專利名稱：支鏈脂肪酸以及其生物性生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)脂肪酸的細(xì)胞和方法，更具體地講涉及生產(chǎn)反異和/或異支鏈脂肪酸的細(xì)胞和方法。
背景技術(shù)：
反異和異支鏈脂肪酸是具有分別在n-2和η-l碳上具有甲基支鏈的羧酸。類似于其他脂肪酸，反異和異支鏈脂肪酸用于制造例如食品、洗滌劑、殺蟲劑和個人護(hù)理產(chǎn)品如洗發(fā)劑、皂和化妝品。反異和異支鏈脂肪酸能夠通過化學(xué)合成或能夠從某些動物和細(xì)菌中分離。雖然某些細(xì)菌例如大腸桿菌非天然生產(chǎn)反異或異支鏈脂肪酸，但一些細(xì)菌如芽孢桿菌屬和鏈霉菌屬的成員天然生產(chǎn)反異和異支鏈脂肪酸。例如，除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)都生產(chǎn)具有15個和17個總碳的反異脂肪酸和具有15個、16個和17個總碳的異支鏈脂肪酸(Cropp等人,Can.J.Microbiology 46:506-14(2000)；De Mendoza等人，Biosynthesis and Function of Membrane Lipids, in Bacillussubtilis and Other Gram-Positive Bacteria, Sonenshein 和 Losick 編輯，AmericanSociety for Microbiology, (1993))。然而,這些生物體不生產(chǎn)商業(yè)可用量的反異和/或異支鏈脂肪酸。這些天然生物體的另一限制是它們似乎不生產(chǎn)中鏈反異和/或異支鏈脂肪酸如具有11個或13個碳的那些。同樣地，需要商業(yè)可用的生物合成生產(chǎn)的反異和/或異支鏈脂肪酸。此外，需要生產(chǎn)此類反異和/或異支鏈脂肪酸的方法。

發(fā)明概述提供了生產(chǎn)反異和/或異支鏈脂肪酸(本文也稱為反異和/或異脂肪酸)的細(xì)胞和方法。多核苷酸包含編碼催化與細(xì)胞中支鏈脂肪酸生產(chǎn)相關(guān)聯(lián)的反應(yīng)的多肽的核酸序列。在一個方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)反異脂肪酸的方法。所述方法包括在允許一種或更多種多核苷酸的表達(dá)和反異脂肪酸的生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞包含至少一種外來的或過表達(dá)的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反應(yīng)中的至少一種:(aa)丙酮酸至檸蘋酸的轉(zhuǎn)化；(bb)檸蘋酸至檸康酸的轉(zhuǎn)化；(cc)檸康酸至β -甲基-D-蘋果酸的轉(zhuǎn)化；(dd) β -甲基-D-蘋果酸至2-氧代丁酸的轉(zhuǎn)化；或(ee)蘇氨酸至2-氧代丁酸的轉(zhuǎn)化。所述細(xì)胞比不包含所述一種或更多種多核苷酸的其它類似的細(xì)胞生產(chǎn)更多的反異脂肪酸。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞還包含至少一種外來的或過表達(dá)的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反應(yīng)中的至少一種:(ff) 2-氧代丁酸至2-乙酰-2-羥丁酸的轉(zhuǎn)化，(gg) 2-乙酰-2-羥丁酸至2，3- 二羥基-3-甲基戊酸的轉(zhuǎn)化，或(hh) 2，3- 二羥基-3-甲基戊酸至2-酮基-3-甲基戊酸的轉(zhuǎn)化。任選地，所述方法還包括從培養(yǎng)物中提取反異脂肪酸或從培養(yǎng)物中提取來源于反異脂肪酸的產(chǎn)物。本發(fā)明也提供細(xì)胞，所述細(xì)胞包含下列多核苷酸:包含編碼蘇氨酸脫氨酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、包含編碼支鏈α -酮酸脫氫酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸和包含編碼3-酮脂酰-ACP合酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸，其中所述多核苷酸在所述細(xì)胞中表達(dá)。此外，本發(fā)明提供細(xì)胞，所述細(xì)胞包含下列多核苷酸:包含編碼朽1蘋酸合酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、包含編碼支鏈a -酮酸脫氫酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸和包含編碼3-酮脂酰-ACP合酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸，其中所述多核苷酸在所述細(xì)胞中表達(dá)。任選地，所述細(xì)胞還包含下列多核苷酸:包含編碼乙酰羥酸合酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸和/或包含編碼硫酯酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸。本發(fā)明也提供了通過培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)反異脂肪酸的方法。在某些實(shí)施方案中，提供了具有至少一種外來的多核苷酸的細(xì)胞。作為另外一種選擇或除此之外，所述細(xì)胞包含過表達(dá)的多核苷酸。所述多核苷酸具有編碼多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反應(yīng)中的一種:異亮氨酸至2-酮基，3-甲基戊酸的轉(zhuǎn)化；2-酮基，3-甲基戊酸至2-甲基丁酰-CoA的轉(zhuǎn)化；2_甲基丁酰-CoA至2-甲基丁酰-ACP的轉(zhuǎn)化；
2-甲基丁酰-ACP至4-甲基3-酮己?；?ACP的轉(zhuǎn)化；2-甲基丁酰-CoA至4-甲基3-酮己?；?ACP的轉(zhuǎn)化；或酰基-ACP至反異脂肪酸的轉(zhuǎn)化。包含外來的多核苷酸的細(xì)胞比不包含所述外來的多核苷酸的其它類似的細(xì)胞生產(chǎn)更多的反異脂肪酸。本發(fā)明也提供了提高細(xì)菌細(xì)胞中反異脂肪酸的方法。所述方法包括在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)編碼多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列反應(yīng)中的一種:2_酮基，3-甲基戊酸至2-甲基丁酰-CoA的轉(zhuǎn)化；2-甲基丁酰-CoA至2-甲基丁酰-ACP的轉(zhuǎn)化；2_甲基丁酰-ACP至4-甲基3-酮己?；?ACP的轉(zhuǎn)化；2-甲基丁酰-CoA至4-甲基3-酮己酰基-ACP的轉(zhuǎn)化；或?；?ACP至反異脂肪酸的轉(zhuǎn)化，以及在允許細(xì)胞生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)所述細(xì)菌細(xì)胞使得反異脂肪酸生產(chǎn)。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)反異脂肪酸的大腸桿菌細(xì)胞。

還提供了提高細(xì)胞中反異脂肪酸的方法。所述方法包括在細(xì)胞中表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼外來的支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶、外來的支鏈a -酮酸脫氫酶(BCDH)和外來的3-酮脂酰-ACP合酶；以及在使得反異脂肪酸生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，提供了生產(chǎn)反異脂肪酸的方法。所述方法包括培養(yǎng)包含至少一種外來的多核苷酸的至少一種細(xì)胞，所述多核苷酸編碼至少一種多肽，其能夠在使得反異脂肪酸生產(chǎn)的條件下從異亮氨酸中生產(chǎn)反異脂肪酸。此外，在某些實(shí)施方案中，還提供了包含至少兩種外來的多核苷酸的細(xì)胞。所述外來的多核苷酸包含編碼多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反應(yīng)中的至少兩種:亮氨酸至2-酮基，4-甲基戊酸的轉(zhuǎn)化；纈氨酸至2-酮基3-甲基丁酸的轉(zhuǎn)化；2_酮基，4-甲基戊酸至3-甲基丁酰-CoA的轉(zhuǎn)化；3-甲基丁酰-CoA至3-甲基丁酰-ACP的轉(zhuǎn)化；3_甲基丁酰-ACP至5-甲基3-酮己?；?ACP的轉(zhuǎn)化；2_酮基3-甲基丁酸至2-甲基丙酰-CoA的轉(zhuǎn)化；2-甲基丙酰-Cok至2-甲基丙酰-ACP的轉(zhuǎn)化；2-甲基丙酰-ACP至4-甲基戊酰-ACP的轉(zhuǎn)化；3_甲基丁酰-CoA至5-甲基3-酮己?；?ACP的轉(zhuǎn)化；2-甲基丙酰-CoA至4-甲基3-酮戊酰-ACP的轉(zhuǎn)化；或?；?ACP至異脂肪酸的轉(zhuǎn)化，并且其中包含所述外來的多核苷酸的細(xì)胞比不包含所述外來的多核苷酸的其它類似的細(xì)胞生產(chǎn)更多的異脂肪酸。還提供了提高細(xì)菌細(xì)胞中異脂肪酸的方法。所述方法包括在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)編碼至少兩種多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列反應(yīng)中的至少兩種:亮氨酸至2-酮基，4-甲基戊酸的轉(zhuǎn)化；纈氨酸至2-酮基3-甲基丁酸的轉(zhuǎn)化；2_酮基，4-甲基戊酸至3-甲基丁酰-CoA的轉(zhuǎn)化；3-甲基丁酰-CoA至3-甲基丁酰-ACP的轉(zhuǎn)化；3_甲基丁酰-ACP至5-甲基3-酮己?；?ACP的轉(zhuǎn)化；2_酮基3-甲基丁酸至2-甲基丙酰-CoA的轉(zhuǎn)化；2_甲基丙酰-CoA至2-甲基丙酰-ACP的轉(zhuǎn)化；2_甲基丙酰-ACP至4-甲基戊酰-ACP的轉(zhuǎn)化；3-甲基丁酰-CoA至5-甲基3-酮己?；?ACP的轉(zhuǎn)化；2-甲基丙酰-CoA至4-甲基3-酮戊酰-ACP的轉(zhuǎn)化；或?；?ACP至異脂肪酸的轉(zhuǎn)化，以及在允許細(xì)胞生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)所述細(xì)菌細(xì)胞使得異脂肪酸生產(chǎn)。下列每個編號的段落簡明地定義本發(fā)明的一個或多個示例性變型:1.生產(chǎn)反異脂肪酸的方法，所述方法包括在在允許一種或更多種多核苷酸的表達(dá)和反異脂肪酸的生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞包含至少一種外來的或過表達(dá)的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反應(yīng)中的至少一種:(aa)丙酮酸至朽1蘋酸的轉(zhuǎn)化；(bb)朽1蘋酸至朽1康酸的轉(zhuǎn)化；(cc)朽1康酸至P -甲基-D-蘋果酸的轉(zhuǎn)化；(dd) P -甲基-D-蘋果酸至2-氧代丁酸的轉(zhuǎn)化；或(ee)蘇氨酸至2_氧代丁酸的轉(zhuǎn)化，其中所述細(xì)胞比不包含所述一種或更多種多核苷酸的其它類似的細(xì)胞生產(chǎn)更多的反異脂肪酸。2.如段落I所述的方法，所述方法還包括將所述細(xì)胞暴露于硫胺素。3.如段落I所述的方法，所述方法還包括從培養(yǎng)物中提取反異脂肪酸。4.如段落I所述的方法，所述方法還包括從所述培養(yǎng)物中提取來源于反異脂肪酸的產(chǎn)物。

