專利名稱：Egfr基因多態(tài)性檢測(cè)用探針及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)EGFR基因的多態(tài)性的探針及其用途。
背景技術(shù)：
表皮成長(zhǎng)因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor :EGFR)是表皮成長(zhǎng)因子 (EGF)的酪氨酸激酶型受體。EGFR已知在大多數(shù)的實(shí)體瘤中高頻率地表達(dá)，其過(guò)剩表達(dá)與癌的惡性程度和預(yù)后相關(guān)。因此，例如，EGFR的酪氨酸激酶阻滯劑吉非替尼(Gefitinib)等可以作為癌治療藥使用。然而，有時(shí)患者產(chǎn)生顯示對(duì)吉非替尼(Gefitinib)的耐受性，得不到治療效果。近年來(lái)闡明了該藥劑耐受性與EGFR的突變相關(guān)(非專利文獻(xiàn)1和2)。上述突變是EGFR的第790位的氨基酸蘇氨酸(T)被取代為蛋氨酸(M)的突變，在EGFR基因的編碼序列中，eXon20的堿基序號(hào)2369的堿基胞嘧啶(c)突變?yōu)樾叵汆奏?t)。因此，如果檢測(cè)出EGn 基因的exOn20中的該突變的有無(wú)，即，檢測(cè)出多態(tài)性，就可以在治療前判斷是否有吉非替尼(Gefitinib)耐受性。由此，可以進(jìn)行更加有效的定制的癌治療。另一方面，作為檢測(cè)基因的多態(tài)性的方法，報(bào)告了各種方法，例如，可舉出 PCR(Polymerase Chain Reaction)-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) 法等。上述PCR-RFLP法，是針對(duì)試樣的靶標(biāo)DNA，利用PCR使檢測(cè)目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增，將該擴(kuò)增物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶處理，通過(guò)Southern雜交對(duì)由多態(tài)性導(dǎo)致的限制酶片段長(zhǎng)的變化進(jìn)行分型的方法?；蛑写嬖谀繕?biāo)突變時(shí)，限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)會(huì)消失，因此可以檢測(cè)切斷的有無(wú)，即，通過(guò)限制酶片段長(zhǎng)的變化，可以檢測(cè)突變的有無(wú)。然而，上述PCR-RFLP法，例如，在PCR之后，必須用各種限制性內(nèi)切酶處理得到的擴(kuò)增物并進(jìn)行分析，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。另外，一旦從反應(yīng)器取出擴(kuò)增物就必須馬上進(jìn)行得到的擴(kuò)增物的限制性內(nèi)切酶處理。因此，有可能發(fā)生第1次的反應(yīng)中得到的擴(kuò)增物發(fā)生飛散，混入第 2次的另外的反應(yīng)。由于這種問(wèn)題，多態(tài)性的檢測(cè)難以自動(dòng)化?？紤]到這樣的問(wèn)題，近年來(lái)，作為多態(tài)性的檢測(cè)方法，Tm (Melting Temperature) 分析備受關(guān)注。該方法如下首先，使用與含有檢測(cè)目標(biāo)多態(tài)性的區(qū)域互補(bǔ)的探針，形成被檢核酸和上述探針的雜交體(雙鏈核酸)；然后，對(duì)得到的雜交體實(shí)施加熱處理，通過(guò)吸光度等的信號(hào)的測(cè)定檢測(cè)隨著溫度上升的上述雜交體向單鏈核酸的解離(熔解)；基于該檢測(cè)結(jié)果來(lái)確定Tm值，由此判斷多態(tài)性。上述雜交體中的兩條單鏈核酸的互補(bǔ)性越高Tm值越高，互補(bǔ)性越低則Tm值越低。因此，檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的多態(tài)性為X或Y時(shí)，對(duì)于含有目標(biāo)多態(tài)性(例如，Y)的核酸和與其100%互補(bǔ)的探針的雜交體，預(yù)先求出Tm值(評(píng)價(jià)基準(zhǔn)值)。 接著，測(cè)定上述被檢核酸和上述探針的Tm值(測(cè)定值)。然后，如果該測(cè)定值與上述評(píng)價(jià)基準(zhǔn)值相同，則可以判斷為上述被檢核酸和上述探針為完全匹配，即，上述被檢核酸的檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)為目標(biāo)多態(tài)性(Y)。另一方面，如果上述測(cè)定值比上述評(píng)價(jià)基準(zhǔn)值低，則可以判斷為上述被檢核酸和上述探針錯(cuò)配，即，上述被檢核酸的檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)為另一個(gè)多態(tài)性(X)。通過(guò)這樣的方法，例如，僅僅對(duì)添加了上述探針的PCR反應(yīng)液實(shí)施溫度處理，進(jìn)行信號(hào)測(cè)定，就可以進(jìn)行多態(tài)性的檢測(cè)。因此，檢測(cè)裝置的自動(dòng)化成為可能。然而，這樣的利用Tm分析的檢測(cè)方法，例如，必須通過(guò)Tm值對(duì)一個(gè)堿基的差異進(jìn)行判斷。因此，特別需要即使在野生型的多態(tài)性和突變型的多態(tài)性混合存在的情況下等，也能夠正確地檢測(cè)突變的有無(wú)?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1 =Pao 等，PLoS Medicine, 2005 年，Vol. 2，No. 3，p. 225-235非專利文獻(xiàn)2 :Lynch 等，New England Journal of Medicine，2004 年，Vol. 350， No. 21，p.2129-2139

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題因此，本發(fā)明的目的在于，提供一種能夠簡(jiǎn)便且可靠性優(yōu)良地對(duì)于EGFR基因判別多態(tài)性的多態(tài)性檢測(cè)用探針及其用途。解決課題的方法為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)用探針是EGFR基因的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其特征在于，含有下述(Pi)的寡核苷酸和(P》的寡核苷酸中的至少一者，(Pl)寡核苷酸，其由堿基長(zhǎng)度為22 50堿基長(zhǎng)度、與含有序列編號(hào)1中的堿基序號(hào)334 355的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成，并且在3’末端區(qū)域具有與上述堿基序號(hào) 334的堿基互補(bǔ)的堿基，(P2)寡核苷酸，其由與上述(Pl)的寡核苷酸互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成。