專利名稱：細(xì)胞的選擇性裂解的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及真核細(xì)胞，特別是動物細(xì)胞，例如血細(xì)胞的裂解。本發(fā)明還涉及具有高濃度的其他細(xì)胞的樣品中的低濃度微生物例如細(xì)菌的檢測。
背景技術(shù)：
分子診斷g在快速檢測樣品例如血液中的微量病原體(通常是細(xì)菌)。然而血液是復(fù)雜的基質(zhì)，且包含用于獲得性免疫系統(tǒng)的白細(xì)胞(white blood cell)(白細(xì)胞(leukocyte)),用于運(yùn)輸氧的紅細(xì)胞(red blood cell)(紅細(xì)胞(erythrocyte))和用于傷ロ愈合的血小板(凝血細(xì)胞)。這使包含高量的細(xì)胞物質(zhì)的樣品例如全血中的病原體的直接檢測變得復(fù)雜。
經(jīng)典的檢測方法包括在選擇性培養(yǎng)基和/或帶有指示劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)細(xì)菌。通常，在可進(jìn)行鑒定之前，這些測定需要至少I或2天的培養(yǎng)步驟。對于基于PCR的方法，新鮮血液樣品中細(xì)菌的量理論上是足夠高以被檢測的而無需進(jìn)一歩培養(yǎng)該樣品內(nèi)存在的細(xì)菌。然而，為實(shí)現(xiàn)微量細(xì)菌的早期檢測，需要大體積的血液。特別是白細(xì)胞中的高量的DNA明顯升高了基于DNA的檢測方法中的背景。另外，血紅蛋白中血紅素的存在強(qiáng)烈降低了 DNA聚合酶的活性。I微升的人血包含約4，000至11，000個白細(xì)胞和約150，000至400，000個血小板。血液中DNA的濃度在約30和60 μ g/ml之間。檢測體積為IOml的全血中約10至100，000的細(xì)菌物種的存在是非常有挑戰(zhàn)性的。白細(xì)胞的高量DNA可產(chǎn)生不相關(guān)的PCR產(chǎn)物，或可清除為檢測細(xì)菌DNA而設(shè)計的引物。這使得在可通過PCR或其他方法檢測細(xì)菌DNA之前徹底純化DNA和分離哺乳動物DNA成為必要。除了干擾PCR反應(yīng)本身，哺乳動物DNA的量增加樣品的粘度。另外，來自裂解過的哺乳動物細(xì)胞的蛋白質(zhì)和膜形成阻礙樣品過濾的復(fù)合物。這對于微型裝置特別成問題。進(jìn)一歩稀釋已經(jīng)大的樣品體積導(dǎo)致不可接受的長的操作步驟。由于以上原因，所以需要去除血液樣品中的人DNA的方法。在哺乳動物DNA存在下專門測定細(xì)菌DNA的方法是已知的。來自SIRSLab公司的Looxter 使用了富集樣品中甲基化DNA的方法。由于細(xì)菌DNA是高度甲基化的，該方法促使富集細(xì)菌DNA。來自Molzym公司的Molysis 使用了離液劑和去污劑來選擇性裂解哺乳動物細(xì)胞。該裂解步驟之后為用不受該離液劑/去污劑影響的DNA酶消化。例如由Roche商業(yè)化的替代性方法(S印tifast )依賴于為防止非特異性結(jié)合人DNA和擴(kuò)增人DNA而設(shè)計的PCR引物對。US 6，803，208描述了ー種方法，其中在37°C下裂解摻雜細(xì)菌的血小板的高度稀釋的懸浮液15分鐘，隨后在0. 4 μ m濾器上過濾小量的裂解樣品以目視檢查截留在濾器上的細(xì)菌是可能的。然而該方法不允許在環(huán)境溫度下處理大體積的樣品。發(fā)明概述在所附獨(dú)立和從屬權(quán)利要求中列出了本發(fā)明的具體和優(yōu)選的方面?？蛇m當(dāng)?shù)貙膶贆?quán)利要求的特征與獨(dú)立權(quán)利要求的特征和與其他從屬權(quán)利要求的特征組合而不僅限于這些權(quán)利要求中明確列出的特征。本發(fā)明的ー個方面涉及用于選擇性裂解包含或疑似包含微生物的樣品中的真核細(xì)胞，特別是動物細(xì)胞的方法。該方法包括以下步驟提供包含或疑似包含微生物的帶有真核細(xì)胞，特別是動物細(xì)胞的樣品，向該樣品中加入非離子型去污劑和緩沖液以獲得具有約
9.5或更高的pH的溶液，和將該溶液孵育足夠長的時間段例如30秒和10分鐘之間，更優(yōu)選2和6分鐘之間以裂解所述真核細(xì)胞，特別是動物細(xì)胞。在具體實(shí)施方式
中，可在15至30°C下，更優(yōu)選接近室溫下進(jìn)行裂解。 在具體實(shí)施方式
