專(zhuān)利名稱(chēng)：用于治療處理腫瘤疾病的成體干細(xì)胞衍生的條件培養(yǎng)基和/或成體干細(xì)胞的制作方法
用于治療處理腫瘤疾病的成體干細(xì)胞衍生的條件培養(yǎng)基和
/或成體干細(xì)胞 本發(fā)明涉及腫瘤疾病的治療處理領(lǐng)域。轉(zhuǎn)移性癌癥細(xì)胞與干細(xì)胞共有許多特征如它們自我更新和產(chǎn)生多種后代(PiOgency)的能力。此外，干細(xì)胞和癌細(xì)胞的表型受微環(huán)境的影響很大。同時(shí)，胚胎微環(huán)境已顯示了抑制多種癌細(xì)胞株(癌細(xì)胞系)的致腫瘤性。結(jié)果表明，在原腸胚形成之前，將轉(zhuǎn)移性黑素瘤細(xì)胞暴露在胚胎斑馬魚(yú)的微環(huán)境中，導(dǎo)致它們重新編程趨向非致瘤表型(CucinaA，等人(2006). Zebrafish embryo proteins induce apoptosis in human colon cancercells (斑馬魚(yú)胚胎蛋白質(zhì)誘導(dǎo)人類(lèi)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡)(Caco2)。Apoptosisll: 1615 - 1628 ；Lee LM,等人(2005). The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos:Assessment of migration and cell division in the absence oftumor formation (人類(lèi)惡性黑素瘤細(xì)胞移植到斑馬魚(yú)胚胎中的命運(yùn)缺乏腫瘤形成的情況下遷移和細(xì)胞分裂的評(píng)估).DevDyn 233:1560-1570)。此外，所述移植到發(fā)育中雞胚的轉(zhuǎn)移性黑素瘤細(xì)胞能跟蹤神經(jīng)嵴遷移路徑，導(dǎo)致致腫瘤性的喪失和神經(jīng)嵴樣表型的獲取。最近研究表明，人類(lèi)胚胎干細(xì)胞(hESC)微環(huán)境，具體地將在轉(zhuǎn)移性黑素瘤和乳腺癌細(xì)胞內(nèi)胚胎形態(tài)Nodal的表達(dá)失效，使它們重新編程至低侵略性表型(Postovit LM等人(2008).Human embryonic stem cell microenvironment suppresses the tumorigenic phenotypeof aggressive cancer cells (人類(lèi)胚胎干細(xì)胞微環(huán)境抑制所述侵略性癌細(xì)胞的致瘤表型).PNAS105:4329 - 4334)。Postovit LM 等人揭示了 hESC-分泌型 Lefty，一種 Nodal 信號(hào)的抑制劑，作為這些現(xiàn)象的重要媒介物(mediator)。這些研究表明胚胎干細(xì)胞的微環(huán)境提供了一種以前未開(kāi)發(fā)的用于在侵略性腫瘤細(xì)胞中調(diào)節(jié)異常表達(dá)的胚胎因子的治療物質(zhì)(therapeutic entity)。在 Giuffrida D 等人，Human embryonic stem cells secrete soluble factorsthat inhibit cancer cell growth (人類(lèi)胚胎干細(xì)胞分泌抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的可溶性因子).Cell Prolif. 2009年9月I日中，結(jié)果表明對(duì)人類(lèi)上皮癌細(xì)胞株增殖的抑制通過(guò)hESC產(chǎn)生的可溶因子進(jìn)行介導(dǎo)。作者發(fā)現(xiàn)，在G (I)階段癌細(xì)胞的比例通過(guò)hESC CM處理增加，伴隨在S和G (2) /M階段細(xì)胞的減少，表明這些因子通過(guò)細(xì)胞周期抑制使癌細(xì)胞的進(jìn)程減慢。然而，通過(guò)胚胎干細(xì)胞已達(dá)到了這樣的結(jié)果，這些胚胎干細(xì)胞很難獲得并且引起倫理和方法學(xué)問(wèn)題，原因是需要破壞胚胎以獲得胚胎干細(xì)胞。此外，胚胎干細(xì)胞在體內(nèi)移植時(shí)經(jīng)受不受控制的增殖。本發(fā)明人在作為WO 2006/126219公布的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)中披露了人類(lèi)成體非卵圓肝臟干/祖細(xì)胞(HLSC)，其表達(dá)間充質(zhì)和胚胎干細(xì)胞標(biāo)記且具有多能分化能力和再生性倉(cāng)泛。雖然在W02006126219中HLSC被定義為“多能祖細(xì)胞”，但應(yīng)理解是，“祖細(xì)胞”和“干細(xì)胞”的表達(dá)均是指能夠自我更新并分化成專(zhuān)化(即分化)細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞。此外,在本發(fā)明背景中的術(shù)語(yǔ)“多能(multipotent)”和“多能性(pluripotent)”被認(rèn)為可互換，因?yàn)樗鼈兌际侵父?祖細(xì)胞分化成多種專(zhuān)化(分化)細(xì)胞類(lèi)型的能力。在此背景下，術(shù)語(yǔ)“多種”是指至少兩種，優(yōu)選地至少三種，專(zhuān)化(specialized)(分化)細(xì)胞類(lèi)型。在本發(fā)明背景下，表達(dá)“成體干細(xì)胞”意思是從成體組織中分離的干細(xì)胞，與從胚泡內(nèi)部細(xì)胞群分離的“胚胎干細(xì)胞”相對(duì)。成體干細(xì)胞也被稱(chēng)為“體干細(xì)胞(somatic stemcells)”。WO 2006/126236中披露的人類(lèi)非卵圓肝臟多能祖/干細(xì)胞顯示經(jīng)歷分化成多種組織細(xì)胞類(lèi)型(即，成熟肝臟細(xì)胞、上皮細(xì)胞、產(chǎn)胰島素細(xì)胞(胰島素分泌細(xì)胞，insulin-producing cell)和骨原細(xì)胞)并發(fā)揮器官再生作用。這種細(xì)胞衍生于非卵圓人類(lèi)肝臟多能祖細(xì)胞株，其表達(dá)肝細(xì)胞標(biāo)記。這種細(xì)胞通過(guò)包括以下步驟的方法分離(i)在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)成體肝臟衍生的人類(lèi)成熟肝細(xì)胞直至成熟肝細(xì)胞死亡并 選擇具有上皮樣形態(tài)的存活細(xì)胞群。(ii)通過(guò)以下擴(kuò)散(擴(kuò)增，expand)具有上皮樣形態(tài)的存活細(xì)胞群在含血清、含葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，補(bǔ)充有hEGF (人類(lèi)上皮生長(zhǎng)因子)和bFGF (堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)且含哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的一般無(wú)機(jī)鹽、氨基酸和維生素，且特別地其中所述成熟肝細(xì)胞在含血清培養(yǎng)基中在防冷凍劑存在下冷凍，然后根據(jù)步驟(i )在培育之前解凍(凍融)。WO 2006/126236中披露的人類(lèi)非卵圓肝臟干/祖細(xì)胞的特征及其制備方法全部引入本文以供參考。本領(lǐng)域也已知間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)制劑在一些組織上發(fā)揮再生作用。例如，熟知骨髓衍生的MSC通過(guò)分泌大量營(yíng)養(yǎng)分子，包括可溶細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，自然地支持造血功能。然而，當(dāng)被給予時(shí)，一些干細(xì)胞制劑具有引起免疫反應(yīng)的主要缺點(diǎn)。一些干細(xì)胞制劑甚至可能導(dǎo)致癌癥。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)條件培養(yǎng)基(conditioned medium, CM)出乎意料地顯示一種有效的抗腫瘤活性，該條件培養(yǎng)基來(lái)源于在液體細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)未充分分化的能夠產(chǎn)生多種分化的細(xì)胞類(lèi)型的成體干細(xì)胞(adult stem cell )，這正如說(shuō)明書(shū)的以下實(shí)驗(yàn)部分中描述的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)所證實(shí)的。本發(fā)明的用于抗腫瘤治療應(yīng)用的所述條件培養(yǎng)基(CM)包括多種分子和生物分子，尤其是蛋白質(zhì)，更尤其是培養(yǎng)期間由所述干細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面是一種條件培養(yǎng)基，該條件培養(yǎng)基包括多種細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)(cell-secreted protein)并可通過(guò)在液體細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)能分化成多種分化細(xì)胞類(lèi)型的成體干細(xì)胞來(lái)獲得，其用于腫瘤疾病的治療處理。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述條件培養(yǎng)基是無(wú)細(xì)胞的。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述條件培養(yǎng)基包含由成體干細(xì)胞(所述條件培養(yǎng)基從中獲得)組成的細(xì)胞組分(細(xì)胞碎片，cell fraction)?？