5.如段落I所述的方法，其中所述細(xì)胞還包含至少一種外來的或過表達(dá)的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反應(yīng)中的至少一種:(ff) 2-氧代丁酸至2-乙酰-2-羥丁酸的轉(zhuǎn)化，(gg) 2-乙酰-2-羥丁酸至2，3- 二羥基-3-甲基戊酸的轉(zhuǎn)化，或(hh) 2，3- 二羥基-3-甲基戊酸至2-酮基-3-甲基戊酸的轉(zhuǎn)化。6.如段落5所述的方法，其中所述細(xì)胞包含外來的或過表達(dá)的多核苷酸，所述多核苷酸編碼催化3、4、5、6、7或全部反應(yīng)的多肽。7.如段落5所述的方法，其中所述細(xì)胞包含外來的或過表達(dá)的多核苷酸，所述多核苷酸編碼催化反應(yīng)(aa)、(bb)、(cc)和(ff)的多肽。8.如段落5所述的方法，其中所述細(xì)胞包含下列多核苷酸:編碼檸蘋酸合酶的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、包含編碼乙酰羥酸合酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、包含編碼異丙基蘋果酸異構(gòu)酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、包含編碼異丙基蘋果酸脫氫酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、或它們的組合。9.如段落8所述的方法，其中所述細(xì)胞包含下列多核苷酸:編碼檸蘋酸合酶的外來的多核苷酸、編碼乙酰羥酸合酶的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、編碼異丙基蘋果酸異構(gòu)酶的外來的或過表達(dá)的多核苷酸和編碼異丙基蘋果酸脫氫酶的外來的或過表達(dá)的多核苷酸。10.如段落8所述的方法，其中所述檸蘋酸合酶是來源于詹氏甲烷球菌(M.jannaschii ) CimA011.如段落8所述的方法，其中所述異丙基蘋果酸異構(gòu)酶是大腸桿菌Leu⑶。12.如段落8所述的方法，其中所述異丙基蘋果酸脫氫酶是大腸桿菌LeuB。
13.如段落8所述的方法，其中所述乙酰羥酸合酶是大腸桿菌IlvIH、大腸桿菌IlvIH (G14D)、大腸桿菌IlvGM或枯草芽孢桿菌IlvBH。14.如段落5所述的方法，其中所述細(xì)胞包含外來的或過表達(dá)的多核苷酸，所述多核苷酸編碼催化反應(yīng)(ee)和(ff)的多肽。15.如段落5所述的方法，其中所述細(xì)胞包含下列多核苷酸:編碼蘇氨酸脫氨酶的外來的或過表達(dá)的多核苷酸和編碼乙酰羥酸合酶的外來的或過表達(dá)的多核苷酸。16.如段落15所述的方法，其中所述蘇氨酸脫氨酶是大腸桿菌TdcB。17.如段落15所述的方法，其中所述乙酰羥酸合酶是大腸桿菌IlvIH、大腸桿菌IlvIH (G14D)、大腸桿菌IlvGM或枯草芽孢桿菌IlvBH。18.如段落5所述的方法，其中所述一種或更多種外來的或過表達(dá)的多核苷酸(i)包含核酸序列，所述核酸序列與如SEQ ID N0:32、36、42、43、46、51、57、62、68或83所示的核酸序列具有至少約90%的同一性，或(ii)編碼多肽，所述多肽包含的氨基酸序列與如SEQID N0:33、39、40、41、47、48、52、53、58、65、66、67、84 或 85 所示的氨基酸序列具有至少約90%的同一性。19.如段落5所述的方法，其中所述細(xì)胞經(jīng)修飾以降低支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶的活性。20.如段落5所述的方法，其中所述細(xì)胞還包含下列多核苷酸:包含編碼支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、包含編碼支鏈a -酮酸脫氫酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、包含編碼?；D(zhuǎn)移酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、包含編碼3-酮脂酰-ACP合酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、包含編碼烯酰-ACP還原酶的核 酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、包含編碼硫酯酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、或它們的組合。21.如段落20所述的方法，其中所述一種或更多種外來的或過表達(dá)的多核苷酸包含核酸序列(i)所述核酸序列與如 SEQ ID N0:l、4、7、13、17、18、19、20、21、22、23、68、77 或78所示的核酸序列具有至少90%的同一性，或(ii)所述核酸序列編碼多肽，所述多肽具有的氨基酸序列，所述氨基酸序列與如SEQ ID NO: 10、16、24、25、26、27、28、29或73所示的氨
基酸序列具有至少90%的同一性。22.如段落20所述的方法，其中所述細(xì)胞包含下列多核苷酸:包含編碼支鏈a -酮酸脫氫酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸和包含編碼3-酮脂酰-ACP合酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸。23.如段落22所述的方法，其中所述細(xì)胞是埃希氏菌屬細(xì)胞。24.如段落22所述的方法，其中所述支鏈a-酮酸脫氫酶是枯草芽孢桿菌Bkd。25.如段落22所述的方法，其中所述3_酮脂酰-ACP合酶是枯草芽孢桿菌FabH。26.如段落22所述的方法，其中所述細(xì)胞還包含外來的或過表達(dá)的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼硫酯酶的核酸序列。27.細(xì)胞，所述細(xì)胞包含下列多核苷酸:包含編碼蘇氨酸脫氨酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、包含編碼支鏈a -酮酸脫氫酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸和包含編碼3-酮脂酰-ACP合酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸,其中所述多核苷酸被表達(dá)，并且所述細(xì)胞比不包含所述一種或更多種多核苷酸的其它類似的細(xì)胞生產(chǎn)更多的反異脂肪酸。28.如段落27所述的細(xì)胞，其中所述支鏈a-酮酸脫氫酶是枯草芽孢桿菌Bkd，并且所述3-酮脂酰-ACP合酶是枯草芽孢桿菌FabH。29.如段落27所述的細(xì)胞，所述細(xì)胞還包含外來的或過表達(dá)的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼硫酯酶的核酸序列。30.如段落27所述的細(xì)胞，所述細(xì)胞還包含外來的或過表達(dá)的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼乙酰羥酸合酶的核酸序列。31.如段落30所述的細(xì)胞，其中所述乙酰羥酸合酶是大腸桿菌IlvIH、大腸桿菌IlvIH (G14D)、大腸桿菌IlvGM或枯草芽孢桿菌IlvBH。32.如段落27所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是非天然生產(chǎn)反異脂肪酸的細(xì)菌細(xì)胞。33.如段落32所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是埃希氏菌屬細(xì)胞。34.生產(chǎn)反異脂肪酸的方法，所述方法包括在允許所述多核苷酸的表達(dá)和反異脂肪酸的生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)段落32的細(xì)菌細(xì)胞。35.細(xì)胞，所述細(xì)胞包含下列多核苷酸:包含編碼檸蘋酸合酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、包含編碼支鏈Ct -酮酸脫氫酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸和包含編碼3-酮脂酰-ACP合酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸，其中所述多核苷酸被表達(dá)，并且所述細(xì)胞比不包含所述一種或更多種多核苷酸的其它類似的細(xì)胞生產(chǎn)更多的反異脂肪酸。36.如段落35所述的細(xì)胞，其中所述檸蘋酸合酶是來源于詹氏甲烷球菌CimAjf述支鏈a -酮酸脫氫酶是枯草芽孢 桿菌Bkd，并且所述3-酮脂酰-ACP合酶是枯草芽孢桿菌FabH037.如段落35所述的細(xì)胞，所述細(xì)胞還包含下列多核苷酸:包含編碼異丙基蘋果酸異構(gòu)酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、包含編碼異丙基蘋果酸脫氫酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、包含編碼乙酰羥酸合酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、包含編碼烯酰-ACP合酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、包含編碼硫酯酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、或它們的組合。38.如段落37所述的方法，其中所述異丙基蘋果酸異構(gòu)酶是大腸桿菌Leu⑶。39.如段落37所述的方法，其中所述異丙基蘋果酸脫氫酶是大腸桿菌LeuB。40.如段落37所述的細(xì)胞，其中所述乙酰羥酸合酶是大腸桿菌IlvIH、大腸桿菌IlvIH (G14D)、大腸桿菌IlvGM或枯草芽孢桿菌IlvBH。41.如段落35所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是非天然生產(chǎn)反異脂肪酸的細(xì)菌細(xì)胞。42.如段落41所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是埃希氏菌屬細(xì)胞。43.生產(chǎn)反異脂肪酸的方法，所述方法包括在允許所述多核苷酸的表達(dá)和反異脂肪酸的生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)段落41的細(xì)菌細(xì)胞。44.細(xì)胞，所述細(xì)胞包含至少一種外來的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含編碼多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反應(yīng)中的其中一種:a.異亮氨酸至2-酮基，3-甲基戊酸的轉(zhuǎn)化；b.2-酮基，3-甲基戊酸至2-甲基丁酰-CoA的轉(zhuǎn)化；c.2-甲基丁酰-CoA至2-甲基丁酰-ACP的轉(zhuǎn)化；d.2-甲基丁酰-ACP至4-甲基3-酮己?；?ACP的轉(zhuǎn)化；e.2-甲基丁酰-CoA至4-甲基3-酮己?；?ACP的轉(zhuǎn)化；或f.?；?ACP至反異脂肪酸的轉(zhuǎn)化，并且其中包含所述外來的多核苷酸的細(xì)胞比不包含所述外來的多核苷酸的其它類似的細(xì)胞生產(chǎn)更多的反異脂肪酸。45.如段落44所述的細(xì)胞，其中所述多核苷酸編碼支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶、支鏈a -酮酸脫氫酶(B⑶H)、?；D(zhuǎn)移酶、3-酮脂酰-ACP合酶或硫酯酶。46.如段落44所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是埃希氏菌屬細(xì)胞。47.如段落44所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含多核苷酸，所述多核苷酸編碼催化
