專利名稱：包含突變fad3等位基因的蕓苔屬植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作物植物和作物部分,尤其是十字花科(Brassicaceae),特別是蕓苔屬(Brassica)種類，其具有改進的脂肪酸組成，更具體地在種子中具有降低的a -亞麻酸含量。本發(fā)明還涉及脂肪酸去飽和酶以及編碼去飽和酶蛋白的核酸。更特別地，本發(fā)明涉及編碼A-15脂肪酸去飽和酶蛋白的核酸以及其突變體，該核酸及其突變體影響植物種子油中的脂肪酸組成。本發(fā)明還提供了鑒定與植物種群種子中降低的a-亞麻酸含量相關(guān)聯(lián)的分子標記的方法。
背景技術(shù)：
由于植物油在人類和動物飲食中以及多種工業(yè)用途中廣泛使用，它們具有日益重要的經(jīng)濟價值。然而，這些油的脂肪酸組成對于許多這些用途通常不是最佳的。由于具有、特定脂肪酸組成的特種油對于營養(yǎng)目的和工業(yè)目的兩者都是需要的，對于通過植物育種和/或通過新的植物生物技術(shù)分子工具在改變油的組成方面存在著相當大的興趣。食用油的具體性能和健康屬性在很大程度上取決于其脂肪酸組成。大多數(shù)源自商用植物品種的植物油主要由棕櫚酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:l)、亞油酸(C18:2)和亞麻酸(C18:3)組成。棕櫚酸和硬脂酸分別為16碳和18碳長的飽和脂肪酸。油酸、亞油酸和亞麻酸是18碳長的不飽和脂肪酸，分別含有1、2和3個雙鍵。油酸被稱為單不飽和脂肪酸，而亞油酸和亞麻酸被稱為多不飽和脂肪酸。蕓苔屬(Brassica)種類如甘藍型油菜(Brassica napus,B. napus)和白菜型油菜(Brassica rapa,B. rapa)構(gòu)成了世界上第三大植物油來源。在加拿大，植物科學家集中致力于構(gòu)建所謂的“雙低”品種，所述品種的種子油中芥酸含量低，并且在油提取之后剩余的固體粗粉中芥子油苷含量低(即，基于總脂肪酸含量的按重量計低于2.0%的芥酸含量(在下文中稱為wt% )，且每克無油粗粉中低于30微摩爾的芥子油苷含量)。這些在加拿大開發(fā)的較高質(zhì)量形式的油菜被稱為卡諾拉(canola)油菜。從卡諾拉油菜的天然和以前商用品種中提取的油含有相對高(8% -10% )的a-亞麻酸含量(C18:3)(美國專利申請20080034457)。也曾報告過更高的數(shù)值，例如11 %(http://www. canolacouncil. org/canola_oil_properties_and_uses. aspx)。三稀月旨肪酸在烹飪過程中不穩(wěn)定且易氧化，進而產(chǎn)生油的異味(GaiIIiard, 1980, Vol. 4,pp. 85_116In Stumpf, P. K. , ed. , The Biochemistry of Plants, Academic Press, New York)。它在存儲期間也形成異味和酸敗味(Hawrysh, 1990, Stability of canola oil, Chapter 7,pp. 99_122In F.Shahidi,ed. Canola和 Rapeseed Production,Chemistry,Nutrition, andProcessing Technology, Van Nostrand Reinhold, New York)。通過降低 C18:3 水平(有利于C18:2)改進了油的風味和營養(yǎng)質(zhì)量兩者(Di印enbrock和Wilson，Crop Sci 27:75-77，1987)。已知通過加氫降低a-亞麻酸含量水平增加了油的氧化穩(wěn)定性。令人遺憾的是，化學加氫導致反式脂肪酸形成，而反式脂肪酸和血液中的低密度脂蛋白膽固醇(LDL或“壞”膽固醇)的升高相關(guān)聯(lián)，因而使冠心病的風險增加。
另一個改進油質(zhì)量的策略是通過培育低亞麻酸品種，這特別具有挑戰(zhàn)性，因為C18:3含量是多基因性狀并通過隱性方式以相對低的遺傳力(W004072259)遺傳。Burns等人(Heredity 90 =39-48,2003)鑒定了與甘藍型油菜中的C18: 3的含量相關(guān)聯(lián)的五個質(zhì)量性狀基因座(QTL)，其中三個具有正效應(yīng)的基因座位于N6、N7和N18上，兩個具有負效應(yīng)的基因座位于N7和Nll上。源自“Stellar”(具有低C18:3含量(3% ))和“Drakkar”(具有常規(guī)C18:3含量(9%-10%))雜交的種群的遺傳分析表明，低C18:3性狀由兩個主要的指定為LI和L2的具有加性效應(yīng)的基因座控制(Jourdren等人，Euphytica 90 =351-357,1996)。發(fā)現(xiàn)控制C18:3含量的這兩個主要基因座與兩個FAD3(脂肪酸去飽和酶3)基因?qū)?yīng)；一個位于N4的基因組A (源于白菜型油菜)上，另一個位于N14的基因組C (源于甘藍)上(Jourdren 等人，Theor. Appl. Genet. 93 :512-518,1996 ；Barret 等人 GCIRC, 1999)。具有FAD3基因突變的卡諾拉油菜品種已經(jīng)描述于現(xiàn)有技術(shù)中。例如，W006/034059描述了兩種具有降低的亞麻酸含量的卡諾拉品種，認為頂COl和MC02(最初分別披露于 US5750827和美國專利申請?zhí)?0080034457中)具有FAD3基因突變。W004/072259披露了FAD3等位基因(基因組C)，其具有在來自突變卡諾拉油菜品系DMS100 (具有大約3%亞麻酸含量)的5’剪接位點中的單核苷酸置換。W001/25453描述了來自低亞麻酸“Apollo”品種的具有多個氨基酸置換的新的FAD3變體，其中之一也存在于“Stellar”中。美國專利申請20040083503披露了一種在保守域中具有一個氨基酸置換的非功能性FAD3突變體。然而，包含這樣的突變FAD3等位基因的卡諾拉植物的亞麻酸表型可依賴于遺傳背景而高度變異。因此，盡管事實上各種FAD3等位基因序列在本領(lǐng)域中是可得的，仍然需要用于穩(wěn)定地降低種子中的a-亞麻酸的量而對植物生長和發(fā)育沒有負效應(yīng)的替代方法(尤其是非轉(zhuǎn)基因方法)。在以下不同實施方案、實例和權(quán)利要求中所描述的本發(fā)明提供了用于開發(fā)產(chǎn)生低C18:3含量種子油的作物植物的方法和手段。
發(fā)明概述諸位本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，甘藍型油菜植物包含5種不同的FAD3基因，通過控制在種子中“功能性表達的"FAD3基因/等位基因(即產(chǎn)生功能性(生物活性)FAD3蛋白)的數(shù)量和/或類型，可以控制蕓苔屬植物特別是所述蕓苔屬植物種子油中的C18:3的水平。通過結(jié)合5個FAD3基因(“fad3等位基因”)的某些突變等位基因，從而導致功能性FAD3蛋白水平的降低，可以顯著降低種子油中的C18:3的水平。人們認為在植物中結(jié)合的FAD3突變等位基因越多，則C18:3種子油含量的將降低越多，而維持了正常的植物生長和種子發(fā)育。因此，在第一方面，本發(fā)明在一個實施方案中提供了在其基因組中包含至少兩個突變FAD3等位基因的蕓苔屬植物(及其部分，例如種子)，其中
i.第一突變FAD3等位基因是選自由FAD3-A1或FAD3-C1組成的組；并且
ii.第二突變FAD3等位基因選自由FAD3-A2、FAD3-A3或FAD3-C2組成的組。
其中當與不包含所述一個或多個突變FAD3等位基因的類似植物的種子油比較時，所述植物的種子油呈現(xiàn)出在包含所述突變FAD3等位基因的一種植物的種子油中的總a-亞麻酸(C18:3)量的顯著降低。本發(fā)明還提供了一種進一步包含第三完全敲除型突變FAD3等位基因的植物，其中所述第三完全敲除型突變FAD3等位基因是選自由FAD3-A1或FAD3-C1組成的組，由此該突變FAD3等位基因是至少3種不同的FAD3基因的突變等位基因。在此還提供了一種進一步包含第四完全敲除型突變FAD3等位基因的植物，其中所述第四完全敲除型突變FAD3等位基因選自由FAD3-A2、FAD3-A3或FAD3-C2組成的組，由此該突變FAD3等位基因是至少4種不同的FAD3基因的突變等位基因。另外，本發(fā)明提供了一種進一步包含第五完全敲除型突變FAD3等位基因的植物，其中所述第五完全敲除型突變FAD3等位基因選自由FAD3-A2、FAD3-A3或FAD3-C2組成的組，由此該突變FAD3等位基因是至少5種不同的FAD3基因的突變等位基因。在另一方面，本發(fā)明提供了編碼野生型和/或突變FAD3蛋白及其片段的核酸序列(分離的)、以及使用這些核酸序列來改變蕓苔屬種子油組成的方法。在此還提供了野生型和/或突變FAD3蛋白本身及其用途、以及包含這些突變FAD3等位基因和FAD3蛋白的植物。本發(fā)明進一步涉及包含一種或多種敲除突變FAD3等位基因的一種植物及其細胞、部分、種子和子代。一方面，與包含編碼相應(yīng)的功能性FAD3蛋白的FAD3等位基因的一種 植物及其細胞、部分、種子和子代相比，所述植物包含降低量的功能性FAD3蛋白。這樣的植物及其細胞、部分、種子和子代可以用于獲得產(chǎn)生具有改變的種子油組成的種子或籽粒，特別是用于獲得產(chǎn)生具有顯著降低的C18:3種子油含量的種子或籽粒的蕓苔屬植物(優(yōu)選地維持農(nóng)藝上適當?shù)闹参锇l(fā)育)。如在此所使用的，“植物部分”包括源自本發(fā)明植物的任何對象，包括植物部分，如細胞、組織、器官、種子、種子莢、種子粗粉、種子餅、種子脂肪或油。在另一方面，本發(fā)明涉及可以從根據(jù)本發(fā)明的植物中獲得的具有降低的C18:3油含量的種子或籽粒、以及所述種子或籽粒的用途，例如用于種植和培育植物子代或用于生產(chǎn)種子粗粉、種子餅、種子脂肪或油。在本發(fā)明的另一方面，提供了用于產(chǎn)生和選擇植物及其細胞、部分、種子和子代的方法，所述植物及其細胞、部分、種子和子代含有一種或多種完全敲除型FAD3等位基因。特別地，提供了用于產(chǎn)生和選擇包含至少兩種FAD3等位基因的蕓苔屬植物，尤其是甘藍型油菜植物及其細胞、部分、種子和子代的方法，其在基因組中的至少兩個不同基因座上含有至少兩種完全敲除型突變FAD3等位基因(即，至少兩種不同的FAD3基因)，并且所述方法用于在植物或植物部分中的突變FAD3等位基因與野生型FAD3等位基因的存在之間進行辨另IJ。因此，這些方法(如誘變和/或標記輔助選擇)被提供用于產(chǎn)生和/或鑒定突變FAD3等位基因或包含此這些等位基因的植物或植物部分，并且用于使適當數(shù)量的突變FAD3等位基因結(jié)合在單株植物中，由此該植物具有顯著降低的種子油含量。還提供了使用本發(fā)明的植物及其細胞、部分、種子和子代的方法，用于從壓碎的蕓苔屬種子中獲得“低亞麻酸”種子油。如在此所使用的，“植物產(chǎn)物”包括源自本發(fā)明的植物的任何對象，包括植物部分，例如種子、種子粗粉、種子餅、種子脂肪或油。
一般定義術(shù)語“核酸序列”(或核酸分子)是指處于單鏈或雙鏈形式的DNA或RNA分子，特別是編碼根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的DNA。“內(nèi)源核酸序列”是指植物細胞內(nèi)的核酸序列，例如存在于蕓苔屬細胞的核基因組中的FAD3基因的內(nèi)源等位基因。“分離的核酸序列”用于表示不再處于其天然環(huán)境中的核酸序列，例如體外或在重組細菌或植物宿主細胞中。術(shù)語“基因”表示包含在細胞內(nèi)被轉(zhuǎn)錄成RNA分子(例如，包含內(nèi)含子序列的然后被剪接為成熟mRNA的前mRNA)的區(qū)域(轉(zhuǎn)錄區(qū))的DNA序列，其可操作地連接到調(diào)節(jié)區(qū)(例如啟動子)上。因此，基因可以包含若干可操作地連接的序列，例如啟動子(一種包含例如涉及翻譯起始的序列的5’前導序列)、(蛋白質(zhì))編碼區(qū)(cDNA或基因組DNA)以及包含例如轉(zhuǎn)錄終止位點的3’非翻譯序列?！皟?nèi)源基因”用于與“外源基因”、“轉(zhuǎn)基因”或“嵌合基因”區(qū)分，并且是指來自某一植物屬、種類或品種的植物的基因，不是通過轉(zhuǎn)化引入植物的(即，它不是‘轉(zhuǎn)基因’)，而是通常存在于所述植物屬、種類或品種的植物中的，或者是從其通常存在的另一種植物屬、種類或品種的植物中，通過普通的育種技術(shù)或通過體細胞雜交(例如原生質(zhì)體融合)引入到植物中的。類似地，基因的“內(nèi)源等位基因”不是通過植物轉(zhuǎn)化引入到植物或植物組織中的，而是例如通過植物誘變和/或選擇產(chǎn)生的，或通過篩選天然植物種群而獲得的。術(shù)語“蛋白質(zhì)”或“多肽”可互換使用，并且是指由氨基酸的鏈組成的分子，不涉及特定的作用模式、大小、三維結(jié)構(gòu)或來源。因此，F(xiàn)AD3蛋白的“片段”或“部分”還可以被稱為“蛋白質(zhì)”?！胺蛛x的蛋白質(zhì)”用來指不再處于其天然環(huán)境中的蛋白質(zhì)，例如體外或在重組細菌或植物宿主細胞中?！懊浮笔且环N包含酶促活性的蛋白質(zhì)，例如功能性FAD3蛋白，能夠 將亞油酸脫飽和成亞麻酸。如在此所使用的，“FAD3蛋白”也稱為“脂肪酸去飽和酶3”、“ Q _3脂肪酸去飽和酶”或“ A-15去飽和酶”，是指引入C18:3脂肪酸生物合成中的第三雙鍵的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)駐留蛋白。脂肪酸去飽和酶是催化將雙鍵引入(依賴于NAD-(P)H-和02)到亞甲基間斷的脂肪?；湹暮F酶。親水性分析表明這些酶包含多達三個長的疏水域，所述該長疏水域足夠長以兩次跨越膜雙層。這些酶包含三個保守的含有組氨酸的區(qū)域(組氨酸簇)，其具有相對于這些潛在的跨膜結(jié)構(gòu)域的一致的定位。推定地涉及鐵結(jié)合的在這些保守區(qū)域中的所有單組氨酸殘基對于蛋白質(zhì)功能顯得是必需的(Shanklin等人，Biochemistry 33:12787-94,1994)。在 FAD3-A1(SEQ ID NO :2)中，在氨基酸位置 92、96、128、131、132、295、298 和 299上存在8個保守的推定的結(jié)合二鐵的組氨酸(GenBank ACS26169. I)。術(shù)語“信號序列”或“信號肽”是指在蛋白質(zhì)N端上的短肽鏈(3-60個氨基酸長)，其指導一種蛋白質(zhì)到胞內(nèi)細胞器例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的初始靶向。ER駐留蛋白，例如FAD3，可以包含用于初始共翻譯祀向(co-translational targeting)到ER的可切割的N端信號序列，而第一跨膜域也可作為指導共翻譯蛋白合成并作為錨定膜內(nèi)蛋白質(zhì)的停止轉(zhuǎn)移序列的不可切割的信號序列。證明的是蕓苔屬FAD3以共翻譯的方式插入ER膜中(McCartney等人，2004，Plant Journal 37，第 156-173 頁)。如在此所使用的“ER滯留基序”是負責靜態(tài)ER滯留或從分泌途徑中的其他區(qū)室回收的C端四肽基序-H/K/RDEL。已知對于基序的任何非保守氨基酸變化導致ER回收損失。FAD3包含作為ER滯留信號起作用的保守雙賴氨酸基序(相對C端的氨基酸位置-3和-5)。五個C端氨基酸-KSKIN的截短或兩個賴氨酸置換為丙氨酸分別導致FAD3錯誤定位到高爾基體或質(zhì)膜上，以及FAD3酶活性的嚴重損害(McCartney等人，2004，Plant Journal 37，156-173頁)。其他FAD3序列中的相應(yīng)的氨基酸區(qū)域或殘基可以通過本領(lǐng)域的已知方法找至IJ，例如通過確定最佳比對，如下所述。術(shù)語“FADS基因”在此是指編碼脂肪酸去飽和酶(即，F(xiàn)AD3蛋白)的核酸序列。功能性“FAD3蛋白”具有脂酰去飽和酶活性，更具體地，它能夠?qū)営退?C18:2)去飽和為亞麻酸(C18:3)?？梢允褂蒙餃y定測試FAD3蛋白的功能性。為了確定特定FAD3基因/蛋白的功能和/或功能性，可以使用例如由Vrinten等人，(2005，Plant Physiol. 139 :79-87)或由Reed等人，(2000,Plant Physiol。122 :715-20)所描述的酵母表達系統(tǒng)或例如Reddy等人，(Plant Mol Biol 22 =293-300,1993)所描述的細菌表達系統(tǒng)?？商娲?，編碼FAD3蛋白的基因可以例如被轉(zhuǎn)化到蕓苔屬(或其他植物)中，并且針對過表達表型篩選生成的轉(zhuǎn)化體，例如在美國專利申請20040083503中所描述的。如在此所使用的，術(shù)語“等位基因”表示在特定基因座的基因的任何一種或多種可替代形式。在生物的二倍體(或雙二倍體)細胞中，給定基因的等位基因位于染色體的特定位置或基因座(復數(shù)個基因座)上。一個等位基因存在于同源染色體對的每條染色體上。如在此所使用的，術(shù)語“同源染色體”表示這樣的染色體，所述染色體含有相同生物學特征的信息，在相同的基因座上含有相同的基因，但可能這些基因的等位基因不同。同源染色體是在減數(shù)分裂過程中配對的染色體。“非同源染色體”代表了生物體的所有生物學特征，形成一組，而在細胞中的組數(shù)被稱為倍性。二倍體生物含有兩組非同源染色體，其中每組同源染色體是從不同的親體遺傳來的。在雙二倍體種類中，實質(zhì)上存在兩組二倍體基 因組，由此將兩組基因組的染色體稱為“同源染色體”(類似地，兩組基因組的基因座或基因被稱為部分同源基因座或基因)。二倍體或雙二倍體的植物種類在特定基因座上可以包含大量的不同的等位基因。如在此所使用的，術(shù)語“雜合”表示當兩個不同的等位基因存在于特定基因座但是分別位于相應(yīng)的在細胞中的同源染色體對上時所存在的遺傳條件。相反地，如在此所使用的，術(shù)語“純合”表示當兩個相同的等位基因存在于特定基因座但是分別位于相應(yīng)的在細胞中的同源染色體對上時所存在的遺傳條件。如在此所使用的，術(shù)語“基因座(復數(shù)個基因座)”表示在染色體上的一個或多個特定位置或位點，其中發(fā)現(xiàn)了例如基因或遺傳標記。例如“FAD3-A1”是指在其中發(fā)現(xiàn)FAD3-A1基因(以及兩個FAD3-A1等位基因)的在染色體上的位置，而“FAD3-C1基因座”是指在其中發(fā)現(xiàn)FAD3-C1基因(以及兩個FAD3-C1等位基因)的在染色體上的位置。如在此所使用的，“基本相似(essentially similar) ”是指具有至少75%、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、98 %、99 %或100 %的序列一致性的序列。這些核酸序列也可以被稱為與提供在序列表中的FAD3序列“實質(zhì)相同”或“基本相同”。兩個相關(guān)核苷酸或氨基酸序列的“序列一致性”，表示為百分比，是指在兩個最優(yōu)比對序列中，具有相同殘基的位置數(shù)(xlOO)除以比較的位置數(shù)。一個空位，即在比對中的一個位置，其中一個殘基存在于一個序列中，但不存在另一個序列中，其被視為具有不相同殘基的位置。根據(jù)European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS, Rice 等人，2000, Trends inGenetics 16(6) :276-277 ;參見例如 http://www. ebi. ac. uk/emboss/align/index, html)中的Needleman和Wunsch總體比對算法(Needleman and ffunsch, 1970, J Mol Biol 48(3)443-53)使用缺省設(shè)置(空位開放罰分=10(對于核苷酸)/10(對于蛋白質(zhì))和空位拓展罰分=0. 5 (對于核苷酸)/0. 5 (對于蛋白質(zhì)))，通過在全長上比對兩個序列來發(fā)現(xiàn)兩個序列的“最優(yōu)比對”。對于核苷酸使用的缺省評分矩陣是EDNAFULL，而對于蛋白質(zhì)，使用的缺省評分矩陣是EBL0SUM62。可以使用“嚴緊雜交條件”來鑒定與給定的核苷酸序列實質(zhì)相同的核苷酸序列。嚴緊條件是序列依賴性的，在不同的情況下將是不同的。通常，嚴緊條件被選擇為比特定序列在定義的離子強度和PH下的熱熔點(Tm)低大約5°C。Tm(在定義的離子強度和pH下)是50%的靶序列與完全匹配的探針雜交的溫度。典型地，所選擇的嚴緊條件是在pH 7和至少60°C的溫度下，鹽濃度為約0.02摩爾。降低鹽濃度和/或增加溫度增加了嚴緊性。用于RNA-DNA雜交的嚴緊條件(Northern印跡，使用例如IOOnt的探針)是例如包括在63°C下，在0. 2X SSC中至少洗滌一次持續(xù)20min的那些條件、或等效條件?！案邍谰o條件”可以例如通過如下來提供在65 °C的水溶液中雜交，該溶液含有 6XSSC(20XSSC 含有 3.0M NaCl、0. 3M 檸檬酸 Na，pH 7.0)、5XDenhardt' s (100XDenhardt' s含有2% Ficoll、2*%聚乙烯卩比咯燒酮、2%牛血清白蛋白)、0. 5%十二烷基硫酸鈉(SDS)、以及作為非特異性競爭物的20 yg/ml變性的載體DNA (單鏈魚精子DNA，具有120-3000個核苷酸的平均長度)。在雜交之后，可以在若干步驟中進行高嚴緊洗滌，其中最終洗滌(大約30分鐘)是在雜交溫度下，在0. 2-0. I X SSC,