商鎿Q地，如上面限定的所述成體干細(xì)胞本身用于腫瘤疾病的治療處理。本發(fā)明的另一個(gè)方面是所述條件培養(yǎng)基的應(yīng)用，該條件培養(yǎng)基包括多種細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)并可通過(guò)在液體細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)能分化成多種分化細(xì)胞類(lèi)型的成體干細(xì)胞來(lái)獲得，該應(yīng)用是用于制備治療處理腫瘤疾病的藥物。所述無(wú)細(xì)胞的或含所述細(xì)胞組分的條件培養(yǎng)基適用于腫瘤疾病的治療處理。然而，優(yōu)選所述無(wú)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，適用于治療處理腫瘤疾病的所述無(wú)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，例如，可通過(guò)包括以下步驟的方法獲得(i)將能夠分化成多種分化細(xì)胞類(lèi)型的成體干細(xì)胞在液體細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)預(yù)定的時(shí)間段，和；(ii)從所述液體細(xì)胞培養(yǎng)基中去除細(xì)胞組分，從而獲得包含多種細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)的無(wú)細(xì)胞條件培養(yǎng)基。本專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)的實(shí)驗(yàn)部分披露了一種適于獲得用于腫瘤疾病治療的所述條件培養(yǎng)基的液體細(xì)胞培養(yǎng)基。但是，應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)本發(fā)明所述適于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物干細(xì)胞或祖細(xì)胞，優(yōu)選人類(lèi)干細(xì)胞或祖細(xì)胞的任何液體細(xì)胞培養(yǎng)基可用于獲得所述細(xì)胞培養(yǎng)基。作為非限制性實(shí)例可提及下列可替換的培養(yǎng)基DulbeCC0改良的Eagle培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)混合物F_12(DMEM/F_12)，洛斯維公園紀(jì)念研究所培養(yǎng)基(RPMI-1640)，最低必需培養(yǎng)基(MEM) α培養(yǎng)基(α -ΜΕΜ)，培養(yǎng)·基199和Iscove改良的Dulbecco培養(yǎng)基(IMDM)。選擇和使用合適的培養(yǎng)基，例如，可取決于用于生成所述培養(yǎng)基的干細(xì)胞的特定類(lèi)型，這完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)和能力范圍內(nèi)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，將所述細(xì)胞組分培養(yǎng)預(yù)定的時(shí)間段，然后通過(guò)離心或過(guò)濾將其從所述液體細(xì)胞培養(yǎng)基中去除。例如，合適的預(yù)定時(shí)間段包含6到48小時(shí)之間，優(yōu)選地在12到24小時(shí)之間。任何適合成體動(dòng)物或人類(lèi)干/祖細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，優(yōu)選地哺乳動(dòng)物細(xì)胞，在非分化條件下，適用于用作所述液體細(xì)胞培養(yǎng)基。去除所述細(xì)胞組分后，由此獲得的所述無(wú)細(xì)胞條件培養(yǎng)基可選地經(jīng)進(jìn)一步純化步驟，例如超速離心法。超速離心法可在約20，000到300，OOOg下方便地進(jìn)行，優(yōu)選地約80，000到200，000g，在溫度低于室溫，例如約4°C，下進(jìn)行約I小時(shí)。進(jìn)一步可選的純化步驟是去除標(biāo)稱(chēng)分子量(nominal molecular weight, NMW)低于約3KDa的物質(zhì)組分，例如通過(guò)超濾來(lái)實(shí)現(xiàn)，和/或用RNA酶(核糖核酸酶，RNase)處理以降解任何可能包含在所述條件培養(yǎng)基內(nèi)的游離RNA。任何能夠分化成多種分化細(xì)胞類(lèi)型并能從成體組織中分離的干細(xì)胞/祖細(xì)胞，與胚胎干細(xì)胞相反，適用于生成對(duì)本發(fā)明治療應(yīng)用有用的所述條件培養(yǎng)基。