本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)用試劑是一種EGFR基因的多態(tài)性檢測(cè)用試劑，其特征在于， 包含本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)用探針。本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)方法是EGFR基因的多態(tài)性檢測(cè)方法，其特征在于，包括使用本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)用探針，檢測(cè)EGFR基因的多態(tài)性的步驟。發(fā)明的效果通過(guò)本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)用探針，例如，能夠通過(guò)Tm分析簡(jiǎn)便且可靠性優(yōu)良地判別EGFR基因的多態(tài)性。具體而言，例如，即使是試樣中目標(biāo)多態(tài)性為野生型的EGFR基因和突變型的EGFR基因共存時(shí)，通過(guò)進(jìn)行使用本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)用探針的Tm分析，也能夠簡(jiǎn)便且可靠性優(yōu)良地檢測(cè)多態(tài)性的種類或突變的有無(wú)。因此，本發(fā)明對(duì)于含有野生型(也稱為正常型)的EGFR基因和突變型的EGFR基因兩者的試樣，特別有用。這樣，根據(jù)本發(fā)明， 能夠簡(jiǎn)便且可靠性優(yōu)良地判別EGFR基因的多態(tài)性，因此例如，可以將檢測(cè)結(jié)果反映在前述那樣的抗癌劑的給藥的治療中。因此，本發(fā)明在醫(yī)療領(lǐng)域等中極為有用。


圖1是表示本發(fā)明的實(shí)施例1中的Tm分析的結(jié)果的圖。圖2是表示本發(fā)明的實(shí)施例2中的Tm分析的結(jié)果的圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明中，EGFR基因中的檢測(cè)目標(biāo)多態(tài)性是指前述的eXOn20中的多態(tài)性。上述多態(tài)性例如為序列編號(hào)1中所示的EGFR基因的部分序列中的堿基序號(hào)347的堿基中的多態(tài)性。對(duì)于野生型的上述多態(tài)性，序列編號(hào)1中所示的EGFR基因的部分序列中，堿基序號(hào) 347的堿基(y)為胞嘧啶(c)，EGFR蛋白質(zhì)的第790位的氨基酸為蘇氨酸。對(duì)于突變型的上述多態(tài)性，在序列編號(hào)1中所示的EGFR基因的部分序列中，堿基序號(hào)347的堿基(y)為胸腺嘧啶(t)，EGFR蛋白質(zhì)的第790位的氨基酸為蛋氨酸?？梢耘袛嘣贓GFR基因中，上述堿基的多態(tài)性為野生型時(shí)，就對(duì)吉非替尼(Gefitinib)等的酪氨酸激酶阻滯劑具有感受性，上述堿基的多態(tài)性為突變型時(shí)，就對(duì)上述酪氨酸激酶阻滯劑具有耐受性。上述EGFR基因的堿基序列，例如作為GenBank accession No. NG_0077^注冊(cè)、上述登錄號(hào)的堿基序列中堿基序號(hào)5001 193307的區(qū)域?yàn)镋GFR基因的全長(zhǎng)堿基序列。序列編號(hào)1中所示的堿基序列為上述EGFR基因的部分序列，例如，為上述登錄號(hào)的堿基序列中的堿基序號(hào)167001 168020的區(qū)域。序列編號(hào)1的堿基序列中，堿基序號(hào)沈2 447 為 exon20。本發(fā)明中，以下，將上述堿基為突變型的上述EGFR基因稱為“突變型EGFR基因”， 將上述堿基為野生型的上述EGFR基因稱為“野生型EGFR基因或正常型EGFR基因”。本發(fā)明中，將上述多態(tài)性的發(fā)生位點(diǎn)，S卩，與序列編號(hào)1的堿基序列(正義鏈)中的堿基序號(hào)347的堿基，或，互補(bǔ)序列(反義鏈)中的與上述正義鏈的堿基序號(hào)347對(duì)應(yīng)的堿基稱為“檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)”。將序列編號(hào)1的序列(正義鏈)或其互補(bǔ)序列(反義鏈)中的、 含有上述檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)且能與上述多態(tài)性檢測(cè)用探針雜交的區(qū)域稱為“雜交區(qū)域或檢測(cè)對(duì)象序列”。在所述檢測(cè)對(duì)象序列之中，除了非檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的任意的位點(diǎn)之外與所述多態(tài)性檢測(cè)用探針完全匹配的檢測(cè)對(duì)象序列稱為“完全匹配序列”，將檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)和任意的位點(diǎn)與所述多態(tài)性檢測(cè)用探針錯(cuò)配的檢測(cè)對(duì)象序列稱為“錯(cuò)配序列”。本發(fā)明中，完全匹配是指所述檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的堿基與所述多態(tài)性檢測(cè)用探針中的對(duì)應(yīng)堿基互補(bǔ)，優(yōu)選是指所述檢測(cè)對(duì)象序列中除了非所述檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的任意的位點(diǎn)之外，所述檢測(cè)對(duì)象序列和所述多態(tài)性檢測(cè)用探針完全互補(bǔ)。本發(fā)明中，錯(cuò)配是指所述檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的堿基與所述多態(tài)性檢測(cè)用探針中的對(duì)應(yīng)堿基非互補(bǔ)，優(yōu)選是指在所述檢測(cè)對(duì)象序列中除了所述檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)和任意的位點(diǎn)之外，所述檢測(cè)對(duì)象序列與所述多態(tài)性檢測(cè)用探針完全互補(bǔ)。本發(fā)明中，使上述EGFR基因擴(kuò)增，進(jìn)而使得到的擴(kuò)增物和本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)用探針雜交時(shí)，以下將上述EGFR基因中的擴(kuò)增區(qū)域稱為“擴(kuò)增對(duì)象區(qū)域”。上述擴(kuò)增對(duì)象區(qū)域例如可以為上述EGFR基因的正義鏈中的區(qū)域，也可為與其對(duì)應(yīng)的反義鏈中的區(qū)域，也可以為兩者。本發(fā)明中，正義鏈和反義鏈例如也表示正義鏈的擴(kuò)增物，反義鏈的擴(kuò)增物的意思。本發(fā)明中，堿基序列的末端表示堿基序列中的5’側(cè)和3’側(cè)的最端部的堿基。