0.1% SDS中進行。 “中度嚴緊條件”是指與在上述溶液中雜交等效的條件，但是在大約60°C -62°C。中度嚴緊洗滌可以在雜交溫度下，在1XSSC、0. 1% SDS中進行?！暗蛧谰o性”指與在上述溶液中雜交等效的條件，但是在大約50°C -52°C。低嚴緊洗滌可以在雜交溫度下，在2XSSC、0. 1% SDS中進行。還參見Sambrook等人，(1989)以及Sambrook和 Russell(2001)。術(shù)語基因或蛋白質(zhì)的“直向同源物”在此是指在另一個種類中發(fā)現(xiàn)的同源基因或蛋白質(zhì)，其具有與該基因或蛋白質(zhì)相同的功能，但其序列(通常)從當包含這些基因(即，通過物種形成從共同祖先進化的基因)的種類發(fā)散時的時間點發(fā)散。因此可以基于序列比較(例如，基于整個序列或特定結(jié)構(gòu)域的序列一致性百分比)和/或功能分析，鑒定在其他的植物種類(例如芥菜型油菜等)中的甘藍型油菜FAD3基因的直向同源物。術(shù)語“突變體”或“突變”是指例如不同于所謂的“野生型(wild type)”變異體(也可寫成“wildtype”或“wild-type”)的植物或基因，是指例如在自然界中最常出現(xiàn)的植物或基因的典型形式?！耙吧椭参铩笔侵敢环N這樣的植物，其具有在自然種群中的這種植物的最常見表型?！耙吧偷任换颉笔侵府a(chǎn)生野生型表型所需要的基因的等位基因。突變植物或等位基因可以發(fā)生在自然種群中或者可以通過人工干預產(chǎn)生，例如，通過誘變，因此“突變等位基因”是指產(chǎn)生突變表型所需要的基因的等位基因。如在此所使用的，術(shù)語“突變 FAD3 等位基因”(例如突變體 FAD3-A1、FAD3-C1、FAD3-A2、FAD3-A3 或 FAD3-C2)是指FAD3等位基因，相比于相應(yīng)的野生型等位基因，其指導顯著降低量的功能性FAD3蛋白的表達。這可以通過編碼非功能性FAD3蛋白的突變FAD3等位基因或者可以通過編碼顯著降低量的功能性FAD3蛋白或根本沒有FAD3蛋白的突變FAD3等位基因而發(fā)生，如在此所使用的非功能性FAD3蛋白是指與對應(yīng)的野生型功能性FAD3蛋白比較，沒有顯著改變的生物活性和/或具有顯著降低的生物活性的FAD3蛋白。因此，與野生型等位基因相比，這種“突變FAD3等位基因”包含在其核酸序列中的一種或多種突變，由此該一種或多種突變優(yōu)選地導致在體內(nèi)細胞中的功能性FAD3蛋白的量(絕對或相對)的顯著減少。核酸序列中的突變可以包括例如
(a)“錯義突變”，是核酸序列中的改變，其導致一個氨基酸置換另一個氨基酸；(b)“無義突變”或“終止密碼子突變”，所述突變是核酸序列中的改變，其導致提前終止密碼子的引入，從而終止翻譯(導致截短的蛋白質(zhì))；植物基因含有翻譯終止密碼子“TGA” (RNA中的UGA)，“TAA” (RNA中的UAA)和“TAG” (RNA中的UAG);因此，導致有待進入正在被翻譯的成熟mRNA中(在閱讀框中)的這些密碼子之一的任何核苷酸置換、插入、缺失將使翻譯終止。
(C) 一個或多個氨基酸的“插入突變”，是由于在核酸的編碼序列中已經(jīng)添加一個或多個密碼子所致；
(d)—個或多個氨基酸的“缺失突變”，是由于在核酸的編碼序列中已經(jīng)缺失一個或多個密碼子所致；
(e)“移碼突變”，導致核酸序列被翻譯在突變的不同的框下游。移碼突變可能具有不同的原因，例如一個或多個核苷酸的插入、缺失或復制，而且影響前mRNA剪接(剪接位點突 變)的突變可以導致移碼；
(f)“剪接位點突變”，其改變或取消前-mRNA序列的正確剪接，導致與野生型不同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。例如，在RNA剪接過程中可以跳過一個或多個外顯子，導致一種缺乏由跳過的外顯子編碼的氨基酸的蛋白質(zhì)?？商娲?，可以通過錯誤剪接，或者可以保留一個或多個內(nèi)含子，或者可以產(chǎn)生替代的剪接供體或受體，或者可以在一個替代位置(例如在內(nèi)含子內(nèi))開始剪接，或者可以產(chǎn)生替代的多腺苷酸化信號，來改變閱讀框。正確的前mRNA剪接是一個復雜的過程，可以是受到FAD3編碼基因的核苷酸序列中的各種突變的影響。在高等真核生物例如植物中，主要的剪接體剪接內(nèi)含子，所述內(nèi)含子在5'剪接位點(供體位點)含有GU，在3'剪接位點(受體位點)含有AG。核真核基因的大約99%的剪接位點遵循 GU-AG 法則(或 GT-AG 法則；參見 Lewin,Genes VI, Oxford University Press 1998,第885-920頁，ISBN 0198577788)，同時內(nèi)含子在5’和3’剪接位點含有其他的二核苷酸，例如GC-AG和AU-AC，分別僅占大約I %和0. I %。所希望的是，在核酸序列中的一個或多個突變優(yōu)選地導致突變蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含顯著降低的體內(nèi)酶活性或沒有體內(nèi)酶活性，即C18:2到C18:3去飽和酶活性。根本而言，相對于野生型蛋白質(zhì)，導致包含至少一個氨基酸插入、缺失和/或置換的蛋白質(zhì)的任何突變可以導致顯著降低的酶活性或沒有酶活性。然而，應(yīng)當理解的是，在蛋白質(zhì)某些部分中的突變更可能導致突變FAD3蛋白的功能降低，例如導致截短的蛋白質(zhì)的突變，由此缺失了功能和/或結(jié)構(gòu)域的重要部分。如在此所使用的，“完全敲除型等位基因”是一個指導顯著降低功能的FAD3表達或沒有功能性FAD3表達的突變體等位基因，即，細胞體內(nèi)顯著降低量的功能性FAD3蛋白或沒有功能性FAD3蛋白。完全敲除型突變FAD3等位基因包括例如編碼區(qū)的整個部分或基本部分的缺失突變，或?qū)е碌鞍踪|(zhì)的基本缺失或整體缺失的移碼或終止密碼子突變。例如，完全敲除型FAD3等位基因包括中斷或缺失ER滯留基序的突變，該ER滯留基序存在于5個最C端氨基酸(-KSKTN)中。這將導致高爾基體或質(zhì)膜中的蛋白質(zhì)的ER回收的完全喪失和隨后的累積，致使不能執(zhí)行其功能(McCartney等人,2004,Plant Journal 37,156-173頁)。因此，例如導致包括ER滯留基序的蛋白質(zhì)的C端截短的任何終止密碼子、移碼或剪接位點突變將導致完全敲除型FAD3等位基因，如同編碼基序自身的核苷酸序列中的錯義突變(例如兩個賴氨酸之一或兩者的置換)、插入或缺失，即在FAD3-A1或其同源殘基的編碼序列中，從SEQ ID NO :11的1117位核苷酸(相應(yīng)于SEQ ID NO 2的Lys373)開始并進一步延伸到相對于ATG起始密碼子的下游?；蛘撸粋€完全敲除型突變FAD3等位基因包含使八個保守組氨酸殘基中的任何一個缺失或中斷的突變。例如，一個完全敲除型突變FAD3等位基因包含突變，例如相對于FAD3-A1編碼序列(Genbank登錄號FJ985689. I)中的ATG起始密碼子在核苷酸274-276和核苷酸895-897之間的無義突變或移碼突變，核苷酸274-276和核苷酸895-897分別編碼第一個和最后一個保守組氨酸(FAD3-A1蛋白的His92和His299 ；Genbank登錄號ACS26169. I)或其同源殘基。在另一個實例中，導致任何這八個組氨酸殘基的置換的錯義突變將導致非功能性FAD3蛋白。仍然在另一個實例中，完全敲除型突變FAD3等位基因包含使編碼八個結(jié)合二鐵的組氨酸的核苷酸的任何一個缺失或改變、或改變相對于潛在跨膜域的八個結(jié)合二鐵的組氨酸的一個或多個或彼此間的定位的插入、缺失或一個或多個剪接位點突變。一個完全敲除型突變FAD3等位基因的另一個實例是編碼N端截短的FAD3蛋白的 FAD3等位基因。在編碼第一個二鐵組氨酸的核苷酸的突變上游的情況下，初始起始密碼子下游的一個替代的ATG可以用于翻譯起始，由此仍然可以形成N端截短的蛋白質(zhì)。然而，這種截短將使通常起到將蛋白質(zhì)靶向ER上的作用的潛在N端信號序列中斷或缺失，導致FAD3錯誤定位到細胞溶質(zhì)中，從而導致所述信號序列不能執(zhí)行其正常功能。如在此所使用的，“顯著降低量的功能性FAD3蛋白”(例如，功能性FAD3-AI、FAD3-A2、FAD3-A3、FAD3-C1和/或FAD3-C2蛋白質(zhì))指與不包含突變FAD3等位基因的細胞產(chǎn)生的功能性FAD3蛋白的量相比，通過含有突變FAD3等位基因的細胞產(chǎn)生的功能性FAD3蛋白的量降低至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100% (即，細胞不產(chǎn)生功能性蛋白)。該定義涵蓋了在體內(nèi)不具有生物活性(C18:2到C18:3去飽和酶活性)的“非功能性”FAD3蛋白(例如，截短的蛋白質(zhì))的產(chǎn)生、功能性蛋白的絕對量的降低(例如，由于FAD3基因突變產(chǎn)生的無功能FAD3蛋白)、和/或與功能性野生型FAD3蛋白(例如FAD3蛋白中的一個或多個氨基酸殘基被另一個氨基酸殘基置換或缺失，其中一個或多個氨基酸殘基對于該編碼的FAD3蛋白的生物活性是至關(guān)重要的)相比具有顯著降低的生物活性的FAD3蛋白的產(chǎn)生。如在此所使用的，術(shù)語“突變FAD3蛋白”是指突變FAD3核酸序列(“ fad3等位基因”)編碼的FAD3蛋白，由此與無突變野生型FAD3序列(“FAD3等位基因”)編碼的FAD3蛋白的活性相比，該突變導致體內(nèi)生物學FAD3活性(C18:2到C18:3去飽和酶活性)顯著降低和/或無活性。如在此所使用的，“顯著降低的C18:3含量”或“低a -亞麻酸”是指當與不包含一個或多個突變FAD3等位基因的相應(yīng)植物的種子油相比時，存在于包含所述一個或多個突變FAD3等位基因的植物的種子油中的總a-亞麻酸(C18:3)的量的顯著降低。在另一個實施方案中，包含一個或多個突變FAD3等位基因的所述植物的C18:3種子油含量降低到低于總種子油含量的11重量％、10重量、9重量、8重量、7. 0重量、6. 0重量、5. 0重量％、4.0重量％、3.0重量％、2.5重量％、2.0重量％、1.5重量％、1.0重量％、0.5重量％。應(yīng)當理解的是，C18:3種子油含量可以改變，取決于遺傳背景和生長條件(例如，溫度)。不期望限制本發(fā)明，預期的是，相比于當植物生長在溫室中時，當它們生長在田間時，其C18:3種子油水平通常是更高的。因此，為了確定根據(jù)本發(fā)明的植物(即包含一個或多個突變FAD3等位基因的植物)是否具有顯著降低的C18:3種子油含量，應(yīng)當將其與生長在相同條件下的不包含所述一個或多個突變FAD3等位基因的相應(yīng)植物(即具有相同的遺傳背景)進行比較，而不是評估絕對C18:3種子油水平?？梢允褂帽绢I(lǐng)域的已知方法確定種子油的脂肪酸組成，包括C18: 3含量，例如通過從種子中提取脂肪酰并且通過毛細管氣-液相色譜法分析它們在種子油中的相對水平，如TO09/007091中所述。如在此所使用的，“誘變”指這樣的過程，其中使植物細胞(例如，蕓苔屬種子或其他部分，如花粉等)經(jīng)受一種誘導細胞DNA中的突變的技術(shù)，例如與誘變劑或電離輻射(中子(如快中子誘變等)、a射線、Y射線(如由鈷60源提供的)、X射線、UV輻射等)或這些之中的兩項或更多項的組合相接觸，所述誘變劑例如化學物質(zhì)(例如，乙基磺酸甲酯(EMS)、乙基亞硝基脲(ENU)等)。因此，所希望的一個或多個FAD3等位基因的誘變可以通過使用化學方法例如通過使一種或多種植物組織與乙基磺酸甲酯(EMS)、乙基亞硝基脲等接觸，使用物理手段例如X射線等，或通過Y輻射(如鈷60源提供的)來實現(xiàn)。雖然由輻射產(chǎn)生的突變通常是大段缺失或其他的嚴重損傷，例如易位或復雜的重排，而化學誘變劑產(chǎn)生的突變通常是更離散的損傷，例如點突變。例如，EMS烷基化物鳥嘌呤堿基導致堿基錯配烷基化的鳥嘌呤將與胸腺嘧啶堿基配對，主要導致G/C向A/T轉(zhuǎn)變。在誘變之后，使用已知的技術(shù)從處理的細胞再生蕓苔屬植物。例如，可以根據(jù)常規(guī)的生長程序種植所獲得的蕓苔屬種子，之后在植物上形成自花授粉種子?？商娲兀梢蕴崛‰p單倍體小植物，以立即形成純合植物，例如，如由Coventry等人(1988, Manual for Microspore CultureTechnique for Brassica napus. Dep. Crop Sci.Techn. Bull. OAC Publication 0489.Univ. of Guelph, Guelph，安大略省，加拿大)所描述。可以收獲作為此類自花授粉的結(jié)果的在這一代或后代中形成的另外的種子，并就突變FAD3等位基因的存在進行篩選。篩選特定突變等位基因的一些技術(shù)是已知的，例如Deleteagene (Delete-a-gene ；Li等人,2001,Plant J 27 :235-242)使用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)測定，來篩選通過快中子誘變產(chǎn)生的缺失突變，TILING(定向誘導基因組局部突變技術(shù)；McCallum等人,2000, Nat Biotechnol18 =455-457)鑒定了 EMS-誘導的點突變等。另外的篩選特定突變FAD3等位基因的存在的技術(shù)描述于以下實施例中。無論何時，除非另外指明，當涉及根據(jù)本發(fā)明的“植物”或“多種植物”時，可以理解為在此還涵蓋了植物部分(細胞、組織或器官、種子莢、種子、已分離的部分如根、葉、花、花粉等)，保留了親本的區(qū)別特征(特別是C18:3種子油含量)的植物子代，例如通過自交或雜交獲得的種子，如雜交種子(通過雜交兩株近交親本品系獲得的)，從其衍生的雜交植物和植物部分?！白魑镏参铩敝缸鳛樽魑镌耘嗟闹参镂锓N，例如甘藍型油菜(AACC，2n = 38)、芥菜(AABB, 2n = 36)、埃塞俄比亞芥(Brassica carinata) (BBCC, 2n = 34)、白菜型油菜(Brassica rapa)(同義詞，蕓苔(Brassica campestris)) (AA, 2n = 20),甘藍(Brassicaoleracea) (CC,2n = 18)或黑芥(Brassica nigra) (BB,2n = 16)。定義沒有涵蓋草,例如擬南芥(Arabidopsis thaliana)。 在此使用的“品種”與國際植物新品種保護公約(UPOV)規(guī)范一致，是指在單個已知最低級別的植物分類單位中的植物分組，所述分組可以通過由給定基因型或基因型的組合所導致的特征的表達來定義，可以通過至少一種所述特征的表達與任何其他植物分組進行區(qū)分，并且在關(guān)于它進行無變化(穩(wěn)定)繁殖的適合性方面可以認為是一個單位。如在此所使用的，當關(guān)于一種植物而使用時，術(shù)語“非天然發(fā)生”或“栽培”表示具有已經(jīng)人工修飾的基因組的植物。轉(zhuǎn)基因植物，例如是含有外源核酸分子(例如含有轉(zhuǎn)錄區(qū)的嵌合基因)的非天然發(fā)生植物，所述轉(zhuǎn)錄區(qū)在被轉(zhuǎn)錄時產(chǎn)生能夠降低內(nèi)源基因表達的生物活性RNA分子(如根據(jù)本發(fā)明的FAD3基因)，因此已經(jīng)被人工基因修飾。此外，在內(nèi)源基因中含有由于暴露于誘變劑導致的突變，例如內(nèi)源FAD3基因中的突變(例如在調(diào)控元件或在編碼序列中)的植物也被認為是一種非天然發(fā)生的植物，因為其已經(jīng)被人工基因修飾。此外，一種特定種類的植物例如甘藍型油菜也被認為是非天然發(fā)生的植物，所述植物含有在該特定植物種類中并不發(fā)生在自然中的內(nèi)源基因(如內(nèi)源FAD3基因)中的突變，這是用與該植物相同或不同種類(例如芥菜型油菜或白菜型油菜)的植物進行的例如定向育種過程如標記輔助育種和選擇或基因滲入的結(jié)果。相反，僅含自發(fā)或天然發(fā)生的突變的植物，即，沒有經(jīng)過人工基因修飾的植物，不是如在此定義的“非天然發(fā)生的植物”，因此不包括在本發(fā)明內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的是，相比于天然發(fā)生的植物，非天然發(fā)生的植物通常具有 改變的核苷酸序列，但非天然發(fā)生的植物也可以被人工基因修飾而不改變其核苷酸序列，例如通過修飾其甲基化方式來進行。如在此所使用的，“農(nóng)藝學上適合的植物發(fā)育”是指植物特別是含油種子油菜植物的發(fā)育，該發(fā)育在通常的農(nóng)業(yè)實踐中對其性能(更具體的是田間移植生長(establishment)、活力、開花時間、高度、成熟、抗倒伏性、產(chǎn)量、抗病性、抗裂角性等)無不利影響。因此，與已知具有平均C18:3種子油含量的植物相比，具有農(nóng)藝學上適合的植物發(fā)育的顯著降低的C18:3種子油含量的品系具有已經(jīng)降低的C18:3種子油含量，同時保持相似的田間移植生長、活力、開花時間、高度、成熟、抗倒伏性、產(chǎn)量、抗病性、抗裂角性等。術(shù)語“包含”應(yīng)當被理解為詳細說明所陳述的部分、步驟或組分的存在，但不排除一種或多種其他的部分、步驟或組分的存在。應(yīng)當理解的是，當提及處于單數(shù)形式的詞語(例如，植物或根)時，復數(shù)形式(例如，復數(shù)個植物，復數(shù)個根)也包括在內(nèi)。因此，通過不定冠詞(“a”或“an”)提及一種要素時，并不排除存在一個以上的要素的可能性，除非上下文明確要求有一個要素以及僅有這些要素之一。因此，不定冠詞單數(shù)形式(“a”或“an”)通常表示“至少一個”。
