專利名稱：使用化學(xué)品的游離重編程的制作方法
使用化學(xué)品的游離重編程
背景技術(shù)：
本申請(qǐng)要求2009年11月4日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/258，120的優(yōu)先權(quán)權(quán)益， 其全部?jī)?nèi)容通過引用方式并入本文。1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總體上涉及干細(xì)胞發(fā)育的領(lǐng)域。更具體地，其涉及多能干細(xì)胞的產(chǎn)生。2.相關(guān)領(lǐng)域描述人胚胎干(ES)細(xì)胞的無限增殖能力和多能潛力已經(jīng)提供了對(duì)于人體的所有細(xì)胞類型的空前的可獲得性。具有需要的遺傳背景的、直接源自患者體細(xì)胞的人誘導(dǎo)的多能干 (iPS)細(xì)胞具有人ES細(xì)胞的這兩項(xiàng)重要特性，這使得這些細(xì)胞成為疾病模型、藥物篩選、毒性測(cè)試和移植治療的優(yōu)良候選物。最初的人iPS細(xì)胞的衍生利用了基因組整合型逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體以遞送重編程轉(zhuǎn)基因(Lowry等人，2008;Park等人，2008 ； Takahashi 等人，2007; Yu等人，2007)。此類載體可能產(chǎn)生插入突變和殘余轉(zhuǎn)基因表達(dá)，插入突變會(huì)干擾人iPS細(xì)胞及其衍生物的正常功能，殘余轉(zhuǎn)基因表達(dá)會(huì)影響向特定譜系的分化( 等人，2007)，或甚至導(dǎo)致腫瘤形成(Okita等人，2007)。已經(jīng)使用重復(fù)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染從小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(Okita等人，2008)、使用非整合型腺病毒載體從小鼠肝細(xì)胞和人成纖維細(xì)胞(Stadtfeld等人，2008 Jhou and Freed, 2009)、使用附連的(piggyback)轉(zhuǎn)座子從體細(xì)胞(Woltjen等人，2009)、使用基于 oriP/ΕΒΝΑ-Ι的游離載體從人成纖維細(xì)胞(Yu等人，2009)和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)衍生了不含異源遺傳元件的iPS細(xì)胞。雖然有這些迅速的進(jìn)展，但是仍然存在大的障礙，阻止了產(chǎn)生高質(zhì)量的不含異源遺傳元件的人iPS細(xì)胞的任何單一技術(shù)的廣泛應(yīng)用。例如，所有目前的允許產(chǎn)生不含異源遺傳元件的人iPS細(xì)胞的技術(shù)(除了附連的轉(zhuǎn)位子方法以外)都具有非常低的重編程效率。這種低效率使得難以從多種可容易獲得的人類體細(xì)胞類型持續(xù)獲得、以及從具有不同遺傳背景和供體年齡的細(xì)胞持續(xù)獲得iPS細(xì)胞。附連的轉(zhuǎn)位子方法提供了適宜的重編程效率。然而，當(dāng)涉及很多供體細(xì)胞系時(shí)，從iPS細(xì)胞中除掉轉(zhuǎn)位子會(huì)是相當(dāng)費(fèi)力的。此外，雖然人iPS細(xì)胞與人ES細(xì)胞有高度相似性，但是，在人iPS細(xì)胞的基因表達(dá) /表觀遺傳學(xué)修飾和譜系特異性分化潛力上存在顯著的克隆與克隆間的差異。特別地，與人 ES細(xì)胞相比，多數(shù)人iPS細(xì)胞顯示出顯著較低的神經(jīng)分化潛力，并且對(duì)于LIF (白血病抑制因子)無應(yīng)答，LIF常規(guī)地支持小鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)。此外，由于缺乏針對(duì)高質(zhì)量人iPS細(xì)胞的良好的容易檢驗(yàn)的標(biāo)志物，高質(zhì)量的人iPS細(xì)胞克隆的選擇可能是費(fèi)時(shí)費(fèi)力的。人類體細(xì)胞遺傳重編程為誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPSC)可以提供用于移植治療的可更新的細(xì)胞來源。為了實(shí)現(xiàn)它們的前途，理想的是，在不含飼養(yǎng)細(xì)胞、不含異源DNA(無印跡)的化學(xué)上確定的培養(yǎng)基中衍生并培養(yǎng)人iPSC。目前，沒有用于產(chǎn)生無印跡的人iPSC的簡(jiǎn)單和有效的無飼養(yǎng)物的非病毒方法。之前的通過使用游離載體遞送轉(zhuǎn)基因而產(chǎn)生無印跡的人iPSC的嘗試是低效率的，并且需要飼養(yǎng)細(xì)胞。因此，需要解決在制備基本上不含異源遺傳成分的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞時(shí)的效率低下的問題或其它問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的方面通過提供用于制備基本上不含異源載體元件的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的新方法而客服了本領(lǐng)域中的主要缺陷，并由此提供了 iPS細(xì)胞應(yīng)用上的特別優(yōu)點(diǎn)。另外，使用小分子，本發(fā)明的某些示例性方面大大改進(jìn)了游離重編程效率(>70 倍；如果使用轉(zhuǎn)化缺陷型MYC例如LMYC，則>300倍)，并使用化學(xué)上確定的培養(yǎng)基建立了無飼養(yǎng)物的重編程條件，用于衍生無印跡的人iPSC。這些改進(jìn)使得能夠從皮膚成纖維細(xì)胞以及很多其它細(xì)胞類型常規(guī)衍生無痕跡的人iPSC，因此使得該技術(shù)容易地適用于臨床級(jí)別的人iPSC的生產(chǎn)。因此，在第一個(gè)實(shí)施方式中，提供了包含iPS細(xì)胞的群體和培養(yǎng)基的組合物，所述 iPS細(xì)胞基本上不含異源逆轉(zhuǎn)錄病毒元件，所述培養(yǎng)基包含外部添加的信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑。在一些方面，這些iPS細(xì)胞可以實(shí)質(zhì)上不含，或優(yōu)選地，基本上不含異源載體或遺傳元件。例如，這些iPS細(xì)胞可以衍生自一種或多種人類細(xì)胞。在另一個(gè)方面，該群體的細(xì)胞可以包含選擇的人類個(gè)體例如人類患者的基因組。在一些方面，所述人類細(xì)胞是原代人類細(xì)胞，其是從活體人類受試者直接獲得的細(xì)胞，并且可以排除建立的或永生化的細(xì)胞系的使用。一些實(shí)施方式可以包括使用末端分化的人類細(xì)胞。原代人類細(xì)胞的非限制性實(shí)例包括成纖維細(xì)胞、角化細(xì)胞、造血細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、消化道細(xì)胞、卵丘細(xì)胞、腺細(xì)胞或胰島細(xì)胞。更具體地，原代人類細(xì)胞可以是造血祖細(xì)胞，例如 CD34+細(xì)胞。原代人類細(xì)胞可以獲自血液樣品、毛發(fā)樣品、皮膚樣品或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何來源。所述信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑可以是選自下列的一種或多種糖原合酶激酶3(GSK_3)抑制劑，有絲分裂原激活的蛋白激酶激酶(MEK)抑制劑，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGF-β)受體抑制劑，白血病抑制因子(LIF)，以及它們的組合。特別地，所述組合物包含細(xì)胞群體和下列的組合GSK-3抑制劑、MEK抑制劑、TGF-β受體抑制劑和可選地LIF。所述培養(yǎng)基可以進(jìn)一步包含外部添加的ROCK抑制劑或肌球蛋白II抑制劑。所述ROCK抑制劑可以是ΗΑ-100。所述培養(yǎng)基可以進(jìn)一步包含外部添加的FGF。在一些方面，所述組合物可以進(jìn)一步包含化學(xué)上確定的培養(yǎng)基?；瘜W(xué)上確定的培養(yǎng)基的非限制性實(shí)例包括^TeSR培養(yǎng)基、人胚胎細(xì)胞培養(yǎng)基、Ν2Β27培養(yǎng)基以及它們的衍生物。所述組合物還可以包含基質(zhì)成分以替代飼養(yǎng)細(xì)胞，以支持細(xì)胞群體的培養(yǎng)。用于細(xì)胞粘附的基質(zhì)成分可以是任何用于使干細(xì)胞或飼養(yǎng)細(xì)胞(如果使用)附著的物質(zhì)。基質(zhì)成分的非限制性實(shí)例包括膠原、明膠、聚-L-賴氨酸、聚-D-賴氨酸、玻連蛋白、層粘連蛋白和纖連蛋白以及它們的混合物，例如，Matrigel 和裂解的細(xì)胞膜制劑。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生iPS細(xì)胞群體的方法，包括a)獲得包含表達(dá)一種或多種重編程因子的染色體外遺傳元件的體細(xì)胞；和b)在重編程條件下培養(yǎng)所述體細(xì)胞和/或其子代細(xì)胞，所述重編程條件包括外部添加的一種或多種信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑，例如GSK-3抑制劑、MEK抑制劑、和/或TGF- β受體抑制劑，從而產(chǎn)生iPS細(xì)胞的群體。 在一些方面，重編程培養(yǎng)基可以包含下列的組合631(-3抑制劑、1^1(抑制劑36 -0受體抑制劑和可選地LIF。
在其它方面，重編程條件可以基本上不含飼養(yǎng)細(xì)胞，例如經(jīng)輻射的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)飼養(yǎng)細(xì)胞。重編程條件可以包括基質(zhì)成分，例如Matrigel 。所述體細(xì)胞可以是人類細(xì)胞或原代細(xì)胞，例如原代人細(xì)胞。體細(xì)胞的實(shí)例可以包括但不限于成纖維細(xì)胞、角化細(xì)胞、造血細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、消化道細(xì)胞、卵丘細(xì)胞、腺細(xì)胞、胰島細(xì)胞。造血細(xì)胞可以包括任何血液細(xì)胞，例如造血祖細(xì)胞(例如⑶34+細(xì)胞)、T細(xì)胞、B細(xì)胞， 或它們的組合。在一些方面，所述染色體外遺傳元件可以進(jìn)一步定義為游離載體。例如，游離載體可以包括復(fù)制起始點(diǎn)和一種或多種用于表達(dá)重編程因子的表達(dá)盒。此類一種或多種表達(dá)盒可以進(jìn)一步包含編碼反式作用因子的核苷酸序列，所述反式作用因子結(jié)合至復(fù)制起始點(diǎn)以復(fù)制染色體外的模板。備選地，體細(xì)胞可以表達(dá)此類反式作用因子。染色體外遺傳元件可以是任何遺傳物質(zhì)或核酸，例如DNA或RNA。此類游離載體可以基本上不含細(xì)菌元件。所述細(xì)菌元件可以是質(zhì)粒在細(xì)菌中復(fù)制所需的載體骨架成分，例如細(xì)菌的復(fù)制起始點(diǎn)，例如PUC復(fù)制起始點(diǎn)，和細(xì)菌選擇盒，例如氨比西林選擇盒。在示例性實(shí)施方式中，復(fù)制起始點(diǎn)可以是淋巴營(yíng)養(yǎng)皰疹病毒或Y皰疹病毒、腺病毒、SV40、牛乳頭瘤病毒或酵母的復(fù)制起始點(diǎn)，例如對(duì)應(yīng)于EBV的oriP的淋巴營(yíng)養(yǎng)皰疹病毒或Y皰疹病毒的復(fù)制起始點(diǎn)。在其它方面，淋巴營(yíng)養(yǎng)皰疹病毒可以是EB病毒(EBV)，卡波西氏肉瘤皰疹病毒(KSHV)，松鼠猴皰疹病毒(HS)或馬立克氏病病毒(MDV)。對(duì)于染色體外遺傳元件的復(fù)制和短暫維持，所述反式作用因子可以是對(duì)應(yīng)于EBV 的EBNA-I (EBV核抗原1)的野生型蛋白的多肽或EBV的EBNA-I (EBV核抗原1)的野生型蛋白的衍生物，優(yōu)選是在存在對(duì)應(yīng)于EBV的OriP的復(fù)制起始點(diǎn)的情況下。相對(duì)于野生型 ΕΒΝΑ-1，所述衍生物可以具有降低的從整合的模板激活轉(zhuǎn)錄的能力，并因此具有降低的異位激活染色體基因以引起致癌轉(zhuǎn)化的機(jī)會(huì)。同時(shí)，在衍生物結(jié)合復(fù)制起始點(diǎn)之后，衍生物可以激活至少為對(duì)應(yīng)的野生型蛋白的5%的從染色體外的模板的轉(zhuǎn)錄。對(duì)于體細(xì)胞的重編程，本方法的一些方面可以包括使用重編程因子，所述重編程因子可以包括選自下列的一種或多種Sox, Oct, Nanog, Lin-28, Klf4, c-Myc和SV40LT，例如，“Sox，Oct, Nanog 和可選的 Lin-28"的組，“Sox，Oct, Klf4 和可選的 c-Myc"的組，或這6種因子的組合。在一些方面，為了降低c-Myc表達(dá)帶來的可能的毒性效應(yīng)，可以包括 c-Myc與SV40大T基因(SV40LT)。在一些方面，為了進(jìn)一步改善重編程效率，可以使用轉(zhuǎn)化缺陷型Myc突變體、變體或同源物。非限制性實(shí)例包括Myc原癌基因家族成員，例如 LMYC (ΝΜ_001033081)，在N末端具有41個(gè)氨基酸刪除的MYC (dN2MYC)或在136位氨基酸具有突變的 MYC(W136E) (Nakagawa 等人 2010)。在一些方面，可以在重編程條件下培養(yǎng)細(xì)胞至少或大約1，2，3，4，6，7，8，9，10，11， 12，13，14，15，16，17’ 18，19，20天，或其中的任意范圍，所述重編程條件具有包含如上所述的信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑的重編程培養(yǎng)基。在將染色體外元件導(dǎo)入體細(xì)胞之后，重編程條件可以持續(xù)至少大約1天至5天的時(shí)間段。起始和終止時(shí)間點(diǎn)可以選自導(dǎo)入之后的1，2，3，4，6，7 ,8,9, 10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20天，或其中的任意范圍，例如在遺傳元件轉(zhuǎn)染之后大約1天至15天。
