鼠抗體，或其抗原結合片段。35.權利要求I的分離的抗體或其抗原結合片段，其與選自CCL3/MIP-1a、CCL4/MIP-Iβ和CCL5/RANTES的至少3種CC趨化因子結合，并且其基本上不與CCL2/MCP-1結八口ο36.權利要求35的分離的抗體或其抗原結合片段，其與所述CC趨化因子中至少一種的N環(huán)、30’s環(huán)或40’s環(huán)中的決定簇結合。37.權利要求35的分離的抗體或其抗原結合片段，其與CCL3/MIP-1α的至少一個抗原決定簇結合，所述決定簇位于SEQIDNO:71的殘基11-15(CCFSY)、殘基17-24(SRQIPQNF)、殘基34-35(QC)或殘基57-67(EffVQKYVSDLE)內；其與CCL4/MIP-1β的至少一個抗原決定簇結合，所述決定簇位于SEQIDNO:72的殘基11-15(CCFSY)、殘基17-24(ARKLPHNF)、殘基34-35(LC)或殘基57-67(SffVQEYVYDLE)內；其與CCL5/RANTES的至少一個抗原決定簇結合，所述決定簇位于SEQIDNO:73的殘基10-14(CCFAY)、殘基16-23(ARPLPRAH)、殘基33-34(KC)或殘基56-66(KffVREYINSLE)內。38.權利要求35的分離的抗體或其抗原結合片段，其包含MAbl8P7E的至少一個⑶R，所述CDR選自SEQIDNO:43、44、45、48、49和50。39.權利要求35的分離的抗體或其抗原結合片段，其由產生MAbl8P7E的雜交瘤細胞系或其繼代培養(yǎng)物產生，或者其競爭性阻斷由雜交瘤細胞系18P7E產生之抗體的結合。40.權利要求35的分離的抗體或其抗原結合片段，其是人抗體、人源化抗體，或嵌合的人-鼠抗體，或其抗原結合片段。41.產生權利要求I之單克隆抗體的雜交瘤細胞系。42.包含權利要求I之抗體或其抗原結合片段以及載體、賦形劑或緩沖劑的組合物。43.制備產生與兩種或更多種CC趨化因子結合之抗因子抗體的雜交瘤細胞系的方法，其包括用一種CC趨化因子對哺乳動物進行序貫免疫，隨后用一種或更多種不同的CC趨化因子加強免疫，從所述哺乳動物產生雜交瘤細胞系，以及分離產生抗因子抗體的雜交瘤細胞系。44.治療由一種或更多種CC趨化因子介導之疾病、功能異?；虿“Y的方法，其包括向有此需要的對象施用權利要求I的抗因子抗體或其抗原結合片段。45.權利要求44的方法，其中所述疾病、功能異?；虿“Y是炎性疾病或由炎癥介導或與其相關的疾病。46.權利要求44的方法，其中所述疾病、功能異常或病癥是自身免疫病。全文摘要抗因子抗體(antikineantibody)與2、3、4、5種或更多種CC趨化因子(例如RANTES/CCL5、MIP-1α/CCL3、MIP-1β/CCL4或MCP-1/CCL2)結合。還公開了抗因子抗體的親和力成熟和人源化方法，以及通過序貫免疫得到產生抗因子抗體之雜交瘤細胞系的方法。文檔編號C12P21/08GK102782148SQ201080048961公開日2012年11月14日申請日期2010年8月27日優(yōu)先權日2009年8月28日發(fā)明者丹·阿莉森,卡羅爾·拉波特申請人:Vlst公司