詳細說明甘藍型油菜(基因組么么0，211 =知=38)是異源四倍體(雙二倍體)種類，由于它來源于二倍體祖先，實質(zhì)上含有兩個二倍體基因組(基因組A和C)，所述甘藍型油菜在其基因組中包括位于基因組A和C上的兩個FAD3基因，在下文中分別稱為FAD3-A1和FAD3-C1。諸位發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，甘藍型油菜基因組包含另外三個FAD3基因，命名為FAD3-A2、FAD3-A3和FAD3-C2。在蕓苔屬育種品系優(yōu)良雄株和優(yōu)良雌株的雜交中發(fā)現(xiàn)，當與不含突變FAD3等位基因的甘藍型油菜植物比較時，對于突變FAD3-A1或FAD3-C1等位基因是純合的甘藍型油菜植物顯示出C18:3種子油含量顯著降低，而對于任何新鑒定的FAD3基因中的突變是純合的植物未展示C18:3的降低。進一步發(fā)現(xiàn)的是，除了對于FAD3-A1或FAD3-C1突變等位基因的純合性以外，甘藍型油菜中的處于純合狀態(tài)的一個第二突變FAD3基因的存在能進一步降低C18:3種子油含量(令人意外地，新的FAD3基因也是如此)。而且，除了處于純合狀態(tài)的FAD3-A1和FAD3-C1突變這兩者以外，對于一個第三突變FAD3等位基因的純合性能夠?qū)⒃跍厥抑猩L的植物的種子油中的C18:3含量降低至甚至低于總種子油含量的3%。此外觀察到的是，疊加在該FAD3-A1和FAD3-C1基因的突變等位基因之上的另外的突變FAD3等位基因越多，則該C18:3油含量越低，生長在溫室的蕓苔屬植物以及對于田間中的植物均是如此。因此，在一個第一實施方案中本發(fā)明提供了一種蕓苔屬植物，其包含具有兩個不同F(xiàn)AD3基因的至少兩個完全敲除型突變FAD3等位基因，其中，
i.該第一突變FAD3等位基因是選自由FAD3-A1或FAD3-C1組成的組；且
ii.該第二突變FAD3等位基因是選自由FAD3-A2、FAD3-A3或FAD3-C2組成的組。在一個實施方案中提供了雙突變植物，其對于該第一突變FAD3等位基因是雜合、或純合的并且對于該第二突變FAD3等位基因是雜合或純合的，其中該植物的基因型可以描述為(當該野生型等位基因被描述為FAD3時，該突變FAD3等位基因被縮寫為fad3)
-FAD3-Al/fad3-al，F(xiàn)AD3-A2/fad3_a2-FAD3-Al/fad3-al，F(xiàn)AD3-A3/fad3_a3-FAD3-Al/fad3-al，F(xiàn)AD3-C3/fad3_c2-FAD3-Cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3_c2-FAD3-Cl/fad3-cl, FAD3-A3/fad3_a3-FAD3-Cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3_c2-fad3-al/fd3a-al，F(xiàn)AD3-A2/fad3~a2-fad3-al/fad3~al，F(xiàn)AD3-A3/fad3~a3-fad3-al/fad3-al，F(xiàn)AD3-C2/fad3_c2-fad3-al/fad3-cl, FAD3-A2/fad3_a2-fad3-cl/fad3-cI，F(xiàn)AD3-A3/fad3_a2-fad3-cl/fad3-cI，F(xiàn)AD3-C2/fad3_c2-FAD3-A1/fad3~al， fad3~a2/fad3~a2-FAD3-A1/fad3~al， fad3~a3/fad3~a3-FAD3-Al/fad3-al， fad3-c2/fad3-c2-FAD3-Cl/fad3-cl, fad3-a2/fad3-a2-FAD3-Cl/fad3-cl, fad3-a3/fad3-a3-FAD3-Cl/fad3-cl, fad3-cl/fad3-c2-fad3-al/fad3~al，fad3~a2/fad3~a2-fad3-al/fad3~al，fad3~a3/fad3~a3-fad3-al/fad3~al，fad3~c2/fad3~c2-fad3-cl/fad3-cl, fad3~a2/fad3~a2-fad3-cl/fad3-cl, fad3~a3/fad3~a2-fad3-cl/fad3-cl, fad3_cl/fad3~c2
其中該植物對于其余FAD3基因(例如FAD3-Al/fad3-al、FAD3-A2/fad3_a2相當于基因型 FAD3-Al/fad3-al、FAD3-A2/fad3-a2、FAD3-A3/FAD3-A3、FAD3-C1/FAD3-C1、FAD3-C2/FAD3-C2)的野生型等位基因是純合的。本發(fā)明還提供了一種植物，其進一步包含一個第三完全敲除型突變FAD3等位基因，其中所述第三完全敲除型突變FAD3等位基因是選自由FAD3-A1或FAD3-C1組成的組，由此這些突變FAD3等位基因是至少三個不同F(xiàn)AD3基因的突變等位基因。技術(shù)人員將清楚的是，當FAD3-A1被選擇為該第一完全敲除型突變FAD3等位基因時，該第三完全敲除型突變FAD3等位基因?qū)⑹荈AD3-C1，反之亦然。因此，在另一個實施方案中提供了三突變植物，其對于該第一突變FAD3等位基因是雜合或純合的、對于該第二突變FAD3等位基因的雜合或純合的，且對于該第三突變FAD3等位基因是雜合或純合的，其中該植物的基因型可以描述為(當該野生型等位基因被描述為FAD3時，該突變FAD3等位基因被縮寫為fad3)
-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A2/fad3_a2，F(xiàn)AD3-Cl/fad3_cl-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A3/fad3_a3，F(xiàn)AD3-Cl/fad3_cl -FAD3-Al/fad3-al, FAD3-C2/fad3_c2，F(xiàn)AD3-Cl/fad3_cl-fad3-al/fad3-al, FAD3-A2/fad3_a2，F(xiàn)AD3-Cl/fad3_cl-fad3-al/fad3-al, FAD3-A3/fad3_a3，F(xiàn)AD3-Cl/fad3_cl-fad3-al/fad3-al, FAD3-C2/fad3_c2，F(xiàn)AD3-Cl/fad3_cl-FAD3-Al/fad3-al, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-Cl/fad3_cl-FAD3-Al/fad3-al, fad3-a3/fad3-a3, FAD3-Cl/fad3_cl-FAD3-Al/fad3-al, fad3-c2/fad3-c2, FAD3-Cl/fad3_cl-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A2/fad3_a2，fad3-cl/fad3-cl-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A3/fad3_a3，fad3-cl/fad3-cl-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-C2/fad3_c2，fad3-cl/fad3-cl-fad3-al/fad3~al, FAD3-A2/fad3~a2, fad3-cl/fad3_cl-fad3-al/fad3~al, FAD3-A3/fad3~a3, fad3-cl/fad3_cl-fad3-al/fad3-al, FAD3-C2/fad3_c2，fad3-cl/fad3-cl-fad3-al/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, FAD3-C1/fad3-cl-fad3-al/fad3~al, fad3~a3/fad3~a3, FAD3-C1/fad3-cl-fad3-al/fad3-al, fad3-c2/fad3-c2, FAD3-Cl/fad3_cl-FAD3-A1/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, fad3-cl/fad3_cl-FAD3-A1/fad3~al, fad3~a3/fad3~a3, fad3-cl/fad3_cl-FAD3-Al/fad3-al, fad3-c2/fad3-c2, fad3-cl/fad3-cl-fad3-al/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, fad3-cl/fad3_cl-fad3-al/fad3~al, fad3~a3/fad3~a3, fad3-cl/fad3_cl-fad3-al/fad3~al, fad3~c2/fad3~c2, fad3-cl/fad3_cl
其中該植物對于其余 FAD3 基因(例如 FAD3-Al/fad3-al、FAD3-A2/fad3-a2、FAD3-Cl/fad3-cl 相應(yīng)于基因型 FAD3-Al/fad3-al、FAD3-A2/fad3_a2、FAD3-Cl/fad3_cl、FAD3-A3/FAD3-A3、FAD3-C2/FAD3-C2)的野生型等位基因是純合的。人們認為，結(jié)合在一種植物中的突變FAD3等位基因越多，則C18:3種子油含量的降低就越多。因此，本發(fā)明還提供了一種植物，其進一步包含第四完全敲除型突變FAD3等位基因，其中所述第四完全敲除型突變FAD3等位基因是選自由FAD3-A2、FAD3-A3或FAD3-C2組成的組，由此該突變FAD3等位基因是至少四個不同F(xiàn)AD3基因的突變等位基因。技術(shù)人員將清楚的是，當FAD3-A2被選擇為該第二完全敲除型突變FAD3等位基因時，該第四完全敲除型突變FAD3等位基因?qū)⑹荈AD3-A3或FAD3-C2。同樣，當FAD3-A3被選擇為該第二完全敲除型突變FAD3等位基因時，該第四完全敲除型突變FAD3等位基因?qū)⑹荈AD3-A2或FAD3-C2，并且當FAD3-C2被選擇為該第二完全敲除型突變FAD3等位基因時，該第四完全敲除型突變FAD3等位基因?qū)⑹荈AD3-A2或FAD3-A3。因此，在另一個實施方案中提供了四突變植物，其對于該第一突變FAD3等位基因是雜合或純合的、對于該第二突變FAD3等位基因是雜合或純合的、對于該第三突變FAD3等位基因是雜合或純合的，且對于該第四突變FAD3等位基因是雜合或純合的，其中該植物的基因型可以被描述為(當該野生型等位基因被描述為FAD3時，該突變FAD3等位基因縮寫為 fad3)
-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A2/fad3_a2，F(xiàn)AD3-Cl/fad3_cl，F(xiàn)AD3-A3/fad3_a3-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A2/fad3_a2，F(xiàn)AD3-Cl/fad3_cl，F(xiàn)AD3-C2/fad3_c2-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A3/fad3_a3，F(xiàn)AD3-Cl/fad3_cl，F(xiàn)AD3-C2/fad3_c2-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A2/fad3_a2，F(xiàn)AD3-Cl/fad3_cl，fad3-a3/fad3-a3-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A2/fad3_a2，F(xiàn)AD3-Cl/fad3_cl，fad3-c2/fad3-c2-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A3/fad3_a3，F(xiàn)AD3-Cl/fad3_cl，fad3-c2/fad3-c2-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A2/fad3_a2，fad3-cl/fad3-cl, FAD3-A3/fad3_a3-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A2/fad3_a2，fad3-cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3_c2-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A3/fad3_a3，fad3-cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3_c2-FAD3-Al/fad3-al, fad2-a2/fad3-a2, FAD3-Cl/fad3_cl，F(xiàn)AD3-A3/fad3_a3-FAD3-Al/fad3-al, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-Cl/fad3_cl，F(xiàn)AD3-C2/fad3_c2-FAD3-Al/fad3-al, fad3-a3/fad3-a3, FAD3-Cl/fad3_cl，F(xiàn)AD3-C2/fad3_c2-fad3-al/fad3-al, FAD3-A2/fad3_a2，F(xiàn)AD3-Cl/fad3_cl，F(xiàn)AD3-A3/fad3_a3-fad3-al/fad3-al, FAD3-A2/fad3_a2，F(xiàn)AD3-Cl/fad3_cl，F(xiàn)AD3-C2/fad3_c2-fad3-al/fad3-al, FAD3-A3/fad3_a3，F(xiàn)AD3-Cl/fad3_cl，F(xiàn)AD3-C2/fad3_c2-fad3-al/fad3~al, FAD3-A2/fad3~a2, fad3-cl/fad3-cl, FAD3-A3/fad3~a3-fad3-al/fad3-al, FAD3-A2/fad3_a2，fad3-cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3_c2-fad3-al/fad3-al, FAD3-A3/fad3_a3，fad3-cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3_c2-fad3-al/fad3-al, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-Cl/fad3_cl，F(xiàn)AD3-A3/fad3_a3-fad3-al/fad3-al, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-Cl/fad3_cl，F(xiàn)AD3-C2/fad3_c2-fad3-al/fad3-al, fad3-a3/fad3-a3, FAD3-Cl/fad3_cl，F(xiàn)AD3-C2/fad3_c2-fad3-al/fad3-al, FAD3-A2/fad3_a2，F(xiàn)AD3-Cl/fad3_cl，fad3-a3/fad3-a3-fad3-al/fad3-al, FADD3-A3/fad3_a2，F(xiàn)AD3-Cl/fad3_cl，fad3-a3/fad3-c2-fad3-al/fad3-al, FAD3-A3/fad3_a3，F(xiàn)AD3-Cl/fad3_cl，fad3-c2/fad3-c2-FAD3-A/flad3-al, FAD3-A/fad3_a3，fad3-cl/fad3-cl, fad3-c3/fad3-a3-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A2/fad3_a2，fad3-cl/fad3-cl, fad3-c2/fad3-c2-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A3/fad3_a3，fad3-cl/fad3-cl, fad3-c2/fad3-c2-FAD3-Al/fad3-al, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-Cl/fad3_cl，fad3-a3/fad3-a3-FAD3-Al/fad3-al, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-Cl/fad3_cl，fad3-c2/fad3-c2-FAD3-Al/fad3-al, fad3-a3/fad3-a3, FAD3-Cl/fad3_cl，fad3-c2/fad3-c2-FAD3-A1/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, fad3-cl/fad3-cl, FAD3-A3/fad3~a3-FAD3-Al/fad3-al, fad3-a2/fad3-a2, fad3-cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3_c2-FAD3-Al/fad3-al, fad3-a3/fad3-a3, fad3-cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3_c2-FAD3-A1/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, fad3-cl/fad3-cl, fad3~a3/fad3~a3-FAD3-A1/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, fad3-cl/fad3-cl, fad3~c2/fad3~c2-FAD3-A1/fad3~al, fad3~a3/fad3~a3, fad3-cl/fad3-cl, fad3~c2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, FAD3-A2/fad3~a2, fad3-cl/fad3-cl, fad3~a3/fad3~a3-fad3-al/fad3~al, FAD3-A2/fad3~a2, fad3-cl/fad3-cl, fad3~c2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, FAD3-A3/fad3~a3, fad3-cl/fad3-cl, fad3~c2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, FAD3-C1/fad3-cl, fad3~a3/fad3~a3-fad3-al/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, FAD3-C1/fad3-cl, fad3~c2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, fad3~a3/fad3~a3, FAD3-C1/fad3-cl, fad3~c2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, fad3-cl/fad3-cl, FAD3-A3/fad3~a3 -fad3-al/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, fad3-cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, fad3~a3/fad3~a3, fad3-cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, fad3-cl/fad3-cl, fad3~a3/fad3~a3-fad3-al/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, fad3-cl/fad3-cl, fad3~c2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, fad3~a3/fad3~a3, fad3-cl/fad3-cl, fad3~c2/fad3~c2其中，該植物對于其余 FAD3 基因(例如 FAD3-Al/fad3-al、FAD3-A2/fad3-a2、FAD3-Cl/fad3-cl、FAD3-A3/fad3-a3 相應(yīng)于基因型 FAD3-Al/fad3_al、FAD3-A2/fad3_a2、FAD3-C1/fad3-cl、FAD3-A3/fad3-a3、FAD3-C2/FAD3-C2)的野生型等位基因是純合的。