重編程之后，可以將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至具有擴(kuò)增培養(yǎng)基的擴(kuò)增條件。擴(kuò)增培養(yǎng)基可以基本上不含外部添加的GSK-3抑制劑、MEK抑制劑和TGF-β受體抑制劑。在一些方面，擴(kuò)增培養(yǎng)基可以具有一種或多種信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑和/或LIF。在一些方面，通過使用該擴(kuò)增條件， 例如，正常的ES細(xì)胞培養(yǎng)基或TeSR培養(yǎng)基，可以獲得類似于人ES細(xì)胞的人iPS細(xì)胞。在一些方面，所述方法可以進(jìn)一步包括選擇iPS細(xì)胞，例如，基于一種或多種胚胎細(xì)胞特性，例如ES細(xì)胞樣形態(tài)學(xué)。在其它方面，所述方法可以包括在擴(kuò)增培養(yǎng)基中培養(yǎng)所選擇的iPS細(xì)胞。作為另外的優(yōu)點(diǎn)，本文描述的培養(yǎng)條件，例如重編程條件或擴(kuò)增條件，可以基本上不含飼養(yǎng)細(xì)胞。無飼養(yǎng)物的條件可以通過降低來自飼養(yǎng)細(xì)胞的差異性和副作用而改善工業(yè)和治療應(yīng)用。例如，可以使用基質(zhì)成分替代飼養(yǎng)細(xì)胞。為了增加無飼養(yǎng)物條件下的游離重編程，可以向重編程培養(yǎng)基中加入信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑和/或FGF。為了增加多能干細(xì)胞的克隆效率，重編程培養(yǎng)基、第一或第二擴(kuò)增培養(yǎng)基可以進(jìn)一步包含Mio相關(guān)激酶(ROCK)抑制劑或肌球蛋白II抑制劑，例如HA-100或blebbistatin。 為了進(jìn)一步有利于游離重編程和/或增強(qiáng)經(jīng)重編程的細(xì)胞的增殖，在一些方面，可以向重編程培養(yǎng)基中加入成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)。外部添加的FGF或信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑可以是下列數(shù)量至少、大約或至多 0. 1，1，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80 ，90，100，150，200ng/ml,至少、大約或至多 0. 05，0. 1，0. 2，0. 2，0. 3，0. 4，0. 5，0. 6，0. 7，0. 8 ，0.9，1，1.5, 2, 2. 5, 3,4, 5,6, 7,8,9, 10 μ M,或其中的任意范圍，或有效改善游離重編程的任何濃度。在具體的實(shí)施方式中，可以使用高濃度的FGF，例如，大約40至200ng/ml，或更特別地，大約lOOng/ml。在一些方面，重編程培養(yǎng)基或擴(kuò)增培養(yǎng)基可以是化學(xué)上確定的，例如TeSR培養(yǎng)基、人胚胎細(xì)胞培養(yǎng)基或N2B27培養(yǎng)基。在一些方面，重編程培養(yǎng)基可以是基本上不含 TGF β的培養(yǎng)基，例如Ν2Β27培養(yǎng)基。擴(kuò)增培養(yǎng)基可以是TeSR培養(yǎng)基或mTeSR培養(yǎng)基。例如，GSK-3抑制劑可以是CHIR99021 ；MEK抑制劑可以是PD0325901 ；TGF-β受體抑制劑可以是Α-83-01。還可以提供根據(jù)以上方法產(chǎn)生的iPS細(xì)胞的群體。在一些方面，用于本方法的起始細(xì)胞可以包含至少或大約104，IO5, IO6, IO7, IO8, 10 9，IO10, IO11, IO12, IO13個(gè)細(xì)胞或其中的任意范圍。起始細(xì)胞群體可以具有至少或大約10，10 \ IO2, IO3, IO4, IO5, IO6, IO7, IO8個(gè)細(xì)胞/ml或其中任意范圍的接種密度。在本發(fā)明的方法和/或組合物的上下文中討論的實(shí)施方式可以通過其中描述的任何其它方法或組合物實(shí)施。因此，涉及一種方法或組合物的實(shí)施方式也可以適用于本發(fā)明的其它方法和組合物。就核酸而言，如本文使用的術(shù)語“編碼”用于使本發(fā)明容易被技術(shù)人員理解；然而， 這些術(shù)語可以與“包含”相互替代地使用。如本文說明書中所使用的"一種(a)"或"一種(an)"可以意指一種或多種。如本文權(quán)利要求中與詞語“包含”聯(lián)合使用的詞語“一種(a)"或“一種(an)"可以意指一種或一種以上。除非明確指明是僅指?jìng)溥x物或者備選物相互排斥，否則權(quán)利要求中的術(shù)語“或”的使用是意指“和/或”，雖然本公開支持僅指替代和“和/或”的定義。如本文使用的“另一種”可以意指至少第二種或更多種。
在本申請(qǐng)通篇中，術(shù)語“大約”用于指某數(shù)值包括儀器誤差、用于測(cè)定該數(shù)值的方法或存在于研究受試者中的差異的內(nèi)在差異。本發(fā)明的其它客體、特征和優(yōu)點(diǎn)將通過以下詳細(xì)描述而變得明顯。然而，應(yīng)該理解，雖然指明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是詳細(xì)描述和具體實(shí)施方式
僅是通過示例性方式給出，因?yàn)楸景l(fā)明的精神和范圍內(nèi)的多種變化和修飾將對(duì)于閱讀了本詳細(xì)描述的本領(lǐng)域技術(shù)人員變得明顯。


以下附圖構(gòu)成本說明書的一部分，包括了它們是為了進(jìn)一步說明本發(fā)明的一些方面。可以通過參考這些附圖中的一個(gè)或多個(gè)以及本文給出的具體實(shí)施方式
的詳細(xì)描述而更好地理解本發(fā)明。圖1A-1C. #ffl/|、_&_#A碰成塵■禾早。圖IA 游離重編程載體。PEF:真核延伸因子Ia啟動(dòng)子；pCMV:巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子。載體的轉(zhuǎn)基因和其它特征通過不同的顏色來表示，如圖所示。圖IB 化合物的不同組合對(duì)于游離重編程效率的影響。FF培養(yǎng)基人包皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基；CM 先前以經(jīng)輻射的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞條件化的人ES細(xì)胞培養(yǎng)基。以lOOng/ml的終濃度使用bFGF。B:BIX0U94( ΙμΜ) ；P:PD0325901(0. 5μΜ) ； C:CHIR99021 (3 μ Μ) ； Α:Α-83_01 (0· 5 μ Μ)?？偟?Total)堿性磷酸酶陽性的iPS細(xì)胞集落的總數(shù)目；大的(Large)大尺寸的好的未分化的堿性磷酸酶陽性的iPS細(xì)胞集落的數(shù)目。圖IC 在存在化合物的情況下通過游離重編程獲得的良好的 iPS細(xì)胞集落的圖像。左側(cè)亮視野；右側(cè)堿性磷酸酶染色。 圖2A-2B.使用小的化合物改善人包皮成纖維細(xì)胞的游離重編程。圖2A :bFGF和不同組合的化合物對(duì)于游離重編程效率的影響。FF培養(yǎng)基人包皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基；CM 先前以經(jīng)輻射的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞條件化的人ES細(xì)胞培養(yǎng)基。以lOOng/ml的終濃度使用 bFGF。Η:ΗΑ-100(10μΜ) ；Β:ΒΙΧ01294(1 μ Μ) ；P:PD0325901 (0. 5 μ Μ) ；C:CHIR99 021 (3 μ Μ) ；Α:Α-83-01(0. 5μΜ) ；L:hLIF(10ng/ml) 總的(Total):堿性磷酸酶陽性的 iPS 細(xì)胞集落的總數(shù)目；大的(Large)大尺寸的好的未分化的堿性磷酸酶陽性的iPS細(xì)胞集落的數(shù)目。圖2B:對(duì)于游離重編程效率，化合物處理的時(shí)機(jī)選擇。在重編程培養(yǎng)物中使用補(bǔ)充了 bFGF(100ng/ml)禾口 HA-100 (10 μ Μ)的 CM。 圖3A-3D.可以從經(jīng)化合物處理的游離重編程培養(yǎng)物獲得不同的iPS細(xì)胞。圖 3A 在補(bǔ)充了 PD0325901(0. 5 μ M)，CHIR99021(3 μ Μ)，Α-83-01(0. 5 μ Μ)和 hLIF(IOng/ ml)的CM(先前以經(jīng)輻射的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞條件化的人ES細(xì)胞培養(yǎng)基)中培養(yǎng)5天之后，分化的人HlES細(xì)胞(p44)和正常的人ES細(xì)胞樣iPS細(xì)胞(p20，在不存在化學(xué)處理的情況下，通過游離重編程從人包皮成纖維細(xì)胞衍生)的圖像。圖;3B:在存在 PD0325901 (0. 5 μ M)，CHIR99021 (3 μ Μ)和 Α-83-01 (0· 5 μ Μ)的情況下通過游離重編程從 42 歲的成人皮膚活組織衍生的正常的人ES細(xì)胞樣iPS細(xì)胞的亮視野圖像。在挑取集落之前的3天(核轉(zhuǎn)染后第23天)除去化合物。挑取iPS細(xì)胞集落并在補(bǔ)充了 bFGF(100ng/ml)、 不存在化合物的人ES細(xì)胞培養(yǎng)基中的經(jīng)輻射的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)飼養(yǎng)細(xì)胞上擴(kuò)增。圖 3C 在存在 PD0325901 (0. 5 μ M)，CHIR99021 (3 μ Μ)，Α-83-01 (0. 5 μ Μ)禾口 hLIF (IOng/ ml)的情況下，通過游離重編程從人包皮成纖維細(xì)胞衍生的iPS細(xì)胞的中期(piPSC表示部分重編程的iPSC)的亮視野圖像。在重編程培養(yǎng)物中始終存在化合物。挑取PiPS細(xì)胞集落并在補(bǔ)充了 PD0325901(0. 5yM)，CHIR99021(3yM)，A-83-01(0. 5μΜ)和 hLIF(10ng/ml) 的CM中的MEF飼養(yǎng)細(xì)胞上擴(kuò)增。圖3D 在除去化合物之后，來自于在補(bǔ)充了 bFGF(100ng/ ml)人ES細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)的piPS細(xì)胞的花結(jié)簇(rosette cluster)(神經(jīng)分化)的亮視野圖像。圖4A-4B.補(bǔ)充了化合物的確定的培養(yǎng)基中的游離重編稈。圖4A 在存在PD03259 01(0. 5 μ M), CHIR99021 (3 μ Μ)，Α-83-01 (0· 5 μ Μ)禾口 hLIF (10ng/ml)的情況下，不同的培養(yǎng)基對(duì)于游離重編程的影響。FF培養(yǎng)基人包皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基；CM 先前以經(jīng)輻射的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞條件化的人ES細(xì)胞培養(yǎng)基。以lOOng/ml的終濃度使用bFGF。H :ΗΑ-100(10μΜ) ；Β:ΒΙΧ01294(1 μΜ) ；P:PD0325901 (0. 5 μ Μ) ；C:CHIR99021 (3 μ Μ) ；Α:Α-83-01 (0.5 μ Μ) ；L:hLIF(10ng/ml)?？偟?Total)堿性磷酸酶陽性的iPS細(xì)胞集落的總數(shù)目； 大的(Large)大尺寸的好的未分化的堿性磷酸酶陽性的iPS細(xì)胞集落的數(shù)目。圖4B 用于衍生正常人ES細(xì)胞樣iPS細(xì)胞和piPS細(xì)胞的三步重編程方法的略圖。圖5A-5C.使用小分子改善游離重編稈效率。圖5A :PD0325901(P，0. 