2、3、4、5或全部反應(yīng)的多肽。48.如段落44所述的細(xì)胞，其中所述多核苷酸與如SEQ ID NO: 1、4、7、13、17、18、19、20、21、22或23所示的序列具有至少30%的序列同一性。49.如段落44所述的細(xì)胞，其中所述多肽與如SEQ ID NO: 10、16、24、25、26、27、28或29所示的序列具有至少40%的序列同一性。50.如段落44所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞，并且所述多核苷酸與如SEQ ID N0:l、4、7、13、17、18、19、20、21、22或23所示的序列具有至少65%的序列同一性。51.如段落44所述的細(xì)胞，其中所述多肽基本上與具有如SEQ ID NO: 10,16,24,25、26、27、28或29所示的序列的多肽相同。52.如段落44所述的細(xì)胞，其中所述反異脂肪酸是中鏈反異脂肪酸。53.如段落44所述的細(xì)胞，其中所述反異脂肪酸在所述細(xì)胞中非天然生產(chǎn)。54.反異脂肪酸由如段 落44所述的細(xì)胞生產(chǎn)。55.如段落44所述的細(xì)胞，其中所述多核苷酸編碼來自芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)或李斯特菌屬(Listeria)的脂肪酸合酶基因。56.如段落44所述的細(xì)胞，其中所述多核苷酸編碼來自天然生產(chǎn)支鏈脂肪酸的生物體的脂肪酸合酶基因。57.提高細(xì)菌細(xì)胞中反異脂肪酸的方法，所述方法包括:a.在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)編碼多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列反應(yīng)中的一種:1.2-酮基，3-甲基戊酸至2-甲基丁酰-CoA的轉(zhuǎn)化；i1.2-甲基丁酰-CoA至2-甲基丁酰-ACP的轉(zhuǎn)化；ii1.2-甲基丁酰-ACP至4-甲基3-酮己酰基-ACP的轉(zhuǎn)化；iv.2-甲基丁酰-Cok至4-甲基3-酮己?；?ACP的轉(zhuǎn)化；或V.?；?ACP至反異脂肪酸的轉(zhuǎn)化，以及b.在允許細(xì)胞生產(chǎn)所述多肽的條件下培養(yǎng)所述細(xì)菌細(xì)胞使得反異脂肪酸生產(chǎn)。58.如段落57所述的方法，其中所述細(xì)胞在表達(dá)所述多核苷酸后比它在表達(dá)所述多核苷酸前生產(chǎn)更高含量的反異脂肪酸。59.如段落57所述的方法，其中所述多肽是支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶、支鏈a -酮酸脫氫酶(BCDH)、3-酮脂酰-ACP合酶或硫酯酶。60.如段落57所述的方法，其中所述細(xì)胞是埃希氏菌屬細(xì)胞。61.如段落57所述的方法，其中所述方法包括在所述細(xì)菌中表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸編碼催化2、3、4、5或全部反應(yīng)的多肽。62.如段落57所述的方法，其中所述多核苷酸與如SEQ ID NO: 1、4、7、13、17、18、19、20、21、22或23所示的序列具有至少30%的序列同一性。63.如段落57所述的方法，其中所述多肽與如SEQ ID NO: 10、16、24、25、26、27、28或29所示的序列具有至少40%的序列同一性。
64.如段落57所述的方法，其中所述細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞，并且所述多核苷酸與如SEQ ID N0:l、4、7、13、17、18、19、20、21、22或23所示的序列具有至少65%的序列同一性。65.如段落57所述的方法，其中所述多肽基本上與具有如SEQ ID NO: 10,16,24,25、26、27、28或29所示的序列的多肽相同。66.如段落57所述的方法，其中所述反異脂肪酸是中鏈反異脂肪酸。67.如段落57所述的方法，其中所述反異脂肪酸在所述細(xì)胞中非天然生產(chǎn)。68.反異脂肪酸由如段落57所述的方法生產(chǎn)。69.大腸桿菌細(xì)胞，所述細(xì)胞生產(chǎn)反異脂肪酸。70.如段落69所述的細(xì)胞，其中所述反異脂肪酸是中鏈脂肪酸。71.如段落69所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含多核苷酸，所述多核苷酸與如SEQID NO: 1、4、7、13、17、18、19、20、21、22或23所示的序列具有至少30%的序列同一性。72.反異脂肪酸由如段落69所述的細(xì)胞生產(chǎn)。73.提高細(xì)胞中反異脂肪酸的方法，所述方法包括:a.在細(xì)胞中表達(dá)一種或更多種多核苷酸，所述多核苷酸編碼外來的支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶、外來的支鏈a -酮酸脫氫酶(BOTH)和外來的3-酮脂酰-ACP合酶；b.在使得反異脂肪酸生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。

74.如段落73所述的方法，其中所述方法還包括在所述細(xì)胞中表達(dá)編碼外來硫酯酶的多核苷酸。75.如段落73所述的方法，其中所述多核苷酸與如SEQ ID NO: 1、4、7、13、17、18、19、20、21、22或23所示的序列具有至少30%的序列同一性。76.如段落73所述的方法，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽與如SEQ IDNO: 10、16、24、25、26、27、28或29所示的序列具有至少40%的序列同一性。77.如段落73所述的方法，其中所述細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞，并且所述多核苷酸與如SEQ ID N0:l、4、7、13、17、18、19、20、21、22或23所示的序列具有至少65%的序列同一性。78.如段落76所述的方法，其中所述多肽基本上與具有如SEQ ID NO: 10,16,24,25、26、27、28或29所示的序列的多肽相同。79.如段落73所述的方法，其中所述反異脂肪酸是中鏈反異脂肪酸。80.如段落73所述的方法，其中所述反異脂肪酸在所述細(xì)胞中非天然生產(chǎn)。81.反異脂肪酸由如段落73所述的方法生產(chǎn)。82.生產(chǎn)反異脂肪酸的方法，所述方法包括培養(yǎng)至少一種細(xì)胞，所述細(xì)胞包含至少一種外來的多核苷酸，所述多核苷酸編碼至少一種多肽，所述多肽能夠在使得反異脂肪酸生產(chǎn)的條件下從異亮氨酸中生產(chǎn)反異脂肪酸。83.如段落82所述的方法，其中所述細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。84.如段落82所述的方法，其中所述反異脂肪酸在所述細(xì)胞中非天然生產(chǎn)。85.反異脂肪酸由如段落82所述的方法生產(chǎn)。86.細(xì)胞，所述細(xì)胞包含至少兩種外來的多核苷酸，其中所述外來的多核苷酸包含編碼多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反應(yīng)中的至少兩種:a.亮氨酸至2-酮基，4-甲基戊酸的轉(zhuǎn)化；b.纈氨酸至2-酮基3-甲基丁酸的轉(zhuǎn)化；c.2-酮基，4-甲基戊酸至3-甲基丁酰-CoA的轉(zhuǎn)化；d.3-甲基丁酰-CoA至3-甲基丁酰-ACP的轉(zhuǎn)化；e.3-甲基丁酰-ACP至5-甲基3-酮己?；?ACP的轉(zhuǎn)化；f.2-酮基3-甲基丁酸至2-甲基丙酰-CoA的轉(zhuǎn)化；g.2-甲基丙酰-CoA至2-甲基丙酰-ACP的轉(zhuǎn)化；h.2-甲基丙酰-ACP至4-甲基戊酰-ACP的轉(zhuǎn)化；1.3-甲基丁酰-CoA至5-甲基3-酮己?；?ACP的轉(zhuǎn)化；j.2-甲基丙酰-CoA至4-甲基3-酮戊酰-ACP的轉(zhuǎn)化；或k.酰基-ACP至異脂肪酸的轉(zhuǎn)化，并且其中包含所述外來的多核苷酸的細(xì)胞比不包含所述外來的多核苷酸的其它類似的細(xì)胞生產(chǎn)更多的異脂肪酸。87.如段落86所述的細(xì)胞，其中所述多核苷酸編碼支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶、支鏈a -酮酸脫氫酶(B⑶H)、酰基轉(zhuǎn)移酶、3-酮脂酰-ACP合酶或硫酯酶。88.如段落86所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是埃希氏菌屬細(xì)胞。89.如段落86所述的細(xì)胞，其中所述多核苷酸包含核酸序列，所述核酸序列編碼催化3、4、5、6、7、8、9、10或全部反應(yīng)的多肽。90.如段落86所述的細(xì)胞，其中所述多核苷酸與如SEQ ID NO: 1、4、7、13、17、18、19、20、21、22或23所示的序列具有至少30%的序列同一性。91.如段落86所述的細(xì)胞，其中所述多肽與如SEQ ID NO: 10、16、24、25、26、27、28或29所示的序列具有至少40%的序列同一性。92.如段落86所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞，并且所述多核苷酸與如SEQ ID N0:l、4、7、13、17、18、19、20、21、22或23所示的序列具有至少65%的序列同一性。93.如段落86所述的細(xì)胞，其中所述多肽基本上與具有如SEQ ID NO: 10,16,24,25、26、27、28或29所示的序列的多肽相同。94.如段落86所 述的細(xì)胞，其中所述異脂肪酸是中鏈異脂肪酸。95.如段落86所述的細(xì)胞，其中所述異脂肪酸在所述細(xì)胞中非天然生產(chǎn)。96.異脂肪酸由如段落86所述的細(xì)胞生產(chǎn)。97.如段落86所述的細(xì)胞，其中所述多核苷酸編碼來自芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬或李斯特菌屬的脂肪酸合酶基因。98.如段落86所述的細(xì)胞，其中所述多核苷酸編碼來自天然生產(chǎn)支鏈脂肪酸的生物體的脂肪酸合酶基因。99.提高細(xì)菌細(xì)胞中異脂肪酸的方法，所述方法包括:a.在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)編碼至少兩種多肽的多核苷酸，所述多肽催化下列反應(yīng)中的至少兩種:1.亮氨酸至2-酮基，4-甲基戊酸的轉(zhuǎn)化；i1.纈氨酸至2-酮基3-甲基丁酸的轉(zhuǎn)化；ii1.2-酮基，4-甲基戍酸至3-甲基丁酰-CoA的轉(zhuǎn)化；iv.3-甲基丁酰-CoA至3-甲基丁酰-ACP的轉(zhuǎn)化；v.3-甲基丁酰-ACP至5-甲基3-酮己?；?ACP的轉(zhuǎn)化；v1.2-酮基3-甲基丁酸至2-甲基丙酰-CoA的轉(zhuǎn)化；vi1.2-甲基丙酰-CoA至2-甲基丙酰-ACP的轉(zhuǎn)化；vii1.2-甲基丙酰-ACP至4-甲基戊酰-ACP的轉(zhuǎn)化；ix.3-甲基丁酰-CoA至5-甲基3-酮己酰基-ACP的轉(zhuǎn)化；x.2-甲基丙酰-CoA至4-甲基3-酮戊酰-ACP的轉(zhuǎn)化；和x1.?；?ACP至異脂肪酸的轉(zhuǎn)化，以及b.在允許細(xì)胞生產(chǎn)所述多肽的條件下培養(yǎng)所述細(xì)菌細(xì)胞使得異脂肪酸生產(chǎn)。100.通過使用不能夠降解脂肪酸的宿主菌株提高反異脂肪酸在所述培養(yǎng)基中積聚的方法。101.如段落100所述的宿主菌株，其中所述生物體是大腸桿菌。102.如段落100所述的宿主菌株，其中所述生物體是大腸桿菌fadD突變體。