中，樣品是哺乳動物血液樣品例如全血。在其他具體實(shí)施方式
中，微生物是細(xì)菌或真菌。根據(jù)具體實(shí)施方式
，其中所加入的去污劑和所加入的緩沖液的體積與樣品的體積之間的比例在2/1和1/10之間。在具體實(shí)施方式
中，非離子型去污劑選自包含Nonidet、Brij、吐溫、Igepal、還原型triton、辛基葡糖苷、cholaat和Triton的組。更優(yōu)選的實(shí)例是Triton X_100、NonidetP40、脫氧膽酸鈉和或Ig^alCA 630。在具體實(shí)施方式
中，本文所用的堿性緩沖液具有大于9的pKa值。其實(shí)例是硼酸鹽、碳酸鹽、CAPS (N-環(huán)己基-3-氨基丙磺酸)、CAPSO (3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-I-丙磺酸)、CHES (2-(N-環(huán)己基氨基)こ磺酸)、焦磷酸鹽和こ醇胺。特別的實(shí)例是碳酸鈉。緩沖液應(yīng)具有足夠的緩沖能力以致于當(dāng)與樣品以根據(jù)本發(fā)明的比例混合時，最終溶液的PH為約9. 5或更高。在具體實(shí)施方式
中，該方法還包括在濾器上過濾經(jīng)孵育的溶液的步驟，該濾器具有在所述濾器上截留微生物的孔徑(pore size)，例如具有小于0.7 μ m，更優(yōu)選小于
0.5 μ m的孔徑的濾器。本發(fā)明的方法有助于過濾大體積的樣品而沒有酶或加熱相關(guān)的處理步驟。在具體實(shí)施方式
中，該方法還包括在根據(jù)本發(fā)明的選擇性裂解后加入酸或酸性緩沖液以獲得約7和9之間的pH的步驟，“中和步驟”。 在具體實(shí)施方式
中，上述方法之后是微生物檢測。其實(shí)例是細(xì)胞計量術(shù)、顯微木、PCR或培養(yǎng)。在具體實(shí)施方式
中，上述方法之后是微生物裂解。本發(fā)明的另一方面涉及用于檢測樣品中微生物的裝置(I)，包括用于接收體積低于40ml，優(yōu)選低于20ml且優(yōu)選I和20ml之間的樣品流體的裂解室(2)，與裂解室連接的，包含具有約9. 5或更大的pH的堿性緩沖液且包含非離子型去污劑的儲存室(3)，或包含pH約9. 5或更大的堿性緩沖液的儲存室(31)，包含非離子型去污劑的儲存室(32)，與所述裂解室連接的用于過濾裂解后樣品的濾器(4)，所述濾器具有在濾器上截留細(xì)菌的孔徑，和用于測定DNA存在的檢測室(5)。本文的堿性緩沖液通常具有高于9. 5的pKa，因此最終溶液將具有約9. 5或更高的pH,且非離子型去污劑通常是Triton X-100、脫氧膽酸鈉、Nonidet P40和/或Igepal CA630。本發(fā)明中所述的方法允許選擇性裂解樣品中的白細(xì)胞和紅細(xì)胞，而細(xì)菌和真菌保持完好(死亡的或存活的)。
本發(fā)明中所述的方法使處理樣品而不顯著稀釋該樣品成為可能，且因此允許處理較大體積的樣品。另外，不需要通過例如DNA酶來酶促降解DNA或使用加熱，使得該方法與現(xiàn)有技術(shù)已知的方法相比復(fù)雜度較低。本發(fā)明中所述的方法產(chǎn)生具有低粘度和最小聚集的裂解樣品，這使得在截留細(xì)菌的濾器上過濾大體積的裂解樣品成為可能。可以約100-1000 μ I之間的體積在該濾器上進(jìn)ー步處理細(xì)菌，這使得處理大的樣品體積以用于隨后的步驟和在集成柱中完全自動進(jìn)行所需要的操作例如中和和洗滌成為可能。從以下詳述結(jié)合通過實(shí)例闡釋本發(fā)明的原理的附圖，本發(fā)明的上述和其他特點(diǎn)、特征和優(yōu)點(diǎn)將變得明顯。僅為了舉例目的而不限制本發(fā)明的范圍，提供了本說明書。以下引用的參考圖是指附圖。附圖簡述
圖I示出了在根據(jù)本發(fā)明的方法的具體實(shí)施方式
的不同pH值下選擇性裂解之后的大體積血液的過濾效率。圖2示出了在根據(jù)本發(fā)明的方法的具體實(shí)施方式
的不同pH值下選擇性裂解之后不同細(xì)菌的回收。圖3示出了在根據(jù)本發(fā)明的方法的具體實(shí)施方式
的不同孵育時間下選擇性裂解之后不同細(xì)菌的回收。圖4示出了通過根據(jù)本發(fā)明的選擇性裂解人背景DNA的減少。圖5和6分別示出了 Iml和5ml全血中不同類型病原體的檢測。圖7示出了根據(jù)本發(fā)明的人工方法和裝置實(shí)施的方法之間的對比。圖8示出了根據(jù)本發(fā)明的方法與市售敗血癥檢測試驗的對比。圖9示出了在根據(jù)本發(fā)明的選擇性裂解和濾器捕集之后病原體的裂解。