5yM)，CHIR9 9021 (C, 3 μ Μ), Α-83-01 (Α, 0· 5 μ Μ)，hLIF(L, 1000U/ml)和 ΗΑ-100 (H, 10 μ Μ)對(duì)于游離重編程的影響。圖5Β:用于改善游離重編程的小分子處理的時(shí)間上的要求。將經(jīng)轉(zhuǎn)染的人包皮成纖維細(xì)胞鋪板至MEF飼養(yǎng)細(xì)胞。使用補(bǔ)充了 lOOng/ml bFGF(CM100)和小分子的MEF條件化的人ESC培養(yǎng)基來支持重編程。在轉(zhuǎn)染后第22-23天計(jì)數(shù)堿性磷酸酶陽性的iPSC集落。iPSC集落的數(shù)目是、.33xl06個(gè)輸入細(xì)胞。數(shù)據(jù)表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差(s.e.m.) (n=3)。圖5C:在存在小分子的情況下，新衍生的iPSC的分化(p!3)。當(dāng)挑取并在補(bǔ)充了小分子的人ESC培養(yǎng)基或MEF條件化的人ESC培養(yǎng)基中在MEF飼養(yǎng)細(xì)胞上擴(kuò)增時(shí)，在持續(xù)存在小分子的情況下衍生的iPSC顯示出廣泛分化。在培養(yǎng)基中加入bFGF無效應(yīng)。黑色箭頭 未分化的iPSC集落；白色箭頭分化的集落。比例尺100μπι。圖6A-6D.開發(fā)用于游離重編程的無飼養(yǎng)物的條件。圖6Α =MEF飼養(yǎng)細(xì)胞、 Matrigel 和培養(yǎng)基對(duì)于游離重編程的影響。將經(jīng)轉(zhuǎn)染的人包皮成纖維細(xì)胞(p6)鋪板于接種了 MEF飼養(yǎng)細(xì)胞的或涂覆了 Matrigel 的10-cm培養(yǎng)皿，并使其經(jīng)歷不同的重編程培養(yǎng)條件。在轉(zhuǎn)染后第18-21天計(jì)數(shù)堿性磷酸酶陽性(AP+)集落。AP+集落的數(shù)目是、.33x IO6個(gè)輸入細(xì)胞。數(shù)據(jù)表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差(s. e. m.) (n=3)。N2B27 補(bǔ)充了 N_2和 B-27 的 DMEM/F12 培養(yǎng)基；N2B27-100 補(bǔ)充了 100ng/ml bFGF 的 N2B27 培養(yǎng)基。* 標(biāo)示出了 piPSCs。圖6B 來自測(cè)試2的piPSC集落和來自測(cè)試1、3和4的人ESC樣iPSC集落的亮視野圖像。比例尺100 μ m。圖6C :piPSC克隆1至4(p3)中的0CT4和NANOG的表達(dá)的定量RT-PCR分析?？偟?Total)內(nèi)源性和轉(zhuǎn)基因表達(dá)二者。人HlESC(H1ESC，p32)用作對(duì)照。數(shù)據(jù)表示為平均值士s.e.m. (n=3)。圖6D 使用確定的培養(yǎng)基，以小分子處理對(duì)于無飼養(yǎng)物的游離重編程的時(shí)間上的要求。將經(jīng)轉(zhuǎn)染的人包皮成纖維細(xì)胞(P7)鋪板至涂覆了 Matrigel 的10-cm培養(yǎng)皿。使用補(bǔ)充了 PCALH的N2B27-100培養(yǎng)基來支持重編程，持續(xù)不同的時(shí)間段(階段幻，然后使用mTeSRl進(jìn)行擴(kuò)增。在轉(zhuǎn)染后第22天計(jì)數(shù)堿性磷酸酶陽性的iPSC集落。iPSC集落的數(shù)目是、.33x IO6個(gè)輸入細(xì)胞。數(shù)據(jù)表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差(s. e. m.) (n=3)。圖7A-7F.在無飼養(yǎng)物的條件下使用確定的培養(yǎng)基衍生的iPSC的表征。圖7A 衍生自成人皮膚成纖維細(xì)胞的iPSC的亮視野圖像(iPS(SK46)克隆2)。比例尺100μπι. 圖7Β :iPS(SK46)克隆2(pl7)的G帶染色體分析。圖7C :iPSC中的重編程載體的PCR分析。E:游離DNA;G:基因組DNA;NF:新生兒包皮成纖維細(xì)胞(p5) ； iPSF7克隆1至3:衍生自新生兒包皮成纖維細(xì)胞的iPSC(p26) ；AF:成人皮膚成纖維細(xì)胞(p6) ； iPS(SK46)克隆1 至3:衍生自成人皮膚成纖維細(xì)胞的iPSC(p22)。衍生自人包皮成纖維細(xì)胞的piPSC(p4) 用作對(duì)照。T-0CT4:轉(zhuǎn)基因 0CT4;T-S0X2:轉(zhuǎn)基因 S0X2；T-NAN0G轉(zhuǎn)基因 NANOG ；T-LIN28: 轉(zhuǎn)基因 LIN28; T-c-MYC 轉(zhuǎn)基因 c-MYC ；T1-KLF4:轉(zhuǎn)基因 KLF4(1) ； T2-KLF4:轉(zhuǎn)基因 KLF4 (2) ； T-SV40LT:轉(zhuǎn)基因SV40LT ；0CT4:內(nèi)源性0CT4。對(duì)于所有的引物組，使用32個(gè)PCR 循環(huán)。圖7D :iPSC克隆中的內(nèi)源性0CT4，NANOG, S0X2和LI擬8表達(dá)的定量RT-PCR分析。 數(shù)據(jù)表示為平均值士s. e.m. (n=3)。圖7E :iPSC克隆中的0CT4和NANOG啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)的亞硫酸氫鹽測(cè)序分析?？招膱A圈代表未甲基化的，實(shí)心圓圈代表甲基化的CpG 二核苷酸。圖7F:iPSC(SK46)克隆2的畸胎瘤切片的蘇木精和伊紅染色。從所有的iPSC克隆獲取畸胎瘤。左側(cè)圖板神經(jīng)組織(外胚層)沖間的圖板軟骨(中胚層)；右側(cè)圖板腸上皮(內(nèi)胚層)。比例尺100μπι。 圖8A-8C.不同的游離重編稈載體組合對(duì)于在存在小分子的情況下從不同的體細(xì)胞類型衍牛iPSC的影響。圖8A:使用游離載體重編程人包皮成纖維細(xì)胞。將經(jīng)轉(zhuǎn)染的人包皮成纖維細(xì)胞(HFF，p6)鋪板于涂覆了 Matrigel 的10-cm培養(yǎng)皿中的包皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基中。在轉(zhuǎn)染后第1至第13天，使用補(bǔ)充了 PD0325901 (P, 0. 5 μ Μ), CHIR99021 (C, 3 μ Μ), A -83-01 (A, 0. 5 μ Μ)，hLIF (L, 1000U/ml)和 HA-100 (H, 10 μ Μ) (PCALH)的 Ν2Β27-100 培養(yǎng)基來支持重編程，然后，在轉(zhuǎn)染后第14天至第21天，使用mTeSRl。iPSC集落的數(shù)目是 0. 33xl06 個(gè)輸入細(xì)胞。數(shù)據(jù)表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差(s. e. m.) (n=3)。7F_1 (pEP4E02SCK2MEN2L 禾口 pEP4E02SET2K)；7F-2(pEP4E02SEN2K, pCEP4_M2L 和 pEP4E02SET2K)；5F(pEP4E02SEN2L 和PEP4E02SET2N)。所有的載體圖譜顯示于圖12。圖8B 使用游離載體重編程衍生自脂肪組織的干細(xì)胞(AdSC)。在補(bǔ)充了 IxGlutamax anvitrogen)的 MeseilCllM -XF 培養(yǎng)基(STEMCELL Technologies Inc. , Vancouver, BC, V5Z 1B3, Canada)中在涂覆了人 I 型膠原(60 μ g/10-cm 培養(yǎng)皿，STEMCELL Technologies Inc.)和纖連蛋白(18 μ g/10-cm 培 #M , Invitrogen) ^ 10-cmAdSC(Zenbio, Research Triangle Park，NC)。
將經(jīng)轉(zhuǎn)染的AdSC (p9，Amaxa VPE-1001，使用程序A_3;3)鋪板于涂覆了 Matrigel 的10-cm 培養(yǎng)皿中的AdSC培養(yǎng)基中。在轉(zhuǎn)染后第2至第13天使用補(bǔ)充了 PCALH的N2B27-100培養(yǎng)基來支持重編程，然后在轉(zhuǎn)染后第13天至第21天，使用mTeSRl。iPSC集落的數(shù)目是 ^0. 35xl06個(gè)輸入細(xì)胞。數(shù)據(jù)表示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差(s. e. m.) (n=2)。圖8C 使用游離載體重編程衍生自臍帶血(CB)的⑶34+細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染之前，在涂覆了纖連蛋白的6孔板中在CB⑶34+細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基中培養(yǎng)衍生自CB的⑶；34+細(xì)胞(STEMCELL Technologies hc.)4天，所述CB CD;34+細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基為補(bǔ)充了下列的StemSpan SFEM (STEMCELL Technologies Inc.) :lx ExCyte 培養(yǎng)基補(bǔ)充物(Millipore, Billericgi, ΜΑ)，IxGluta max,250ng/ml SCF(Peprotech, Rocky Hill, NJ)，250ng/ml FLT3L(Peprotech)，IOOng/ ml TPO(Peprotech), 20ng/ml IL-3(Peprotech), 50ng/ml IL-6 (Peprotech)禾口 lOng/ml sIL6-R(Peprotech) ο將經(jīng)轉(zhuǎn)染的CB細(xì)胞(Amaxa VPA-1003，使用程序T-16)鋪板于涂覆了纖連蛋白/Matrigel 的6孔板中的CB⑶34+細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基中。在轉(zhuǎn)染后第2至第11天使用補(bǔ)充了 PCALH的N2B27-100培養(yǎng)基來支持重編程，然后在轉(zhuǎn)染后第11天至第17天， 使用mTeSRl。iPSC集落的數(shù)目是 0. 33xl06個(gè)輸入細(xì)胞(培養(yǎng)4天之后)。數(shù)據(jù)表示為平均值士 標(biāo)準(zhǔn)誤差(s. e. m.) (s. e. m.) (n=3)。圖9.在存在小分子的情況下#用轉(zhuǎn)化缺陷型MYCtimmmmmnm^.使用游離載體組合7F-2來進(jìn)行iPSC衍生。將載體pCEP4-M2L中的c-Myc替換為轉(zhuǎn)化缺陷型MYC LMYC (ΝΜ_001033081)、在N末端具有41個(gè)氨基酸刪除的MYC (dN2MYC)或在136位氨基酸具有突變的MYC(W136E) (Nakagawa等人，2010)。將經(jīng)轉(zhuǎn)染的人包皮成纖維細(xì)胞(HFF，p9)鋪板于涂覆了 Matrigel 的ΙΟ-cm培養(yǎng)皿中的包皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基。在轉(zhuǎn)染后第2天至第 13 天使用補(bǔ)充了 PD0325901 (P, 0. 5 μ M)，CHIR99021 (C, 3 μ Μ)，Α-83-01 (Α, 0. 5 μ Μ)，hLIF (L ，1000U/ml)和HA-100 (H，10 μ M) (PCALH)的Ν2Β27-100培養(yǎng)基來支持重編程，然后在轉(zhuǎn)染后第14至20天使用mTeSRl。iPSC集落的數(shù)目是 0. 33χ106個(gè)輸入細(xì)胞。數(shù)據(jù)顯示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差(s. e. m.) (n=3)。圖10A-10C.開發(fā)用于游離重編稈的無飼養(yǎng)物的條件。圖IOA :piPSCs (p6)中的人 ESC特異性細(xì)胞表面標(biāo)志物(SSEA-3，SSEA-4, Tra-1-60和Tra_l_81)以及成纖維細(xì)胞標(biāo)志物CD44的流式細(xì)胞術(shù)表達(dá)分析。未填充的圖同種型對(duì)照；填充的圖抗原染色。圖IOB 分離自piPSCs (p7)的游離DNA中的重編程載體的PCR分析。泳道1 轉(zhuǎn)基因0CT4 (T-0CT4)；泳道 2:轉(zhuǎn)基因 NANOG(T-NANOG)；泳道 3:轉(zhuǎn)基因 KLF4(1) (T1-KLF4)；泳道 4:轉(zhuǎn)基因 KLF4(2) (T2-KLF4)；泳道 5:轉(zhuǎn)基因 SV40LT (T-SV40LT)；泳道 6:轉(zhuǎn)基因 S0X2 (T-S0X2)；泳道 7:轉(zhuǎn)基因 LI擬8 (T-LIN28)；泳道 8:轉(zhuǎn)基因 c_MYC (T-c-MYC)；泳道 9:內(nèi)源性 0CT4(0CT4)。圖 IOC 以小分子處理對(duì)于無飼養(yǎng)物的游離重編程(使用mTeSRl)的時(shí)間上的要求。將經(jīng)轉(zhuǎn)染的人包皮成纖維細(xì)胞(P7)鋪板于涂覆了 Matrigel 的10-cm培養(yǎng)皿中。