103.提高細(xì)胞中反異脂肪酸產(chǎn)量的方法，所述方法包括:a.在所述細(xì)胞中表達(dá)編碼多肽的多核苷酸，所述多肽具有下列活性中的一種:檸蘋酸合酶、異丙基蘋果酸異構(gòu)酶和/或異丙基蘋果酸脫氫酶，以及b.在允許細(xì)胞生產(chǎn)所述多肽的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞使得反異脂肪酸生產(chǎn)。104.如段落103所述的方法，其中所述方法包括在所述細(xì)胞中表達(dá)編碼具有2種或3種所述活性的多肽的多核苷酸。105.提高細(xì)胞中反異脂肪酸產(chǎn)量的方法，所述方法包括:a.在所述細(xì)胞中表達(dá)編碼ilvA、tdcB、ilvl、ilvH、ilvC和/或ilvD的多核苷酸的至少一種，以及b.在允許細(xì)胞生產(chǎn)由所述多核苷酸編碼的多肽的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞使得反異脂肪酸生產(chǎn)。106.提高細(xì)胞中異和/或反異脂肪酸產(chǎn)量的方法,所述方法包括:a.在所述細(xì)胞中表達(dá)編碼具有乙酰-CoA羧化酶活性的多肽的多核苷酸，以及b.在允許細(xì)胞生產(chǎn)所述多肽的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞使得異和/或反異脂肪酸生產(chǎn)。附圖簡述

圖1是反異和異支鏈脂肪酸生物合成途徑的圖表。圖2是蘇氨酸依賴型反異脂肪酸生物合成途徑的圖表。圖3是擴(kuò)增的bkd操縱子的DNA序列(SEQ ID NO:1)。圖4 是 bkd 引物的序列(SEQ ID N0:2、3)。圖5是bkd操縱子的IpdV基因的DNA序列(SEQ ID NO:4)。

圖6 是 fabHA 引物的序列(SEQ ID N0:5、6、8、9)。圖1是枯草芽孢桿菌fabHA DNA序列(SEQ ID NO: 7)。圖8是枯草芽孢桿菌FabHA氨基酸序列(SEQ ID NO: 10)。圖9 是 fabHB 引物的序列(SEQ ID NO: 11、12、14 和 15)。圖10是枯草芽孢桿菌fabHB DNA序列(SEQ ID NO: 13)。圖11是枯草芽孢桿菌FabHB氨基酸序列(SEQ ID NO: 16 )。圖12是密碼子優(yōu)化的綠頭鴨(Mallard)中鏈脂肪酸硫酯酶基因的DNA序列(SEQID NO:17)。圖13是最優(yōu)化的開放閱讀框(ORF) (SEQ ID NO: 17)與初始綠頭鴨中鏈脂肪酸硫酯酶序列(SEQ ID N0:18)的比對。圖14是密碼子優(yōu)化的大鼠乳腺中鏈脂肪酸硫酯酶基因的DNA序列(SEQ IDNO:19)。圖15是最優(yōu)化的ORF (SEQ ID NO: 19)與初始大鼠乳腺中鏈脂肪酸硫酯酶(SEQID NO:20)的比對。圖16是補(bǔ)充異亮氨酸對反異脂肪酸產(chǎn)量的效應(yīng)的示意圖。圖17是蘇氨酸依賴型反異脂肪酸合成途徑的圖表。圖18是bkd操縱子的bkdAA基因的DNA序列(SEQ ID N0:21)圖19是bkd操縱子的bkdAB基因的DNA序列(SEQ ID N0:22)圖20是bkd操縱子的bkdB基因的DNA序列(SEQ ID NO: 23)圖21是bkd操縱子的IpdV基因的蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO: 24)圖22是bkd操縱子的bkdAA基因的蛋白質(zhì)序列(SEQ ID N0:25)
圖23是bkd操縱子的bkdAB基因的蛋白質(zhì)序列(SEQ ID N0:26)圖24是bkd操縱子的bkdB基因的蛋白質(zhì)序列(SEQ ID N0:27)圖25是綠頭鴨中鏈脂肪酸硫酯酶的蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO: 28)。圖26是大鼠乳腺中鏈脂肪酸硫酯酶的蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO: 29)。圖27是示出在大腸桿菌菌株K27-Z1 (親本菌株)、K27-Z1 (Bs bkd Bs fabH)、K27-Zl(Bs bkd Bs fabH Ec tcdB)和 K27_Zl(Bs bkd Bs fabH Ec tdcB Ec ilvIH(G14D))(x-軸)中的C15反異脂肪酸產(chǎn)量(在合成總脂肪酸中的a-C15反異脂肪酸部分；y_軸)的柱狀圖。制備三等份培養(yǎng)物，脂肪酸測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差通過誤差條表示。圖28是示出在表達(dá)不同AHAS基因的大腸桿菌K27-Z1衍生菌株中的C15和C17反異脂肪酸產(chǎn)量的柱狀圖。K27-Z1衍生菌株(X-軸)包含以下質(zhì)粒和基因:(i)pTrCHisA和pZA31MCS (載體對照)；(ii) Bs bkd Bs fabHA pTrcHisA ； (iii) Bs bkd fabHA Ec tdcB ；(iv) Bs bkd fabHA Ec tdcBEc ilvIH ； (v) Bs bkd fabHA Ec tdcB Ec ilvIH (G14D);和(vi) Bs bkd Bs fabHA Ec tdcB Bs iIvBH0氣相色譜分析的峰面積在y-軸上不出。一個生物平行測定用重復(fù)樣品脂肪酸分析表示。圖29是示出大腸桿菌BL21 Star (DE3)衍生菌株的C15反異脂肪酸產(chǎn)量的柱狀圖。圖30是示出以下大腸桿菌衍生菌株的C15和C17反異脂肪酸產(chǎn)量的柱狀圖:K27-Z1 CpTrcHisA pZA31 MCS (載體對照))、K27_Z1 (Bs bkd Bs fabHA)、K27_Zl (Bs bkdBs fabHA Ec tdcB)和 K27-Z1 (Bs bkd Bs fabHA Ec tdcB Ec ilvGM)。一個生物平行測定用重復(fù)樣品脂肪酸分析來測試；標(biāo)準(zhǔn)偏差通過誤差條表示。

圖31是示出大腸桿菌K27-Z1衍生菌株的C15和C17反異脂肪酸產(chǎn)量的柱狀圖，所述菌株設(shè)計(jì)用于制備指定的重組蛋白:Bkd-FabHA、Bkd-FabHA-CimA-LeuBCD、Bkd-FabHA-CimA-LeuBCD-1 IVIH、Bkd-FabHA-CimA-LeuBCD-1lvIH (G14D)、Bkd-FabHA-CimA-LeuBCD-1IvBH和 Bkd-FabHA-CimA-LeuBCD-1IvGM。圖32 是示出大腸桿菌 K27-Z1 (Bs bkd Bs fabH)和大腸桿菌 K27-Z1 (Bs bkd BsfabHA Ec ‘tesA)中的C13、C15和C17反異脂肪酸產(chǎn)量的柱狀圖。圖 33 是示出大腸桿菌 BL21 Star (DE3) (Bs bkd Bs fabHA)和 BL21 Star (DE3)(Bs bkd Bs fabHA Ec ‘tesA)中的C13、C15和C17反異脂肪酸產(chǎn)量的柱狀圖。圖34是示出在存在或不存在硫胺素的情況下培養(yǎng)的大腸桿菌中C15和C17反異脂肪酸產(chǎn)量的柱狀圖。大腸桿菌衍生菌株設(shè)計(jì)用于制備指定的重組蛋白。重復(fù)樣品用“#2”表示。在培養(yǎng)基中存在的硫胺素改善反異脂肪酸的產(chǎn)量。圖35 是不出大腸桿菌 ilvE 缺失菌株(Bs bkd Bs fabHA Ec tdcB Ec ilvIH(G14D))和對照ilvE缺失菌株(pZA31 MCS pTrcHisA)中的C15和C17反異脂肪酸產(chǎn)量的柱狀圖。圖36是示出在大腸桿菌BW25113衍生菌株中的反異和異支鏈脂肪酸產(chǎn)量的柱狀圖，所述菌株包含編碼單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)FabH和枯草芽孢桿菌Bkd的多核苷酸。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及生物性生產(chǎn)的反異和/或異支鏈脂肪酸以及此類反異和/或異支鏈脂肪酸的改善的生物性生產(chǎn)。這種改善的生物性生產(chǎn)能夠在某些實(shí)施方案中提供較高的反異和/或異支鏈脂肪酸產(chǎn)量。此外或作為另外一種選擇，本發(fā)明提供將反異和/或異支鏈脂肪酸的鏈長度剪切至期望鏈長度的能力。如本文所用，“擴(kuò)增”指將多核苷酸序列拷貝成大量多核苷酸分子的任何方法或規(guī)程如反轉(zhuǎn)錄、聚合酶鏈反應(yīng)和連接酶鏈反應(yīng)。如本文所用，“反義序列”指特異性地與第二個多核苷酸序列雜交的序列。例如反義序列是相對于其轉(zhuǎn)錄正常取向反向的DNA序列。反義序列能夠表達(dá)與在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的靶mRNA分子互補(bǔ)的RNA轉(zhuǎn)錄物(例如它能夠通過Watson-Crick堿基配對雜交到靶mRNA分子上)。如本文所用，“cDNA”指以單鏈或雙鏈形式與mRNA互補(bǔ)或相同的DNA。如本文所用，“互補(bǔ)”指與多核苷酸與第二多核苷酸堿基成對。換句話說，“互補(bǔ)”描述了通過堿基配對退火的兩個單鏈核酸序列之間的關(guān)系。例如具有序列5’-GTCCGA-3’的多核苷酸與具有序列5’-TCGGAC-3’的多核苷酸互補(bǔ)。如本文所用，“保守取代”指用功能上類似的氨基酸取代多肽中的氨基酸。換句話說，保守取代涉及用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基取代氨基酸殘基。本領(lǐng)域已經(jīng)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族，它們包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸和組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)、具有不帶電極性側(cè)鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和半胱氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸)、具有^ -支鏈側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸和異亮氨酸)和具有芳族側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和組氨酸)。如本文所用，“編 碼”指核苷酸作為其他聚合物和大分子合成模板作用的固有特性。除非另外指明，“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此為簡并版本并編碼相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。如本文所用，“內(nèi)源的”指在生物體或細(xì)胞內(nèi)天然表達(dá)的或原生的多核苷酸、多肽或其他化合物。即，內(nèi)源多核苷酸、多肽或其他化合物不是外來的。例如當(dāng)所述細(xì)胞初始分離自天然來源時，“內(nèi)源的”多核苷酸或肽存在于細(xì)胞中。如本文所用，“表達(dá)載體”指包含重組多核苷酸的載體，所述多核苷酸包含可操作地連接到擬表達(dá)的核苷酸序列上的表達(dá)控制序列。例如合適的表達(dá)載體可為自主復(fù)制的或整合進(jìn)染色體中的質(zhì)粒。