另外，5’末端區(qū)域是指從堿基序列中的5’末端起數(shù)個(gè)堿基的區(qū)域，3’末端區(qū)域是從堿基序列的3’末端起數(shù)個(gè)堿基的區(qū)域。上述數(shù)個(gè)堿基例如為含有上述末端堿基的1 10個(gè)堿基、 1 4個(gè)堿基、1 3個(gè)堿基、1 2個(gè)堿基。本發(fā)明中，從堿基序列的末端起第Z位的堿基 (Z為正的整數(shù))是指將末端的堿基作為第1位的順序，例如，從末端起第1位的堿基是指末端的堿基，從末端起第2位的堿基是指與末端相鄰的堿基。<多態(tài)性檢測(cè)用探針>本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)用探針，如上所述，其為EGFR基因的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其特征在于，含有下述(Pl)的寡核苷酸和(P》的寡核苷酸的至少一者。(Pl)其由堿基長(zhǎng)度為22 50堿基長(zhǎng)度、與含有序列編號(hào)1中的堿基序號(hào)334 355的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成，3’末端區(qū)域具有與上述堿基序號(hào)334的堿基互補(bǔ)的堿基的寡核苷酸，(P2)由與上述(Pl)的寡核苷酸互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸。本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)用探針是用來(lái)對(duì)序列編號(hào)1中所示的EGFR基因的部分序列中的堿基序號(hào)347的堿基(y)的多態(tài)性(c/t)進(jìn)行檢測(cè)的探針。上述(Pl)的寡核苷酸與上述EGFR基因的正義鏈互補(bǔ)，通過(guò)與上述正義鏈的雜交能夠確認(rèn)多態(tài)性。上述(P2)的寡核苷酸與上述EGFR基因的正義鏈相同，通過(guò)與反義鏈的雜交，能夠確認(rèn)多態(tài)性。上述(Pl)和(P》的寡核苷酸中，所謂互補(bǔ)可以是完全互補(bǔ)也可以是除任意的堿基之外完全互補(bǔ)。上述任意的堿基，例如為與上述檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)雜交的位點(diǎn)以外的堿基，其數(shù)量沒(méi)有特別限制，例如，1個(gè)。上述(Pl)和(P》的寡核苷酸的堿基長(zhǎng)度，如上所述為22 50堿基長(zhǎng)度。上限例如優(yōu)選為40堿基長(zhǎng)度，更優(yōu)選為30堿基長(zhǎng)度。上述(Pl)的寡核苷酸中，與序列編號(hào)1中的堿基序號(hào)347的堿基互補(bǔ)的堿基用r 表示，為腺嘌呤(a)或鳥嘌呤(g)。上述(Pl)的寡核苷酸，在上述3’末端區(qū)域具有與上述堿基序號(hào)334的堿基互補(bǔ)的堿基，該堿基優(yōu)選位于從3’末端起數(shù)第1 4位的位置，更優(yōu)選位于第1 3位，特別優(yōu)選位于第1位(3’末端)或第2位。上述(Pl)的寡核苷酸，例如，可例示由序列編號(hào)2、序列編號(hào)15、序列編號(hào)16和序列編號(hào)17的任一者所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸。tgagctgcrtgatgaggtgcac (序歹丨J編號(hào) 2)tgagctgcrtgatgaggtgcacg (序列編號(hào) 15)tgagctgcrtgatgaggtgcacgg( j^^lJIS16)tgagctgcrtgatgaggtgcacggt ( ；！5歹號(hào) 17)序列編號(hào)2、15 17中所示的上述(Pl)的寡核苷酸與序列編號(hào)1所示的堿基序列中的包含堿基序號(hào)334 355的區(qū)域?qū)?yīng)時(shí)，為除從5’末端起第17位的堿基(g)之外，與上述區(qū)域完全互補(bǔ)的堿基序列。上述(Pl)的寡核苷酸中，從5’末端起第9位的堿基r為上述正義鏈的檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)，即與序列編號(hào)1的堿基序列中的堿基序號(hào)347的堿基(y)互補(bǔ)的堿基。上述r為腺嘌呤(a)或鳥嘌呤(g)。序列編號(hào)2、15 17中所示的上述(Pl)的寡核苷酸中，從5’末端起第9位的堿基r為鳥嘌呤(g)時(shí)，除從5’末端起第17位的堿基(g)之外，與序列編號(hào)1的堿基序列中的堿基序號(hào)347的堿基(y)為胞嘧啶(c)的檢測(cè)對(duì)象序列完全匹配。另外，上述(Pl)的寡核苷酸中，上述第9位的堿基r為鳥嘌呤(g)時(shí)，與序列編號(hào)1的堿基序列中堿基序號(hào)347 的堿基(y)為胸腺嘧啶(t)的檢測(cè)對(duì)象序列錯(cuò)配。這時(shí)，上述(Pl)的寡核苷酸中，上述第9 位的堿基(g)和上述第17位的堿基(g)與上述檢測(cè)對(duì)象序列的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的堿基錯(cuò)配。另一方面，上述(Pl)的寡核苷酸中，上述第9位的r為腺嘌呤(a)時(shí)，除上述第17位的堿基 (g)之外，與序列編號(hào)1中堿基序號(hào)347的堿基(y)為胸腺嘧啶(t)的檢測(cè)對(duì)象序列完全匹配。另外，上述(Pl)的寡核苷酸中，上述第9位的r為腺嘌呤(a)時(shí)，除上述第17位的堿基(g)之外，與序列編號(hào)1中堿基序號(hào)347的堿基(y)為胞嘧啶(c)的檢測(cè)對(duì)象序列錯(cuò)配。這時(shí)，上述(Pl)的寡核苷酸中，上述第9位的堿基(a)和上述第17位的堿基(g)與上述檢測(cè)對(duì)象序列的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的堿基錯(cuò)配。因此，根據(jù)是否與上述EGFR基因的檢測(cè)對(duì)象序列完全匹配，可以檢測(cè)EGFR基因的多態(tài)性。序列編號(hào)2、15 17中所示的上述(Pl)的寡核苷酸例如可舉出由序列編號(hào)3、4、 18 23中所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸，優(yōu)選由序列編號(hào)3、18、20、23中所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸。tgagctgcatgatgaggtgcac (序歹丨J編號(hào) 3)tgagctgcgtgatgaggtgcac (^lJIS4)tgagctgcatgatgaggtgcacg( j^^lJIS18)tgagctgcgtgatgaggtgcacg( j^^lJIS-^· 19)tgagctgcatgatgaggtgcacgg (^lJIS20)tgagctgcgtgatgaggtgcacgg( j^^lJIi)-^· 21)tgagctgcatgatgaggtgcacggt (序列編號(hào) 22)tgagctgcgtgatgaggtgcacggt (序列編號(hào) 23)上述(P》的寡核苷酸如上所述與上述(Pl)的寡核苷酸互補(bǔ)。上述(P》的寡核苷酸的堿基長(zhǎng)度為22 50堿基長(zhǎng)度，由與序列編號(hào)1中的含有堿基序號(hào)334 355的堿基序列同源的堿基序列構(gòu)成，也可以稱為在5’末端區(qū)域具有上述堿基序號(hào)334的堿基的寡核苷酸。上述所謂同源，可以是完全同源，也可以是除任意的堿基之外完全同源。上述任意的堿基，例如為與上述檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)雜交的位點(diǎn)以外的堿基，其數(shù)量沒(méi)有特別限制，例如，為1 個(gè)。作為具體例，上述(P2)的寡核苷酸，例如由與含有序列編號(hào)1中的除堿基序號(hào)第339 位的堿基(g)之外的堿基序號(hào)334 355的區(qū)域同源的堿基序列構(gòu)成。上述(P2)的寡核苷酸中，序列編號(hào)1中的堿基序號(hào)；347的堿基以y表示。上述y為胸腺嘧啶(t)或胞嘧啶