圖10示出了當(dāng)在根據(jù)本發(fā)明的選擇性裂解和濾器捕集之后進(jìn)行的與其他裂解方法相比的病原體裂解效率。圖11示出了用于進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式中所述的選擇性裂解的裝置的實(shí)施方式的圖解概覽。圖12示出了包含本發(fā)明的實(shí)施方式中所述的選擇性裂解單元的集成裝置的實(shí)例。 在不同的附圖中，相同的參考標(biāo)記表示相同或相似的元件。將參考具體實(shí)施方式
并參考某些附圖描述本發(fā)明，但是本發(fā)明不受其限制而僅受權(quán)利要求限制。權(quán)利要求書中的任何參考標(biāo)記不應(yīng)解釋為限制范圍。所述的附圖僅是圖解性的而非限制性的。在附圖中，某些元件的尺寸可被放大且為了說明性目的未按比例繪制。當(dāng)術(shù)語“包括(comprising) ”用于本說明書和權(quán)利要求書中時，其不排除其他元件或步驟。當(dāng)表示單數(shù)名詞時使用不定冠詞或定冠詞例如“a(—個)”或“an (—種)”、“the (該)”的情況下，這包括那個名詞的復(fù)數(shù)，除非明確指出其他。另外，說明書和權(quán)利要求書中的術(shù)語第一、第二、第三及類似術(shù)語用于區(qū)分相似元件且不一定用于描述順序性或時間性順序。應(yīng)當(dāng)理解，在合適的情境下如此使用的術(shù)語是可互換的，且本文所述的本發(fā)明的實(shí)施方式能夠以不同于本文所述或闡明的其他順序?qū)嵤?br> 僅為有助于理解本發(fā)明而提供了以下術(shù)語或定義。這些定義不應(yīng)解釋為具有小于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解的范圍。實(shí)施方式詳述本發(fā)明上下文中“血細(xì)胞”涉及血液中存在的哺乳動物細(xì)胞且包括紅細(xì)胞(紅細(xì)胞)、白細(xì)胞(白細(xì)胞)和血小板(凝血細(xì)胞)。本發(fā)明上下文中的“全血”涉及可能用抗凝劑處理的包含血漿和細(xì)胞的未處理的血液。“樣品”涉及包含細(xì)胞物質(zhì)的含水懸浮液，且包括體液例如淋巴、腦脊液、血液(全血和血漿)、唾液，但還包括例如均質(zhì)化的懸浮液諸如例如肌肉、腦、肝或其他組織的含水部分。
本發(fā)明中的“真核的”涉及不包括真菌的任何類型的真核生物體，例如動物，特別是包含血液的動物，且包括無脊椎動物例如甲殼動物和脊椎動物。脊椎動物包括冷血動物(魚、爬行動物、兩棲動物)和溫血動物(鳥類和哺乳動物)。哺乳動物特別包括靈長類且更特別地包括人。在樣品(例如血液)中，當(dāng)與保持完好的來自被收集樣品的生物體中的真核細(xì)胞的百分比相比，該樣品中保持完好的微生物細(xì)胞(例如細(xì)菌細(xì)胞)的百分比明顯更高(例如，2、5、10、20、50、100、250、500或1000倍更多)時，獲得本發(fā)明中使用的“選擇性裂解”。本發(fā)明中使用的“微生物”涉及通常作為病原體的存在于已被收集樣品的生物體中的細(xì)菌(革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌，以及細(xì)菌孢子)和單細(xì)胞真菌例如酵母和霉菌。本發(fā)明的第一方面涉及用于選擇性裂解包含或疑似包含微生物例如細(xì)菌的樣品中的真核細(xì)胞，特別是動物細(xì)胞的方法。該方法的目標(biāo)是增加用于檢測樣品中的微量細(xì)菌(gp，每ml樣品小于10000、1000、100或甚至更少的微生物)的試驗的靈敏度。如在發(fā)明背景中解釋的，來自樣品中真核細(xì)胞特別是動物細(xì)胞的DNA干擾基于PCR的檢測方法且該DNA與蛋白質(zhì)和膜一起形成聚集物，這種聚集物増加了裂解后的粘度并對裂解樣品的過濾具有顯著影響。為解決該問題，選擇性地裂解真核細(xì)胞特別是動物細(xì)胞，其中大部分的(即，大于20%、40%、60%、80%、90%或甚至大于95% )微生物保持存活，或如果被這種處理殺死，細(xì)菌DNA仍包含在細(xì)胞壁內(nèi)。本發(fā)明所述的方法中，解決了以上提及的問題。