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述成體干細(xì)胞選自由以下組成的組中肝臟干細(xì)胞、腎臟干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、血管周多能祖細(xì)胞(perivascular multipotent progenitor cell)、牙髓干細(xì)胞、上皮干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、來(lái)自脫落乳牙的干細(xì)胞和臍帶干細(xì)胞。所述成體干細(xì)胞可以是動(dòng)物干細(xì)胞或人類(lèi)干細(xì)胞。當(dāng)對(duì)人類(lèi)患者給予(實(shí)施)治療處理時(shí)，優(yōu)選人類(lèi)干細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述成體干細(xì)胞為非卵圓肝臟干細(xì)胞，優(yōu)選WO2006/126236中披露的所述非卵圓人類(lèi)肝臟多能祖細(xì)胞(HLSC)。然而，對(duì)腫瘤疾病的治療處理有效的條件培養(yǎng)基，也可從其它干細(xì)胞中獲得，例如前面段落提及的那些。本專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)實(shí)驗(yàn)部分提供的“比較例”表明HSLC-CM和MSC-CM都可有效地增加H印G2細(xì)胞的凋亡，盡管HSLC-CM比MSC-CM更有效。所述比較例也說(shuō)明兩個(gè)條件培養(yǎng)基(HSLC-CM和MSC-CM)比只使用TGF-β更有效。
在下文中，衍生于非卵圓肝臟干細(xì)胞(non-oval liver stem cell)的所述條件培養(yǎng)基，優(yōu)選W02006/126236中披露的所述非卵圓人類(lèi)肝臟多能祖細(xì)胞(non-oval humanliver pluripotent progenitor cell),被稱(chēng)為 “HLSC-CM”。HLSC-CM 優(yōu)選無(wú)細(xì)胞的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，HLSC具有W02006/126236第7頁(yè)，表I中總結(jié)的特性，(其中所述細(xì)胞被命名為“HuHEP”)，其例示了通過(guò)FACS和免疫熒光分析對(duì)它們的表征。本文下面報(bào)道了這些分析的結(jié)果。
權(quán)利要求
1.ー種條件培養(yǎng)基，其含有多種細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)并且其可通過(guò)在液體細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)能夠分化成多種分化細(xì)胞類(lèi)型的成體干細(xì)胞而獲得，用于腫瘤疾病的治療處理。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的條件培養(yǎng)基，其包含由從其中可獲得所述條件培養(yǎng)基的成體干細(xì)胞組成的細(xì)胞組分。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的條件培養(yǎng)基，其無(wú)細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的條件培養(yǎng)基，其可通過(guò)包括以下步驟的方法獲得 (i)將能夠分化成多種分化細(xì)胞類(lèi)型的成體干細(xì)胞在液體細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)預(yù)定的時(shí)間段；和 (ii)從所述液體細(xì)胞培養(yǎng)基中去除所述細(xì)胞組分，從而獲得包含多種細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)的無(wú)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的條件培養(yǎng)基，其中，通過(guò)離心或過(guò)濾將所述細(xì)胞組分從所述液體細(xì)胞培養(yǎng)基中去除。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的條件培養(yǎng)基，其中，所述液體細(xì)胞培養(yǎng)基另外在約20，000到300，000g，優(yōu)選地在約80，000到200，OOOg的G力下經(jīng)受超速離心。
7.根據(jù)權(quán)利要求4至6中任一項(xiàng)所述的條件培養(yǎng)基，其中，所述方法進(jìn)ー步包括以下步驟 (iii)從所述無(wú)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中去除標(biāo)稱(chēng)分子量低于3kDa的物質(zhì)組分。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的條件培養(yǎng)基，其中，標(biāo)稱(chēng)分子量低于3kDa的所述物質(zhì)組分利用超濾從所述無(wú)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中去除。