(C)。本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)用探針例如可以是含有上述寡核苷酸的探針，也可以是由上述寡核苷酸構(gòu)成的探針。本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)用探針優(yōu)選為具有標(biāo)記物質(zhì)的標(biāo)記探針，例如，上述寡核苷酸優(yōu)選用上述標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記(修飾)。上述寡核苷酸中，通過(guò)上述標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行了標(biāo)記的位點(diǎn)，沒(méi)有特別限制，例如，優(yōu)選為5’末端區(qū)域或3’末端區(qū)域，更優(yōu)選為5’末端或3’末端。如后所述，上述寡核苷酸中，通過(guò)上述標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記的堿基，例如優(yōu)選為胞嘧啶(C) 或鳥嘌呤(g)。上述標(biāo)記物質(zhì)，例如，可以將堿基直接標(biāo)記，也可以間接將上述堿基標(biāo)記。為后者的情況時(shí)，例如，通過(guò)將含有上述堿基的核苷酸殘基中的任何位點(diǎn)標(biāo)記，可以間接地將上述堿基標(biāo)記。上述(Pl)的寡核苷酸優(yōu)選在3’末端區(qū)域具有上述標(biāo)記物質(zhì)，具體而言，例如，優(yōu)選在從3’末端起數(shù)第1 4位的堿基的位置具有上述標(biāo)記物質(zhì)，更優(yōu)選為從3’末端起數(shù)第 1 4位的堿基，進(jìn)一步優(yōu)選，從3’末端起數(shù)第1 3位的堿基，特別優(yōu)選，從3’末端起數(shù)第2位或3’末端的堿基。上述(Pl)的寡核苷酸中，例如，優(yōu)選與上述堿基序號(hào)334 337 的堿基互補(bǔ)的任何堿基具有上述標(biāo)記物質(zhì)，更優(yōu)選與上述堿基序號(hào)334的堿基互補(bǔ)的堿基 (c)具有上述標(biāo)記物質(zhì)。上述(P》的寡核苷酸優(yōu)選在5’末端區(qū)域具有上述標(biāo)記物質(zhì)，具體而言，例如，優(yōu)選在從5’末端起數(shù)第1 4位的堿基的位置具有上述標(biāo)記物質(zhì)，更優(yōu)選從5’末端起數(shù)第 1 4位的堿基，進(jìn)一步優(yōu)選從5’末端起數(shù)第1 3位的堿基，特別優(yōu)選從5’末端起數(shù)2 第位或5’末端的堿基。上述(P》的寡核苷酸，例如，優(yōu)選在上述堿基序號(hào)334 337中任何堿基上具有上述標(biāo)記物質(zhì)，更優(yōu)選在上述堿基序號(hào)334的堿基(g)上具有上述標(biāo)記物質(zhì)。上述標(biāo)記物質(zhì)沒(méi)有特別限制，例如，優(yōu)選上述標(biāo)記探針單獨(dú)發(fā)出信號(hào)，或者通過(guò)形成雜交體而發(fā)出信號(hào)。上述信號(hào)的種類，沒(méi)有特別限制，例如，可舉出熒光、呈色等。上述呈色例如可以為發(fā)色，也可以為變色。上述信號(hào)為熒光時(shí)，信號(hào)值，例如，可舉出熒光強(qiáng)度。上述信號(hào)為呈色時(shí)，上述信號(hào)值例如可舉出反射率、吸光度、透射率等。上述信號(hào)，例如，可以從上述標(biāo)記物質(zhì)直接發(fā)出，也可以間接發(fā)出。上述標(biāo)記物質(zhì)沒(méi)有特別限制，例如，可舉出熒光團(tuán)等熒光標(biāo)記物質(zhì)等。上述熒光物質(zhì)，例如，可舉出熒光黃、磷光體、羅丹明、聚甲炔染料衍生物等。市售的熒光物質(zhì)例如，可舉出 Pacific Blue (注冊(cè)商標(biāo)，Molecular Probe 公司制)，BODIPY FL(注冊(cè)商標(biāo)，Molecular Probe 公司制)，F(xiàn)luorePrime (商品名，Amersham Pharmacia 公司制)，F(xiàn)luoredite (商品名， Mi 11 ipore 公司制)，F(xiàn)AM (注冊(cè)商標(biāo)，ABI 公司制)，Cy3 和 Cy5 (商品名，Amersham Pharmacia 公司制)，TAMRA(注冊(cè)商標(biāo)，Molecular Probe公司制)等。上述熒光物質(zhì)的檢測(cè)條件沒(méi)有特別限制，例如可根據(jù)使用的熒光物質(zhì)的種類適當(dāng)確定。作為具體例，Pacific Blue例如可以在檢測(cè)波長(zhǎng)450 480nm檢測(cè)，TAMRA例如可以在檢測(cè)波長(zhǎng)585 700nm檢測(cè)，BODIPY FL例如可以在檢測(cè)波長(zhǎng)515 555nm檢測(cè)。若使用這樣的標(biāo)記探針，例如，通過(guò)檢測(cè)熒光作為信號(hào)，測(cè)定熒光強(qiáng)度作為信號(hào)值，就可以根據(jù)熒光強(qiáng)度的變動(dòng)，容易地確認(rèn)雜交和解離。上述標(biāo)記探針，例如，優(yōu)選單獨(dú)顯示信號(hào)，且通過(guò)雜交體形成不顯示信號(hào)的標(biāo)記探針，或，單獨(dú)不顯示信號(hào)且通過(guò)雜交體形成而顯示信號(hào)的標(biāo)記探針。上述標(biāo)記物質(zhì)為熒光物質(zhì)時(shí)，上述標(biāo)記探針例如優(yōu)選被上述熒光物質(zhì)標(biāo)記且單獨(dú)顯示熒光，且通過(guò)雜交體形成熒光減少(例如，淬滅)的探針。這樣的現(xiàn)象通常稱為熒光淬滅現(xiàn)象(Quenching phenomenon) 0利用該現(xiàn)象的探針，通常稱為熒光淬滅探針。其中，上述熒光淬滅探針例如， 優(yōu)選寡核苷酸的3’末端或者5’末端被上述熒光物質(zhì)標(biāo)記，優(yōu)選經(jīng)標(biāo)記的上述末端的堿基為胞嘧啶(c)或鳥嘌呤(g)。