本發(fā)明還提供了一種植物，其進一步包含第五完全敲除型突變FAD3等位基因，其中所述第五完全敲除型突變FAD3等位基因是選自由FAD3-A2、FAD3-A3或FAD3-C2組成的組，由此該突變FAD3等位基因是至少五個不同F(xiàn)AD3基因的突變等位基因。因此，在另一個實施方案中提供了五突變植物，其對于該第一突變FAD3等位基因是雜合或純合的、對于該第二突變FAD3等位基因是雜合或純合的、該對于該第三突變FAD3等位基因是雜合或純合的、對于該第四突變FAD3等位基因是雜合或純合的，并且對于該第五突變FAD3等位基因的雜合或純合的，其中該植物的基因型可以被描述為(當該野生型等位基因被描述為FAD3時，該突變FAD3等位基因被縮寫為fad3)
-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, FAD3-Cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3-c2-fad3-al/fad3-al, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a2, FAD3-Cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3-c2-FAD3-Al/fad3-al, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, FAD3-Cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3-c2-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A2/fad3-a2, fad3-a3/fad3-a3, FAD3-Cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3-c2-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, fad3-cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3-c2-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, FAD3-Cl/fad3-cl, fad3-c2/fad3-c2-fad3al/fad3-al, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, FAD3~Cl/fad3_cl，F(xiàn)AD3~C2/fad3_c2-fad3al/fad3-al, FAD3-A2/fad3-a2, fad3-a3/fad3-a3, FAD3~Cl/fad3_cl，F(xiàn)AD3~C2/fad3_c2-fad3al/fad3-al, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, fad3-cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3-c2-fad3al/fad3-al, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, FAD3-Cl/fad3-cl, fad3-c2/fad3-c2-FAD3-Al/fad3-al, fad3-a2/fad3-a2, fad3-a3/fad3-a3, FAD3~Cl/fad3_cl，F(xiàn)AD3~C2/fad3_c2-FAD3-Al/fad3-al, fad3-a2/fa d3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, fad3-cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3-c2-FAD3-Al/fad3-al, fad3-a2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, FAD3-Cl/fad3-cl, fad3-c2/fad3-c2-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A2/fad3-a2, fad3-a3/fad3-a3, fad3-cl/fad3-cl, FAD3-C2/fad3-c2-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A2/fad3-a2, fad3-a3/fad3-a3, FAD3-Cl/fad3-cl, fad3-c2/fad3-c2-FAD3-Al/fad3-al, FAD3-A2/fad3-a2, FAD3-A3/fad3-a3, fad3-cl/fad3-cl, fad3-c2/fad3-c2-fad3-al/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, fad3~a3/fad3 ~a3, FAD3-C1/fad3-cl, FAD3-C2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, FAD3-A3/fad3~a3, FAD3-C1/fad3-cl, fad3~c2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, FAD3-A3/fad3~a3, fad3~c I/fad3~c I, FAD3-C2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, FAD3-A2/fad3~a2, fad3~a3/fad3~a3, fad3~c I/fad3~c I, FAD3-C2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, FAD3-A2/fad3~a2, fad3~a3/fad3~a3, FAD3-C1/fad3-cl, fad3~c2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, FAD3-A2/fad3~a2, FAD3-A3/fad3~a3, fad3~c I/fad3~c I, fad3~c2/fad3~c2-FAD3-A1/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, fad3~a3/fad3~a3, fad3~c I/fad3~c I, FAD3-C2/fad3~c2-FAD3-A1/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, fad3~a3/fad3~a3, FAD3-C1/fad3-cl, fad3~c2/fad3~c2-FAD3-A1/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, FAD3-A3/fad3~a3, fad3~c I/fad3~c I, fad3~c2/fad3~c2-FAD3-A1/fad3~al, FAD3-A2/fad3~a2, fad3~a3/fad3~a3, fad3~c I/fad3~c I, fad3~c2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, fad3~a3/fad3~a3, fad3~c I/fad3~c I, FAD3-C2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, daf3~a3/fad3~a3, FAD3-C1/fad3-cl, fad3~c2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, FAD3-A3/fad3~a3, fad3~c I/fad3~c I, fad3~c2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, FAD3-A2/fad3~a2, fad3~a3/fad3~a3, fad3~c I/fad3~c I, fad3~c2/fad3~c2-FAD3-A1/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, fad3~a3/fad3~a3, fad3~c I/fad3~c I, fad3~c2/fad3~c2-fad3-al/fad3~al, fad3~a2/fad3~a2, fad3~a3/fad3~a3, fad3~c I/fad3~c I, fad3~c2/fad3~c2在另一個實施方案中，本發(fā)明的這些植物包含突變FAD3等位基因，其包含一個無義(終止密碼子)突變。在另一個實施方案中，本發(fā)明的這些植物包含突變FAD3等位基因，其是選自由LOLI105, LOLI103, LOLI108, L0LI111 或 LOLI115 組成的組。如在此所使用的，LOLI105或LOLI105是一個FAD3-A1基因組序列的一個突變等位基因，其分別是SEQ ID N0:11或SEQ ID NO :2的編碼序列或氨基酸序列，其在SEQ ID NO:I核苷酸位置2405、在SEQ ID NO : 11核苷酸位置732或在SEQ ID NO :2氨基酸位置244包含一種突變，導致在SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :11中的密碼子TGG變?yōu)門GA或者在色氨酸SEQ ID NO : 2中的氨基酸變?yōu)榻K止。如在此所使用的，LOLI103或LOLI103是FAD3-C1基因組序列的一個突變等位基因，其分別是SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :12或SEQ ID NO :4的編碼序列或氨基酸序列，其在SEQ ID NO :3中的核苷酸位置2702、在SEQ ID NO : 12中核苷酸位置543或在SEQ ID NO 4中的氨基酸位置181包含一個突變，導致在SEQ ID NO :3或SEQ ID NO : 12中的密碼子TGG變?yōu)門GA變或者在SEQ ID NO 4中的氨基酸Trp變?yōu)榻K止(Trp to stop)。
如在此所使用的，LOLI108或LOLI108是FAD3-A2基因組序列的一個突變等位基因，其分別是SEQ ID NO :5、SEQ ID NO : 13或SEQ ID NO 6的編碼序列或氨基酸序列，其在SEQ ID NO 5中的核苷酸位置3934、在SEQ ID NO 13中的核苷酸位置749或在SEQ IDNO 6中的氨基酸位置250包含一個突變，導致在SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 13中的密碼子TGG變?yōu)門GA或者在SEQ ID NO :6中的氨基酸Trp變?yōu)榻K止。如在此所使用的，L0LI111或L0LI111是FAD3-A3基因組序列的一個突變等位基因，其分別是SEQ ID NO 7, SEQ ID N0:14或SEQ ID NO :8的編碼序列或氨基酸序列，其在SEQ ID NO 7中的核苷酸位置2847、在SEQ ID NO 14中的核苷酸位置552或在SEQ IDNO 8中的氨基酸位置184包含一個突變，導致在SEQ ID NO 7或SEQ ID NO 14中的密碼子TGG變?yōu)門GA或者在SEQ ID NO :8中的氨基酸Trp變?yōu)榻K止。如在此所使用的，LOLI115或L0LI115是FAD3-C2基因組序列的一個突變等位基因，分別是SEQ ID NO 9, SEQ ID N0:15或SEQ ID NO : 10的編碼序列或氨基酸序列，其在SEQ ID NO :9中的核苷酸位置3909、在SEQ ID NO : 15中的核苷酸位置551或在SEQ ID NO:10中的氨基酸位置184包含一個突變，導致在SEQ ID NO :9或SEQ ID NO: 15中的密碼子 TGG變?yōu)門GA或者在SEQ ID NO 10中的氨基酸Trp變?yōu)榻K止。在一個實施方案中，與不含本發(fā)明的突變FAD3等位基因的相應(yīng)植物產(chǎn)生的功能性FAD3蛋白的量相比，本發(fā)明的植物可以產(chǎn)生功能性FAD3蛋白的量的顯著降低。在另一個實施方案中，與不含突變FAD3等位基因的植物相比，該植物的種子可具有一個顯著降低的C18:3種子油含量。在此進一步提供了來自蕓苔屬種類的野生型和突變FAD3基因/等位基因的核酸序列、以及野生型和突變FAD3蛋白。還提供了在蕓苔屬植物中產(chǎn)生和結(jié)合突變與野生型FAD3等位基因的方法、以及在其基因組中包含野生型與突變FAD3等位基因的特定組合的蕓苔屬植物和植物部分，由此C18:3種子油含量降低。使用這些植物將突變FAD3等位基因轉(zhuǎn)移到其他植物也是本發(fā)明的一個實施方案，如所描述的任何植物的植物產(chǎn)物。另外提供了用于結(jié)合或檢測突變FAD3基因和/或等位基因的標記輔助選擇(MAS)的試劑盒和方法。下文詳細描述了本發(fā)明的每個實施方案。
根據(jù)本發(fā)明的核酸序列提供了編碼功能性FAD3蛋白的野生型FAD3核酸序列和來自十字花科(特別是來自蕓苔屬種類，尤其是來自甘藍型油菜，也可以是來自其他蕓苔屬作物種類)的FAD3基因的突變FAD3核酸序列(其包含一個或多個突變，優(yōu)選導致編碼的FAD3蛋白沒有生物活性或生物活性顯著降低、或者導致不產(chǎn)生FAD3蛋白的突變)。例如，包含一個基因組A和/或C的蕓苔屬種類可以包含F(xiàn)AD3基因的不同等位基因，其可以被鑒定并且結(jié)合在根據(jù)本發(fā)明的一個單株植物中。另外，可以采用誘變方法在野生型FAD3等位基因中產(chǎn)生突變，由此產(chǎn)生用于根據(jù)本發(fā)明的用途的突變FAD3等位基因。由于特定的FAD3等位基因優(yōu)選通過雜交和選擇結(jié)合在一種植物中，在一個實施方案中該FAD3核酸序列被提供在一種植物內(nèi)(即內(nèi)源地)，例如一種蕓苔屬植物，優(yōu)選一種可以與甘藍型油菜雜交或可以用來制造一種“合成的”甘藍型油菜植物的蕓苔屬植物。在本領(lǐng)域中描述了在不同蕓苔屬種類之間的雜交，例如，在 Snowdon(2007,Chromosome research 15 :85-95)中提到的。.種間雜交可以，例如，用于將基因從如甘藍型油菜中的基因組C(AACC)轉(zhuǎn)移到埃塞俄比亞芥中的基因組C(BBCC)中，甚至從如甘藍型油菜中的基因組C(AACC)轉(zhuǎn)移到芥菜型油菜的基因組B (AABB)中(通過在它們的基因組C和B之間的非常規(guī)重組的偶發(fā)事件)。通過雜交原始祖先，甘藍型油菜(CC)和白菜型油菜(AA)，可以產(chǎn)生“再合成的”或“合成的”甘藍型油菜品系。在蕓苔屬作物種類和其親緣植物之間的雜交，可以成功克服種間還有屬間的不親和性障礙，例如通過胚胎拯救技術(shù)或原生質(zhì)體融合(參見例如，Snowdon,見上文)。然而，在此還提供了分離的FAD3和FAD3核酸序列(例如，通過克隆從該植物中分離的或通過DNA合成來合成制備的)，以及在此提供了任何這些序列的變體及其片段，由于這些可以用來確定哪個序列在一種植物或植物部分中是內(nèi)源地存在的，無論該序列是否編碼一種功能性、非功能性的蛋白質(zhì)或不編碼蛋白質(zhì)(例如，通過在重組宿主細胞中表達，如在此所述)，以及用于選擇特定的等位基因并且將其從一個植物轉(zhuǎn)移到另一個植物中，以便產(chǎn)生一種具有所希望的組合的功能和突變等位基因的植物。已經(jīng)從甘藍型油菜中分離出FAD3等位基因的核酸序列，如在序列表中所述。關(guān)于野生型FAD3序列，描述了野生型FAD3序列，同時在下文和實施例中描述了這些序列的突變FAD3序列以及與這些基本相似的序列。編碼基因組FAD3蛋白的DNA、以及相應(yīng)的前-mRNA， 包含被7個內(nèi)含子(內(nèi)含子1-7，從5’端開始編號)中斷的8個外顯子(外顯子1-8，從5’端開始編號)。在該cDNA和相應(yīng)的加工的mRNA (即剪接的RNA)中，內(nèi)含子被去除并且外顯子被連接，如在序列表中所示。外顯子序列是在進化上更保守的，因此比內(nèi)含子序列更少變化。根據(jù)本發(fā)明的“FAD3-A1核酸序列”或“FAD3-A1變體核酸序列”是編碼與SEQ IDNO 2具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、98%、99%或100%的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或者與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :11具有至少80%、至少85 %、至少90 %、至少95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或100 %的序列一致性的核酸序列。這些核酸序列也可以被稱為與提供在序列表中的FAD3序列“基本相似”或“基本相同”。根據(jù)本發(fā)明的“FAD3-C1核酸序列”或“FAD3-C1變體核酸序列”是編碼與SEQ IDNO 4具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、98%、99%或100%的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或者與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :12具有至少80%、至少85 %、至少90 %、至少95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或100 %的序列一致性的核酸序列。這些核酸序列也可以被稱為與提供在序列表中的FAD3序列“基本相似”或“基本相同”。