表達(dá)載體也可為基于病毒的載體。如本文所用，“外來的”指在其中期望進(jìn)行表達(dá)的特定細(xì)胞或生物體中非天然表達(dá)的任何多核苷酸或多肽。內(nèi)源多核苷酸、多肽或其他化合物不是外來的。如本文所用，“雜交”包括核酸鏈與互補(bǔ)核酸鏈通過堿基配對接合的任何過程。因此，該術(shù)語指靶序列結(jié)合到測試(即，靶)序列上的互補(bǔ)能力，或反之亦然。如本文所用，“雜交條件”通常按測量雜交的條件的“嚴(yán)格性”程度分類。嚴(yán)格性程度可基于核酸結(jié)合絡(luò)合物或探針的例如熔融溫度(Tm)確定。例如“最大嚴(yán)格性”通常發(fā)生在約Tm-5°C (低于探針Tm5° );“高嚴(yán)格性”在約低于Tm5-10° ;“中嚴(yán)格性”在約低于探針1'11110-20° ;并且“低嚴(yán)格性”在約低于Tm20-25°。作為另外一種選擇或除此之外，雜交條件可基于雜交的鹽或離子強(qiáng)度條件和/或一次或多次嚴(yán)格性洗滌來確定。例如，6xSSC=非常低的嚴(yán)格性；3xSSC=低至中的嚴(yán)格性；lxSSC=中嚴(yán)格性；并且0.5xSSC=高嚴(yán)格性。功能上，最大嚴(yán)格性條件可用于鑒定與雜交探針具有嚴(yán)格(即，約100%)同一性或近嚴(yán)格同一性的核酸序列；而高嚴(yán)格性條件可用于鑒定與探針具有約80%或更高序列同一性的核酸序列。如本文所用，涉及兩個或更多個多核苷酸或多肽序列的“相同的”或百分比“同一性”指兩個或更多個序列當(dāng)使用序列比較算法或目測比較并比對最大匹配時，它們是相同的或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸殘基。如本文所用，“長鏈脂肪酸”指具有長于14個碳的脂族尾的脂肪酸。如本文所用，“中鏈脂肪酸”指具有介于6個和14個碳之間的脂族尾的脂肪酸。在某些實(shí)施方案中，中鏈脂肪酸可具有11個至13個碳。如本文所用，“天然存在的”指天然可見的物質(zhì)。例如存在于生物體(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列，其能夠從天然來源中分離并且未曾在實(shí)驗(yàn)室中受到人為地有意修飾，是天然存在的。如本文所用，當(dāng)描述兩個DNA區(qū)域或兩個多肽區(qū)域之間的關(guān)系時，“可操作地連接的”指所述區(qū)域彼此功能上相關(guān)。例如，如果啟動子控制編碼序列的轉(zhuǎn)錄，它可操作地連接至該序列；如果將核糖體結(jié)合位點(diǎn)定位以允許翻譯，它可操作地連接至編碼序列；并且如果一個序列功能上作為信號序列，例如通過參與成熟形式蛋白的分泌，它可操作地連接至一個肽。如本文所用，“過表達(dá)”指在宿主細(xì)胞中以比正常表達(dá)水平更高的水平表達(dá)多核苷酸以生產(chǎn)產(chǎn)物(例如多肽或RNA)。過表達(dá)的多核苷酸一般是宿主細(xì)胞的天然多核苷酸，其生成的產(chǎn)物量大于宿主細(xì)胞中正常存在的量。過表達(dá)例如并且不受限制地通過將多核苷酸可操作地連接至與該多核苷酸天然啟動子不同的啟動子或?qū)⒏郊涌截惖乃龆嗪塑账釋?dǎo)入宿主細(xì)胞中來完成。 如本文所用，“多核苷酸”指由核苷酸組成的聚合物。多核苷酸可為分離片段形式或可為較大的核苷酸序列構(gòu)建體的組件，其已經(jīng)來源于分離至少一次的核苷酸序列，該核苷酸序列的數(shù)量或濃度使其能夠通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法如使用克隆載體鑒定、操縱、并回收該序列及其組成核苷酸序列。當(dāng)核苷酸序列用DNA序列(即A、T、G、C)表示時，這也包括RNA序列(即A、U、G、C)，其中“U”取代了 “T”。換句話說，“多核苷酸”指與其他核苷酸分離的核苷酸聚合物(分離片段或?qū)嶓w)或可為較大核苷酸構(gòu)建體的組件或元件，例如表達(dá)載體或多順反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。如本文所用，“多肽”指由氨基酸殘基組成的聚合物，其可包含或可不包含修飾形式如磷酸基和甲?；Ｈ绫疚乃?，“重組表達(dá)載體”指用于表達(dá)多核苷酸例如編碼期望多肽的多核苷酸的DNA構(gòu)建體。重組表達(dá)載體可包括例如轉(zhuǎn)錄亞基，其包括(i )具有基因表達(dá)調(diào)節(jié)功能的遺傳元件如啟動子和增強(qiáng)子的組合件，(ii)轉(zhuǎn)錄成mRNA并翻譯成蛋白的結(jié)構(gòu)或編碼序列，以及(iii)合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯啟動和終止序列。以任何合適的方式構(gòu)建重組表達(dá)載體。載體的性質(zhì)是不重要的，并且可使用任何載體包括質(zhì)粒、病毒、噬菌體和轉(zhuǎn)座子。本發(fā)明使用的可能載體包括但不限于染色體、非染色體和合成DNA序列如細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體DNA ;酵母質(zhì)粒；和來源于質(zhì)粒與噬菌體DNA組合的載體，來源于病毒如牛痘、腺病毒、禽痘、桿狀病毒、SV40和偽狂犬病病毒的DNA。如本文所用，“引物”指將多核苷酸引物置于誘導(dǎo)合成的條件下，能夠特異性地雜交到指定多核苷酸模板上并提供互補(bǔ)多核苷酸合成啟動點(diǎn)的多核苷酸如本文所用，“重組多核苷酸”指具有非天然連接在一起的序列的多核苷酸。可將重組多核苷酸包括在合適載體中，并且所述載體可用于轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞。包含重組多核苷酸的宿主細(xì)胞稱為“重組宿主細(xì)胞”。然后將所述多核苷酸在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)以生產(chǎn)例如“重組多肽”。如本文所用，“特異性雜交”指多核苷酸在嚴(yán)格條件下優(yōu)先結(jié)合、雙聯(lián)或雜交到特定核苷酸序列上。如本文所用，“嚴(yán)格條件”指在該條件下探針將優(yōu)先雜交到其靶向亞序列上，并且與其他序列雜交的程度較低或完全不雜交。如本文所用，“短鏈脂肪酸”指具有少于6個碳的脂族尾的脂肪酸。如本文所用，涉及兩個核酸或多肽的“基本上同源的”或“基本上相同的” 一般指兩個或更多個序列或亞序列當(dāng)使用序列比較算法或目測比較并比對最大匹配時，具有至少40%、60%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的核苷酸或氨基酸殘基同一性?；旧舷嗤軌虼嬖谟谛蛄腥魏魏线m的區(qū)域，例如長度為至少約50個殘基的區(qū)域，長度為至少約100個殘基的區(qū)域，或長度為至少約150個殘基的區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，序列在任一個或兩個比較生物聚合物全長上基本上相同。在一個方面，本發(fā)明涉及使用細(xì)菌生產(chǎn)反異和/或異支鏈脂肪酸(或來源于反異和/或異支鏈脂肪酸的產(chǎn)物)的新方法。在一個方面，所述方法特征在于在合適細(xì)胞中例如通過用一種或更多種多 核苷酸轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化細(xì)胞加入一個或多個外來的多核苷酸，其提高反異或異脂肪酸的產(chǎn)量。作為另外一種選擇或除此之外，所述方法包括過表達(dá)一種或更多種多核苷酸以提高宿主細(xì)胞內(nèi)反異或異脂肪酸的產(chǎn)量。在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)反異和異脂肪酸的示例性代謝途徑在圖1、2和17中示出。圖1示出生產(chǎn)以下產(chǎn)物的代謝途徑:(I)反異脂肪酸，其經(jīng)由包括異亮氨酸至2-酮基3-甲基戊酸的轉(zhuǎn)化的途徑生產(chǎn)，(2)奇數(shù)總碳異支鏈脂肪酸，其經(jīng)由包括亮氨酸至2-酮異己酸(也稱為2-酮基，4-甲基戊酸)的轉(zhuǎn)化的途徑生產(chǎn)，和(3)偶數(shù)總碳異支鏈脂肪酸，其經(jīng)由包括纈氨酸至2-酮基-異戊酸(也稱為2-酮基3-甲基丁酸)的轉(zhuǎn)化的途徑生產(chǎn)。在某些實(shí)施方案中，驅(qū)動碳流流向支鏈2-酮酸前體導(dǎo)致相應(yīng)的支鏈脂肪酸產(chǎn)量提高。例如，I)流向異亮氨酸途徑的碳流增加導(dǎo)致反異脂肪酸產(chǎn)量提高；2)流向亮氨酸途徑的碳流增加導(dǎo)致具有奇數(shù)碳的異支鏈脂肪酸產(chǎn)量提高；和/或3)流向纈氨酸途徑的碳流增加導(dǎo)致具有偶數(shù)碳的異支鏈脂肪酸產(chǎn)量提高。圖2和圖17示出了分別從蘇氨酸或丙酮酸生成異亮氨酸和/或2-酮基3-甲基戊酸的途徑。提高通過蘇氨酸和/或丙酮酸途徑的碳流提高重組宿主細(xì)胞中的異支鏈脂肪酸的產(chǎn)量。在一個方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)反異脂肪酸的方法。所述方法包括培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞包含至少一種外來的或過表達(dá)的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反應(yīng)中的至少一種:(aa)丙酮酸至檸蘋酸的轉(zhuǎn)化；(bb)檸蘋酸至檸康酸的轉(zhuǎn)化；(cc)檸康酸至P -甲基-D-蘋果酸的轉(zhuǎn)化；(dd) ^ -甲基-D-蘋果酸至2-氧代丁酸的轉(zhuǎn)化；或(ee)蘇氨酸至2-氧代丁酸的轉(zhuǎn)化。任選地，所述細(xì)胞還包含至少一種外來的或過表達(dá)的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反應(yīng)中的至少一種:(ff) 2-氧代丁酸至2-乙酰-2-羥丁酸的轉(zhuǎn)化，(gg) 2-乙酰-2-羥丁酸至2，3- 二羥基-3-甲基戊酸的轉(zhuǎn)化，或(hh) 2，3- 二羥基-3-甲基戊酸至a -酮基-3-甲基戊酸的轉(zhuǎn)化。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞包含外來的或過表達(dá)的多核苷酸，所述多核苷酸編碼催化
3、4、5、6、7或(aa)-(hh)全部反應(yīng)的多肽。所述細(xì)胞在允許一種或更多種多核苷酸的表達(dá)和反異脂肪酸的生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)?；谟^察到的結(jié)果，至少部分地斷定包含本文所述的基因修飾的宿主細(xì)胞比不包含所述一種或更多種多核苷酸外其它類似的細(xì)胞生產(chǎn)更多的反異脂肪酸。下文進(jìn)一步描述了提高細(xì)胞中反異和異脂肪酸產(chǎn)量的代謝途徑和基因修飾。增加流向異亮氨酸途徑的碳流的一個方法包括通過圖2的蘇氨酸依賴型途徑上調(diào)2-酮基3-甲基戍酸的產(chǎn)量。能夠在例如大腸桿菌(Lee等人，Molecular SystemsBiology 3:149(2007))中并通過圖2所示的一系列步驟生產(chǎn)高水平的蘇氨酸，異亮氨酸經(jīng)由作為中間體的2-酮基3-甲基戊酸從蘇氨酸開始生產(chǎn)。如圖2所示，蘇氨酸依賴型的途徑通過例如蘇氨酸脫氨酶將蘇氨酸轉(zhuǎn)化成2-氧代丁酸；通過例如乙酰羥酸合酶(AHAS)(也稱為乙酰羥基丁酸合酶)將2-氧代丁酸轉(zhuǎn)化成2-乙酰-2-羥丁酸；通過例如乙酰羥酸異構(gòu)還原酶將2-乙酰-2-羥丁酸轉(zhuǎn)化成2，3- 二羥基-3-甲基戊酸；并且通過例如二羥酸脫水酶將2，3- 二羥基-3-甲基戊酸轉(zhuǎn)化成2-酮基-3-甲基戊酸。通過表達(dá)外來的多核苷酸或過表達(dá)內(nèi)源多核苷酸優(yōu)化該途徑使碳流流向2-酮基-3-甲基戊酸并且最終轉(zhuǎn)化成反異脂肪酸，所述多核苷酸編碼上述活性的任何一個或多個。例如通過過表達(dá)ilvA、tdcB、ilvl、ilvH、ilvC和/或ilvD優(yōu)化該途徑使碳流流向2-酮基3-甲基戊酸。IlvA和TdcB是蘇氨酸脫氨酶。IlvC是乙酰羥酸異構(gòu)還原酶(也稱為酮醇酸還原異構(gòu)酶)，而IlvD是二羥酸脫水酶。IlvI和IlvH是形成AHAS的兩個亞基，它們催化從丙酮酸形成2-乙酰乳酸以合成纈氨酸和亮氨酸，或催化從2-氧代丁酸和丙酮酸形成2-乙酰-2-羥丁酸以生物合成異亮氨酸(參見圖1)。兩個AHAS反應(yīng)是合成兩組不同的支鏈氨基酸的不可逆步驟和關(guān)鍵步驟。在某些實(shí)施方案中，例如AHAS I (iIvBN)的缺失和/或AHAS II (iIvGM)和/或AHAS III(ilvIH)的過量生產(chǎn)最小化來源于亮氨酸或纈氨酸的異脂肪酸的產(chǎn)量。IlvBH也是適用于本發(fā)明相關(guān)內(nèi)容的AHAS。