上述末端的堿基為胞嘧啶(c)時(shí)，上述熒光淬滅探針例如在與被檢核酸形成雜交體時(shí)，優(yōu)選對(duì)上述熒光淬滅探針的堿基序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，以使得上述被檢核酸中的、與經(jīng)標(biāo)記的末端的胞嘧啶(c)成對(duì)的堿基或與上述成對(duì)的堿基相距1 3個(gè)堿基的堿基為鳥嘌呤(g)。與上述成對(duì)的堿基相距一個(gè)堿基的堿基，是指上述成對(duì)的堿基的相鄰堿基。這樣的探針，通常稱為鳥嘌呤淬滅探針，已知所謂QProbe (注冊(cè)商標(biāo))。上述鳥嘌呤淬滅探針與上述被檢核酸雜交時(shí)，例如，用上述熒光物質(zhì)標(biāo)記的末端的胞嘧啶(C) 通過(guò)靠近上述被檢核酸中的鳥嘌呤(g)，會(huì)顯示上述熒光物質(zhì)的熒光減弱，即熒光強(qiáng)度減少的現(xiàn)象。使用上述探針時(shí)，例如，基于熒光強(qiáng)度的變動(dòng)，可以容易地確認(rèn)雜交和解離。同樣， 上述末端的堿基為鳥嘌呤(g)時(shí)，上述熒光淬滅探針，例如，在與上述被檢核酸形成雜交體時(shí)，優(yōu)選對(duì)上述熒光淬滅探針的堿基序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，以使得上述被檢核酸中的、與經(jīng)標(biāo)記的末端的鳥嘌呤(g)成對(duì)的堿基或與上述成對(duì)的堿基相距1 3堿基的堿基為胞嘧啶(c)。本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)用探針，例如，可以在3’末端添加磷酸基。如后所述，被檢核酸例如可以通過(guò)PCR等的核酸擴(kuò)增法來(lái)制備。此時(shí)，可以使本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)用探針在核酸擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系中共存。這種情況下，如果在上述多態(tài)性檢測(cè)用探針的3’末端添加磷酸基，就可以充分防止上述多態(tài)性檢測(cè)用探針自身通過(guò)上述核酸擴(kuò)增反應(yīng)延伸。另外， 通過(guò)在上述多態(tài)性檢測(cè)用探針的3’末端添加前述那樣的標(biāo)記物質(zhì)，可以得到同樣的效果。使用了本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)用探針的多態(tài)性的檢測(cè)中，檢測(cè)方法沒(méi)有限制，只要是利用上述檢測(cè)對(duì)象序列和探針的雜交的方法即可。作為上述多態(tài)性的檢測(cè)方法，以下對(duì)本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)方法進(jìn)行說(shuō)明。<多態(tài)性檢測(cè)方法>本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)方法是EGFR基因的多態(tài)性檢測(cè)方法，其特征在于，如上所述，包括使用本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)用探針，對(duì)EGFR基因的多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)的步驟。本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)方法，優(yōu)選包括例如下述(A)步驟和(B)步驟。(A)使含有被檢核酸和本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)用探針的反應(yīng)體系的溫度變化，測(cè)定顯示上述被檢核酸和上述多態(tài)性檢測(cè)用探針的雜交體的熔解狀態(tài)的信號(hào)值的步驟；(B)由伴隨上述溫度變化的上述信號(hào)值的變動(dòng)，檢測(cè)上述被檢核酸中的上述多態(tài)性的步驟。本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)方法的特征是使用本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其他構(gòu)成、 條件等，不限于以下的記載。本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)用探針優(yōu)選如上所述標(biāo)記探針。本發(fā)明中，上述反應(yīng)體系例如為反應(yīng)液。本發(fā)明中，上述被檢核酸可以為單鏈核酸，也可以是雙鏈核酸。上述被檢核酸為上述雙鏈核酸時(shí)，例如，如后所述，在上述(A)步驟中，優(yōu)選包括加熱上述反應(yīng)體系，使雙鏈的被檢核酸解離的步驟。通過(guò)將上述雙鏈核酸解離為單鏈核酸，本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)用探針和上述單鏈核酸發(fā)生雜交。本發(fā)明中，上述被檢核酸例如可以是試樣中本來(lái)含有的核酸，也可以是上述核酸的擴(kuò)增物。后者例如能提高檢測(cè)精度因而優(yōu)選，上述擴(kuò)增物，例如，可將上述試樣中的上述核酸作為模板核酸，通過(guò)核酸擴(kuò)增法使其擴(kuò)增來(lái)進(jìn)行制備。上述擴(kuò)增物，例如，可以為將上述試樣中的DNA作為模板而得的擴(kuò)增物，也可以是將由上述試樣中的RNA合成的cDNA為模板而得的擴(kuò)增物。上述試樣中的RNA，例如，可以舉出總RNA、mRNA等RNA，上述cDNA例如可由上述 RNA 利用 RT-PCR(Reverse Transcription PCR)進(jìn)行合成。本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)方法中，上述被檢核酸為上述擴(kuò)增物時(shí)，例如，還可包含下述 (X)步驟。上述(X)步驟例如優(yōu)選在上述(A)步驟之前進(jìn)行。另外，上述(X)步驟，例如可以是在上述多態(tài)性檢測(cè)用探針的存在下，在反應(yīng)體系中由上述模板核酸生成上述擴(kuò)增物的步驟ο(X)由模板核酸生成上述擴(kuò)增物的步驟上述(A)步驟中，上述多態(tài)性檢測(cè)用探針，例如，只要在上述反應(yīng)體系中含有即可，其添加的時(shí)機(jī)，沒(méi)有特別限定。上述被檢核酸為上述擴(kuò)增物時(shí)，上述(A)步驟中的上述反應(yīng)體系，例如，可以是使用上述(X)步驟中得到的上述擴(kuò)增物和上述多態(tài)性檢測(cè)用探針而新制備的，也可以是上述(X)步驟中的上述擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系。為后者時(shí)，上述多態(tài)性檢測(cè)用探針，例如，可以在上述(X)步驟之前或中途添加到上述擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系，也可在上述(X)步驟之后，添加到上述擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系。