使用補(bǔ)充了小分子(PCALH)的mTeSRl來支持重編程，持續(xù)不同的時(shí)間段(階段2)，然后使用不含小分子的 mTeSRl進(jìn)行擴(kuò)增。在轉(zhuǎn)染后第22天計(jì)數(shù)堿性磷酸酶陽性的iPSC集落。iPSC集落的數(shù)目是 0. 33xl06個(gè)輸入細(xì)胞。數(shù)據(jù)表示為平均值士 s. e. m. (n=3)。圖1IA-IIE.使用確定的培養(yǎng)基在無飼養(yǎng)物的條件下衍生的iPSC的表征。圖 IlA 衍生自人包皮成纖維細(xì)胞的iPSC(iPSF7克隆1)的亮視野圖像。比例尺100 μ m。圖 llB:iPSF7克隆1(ρ18)的G帶染色體分析。圖IlC :iPSC克隆中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的RT-PCR 分析。NF:新生兒包皮成纖維細(xì)胞(pO;iPSF7克隆1至3:衍生自新生兒包皮成纖維細(xì)胞的iPSC(p^) ;AF:成人皮膚成纖維細(xì)胞(p6) ;iPS(SK46)克隆1至3:衍生自成人皮膚成纖維細(xì)胞的iPSC(p22)。衍生自人包皮成纖維細(xì)胞的HlESC(p3》和piPSC(p4)用作對(duì)照。T-0CT4 轉(zhuǎn)基因 0CT4 ； T-S0X2 轉(zhuǎn)基因 S0X2 ； T-NANOG 轉(zhuǎn)基因 NANOG ； T-LIN28 轉(zhuǎn)基因 LIN28;T-c-MYC:轉(zhuǎn)基因 c-MYC;T1-KLF4:轉(zhuǎn)基因 KLF4(1) ；T2-KLF4:轉(zhuǎn)基因 KLF4(2) ;T-SV40LT:轉(zhuǎn)基因 SV40LT;0CT4:內(nèi)源性 0CT4；GAPDH內(nèi)源性對(duì)照。除了 T-0CT4 之外(30個(gè)循環(huán))，對(duì)于所有的引物組，使用32個(gè)PCR循環(huán)。圖11D.人ESC特異性細(xì)胞表面標(biāo)志物(SSEA-3，SSEA-4, Tra-1-60和Tra_l_81)和成纖維細(xì)胞富集標(biāo)志物CD44的流式細(xì)胞術(shù)表達(dá)分析。未填充的圖同種型對(duì)照；填充的圖抗原染色。圖IlE :iPSF7克隆1的畸胎瘤切片的蘇木精和伊紅染色。上面的圖板神經(jīng)組織(外胚層)；中間的圖板軟骨(中胚層)；下面的圖板腸上皮(內(nèi)胚層)。比例尺100 μ m。圖12.游離重編稈載體。游離重編稈載體的遺傳成分的詳述。pEF:真核延伸因子
11Ia啟動(dòng)子；pCMV:巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子；IRES2:內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)；SV40pA:猴空泡病毒40多腺苷化信號(hào)；oriP:EBV復(fù)制起始點(diǎn)；EBNA-I :EBV核抗原1 ；Amp:氨比西林細(xì)菌抗性選擇盒；PUC起始點(diǎn)細(xì)菌的復(fù)制起始點(diǎn)；0ct4:octamer4轉(zhuǎn)錄因子；Sox2:Sox2轉(zhuǎn)錄因子；c-Myc:c-Myc轉(zhuǎn)錄因子；Klf4:Kreuppel樣因子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子；SV40LT:SV40大T基因； Nanog: NANOG 轉(zhuǎn)錄因子；LiM8 Lir^8mRNA 結(jié)合蛋白。發(fā)明詳述I.簡(jiǎn)介本發(fā)明部分地基于以下發(fā)現(xiàn)通過在存在GSK-3抑制劑、MEK抑制劑和TGF-β抑制劑的情況下培養(yǎng)重編程的細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑可用于改善游離重編程效率和動(dòng)力學(xué)。雖然已經(jīng)報(bào)道了使用包含MEK抑制劑和TGF-β受體抑制劑的化學(xué)品混合物改善人成纖維細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒重編程(Lin等人，2009)，但是逆轉(zhuǎn)錄病毒(包括慢病毒)重編程與游離重編程是根本上不同的，因?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄病毒載體元件整合進(jìn)入基因組，整合的載體元件持續(xù)轉(zhuǎn)基因表達(dá)。例如，如實(shí)施例中所證明，相對(duì)于存在MEK抑制劑和TGF-β受體抑制劑的情況(相對(duì)于基線僅具有極小的增強(qiáng))，在存在這三種抑制劑的組合的情況下的游離重編程產(chǎn)生了預(yù)料不到的高的重編程效率。相對(duì)于整合進(jìn)入基因組的載體，在本發(fā)明的一些方面中使用游離載體具有數(shù)個(gè)優(yōu)點(diǎn)。第一，其降低了由于隨機(jī)整合進(jìn)入DNA而造成的非相關(guān)表型變化的背景。第二，游離體降低了插入誘變的可能性，插入誘變可能導(dǎo)致腫瘤形成。第三，游離載體的復(fù)制可以導(dǎo)致異源載體元件的逐漸喪失，這為細(xì)胞留下最小化的異源遺傳修飾。然而，低的重編程效率阻礙了游離載體在重編程體細(xì)胞中的應(yīng)用，這可以通過本發(fā)明的一些方面獲得解決。在其它方面，開發(fā)了產(chǎn)生具有改善的工業(yè)和臨床應(yīng)用的iPS細(xì)胞的方法。該方法可以包括使用無飼養(yǎng)物的條件來產(chǎn)生基本上不含異源遺傳元件的iPS細(xì)胞，從而避免了由于異源遺傳元件的持續(xù)性或誘變性效應(yīng)和飼養(yǎng)細(xì)胞的差異性或不想要的效應(yīng)而帶來的問題。以下也描述了用于產(chǎn)生iPS細(xì)胞群體的組合物和方法的其它進(jìn)展。II.定義如本文使用的“原代細(xì)胞”是指從活生物體或其子代直接獲得的、不建立或永生化為細(xì)胞系的細(xì)胞。“人原代細(xì)胞”是指獲自活的人類受試者的原代細(xì)胞?！芭咛ジ?ES)細(xì)胞”是源自早期胚胎的多能干細(xì)胞。ES細(xì)胞最初在1981年建立， 從1989年開始，其已被用于產(chǎn)生敲除小鼠。在1998年，建立了人ES細(xì)胞，其目前正在逐漸用于再生醫(yī)學(xué)。“誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞”，通常簡(jiǎn)寫為iPS細(xì)胞或iPSC，是指從非多能細(xì)胞、通常為成年體細(xì)胞或末端分化的細(xì)胞、例如成纖維細(xì)胞、造血細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)元、上皮細(xì)胞等通過重編程而人工制備的多能干細(xì)胞?！岸嗄苄浴笔侵妇哂蟹只癁闃?gòu)成一種或多種組織或器官或優(yōu)選三個(gè)胚層的任意項(xiàng)的所有細(xì)胞的潛力的干細(xì)胞，所述三個(gè)胚層為內(nèi)胚層(胃內(nèi)壁、胃腸道、肺)、中胚層(肌肉、 骨、血液、泌尿和生殖系統(tǒng))或外胚層(上皮組織和神經(jīng)系統(tǒng))。本文使用的“多能干細(xì)胞”是指能夠分化為衍生自三個(gè)胚層的任意項(xiàng)的細(xì)胞的細(xì)胞，例如，全能細(xì)胞的直接后代、胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)的多能細(xì)胞。
如本文使用的術(shù)語“體細(xì)胞”是指除了生殖細(xì)胞(例如卵、精子等)之外的任意細(xì)胞，其不將其DNA直接傳至下一代。通常而言，體細(xì)胞具有有限的或無多能性。本文使用的體細(xì)胞可以是天然產(chǎn)生的或遺傳修飾的?！爸鼐幊獭笔沁@樣的過程相對(duì)于在相同條件下無重編程而言，其賦予細(xì)胞可測(cè)的增強(qiáng)的形成至少一種新細(xì)胞類型的子代的能力，可以在培養(yǎng)物中或在體內(nèi)。更具體地，重編程是這樣的過程其賦予體細(xì)胞多能潛力。這意味著如果在重編程之前基本上不形成具有新細(xì)胞類型特征性表型的子代的話，在足夠的增殖之后有可測(cè)的比例的此類子代；或者， 具有新細(xì)胞類型特征性表型的比例可測(cè)地大于重編程之前。在一定條件下，具有新細(xì)胞類型特征的子代的比例可以是至少大約0. 05%, 0. 1%, 0. 5%, 1%, 5%, 25%或更高，越高越優(yōu)選。如本文所使用，當(dāng)細(xì)胞具有小于10%的異源遺傳元件或載體元件時(shí)，細(xì)胞為“實(shí)質(zhì)上不含”所述元件；當(dāng)細(xì)胞具有小于1%的異源遺傳元件或載體元件時(shí)，細(xì)胞為“基本上上不含”所述元件。然而，更理想的是這樣的細(xì)胞群體其中小于0. 5%或小于0. 1%的總細(xì)胞群體包含異源遺傳元件或載體元件。當(dāng)介質(zhì)具有低于可檢測(cè)水平(使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的常規(guī)檢測(cè)方法)的某些試劑時(shí)(例如MEK抑制劑、GSK抑制劑、TGF-β受體抑制劑、 LIF)，介質(zhì)“基本上不含”這些試劑。當(dāng)與細(xì)胞或生物體中的蛋白、基因、核酸、多核苷酸、遺傳元件或載體元件相關(guān)聯(lián)使用時(shí)，術(shù)語“異源”是指通過人工或天然方式被導(dǎo)入細(xì)胞或生物體的蛋白、基因、核酸、多核苷酸、遺傳元件或載體元件；或者，與細(xì)胞相關(guān)時(shí)，是指被分離、隨后通過人工或天然方式被導(dǎo)入其它細(xì)胞或?qū)肷矬w的細(xì)胞。異源核酸可以來自不同的生物體或細(xì)胞，或者其可以是天然存在于生物體或細(xì)胞中的核酸的一個(gè)或多個(gè)另外的拷貝。異源細(xì)胞可以來自不同的生物體，或者可以來自相同的生物體。通過非限制性舉例而言，異源核酸在不同于天然細(xì)胞中的染色體位置的位置，或者其兩翼為不同于天然狀態(tài)下的核酸序列。"復(fù)制起始點(diǎn)"("ori")或“復(fù)制起點(diǎn)”是這樣的DNA序列例如，在淋巴營(yíng)養(yǎng)皰疹病毒中，當(dāng)存在于細(xì)胞中的質(zhì)粒中時(shí)，能夠?qū)⑺B接的序列維持在質(zhì)粒中，和/或DNA合成起始的位點(diǎn)處或附近。EBV的ori包括FR序列(30bp重復(fù)序列的20個(gè)不完美拷貝)和優(yōu)選地包括DS序列；然而，EBV中的其它位點(diǎn)結(jié)合EBNA-1，例如R印*序列能夠取代DS，作為復(fù)制起始點(diǎn)(Kirchmaier and Sugden, 1998)。因此，EBV的復(fù)制起始點(diǎn)包括FR, DS或R印* 序列或通過核酸修飾而產(chǎn)生的任何功能等同序列或源自其中的合成組合。例如，本發(fā)明也可以使用EBV的遺傳工程化的復(fù)制起始點(diǎn)，例如通過插入單一元件或單一元件的突變而產(chǎn)生的，如Lindner等人Q008)中所具體描述?！傲馨蜖I(yíng)養(yǎng)”皰疹病毒是在成淋巴細(xì)胞(例如人B成淋巴細(xì)胞)或其它細(xì)胞類型中復(fù)制并在其天然生命周期的至少一部分中在染色體外復(fù)制的皰疹病毒。感染宿主之后，這些病毒通過維持其病毒基因組為質(zhì)粒而潛伏地感染宿主。單純皰疹病毒(HSV)不是“淋巴營(yíng)養(yǎng)”皰疹病毒。示例性的淋巴營(yíng)養(yǎng)皰疹病毒包括但不限于EBV、卡波西氏肉瘤皰疹病毒 (KSHV)，松鼠猴皰疹病毒(HS)和馬立克氏病病毒(MDV)。“載體”或“構(gòu)建體”(有時(shí)稱作基因遞送或基因轉(zhuǎn)移“媒介”)是指包含待向宿主細(xì)胞遞送(體外或體內(nèi))的多核苷酸的大分子或分子復(fù)合物?！百|(zhì)?！笔浅Ｒ姷妮d體類型，其是與染色體DNA分離的染色體外DNA分子，其能夠獨(dú)立于染色體DNA而復(fù)制。在一些情況下，其是環(huán)形的和雙鏈的。