根據(jù)本發(fā)明的“FAD3-A2核酸序列”或“FAD3-A2變體核酸序列”是編碼與SEQ IDNO 6具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、98%、99%或100%的序列一致性的氨基酸序列的核酸數(shù)列或者與SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :13具有至少80%、至少85 %、至少90 %、至少95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或100 %的序列一致性的核酸序列。這些核酸序列也可以被稱為與提供在序列表中的FAD3序列“基本相似”或“基本相同”。根據(jù)本發(fā)明的“FAD3-A3核酸序列”或“FAD3-A3變體核酸序列”是與SEQ ID NO 8具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、98%、99%或100%的序列一致性的氨基酸序列的核酸數(shù)列或者與SEQ ID NO :7或SEQ ID NO :14具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列一致性的核酸序列。這些核酸序列也可以被稱為與序列表中提供的該FAD3序列“基本相似”或“基本相同”。根據(jù)本發(fā)明的“FAD3-C2核酸序列”或“FAD3-C2變體核酸序列”是編碼與SEQ IDNO 10具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、98%、99%或100%的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列或者與SEQ ID NO :9或SEQ ID NO :15具有至少80%、至少85 %、至少90 %、至少95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或100 %的序列一致性的核酸序列。這些核酸序列也可以被稱為與提供在序列表中的FAD3序列“基本相似”或“基本相同”。因此，本發(fā)明提供了編碼野生型、功能性FAD3蛋白的核酸序列，包括其變體和片段(如下文進一步定義的)，以及任何這些序列的突變核酸序列，與野生型FAD3蛋白相比，該核酸序列中的突變優(yōu)選地導致一個或多個氨基酸插入、缺失或置換。如已經(jīng)提及的，優(yōu)選地，該核酸序列中的一個或多個突變導致一個或多個氨基酸變化(即相對于野生型氨基酸序列，插入、缺失或置換一個或多個氨基酸)，由此該FAD3蛋白的生物活性顯著降低或完全消除，或者由此表達顯著降低量的功能性FAD3蛋白或不表達功能性FAD3蛋白。該FAD3蛋白生物活性的顯著降低或完全消除在此是指結(jié)構(gòu)和/或功能上相關(guān)的氨基酸殘基或結(jié)構(gòu)域(例如C-端ER駐留基序)的缺失或者中斷，八種保守組氨酸的任何一種的缺失、置換或復位，和/或該信號序列的缺失或中斷，這樣使得與表達相應(yīng)野生型FAD3等位基因的一種植物相比，表達該突變FAD3等位基因的一種植物的C18:3種子油含量降低。
在此提供了內(nèi)源核酸序列和分離的核酸序列兩者。還提供了以上定義的FAD3序列和FAD3變體核酸序列的片段，用作引物或探針以及用作根據(jù)本發(fā)明的另一個方面的試劑盒的組分(見下文)。一個FAD3或FAD3核酸序列或其變體的一個“片段”(如定義的)可以具有不同的長度，例如該FAD3編碼序列(或其變體序列)的至少10、20、50、100、200、500、1000、1100個連續(xù)的核苷酸，或者例如該FAD3基因組序列(或其變體序列)的至少10、20、50、100、200、500、1000、2000、2900 個連續(xù)的核苷酸。
編碼功能性FAD3蛋白的核酸序列描述于序列表中的核酸序列編碼來自甘藍型油菜的野生型、功能性FAD3蛋白。因此，這些序列對于它們自其分離的甘藍型油菜植物來說是內(nèi)源性的?？梢葬槍ζ渌腇AD3等位基因?qū)ζ渌|苔屬作物種類、品種、育種品系或野生登記物(wild accession)進行篩選，這些基因編碼相同的FAD3蛋白或其變體。例如，可以使用核酸雜交技術(shù)(例如使用嚴緊雜交條件的Southern印跡)或基于PCR的技術(shù)來鑒定對于其他蕓苔屬植物(例如不同的甘藍型油菜品種、品系或登記物)的內(nèi)源FAD3等位基因，而且還可以針對其他的野生型FAD3等位基因?qū)λj菜型油菜(特別是在基因組A上的FAD3等位基因)、埃塞俄比亞芥(特別是在基因組C上的FAD3等位基因)和白菜型油菜(基因組A)和甘藍(基因組C)植物、器官或組織進行篩選。同樣，也可以針對基因組B上的FAD3等位基因?qū)诮?基因組B)、埃塞俄比亞芥(基因組B和C)和芥菜型油菜(基因組A和B)植物、器官或組織進行篩選。為了針對FAD3等位基因的存在對這些植物、植物器官或組織進行篩選，可以使用提供在序列表中的FAD3核酸序列，或任何這些序列的變體或片段。例如可以使用完整序列或片段作為探針或引物。例如可以使用特異性或簡并引物從植物、植物器官或組織的基因組DNA或cDNA來擴增編碼FAD3蛋白的核酸序列?？梢允褂脴藴史肿由飳W技術(shù)分離這些FAD3核酸序列并將其測序。然后，可以使用生物信息學分析來表征一個或多個等位基因，例如為了確定該序列對應(yīng)哪種FAD3等位基因、以及該序列編碼哪種FAD3蛋白或蛋白質(zhì)變體?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)分析一個核酸序列是否編碼一種功能性FAD3蛋白，例如，通過一種遺傳互補試驗(使用例如對于完全敲除型FAD3是純合的一種擬南芥屬植物)、或者通過如上所述的方法。此外，可以理解的是，通過在核酸數(shù)據(jù)庫中篩選基本相似的序列，可以用電腦(inSilico)鑒定FAD3核酸序列及其變體(或任何這些序列的片段)。同樣，可以化學合成核酸序列。還提供了根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的片段，將在下文中進一步描述。
編碼突變FAD3蛋白的核酸序列相對于這些野生型核酸序列，包含一個或多個核苷酸缺失、插入或置換的核酸序列是本發(fā)明的另一個實施方案(同樣地這些突變核酸分子的片段也是)。如下文進一步描述的，可以使用多種已知的方法產(chǎn)生和/或鑒定這些突變核酸序列(稱為fad3序列)。此夕卜，以內(nèi)源形式和分離的形式兩者提供了這些核酸分子。在一個實施方案中，一個或多個突變導致所編碼的FAD3蛋白的氨基酸序列中的一個或多個變化(缺失、插入和/或置換)(即，其不是一個“沉默突變”)。在另一個實施方案中，核酸序列中的一個或多個突變導致所編碼的FAD3蛋白的生物活性顯著降低或完全消失(相對于野生型蛋白質(zhì))。
因此，這些核酸分子可以包含一個或多個突變，例如如上已經(jīng)詳細描述的錯義突變、無義突變或“終止”密碼子突變、插入或缺失突變、移碼突變和/或剪接位點突變。如已經(jīng)提及的，所希望的是，核酸序列中的一個或多個突變優(yōu)選地導致在細胞體內(nèi)顯著降低量的功能性FAD3蛋白或沒有功能性FAD3蛋白。根本而言，相對于野生型蛋白質(zhì)，導致一個包含至少一個氨基酸插入、缺失和/或置換的蛋白質(zhì)的任何突變都可以導致顯著降低的生物活性或沒有生物活性。然而，可以理解的是，在蛋白質(zhì)的某些部分的突變更可能導致該突變FAD3蛋白的功能降低，例如導致截短的蛋白質(zhì)的突變，由此缺失或取代了該功能性氨基酸殘基或結(jié)構(gòu)域的重要部分，例如ER駐留信號、八個保守組氨酸殘基或信號序列。因此，在一個實施方案中，提供了包含一個或多個上述任何突變類型的核酸序列。在另一個實施方案中，提供了包含一個或多個終止密碼子(無義)突變的fad3序列。提供了任何上述突變核酸序列本身(以分離的形式)，如內(nèi)源地包含這些序列的植物和植物部分。在下文的表2中描述了最優(yōu)選的fad3等位基因。如在此所使用的，在FAD3等位基因中的一個無義突變是在FAD3等位基因中的這樣一個突變，由此一個或多個翻譯終止密碼子被引入到相應(yīng)的野生型FAD3等位基因的編碼DNA和相應(yīng)的mRNA序列中。翻譯終止密碼子是TGA (在mRNA中是UGA)、TAA (UAA)和TAG(UAG)。因此，導致在該編碼序列中產(chǎn)生一個框內(nèi)終止密碼子的任何突變(缺失、插入或置換)將導致翻譯的終止和氨基酸鏈的截短。在一個實施方案中，包含一個無義突變的一個突變FAD3等位基因是這樣的FAD3等位基因，其中一個框內(nèi)終止密碼子通過單核苷酸置換(例如LOLI103, LOLI105, LOLI108, LOLI111和LOLI115)而被引入到該FAD3密碼子序列中。在另一個實施方案中，包含一個無義突變的一個突變FAD3等位基因是這樣的FAD3等位基因，其中一個框內(nèi)終止密碼子通過雙核苷酸置換而引入到該FAD3編碼序列中。在另一個實施方案中，包含一個無義突變的一個突變FAD3等位基因是這樣的FAD3等位基因，其中一個框內(nèi)終止密碼子通過三核苷酸置換而被引入到該FAD3編碼序列中。該截短的蛋白質(zhì)缺乏由該突變的編碼DNA下游(3’)所編碼的氨基酸(即，該FAD3蛋白的C-端部分)，并保留了由該突變的編碼DNA上游(5，)所編碼的氨基酸(即，該FAD3蛋白的N-端部分)。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含一個無義突變的突變FAD3等位基因，該突變FAD3等位基因是這樣的FAD3等位基因，其中該無義突變存在于編碼ER駐留基序(SEQ ID NO : 11的核苷酸1117-1131)的核苷酸的上游或包括該核苷酸的任何地方，因此至少缺乏賴氨酸375和/或賴氨酸373，或其同源殘基。與野生型FAD3蛋白相比，該突變FAD3蛋白截短得越多，則該截短越有可能導致該FAD3蛋白在體內(nèi)的功能性顯著降低或無功能性。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一個突變FAD3等位基因，其包含SEQ ID NO :11的核苷酸895-897、核苷酸892-894或核苷酸883-885的上游(或包括SEQ ID NO : 11的核苷酸895-897、核苷酸892-894或核苷酸883-885)的一個無義突變即，導致少于SEQ ID NO 2的大約299、298或295個氨基酸的截短的蛋白質(zhì)(缺乏第三組氨酸簇的第八、第七和/或第六保守組氨酸)。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一個突變FAD3等位基因，其包含SEQ ID NO : 11的核苷酸394-396、核苷酸391-393或核苷酸382-384上游(或包括SEQ ID NO : 11的核苷酸394-396、核苷酸391-393或核苷酸382-384)的一個無義突變，即導致少于SEQ ID NO :2的大約131、130或128個氨基酸的截短的蛋白質(zhì)(缺乏第二組氨酸簇的第五、第四和/或第三保守組氨酸)。 仍然在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一個突變FAD3等位基因，其包含SEQ ID N0:11的核苷酸286-288或核苷酸274-276上游(或包括SEQ ID NO 11的核苷酸286-288或核苷酸274-276)的一個無義突變，即導致少于SEQ ID NO 2的大約96或92個氨基酸的截短的蛋白質(zhì)(缺乏第一組氨酸簇的第二和/或第一第六保守組氨酸)。如已經(jīng)提及的，可以通過確定最佳比對來鑒定在其他FAD3核酸序列和FAD3氨基酸序列中的相應(yīng)區(qū)域或殘基。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含一個無義突變的突變FAD3等位基因，該無義突變導致使用一個可替代的ATG作為起始密碼子以及合成缺乏推定信號序列的N-端截短的蛋白質(zhì)。如在此所使用的，一個FAD3等位基因的錯義突變是在FAD3等位基因中的任何突變(缺失、插入或置換)，其中一個或多個密碼子改變成相應(yīng)野生型FAD3等位基因的編碼DNA和相應(yīng)的mRNA序列，導致該野生型FAD3蛋白中的一個或多個氨基酸被置換成該突變FAD3蛋白中的一個或多個其他氨基酸。在一個實施方案中，包含一個錯義突變的突變FAD3等位基因是一個這樣的FAD3等位基因，其中該ER駐留基序的一個或多個氨基酸，即殘基373-377，特別是FAD3-A1的賴氨酸373和/或375或其同源殘基被取代。這些突變將引起ER定位的喪失。導致八個保守的結(jié)合二鐵的組氨酸殘基的一個或多個置換的錯義突變也將導致蛋白質(zhì)功能的完全喪失。此外，由于其ER定位的喪失，導致N-端信號序列中的氨基酸的置換的錯義突變有可能導致一種非功能性酶。如在此所使用的，在FAD3等位基因中的一個移碼突變是在FAD3等位基因中的這樣的突變(缺失、插入、復制等等)，其導致該核酸序列在該突變的一個不同的框的下游被翻譯，該突變引起體內(nèi)顯著降低量的功能性FAD3酶或不產(chǎn)生功能性FAD3酶。在FAD3等位基因中的一個剪接位點突變是一個這樣的突變，其導致前mRNA的異常剪接，由此導致具有顯著降低的活性或沒有活性的突變蛋白質(zhì)。改變前mRNA剪接并由此導致體內(nèi)顯著降低量的功能性FAD3酶或不產(chǎn)生功能性FAD3酶的任何突變(一個或多個核苷酸的插入、缺失和/或置換)包含在此。在一個實施方案中，包含一個剪接位點突變的突變FAD3等位基因是這樣的FAD3等位基因，其中改變的剪接是通過在該FAD3轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域中引入5’剪接位點或3’剪接位點的共有二核苷酸的一個或多個核苷酸置換導致的，如上所述。例如，GU可以例如在該供體剪接位點中突變?yōu)锳U和/或AG可以在該受體剪接位點序列中突變?yōu)锳A。
根據(jù)本發(fā)明的氨基酸序列提供了野生型(功能性)FAD3氨基酸序列、以及來自十字花科的尤其是來自蕓苔屬種類，特別是來自甘藍型油菜(但也可以來自其他蕓苔屬作物種類)的突變FAD3氨基酸序列(包括一個或多個突變，優(yōu)選導致體內(nèi)顯著降低量的功能性FAD3酶或不產(chǎn)生功能性FAD3酶的突變)。例如，包含基因組A和/或C的蕓苔屬種類可以編碼不同的FAD3氨基酸。此外，可以使用誘變方法在野生型FAD3等位基因中產(chǎn)生突變，從而產(chǎn)生可以編碼其他突變FAD3蛋白的突變等位基因。在一個實施方案中，提供了在一種蕓苔屬植物中(即內(nèi)源)的野生型和/或突變FAD3氨基酸序列。然而，在此還提供了分離的FAD3氨基酸序列(例如從該植物中分離的或人工合成的)、及其變體以及任何這些序列的片段。已經(jīng)從分離自甘藍型油菜的基因組DNA FDA3序列中推導出FAD3蛋白的氨基酸序、列，如在序列表中所描述。關(guān)于該野生型FDA3序列，描述了這些野生型FAD3序列，而在下文描述了這些序列的突變FDA3序列以及與這些序列基本類似的序列。在此描述的蕓苔屬的這些FAD3蛋白的長度為377至378個氨基酸，并且包含許多結(jié)構(gòu)性和功能性結(jié)構(gòu)域以及氨基酸殘基，如上所述。根據(jù)本發(fā)明的“FAD3-A1氨基酸序列”或“FAD3-A1變體氨基酸序列”是與SEQ IDNO 2具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、98%、99%或100%序列一致性的氨基酸序列。這些氨基酸序列還可以被稱為與提供在該序列表中的這些FAD3序列“基本相似”或“基本相同”。根據(jù)本發(fā)明的“FAD3-C1氨基酸序列”或“FAD3-C1變體氨基酸序列”是與SEQ IDNO 4具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、98%、99%或100%序列一致性的氨基酸序列。這些氨基酸序列也可以被稱為與提供在該序列表中的這些FAD3序列“基本相似”或“基本相同”。根據(jù)本發(fā)明的“FAD3-A2氨基酸序列”或“FAD3-A2變體氨基酸序列”是與SEQ IDNO 6具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、98%、99%或100%序列一致性的氨基酸序列。這些氨基酸序列還可以被稱為與提供在該序列表中的這些FAD3序列“基本相似”或“基本相同”。根據(jù)本發(fā)明的“FAD3-A3氨基酸序列”或“FAD3-A3變體氨基酸序列”是與SEQ IDNO 8具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、98%、99%或100%序列一致性的氨基酸序列。這些氨基酸序列還可以被稱為與提供在該序列表中的這些FAD3序列“基本相似”或“基本相同”。根據(jù)本發(fā)明的“FAD3-C2氨基酸序列”或“FAD3-C2變體氨基酸序列”是與SEQ IDNO 10具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、98%、99%或100%序列一致性的氨基酸序列。這些氨基酸序列還可以被稱為與提供在該序列表中的這些FAD3序列“基本相似”或“基本相同”。因此，本發(fā)明提供了野生型、功能性FAD3蛋白的氨基酸序列兩者，包括其變體和片段(如下文進一步定義的)，還提供了任何這些序列的突變氨基酸序列，與相應(yīng)的野生型FAD3蛋白的生物活性相比，由此氨基酸序列中的突變優(yōu)選地導致該FAD3蛋白的生物活性顯著降低或完全消除。FAD3蛋白的生物活性的顯著降低或完全消除在此是指C18:2轉(zhuǎn)化為C18:3的顯著降低，這樣，相比于表達相應(yīng)的野生型FAD3蛋白的一種植物，表達該突變FAD3蛋白的一種植物的種子油具有降低的C18:3含量。在此提供了內(nèi)源性氨基酸序列和分離的氨基酸序列兩者。還提供了以上定義的FAD3氨基酸序列和FAD3變體氨基酸序列的片段。一個FAD3氨基酸序列或其變體(如定義的)的一個“片段”可以具有不同的長度，例如該FAD3序列的(或其變體序列的)至少10、