上述核酸擴(kuò)增法沒(méi)有特別限制，例如，可舉出PCR(Polymerase Chain Reaction)法、NASBA (Nuc 1 e i c Acid Sequence Based Amplification)法、TMA (Transcript ion-Mediated Amplification)法、SDA(Strand Displacement Amplification)法等，其中，優(yōu)選PCR法。上述核酸擴(kuò)增法的條件沒(méi)有特別限制，可以利用以往公知的方法進(jìn)行。在由上述模板核酸生成上述核酸擴(kuò)增物時(shí)，優(yōu)選使用用于擴(kuò)增包含上述EGFR基因中的檢測(cè)目標(biāo)多態(tài)性的區(qū)域的引物。上述引物的序列沒(méi)有特別限制，例如，只要能擴(kuò)增包含上述檢測(cè)對(duì)象位點(diǎn)的檢測(cè)對(duì)象序列即可，可以根據(jù)上述檢測(cè)對(duì)象序列及其周邊序列等， 通過(guò)以往公知的方法適當(dāng)設(shè)定。上述引物的長(zhǎng)度沒(méi)有特別限制，可以設(shè)定為一般的長(zhǎng)度，例如，可舉出10 30堿基長(zhǎng)度。上述引物例如可使用擴(kuò)增基因的正義鏈的正向引物(以下，也稱為“F引物”)和擴(kuò)增反義鏈的反向引物(以下，也稱為“R引物”)中的任一者，但是優(yōu)選使用將兩者作為一對(duì)的引物對(duì)。以下，以F引物和R引物為例示，但是它們只是一個(gè)例子，對(duì)本發(fā)明并沒(méi)有限制作用。F 引物5' -tccaggaagcctacgtgatggccag-3 ‘ (序列編號(hào) 5)R 引物5' -ccaatattgtctttgtgttcccggacatagtc-3'(序歹[J編號(hào) 6)5' -cgaagggcatgagctgcg-3'(序列編號(hào) 7)5' -ccgaagggcatgagctgca-3‘(序歹丨」編號(hào) 8)上述序列編號(hào)7中所示的R引物例如是特異性擴(kuò)增野生型EGFR基因的引物，上述序列編號(hào)8中所示的R引物例如是特異性擴(kuò)增突變型EGFR基因的引物。上述序列編號(hào)7 中所示的引物和上述序列編號(hào)8中所示的引物例如可以并用。也將上述序列編號(hào)中所示的引物稱為本發(fā)明的引物。上述引物的組合沒(méi)有特別限定。作為具體例，可舉出序列編號(hào)5中所示的引物和序列編號(hào)6中所示的引物的組合，序列編號(hào)7中所示的引物和序列編號(hào)8中所示的引物的
組合等。上述反應(yīng)體系中，上述引物的添加比例沒(méi)有特別限制，例如，對(duì)于一種引物，例如， 為0. 1 2ymol/L，優(yōu)選為0. 25 1. 5 μ mol/L，特別優(yōu)選為0. 5 1 μ mol/L。另外，使用 F引物和R引物時(shí)，上述F引物(F)與R引物(R)的添加比例(摩爾比F R)沒(méi)有特別限制，例如優(yōu)選為1 0.25 1 4，更優(yōu)選為1 0. 5 1 2。上述(A)步驟中，上述多態(tài)性檢測(cè)用探針相對(duì)于上述被檢核酸的添加比例(摩爾比)沒(méi)有特別限制，從充分確保檢測(cè)信號(hào)的角度考慮，優(yōu)選1倍以下，更優(yōu)選0. 1倍以下。 此時(shí)，上述被檢核酸，例如，可以是具有完全匹配序列的完全匹配核酸和具有錯(cuò)配序列的錯(cuò)配核酸的合計(jì)，也可以是含有完全匹配序列的擴(kuò)增物和含有錯(cuò)配序列的擴(kuò)增物的合計(jì)。被檢核酸中的完全匹配核酸的比例通常不確定，但是結(jié)果上，上述多態(tài)性檢測(cè)用探針的添加比例(摩爾比)優(yōu)選相對(duì)于完全匹配核酸(含有完全匹配序列的擴(kuò)增物)為10倍以下，更優(yōu)選為5倍以下，進(jìn)一步優(yōu)選為3倍以下。另外，其下限沒(méi)有特別限制，例如，為0. 001倍以上，優(yōu)選為0. 01倍以上，更優(yōu)選0. 1倍以上。本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)用探針相對(duì)于上述被檢核酸的添加比例，例如，可以是相對(duì)于雙鏈核酸的摩爾比，也可以是相對(duì)于單鏈核酸的摩爾比。
上述反應(yīng)體系中的本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)用探針的添加比例沒(méi)有特別限制，例如， 優(yōu)選以上述多態(tài)性檢測(cè)用探針達(dá)到10 lOOOnmol/L的范圍的方式添加，更優(yōu)選為20 500nmol/Lo另外，例如，從確保足夠的信號(hào)值的角度考慮，上述反應(yīng)體系中，上述多態(tài)性檢測(cè)用探針相對(duì)于上述被檢核酸的摩爾比，例如優(yōu)選1倍以下，更優(yōu)選為0. 1倍以下。上述多態(tài)性檢測(cè)用探針相對(duì)于上述被檢核酸的添加比例，例如，可以是相對(duì)于雙鏈核酸的摩爾比， 也可以是相對(duì)于單鏈核酸的摩爾比。應(yīng)用本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)方法的試樣沒(méi)有特別限制，可舉出生物試樣。上述生物試樣的具體例，例如，可舉出全血，白細(xì)胞等血細(xì)胞，口腔粘膜等口腔內(nèi)細(xì)胞，指甲、毛發(fā)等體細(xì)胞，生殖細(xì)胞，吐出的痰，羊水，石蠟包埋組織，尿，胃液，胃清洗液等。本發(fā)明中，上述試樣的采集方法，從上述試樣制備被檢核酸的方法等沒(méi)有限制，可采用以往公知的方法。本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)方法可以利用前述那樣的所謂的Tm分析。對(duì)Tm分析中的Tm 值進(jìn)行說(shuō)明。例如，加熱含雙鏈DNA的溶液時(shí)，260nm中的吸光度上升。這是因?yàn)殡p鏈DNA 中的兩鏈間的氫鍵由于加熱而斷裂，解離為單鏈DNA(DNA的熔解)。然后，全部雙鏈DNA解離形成單鏈DNA時(shí)，其吸光度顯示加熱開始時(shí)的吸光度(僅雙鏈DNA的吸光度)的約1. 5 倍左右。由此，可判斷為熔解終止?；谠摤F(xiàn)象，熔解溫度Tm通常定義為吸光度達(dá)到吸光度全部上升量的50%時(shí)的溫度。上述(A)步驟中，顯示上述被檢核酸和上述多態(tài)性檢測(cè)用探針的雜交體的熔解狀態(tài)的信號(hào)的測(cè)定，例如，可以是前述的260nm處吸光度測(cè)定，也可以是上述標(biāo)記物質(zhì)的信號(hào)測(cè)定。具體而言，作為上述多態(tài)性檢測(cè)用探針，如前所述，優(yōu)選使用以上述標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記的標(biāo)記探針，進(jìn)行上述標(biāo)記物質(zhì)的信號(hào)測(cè)定。上述標(biāo)記探針，例如，可舉出單獨(dú)顯示信號(hào)，且通過(guò)雜交體形成而不顯示信號(hào)的標(biāo)記探針，或，單獨(dú)不顯示信號(hào)且通過(guò)雜交體形成顯示信號(hào)的標(biāo)記探針。