如本文使用的“模板”是包含復(fù)制起始點(diǎn)的DNA或RNA分子?！罢系哪０濉笔欠€(wěn)定維持在細(xì)胞基因組中的模板，例如整合進(jìn)入該細(xì)胞的染色體?！叭旧w外模板”是穩(wěn)定維持在細(xì)胞內(nèi)但是不整合進(jìn)入染色體的模板?！氨磉_(dá)構(gòu)建體”或“表達(dá)盒”意指能夠指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的核酸分子。表達(dá)構(gòu)建體至少包括啟動(dòng)子或功能上等同于啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)。還可以包括另外的元件，例如增強(qiáng)子，和/或轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。核酸分子可以是DNA或RNA。術(shù)語“對(duì)應(yīng)于”在本文中意指多核苷酸序列對(duì)于參考多核酸序列的全部或一部分而言是同源的(即，是相同的，非嚴(yán)格的進(jìn)化上相關(guān))，或者，多肽序列與參考多肽序列是相同的。與此不同，術(shù)語“互補(bǔ)于”在本文中用于指互補(bǔ)序列對(duì)于參考多核酸序列的全部或一部分而言是互補(bǔ)的。舉例而言，核苷酸序列"TATAC"對(duì)應(yīng)于參考序列"TATAC"，互補(bǔ)于參考序列 〃GTATA〃。Ill.iPS 細(xì)胞誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞，通常簡(jiǎn)寫為iPS細(xì)胞或iPSC，是一類從非多能細(xì)胞、通常為成年體細(xì)胞人工衍生而來的多能干細(xì)胞。相信誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞與天然多能干細(xì)胞、例如胚胎干細(xì)胞在很多方面(例如表達(dá)某些干細(xì)胞基因和蛋白，染色質(zhì)甲基化模式，倍增時(shí)間、類胚體形成、畸胎瘤形成、活的嵌合體形成和潛能(potency)和分化力)是類似的(如果不完全相同的話)，但是它們與天然多能干細(xì)胞的關(guān)系的完全程度仍待測(cè)定。從除了胚胎來源之外的人類組織衍生誘導(dǎo)的干細(xì)胞是令人期望的，以便緩解涉及胚胎和胚胎組織的實(shí)驗(yàn)性使用的倫理學(xué)問題。已經(jīng)提出了從誘導(dǎo)的多能細(xì)胞進(jìn)行治療性應(yīng)用的前景。醫(yī)學(xué)應(yīng)用包括治療阿爾茨海默病，糖尿病和脊髓損失(略舉幾例)。其它應(yīng)用包括疾病模擬和藥物篩選。IPS細(xì)胞首先是于2006年從小鼠細(xì)胞(Takahashi等人，2006)以及在2007年從人類細(xì)胞(Takahashi等人，2007;Yu等人，2007)產(chǎn)生的。這被認(rèn)為是干細(xì)胞研究上的重大進(jìn)展，因?yàn)槠淇稍试S研究人員獲得多能干細(xì)胞，其對(duì)于研究具有重要意義，并且潛在地具有治療應(yīng)用，無需有爭(zhēng)議地使用胚胎。從小鼠或人類組織首次成功證明產(chǎn)生誘導(dǎo)的干細(xì)胞 (iPS細(xì)胞)涉及使用表達(dá)特定組的轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。James Thomson和Siinya Yamanaka的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的研究已經(jīng)證明通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將特定的轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入小鼠或人成纖維細(xì)胞足以重編程那些細(xì)胞為未分化的多能干細(xì)胞。Thomson使用的因子包括 0ct4，Sox2，Nanog 和 LiM8。Yamanaka 使用的因子包括 0ct4, Sox2, Klf4 和 c_Myc。通過任一基因組合進(jìn)行的重編程都是通過整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組并表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子而實(shí)現(xiàn)的。 0ct4和Sox2似乎是重編程必需的轉(zhuǎn)錄因子。重編程的效率是低下的，頻率為起始細(xì)胞群體的 0. 01% - 0. 02%。為了改進(jìn)目前的重編程方法，在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，公開了通過下列方式重編程體細(xì)胞的方法使用染色體外遺傳元件將重編程因子導(dǎo)入體細(xì)胞中，然后在包含一種或多種如上所述的信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑的重編程培養(yǎng)基中培養(yǎng)。這些細(xì)胞的潛能在多個(gè)方面可以與胚胎干細(xì)胞相同，如下文所述，但是基本上不含異源遺傳元件。最初的胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)是衍生自胚泡(早期胚胎)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的多能干細(xì)胞。ES細(xì)胞通過兩個(gè)獨(dú)特特征加以區(qū)分它們的多能性和它們的無限自我更新能力。ES 細(xì)胞是多能細(xì)胞，即，它們能夠分化為三個(gè)原始胚層即外胚層、內(nèi)胚層和中胚層的所有衍生物。另外，在確定的條件下，胚胎干細(xì)胞能夠無限繁殖自身。這允許胚胎干細(xì)胞被用作研究和再生醫(yī)學(xué)的有用工具，因?yàn)樗鼈兡軌虍a(chǎn)生無限數(shù)目的自身以用于持續(xù)研究或臨床應(yīng)用。然而，在小鼠與人類ES細(xì)胞之間存在顯著差異。當(dāng)被James Thomson發(fā)現(xiàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)人類ES細(xì)胞與小鼠ES細(xì)胞在潛能和培養(yǎng)條件上是不同的，尤其是，對(duì)于LIF(培養(yǎng)小鼠 ES細(xì)胞所需的要素)完全無應(yīng)答，這是由人類ES細(xì)胞中的失活的白血病抑制因子途徑造成的?，F(xiàn)有的人類IPS細(xì)胞在這些方面類似于人類ES細(xì)胞，因此，它們可被稱作人類ES細(xì)胞樣iPS細(xì)胞。IV.用于重編程的染色體外遺傳元件已經(jīng)使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體通過異位表達(dá)重編程基因而實(shí)現(xiàn)了從人類體細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒例如莫洛尼鼠白血病病毒具有以穩(wěn)定方式整合進(jìn)入宿主基因組的能力。它們包含逆轉(zhuǎn)錄酶，允許整合進(jìn)入宿主基因組。慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的亞類。由于它們整合進(jìn)入非分裂細(xì)胞以及分裂細(xì)胞的基因組的能力，使它們廣泛適合用作載體。當(dāng)病毒進(jìn)入細(xì)胞時(shí)，RNA形式的病毒基因組被逆轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生DNA，然后DNA通過病毒整合酶被插入基因組的隨機(jī)位置。因此，目前的成功重編程技術(shù)依賴于基于整合的病毒方法。然而，使用目前的技術(shù)，靶向整合仍然不是常規(guī)的(Bode等人，2000)，慣常的備選方式，隨機(jī)整合，可能在誘導(dǎo)的干細(xì)胞中導(dǎo)致插入誘變，其具有不可預(yù)測(cè)的后果。由于相同的原因，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)不能被控制，因?yàn)槠湟蕾囉谡衔稽c(diǎn)的染色質(zhì)環(huán)境(Baer等人，2000)。只能在有利的基因座實(shí)現(xiàn)高水平表達(dá)，但是存在以下危險(xiǎn)整合進(jìn)入高表達(dá)位點(diǎn)會(huì)干擾誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的生死攸關(guān)的細(xì)胞功能。此外，越來越多的證據(jù)表明存在針對(duì)外源DNA的細(xì)胞防御機(jī)制，其通過伴隨DNA甲基化的過程下調(diào)轉(zhuǎn)基因而發(fā)揮作用(Bingham，1997，Garrick等人，1998)。此外，病毒成分可能與其它因子一起作用以轉(zhuǎn)化細(xì)胞。伴隨著從多個(gè)病毒基因的持續(xù)表達(dá)，至少部分病毒基因組在細(xì)胞中的持續(xù)存在可能引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化。這些基因可能干擾細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)途徑， 導(dǎo)致所觀察到的細(xì)胞的表型變化，產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其顯示出增加的細(xì)胞分裂，這對(duì)于病毒是有利的。因此，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明開發(fā)了用于產(chǎn)生基本上不含異源遺傳元件、例如來自之前方法中所使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體的元件的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的新方法。本發(fā)明的這些方法利用了染色體外復(fù)制載體，或能夠游離復(fù)制的載體(見美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?12/478，154，通過引用方式并入本文)，并聯(lián)合在存在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑的情況下培養(yǎng)重編程的細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)最佳的重編程效率和動(dòng)力學(xué)。有多種DNA病毒，例如腺病毒、猴空泡病毒40(SV40)、牛乳頭瘤病毒(BPV)或包含出芽酵母ARS(自主復(fù)制序列)的質(zhì)粒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中染色體外復(fù)制。這些游離質(zhì)粒內(nèi)在地不具有與整合載體相關(guān)的所有這些缺點(diǎn)(Bode等人，2001)。基于淋巴營(yíng)養(yǎng)皰疹病毒 (包括EB病毒(EBV))的系統(tǒng)也可在染色體外復(fù)制并輔助遞送重編程基因至體細(xì)胞。例如，用于本發(fā)明中的基于游離載體的方法利用了基于EBV元件的系統(tǒng)的成功復(fù)制和維持所必需的有力元件，而不破壞該系統(tǒng)在臨床環(huán)境下的易處理性，如下文所詳述。有用的EBV元件是OriP和EBNA-I，或它們的變體或功能等同物。該系統(tǒng)的額外優(yōu)點(diǎn)是這些異源元件在被導(dǎo)入細(xì)胞之后將隨著時(shí)間喪失，產(chǎn)生自我持續(xù)的基本上不含這些元件的iPS細(xì)胞。A. EB 病毒EB病毒(EBV)，也被稱作人類皰疹病毒4 (HHV-4)，是皰疹病毒家族(包括單純皰疹病毒和巨細(xì)胞病毒)的病毒，是人類中最常見的病毒之一。EBV維持其基因組在染色體外并與宿主細(xì)胞機(jī)構(gòu)合作進(jìn)行有效復(fù)制和維持(Lindner and Sugden，2007)，在細(xì)胞分裂過程中僅依賴兩個(gè)必不可少的特征以進(jìn)行其復(fù)制和在細(xì)胞內(nèi)的保留(Yates等人1985; Yates等人1984)。一個(gè)元件通常被稱作oriP，以順式存在并擔(dān)當(dāng)復(fù)制起始點(diǎn)。另一個(gè)因子EBNA-1， 通過結(jié)合oriP內(nèi)的序列而以反式發(fā)揮作用，以促進(jìn)質(zhì)粒DNA的復(fù)制和維持。作為非限制性實(shí)例，本發(fā)明的一些方面利用了這兩個(gè)特征并在載體的環(huán)境下使用它們，以運(yùn)送重編程體細(xì)胞必需的基因，以促進(jìn)這些基因的復(fù)制和持續(xù)表達(dá)(相對(duì)于常規(guī)質(zhì)粒)。B.復(fù)制起始點(diǎn)在一些方面，可以使用EBV的復(fù)制起始點(diǎn)OriP。OriP是DNA復(fù)制起始處或其附近的位點(diǎn)，通常由間隔大約1000堿基對(duì)的兩個(gè)順式作用序列組成它們被稱作重復(fù)家族(FR) 和二重對(duì)稱(DS)。FR由21個(gè)不完美拷貝的30bp重復(fù)序列組成，并包含20個(gè)高親和性的EBNA-I 結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)FR與EBNA-I結(jié)合時(shí)，其同時(shí)作為啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子(以順式，相距至多 IOkb)(Reisman and Sugden, 1986；Yates, 1988；Sugden and Warren, 1989；Wysokenski and Yates, 1989; Gahn and Sugden, 1995; Kennedy and Sugden，2003; Altmann 等人，2006)并促成細(xì)胞核保持和包含F(xiàn)R的質(zhì)粒的可靠的維持(Langle-Rouault等人，1998 ； Kirchmaier and Sugden, 1995; Wang 等人，2006 ； Nanbo and Sugden, 2007)。oriP 質(zhì)粒的有效分裂也可能歸因于FR。雖然病毒已經(jīng)進(jìn)化為在FR中維持20個(gè)EBNA-I結(jié)合位點(diǎn)，但是有效的質(zhì)粒維持僅需要這些位點(diǎn)中的7個(gè)，并且可以被3個(gè)拷貝的DS的聚合物(總共具有12個(gè)EBNA-I 結(jié)合位點(diǎn))重構(gòu)(Wysokenski and Yates, 1989)。