本發(fā)明所述的方法特別適用于任何類型的樣品，其中包含DNA的其他細(xì)胞，特別是來自其中微生物以病原體存在的宿主的細(xì)胞的存在阻礙了來自微生物，特別是細(xì)菌的DNA的檢測。現(xiàn)在進(jìn)一步闡述本發(fā)明所述的方法的實(shí)施方式，其中研究了哺乳動物血液樣品中微量細(xì)菌的存在。可將該血液樣品以全血或處理過的部分例如血漿或血小板制品儲存。通常，對新鮮分離的全血實(shí)施本發(fā)明所述的方法。通常用例如肝素、EDTA或檸檬酸鹽處理這些樣品以避免凝結(jié)?？蛇x擇地，通過將來自靜脈的血液直接收集在帶有去污劑和緩沖液的管中對新鮮血液實(shí)施該方法。因此，用緩沖液或非離子型去污劑補(bǔ)充新鮮的血液樣品或保存的樣品。緩沖液或其濃度的選擇被選擇為用于補(bǔ)償所提供的血液樣品的緩沖能力并獲得約9. 5或高于9. 5，更特別地在9. 5和11. 5之間，甚至更特別地在9. 5和10. 5之間的pH。大于11. 5的pH值適合更強(qiáng)健的生物體例如革蘭氏陽性細(xì)菌和真菌。同樣地充分濃縮緩沖液以向樣品中加入至多樣品體積的200 %、150 %、100 %、50 %、20 %或IO %的緩沖液體積以獲得所需要的pH變化。本發(fā)明上下文中合適緩沖液通常具有大于9、大于9. 5或甚至大于10的pKa，且包括硼酸鹽、碳酸鹽、CAPS、CAPSO、CHES、焦磷酸鹽、こ醇胺和在以上提及的pH范圍內(nèi)具有最佳緩沖能力的其他通常使用的緩沖液。合適的去污劑是非離子型去污劑，其一方面僅對真核細(xì)胞，特別是動物細(xì)胞具有裂解作用，且另一方面對DNA和蛋白質(zhì)具有增溶作用。非離子型去污劑的實(shí)例是烷基葡糖苷、Brij 35(C12E23聚氧こ烯ニ醇十二烷基醚)(15、7)、Brij 58 (C16E20聚氧こ烯ニ醇十二烷基醚)(16)、Genapol (13至 19)、glucanids 例如 MEGA-8、-9、-10、辛基葡糖苷(12、6)、Pluronic F127、TritonX-IOO(C14H22O(C2H4O)n) (13、4)、Triton X-IH(C24H42O6) (12、4)、吐溫 20 (聚山梨醇 20) (16、7)和吐溫80 (聚山梨醇80) (15) Nonidet P40脫氧膽酸鈉、還原型Triton X-100和或IgepalCA 630。非離子型去污劑的特別優(yōu)選的實(shí)例是Triton-X100。去污劑的最有效濃度取決于不同的去污劑，但通常在0. 1%和5%之間的范圍內(nèi)，更特別地在0. 1%和1%之間的范圍內(nèi)。取決于去污劑(固體或液體)，％分別指w/v%或
v/v% O在緩沖液和去污劑存在下，在10至30°C的溫度下，更優(yōu)選室溫附近，在10分鐘內(nèi)， 優(yōu)選在30秒和10分鐘之間且更優(yōu)選在約I至3、1-5、1-8、2-6或1_10分鐘內(nèi)進(jìn)行血液樣
品的孵育。根據(jù)本發(fā)明的方法具有優(yōu)點(diǎn)在低于30°C的溫度下，在10分鐘以下獲得選擇性裂解。因此，通?？稍诃h(huán)境溫度下實(shí)施該方法而不需要加熱樣品。任選地，裂解后，通過在中和步驟中加入酸或酸性緩沖液使裂解樣品的pH變成中性值(即，在7和9之間)。發(fā)現(xiàn)中性pH的裂解樣品可儲存更長的時間(多至1、2、6、12或甚至24小時)而不進(jìn)一歩裂解細(xì)菌細(xì)胞且沒有裂解樣品的流體性質(zhì)的顯著變化。本發(fā)明的方法中研究的另ー個參數(shù)是裂解后血液樣品的流體性質(zhì)的評價。這可通過檢驗可通過0. 22 μ m濾器過濾的裂解的血液的體積來測定。根據(jù)本發(fā)明的方法允許過濾通過向I體積的樣品中加入I體積的緩沖液/去污劑溶液稀釋的至少2、5、7. 5或甚至IOml的全血。通常，根據(jù)本發(fā)明的方法包括這樣的步驟，其中通常通過離心或過濾從樣品中分離完好的細(xì)菌細(xì)胞。在具體實(shí)施方式
中，通過使裂解樣品經(jīng)過具有I μ m以下的孔徑的濾器例如具有0. 4或0. 22 μ m的市售濾器截留通常具有0. 5和10 μ m之間的大小的細(xì)菌來從樣品中分離完好的細(xì)菌。對于樣品的過濾，存在各種各樣的市售裝置，例如這樣的濾器，其適合安裝在注射器上以可在裂解后通過對注射器的活塞人工施壓使注射器內(nèi)的流體流經(jīng)濾器。此后，可研究濾器上細(xì)菌(或真菌)的存在。在具體實(shí)施方式