12、15、18、20、50、100、150、200、250、300、350 或 370 個連續(xù)的氨基酸。
功能性FAD3蛋白的氨基酸序列序列表中描述的氨基酸序列是源自甘藍型油菜的野生型、功能性FAD3蛋白。因此，這些序列對于分離它們的甘藍型油菜植物是內(nèi)源的?？梢葬槍哂邢嗤被嵝蛄械?其他的功能性FAD3蛋白或其變體對其他的蕓苔屬作物種類、品種、育種品系或野生登記物進行篩選，如上所述。此外，可以理解的是，通過在氨基酸數(shù)據(jù)庫中篩選基本相似的序列，可以用電腦(in silico)鑒定FAD3氨基酸序列及其變體(或任何這些序列的片段)。還提供了根據(jù)本發(fā)明的氨基酸分子的片段。
突變FAD3蛋白的氨基酸序列相對于野生型氨基酸序列，包含一個或多個氨基酸缺失、插入或置換的氨基酸序列是本發(fā)明的另一個實施方案(這些突變氨基酸分子的片段也是)。如上所述，可以使用多種已知的方法產(chǎn)生和/或鑒定這些突變氨基酸序列。此外，以內(nèi)源形式和分離的形式提供了這些氨基酸分子。在一個實施方案中，該氨基酸序列中的一個或多個突變導致該FAD3蛋白的生物活性顯著降低或完全消除(相對于野生型蛋白質(zhì))。如上所述，基本上導致包含至少一個氨基酸插入、缺失和/或置換的蛋白質(zhì)的任何突變(相對于野生型蛋白質(zhì))可以導致顯著降低的生物活性或沒有生物活性。然而，可以理解的是，在該蛋白質(zhì)的某些部分中的突變更有可能導致該突變FAD3蛋白的功能降低，例如導致截短的蛋白質(zhì)的突變，由此缺失或取代了功能性和/或結(jié)構(gòu)性氨基酸殘基或結(jié)構(gòu)域的重要部分，例如ER駐留信號、八個保守氨基酸殘基或信號序列，如上所述。因此在一個實施方案中，提供了包含一個或多個缺失或插入突變的突變FAD3蛋白，由此該一個或多個缺失、一個或多個插入或置換導致在體內(nèi)具有顯著降低的活性或沒有活性的突變蛋白。這些突變FAD3蛋白是這樣的FAD3蛋白，其中與野生型蛋白相比，缺失、插入或置換了至少 I、至少 2、3、4、5、10、20、30、50、100、150、200、250、300、350、370 或更多個氨基酸，由此該一個或多個缺失或一個或多個插入導致在體內(nèi)具有顯著降低的活性或沒有活性的突變蛋白。在另一個實施方案中，提供了截短的突變FAD3蛋白，由此該截短導致一個在體內(nèi)具有顯著降低或沒有活性的突變蛋白。該截短的蛋白質(zhì)缺乏由該突變的編碼DNA下游(3’)(SP，該FAD3蛋白的C-端部分)編碼的氨基酸，并且保留了由該突變的編碼DNA上游(5，)(即該FAD3蛋白的N-端部分)編碼的氨基酸。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種截短的FAD3蛋白，其包含相應(yīng)野生型FAD3蛋白的N-端部分，直到但不(完全)包括該ER駐留基序，即相應(yīng)于SEQ ID NO 2的第375位和/或第373位賴氨酸殘基的上游的任何地方，這樣至少缺乏賴氨酸375和/或賴氨酸373(或其他FAD3蛋白中的相應(yīng)賴氨酸殘基)。與野生型FAD3蛋白相比，該突變FAD3蛋白被截短得越多，則該截短越有可能導致在體內(nèi)FAD3蛋白活性的顯著降低或沒有活性。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種截短的蛋白質(zhì)，其含有少于SEQ ID NO :2或其同源殘基的大約299、298或295個氨基酸(缺乏第三組氨酸簇的第八、第七和/或第六保守組氨酸)，少于大約131、130或128個氨基酸(缺乏第二組氨酸簇的第五、第四和/或第三第六保守組氨酸)，少于大約96或92個氨基酸(缺乏第一組氨酸簇的第二和/或第一第六保守組氨酸)。仍然在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種缺乏該推定信號序列的N-端截短的蛋白質(zhì)。在另一個實施方案中，提供了包含一個或多個置換突變的突變FAD3蛋白，由此該置換導致在體內(nèi)具有顯著降低的活性或無活性的突變蛋白。這些突變FAD3蛋白是這樣的FAD3蛋白，由此置換了具有特定功能(例如ER靶向或駐留或鐵結(jié)合)的保守氨基酸殘基。在一個實施方案中，提供了一種突變FAD3蛋白，其中置換了該ER駐留基序或其同源殘基的一個或多個氨基酸，即SEQ ID NO :2的殘基373-377，特別是賴氨酸373和/或375。這些突變將導致ER定位的喪失。還提供了突變FAD3蛋白，其具有八個保守組氨酸殘基的一個或多個的置換，這種置換將導致蛋白質(zhì)功能的完全喪失。此外，提供了突變FAD3蛋白，其具 有在N-端信號序列中的一個或多個氨基酸的一個或多個置換。由于初始ER靶向的喪失，這些置換可能導致一種非功能性FAD3蛋白。仍然在另一個實施方案中，提供了突變FAD3蛋白，其包含一個或多個插入或缺失突變，其中該一個或多個插入和/或一個或多個缺失導致在體內(nèi)具有顯著降低的活性或無活性的突變蛋白。這些突變FAD3蛋白是這樣的FAD3蛋白，由此已經(jīng)改變了具有一個特定功能的在保守氨基酸殘基之間的定位。在一個實施方案中，提供了一種突變FAD3蛋白，其中在八個保守組氨酸的任何一個與推定跨膜結(jié)構(gòu)域之間已經(jīng)插入了一個或多個氨基酸。在另一個實施方案中，提供了一種突變FAD3蛋白，其中在八個保守組氨酸的任何一個與該推定跨膜結(jié)構(gòu)域之間已經(jīng)缺失了一個或多個氨基酸。這些突變可能導致該FAD3蛋白的一種改變的結(jié)構(gòu)，并且可能導致其功能的喪失。
根據(jù)本發(fā)明的方法利用本領(lǐng)域常規(guī)的一系列方法，可以產(chǎn)生(例如通過誘變產(chǎn)生)和/或鑒定突變FAD3等位基因，例如采用基于PCR的方法來擴增部分或全部FAD3基因組或cDNA。誘變之后，采用已知技術(shù)，從處理的種子生長出、或從處理的細胞再生出植物。例如，可以根據(jù)常規(guī)的生長步驟種植誘變的種子，并且在自花授粉后，在該植物上形成種子?？商娲兀梢詮奶幚淼男℃咦踊蚧ǚ奂毎刑崛‰p單倍體小植物，立即形成純合植物，例如 Coventry 等人描述的(1988, Manual for Microspore Culture Technique forBrassica napus. Dep. Crop Sci. Techn. Bull. OAC Publication 0489. Univ. of Guelph，Guelph，安大略省，加拿大)?？梢允斋@在這一代或下一代作為此類自花授粉的結(jié)果所形成的另外的種子，并篩選突變FAD3等位基因的存在，使用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，例如基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的技術(shù)(擴增該FAD3等位基因)或基于雜交的技術(shù)(例如Southern印跡分析、BAC庫篩選等)、和/或FAD3等位基因的直接測序。為了在突變FAD3等位基因中篩選點突變(所謂的單核苷酸多態(tài)性或SNP)的存在，可以使用本領(lǐng)域常規(guī)的SNP檢測方法，例如基于寡核苷酸連接(oligoligation)的技術(shù)、基于單堿基延伸的技術(shù)(如焦磷酸測序(pyrosequencing))、或基于限制酶切位點的差異的技術(shù)(如TILLING)。如上所述，特定野生型FAD3等位基因的誘變(自發(fā)的和誘導的)導致在生成的突變FAD3等位基因中存在一個或多個缺失、插入或置換的核苷酸(在下文中稱為“突變區(qū)”)。因此，可以通過該野生型FAD3等位基因中的一個或多個缺失、插入或置換的核苷酸的位置和構(gòu)型來表征突變FAD3等位基因。在該野生型FAD3等位基因中分別被一個或多個核苷酸插入、缺失或取代的位點再次也被稱為“突變區(qū)或序列”。在此使用的“5’或3’側(cè)翼區(qū)或序列”指在該突變(或相應(yīng)的野生型)FAD3等位基因中的一個DNA區(qū)域或序列，所述DNA區(qū)域或序列是至少20bp、優(yōu)選地至少50bp、至少750bp、至少1500bp和多達5000bp的DNA(該DNA與含有一個或多個缺失、插入或置換的核苷酸的DNA不同)，優(yōu)選地，該DNA來自該突變(或相應(yīng)的野生型)FAD3等位基因，其剛好位于該突變FAD3等位基因(或相應(yīng)的野生型FAD3等位基因)突變區(qū)的上游并且與之相鄰(5，側(cè)翼區(qū)或序列)，或者剛好位于所述突變區(qū)的下游并且與之相鄰(3’側(cè)翼區(qū)或序列)。在此使用的一個“連接區(qū)”是指在該突變(或相應(yīng)的野生型)FAD3等位基因中的一個DNA區(qū)域，在該DNA區(qū)域中，該突變區(qū)和該5’或3’側(cè)翼區(qū)相互連接。因此，一個跨越在該突變區(qū)和該5’或3’側(cè)翼區(qū)之間的連接區(qū)的序列包含一個突變序列以及與其鄰近的側(cè)翼序列。與相應(yīng)的野生型FAD3等位基因的基因組特征相比，基于特定突變FAD3等位基因的特定基因組特征，例如，包含突變區(qū)的基因組區(qū)域的特定限制性酶切圖譜、分子標記、或者側(cè)翼和/或突變區(qū)的序列，開發(fā)了多種工具，以鑒定一種特定突變FAD3等位基因或者包含該特定突變FAD3等位基因的植物或植物材料、或者包括含有該特定突變FAD3等位基因的植物材料的產(chǎn)品。一旦對一種特定突變FAD3等位基因進行了測序，就可以通過一種分子生物學技術(shù)開發(fā)引物和探針，所述引物和探針特異性識別樣品核酸(DNA或RNA)中的在該突變FAD3等位基因的5’側(cè)翼、3’側(cè)翼和/或突變區(qū)之內(nèi)的一個序列。例如，可以開發(fā)用來鑒定在生物樣品(例如植物、植物材料或包含植物材料的產(chǎn)品的樣品)中的該突變FAD3等位基因的PCR方法。這樣的PCR是基于至少兩種特異性“引物”(I)分別是一種識別該突變FAD3等位基因的5’或3’側(cè)翼區(qū)中的一個序列，另一種識別該突變FAD3等位基因的3’或5’側(cè)翼區(qū)中的一個序列；或者(2) —種識別該突變FAD3等位基因的5’或3’側(cè)翼區(qū)中的一個序列，另一種識別該突變FAD3等位基因的突變區(qū)中的一個序列；或者(3)分別是一種識別該突變FAD3等位基因的5’或3’側(cè)翼區(qū)中的一個序列，另一種識別跨越該特定突變FAD3等位基因的3’或5’側(cè)翼區(qū)與突變區(qū)之間的連接區(qū)的一個序列(如下所述)。這些引物優(yōu)選具有一個在15至35個核苷酸之間的序列，其在優(yōu)化的PCR條件下“特異性識別”特定突變FAD3等位基因的在5’或3’側(cè)翼區(qū)中的一個序列、在該突變區(qū)中的一個序列、或跨越3’或5’側(cè)翼區(qū)與突變區(qū)之間的連接區(qū)的一個序列，以便從包含該特定突變FAD3等位基因的核酸樣品中擴增一個特定片段(“突變FAD3特異性片段”或區(qū)分性擴增子)。這表示在優(yōu)化的PCR條件下在植物基因組中僅有靶向的突變FAD3等位基因而沒有其他序列被擴增。適合于本發(fā)明的PCR引物可以是以下各項
-長度范圍在17nt至大約200nt的寡核苷酸，其包含選自特定突變FAD3等位基因的5’或3’側(cè)翼序列或其互補序列(即，例如，在本發(fā)明的突變FAD3等位基因中的一個或多個核苷酸缺失、插入或置換的5’或3’側(cè)翼的序列，例如在上述無義、錯義、插入、缺失、移碼或剪接位點突變的5’或3’側(cè)翼的序列或其互補序列)的至少17個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選20個連續(xù)核苷酸的一個核苷酸序列(識別5’側(cè)翼序列的引物)；或
-長度范圍在17nt至大約200nt的寡核苷酸，其包含選自特定突變FAD3等位基因的突變區(qū)的一個至少17個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列或其互補序列(即，例如，在本發(fā)明的FAD3基因中插入或置換的核苷酸的序列或其互補序列)(識別突變序列的引物)。當然這些引物可以比提及的17個連續(xù)核苷酸長，并且可以是例如18、19、20、21、30、35、50、75、100、150、200個nt長或甚至更長。這些引物可以完全由選自所提及的側(cè)翼和突變序列的核苷酸序列組成。然而，這些引物在其5’末端的核苷酸序列(即在3’定位的17個連續(xù)核苷酸外側(cè))是較不關(guān)鍵的。因此，這些引物的5’序列可以由一個選自側(cè)翼或突變序列的核苷酸序列組成，但是在適當情況下可以含有若干個(例如1、2、5、10個)錯配。這些引物的5’序列甚至可以完全由一個與該側(cè)翼或突變序列無關(guān)的核苷酸序列組成， 例如像代表限制酶識別位點的核苷酸序列。這樣的無關(guān)序列或具有錯配的側(cè)翼DNA序列優(yōu)選地應(yīng)當不長于100個，更優(yōu)選地不長于50個或甚至25個核苷酸。此外，適合的引物可以包含一個跨越在側(cè)翼與突變序列之間的連接區(qū)的核苷酸序列或者由其組成(即，例如，在本發(fā)明的該突變FAD3等位基因中的一個或多個缺失、插入或置換的核苷酸的5’或3’側(cè)翼的序列與一個或多個插入或置換的核苷酸的序列或分別在一個或多個缺失的核苷酸的3’或5’側(cè)翼的序列之間的連接區(qū)，例如，在本發(fā)明上述FAD3基因中的無義、錯義、插入、缺失、譯碼或剪接位點突變5’或3’側(cè)翼的序列與無義、錯義或移碼突變的序列之間的連接區(qū)，或者在以上指出的潛在終止密碼子突變或以上指出的置換突變的5’或3’側(cè)翼的序列與該潛在終止密碼子突變或該置換突變的序列之間的連接區(qū))，條件是該核苷酸序列不是專一地源自該突變區(qū)或側(cè)翼區(qū)。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員立即清楚的是，適當選取的PCR引物對還應(yīng)當不包含彼此互補的序列。出于本發(fā)明的目的，“SEQ ID No :X代表的核苷酸序列的互補序列”是這樣的核苷酸序列，其可以根據(jù)查加夫法貝1J (Chargaff ’ s rule) ( A*^T；Cj4- C )通過用其互補的核苷酸來取代該核苷酸，并以5’至3’方向閱讀該序列(即，與所代表的核苷酸序列相反的方向)而源自所代表的核苷酸序列。適合于鑒定特定突變FAD3等位基因的引物的例子描述于實施例中。如在此所使用的，“從位置X到位置Y的核苷酸序列SEQ ID No. Z”表示包括兩個核苷酸端點的核苷酸序列。優(yōu)選地，該擴增的片段具有在50至1000個核苷酸之間的一個長度，例如在50至500個核苷酸之間的一個長度，或在100至350個核苷酸之間的一個長度。特異性引物可以具有一個與特定突變FAD3等位基因的5’或3’側(cè)翼區(qū)中的一個序列、突變區(qū)中的一個序列或跨越3’或5’側(cè)翼與突變區(qū)之間的連接區(qū)的一個序列具有80至100%同一性的序列，條件是這些錯配仍然允許用這些引物在優(yōu)化的PCR條件下特異性地鑒定該特定突變FAD3等位基因。然而，通過實驗可以容易確定可允許的錯配范圍，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。“突變FAD3特異性片段”的檢測和/或鑒定可以存在多種方法，例如，通過在凝膠或毛細管電泳之后的大小評估、或者通過基于熒光的檢測方法。還可以對突變FAD3特異性片段直接測序。用于檢測擴增DNA片段的其他序列特異性方法也是本領(lǐng)域已知的。本領(lǐng)域描述了標準的PCR實驗方案，例如“PCR應(yīng)用手冊”(Roche MolecularBiochemicals，第2版，1999)和其他參考文獻。對于各個特定突變FAD3等位基因，在“PCR鑒定實驗方案”中詳細說明了優(yōu)化的PCR條件，包括特異性引物的序列。然而，應(yīng)當理解的是，可能需要將PCR鑒定實驗方案中的多個參數(shù)調(diào)整到特定的實驗室條件，并且可以略加修改以獲得相似的結(jié)果。例如，使用不同的制備DNA的方法可能需要調(diào)整例如所使用的引物的量、聚合酶、氯化鎂(MgCl2)濃度或退火條件。同樣，其他引物的選擇可以指定用于PCR鑒定實驗方案的其他優(yōu)化條件。然而，這些調(diào)整對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是清楚的，并且進一步詳述在當前的PCR應(yīng)用手冊中，例如上文所引用的?？商娲兀梢允褂锰禺愋砸飦頂U增突變FAD3特異性片段，所述片段可以用作“特異性探針”，用于鑒定在生物樣品中的特定突變FAD3等位基因。在允許該探針和該核酸中的相應(yīng)片段的雜交的條件下，使生物樣品的核酸與該探針接觸，導致形成一種核酸/探 針雜交體?？梢詸z測這種雜交體的形成(例如，該核酸或探針的標記)，由此該雜交體的形成指示特定突變FAD3等位基因的存在。本領(lǐng)域中已經(jīng)描述了這樣的基于與一種特異性探針雜交(在一種固相載體上或在溶液中)的鑒定方法。該特異性探針優(yōu)選是這樣的序列，其在優(yōu)化的條件下與該特定突變FAD3等位基因的5’或3’側(cè)翼區(qū)之內(nèi)和/或突變區(qū)之內(nèi)的一個區(qū)域(在下文中稱為“突變FAD3特定區(qū)域”)特異性地雜交。優(yōu)選地，該特異性探針包含在10至IOOObp之間、在50至600bp之間、在100至500bp之間、在150至350bp之間的一個序列，其與一個特定區(qū)域的核苷酸序列至少80%，優(yōu)選在80%至85%之間，更優(yōu)選在85 %至90 %之間，特別優(yōu)選在90 %至95 %之間，最優(yōu)選在95 %至100 %之間是一致的(或互補的)。優(yōu)選地，該特異性探針將包含一個大約13至大約100個連續(xù)的核苷酸的序列，所述核苷酸序列與該特定突變FAD3等位基因的一個特定區(qū)域是一致的(或互補的)。適合于本發(fā)明的特異性探針可以是以下各項
-長度范圍在13nt至大約IOOOnt的寡核苷酸，其包含選自特定突變FAD3等位基因的5’或3’側(cè)翼序列的至少13個連續(xù)核苷酸的一個核苷酸序列或其互補序列(即，例如，在本發(fā)明的突變FAD3等位基因中的一個或多個缺失、插入或置換的核苷酸的5’或3’側(cè)翼的序列，例如上述無義、錯義、插入、缺失、移碼突變或剪接位點的5’或3’側(cè)翼的序列，或無義、錯義、插入、缺失或移碼突變的5’或3’側(cè)翼的序列)，或者與之具有至少80%序列一致性的序列(識別5’或3’側(cè)翼序列的探針)；或者