二重對(duì)稱元件(此)對(duì)于在存在EBNA-I的情況下啟動(dòng)DNA合成是足夠的(Aiyar等人，1998; Yates等人，2000)，啟動(dòng)發(fā)生于DS處或其附近(Gahn and Schildkraut, 1989 ；Niller等人，1995)。認(rèn)為病毒DNA合成的終止發(fā)生于FR處，因?yàn)楫?dāng) FR被EBNA-I結(jié)合時(shí)，其發(fā)揮復(fù)制叉屏障的作用，如通過2D凝膠電泳所觀察到的(Gahn and Schildkraut, 1989 ；Ermakova 等人，1996 ； Wang 等人，2006)。從 DS 的 DNA 合成起始被限定為每個(gè)細(xì)胞周期一次(Adams，1987; Yates and Guan, 1991)，并且被細(xì)胞復(fù)制系統(tǒng)的成分調(diào)控(Chaudhuri 等人，2001 ； Ritzi 等人，2003 ； Dhar 等人，2001 ； Schepers 等人，2001 ； Zhou 等人，2005 ； Julien等人，2004)。DS包含4個(gè)EBNA-I結(jié)合位點(diǎn)，雖然比FR中發(fā)現(xiàn)的那些親和性低(Reisman等人，1985)。DS的拓?fù)鋵W(xué)為4個(gè)結(jié)合位點(diǎn)安排為2對(duì)位點(diǎn)，每對(duì)之間有 21bp中心至中心的間隔，2個(gè)非配對(duì)內(nèi)部結(jié)合位點(diǎn)之間有33bp的中心至中心的間隔(Baer 等人，1984;Rawlins 等人，1985)。已經(jīng)通過研究EBV基因組的另一區(qū)域(被稱作Itep*)而確認(rèn)了 DS內(nèi)的元件的功能性作用，R印*被鑒定為可無效率地替代DS的元件(Kirchmaier and Sugden, 1998)。使R印* 聚合8次產(chǎn)生在支持復(fù)制上如DS —樣有效的元件(Wang等人，2006)。R印*的生物化學(xué)解剖鑒定了一對(duì)EBNA-I結(jié)合位點(diǎn)，具有21bp的中心至中心間隔，這對(duì)于其復(fù)制功能具有關(guān)鍵意義(參考文獻(xiàn)同上)。發(fā)現(xiàn)R印*的最小復(fù)制子是這對(duì)EBNA-I結(jié)合位點(diǎn)，因?yàn)榧词箤⒕酆衔镏兴械膬梢硇蛄刑鎿Q為衍生自λ噬菌體的序列之后仍然保持復(fù)制功能。DS與R印*的對(duì)比已經(jīng)揭示了共同的機(jī)理這些復(fù)制子通過募集細(xì)胞復(fù)制機(jī)構(gòu)(經(jīng)由一對(duì)適當(dāng)間隔的位點(diǎn)，被EBNA-I彎曲和結(jié)合)而支持DNA合成的起始。還有其它的染色體外的、得到許可的在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)復(fù)制而與EBV無關(guān)的質(zhì)粒，在一些方面表現(xiàn)得與EBV的Raji株系內(nèi)的起始區(qū)域相似。Hans Lipps及其同事已經(jīng)開發(fā)并研究了包含“細(xì)胞核支架/基質(zhì)附著區(qū)域”(S/MAR)和有力的轉(zhuǎn)錄單元的質(zhì)粒 (Piechaczek等人，1999; Jenke等人，2004)。它們的S/MAR源自人類干擾素β基因，富含 Α/Τ，并通過其與細(xì)胞核基質(zhì)的結(jié)合及其在低離子強(qiáng)度下或包埋在超螺旋DNA中時(shí)的優(yōu)先解開而被操作地定義(Bode等人，1992)。這些質(zhì)粒半保留地復(fù)制，結(jié)合ORC蛋白，并有效地隨機(jī)地貫穿它們的DNA支持DNA合成的起始(khaarschmidt等人，2004)。它們被有效維持于增殖的倉鼠和人類細(xì)胞中，無需藥物選擇，當(dāng)被導(dǎo)入豬胚胎時(shí)，能夠支持GFP在動(dòng)物胎兒的多數(shù)組織中的表達(dá)(Manzini等人，2006)。C.反式作用因子反式作用因子的具體實(shí)例可以是EB細(xì)胞核抗原1 (EBNA-I)，其是DNA結(jié)合蛋白，與 oriP的FR和DS或R印*結(jié)合，以促進(jìn)每次細(xì)胞分裂時(shí)基于EBV的載體的復(fù)制和可靠分裂至子代細(xì)胞，獨(dú)立于細(xì)胞染色體，但與其相協(xié)調(diào)。已經(jīng)通過突變和缺失分析將EBNA-I的641個(gè)氨基酸(AA)歸組為與其不同功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)域。AA40-89之間的區(qū)域和AA329-378之間的區(qū)域能夠以順式或反式連接2個(gè)DNA元件(當(dāng)與EBNA-I結(jié)合時(shí))，因此被稱作連接區(qū)1和2(LR1，LR2) (Middleton and Sugden, 1992 ；Frappier and 0'Donnell, 1991 ； Su 等人，1991 ;Mackey 等人，1995)。 將EBNA-I的這些結(jié)構(gòu)域與GFP融合會(huì)使GFP歸巢至有絲分裂的染色體(Marechal等人，1999;Kanda等人，2001)。LRl和LR2對(duì)于復(fù)制是功能上冗余的；任一個(gè)的刪除產(chǎn)生能夠支持 DNA 復(fù)制的 EBNA-I 的衍生物(Mackey and Sugden, 1999; Sears 等人，2004)。LRl 和LR2富含精氨酸和甘氨酸殘基，并類似于與富含A/T的DNA結(jié)合的AT鉤基序(AT_hook motif) (Aravind and Landsman, 1998)，(Sears 等人，2004)。EBNA-I 的 LRl 和 LR2 的體外分析已經(jīng)證明了它們與富含A/T的DNA結(jié)合的能力Gears等人，2004)。當(dāng)LRl (包含一個(gè)此類AT鉤)與EBNA-I的DNA結(jié)合和二聚化結(jié)構(gòu)域融合時(shí)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)于oriP質(zhì)粒的DNA復(fù)制是足夠的，雖然不如野生型EBNA-I效率高(參考文獻(xiàn)同上)。但是LRl和LR2確有不同。LRl的C末端的一半由除了 N末端的一半的重復(fù)的Arg-Gly之外的氨基酸組成，被稱作獨(dú)特區(qū)域1 (URl)。URl對(duì)于EBNA-I從轉(zhuǎn)染和整合的報(bào)告子DNA(包含F(xiàn)R)有效激活轉(zhuǎn)錄是必需的(Wu等人，2002;Kennedy and Sugden, 2003; Altmann等人，2006)。URl對(duì)于被EBV感染的B細(xì)胞的有效轉(zhuǎn)化也是必需的。 當(dāng)缺少該結(jié)構(gòu)域的EBNA-I衍生物替代完整病毒環(huán)境下的野生型蛋白時(shí)，這些衍生病毒具有0. 1%的野生型病毒的轉(zhuǎn)化能力(Altmarm等人，2006)。LR2 對(duì)于 EBNA-I 支持 oirP 復(fù)制不是必需的(Shire 等人，1999 ； Mackey and Sugden, 1999 Jears等人，2004)。另外，EBNA-I的N末端的一半可以被包含AT鉤基序的細(xì)胞蛋白替代，例如HMGAla，并且仍然保持復(fù)制功能(Hung等人，2001 ； kars等人，2003; Altmann等人，2006)。這些發(fā)現(xiàn)表明LR1和LR2的AT鉤活性可能是人類細(xì)胞中 oriP的維持所必需的。
EBNA-I第三結(jié)構(gòu)域(AA91 - 328)由甘氨酸-甘氨酸-丙氨酸(GGA)的重復(fù)序列組成，參與EBNA-I的規(guī)避宿主免疫應(yīng)答的能力，其是通過抑制蛋白體降解和呈現(xiàn) (Levitskaya等人，1995 ； Levitskaya等人，1997)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些重復(fù)序列在體外和體內(nèi)抑制EBNA-I的翻譯(Yin等人，2003)。然而，該結(jié)構(gòu)域的大部分的刪除對(duì)于EBNA-I在細(xì)胞培養(yǎng)中的功能無明顯影響，這使得該結(jié)構(gòu)域的功能難以被闡釋。AA379 - 386編碼細(xì)胞核定位信號(hào)(NLS)，其也與細(xì)胞核輸入機(jī)構(gòu)相關(guān)(Kim等人，1997;Fischer等人，1997)。由于它們的高度堿性含量，LRl和LR2的富含Arg-Gly的區(qū)域內(nèi)的序列也可以作為NLS發(fā)揮作用。最后，C末端(AA458 - 607)編碼EBNA-I的重疊的DNA結(jié)合和二聚化結(jié)構(gòu)域。已經(jīng)通過X-射線晶體學(xué)揭示了與DNA結(jié)合的這些結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其類似于乳頭瘤病毒的 E2蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Hegde等人，1992 ； Kim等人，2000 ； Bochkarev等人，1996)。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，重編程載體將包含oriP和編碼能支持質(zhì)粒復(fù)制及其在細(xì)胞分裂過程中的正確維持的EBNA-I的形式的簡(jiǎn)短序列。野生型EBNA-I的氨基末端1/3內(nèi)的高度重復(fù)序列和被證明在多種細(xì)胞中具有毒性的25個(gè)氨基酸的區(qū)域的刪除對(duì)于EBNA-I的與oriP相關(guān)的反式作用功能是可有可無的(Yates等人1985;Kennedy等人 2003)。因此，簡(jiǎn)短形式的EBNA-I (其被稱作Δ URl)可與oriP—起用于一個(gè)實(shí)施方式中的基于游離載體的系統(tǒng)。在一些方面，可用于本發(fā)明中的EBNA-I的衍生物是這樣的多肽相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型多肽，其具有修飾的氨基酸序列。所述修飾包括刪除、插入或替換對(duì)應(yīng)于EBNA-I的 LRl (大約40至大約89位的殘基)的獨(dú)特區(qū)域(大約65至大約89的殘基)的區(qū)域中的至少一個(gè)氨基酸殘基，并且可以包括刪除、插入和/或替換對(duì)應(yīng)于EBNA-I的其它殘基的區(qū)域[例如大約1位至大約40位的殘基，大約90位至大約3 位的殘基(〃Gly-Gly-Ala〃重復(fù)區(qū)域)，大約3 至大約377位的殘基(LR2)，大約379至大約386位的殘基(NLS)，大約 451至大約608位的殘基(DNA結(jié)合和二聚化)或大約609至大約641位的殘基]中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，只要得到的衍生物具有所需的性質(zhì)，例如使包含對(duì)應(yīng)于oriP的ori的 DNA 二聚化并與之結(jié)合，定位于細(xì)胞核，無毒性，從染色體外激活轉(zhuǎn)錄但不從整合的模板實(shí)質(zhì)上激活轉(zhuǎn)錄。D.無殘余的特征重要的是，基于oriP的游離載體的復(fù)制和維持是不完美的，并且在其被導(dǎo)入細(xì)胞的頭2周內(nèi)從細(xì)胞急劇地喪失(每次細(xì)胞分裂25%)；然而，保留質(zhì)粒的那些細(xì)胞喪失較慢 (每次細(xì)胞分裂 3%) (Leight and Sugden, 2001; Nanbo and Sugden, 2007)。一旦對(duì)于攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞的選擇被除掉，質(zhì)粒將在每次細(xì)胞分裂中喪失，直至它們隨著時(shí)間全部被消除， 在得到的子代細(xì)胞中不留下其之前存在的痕跡。本發(fā)明的一些方面利用了基于oriP的系統(tǒng)的這種無痕跡特征，作為目前的與病毒相關(guān)的方法的替代，以遞送基因以產(chǎn)生iPS細(xì)胞。 其它的染色體外載體也將在宿主細(xì)胞復(fù)制和繁殖過程中喪失，也可用于本發(fā)明。E.重編程因子用于誘導(dǎo)的基因?qū)τ趇PS細(xì)胞的產(chǎn)生具有關(guān)鍵意義。以下因子或其組合可用于本發(fā)明公開的載體系統(tǒng)中。在一些方面，重編程載體中將包括編碼Sox和Oct (優(yōu)選0ct3/4) 的核酸。例如，重編程載體可以包含編碼Sox2、0ct4、Nanog和任選Lin-觀的表達(dá)盒，或編碼SoX2、0ct4、Klf4和任選c-myc的表達(dá)盒。編碼這些重編程因子的核酸可以包含在同一表達(dá)盒中、不同表達(dá)盒中、同一重編程載體中，或不同重編程載體中。0ct-3/4和Sox基因家族的一些成員(Soxl、Sox2、Sox3和Soxl5)已經(jīng)被鑒定為參與誘導(dǎo)過程的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，其缺失會(huì)使誘導(dǎo)不能進(jìn)行。另一方面，另外的基因，包括Klf家族的一些成員(Klfl、Klf2、Klf4和Klf5)、Myc家族的一些成員(C-myc、L-myc和 N-myc)、Nanog和LIN28已經(jīng)被鑒定為增強(qiáng)誘導(dǎo)效率。