中，通過PCR研究微生物的存在。為了該目的，可將細(xì)菌(或真菌)從濾器上洗掉并為了 PCR擴(kuò)增進(jìn)一步處理細(xì)菌(或真菌)?？蛇x擇地，用裂解緩沖液清洗濾器以釋放微生物中的DNA，其進(jìn)ー步用于PCR反應(yīng)。其他檢測步驟可通過細(xì)胞計量術(shù)、顯微鏡、PCR或培養(yǎng)實(shí)施。可在ー個裝置(圖11中所圖解示出的)中進(jìn)行樣品的裂解，微生物的過濾和檢測。因此，本發(fā)明的ー個方面涉及裝置(I)，其包括用于接收體積為I和IOml之間的樣品流體的裂解室(2)，與裂解室(2)連接的，包含堿性緩沖液及上述表面活性劑的儲存室(3)，或包含上述堿性緩沖液的儲存室(31)和包含上述表面活性劑的儲存室(32)。在裝置內(nèi)，裂解室與濾器(4)連接以在裂解后過濾樣品從而將微生物截留在濾器上。該裝置還包括從濾器中去除微生物并在隔開的室中裂解這些微生物的通道?？蛇x擇地，該裝置還包括用于在濾器上裂解微生物的設(shè)備，和將裂解細(xì)菌或真菌細(xì)胞的DNA從濾器轉(zhuǎn)移到隔開的室中的通道。該裝置還可包含DNA純化和檢測室(5)以測定DNA的存在。通常，檢測室是PCR模塊。圖12中示出了其中進(jìn)行選擇性裂解和隨后的DNA純化和鑒定的裝置的實(shí)例。體現(xiàn)本發(fā)明的系統(tǒng)和方法的其他布置將對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的。應(yīng)當(dāng)理解，盡管本文已討論了用于根據(jù)本發(fā)明的裝置的優(yōu)選實(shí)施方式、具體構(gòu)造和結(jié)構(gòu)，以及材料，可進(jìn)行形式和細(xì)節(jié)的多種變化或修改而不偏離本發(fā)明的范圍和精神。實(shí)施例IpH對過濾的影響該實(shí)驗的目標(biāo)是評價緩沖液的pH對過濾效率的影響。如通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)測量最終溶液的PH確認(rèn)的，緩沖能力是足夠在最終溶液中獲得相似pH的。緩沖液包含IM 硼酸鈉，pH 9. 0+1% Triton X-100IM 硼酸鈉，pH 9. 5+1% Triton X-100IM 碳酸鈉，pH 10. 0+1% Triton X-100IM 碳酸鈉，pH 10. 3+1% Triton X-100IM 碳酸鈉，pH 10. 8+1% Triton X-100將Iml的緩沖液與Iml的全血混合并孵育3分鐘。此后，加入中和緩沖液并使用真空過濾設(shè)置通過直徑25mm和具有0. 45 μ m孔徑的尺寸選擇濾器過濾混合物。測量阻塞前能夠通過濾器的血液體積。圖I中示出了結(jié)果。該實(shí)驗表明，為獲得足夠分析低濃度病原體的濾過的血液體積,最終pH值應(yīng)為約9. 5或更高。實(shí)施例2表明了緩沖液的pH對選擇性裂解血細(xì)胞后完好病原體(大腸桿菌(E.coli))的回收的影響。所使用的緩沖液包含IM 硼酸鈉，pH 9. 0+1% Triton X-100IM 硼酸鈉，pH 9. 5+1% Triton X-100IM 碳酸鈉，pH 10. 0+1% Triton X-100IM 碳酸鈉，pH 10. 5+1% Triton X-100將相同量的細(xì)菌摻入到Iml血液中。用以上提及的緩沖液處理該體積3分鐘。此后，離心(10min，4000g)血液以收集完好的細(xì)菌。使用標(biāo)準(zhǔn)的堿裂解方法裂解細(xì)菌并使用Qiagen離心柱(QiaAmp血液微型試劑盒)純化DNA。使用實(shí)時PCR對DNA量定量。圖2中不出了結(jié)果。以上提及的附圖示出了作為選擇性裂解緩沖液的pH的函數(shù)的細(xì)菌回收。在低pH值下，白細(xì)胞DNA不被降解且抑制PCR反應(yīng)。在高pH值下，細(xì)菌開始在選擇性裂解期間被裂解，且其未被回收。實(shí)施例3孵育時間對病原體回收的影響。該實(shí)驗表明血液與根據(jù)本發(fā)明的選擇性裂解緩沖液的延長孵育對完好病原體的回收的影響。將固定數(shù)量的細(xì)菌銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)摻入到血液中。將Iml的摻雜的血液與Iml的選擇性裂解緩沖液(1M碳酸鈉pH 10. 