-長度范圍在13nt至大約IOOOnt的寡核苷酸，其包含選自特定突變FAD3等位基因的突變序列的至少13個連續(xù)核苷酸的一個核苷酸序列或其互補序列(即，例如，在本發(fā)明的該FAD3基因中插入或置換的核苷酸的序列，或其互補序列)，或者與之具有至少80%序列一致性的序列(識別突變序列的探針)。這些探針可以完全由選自提及的側(cè)翼和突變序列的核苷酸序列組成。然而，在這些探針的5’或3’末端的核苷酸序列是較不關(guān)鍵的。因此，這些探針的該5’或3’序列可以由選自側(cè)翼或突變序列的一個核苷酸序列組成，但是在適當情況下也可以由一個與側(cè)翼或突變序列無關(guān)的核苷酸序列組成。這樣的無關(guān)序列應(yīng)當優(yōu)選地不長于50個，更優(yōu)選地不長于25個或甚至不長于20個或15個核苷酸。
而且，適合的探針可以包含這樣一個核苷酸序列或由其組成，該核苷酸序列跨越了側(cè)翼與突變序列之間的連接區(qū)(即，例如，在本發(fā)明的突變FAD3等位基因中的一個或多個核苷酸缺失、插入或置換的5’或3’側(cè)翼的序列與一個或多個插入或置換的核苷酸的序列或分別在一個或多個缺失的核苷酸的3’或5’側(cè)翼的序列之間的連接區(qū)，例如，在上述本發(fā)明的FAD3基因中的無義、錯義、插入、缺失、移碼或剪接位點突變的5’或3’側(cè)翼的序列與無義、錯義、插入、缺失失、移碼或剪接位點突變的序列之間的連接區(qū))，條件是該提及的核苷酸序列不專一地源自該突變區(qū)或側(cè)翼區(qū)。適合于鑒定特定突變FAD3等位基因的特異性探針的例子描述于實施例中。與特異性探針雜交的“突變FAD3特定區(qū)域”的檢測和/或鑒定可以存在多種方法，例如，通過在凝膠電泳之后的大小評估、或者通過基于熒光的檢測方法。用于檢測與特異性探針雜交的“突變FAD3特定區(qū)域”的其他的序列特異性方法也是本領(lǐng)域已知的?？商娲?，可以使用其他方法產(chǎn)生和鑒定包含一個或多個突變FAD3等位基因的植物或植物部分，例如“Delete-a-gene ”方法，所述方法使用PCR來篩選通過快中子誘 變(綜述見 Li 和 Zhang, 2000, Funct Integr Genomics 2 :254-258)產(chǎn)生的缺失突變體，例如鑒定EMS-誘導的點突變的TILLING (定向誘導基因組局部突變技術(shù))，其使用變性高效液相色譜分析(DHPLC)通過異源雙鏈分析檢測堿基對變化等(McCallum等人，2000，NatBiotech 18 :455，和 McCallum 等人 2000，Plant Physiol 123,439-442)。如所提及的，TILLING使用針對突變的高通量篩選(例如使用突變體-野生型異源雙鏈DNA的Cel I切割以及使用一種測序膠系統(tǒng)的檢測)。因此，在此涵蓋了使用TILLING來鑒定包含一個或多個突變FAD3等位基因的植物或植物部分、以及用于產(chǎn)生和鑒定這樣的植物、植物器官、組織和種子的方法。因此在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法包含以下步驟誘變植物種子(例如EMS誘變)、植物個體或DNA的匯合、感興趣區(qū)域的PCR擴增、異源雙鏈體的形成和高通量檢測、突變植物的鑒定、突變PCR產(chǎn)品的測序。應(yīng)當理解的是，同樣可以使用其他誘變和選擇方法來產(chǎn)生這樣的突變植物。除了在FAD3基因中誘導突變以外，可以通過本領(lǐng)域已知方法鑒定天然(自發(fā))突變等位基因。例如，可以使用ECOTILLING(Henikoff 等人，2004，Plant Physiology 135(2)630-6)來篩選在多種植物或植物部分中的天然突變FAD3等位基因的存在。對于上述誘變技術(shù)，優(yōu)選地包含基因組A和/或C的蕓苔屬種類被篩選，這樣所鑒定的FAD3基因可以通過雜交(種內(nèi)或種間雜交)和選擇隨后引入到其他蕓苔屬種類(例如甘藍型油菜)中。在EC0TILLING中，通過上述TILLING方法學，篩選育種品系或相關(guān)種類中的天然多態(tài)性，其中，使用單個植物或植物庫進行FAD3靶的PCR擴增、異源雙鏈形成和高通量分析。在此之后，可以選擇具有一個所需突變的單個植物，其隨后可以被用于育種計劃中以摻入所希望的突變等位基因。然后，可以對這些鑒定的突變等位基因進行測序，并且可以將該序列與該野生型等位基因比較，以鑒定一個或多個突變。任選地，可以如上所示測試功能性。采用這種方法可以鑒定多個突變FAD3等位基因(以及包含這些等位基因中的一個或多個的蕓苔屬植物)。然后，進一步如下所述，可以通過雜交和選擇方法，將所希望的突變等位基因與所希望的野生型等位基因組合。最后，產(chǎn)生了一個包含所希望的數(shù)量的突變FAD3和所希望的數(shù)量的野生型FAD3等位基因的單個植物。
適合作為PCR引物或特異性探針用于檢測特定突變FAD3等位基因的寡核苷酸也可以用來開發(fā)確定該特定突變FAD3等位基因的接合性狀態(tài)的方法。為了確定特定突變FAD3等位基因的接合性狀態(tài)，可以開發(fā)一種基于PCR的測定來確定突變和/或相應(yīng)的野生型FAD3特異性等位基因的存在為了確定特定突變FAD3等位基因的接合性狀態(tài)，可以以這樣的方式設(shè)計特異性識別野生型FAD3等位基因的兩種引物，即兩種引物針對彼此且具有位于兩種引物之間的突變區(qū)。這些引物可以是分別特異性識別5’和3’側(cè)翼序列的引物。該組引物允許該突變體以及相應(yīng)的野生型FAD3等位基因的同步診斷性PCR擴增?？商娲?，為了確定一個特定突變FAD3等位基因的接合性狀態(tài)，可以以這種方式設(shè)計特異性識別野生型FAD3等位基因的兩種引物，即兩種引物針對彼此且其中一種特異性識別突變區(qū)。這些引物可以是分別特異性識別野生型FAD3等位基因的5’或3’側(cè)翼區(qū) 和突變區(qū)的引物。該組引物與特異性識別突變FAD3等位基因中的突變區(qū)的序列的一個第 三引物一起，允許突變FAD3基因以及野生型FAD3基因的同步診斷性PCR擴增。可替代地，為了確定一個特定突變FAD3等位基因的接合性狀態(tài)，可以以這種方式設(shè)計特異性識別野生型FAD3等位基因的兩種引物，即兩種引物是針對彼此的并且其中一種特異性識別在5’或3’側(cè)翼區(qū)與突變區(qū)之間的連接區(qū)。這些引物可以是分別特異性識別野生型FAD3等位基因的5’或3’側(cè)翼序列和在突變區(qū)與3’或5’側(cè)翼區(qū)之間的連接區(qū)的引物。該組引物與第三弓I物一起，允許突變FAD3基因以及野生型FAD3基因的同步診斷性PCR擴增，所述第三引物特異性識別突變FAD3等位基因的在突變區(qū)與3’或5’側(cè)翼區(qū)之間的連接區(qū)?？商娲兀梢酝ㄟ^使用替代的引物組來確定特定突變FAD3等位基因的接合性狀態(tài)，這些引物組特異性識別突變和野生型突變FAD3等位基因。如果該植物對于突變FAD3等位基因或相應(yīng)的野生型FAD3等位基因是純合的，對于突變或野生型FAD3等位基因，上述診斷性PCR測定將產(chǎn)生一個典型的單PCR產(chǎn)品，優(yōu)選在長度上是典型的。如果該植物對于突變FAD3等位基因是雜合的，將出現(xiàn)兩種特異的PCR產(chǎn)品，其反映突變和野生型FAD3等位基因兩者的擴增。例如可以通過在凝膠或毛細管電泳之后的大小評估(例如，對于包含導致從野生型和突變FAD3等位基因擴增的片段之間的大小差異的多個插入或缺失核苷酸的突變FAD3等位基因，從而所述片段可以在一種凝膠上可視地分離)；通過在凝膠或毛細管電泳之后，評估兩種不同片段的存在或缺乏，由此任選地可以將突變FAD3等位基因的診斷性PCR擴增與野生型FAD3等位基因的診斷性PCR擴增分開進行；通過擴增片段的直接測序；或者通過基于熒光的檢測方法，來進行野生型和突變FAD3特定PCR產(chǎn)品的鑒定。< 0適合于確定特定突變FAD3等位基因的接合性的引物的例子描述于實施例中?？商娲?，為了確定特定突變FAD3等位基因的接合性狀態(tài)，可以開發(fā)基于雜交的測定來確定突變和/或相應(yīng)的野生型FAD3特定等位基因的存在。為了確定特定突變FAD3等位基因的接合性狀態(tài)，可以以這樣一種方式設(shè)計鑒定野生型FAD3等位基因的兩種特異性探針，即每種探針特異性識別在FAD3野生型等位基因中的一個序列，并且突變區(qū)位于探針識別的序列之間。這些探針可以是分別特異性識別5’或3’側(cè)翼序列的探針。這些探針的一種或者優(yōu)選地兩種的使用允許突變以及相應(yīng)的野生型FAD3等位基因的同步診斷性雜交?？商娲兀瑸榱舜_定特定突變FAD3等位基因的接合性狀態(tài)，可以以這樣一種方式設(shè)計識別野生型FAD3等位基因的兩種特異性探針，即其中一種特異性識別在FAD3野生型等位基因中的在突變區(qū)上游或下游(優(yōu)選在突變區(qū)的上游)的序列，并且兩種探針之一特異性地識別突變區(qū)。這些探針可以是分別特異性識別野生型FAD3等位基因的5’或3’側(cè)翼區(qū)(優(yōu)選5’側(cè)翼區(qū))、以及突變區(qū)的序列的探針。這些探針的一種或者優(yōu)選地兩種、任選地連同一個第三探針的使用允許突變以及野生型FAD3基因的診斷性雜交，所述第三探針特異性識別在突變FAD3等位基因中的突變區(qū)的序列?？商娲?，為了確定特定突變FAD3等位基因的接合性狀態(tài)，可以以這樣一種方式設(shè)計識別野生型FAD3等位基因的特異性探針，即該探針特異性識別在野生型FAD3等位基因的5’或3’側(cè)翼區(qū)(優(yōu)選5’側(cè)翼區(qū))與突變區(qū)之間的連接區(qū)。這種探針任選地與一個第二探針一起允許突變和野生型FAD3等位基因的診斷性雜交，所述第二探針特異性識別在突變FAD3等位基因的5’或3’側(cè)翼區(qū)(優(yōu)選5’側(cè)翼區(qū))與突變區(qū)之間的連接區(qū)。
可替代地，可以通過使用可替代的多個探針組來確定一個特定突變FAD3等位基因的接合狀態(tài)，這些探針組特異性識別突變和野生型FAD3等位基因。如果該植物對于突變FAD3基因或相應(yīng)的野生型FAD3基因是純合的，對于突變或野生型FAD3等位基因，上述診斷性雜交測定將產(chǎn)生一種典型的單特異性雜交產(chǎn)物，例如一個或多個雜交DNA(限制性)片段，優(yōu)選地在長度上是典型的。如果該植物對于突變FAD3等位基因是雜合的，則可出現(xiàn)兩種特異性雜交產(chǎn)物，其反映突變和野生型FAD3等位基因兩者的雜交。例如可以通過在凝膠或毛細管電泳之后的大小評估(例如，對于包含導致來自野生型和突變FAD3等位基因中的雜交DNA(限制性)片段之間的大小差異的多個插入或缺失核苷酸的突變FAD3等位基因，由此所述片段可以在一種凝膠上可視地分離)；通過在凝膠或毛細管電泳之后評估兩種不同的特異性雜交產(chǎn)物的存在或缺乏，由此任選地可以將突變FAD3等位基因的診斷性雜交與野生型FAD3等位基因的診斷性雜交分開進行；通過雜交DNA(限制性)片段的直接測序；或者通過基于熒光的檢測方法，來進行野生型和突變FAD3特異性雜交產(chǎn)物的鑒定。適合于確定特定突變FAD3等位基因的接合性的探針的例子描述于實施例中。此外，還可以使用在此提供的特定突變FAD3等位基因特異性序列信息，開發(fā)針對特定突變FAD3等位基因的特異性的多種檢測方法，這些檢測方法不同于基于PCR或雜交的擴增方法。這些可替代的檢測方法包括基于特定核酸結(jié)構(gòu)的侵入性切割(invasive cleavage)的線性信號擴增檢測方法,也稱為Invader 技術(shù)(描述在美國專利5，985，557 “Invasive Cleavage of Nucleic Acids”，6001567 “Detection of NucleicAcid sequences by Invader Directed Cleavage，，,通過引用結(jié)合在此)，基于RT-PCR的檢測方法，例如Taqman,或其他檢測方法,例如SNPlex。簡言之,在Invader 技術(shù)中，該革巴向突變序列可以例如與一個標記的第一核酸寡核苷酸(包含突變序列的核苷酸序列或跨越在5’側(cè)翼區(qū)與突變區(qū)之間的連接區(qū)的一個序列)、并且與一個第二核酸寡核苷酸(包含與突變序列相鄰且剛好在其下游的3’側(cè)翼序列)雜交，其中該第一和第二寡核苷酸重疊至少一個核苷酸。通過這種雜交產(chǎn)生的雙鏈體或三鏈體結(jié)構(gòu)允許用酶(Gleavase )選擇性探針切割，使靶序列完整。隨后有可能通過一個中間步驟檢測切割下來的標記探針，導致進一步的信號放大。如在此所使用的，一個“試劑盒”是指用于實施本發(fā)明方法的目的的試劑集合，更特別地用于生物樣品中的特定突變FAD3等位基因的鑒定、或包含特定突變FAD3等位基因的植物材料的接合狀態(tài)的確定等。更特別地，本發(fā)明的試劑盒的一個優(yōu)選實施方案包括如上所述的用于特定FAD3等位基因鑒定的至少兩種特異性引物、或用于接合性狀態(tài)確定的至少兩種或三種特異性引物。任選地，該試劑盒可以進一步包括任何在此描述的在PCR鑒定實驗方案中的其他試劑?？商娲?，根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，試劑盒可以包含至少一個特異性探針，所述探針與生物樣品的核酸特異性雜交，以鑒定其中的如上所述的特定突變FAD3等位基因的存在，用于特定突變FAD3等位基因的鑒定，或者包含至少兩種或三種用于確定接合狀態(tài)的特異性探針。任選地，該試劑盒可以進一步包括通過使用該特異性探針用于鑒定生物樣品中的特定突變FAD3等位基因的任何其他試劑(例如但不限于雜交緩沖液，標記)。、
可以使用本發(fā)明的試劑盒(并且其組分可以被特異性地調(diào)整)，用于以下目的質(zhì)量控制(例如，種子批的純度)、檢測植物材料或者包含或源自植物材料的材料(例如但不限于食品或飼料產(chǎn)品)中的特定突變FAD3等位基因的存在或缺乏。如在此所使用的，術(shù)語“引物”涵蓋了能夠在一個依賴模板的過程(如PCR)中引發(fā)新生核酸合成的任何核酸。典型地，引物是10至30個核苷酸的寡核苷酸，但可以使用更長的序列。引物可以被提供為雙鏈形式，雖然單鏈形式是優(yōu)選的。探針可以用作引物，但是被設(shè)計為與靶DNA或RNA結(jié)合，而無需用于一個擴增過程中。當提及特異性引物時，如在此所使用的術(shù)語“識別”是指這樣的事實，即在該方法中所提出的條件下(例如PCR鑒定實驗方案的條件)，這些特異性引物與特定突變FAD3等位基因中的核酸序列特異性雜交，由此通過陽性和陰性對照的存在來確定該特異性。當提及特異性探針時，如在此所使用的術(shù)語“雜交”是指這樣的事實，即在標準嚴緊條件下，該探針與特定(突變或野生型)FAD3等位基因的核酸序列中的特定區(qū)域結(jié)合。如在此所使用的標準嚴緊條件是指在此描述的用于雜交的條件、或由Samtoook等人，1989，(Molecular Cloning A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbour LaboratoryPress,NY)描述的常規(guī)雜交條件，例如可以包括下列步驟1)將植物基因組DNA片段或BAC文庫DNA固定在濾膜上，2)在65°C，6X SSC, 5X Denhardt試劑，0. 5% SDS和20 u g/ml變性載體DNA中使該濾膜預雜交I至2小時，3)添加已經(jīng)標記的雜交探針，4)孵育16至20小時，5)在 68°C在 6X SSC, 0. I % SDS 中洗滌濾膜一次，30 分鐘，6)在 68°C，6X SSC, 0. I % SDS中洗滌濾膜三次(在30ml中兩次，各30分鐘，在500ml中一次，10分鐘)，以及7)將濾膜在_70°C下暴露于X射線膜持續(xù)4至48小時。如在此所使用的，“生物樣品”是植物、植物材料或包含植物材料的產(chǎn)品的樣品。術(shù)語“植物”意指涵蓋任何成熟階段的植物組織，以及取自或源自任何此類植物的任何細胞、組織或器官，包括但不限于任何種子、葉、莖、花、根、單細胞、配子、細胞培養(yǎng)物、組織培養(yǎng)物或原生質(zhì)體。如在此所使用的，“植物材料”指從植物獲得的或源自植物的材料。包含植物材料的產(chǎn)品涉及食品、飼料或其他產(chǎn)品，所述產(chǎn)品使用植物材料生產(chǎn)或可能被植物材料污染。應(yīng)當理解的是，在本發(fā)明的上下文中，針對特定突變FAD3等位基因特異的核酸的存在對這些生物樣品進行測試，提示樣品中核酸的存在。因此，本文所指的用于在生物樣品中識別特定突變FAD3等位基因的方法，涉及生物樣品中核酸的識別，所述核酸包含特定突變FAD3等位基因。本發(fā)明還涉及在一株植物中的特定FAD3等位基因的組合，涉及將一個或多個特定突變FAD3等位基因從一株植物轉(zhuǎn)移到另一株植物，涉及包含一個或多個特定突變FAD3等位基因的植物，從這些植物獲得的子代，并且涉及源自這些植物的植物細胞、植物部分和植物種子。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種用于將兩個或更多個選擇的突變FAD3等位基因結(jié)合在一株植物中的方法，所述方法包括下列步驟
a.產(chǎn)生和/或鑒定兩株或更多株植物，每株包含如上所述的一個或多個選擇的突變FAD3等位基因，
b.使包含一個或多個選擇的突變FAD3等位基因的第一植物與包含一個或多個其他選擇的突變FAD3等位基因的第二植物雜交，從雜交體(cross)收集Fl種子，以及任選地鑒定包含來自第一植物的一個或多個選擇的突變FAD3等位基因和來自第二植物的一個或多個選擇的突變FAD3等位基因的Fl植物，如上所述，
c.任選地，重復步驟(b)，直到獲得包含所有選擇的突變FAD3等位基因的Fl植物，
d.任選地，
-通過確定如上所述的突變FAD3等位基因的接合性狀態(tài)，鑒定對于選擇的突變FAD3等位基因是純合或雜合的Fl植物，或
-通過進行以下步驟之一，產(chǎn)生對于一個或多個選擇的突變FAD3等位基因是純合的植物:0}
-從包含如上所述的一個或多個選擇的突變FAD3等位基因的Fl植物的經(jīng)處理的小孢子或花粉細胞中提取雙單倍體植物，
-使包含一個或多個選擇的突變FAD3等位基因的Fl植物自交一代或多代(y)，從自交體(selfing)中收集FlSy種子，并且鑒定對于如上所述的一個或多個突變FAD3等位基因是純合的Fl Sy植物。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了將一個或多個突變FAD3等位基因從一株植物轉(zhuǎn)移到另一株植物的方法，所述方法包括以下步驟
a.產(chǎn)生和/或鑒定包含如上所述的一個或多個選擇的突變FAD3等位基因的第一植物，或者通過在一株植物中結(jié)合一個或多個選擇的突變FAD3等位基因來產(chǎn)生第一植物，如上所述(其中該第一植物對于一個或多個突變FAD3等位基因是純合或雜合的)，