0ct-3/4(Pou5fl)是八聚合體(octamer，"Oct")家族轉(zhuǎn)錄因子之一，在維持多能性方面具有關(guān)鍵作用。Oct-3/4+細(xì)胞例如卵裂球和胚胎干細(xì)胞中Oct-3/4的缺失會(huì)導(dǎo)致自發(fā)的滋養(yǎng)層分化，因此Oct-3/4的存在產(chǎn)生胚胎干細(xì)胞的多能性和分化潛力。"Oct"家族中的多個(gè)其它基因，包括Oct-3/4的近親Octl和0ct6，不能引發(fā)誘導(dǎo)。與Oct-3/4類似，Sox基因家族與維持多能性相關(guān)，雖然其與多潛能 (multipotent)和單能干細(xì)胞相關(guān)，而Oct-3/4與此相反，0ct-3/4專有性地在多能干細(xì)胞中表達(dá)。雖然Sox2是用于誘導(dǎo)的最初基因(Takahashi等人(2006)，^fernig等人Q007)和 Yu等人O007))，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Sox家族中的其它基因也在誘導(dǎo)過程中同樣起作用。Soxl 以類似于Sox2的效率產(chǎn)生iPS細(xì)胞，基因Sox3、Soxl5和Soxl8也產(chǎn)生iPS細(xì)胞，雖然效率較低。Nanog是在未分化的胚胎干細(xì)胞的自我更新中具有關(guān)鍵意義的轉(zhuǎn)錄因子。在人類中，該蛋白由NANOG基因編碼。Nanog是胚胎干細(xì)胞(ESC)中表達(dá)的基因，被認(rèn)為是維持多能性的關(guān)鍵因子。NANOG被認(rèn)為與其它因子例如0ct4(P0U5Fl)和Sox2協(xié)調(diào)發(fā)揮作用以建立ESC的身份。LIN28是一種mRNA結(jié)合蛋白，其在胚胎干細(xì)胞和胚胎癌細(xì)胞中表達(dá)，與分化和增殖相關(guān)。Yu等人Q007)證明其是產(chǎn)生iPS的一個(gè)因子，雖然其不是必需的。Klf基因家族的Klf4最初由Takahashi等人^)06)鑒定，并由^fernig等人 (2007)確認(rèn)為用于產(chǎn)生小鼠iPS細(xì)胞的因子，并由Takahashi等人Q007)證明是用于產(chǎn)生人類iPS細(xì)胞的因子。然而，Yu等人Q007)報(bào)道Klf4對(duì)于人類iPS細(xì)胞的產(chǎn)生不是必需的。發(fā)現(xiàn)Klf2和Klf4是能夠產(chǎn)生iPS細(xì)胞的因子，相關(guān)的基因Klfl和Klf5同樣也是，雖然效率較低。Myc基因家族是牽涉于癌癥的原癌基因。Takahashi等人Q006)和^fernig等人 (2007)證明c-myc是牽涉于小鼠iPS細(xì)胞之產(chǎn)生中的因子，Yamanaka等人證明其是牽涉于人類iPS細(xì)胞之產(chǎn)生中因子。然而，Yu等人(2007)和Takahashi等人(2007)報(bào)道c-myc 對(duì)于產(chǎn)生人類iPS細(xì)胞不是必需的。將"myc"基因家族用于誘導(dǎo)iPS細(xì)胞對(duì)于iPS細(xì)胞最終作為臨床治療具有麻煩，因?yàn)?5%的移植了 c-myc誘導(dǎo)的iPS細(xì)胞的小鼠產(chǎn)生致命性畸胎瘤。N-myc和L-myc已經(jīng)被鑒定為以類似的效率誘導(dǎo)功能性(替代c-myc)。在一些方面， 可以使用Myc突變體、變體、同源物或衍生物，例如具有減少的細(xì)胞轉(zhuǎn)化的突變體。其實(shí)例包括LMYC (ΝΜ_001033081)，在N末端刪除了 41個(gè)氨基酸的MYC(dN2MYC)或在136位氨基酸具有突變的MYC (例如，W136E)。V.細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑在本發(fā)明的一些方面，在至少一部分重編程過程中，可以在存在一種或多種信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑的情況下維持細(xì)胞，所述抑制劑抑制信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)中的信號(hào)傳導(dǎo)子，例如，在MEK抑制劑、GSK3抑制劑、TGF- β受體抑制劑、MEK抑制劑和GSK3抑制劑二者、GSK3抑制劑和TGF-β受體抑制劑二者、MEK抑制劑和TGF-β受體抑制劑二者、這三種抑制劑的組合， 或這些相同途徑內(nèi)的其它信號(hào)傳導(dǎo)子的抑制劑的存在下維持細(xì)胞。在一些方面，ROCK抑制劑、例如ΗΑ-100或肌球蛋白II抑制劑、例如blelAistatin，可用于促進(jìn)重編程的細(xì)胞和得到的iPS細(xì)胞的克隆擴(kuò)增。高濃度的FGF與特定重編程培養(yǎng)基、例如條件化的人ES細(xì)胞培養(yǎng)基或化學(xué)上確定的培養(yǎng)基例如無血清的確定的N2B27培養(yǎng)基的組合也可用于增大重編程效率。在一些實(shí)施方式中，除了通過染色體外遺傳元件向細(xì)胞中導(dǎo)入一種或多種重編程因子(例如2、3或更多種，如本文所描述)之外，以包含下列的重編程培養(yǎng)基處理細(xì)胞MEK 抑制劑、TGF-β受體抑制劑、GSK3抑制劑和可選的LIF，其優(yōu)點(diǎn)在于，例如，改善重編程效率和動(dòng)力學(xué)，促進(jìn)原代重編程培養(yǎng)物中iPS細(xì)胞的鑒定，從而保持iPS細(xì)胞的克隆形成能力 (clonality)0應(yīng)理解，在這些方面和實(shí)施方式中，可以視需要以其它信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑(其抑制相同信號(hào)傳導(dǎo)途徑(例如ERKl或ERK2級(jí)聯(lián))的信號(hào)傳導(dǎo)組分)替換MEK抑制劑。這可以包括抑制MAHi途徑的上游刺激劑，特別是通過FGF受體(Ying，2008)。同樣，可以視需要替換GSK3抑制劑為GSK3相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑(例如胰島素合成和Wnt/ β -連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo))的其它抑制劑；可以視需要替換LIF為Stat3或gpl30信號(hào)傳導(dǎo)的其它激活子?？梢砸灾辽倩虼蠹s0. 02，0. 05，0. 1，0. 2，0. 5，1，2，3，4，5，10，15，20，25，30，35，40， 45，50，100, 150，200, 500至大約1000 μ M的有效濃度或其中任意范圍的濃度使用此類信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑，例如MEK抑制劑、GSK3抑制劑、TGF- β受體抑制劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過常規(guī)方式或從常規(guī)來源提供或獲得抑制劑(另見 W02007113505)。Α.糖原合酶激酶3抑制劑糖原合酶激酶3(GSK-;3)是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其介導(dǎo)將磷酸分子添加至特定細(xì)胞底物中的某些絲氨酸和蘇氨酸氨基酸上。通過GSK-3進(jìn)行的這些其它蛋白的磷酸化通常會(huì)抑制靶蛋白(也稱作“底物”)。如所提及的，已知GSK-3磷酸化糖原合酶并因此使其滅活。其還被指參與控制針對(duì)受損DNA的細(xì)胞應(yīng)答和Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。GSK-3還在 Hedgehog(Hh)途徑中使Ci磷酸化，將其靶向蛋白水解為無活性的形式。除了糖原合酶之外，GSK-3具有很多其它底物。然而，GSK-3在激酶中與眾不同之處在于，其通常需要“引發(fā)激酶”(priming kinase)以首先使底物磷酸化。GSK-3磷酸化的后果通常是抑制底物。例如，當(dāng)GSK-3使其另一底物，轉(zhuǎn)錄因子的 NFAT家族，磷酸化時(shí)，這些轉(zhuǎn)錄因子不能轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，因此被抑制。除了其在Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的重要作用以外(這對(duì)于在發(fā)育過程中建立組織式樣是必需的)，GSK-3對(duì)于在諸如骨骼肌肥大環(huán)境中被誘導(dǎo)的蛋白的合成也是關(guān)鍵性的。其作為NFAT激酶的作用也使其成為分化和細(xì)胞增殖的重要調(diào)節(jié)者。GSK3抑制可以指一種或多種GSK3酶的抑制。GSK3酶家族是熟知的，已經(jīng)描述了多個(gè)變體(見，例如khaffer等人，2003)。在具體的實(shí)施方式中，GSK3-β被抑制。GSK3-α 抑制劑也是合適的，在一些方面，用于本發(fā)明的抑制劑抑制GSK3-ci和GSK3-i3 二者。GSK3的抑制劑可以包括結(jié)合GSK3的抗體，GSK3的顯性陰性變體，靶向GSK3的
20siRNA和反義核酸。GSK3抑制劑的實(shí)例描述于Bennett等人Q002)和Ring等人(2003)。GSK3抑制劑的具體實(shí)例包括但不限于:Kenpaullone, 1-Azakenpaul lone, CH IR99021, CHIR98014, AR-A014418 (見，例如，Gould 等人，2004)，CT 99021(見，例如， Wagman, 2004)，CT 20026 (見，Wagman,見上文)，SB415286, SB216763 (見，例如，Martin 等人，2005)，AR-AO14418 (見，例如，Noble 等人，2005)，鋰(見，例如，Gould 等人，2003)，SB 415286 (見，例如，F(xiàn)rame等人，2001)和TDZD-8 (見，例如，Chin等人，2005)。另外的示例性的GSK3抑制劑可從Calbiochem獲得(見，例如，Dalton等人，W02008/094597， 通過引用方式并入本文)，包括但不限于ΒΙ0(2，Ζ, 3，￡)-6-Bromomdirubm-3'-肟 (GSK3抑制劑IX) ； BIO-丙酮肟(2’ Z, 3’ E) -6-溴代靛玉紅_3’ -丙酮肟(GSK3抑制劑 X) ； (5-甲基-IH-吡唑-3-基)-苯基喹唑啉-4-基)胺(GSK3-抑制劑XIII)；吡啶卡巴唑-環(huán)戊二烯釕復(fù)合物(GSK3抑制劑XV) ;TDZD-84-芐基-2-甲基-1，2，4-噻二唑-3，5-二酮(GSK3i3抑制劑I);2-硫代(3-碘芐基)-5-(1-吡啶基)-[1，3，4]-噁二唑(GSK3 β抑制劑II) ； OTDZT 2，4- 二苯基-5-氧代噻二唑_3_硫酮(GSK3 β抑制劑 III) ； α-4-二溴乙酰苯(GSK3 β 抑制劑 VII) ； AR-AO 14418Ν-(4-甲氧基芐基)-N，-(5-硝基-1，3-噻唑-2-基)脲(GSK-3i3抑制劑VIII) ； 3-(1-(3-羥基苯基)_1Η_吡咯并 [2，3-b]吡啶-3-基]-4-吡嗪-2-基-吡咯-2，5- 二酮(GSK-3 β 抑制劑 XI) ； TffSl 19 吡咯并嘧啶化合物(GSK3 β抑制劑XII) ； L803H-KEAPP APPQSpP_NH2或其豆蔻?；问?GSK3 β抑制劑XIII) ； 2-氯-1- (4，5- 二溴-噻吩-2-基)-乙酮(GSK3 β抑制劑 VI)；AR-A0144-18;SB216763;和 SB415286。GSK3抑制劑能夠激活例如Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑。很多β-連環(huán)蛋白下游基因共調(diào)節(jié)多能性基因網(wǎng)絡(luò)。例如，GSK抑制劑激活cMyc表達(dá)并增強(qiáng)其蛋白穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性。 因此，在一些實(shí)施方式中，GSK3抑制劑可用于刺激細(xì)胞中的內(nèi)源性Myc多肽的表達(dá)，從而消除誘導(dǎo)多能性對(duì)于Myc表達(dá)的需求。另外，已經(jīng)表征了 GSK3_i3的活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)，并鑒定了與特異性和非特異性抑制劑相互作用的關(guān)鍵殘基(Bertrand等人，200 。這種結(jié)構(gòu)表征允許容易地鑒定另外的 GSK抑制劑。本文使用的抑制劑優(yōu)選為特異于所靶向的激酶。某些實(shí)施方式的抑制劑特異于 GSK3-β和GSK3-a，基本上不抑制erk2，基本上不抑制cdc2。優(yōu)選地，相對(duì)于小鼠erk2和 /或人cdc2，所述抑制劑對(duì)于人GSK3具有至少100倍、更優(yōu)選至少200倍、非常優(yōu)選至少 400倍的選擇性(通過IC5tl值的比例測(cè)定)；此處，提及GSK3IC5(I值是指對(duì)于人GSK3-i3和 GSK3- α的平均值。已經(jīng)使用CHIR99021獲得了良好的結(jié)果，其特異于GSK3。使用CHIR99021 的合適的濃度是0. 01至100、優(yōu)選0. 1至20、更優(yōu)選0. 3至10 μ M。B. MEK 抑制劑MEK抑制劑，包括有絲分裂原激活的蛋白激酶激酶(MAPK/ERK激酶或MEK)或其相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)途徑例如MAI3K級(jí)聯(lián)的抑制劑，可用于本發(fā)明的一些方面。有絲分裂原激活的蛋白激酶激酶(sic)是這樣的激酶其使有絲分裂原激活的蛋白激酶磷酸化。其也被稱作 ΜΑΡ^(。細(xì)胞外刺激物導(dǎo)致MAP激酶通過信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)("MAH(級(jí)聯(lián)“)被激活，所述級(jí)聯(lián)由下列組成MAP激酶、MAP激酶激酶(MEK，MKK, MEKK,或MAP2K)和MAP激酶激酶激酶(MKKK 或 MAPI)。