0+1% Triton X-100)混合并孵育1、2、3、5、7或10分鐘。此后，加入Iml的中和緩沖液。通過離心(4000g下IOmin)收集、病原體并洗滌細(xì)菌沉淀。最后，通過標(biāo)準(zhǔn)的堿裂解來裂解細(xì)胞，接下來使用QiaAmp血液微型試劑盒純化DNA。通過實(shí)時PCR測量回收的DNA的量。結(jié)果示出在圖3中并表明優(yōu)選孵育進(jìn)行30秒和10分鐘之間。實(shí)施例4通過根據(jù)本發(fā)明的選擇性裂解降低人背景本方法中真核細(xì)胞DNA，更具體地白細(xì)胞DNA的量的減少是重要的，因為當(dāng)存在吋，其將抑制接下來的檢測病原體DNA或RNA的PCR反應(yīng)。為檢測殘留背景DNA的量，用根據(jù)本發(fā)明的選擇性裂解方法處理不同的血液樣品并使用RNA酶P檢測試劑盒(AppliedBiosystems)分析PCR反應(yīng)中白細(xì)胞DNA的量。將這些樣品的Ct值與從存在全部白細(xì)胞DNA的200 μ I血液全血樣品中獲得的那些Ct值進(jìn)行比較。從文獻(xiàn)中已知來自于200μ I全血的人DNA是PCR反應(yīng)可耐受而不抑制病原體DNA擴(kuò)增的背景DNA的最大量。圖4中示出了不同PCR反應(yīng)的結(jié)果。該圖示出了根據(jù)本發(fā)明的方法(1Μ碳酸鈉pH 10. 0+1% Triton X-100)的Iml處理的血液樣品和200 μ I全血參考樣品的人背景的量的差異。處理了不同的樣品且以單獨(dú)的數(shù)據(jù)點(diǎn)示出了 PCR結(jié)果。這些結(jié)果表明與200 μ I全血參考樣品相比，根據(jù)本發(fā)明處理的Iml的樣品中的背景DNA的量低得多(=更高的Ct值)。該結(jié)果證明當(dāng)使用根據(jù)本發(fā)明的方法時有效且充分地去除了樣品中的白細(xì)胞DNA。實(shí)施例5該實(shí)施例的目的是闡明通過使用根據(jù)本發(fā)明的方法檢測來自全血的不同類型的病原體。將不同類型的病原體，革蘭氏陰性菌(銅綠假單胞菌)、革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌(S. aureus))和真菌(白色念珠菌(C. albicans)) —起混合到Iml血液中。用選擇性裂解緩沖液(Iml的IM碳酸鈉pH 10. 0+1% TX-100溶液)處理血液樣品3min，接下來中和PH并使用具有足夠小以截留所有細(xì)胞的孔的尺寸選擇濾器過濾。清洗濾器以去除殘留的抑制劑例如血紅蛋白和白細(xì)胞DNA。此后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的堿裂解方法裂解細(xì)胞并使用Qiagen血液微型試劑盒純化DNA。通過實(shí)時PCR檢測病原體DNA ;Ct值是DNA量的量度。為了定量，將小份的摻雜的血液樣品涂布在血瓊脂平板上以獲得CFU計數(shù)。圖5中提供的數(shù)據(jù)表明檢測來自全血的低數(shù)目的病原體是可能的。參考樣品包含于小體積的PBS緩沖液中的相同數(shù)目的細(xì)菌，直接裂解這些細(xì)菌，隨后純化DNA并使用實(shí)時PCR定量。參考測量和來自血液的實(shí)際的富集實(shí)驗提供了相似的Ct值，因此說明高的回收率。陰性對照(無細(xì)菌的血液)表明無PCR信號。該測定允許使用較大體積的血液。實(shí)驗設(shè)置與之前的實(shí)施例相同但血液的量增至5ml。參考樣品包含與5ml血液樣品相同數(shù)目的病原體但細(xì)胞留在小體積的PBS中并被直接裂解。圖6中示出了結(jié)果。該實(shí)驗表明從大體積的血液中回收低數(shù)目的病原體的可能性。數(shù)據(jù)表明回收的病原體DNA的濃度與參考相同。因此可得出結(jié)論大部分的病原體在選擇性裂解期間保持完好且白細(xì)胞DNA的減少對防止抑制病原體PCR是有效的。實(shí)施例6根據(jù)本發(fā)明的選擇性裂解法可以多種方式實(shí)施，包括但不限于人工程序和其中通過根據(jù)本發(fā)明的裝置實(shí)施該方法的程序(集成程序)。本實(shí)施例比較了該集成程序和人工程序。人工程序需要人工吸取和離心步驟，而集成程序使用能夠進(jìn)行全部所需操作的微量流體柱體(micro-fluidic cartridge)和尺寸選擇濾器。