因此，在一個方面本發(fā)明的細(xì)胞包含外來的或過表達(dá)的多核苷酸，所述多核苷酸編碼的多肽催化蘇氨酸轉(zhuǎn)化成2-氧代丁酸(例如蘇氨酸脫氨酶)，并且催化2-氧代丁酸轉(zhuǎn)化成2-乙酰-2-羥丁酸(例如AHAS )。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞或生物體經(jīng)工程化以在氮限制條件下積聚反異脂肪酸并利用蘇氨酸依賴型異亮氨酸合成途徑如圖17所示的丙酮酸途徑。如圖17所示，通過例如檸蘋酸合酶將丙酮酸和乙酰-CoA組合以生產(chǎn)檸蘋酸。示例性的檸蘋酸合酶是CimA，例如來源于詹氏甲烷球菌CimA。然后通過例如檸康酸水解酶(也稱為異丙基蘋果酸或檸蘋酸異構(gòu)酶)將檸蘋酸轉(zhuǎn)化成檸康酸，所述酶的一個實(shí)例由IeuCD編碼。通過例如異丙基蘋果酸異構(gòu)酶(如LeuCD)將朽1康酸轉(zhuǎn)化成￠-甲基-D-蘋果酸,并且通過例如異丙基蘋果酸脫氫酶(如LeuB)將所得￠-甲基-D-蘋果酸轉(zhuǎn)化成2-氧代丁酸(也稱為a-丁酮酸)。丙酮酸途徑與圖2的蘇氨酸途徑銜接，通過例如AHAS將2-氧代丁酸轉(zhuǎn)化成2-乙酰-2-羥丁酸；通過例如乙酰羥酸異構(gòu)還原酶將2-乙酰-2-羥丁酸轉(zhuǎn)化成2，3- 二羥基-3-甲基戊酸；并且通過例如二羥酸脫水酶將2，3- 二羥基-3-甲基戊酸轉(zhuǎn)化成2-酮基3-甲基戊酸。通過表達(dá)外來的多核苷酸或過表達(dá)內(nèi)源多核苷酸優(yōu)化該途徑使碳流流向2-酮基3-甲基戊酸并且最終轉(zhuǎn)化成反異脂肪酸，所述多核苷酸編碼上述活性的任何一個或多個。例如，通過過表達(dá)或表達(dá)外來 cimA、leuCD、leuB、ilvl、ilvH、ilvC ilvG、ilvM 和 / 或 ilvD 優(yōu)化所述途
徑使碳流流向2-酮基3-甲基-戊酸。因此，在一個方面，本發(fā)明的細(xì)胞包含外來的或過表達(dá)的多核苷酸，所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽催化:丙酮酸至檸蘋酸的轉(zhuǎn)化、檸蘋酸至檸康酸的轉(zhuǎn)化、檸康酸至3 -甲基-D-蘋果酸的轉(zhuǎn)化和2-氧代丁酸至2-乙酰-2-羥丁酸的轉(zhuǎn)化。例如，在一個實(shí)施方案中，所述細(xì)胞包含下列多核苷酸:包含編碼檸蘋酸合酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、包含編碼異丙基蘋果酸異構(gòu)酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、包含編碼異丙基蘋果酸脫氫酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、包含編碼AHAS的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、或它們的組合，包括編碼所有四個多肽的多核苷酸的組合。

在一個方面，修飾宿主細(xì)胞以表達(dá)外來的多核苷酸或過表達(dá)天然多核苷酸，所述多核苷酸編碼調(diào)節(jié)從異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸中生產(chǎn)反異或異脂肪酸的下游反應(yīng)的一種或更多種酶活性。例如，如圖1所示，在某些實(shí)施方案中，修飾細(xì)胞以經(jīng)由包括通過支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶(BCAT)將異亮氨酸轉(zhuǎn)化成2-酮基3-甲基戊酸的途徑生產(chǎn)反異脂肪酸。作為另外一種選擇，將2-酮基3-甲基戊酸導(dǎo)入異亮氨酸生物合成途徑，無需首先將其轉(zhuǎn)化成異亮氨酸。然后通過例如支鏈a-酮酸脫氫酶(B⑶H)如由bkd編碼的B⑶H將2-酮基3-甲基戊酸轉(zhuǎn)化成2-甲基丁酰-CoA。通過例如3-酮脂酰-ACP合酶縮合2-甲基丁酰-CoA與丙二酰-ACP，并且隨后通過反異?；?ACP的脂肪酸生物合成加入丙二酰-ACP。然后經(jīng)由硫酯酶將Acyl-ACP轉(zhuǎn)化成反異脂肪酸。在某些實(shí)施方案中，奇數(shù)總碳異支鏈脂肪酸經(jīng)由包括通過例如BCAT將亮氨酸轉(zhuǎn)化成2-酮異己酸(也稱為2-酮基，4-甲基戊酸)的途徑生產(chǎn)。如果需要，將2-酮異己酸引入亮氨酸生物合成途徑，無需首先將其轉(zhuǎn)化成亮氨酸。然后通過例如BCDH如由bkd編碼的B⑶H將2-酮異己酸轉(zhuǎn)化成異戊酰-CoA (也稱為3-甲基丁酰-CoA)。通過例如3-酮脂酰-ACP合酶縮合異戊酰-CoA與丙二酰-ACP，并且隨后通過異?；?ACP的脂肪酸生物合成加入丙二酰-ACP。然后經(jīng)由硫酯酶將異?；?ACP轉(zhuǎn)化成異脂肪酸。此外，在某些實(shí)施方案中，偶數(shù)總碳的異支鏈脂肪酸經(jīng)由包括通過BCAT將纈氨酸轉(zhuǎn)化成2-酮基-異戊酸(也稱為2-酮基3-甲基丁酸)的途徑生產(chǎn)。任選地，將2-酮基-異戊酸導(dǎo)入纈氨酸生物合成途徑，無需將其首先轉(zhuǎn)化成纈氨酸。然后通過例如BCDH如由bkd編碼的B⑶H將2-酮基-異戊酸轉(zhuǎn)化成異丁酰-CoA。通過例如3-酮脂酰-ACP合酶縮合異丁酰-CoA與丙二酰-ACP，并且隨后通過異?；?ACP的脂肪酸生物合成加入丙二酰-ACP。然后可經(jīng)由硫酯酶將異?；?ACP轉(zhuǎn)化成異脂肪酸。因此，在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含編碼B⑶H的外來的或過表達(dá)的多核苷酸或生物活性片段或其變體。作為另外一種選擇或除此之外，所述細(xì)胞包含編碼BCAT的外來的或過表達(dá)的多核苷酸和/或編碼?；D(zhuǎn)移酶的外來的或過表達(dá)的多核苷酸。作為另外一種選擇或除此之外，所述細(xì)胞包含編碼3-酮脂酰-ACP合酶的外來的或過表達(dá)的多核苷酸，所述酶在合適細(xì)胞中利用反異和/或異支鏈-CoA引物作為底物。作為另外一種選擇或除此之外，所述細(xì)胞包含具有編碼烯酰-ACP還原酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸。作為另外一種選擇或除此之外，所述細(xì)胞包含編碼硫酯酶的外來的或過表達(dá)的多核苷酸。取決于硫酯酶的活性和底物特異性，此類重組細(xì)胞能夠生產(chǎn)具有期望鏈長的反異和/或異支鏈脂肪酸。例如，在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞優(yōu)先生產(chǎn)長鏈脂肪酸、中鏈脂肪酸、或它們的期望組合(例如60%、70%、80%、85%、90%、95%或更多的脂肪酸包含期望數(shù)目的碳)。也設(shè)想本文所述的任何酶的組合，例如細(xì)胞包含編碼BCDH、3-酮脂酰-ACP合酶和硫酯酶(例如TesA)的外來的或過表達(dá)的多核苷酸。實(shí)際上，本發(fā)明設(shè)想細(xì)胞經(jīng)工程化以增加通過如上所述的蘇氨酸依賴型和/或蘇氨酸依賴型途徑的碳流，并且還包含增加通過圖1所示的異亮氨酸、亮氨酸和/或纈氨酸途徑的碳流的外來的或過表達(dá)的多核苷酸。任選地，一種或更多種外來的或過表達(dá)的多核苷酸包含與如SEQ ID N0:l、4、7、13、17-23、68、77或78所示的核酸序列具有至少90%同一性的核酸序列。作為另外一種選擇或除此之外，在某些實(shí)施方案中，通過修飾細(xì)胞以提高乙酰-CoA羧化酶活性來提高反異和/或異支鏈脂肪酸的產(chǎn)量。例如，通過例如提高可利用的生物素量或通過提高生物素-蛋白連接酶BirA的活性或量來提高一種或更多種酶亞基的產(chǎn)量。本文也設(shè)想通過例如提高硫胺素合酶產(chǎn)量來上調(diào)宿主細(xì)胞中的硫胺素水平以進(jìn)一步促進(jìn)支鏈脂肪酸合成。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，細(xì)胞經(jīng)工程化以表達(dá)編碼本文所述的一種或更多種酶活性的一種或更多種外來的多核苷酸和/或經(jīng)工程化以過表達(dá)編碼本文所述的一種或更多種酶活性的一種或更多種內(nèi)源多核苷酸。不同生物使用不同途徑生產(chǎn)脂肪酸，并且內(nèi)源脂肪酸合成反應(yīng)能夠從支鏈脂肪酸合成中獲取資源。因此，在某些實(shí)施方案中，減弱天然酶活性以促進(jìn)支鏈脂肪酸合成。例如，在非天然生產(chǎn)反異和/或異支鏈脂肪酸的大腸桿菌中，在脂肪酸合成中的第一縮合反應(yīng)是乙酰-CoA與丙二酰-ACP的反應(yīng)，該反應(yīng)生產(chǎn)3-酮丁酉先-ACP (Smirnova 和 Reynolds, J.1ndustrial Microbiology & Biotechnology 27:246-51 (2001))。這一反應(yīng)主要由fabH產(chǎn)物催化，該產(chǎn)物是3-酮脂酰-ACP合酶。然而大腸桿菌3-酮脂酰-ACP合酶顯示其優(yōu)選乙酰-CoA而不是支鏈?；?Cok如2-甲基丁酰-Cok的特異性(Choi等人，J.Bacteriology 182:365-70 (2000))。通過化學(xué)抑制劑如淺藍(lán)菌素或通過基因工程(例如通過生 成fabD和fabH雙突變體)降低或除去內(nèi)源FabH活性減少生產(chǎn)的直鏈脂肪酸的量。如果需要，也通過例如引入來源于微小桿菌屬(Exiguobacterium)的脂肪酸合成基因以縮短鏈長和/或提高反異和/或異支鏈脂肪酸的量，從而通過除去或降低宿主細(xì)胞(例如大腸桿菌細(xì)胞)制備直鏈脂肪酸的能力來提高支鏈脂肪酸產(chǎn)量。作為另外一種選擇或除此之外，使用最小化流向不導(dǎo)致反異或異脂肪酸形成的分支途徑碳流的基因敲除或減少。例如，在一個方面，減弱異亮氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性以使碳流從異亮氨酸合成再轉(zhuǎn)向到反異支鏈脂肪酸合成(參見圖2和17)。在這個方面，在本發(fā)明的示例性實(shí)施方案中，所述細(xì)胞經(jīng)基因修飾以減少ilvE的表達(dá)或抑制基因產(chǎn)物的活性。在本發(fā)明的一個方面，修飾所述細(xì)胞以生成fadD突變體，其缺失將脂肪酸轉(zhuǎn)化成脂肪酰-CoA的步驟，該步驟是脂肪酸降解的第一個步驟。從而提高脂肪酸含量。作為另外一種選擇或除此之外，修飾所述細(xì)胞以減弱支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶(BCAT)的活性。