9.根據(jù)權(quán)利要求4至8中任一項(xiàng)所述的條件培養(yǎng)基，其中，所述方法進(jìn)ー步包括用RNA酶處理步驟(ii)或步驟(iii)中獲得的所述無(wú)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。
10.根據(jù)權(quán)利要求I至9中任一項(xiàng)所述的條件培養(yǎng)基，其中，能夠分化成多種分化細(xì)胞類(lèi)型的成體干細(xì)胞選自由以下組成的組中肝臟干細(xì)胞、腎臟干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、血管周多能祖細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞、上皮干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、來(lái)自脫落乳牙的干細(xì)胞和臍帶干細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的條件培養(yǎng)基,其中，能夠分化成多種分化細(xì)胞類(lèi)型的成體干細(xì)胞為非卵圓肝臟干細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的條件培養(yǎng)基，其中，所述非卵圓肝臟干細(xì)胞能夠分化為成熟肝臟細(xì)胞、產(chǎn)胰島素細(xì)胞、骨原細(xì)胞和上皮細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求I至12中任一項(xiàng)所述的條件培養(yǎng)基，其中，能夠分化成多種分化細(xì)胞類(lèi)型的成體干細(xì)胞為人類(lèi)細(xì)胞。
14.ー種成體干細(xì)胞，能夠分化成多種分化細(xì)胞類(lèi)型,用于腫瘤疾病的治療處理。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的成體干細(xì)胞，其是在權(quán)利要求10至13中任一項(xiàng)中所限定的。
16.根據(jù)權(quán)利要求I至13中任一項(xiàng)所述的條件培養(yǎng)基或根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的成體干細(xì)胞，其中，所述腫瘤疾病為實(shí)體腫瘤。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的條件培養(yǎng)基或成體干細(xì)胞，其中，所述腫瘤疾病選自包括以下的組中肝腫瘤、上皮性腫瘤、乳腺腫瘤、肺腫瘤、前列腺腫瘤、胃腫瘤、結(jié)腸腫瘤。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的條件培養(yǎng)基或成體干細(xì)胞，其中，所述腫瘤疾病選自包括以下的組中肝癌、卡波西肉瘤和乳腺癌。
19.權(quán)利要求I至13中任一項(xiàng)所述的條件培養(yǎng)基或權(quán)利要求14或15所述的成體干細(xì)胞在制備用于治療處理腫瘤疾病的藥物中的應(yīng)用。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的應(yīng)用，其中，所述腫瘤疾病是如在權(quán)利要求16至18中任一項(xiàng)所限定的。
21.根據(jù)權(quán)利要求19或20所述的應(yīng)用，其中，所述藥物用于局部或全身給予。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的應(yīng)用，其中，所述藥物用于通過(guò)注射給予。
全文摘要
本發(fā)明屬于腫瘤治療處理領(lǐng)域。已發(fā)現(xiàn)條件培養(yǎng)基發(fā)揮顯著的抗腫瘤作用，該條件培養(yǎng)基通過(guò)在液體細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)能夠分化成多種分化細(xì)胞類(lèi)型的成體干細(xì)胞和/或從中可獲得該條件培養(yǎng)基的成體干細(xì)胞而獲得。在這種治療應(yīng)用中優(yōu)選的成體干細(xì)胞衍生的條件培養(yǎng)基為衍生自人類(lèi)肝臟干細(xì)胞(HLSC-CM)的無(wú)細(xì)胞條件培養(yǎng)基。
文檔編號(hào)C12N5/074GK102686723SQ201080055957
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2010年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月9日
發(fā)明者喬瓦尼·卡穆西, 奇羅·泰塔, 瑪利亞·比阿特麗斯·赫雷拉桑切斯, 瓦倫丁娜·豐薩托 申請(qǐng)人:弗雷森紐斯醫(yī)療護(hù)理德國(guó)有限責(zé)任公司