基礎(chǔ)生化方法是相似的使用IM·碳酸鈉+1% Triton X-100溶液選擇性裂解白細(xì)胞和紅細(xì)胞，然后3分鐘后進(jìn)行中和步驟。下一歩，將混合物離心(人工)或過濾(集成)并洗滌細(xì)胞且最后通過標(biāo)準(zhǔn)堿裂解程序釋放DNA。在最后的步驟中，使用Qiagen血液微型試劑盒純化DNA并通過實(shí)時PCR檢測DNA。以下圖7中可找到集成程序和人工程序的結(jié)果。獲得了相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果，表明該結(jié)果獨(dú)立于測定的實(shí)施形式。實(shí)施例7在該實(shí)施例中，相對于市售方法，即MolYsis Complete試劑盒(Molzym),檢驗(benchmark)根據(jù)本發(fā)明的方法。該試劑盒使用了離液劑和去污劑來選擇性裂解哺乳動物細(xì)胞。該裂解步驟之后是用不受該離液劑/去污劑影響的DNA酶消化。對于該實(shí)驗，用不同濃度的金黃色葡萄球菌摻雜Iml的血液樣品。按實(shí)施例5中所述處理Iml血液,并用MolYsis試劑盒根據(jù)廠家說明處理另外的lml。圖8中繪制了 Ct值對細(xì)胞濃度的圖，且Ct值表明不添加酶或離液鹽時根據(jù)本發(fā)明的方法至少與已知的MolYsis試劑盒ー樣有效。實(shí)施例8在選擇性裂解血細(xì)胞并在尺寸選擇濾器上富集病原體細(xì)胞后，采用堿裂解實(shí)現(xiàn)在濾器上同時裂解不同病原體以制備可用于PCR分析的DNA。圖9示出了在集成柱體上實(shí)施堿裂解程序的結(jié)果。用IO6金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和白色念珠菌的細(xì)胞摻雜Iml的血液。在選擇性裂解血細(xì)胞并在濾器上富集病原體細(xì)胞后，使用在95°C孵育IOmin的200 μ I的包含200mM NaOH,O. 5% SDS的溶液進(jìn)行堿裂解以在濾器中獲得對病原體的完全裂解。用20μ I的IM檸檬酸溶液中和包含病原體DNA的洗脫液，并使用QIAamp DNA/血液微型試劑盒純化。作為對照樣品，在實(shí)驗臺上裂解每種病原體的IO6細(xì)胞，并如上所述地中和并純化。為了優(yōu)化并檢驗堿裂解程序，選擇白色念珠菌(Candida albicans)作為模型系統(tǒng)，因為這些酵母細(xì)胞因其難以裂解的硬質(zhì)細(xì)胞壁而被熟知。圖10比較了堿裂解程序(使用50mM NaOH,O. 25% SDS結(jié)合熱處理)和其他裂解方法，即高強(qiáng)度超聲(HiFU)處理和商購試劑盒(BD GeneOhm裂解試劑盒)。對于堿裂解和商購試劑盒裂解,使用離心分別將樣品從Iml濃縮至160 μ I和100 μ I。對于HiFU，使用了 2ml細(xì)胞溶液，沒有之前的離心。裂解后，通過離心去除樣品中的未裂解的細(xì)胞和碎片。將1μ I的粗裂解液用作PCR輸入。NaOH和SDS的組合對裂解比每種單獨(dú)的化合物更有效。任何ー種化合物的濃度增加不會進(jìn)一步增加裂解效率。無加熱孵育步驟的堿裂解明顯更低效?？赏ㄟ^在95°C孵育2min増加裂解效率，然而，為了將測定整合入柱體，在70°C下孵育更長的時間是優(yōu)選的。對于堿性裂解，將細(xì)胞重懸在100 μ I的包含50mM NaOH和O. 25% SDS的裂解溶液中。隨后將樣品在70°C孵育lOmin，迅速冷卻至室溫并通過加入30 μ I的500mM Tris-HCl，pH 7.0(產(chǎn)生終濃度為150mM的Tris ，即NaOH濃度的3倍)來中和。對于粗裂解產(chǎn)物PCR，通過離心(5min，14，OOOg)去除樣品中的未裂解的細(xì)胞和碎片。將I μ I的上清液加入到25 μ I的PCR反應(yīng)中。PCR檢測基于靶向rRNA基因的Taqman PCR測定(Apollo)。使用500nM正向引物和300nM反向引物和FAM-BHQl標(biāo)記的探針(所有寡核苷酸由 Biolegio BV 定制合成)，在 Taqman Universal 主混合物(Applied Biosystems)中進(jìn)行PCR反應(yīng)。在Biorad CFX實(shí)時PCR系統(tǒng)中進(jìn)行PCR反應(yīng)。在95°C下IOmin的初始加熱步驟以活化熱啟動聚合酶之后，使用50個循環(huán)的95°C下持續(xù)15sec和60°C下持續(xù)Imin來擴(kuò)增。在每個循環(huán)中的60°C步驟期間檢測熒光信號。用Biorad CFX軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