通過例如突變所述酶的編碼序列以生成無功能或功能降低的多肽、從細(xì)胞基因組中移除酶的編碼序列、干擾編碼所述酶的RNA轉(zhuǎn)錄物的翻譯(例如使用反義寡核苷酸)、或通過操縱影響所述酶表達(dá)的表達(dá)控制序列來減弱(即降低或消除)活性。使用任何合適的細(xì)胞或生物體如細(xì)菌細(xì)胞或其原核細(xì)胞、酵母細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)反異和/或異支鏈脂肪酸。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及細(xì)胞如埃希氏菌屬細(xì)胞(例如大腸桿菌)，其非天然生產(chǎn)反異和/或異支鏈脂肪酸。這些細(xì)胞經(jīng)工程化以生產(chǎn)如本文所述的反異和/或異支鏈脂肪酸。在一個方面，修飾所述細(xì)胞以生產(chǎn)期望水平并具有期望鏈長的反異和/或異支鏈脂肪酸。此外，在某些實(shí)施方案中，工程化細(xì)胞耐受在生長培養(yǎng)基、質(zhì)膜、或脂滴中的大量反異和/或異支鏈脂肪酸，和/或通過例如與未修飾細(xì)胞相比使用更便宜的原料、需要更少的發(fā)酵時間等來更經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)反異和/或異支鏈脂肪酸。在某些實(shí)施方案中，天然生產(chǎn)反異和/或異支鏈脂肪酸的細(xì)胞或生物體如枯草芽孢桿菌或除蟲鏈霉菌如本文所述經(jīng)修飾以生產(chǎn)比未修飾細(xì)胞或生物體更高水平的反異和/或異支鏈脂肪酸。例如通過摻入導(dǎo)致細(xì)胞中脂肪酸水平提高的調(diào)節(jié)突變體和/或過表達(dá)提高支鏈酮酸前體和/或脂肪酸生物合成途徑前體的酶活性來完成優(yōu)化。也可通過減弱使碳流從支鏈脂肪酸生產(chǎn)改向的酶活性完成優(yōu)化。作為另外一種選擇或除此之外，所述細(xì)胞生產(chǎn)具有特定鏈長的反異和/或異支鏈脂肪酸。如果需要，選擇硫酯酶的特異性以生產(chǎn)特定鏈長。例如，來自綠頭鴨的尾脂腺和大鼠乳腺的硫酯酶優(yōu)先生成具有C6-C14脂族尾的中鏈脂肪酸。天然生產(chǎn)支鏈脂肪酸并適用于本發(fā)明的示例性的細(xì)菌包括但不限于橙黃螺旋體(Spirochaeta aurantia)、卵黃螺旋體(Spirochaeta littoral is)、嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonas maltophilia)、腐敗假單胞菌(Pseudomonas putrefaciens)、野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)、茴香軍團(tuán)菌(Legionella anisa)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhal is)、水生棲熱菌(Thermus aquaticus)、水生黃桿菌(Flavobacterium aquatile)、非解糖擬桿菌(Bacteroides asaccharolyticus)、脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)、溶淀粉玻拍酸單胞菌(Succinimonas amylolytica)、非洲脫硫弧菌(Desulfovibrio africanus)、運(yùn)動性微球菌(Micrococcus agilis)、粘滑口腔球菌(Stomatococcus muciIaginosus)、梓樣色動性球菌(Planococcus citreus)、白色海球菌(Marinococcus albusb)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、厭氧消化鏈球菌(Peptostreptococcus anaerobius)、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)、藤黃八疊球菌(Sarcina lu tea)、炭疽桿菌(Bacillus anthracis)、菊糖芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus inulinus)、熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)、服芽抱八疊球菌(Sporosarcina ureae)、致黑脫硫腸狀菌(Desulfotomaculum nigrificans)、單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、熱殺索絲菌(Brochothrix thermosphacta)、鮭魚腎桿菌(Renibacterium salmoninarum)、佐氏庫特氏菌(Kurthia zopf ii )、水生棒桿菌(Corynebacterium aquaticum)、耐身寸線節(jié)桿菌(Arthrobacter radiotolerans)、發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium fermentans)、產(chǎn)丙酸丙酸桿菌(Propionibacteriumacidipropionici)、遲緩真桿菌(Eubacterium lentum)、水生嗷纖維菌(Cytophagaaquatilis)、多食鞘氨醇桿菌(Sphingobacteriuma multivorumb)、牙銀二氧化碳嗷纖維菌(Capnocytophaga gingival is)、粘球生抱嚼纖維菌(Sporocytophaga myxococcoides)、華美屈提桿菌(Flexibacter elegans)、珊瑚狀粘球菌(Myxococcus coral1ides)、過渡原囊菌(Archangium gephyra)、橙色標(biāo)粧菌(Stigmatella aurantiaca)、騷動厄氏菌(Oerskovia turbata)和綠色糖單胞菌(Saccharomonospora viridis)。生產(chǎn)支鏈脂肪酸的示例性的微生物也在例如Kaneda，Microbiol.Rev.55 (2):288-302 (1991)中公開(參見表3)。
編碼一種或更多種酶活性以生產(chǎn)反異和/或異脂肪酸的一種或更多種多核苷酸可得自任何來源。取決于本發(fā)明的實(shí)施方案，所述多核苷酸分離自天然來源如細(xì)菌、藻類、真菌、植物或動物；經(jīng)由半合成途徑(例如多核苷酸的核酸序列經(jīng)密碼子優(yōu)化以在特定宿主細(xì)胞如大腸桿菌中表達(dá))生產(chǎn)；或從頭合成。在某些實(shí)施方案中，基于例如酶的底物特異性、由該來源生產(chǎn)的支鏈脂肪酸的類型、或在給定宿主細(xì)胞中的酶活性水平從特定來源選擇酶是有利的。在本發(fā)明的一個方面，所述酶和相應(yīng)的多核苷酸天然存在于宿主細(xì)胞中并且期望過表達(dá)多核苷酸。在這個方面，在某些情況下，將附加拷貝的多核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中以提高脂肪酸生產(chǎn)可用的酶量。天然多核苷酸的過表達(dá)也通過上調(diào)內(nèi)源啟動子活性或?qū)⑺龆嗪塑账峥刹僮鞯剡B接至較強(qiáng)啟動子上來完成。外來的酶和它們相應(yīng)的多核苷酸也適用于本發(fā)明，并且可根據(jù)所用的特定酶改變生物合成途徑的特征或終產(chǎn)物。如果需要，一種或更多種多核苷酸分離自或來源于本文所述的生產(chǎn)支鏈脂肪酸的生物。例如，大腸桿菌FabH，3-酮脂酰-ACP合酶，優(yōu)先利用乙酰-CoA而不是支鏈?；?CoA作為底 物，而來自枯草芽孢桿菌的FabH較高效地促進(jìn)支鏈脂肪酸合成。因此，在一個方面，本發(fā)明的細(xì)胞是包含編碼枯草芽孢桿菌FabH的多核苷酸的大腸桿菌細(xì)胞。由該細(xì)胞生產(chǎn)的示例性的檸蘋酸合酶來源于詹氏甲烷球菌CimA。示例性的AHAS包括大腸桿菌IlvIH、大腸桿菌IlvIH (G14D)、大腸桿菌IlvGM和枯草芽孢桿菌IlvBH。示例性的BCDH是枯草芽孢桿菌Bkd，并且示例性的3-酮脂酰-ACP合酶是枯草芽孢桿菌FabH。示例性的蘇氨酸脫氨酶是大腸桿菌TdcB。示例性的硫酯酶包括但不限于大腸桿菌TesA、來源于綠頭鴨尾脂腺的硫酯酶和來源于大鼠乳腺的硫酯酶。示例性的異丙基蘋果酸異構(gòu)酶是大腸桿菌LeuCD，并且示例性的異丙基蘋果酸脫氫酶是大腸桿菌LeuB。在一個方面，所述細(xì)胞包含核酸序列，所述核酸序列與如SEQ ID N0:32、36、42、43、46、51、57、62、68或83所示的核酸序列具有至少約90%的同一性，或所述細(xì)胞編碼多肽，所述多肽包含的氨基酸序列與如 SEQ ID N0:33、39、40、41、47、48、52、53、58、65、66、67、84 或 85 所示的氨基酸序列具有至少約90%的同一性。調(diào)節(jié)反異和/或異脂肪酸生產(chǎn)的示例性的酶也在表A中公開。表A
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)反異脂肪酸的方法，所述方法包括在允許一種或更多種多核苷酸的表達(dá)和反異脂肪酸的生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞包含至少一種外來的或過表達(dá)的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反應(yīng)中的至少一種: (aa)丙酮酸至檸蘋酸的轉(zhuǎn)化； (bb)檸蘋酸至檸康酸的轉(zhuǎn)化； (Ce)朽1康酸至β -甲基-D-蘋果酸的轉(zhuǎn)化； (dd) β -甲基-D-蘋果酸至2-氧代丁酸的轉(zhuǎn)化；或 (ee)蘇氨酸至2-氧代丁酸的轉(zhuǎn)化 其中所述細(xì)胞比不包含所述一種或更多種多核苷酸的其它類似的細(xì)胞生產(chǎn)更多的反異脂肪酸。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括將所述細(xì)胞暴露于硫胺素。
3.按權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括從培養(yǎng)物中提取反異脂肪酸。
4.按權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括從所述培養(yǎng)物中提取來源于反異脂肪酸的產(chǎn)物。
5.按權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞還包含至少一種外來的或過表達(dá)的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反應(yīng)中的至少一種: (ff) 2-氧代丁酸至2-乙酰-2-羥丁酸的轉(zhuǎn)化， (gg) 2-乙酰-2-羥丁酸至2，3- 二羥基-3-甲基戊酸的轉(zhuǎn)化，或 (hh) 2，3- 二羥基-3-甲基戊酸至2-酮基-3-甲基戊酸的轉(zhuǎn)化。
6.按權(quán)利要求5所述的方法，其中所述細(xì)胞包含外來的或過表達(dá)的多核苷酸，所述多核苷酸編碼催化3、4、5、6、7或全部反應(yīng)的多肽。
7.按權(quán)利要求5所述的方法，其中所述細(xì)胞包含外來的或過表達(dá)的多核苷酸，所述多核苷酸編碼催化反應(yīng)(aa)、(bb)、(cc)和(ff)的多肽。