為前者的探針時(shí)，與上述擴(kuò)增物形成雜交體(雙鏈DNA)時(shí)，不顯示信號(hào)，通過(guò)加熱上述探針從上述擴(kuò)增物解離時(shí)，顯示信號(hào)。另外，為后者的探針時(shí)，通過(guò)與上述擴(kuò)增物形成雜交體(雙鏈DNA)顯示信號(hào)，通過(guò)加熱上述探針從上述擴(kuò)增物解離時(shí)，信號(hào)減少(消失)。因此，通過(guò)上述標(biāo)記物質(zhì)的信號(hào)的檢測(cè)，與上述^Onm中的吸光度測(cè)定同樣，能進(jìn)行雜交體的熔解的進(jìn)行狀態(tài)的檢測(cè)、Tm值的決定等。上述標(biāo)記物質(zhì)的信號(hào)檢測(cè)只要例如能在特有的條件下對(duì)上述標(biāo)記物質(zhì)的信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)即可。上述條件，例如，可舉出激發(fā)波長(zhǎng)、檢測(cè)波長(zhǎng)等。上述標(biāo)記探針以及上述標(biāo)記物質(zhì)如上所述。接著，對(duì)本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)方法，舉一個(gè)例子進(jìn)行說(shuō)明。本例中，作為本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)用探針，使用用熒光物質(zhì)標(biāo)記的標(biāo)記探針，在上述多態(tài)性檢測(cè)用探針的存在下， 進(jìn)行模板核酸的擴(kuò)增，將得到的擴(kuò)增物作為上述被檢核酸。本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)方法特征在于使用本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)用探針的行為本身，對(duì)于其他步驟和條件沒(méi)有任何限制。首先，從上述生物體試樣分離基因組DNA。從上述生物體試樣的基因組DNA的分離可通過(guò)以往公知的方法進(jìn)行。作為具體例，例如，可使用市售的基因組DNA分離試劑盒(商品名 GFX Genomic Blood DNA Purification kit ；GE Healthcare Bioscience 公司制)等。接著，在含有分離的基因組DNA的試樣中添加標(biāo)記探針，制備反應(yīng)液。上述標(biāo)記探針例如，如上所述優(yōu)選QProbe (注冊(cè)商標(biāo))。上述標(biāo)記探針，例如，可以在含有分離的基因組DNA的試樣中添力卩，也可以在溶劑中與基因組DNA混合。上述溶劑沒(méi)有特別限制，例如，可舉出Tris-HCl等的緩沖液、含KC1、MgCl2、MgS04、甘油等的溶劑，PCR用的反應(yīng)液等的核酸擴(kuò)增用反應(yīng)液等，以往公知的溶劑。上述標(biāo)記探針的添加的時(shí)機(jī)沒(méi)有特別限制，例如，可在核酸擴(kuò)增反應(yīng)之前、中途或之后添加。其中，例如，由于不必為了上述標(biāo)記探針的添加而將上述反應(yīng)液露出于外部環(huán)境，而且能連續(xù)進(jìn)行上述核酸擴(kuò)增反應(yīng)和信號(hào)值的測(cè)定，因此優(yōu)選在上述核酸擴(kuò)增反應(yīng)前在上述反應(yīng)液中添加。這時(shí)，上述標(biāo)記探針，如上所述，優(yōu)選其3’末端被標(biāo)記物質(zhì)或磷酸基修飾。接著，將分離的基因組DNA作為模板，在上述標(biāo)記探針的存在下，通過(guò)PCR等的核酸擴(kuò)增法，使含有檢測(cè)目標(biāo)多態(tài)性的檢測(cè)對(duì)象序列擴(kuò)增。以下，作為核酸擴(kuò)增法舉出PCR為例進(jìn)行說(shuō)明，但是本發(fā)明不限于此。另外，PCR的條件沒(méi)有特別限制，可通過(guò)以往公知的方法進(jìn)行。具體而言，對(duì)含有上述基因組DNA、上述標(biāo)記探針和上述引物的上述反應(yīng)液進(jìn)行 PCR0上述反應(yīng)液的組成沒(méi)有特別限制，本領(lǐng)域人員可以適當(dāng)設(shè)定。上述反應(yīng)液，例如，除了含有上述基因組DNA、上述標(biāo)記探針和上述引物以外，還可以含有DNA聚合酶等聚合酶、核苷三磷酸、緩沖液、各種催化劑等。上述反應(yīng)液中的上述標(biāo)記探針和上述引物的添加比例沒(méi)有特別限制，例如，可分別舉出前述的范圍。上述DNA聚合酶沒(méi)有特別限制，例如，可使用來(lái)自以往公知的耐熱性細(xì)菌的聚合酶。作為具體例，例如，在商業(yè)上可購(gòu)得來(lái)自Itam aauaticus的DNA聚合酶(美國(guó)專利第 4，889，818 號(hào)和第 5，079, 352 號(hào))(商品名 Taq 聚合酶)、來(lái)自 Hiermus thermophilus 的 DNA 聚合酶(W0 91/09950) (rTth DNA polymerase)、來(lái)自 Pyrococcus furiosus 的 DNA 聚合酶 (W0 92/9689) (Pfu DNA polymerase StrataRenes公司制)、來(lái)自 Hiermococcus Iitoralis 的聚合酶(EP-A 455 430(商標(biāo)Vent) =New England Biolabs公司制)等，其中，優(yōu)選來(lái)自 Thermus aquaticus的耐熱性聚合酶。上述反應(yīng)液中的DNA聚合酶的添加比例沒(méi)有特別限制，例如為1 100U/mL，優(yōu)選5 50U/mL，更優(yōu)選20 40U/mL。對(duì)于DNA聚合酶的活性單位(U)，通常以將活化鮭魚精DNA作為模板引物，在活性測(cè)定用反應(yīng)液中，在74°C、30分鐘將IOnmol的全核苷酸處理為酸不溶性沉淀物的活性為1U。上述活性測(cè)定用反應(yīng)液的組成例如為25mmol/L TAPS buffer (pH9. 3, 25°C ) >50mmol/L KCl,2mmol/L MgCl2、lmmol/L巰基乙醇、200 μ mol/L dATP、 200 μ mol/L dGTP、200 μ mol/L dTTPUOO μ mol/L" α -32P，，dCTP、0. 25mg/mL活化鮭魚精DNA。上述核苷三磷酸通?？膳e出dNTP (dATP、dCTP、dGTP和dTTP或dUTP)。上述反應(yīng)液中的dNTP的添加比例沒(méi)有特別限制，例如為0. 01 lmmol/L，優(yōu)選為0. 05 0. 5mmol/ L,更優(yōu)選為0. 1 0. 3mmol/L0上述緩沖液例如可舉出！"ris-HCl、！"ricine、MES、MOPS、HEPES、CAPS等，可使用市售的PCR用緩沖液和市售的PCR試劑盒的緩沖液等。上述反應(yīng)液還可以含有肝素、甜菜堿、KC1、MgCl2, MgSO4、甘油等、，它們的添加比例，可以在例如不損害PCR反應(yīng)的范圍內(nèi)設(shè)定。上述反應(yīng)液的總體積沒(méi)有特別限制，例如，根據(jù)熱循環(huán)等所使用的機(jī)器等可以適當(dāng)設(shè)定，但是通常為1 500 μ L，優(yōu)選為10 100 μ L0接著，進(jìn)行PCR。上述PCR的循環(huán)條件沒(méi)有特別限定。作為具體例，例如，(1)作為被檢核酸的雙鏈DNA解離為單鏈DNA，(2)引物退火為上述單鏈DNA，(3)上述引物基于聚合酶反應(yīng)而延伸，分別可例示下述表1的條件。PCR的循環(huán)數(shù)沒(méi)有特別限制，將下述(1) (3)的3步作為1個(gè)循環(huán)，例如，優(yōu)選為30個(gè)循環(huán)以上。上述循環(huán)數(shù)的合計(jì)的上限沒(méi)有特別限制，例如，100個(gè)循環(huán)以下，優(yōu)選70個(gè)循環(huán)以下，進(jìn)一步優(yōu)選50個(gè)循環(huán)以下。各步的溫度變化，例如，可使用熱循環(huán)等自動(dòng)進(jìn)行控制。表 權(quán)利要求