權(quán)利要求
1.一種選擇性裂解包含或疑似包含微生物的樣品內(nèi)的真核細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟 a)提供包含或疑似包含微生物的帶有真核細(xì)胞的樣品， b)向所述樣品中加入非離子型去污劑和緩沖液以獲得具有約9.5或更高的pH的溶液； c)將所述溶液孵育足夠長的時間段以裂解所述真核細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述樣品是哺乳動物血液樣品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述血液樣品是全血。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項所述的方法，其中所述微生物是細(xì)菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項所述的方法，其中所述微生物是真菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一項所述的方法，其中所述孵育步驟c)進(jìn)行30秒和10分鐘之間。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項所述的方法，其中加入的去污劑和加入的緩沖液的體積與樣品的體積之間的比例在2/1和1/10之間。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至7中任一項所述的方法，其中所述非離子型去污劑以O(shè).1%和5%(w/v%或v/v% )的濃度存在。
9.根據(jù)權(quán)利要求I至8中任一項所述的方法，其中所述非離子型去污劑選自包括Nonidet P40、脫氧膽酸鹽、Igepal CA 630 和/或 Triton-X 100 的組。
10.根據(jù)權(quán)利要求I至9中任一項所述的方法，還包括將所述孵育的溶液離心并分離所述微生物的步驟。
11.根據(jù)權(quán)利要求I至10中任一項所述的方法，還包括在濾器上過濾所述孵育的溶液的步驟，所述濾器具有在所述濾器上截留微生物的孔徑。
12.根據(jù)權(quán)利要求I至11中任一項所述的方法，還包括裂解所述微生物的步驟。
13.根據(jù)權(quán)利要求I至12中任一項所述的方法，還包括基于核酸的分子測定。
14.一種用于檢測樣品中的微生物的裝置(I)，所述裝置(I)包括 用于接收體積低于40ml的樣品流體的裂解室(2)， 與所述裂解室連接的，包含具有9. 5或更高的pH的堿性緩沖液且包含非離子型去污劑的儲存室(3)，或包含pH約9. 5或更大的堿性緩沖液的儲存室(31)和包含非離子型去污劑的儲存室(32)， 與所述裂解室連接的用于過濾裂解樣品的濾器(4)，所述濾器(4)具有在所述濾器上截留細(xì)菌的孔徑，和 用于測定DNA的存在的檢測室(5)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的裝置，其中所述堿性緩沖液具有大于9.O的pKa和/或所述非離子型去污劑是Triton X-100。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于選擇性裂解包含微生物例如細(xì)菌的樣品中的細(xì)胞的方法和裝置。通過將樣品在堿性條件下在非離子型去污劑中孵育而獲得該選擇性裂解。
文檔編號C12N1/06GK102725423SQ201080055537
公開日2012年10月10日 申請日期2010年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月8日
發(fā)明者保羅·阿諾德·凡德維爾, 克里斯蒂安·安妮·施密特, 巴特·愛德華·古斯塔·約瑟夫·凡米爾伯根, 朗·吉爾, 歐娜·米哈埃拉·皮丘, 澤伊內(nèi)普·塞弗萊克·維奈, 羅埃爾·彼得曼, 西格林德·尼爾肯, 馬克·威廉默斯·吉斯波特·彭杰 申請人:比奧卡爾齊什股份有限公司