8.按權(quán)利要求5所述的方法，其中所述細(xì)胞包含下列多核苷酸:編碼檸蘋酸合酶的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、包含編碼乙酰羥酸合酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、包含編碼異丙基蘋果酸異構(gòu)酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、包含編碼異丙基蘋果酸脫氫酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、或它們的組合。
9.按權(quán)利要求8所述的方法，其中所述細(xì)胞包含下列多核苷酸:編碼檸蘋酸合酶的外來的多核苷酸、編碼乙酰羥酸合酶的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、編碼異丙基蘋果酸異構(gòu)酶的外來的或過表達(dá)的多核苷酸和編碼異丙基蘋果酸脫氫酶的外來的或過表達(dá)的多核苷酸。
10.按權(quán)利要求8所述的方法，其中所述檸蘋酸合酶是來源于詹氏甲烷球菌CimA。
11.按權(quán)利要求8所述的方法，其中所述異丙基蘋果酸異構(gòu)酶是大腸桿菌LeuCD。
12.按權(quán)利要求8所述的方法，其中所述異丙基蘋果酸脫氫酶是大腸桿菌LeuB。
13.按權(quán)利要求8所述的方法，其中所述乙酰羥酸合酶是大腸桿菌IlvIH、大腸桿菌IlvIH (G14D)、大腸桿菌IlvGM或枯草芽孢桿菌IlvBH。
14.按權(quán)利要求5所述的方法，其中所述細(xì)胞包含外來的或過表達(dá)的多核苷酸，所述多核苷酸編碼催化反應(yīng)(ee)和(ff)的多肽。
15.按權(quán)利要求5所述的方法，其中所述細(xì)胞包含下列多核苷酸:編碼蘇氨酸脫氨酶的外來的或過表達(dá)的多核苷酸和編碼乙酰羥酸合酶的外來的或過表達(dá)的多核苷酸。
16.按權(quán)利要求15所述的方法，其中所述蘇氨酸脫氨酶是大腸桿菌TdcB。
17.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述乙酰羥酸合酶是大腸桿菌IlvIH、大腸桿菌IlvIH (G14D)、大腸桿菌IlvGM或枯草芽孢桿菌IlvBH。
18.按權(quán)利要求5所述的方法,其中所述一種或更多種外來的或過表達(dá)的多核苷酸 (i)包含核酸序列，所述核酸序列與如SEQID N0:32、36、42、43、46、51、57、62、68或83所示的核酸序列具有至少約90%的同一性，或 (ii)編碼多肽，所述多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列與如SEQID N0:33、39、40、41、47、48、52、53、58、65、66、67、84或85所示的氨基酸序列具有至少約90%的同一性。
19.按權(quán)利要求5所述的方法，其中所述細(xì)胞經(jīng)修飾以降低支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶的活性。
20.按權(quán)利要求5所述的方法，其中所述細(xì)胞還包含下列多核苷酸:包含編碼支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、包含編碼支鏈α -酮酸脫氫酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、包含編碼?；D(zhuǎn)移酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、包含編碼3-酮脂酰-ACP合酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、包含編碼烯酰-ACP還原酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、包含編碼硫酯酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、或它們的組合。
21.按權(quán)利要求20所述的方法,其中一種或更多種外來的或過表達(dá)的多核苷酸包含核酸序列，Q)所述核酸序列與如 SEQ ID N0:l、4、7、13、17、18、19、20、21、22、23、68、77 或 78所示的核酸序列具有至少90%的同一性，(ii)所述核酸序列編碼多肽，所述多肽具有氨基酸序列，所述氨基酸序列與如SEQ ID NO: 10、16、24、25、26、27、28、29或73所示的氨基酸序列具有至少90%的同一性。
22.按權(quán)利要求20所述的方法，其中所述細(xì)胞包含下列多核苷酸:包含編碼支鏈α -酮酸脫氫酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸和包含編碼3-酮脂酰-ACP合酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸。
23.按權(quán)利要求22所述的方法，其中所述細(xì)胞是埃希氏菌屬細(xì)胞。
24.按權(quán)利要求22所述的方法，其中所述支鏈α-酮酸脫氫酶是枯草芽孢桿菌Bkd。
25.按權(quán)利要求22所述的方法，其中所述3-酮脂酰-ACP合酶是枯草芽孢桿菌FabH。
26.按權(quán)利要求22所述的方法，其中所述細(xì)胞還包含具有編碼硫酯酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸。
27.一種細(xì)胞，所述細(xì)胞包含下列多核苷酸: 包含編碼蘇氨酸脫氨酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸， 包含編碼支鏈α-酮酸脫氫酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸，和 包含編碼3-酮脂酰-ACP合酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸， 其中所述多核苷酸被表達(dá)，并且所述細(xì)胞比不包含所述一種或更多種多核苷酸的其它類似的細(xì)胞生產(chǎn)更多的反異脂肪酸。
28.按權(quán)利要求27所述的細(xì)胞，其中所述支鏈α-酮酸脫氫酶是枯草芽孢桿菌Bkd，并且所述3-酮脂酰-ACP合酶是枯草芽孢桿菌FabH。
29.按權(quán)利要求27所述的細(xì)胞，所述細(xì)胞還包含具有編碼硫酯酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸。
30.按權(quán)利要求27所述的細(xì)胞，所述細(xì)胞還包含具有編碼乙酰羥酸合酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸。
31.按權(quán)利要求30所述的細(xì)胞，其中所述乙酰羥酸合酶是大腸桿菌IlvIH、大腸桿菌IlvIH (G14D)、大腸桿菌IlvGM或枯草芽孢桿菌IlvBH。
32.按權(quán)利要求27所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是非天然生產(chǎn)反異脂肪酸的細(xì)菌細(xì)胞。
33.按權(quán)利要求32所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是埃希氏菌屬細(xì)胞。
34.一種生產(chǎn)反異脂肪酸的方法，所述方法包括在允許所述多核苷酸的表達(dá)和反異脂肪酸的生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求32的細(xì)菌細(xì)胞。
35.一種細(xì)胞，所述細(xì)胞包含下列多核苷酸: 包含編碼檸蘋酸合酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸， 包含編碼支鏈α-酮酸脫氫酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸，和 包含編碼3-酮脂酰-ACP合酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸， 其中所述多核苷酸被表達(dá)，并且所述細(xì)胞比不包含所述一種或更多種多核苷酸的其它類似的細(xì)胞生產(chǎn)更多的反異脂肪酸。
36.按權(quán)利要求35所述的細(xì)胞，其中所述檸蘋酸合酶是來源于詹氏甲烷球菌CimA，所述支鏈α -酮酸脫氫酶是枯草芽孢桿菌Bkd，并且所述3-酮脂酰-ACP合酶是枯草芽孢桿菌FabH0
37.按權(quán)利要求35所述的細(xì)胞，所述細(xì)胞還包含下列多核苷酸:包含編碼異丙基蘋果酸異構(gòu)酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、包含編碼異丙基蘋果酸脫氫酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、包含編碼乙酰羥酸合酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、包含編碼烯酰-ACP合酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、包含編碼硫酯酶的核酸序列的外來的或過表達(dá)的多核苷酸、或它們的組合。
38.按權(quán)利要求37所述的方法，其中所述異丙基蘋果酸異構(gòu)酶是大腸桿菌LeuCD。
39.按權(quán)利要求37所述的方法，其中所述異丙基蘋果酸脫氫酶是大腸桿菌LeuB。
40.按權(quán)利要求37所述的細(xì)胞，其中所述乙酰羥酸合酶是大腸桿菌IlvIH、大腸桿菌IlvIH (G14D)、大腸桿菌IlvGM或枯草芽孢桿菌IlvBH。
41.按權(quán)利要求35所述的細(xì)胞 ，其中所述細(xì)胞是非天然生產(chǎn)反異脂肪酸的細(xì)菌細(xì)胞。
42.按權(quán)利要求41所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是埃希氏菌屬細(xì)胞。
43.一種生產(chǎn)反異脂肪酸的方法，所述方法包括在允許所述多核苷酸的表達(dá)和反異脂肪酸的生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求41的細(xì)菌細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了生產(chǎn)反異脂肪酸的方法。所述方法包括在允許一種或更多種多核苷酸的表達(dá)和反異脂肪酸的生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞包含至少一種外來的或過表達(dá)的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼多肽的核酸序列，所述多肽催化下列反應(yīng)中的至少一種丙酮酸至檸蘋酸的轉(zhuǎn)化；檸蘋酸至檸康酸的轉(zhuǎn)化；檸康酸至β-甲基-D-蘋果酸的轉(zhuǎn)化；β-甲基-D-蘋果酸至2-氧代丁酸的轉(zhuǎn)化；或蘇氨酸至2-氧代丁酸的轉(zhuǎn)化。任選地，所述細(xì)胞還包含至少一種外來的或過表達(dá)的多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼多肽的核酸序列所述多肽催化下列反應(yīng)2-氧代丁酸至2-乙酰-2-羥丁酸的轉(zhuǎn)化、2-乙酰-2-羥丁酸至2,3-二羥基-3-甲基戊酸的轉(zhuǎn)化、和/或2,3-二羥基-3-甲基戊酸至α-酮基-3-甲基戊酸的轉(zhuǎn)化。本發(fā)明也提供了生產(chǎn)反異脂肪酸的細(xì)胞以及使用所述細(xì)胞生產(chǎn)反異脂肪酸的方法。
文檔編號C12N9/88GK103097538SQ201080058023
公開日2013年5月8日 申請日期2010年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日
發(fā)明者C·W·桑德斯, 徐雋, P·R·格林, D·B·庫蒂, Z·S·坎巴塔 申請人:寶潔公司