1.一種EGFR基因的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其特征在于，含有下述(Pl)的寡核苷酸和 (P2)的寡核苷酸中的至少一者，(Pl)寡核苷酸，其由堿基長(zhǎng)度為22 50堿基長(zhǎng)度、與含有序列編號(hào)1中的堿基序號(hào) 334 355的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成，并且在3’末端區(qū)域具有與所述堿基序號(hào)334 的堿基互補(bǔ)的堿基，(P2)寡核苷酸，其由與所述(Pl)的寡核苷酸互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成。
2.如權(quán)利要求1所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中，所述(Pl)的寡核苷酸在從3’末端起數(shù)第1 4位的位置具有與所述堿基序號(hào)334的堿基互補(bǔ)的堿基。
3.如權(quán)利要求1所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中，所述(Pl)的寡核苷酸為由序列編號(hào)2、序列編號(hào)15、序列編號(hào)16和序列編號(hào)17中的任一者所示的堿基序列構(gòu)成的寡核苷酸，tgagctgcrtgatgaggtgcac ( ·歹ΟΙ 2)、 tgagctgcrtgatgaggtgcacg( j^^lJISij 15)、 tgagctgcrtgatgaggtgcacgg ( ·歹ΟΙ 16)、 tgagctgcrtgatgaggtgcacggt ( ·歹ΟΙ 17)。
4.如權(quán)利要求1所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中， 所述探針為具有熒光標(biāo)記物質(zhì)的標(biāo)記探針。
5.如權(quán)利要求4所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中，所述(Pl)的寡核苷酸在3’末端區(qū)域具有所述熒光標(biāo)記物質(zhì)，所述(P》的寡核苷酸在 5’末端區(qū)域具有所述熒光標(biāo)記物質(zhì)。
6.如權(quán)利要求4所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中，所述(Pl)的寡核苷酸在從3’末端起數(shù)第1 4位的堿基的位置處具有所述熒光標(biāo)記物質(zhì)，所述(P》的寡核苷酸在從5’末端起數(shù)第1 4位的堿基的位置處具有所述熒光標(biāo)記物質(zhì)。
7.如權(quán)利要求4所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中，所述(Pl)的寡核苷酸在與所述堿基序號(hào)334的堿基互補(bǔ)的堿基上具有所述熒光標(biāo)記物質(zhì)，所述(P》的寡核苷酸在序列編號(hào)1中的堿基序號(hào)334的堿基上具有所述熒光標(biāo)記物質(zhì)。
8.如權(quán)利要求1所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其中， 所述多態(tài)性檢測(cè)用探針為Tm分析用的探針。
9.一種EGFR基因的多態(tài)性檢測(cè)方法，其特征在于，包括使用權(quán)利要求1所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針，檢測(cè)EGFR基因的多態(tài)性的步驟。
10.如權(quán)利要求9所述的多態(tài)性檢測(cè)方法，其包括下述(A)步驟和(B)步驟，(A)改變含有被檢核酸和權(quán)利要求1所述的多態(tài)性檢測(cè)用探針的反應(yīng)體系的溫度，測(cè)定顯示所述被檢核酸和所述多態(tài)性檢測(cè)用探針的雜交體的熔解狀態(tài)的信號(hào)值的步驟；(B)由伴隨所述溫度變化的所述信號(hào)值的變動(dòng)，確定所述被檢核酸中的所述多態(tài)性的步驟。
11.如權(quán)利要求10所述的多態(tài)性檢測(cè)方法，其中，在所述(A)步驟中，所述被檢核酸是由模板核酸形成的擴(kuò)增物。
12.如權(quán)利要求11所述的多態(tài)性檢測(cè)方法， 還包括由所述模板核酸生成核酸擴(kuò)增物的步驟。
13.如權(quán)利要求12所述的多態(tài)性檢測(cè)方法，其中，所述(A)步驟還包括在所述多態(tài)性檢測(cè)用探針的存在下，在反應(yīng)體系中由所述模板核酸生成所述核酸擴(kuò)增物的步驟，且使所述生成步驟中的所述反應(yīng)體系的溫度變化，進(jìn)行所述信號(hào)值的測(cè)定。
全文摘要
本發(fā)明提供一種能簡(jiǎn)便且可靠性優(yōu)良地判別EGFR基因的多態(tài)性的多態(tài)性檢測(cè)用探針以及使用其的多態(tài)性檢測(cè)方法。本發(fā)明的多態(tài)性檢測(cè)用探針是EGFR基因的多態(tài)性檢測(cè)用探針，其特征在于，含有下述(P1)的寡核苷酸和(P2)的寡核苷酸的至少一者。(P1)寡核苷酸，其由堿基長(zhǎng)度為22～50堿基長(zhǎng)度、與含有序列編號(hào)1中的堿基序號(hào)334～355的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成，在3’末端區(qū)域具有與上述堿基序號(hào)334的堿基互補(bǔ)的堿基，(P2)寡核苷酸，其由與上述(P1)的寡核苷酸互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成。
文檔編號(hào)C12N15/09GK102597271SQ20108004973
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2010年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月30日
發(fā)明者伊集院萌子 申請(qǐng)人:愛(ài)科來(lái)株式會(huì)社