b.使包含一個或多個突變FAD3等位基因的第一植物與不包含一個或多個突變FAD3等位基因的第二植物雜交，從雜交體收集Fl種子(其中，如果第一植物對于突變FAD3等位基因是純合的，則這些種子對于突變FAD3等位基因來說是雜合的；并且其中，如果第一植物對于突變FAD3等位基因來說是雜合的，則這些種子中的一半對于突變FAD3等位基因來說是雜合的，這些種子中的一半是不成對的，即不包含突變FAD3等位基因)，以及任選地鑒定包含如上所述的一個或多個選擇的突變FAD3等位基因的Fl植物，
c.使包含一個或多個選擇的突變FAD3等位基因的Fl植物與不包含一個或多個選擇的突變FAD3等位基因的第二植物回交一代或多代(X)，從雜交體中收集BCx種子，并且在每一代中鑒定包含如上所述的一個或多個選擇的突變FAD3等位基因的BCx植物，
d.任選地，產(chǎn)生對一個或多個選擇的突變FAD3等位基因是純合的BCx植物，這通過以下步驟之一來進行
-從包含如上所述的一個或多個所希望的突變FAD3等位基因的BCx植物的經(jīng)處理的小孢子或花粉細胞中提取雙單倍體植物，
-使包含一個或多個所希望的突變FAD3等位基因的BCx植物自交一代或多代(y)，從自交體中收集BCx Sy種子，并且鑒定出對于如上所述的一個或多個所希望的突變FAD3等位基因是純合的BCx Sy植物。在本發(fā)明的另一個方面，第一和第二植物是十字花科植物，特別是蕓苔屬植物，尤其是甘藍型油菜植物或來自其他的蕓苔屬作物種類的植物。在本發(fā)明的另一方面，該第一植物是十字花科植物，特別是蕓苔屬植物，尤其是甘藍型油菜植物或來自其他蕓苔屬作物種類的植物，并且該第二植物是來自十字花科育種品系，特別是來自蕓苔屬育種品系，尤其是來自甘藍型油菜育種品系或者來自其他蕓苔屬作物種類的育種品系的植物。如在此所使用的，“育種品系”優(yōu)選地是一種純合的植物品系，其可通過優(yōu)選的基因型和/或表型與其他植物品系區(qū)別開，其用來產(chǎn)生雜交后代。仍然在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了一種方法用于生產(chǎn)植物，特別是蕓苔屬作物植物，例如甘藍型油菜植物，所述植物的種子油具有顯著降低的C18:3含量，但優(yōu)選地保持農(nóng)藝學上適合的發(fā)育，該方法包括將根據(jù)本發(fā)明的突變FAD3等位基因結(jié)合和/或轉(zhuǎn)移進或轉(zhuǎn)移到一株蕓苔屬植物，如上文所述。在本發(fā)明的一個方面，該植物是包含至少兩個突變FAD3等位基因的蕓苔屬植物，其中種子油具有顯著降低的C18:3含量，但該植物優(yōu)選地保持農(nóng)藝學上適合的發(fā)育，這通過將根據(jù)本發(fā)明的至少兩個突變FAD3等位基因結(jié)合和/或轉(zhuǎn)移進或轉(zhuǎn)移到該蕓苔屬植物來實現(xiàn)，如上文所述。本發(fā)明還涉及一種植物的用途，特別是一種蕓苔屬作物植物，例如一種甘藍型油菜植物，其包含一個或多個本發(fā)明的突變FAD3等位基因，用于將根據(jù)本發(fā)明的突變FAD3等位基因結(jié)合和/或轉(zhuǎn)移進或至轉(zhuǎn)移到一株蕓苔屬植物，如上文所述。仍然在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的突變FAD3等位基因用來降低一種蕓苔屬植物的種子油中的C18:3含量的用途。在本發(fā)明的另一方面，提供了本發(fā)明的植物和種子用于生產(chǎn)菜籽油的用途。在另外一個實施方案中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的植物用于生產(chǎn)包含突變FAD3等位基因的種子或生產(chǎn)包含突變FAD3蛋白的油菜作物的用途。序列SEQ ID NO : I :來自甘藍型油菜的FAD3-A1基因的基因組DNASEQ ID NO 2 2 :來自甘藍型油菜的FAD3-A1蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO 3 :來自甘藍型油菜的FAD3-C1基因的基因組DNASEQ ID NO 4 4 :來自甘藍型油菜的FAD3-A2蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO 5 :來自甘藍型油菜的FAD3-A2基因的基因組DNASEQ ID NO 6 :來自甘藍型油菜的FAD3-A2蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO 7 :來自甘藍型油菜的FAD3-A3基因的基因組DNASEQ ID NO 8 :來自甘藍型油菜的FAD3-A3蛋白的氨基酸序列
SEQ ID NO :9 :來自甘藍型油菜的FAD3-C2基因的基因組DNASEQ ID NO 10 :來自甘藍型油菜的FAD3-C2蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO : 11 :來自甘藍型油菜的FAD3-A1基因的編碼區(qū)SEQ ID NO 12 :來自甘藍型油菜的FAD3-C1基因的編碼區(qū)SEQ ID NO: 13 13 :來自甘藍型油菜的FAD3-A2基因的編碼區(qū)SEQ ID NO 14 :來自甘藍型油菜的FAD3-A3基因的編碼區(qū)
SEQ ID NO 15 :來自甘藍型油菜的FAD3-C2基因的編碼區(qū)SEQ ID NO 16 :擬南芥屬FAD3正向PCR引物SEQ ID NO 17 :擬南芥屬FAD3反向PCR引物SEQ ID NO :18 :L0LI105FAM 探針SEQ ID NO :19 :L0LI105VIC 探針SEQ ID NO 20 L0LI 105Fw 引物SEQ ID NO 21 :L0LI105Rw 引物SEQ ID NO :22 :L0LI103FAM 探針SEQ ID NO :23 :L0LI103VIC 探針SEQ ID NO :24 L0LI103Fw 引物SEQ ID NO :25 L0LI103Rw 引物SEQ ID NO :26 :L0LI108FAM 探針SEQ ID NO :27 :L0LI108VIC 探針SEQ ID NO :28 L0LI108Fw 引物SEQ ID NO :29 L0LI108Rw 引物SEQ ID NO :30 :L0LI111FAM 探針SEQ ID NO 31 :L0LI111VIC 探針SEQ ID NO :32 L0LI11 IFw 引物SEQ ID NO :33 L0LI11 IRw 引物SEQ ID NO :34 :L0LI115FAM 探針SEQ ID NO :35 :L0LI115VIC 探針SEQ ID NO :36 L0LI115Fw 引物SEQ ID NO 37 L0LI115Rw 引物
實施例所有實施例基本如W009/007091所描述而進行，以其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。
實施例I-甘藍型油菜中的FAD3基因數(shù)目的確定以及FAD3基因的DNA序列的分離根據(jù)標準分子生物技術(shù)，使用一種探針篩選甘藍型油菜研究春OSR品系(research spring OSR line)的細菌人工染色體(BAC)文庫,所述探針是用具有SEQ IDN0:16和SEQ ID NO : 17的引物是從擬南芥屬(Arabidopsis)基因組DNA擴增的，并且分離與該探針雜交的BAC集落(在下文稱“陽性集落”)。根據(jù)標準分子生物技術(shù)，使用如上所述的相同探針對從這些陽性集落分離的BAC克隆DNA以及從甘藍型油菜(AC)、白菜型油菜(AA)和甘藍(CC)分離的基因組DNA進行Southern印跡分析?；阼b定的陽性集落的BAC克隆DNA和從甘藍型油菜、白菜型油菜和甘藍分離的基因組DNA消化之后所獲得的雜交圖譜的對比，這些BAC克隆被分為5組，其中三組可映射到基因組A，兩組可映射到基因組C。對于5組中的每一組，選擇了一個BAC克隆
實施例2-來自甘藍型油菜的FAD3基因序列的表征所選陽性集落的BAC克隆的全部DNA序列通過454測序確定，其后用擬南芥FAD3基因(GenBank登錄號D26508)作為查詢序列通過BLAST分析(Blast2seq)鑒定FAD3序列。用FgeneSH(Softberry, Inc. Mount Kisco, NY, USA)并且通過與具有擬南芥編碼序列(GenBank登錄號NM_128552)的基因序列的最佳比對來確定FAD3序列的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)。FAD3基因的蛋白編碼區(qū)域以及由這些核酸序列編碼的FAD3氨基酸序列呈現(xiàn)于序列表中。在映射到基因組A的FAD3基因中，發(fā)現(xiàn)映射到N04的FAD3基因的序列與FAD3-A基因(GenBank登錄號L22962)對應(yīng)并且被命名為FAD3-A1，而映射到N05和N03的序列分 別被命名為FAD3-A2和FAD3-A3。在映射到基因組C的FAD3基因中，發(fā)現(xiàn)這些序列之一與FAD3-C基因(描述于W004/072259中)對應(yīng)并且被命名為FAD3-C1，而發(fā)現(xiàn)另一個序列與FAD3-A2是同源的并且被命名為FAD3-C2。這些名稱貫穿本說明書而被使用。FAD3基因的基因組序列呈現(xiàn)于序列表中。
實施例3-蕓苔屬FAD3基因的表達基因的相對和絕對表達水平。為了產(chǎn)生cDNA，使用TRIZOL試劑(Invitrogen)提取總RNA。對于每個胚芽的發(fā)育階段，該操作重復進行三次。其后，將從同一發(fā)育階段的胚的總RNA樣品匯集，并且用GE Healthcare mRNA純化試劑盒從總RNA樣品提純mRNA。在下一步驟中，使用SuperScript雙鏈cDNA合成試劑盒(Invitrogen)制備cDNA。然后，根據(jù)SMART cDNA文庫構(gòu)建試劑盒(Clontech)中描述的實驗方案使用CHROMA Spin-400柱根據(jù)大小進行cDNA分級。在cDNA序列分析之后，通過靶序列的讀數(shù)進行轉(zhuǎn)錄本的定量。用每個時間點數(shù)據(jù)集中的序列的數(shù)目將每個FAD3基因的表達標準化。
表I :在14-35個花后天數(shù)(DAF)的甘藍型油菜的胚中的總FAD3表達的標準化(norm)FAD3表達和百分比(％ )。
權(quán)利要求
1. 一種蕓苔屬植物，包含至少兩種完全敲除型突變FAD3等位基因，其中 1.第一完全敲除型突變FAD3等位基因是選自由FAD3-A1或FAD3-C1組成的組；并且 ii.第二完全敲除型突變FAD3等位基因是選自由FAD3-A2、FAD3-A3或FAD3-C組成的組。
其中所述完全敲除型突變FAD3等位基因各自包含一種選自下組的核苷酸序列，該組由以下各項組成(a)一種包含與 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 7 或 SEQ IDNO 9具有至少90%的序列一致性的核苷酸序列；(b)一種包含與 SEQ ID NO 1U SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO : 14 或 SEQID NO 15具有至少90%的序列一致性的核苷酸序列；或(c)一種編碼包含與 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 8 或 SEQID NO 10具有至少90%的序列一致性的氨基酸序列的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求I所述的植物，進一步包含一個第三，或一個第三和一個第四，或一個第三、一個第四和一個第五完全敲除型突變FAD3等位基因，其中所述第三完全敲除型突變FAD3等位基因是選自由FAD3-A1或FAD3-C1組成的組，并且其中所述第四和所述第五完全敲除型突變FAD3等位基因是選自由FAD3-A2、FAD3-A3或FAD3-C2組成的組，并且由此所述完全敲除型突變FAD3等位基因是具有不同F(xiàn)AD3基因的突變等位基因。
3.如權(quán)利要求I或2所述的植物，所述完全敲除型突變FAD3等位基因是選自由LOLI105, LOLI103, LOLI108, L0LI111 或 LOLI115 組成的組。
4.一種FAD3基因的完全敲除型突變等位基因，包含一種選自下組的核苷酸序列，該組由以下各項組成(a)一種包含與 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 7 或 SEQ IDNO 9具有至少90%的序列一致性的核苷酸序列；(b)一種包含與 SEQ ID NO 1U SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO : 14 或 SEQID NO 15具有至少90%序列一致性的核苷酸序列；或(c)一種編碼包含與 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 8 或 SEQID NO 10具有至少90%的序列一致性的氨基酸序列的核苷酸序列。
5.如權(quán)利要求4所述的完全敲除型突變等位基因，選自由L0LI105、L0LI103、L0LI108、L0LI111或LOLI115組成的組。
6.一種蕓苔屬植物，包含F(xiàn)AD3基因的至少一種完全敲除型突變等位基因，該FAD3基因包含一種選自下組的核苷酸序列，該組由以下各項組成(a)一種包含與 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 7 或 SEQ IDNO 9具有至少90%的序列一致性的核苷酸序列；(b)一種包含與 SEQ ID NO 1U SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO : 14 或 SEQID NO 15具有至少90%的序列一致性的核苷酸序列；(c)一種編碼包含與 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 8 或 SEQID NO 10具有至少90%的序列一致性的氨基酸序列的核苷酸序列。
7.如權(quán)利要求6所述的蕓苔屬植物，其中所述完全敲除型突變等位基因是選自由LOLI105, LOLI103, LOLI108, L0LI111 或 LOLI115 組成的組。
8.—種如權(quán)利要求1、2、3、6或7的任一項所述的植物的植物細胞、種子或子代。
9.一種可以從權(quán)利要求1、2、3、6或7的任一項所述的植物的種子獲得的種子油。
10.一種選自下組的蕓苔屬種子，該組由以下各項組成 -包含 FAD3-A1-LOLI105 和 FAD3-C1-LOLI103 (已經(jīng)于 2009 年 10 月 9 日以登錄號 NCMB41655保藏在NCMB Limited中)的蕓苔屬種子。
-已經(jīng)于2009年10月9日以登錄號NCMB 41656保藏在NCMB Limited 中的包含 FAD3-A2-L0LI108 和 FAD3-C2-LOLI115 的蕓苔屬種子。
-已經(jīng)于2009年10月9日以登錄號NCMB 41657保藏在NCMBLimited中的包含F(xiàn)AD3-A3-LOLI111的蕓苔屬種子。
11.一種用于確定在一種植物或其細胞、部分、種子或子代中的如權(quán)利要求4或5的任一項所述的突變FAD3等位基因的接合性狀態(tài)的方法，包括確定在所述植物或其細胞、部分、種子或子代的基因組DNA中的突變和/或相應(yīng)的野生型FAD3特定區(qū)域的存在。
12.一種用于將如權(quán)利要求4或5所述的至少兩種選擇的突變FAD3等位基因結(jié)合在一種植物中的方法，該方法包括以下步驟 (a)通過根據(jù)權(quán)利要求11確定該至少一種選擇的突變FAD3等位基因的接合性狀態(tài)，鑒定各自包含至少一種選擇的突變FAD3等位基因的至少兩種植物； (b)使這至少兩種植物雜交,并且從至少一個雜交體收集Fl雜交種子；并且 (c)任選地，通過根據(jù)權(quán)利要求11確定該至少兩種選擇的突變FAD3等位基因的接合性狀態(tài)，鑒定一種包含至少兩種選擇的突變FAD3等位基因的Fl植物。
13.一種降低在蕓苔屬植物種子油中的C18:3含量的方法，包括使至少兩種完全敲除型FAD3等位基因結(jié)合在所述植物的基因組DNA中，其中 i.第一完全敲除型突變FAD3等位基因是選自由FAD3-A1或FAD3-C1組成的組；并且 ii.第二完全敲除型突變FAD3等位基因是選自由FAD3-A2、FAD3-A3或FAD3-C2組成的組， 其中所述完全敲除型突變FAD3等位基因各自選自下組，該組由以下各項組成(a)一種包含與 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 7 或 SEQ IDNO 9具有至少90%的序列一致性的核苷酸序列；(b)一種包含與 SEQ ID NO 1U SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO : 14 或 SEQID NO 15具有至少90%的序列一致性的核苷酸序列；或(c)一種編碼包含與 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 8 或 SEQID NO 10具有至少90%的序列一致性的氨基酸序列的核苷酸序列。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述植物進一步包含一個第三，或一個第三和一個第四，或一個第三、一個第四和一個第五完全敲除型突變FAD3等位基因，所述第三完全敲除型突變FAD3等位基因是選自由FAD3-A1或FAD3-C1組成的組，且其中所述第四和所述第五完全敲除型突變FAD3等位基因是選自由FAD3-A2、FAD3-A3或FAD3-C2組成的組，由此所述完全敲除型突變FAD3等位基因是具有不同F(xiàn)AD3基因的突變等位基因。
15.如權(quán)利要求13或14所述的方法，其中所述完全敲除型突變FAD3等位基因是選自由 LOLI105, LOLI103, LOLI108, L0LI111 或 LOLI115 組成的組。
16.如權(quán)利要求4或5所述的突變FAD3等位基因用來降低蕓苔屬植物的種子油中的C18:3含量的用途。
17.如權(quán)利要求1、2、3、6或7的任一項所述的植物或如權(quán)利要求8或10所述的種子用來生產(chǎn)菜籽油或油菜種子餅的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含突變FAD3等位基因、FAD3核酸序列和蛋白質(zhì)的蕓苔屬植物，以及用于產(chǎn)生和鑒定所述植物和等位基因的方法，這些植物和方法可以用來獲得具有降低的α-亞麻酸含量的種子油。
文檔編號C12N9/02GK102712911SQ201080052417
公開日2012年10月3日 申請日期2010年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月20日
發(fā)明者B·拉加, P·德諾爾夫 申請人:拜爾作物科學公司