本文中的MEK抑制劑一般是指MEK的抑制劑。因此，MEK抑制劑是指蛋白激酶的 MEK家族的成員(包括MEK1、MEK2和MEK5)的任意抑制劑。還提及了 MEK1、MEK2和MEK5 抑制劑。適宜的MEK抑制劑的本領(lǐng)域已知的實(shí)例包括MEK1抑制劑PD184352和PD98059， MEKl和MEK2的抑制劑UO126和SL327,以及如Davies等人(2000)中所討論。特別地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PD184352和PD0325901與其它已知的MEK抑制劑相比，具有高度的特異性和效力(Bain等人，2007)。其它的MEK抑制劑和MEK抑制劑的類別描述于^iang 等人Q000)。MEK的抑制劑可以包括MEK的抗體、MEK的顯性陰性變體，抑制MEK表達(dá)的siRNA 和反義核酸。MEK抑制劑的具體實(shí)例包括但不限于PD0325901(見，例如，Rinehart等人，2004)，PD98059 (可以獲自例如 Cell Signaling Technology)，U0126 (可以獲自例如 Cell Signaling ^Technology)，SL327 (可以獲自例如 Sigma-Aldricti)，ARRY-162 (可以獲自例如 Array Biopharma)，PD184161 (見，例如，Klein 等人，2006)，PD184352 (CI-1040) (見，例如，Mattingly 等人，2006)，sunitinib (見，例如，Voss,等人，US2008004287, 通過引用方式并入本文)，sorafenib(見，Voss,見上文)，Vandetanib (見，Voss見上文)，pazopanib (見，例如，Voss，見上文)，Axitinib (見，Voss 見上文)和 PTK787 (見，Voss， 見上文)。目前，有幾種MEK抑制劑正進(jìn)行臨床試驗(yàn)評(píng)估。CI-1040已進(jìn)行了針對(duì)癌癥的臨床I期和II期評(píng)估(見，例如Rinehart等人，2004)。處于臨床試驗(yàn)評(píng)估的其它MEK抑制劑抑制劑包括PD 184352 (見，例如English等人，2002)，BAY 43-9006 (見，例如Chow等人，2001),PD-325901 (也叫 PD0325901)，GSKl 120212，ARRY-438162, RDEAl 19，AZD6244 (也叫 ARRY-1^886 或 ARRY-886)，R05126766, XL518 和 AZD8330 (也叫 ARRY-704)?？梢允褂肦NA介導(dǎo)的干擾(RNAi)方便地實(shí)現(xiàn)MEK的抑制。通常而言，將互補(bǔ)于全部或部分MEK基因的雙鏈RNA分子導(dǎo)入多能細(xì)胞，從而促進(jìn)編碼MEK的mRNA分子的特異性降解。這種轉(zhuǎn)錄后機(jī)制導(dǎo)致所靶向的MEK基因的減少的表達(dá)或表達(dá)被消除。使用RNAi實(shí)現(xiàn)MEK抑制的適當(dāng)?shù)募夹g(shù)和程序是已知的。用于鑒定激酶抑制劑、包括GSK3抑制劑和MEK抑制劑的多種測(cè)定法是已知的。例如，Davies等人Q000)描述了這樣的激酶測(cè)定法其中將激酶在存在肽底物和放射標(biāo)記的 ATP的情況下溫育。激酶引起的底物磷酸化導(dǎo)致標(biāo)記物被摻入底物。每個(gè)反應(yīng)的等份被固定于磷酸纖維素紙上并在磷酸中洗滌以除掉游離的ATP。然后測(cè)定溫育之后的底物活性并提供激酶活性的指示?？梢允褂么祟悳y(cè)定法容易地確定在存在和不存在候選激酶抑制劑的情況下的相對(duì)激酶活性。Downey等人(1996)也描述了用于激酶活性的測(cè)定法，其可用于鑒定激酶抑制劑。C. TGF-β受體抑制劑TGF-β受體抑制劑可以包括一般性的TGF信號(hào)傳導(dǎo)的任何抑制劑或特異于 TGF- β受體(例如ALK5)的抑制劑，其可以包括TGF- β受體(例如ALK5)的抗體、 TGF-β受體的顯性陰性變體，和抑制TGF-β受體表達(dá)的siRNA和反義核酸。示例性的 TGF β受體/ALK5抑制劑包括但不限于:SB431542(見，例如，Inman等人，2002)，A-83-01， 也被稱作3- (6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4- (4-喹啉基)-IH-吡唑-1-硫代甲酰胺(見，例如，Tojo等人，2005，可從例如Toicris Bioscience通過商業(yè)途徑獲得);2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1Η-吡唑-4-基)-1, 5-萘啶,Wnt3a/BI0(見，例如，Dalton，等人，W02008/094597，通過引用方式并入本文)，BMP4 (見，Dalton，見上文)，GW788388 (- (4-[3-(吡啶-2-基)-IH-吡唑-4-基]吡啶-2-基} -N-(四氫-2H-吡喃-4-基)苯甲酰胺)(見，例如，Gellibert等人，2006)，SM16 (見，例如，Suzuki等人，2007)，IN-1130 (3- ((5- (6-甲基吡啶 _2_ 基)_4_ (喹噁啉-6-基)-IH-咪唑-2-基) 甲基)苯甲酰胺)(見，例如，Kim等人，2008)，GW6604 (2-苯基-4- (3-吡啶-2-基-IH-吡唑-4-基)吡啶)(見，例如，de Gouville 等人，2006)，SB-505124 (2-(5-苯并[1，3] 二噁-5-基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶鹽酸)(見，例如，DaCosta等人，2004) 和嘧啶衍生物(見，例如，Stiefl等人，W02008/006583中列舉的那些，通過引用方式并入本文)。另外，雖然"ALK5抑制劑“不是意在包括非特異性激酶抑制劑，但是"ALK5抑制劑 “應(yīng)理解為包括除了 ALK5之外，還抑制ALK4和/或ALK7的抑制劑，例如SB-431542 (見， 例如Inman等人，200 。不是意在限制本發(fā)明的范圍，相信ALK5抑制劑會(huì)影響間充質(zhì)至上皮的轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)變(MET)過程。TGFii/活化素途徑是上皮至間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)的驅(qū)動(dòng)者。 本發(fā)明人想到抑制TGFi3 /活化素途徑能夠促進(jìn)MET (即重編程)過程。相信抑制TGF β /活化素途徑將具有相似的效應(yīng)。因此，TGF β /活化素途徑的任何抑制劑(例如，上游或下游)可與如本文描述的TGF-β/ALK5抑制劑聯(lián)合使用或替代之。 示例性的TGF β/活化素途徑的抑制劑包括但不限于TGF-β受體抑制劑，SMAD 2/3磷酸化抑制劑，SMAD 2/3和SMAD 4相互作用的抑制劑，SMAD 6和SMAD 7的激活劑/激動(dòng)劑。此外，本文描述的類別僅是為了組編目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員將知曉化合物能夠影響途徑內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)，因此，化合物可能按照不止一個(gè)所定義的類別來發(fā)揮作用。TGF-β受體抑制劑可以包括TGF_i3受體的抗體、TGF-β受體的顯性陰性變體， 靶向TGF-β受體的siRNA或反義核酸。抑制劑的具體實(shí)例包括但不限于STO416;2-(5-苯并[1，3] 二噁-5-基-2-叔丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶鹽酸(SB-505124) ； Ierde limumb (CAT-152)；metelimumab(CAT-192)；GC_1008;ID1 1；AP-12009；AP-11014；LY550410 ；LY580276；LY364947；LY2109761；SB-505124；SB-431542；SD-208；SM16；NPC-30345；Κ 2689 4 ； SB-203580 ； SD-093 ； Gleevec ； 3, 5，7，2，，4，-五羥基黃酮(Morin)；活化素 _M108A;P144; 可溶性的TBR2-Fc;靶向TGF-β受體的反義轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞(見，例如Wrzesinski等人，2007 ； Kaminska 等人，2005 ；和 Chang 等人，2007)。D. ROCK抑制劑和肌球蛋白11 AIPase抑制劑多能干細(xì)胞，尤其是人ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞，在細(xì)胞分離和解離之后易于發(fā)生凋亡， 這對(duì)于克隆分離或擴(kuò)增和分化誘導(dǎo)具有重要意義。最近發(fā)現(xiàn)了一類小分子增加解離的多能干細(xì)胞的克隆效率和存活，例如Mio相關(guān)的激酶(ROCK)抑制劑，其為ROCK相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的抑制劑，例如Mio特異性抑制劑，ROCK特異性抑制劑，或肌球蛋白II特異性抑制劑。在本發(fā)明的一些方面，ROCK抑制劑可用于多能干細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代和/或干細(xì)胞的分化。因此，ROCK抑制劑可存在于多能干細(xì)胞生長(zhǎng)、解離、形成聚集物或經(jīng)歷分化的任意細(xì)胞培養(yǎng)基中，例如粘附培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)。除非本文另有指明，否則肌球蛋白II抑制劑，例如 blebbistatin，可替代ROCK抑制劑的實(shí)驗(yàn)性使用。ROCK信號(hào)傳導(dǎo)途徑可以包括Mio家族GIPase ；ROCK, Rho下游的主要的效應(yīng)子激酶；肌球蛋白II，R0CK下游的主導(dǎo)效應(yīng)子(Harb等人，2008)；以及任何中間體、上游或下游信號(hào)處理者。ROCK能夠使肌球蛋白磷酸酶靶亞基1 (MYPTl)磷酸化和失活，其是ROCK的主要下游靶物之一，通過肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈(MRLC)的去磷酸化陰性地調(diào)節(jié)肌球蛋白功能。ROCK是絲氨酸/蘇氨酸激酶，其作為Mio (其有三種同種型一I hoA，RhoB和IihoC) 的靶蛋白。這些激酶最初被表征為MioA誘導(dǎo)的應(yīng)激纖維和局灶性粘連的形成的介導(dǎo)子。兩種ROCK同種型一ROCKl (pl60R0CK，也稱作ROK β )和R0CK2 (R0K α )一由N-末端激酶結(jié)構(gòu)域、后跟卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(包含Mio結(jié)合結(jié)構(gòu)域和pleckstrin-同源性結(jié)構(gòu)域(PH))組成。 這兩種ROCK都是細(xì)胞支架的調(diào)節(jié)者，介導(dǎo)I^hoA對(duì)于應(yīng)激纖維形成、平滑肌收縮、細(xì)胞粘附、 膜起皺和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的效應(yīng)。ROCK可以通過靶向下游分子、例如肌球蛋白II、肌球蛋白輕鏈 (MLC)、MLC磷酸酶(MLCP)和磷酸酶和緊張素同源物(PTEN)而發(fā)揮它們的生物學(xué)活性。ROCK抑制劑的非限制性實(shí)例包括:ΗΑ-100, Υ-27632，Η-1152，F(xiàn)asudi 1 (也稱作 ΗΑ1077)，Υ-30141 (描述于美國(guó)專利 5，478，838)，fff-536, HA-1077,羥基-HA-1077, GSK2699 62A, SB-772077-B,以及它們的衍生物，和針對(duì)ROCK的反義核酸，RNA干擾誘導(dǎo)核酸(例如， siRNA)，競(jìng)爭(zhēng)性肽，拮抗劑肽，抑制性抗體，抗體-ScFV片段，其顯性陰性變體和表達(dá)載體。 此外，由于其它小分子化合物已知為ROCK抑制劑，這些化合物或其衍生物也可用于實(shí)施方式中(例如，見美國(guó)專利
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