專利名稱：誘導(dǎo)脂肪源性成體干細(xì)胞遷移的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及脂肪組織源性成體干細(xì)胞遷移的能力，且尤其是涉及脂肪組織源性成體干細(xì)胞及其特定分泌產(chǎn)物的新型用途，所述脂肪組織源性成體干細(xì)胞及其特定分泌產(chǎn)物具有遷移至有趨化因子或生長因子在其中表達(dá)的疾病部位的能力，以及本發(fā)明涉及能夠更有效地增強(qiáng)趨化因子或生長因子受體功能的方法。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞是指不僅具有自我復(fù)制能力，而且具有分化為至少兩種類型細(xì)胞的能力的細(xì)胞，并可分為全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞(pluripotent stem cell)和多潛能干細(xì)胞(專能干細(xì)胞，multipotent stem cell)。 全能干細(xì)胞是具有能夠發(fā)育為一個完整個體的全能特性的細(xì)胞，卵細(xì)胞和精子受精后達(dá)8細(xì)胞階段的細(xì)胞擁有這些特性。當(dāng)將這些細(xì)胞分離并移植至子宮時，它們能夠發(fā)育成一個完整個體。多能干細(xì)胞源自受精后4-5天產(chǎn)生的位于囊胚內(nèi)側(cè)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，是能夠發(fā)育為源自外胚層、中胚層和內(nèi)胚層的多種細(xì)胞及組織的細(xì)胞。這些細(xì)胞被稱為“胚胎干細(xì)胞”并且能夠分化為其他各種組織細(xì)胞，但不形成新的生物體。專能干細(xì)胞是指能夠分化為對含有這些細(xì)胞的組織和器官特異的單一細(xì)胞，且不但涉及胎兒、新生兒及成人時期多種組織和器官的生長與發(fā)育，還涉及保持成體組織的體內(nèi)平衡以及在組織損傷時誘導(dǎo)再生的功能。將組織特異的專能細(xì)胞(multipotent cell)共同稱為“成體干細(xì)胞”。成體干細(xì)胞是通過從各種人體器官取出細(xì)胞并將細(xì)胞發(fā)育為干細(xì)胞而獲得，且其特征在于它們分化為單一特定組織。然而，最近，關(guān)于將成體干細(xì)胞分化為包括肝細(xì)胞在內(nèi)的多種組織的實(shí)驗相當(dāng)成功，這成為了焦點(diǎn)。人們在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已做出了努力，利用細(xì)胞來再生生物組織及器官，并恢復(fù)它們由于疾病或事故及類似原因而喪失的功能。通常用于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的方法包括以下步驟收集干細(xì)胞、來自患者的血源性單核細(xì)胞或骨髓源性單核細(xì)胞；通過試管培養(yǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖和/或分化；并通過移植將選定的未分化(干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞)和/或分化細(xì)胞引入患者的身體。因此，預(yù)期現(xiàn)有的通過藥物或外科手術(shù)治療疾病的傳統(tǒng)方法將被細(xì)胞/組織替代療法取代，該療法采用健康的細(xì)胞、組織或器官來替代損傷的細(xì)胞、組織或器官，因而干細(xì)胞的應(yīng)用將進(jìn)一步增加。因此，人們目前正研究干細(xì)胞的多種功能。特別地，正在進(jìn)行關(guān)于干細(xì)胞的有效分離、未分化狀態(tài)的干細(xì)胞的維持和增殖以及干細(xì)胞分化為組織細(xì)胞的多種研究。已有一些關(guān)于通過趨化因子處理來誘導(dǎo)骨髓源性干細(xì)胞遷移的報告(Adriana Lopez Ponteet al.，Stem Cells，25 :1737-1745，2007 ；Marek Honczarenko et al.，Stem Cells，24 1031-1041，2006 ；Sordi V et al. ， Blood，106 :419-427,2005 ；Fiedler J et al. ， J CellBiochem,87 :305-312,2002 ；Forte G et al.，Stem Cells，24 :23-33,2006 ；Wright DE etal.，Blood，87 :4100-4108,1996 ；Son BR et al.，Stem Cells，24 :1254-1264，2006)，但還沒有關(guān)于脂肪干細(xì)胞遷移的報道。
由此，本申請發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞具有遷移的能力，且當(dāng)干細(xì)胞以各種趨化因子或生長因子進(jìn)行前處理時，顯著誘導(dǎo)了通過特定趨化因子或生長因子的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移?；诖私Y(jié)果，本申請發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了能夠增強(qiáng)脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)趨化因子或生長因子受體能力的方法，由此完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞遷移的組合物，該組合物含有作為活性成分的一種或多種脂肪組織源性成體干細(xì)胞及其分泌產(chǎn)物。本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于誘導(dǎo)脂肪組織源性成體干細(xì)胞遷移至疾病部位的方法。
本發(fā)明涉及表達(dá)趨化因子或生長因子受體的脂肪組織源性成體干細(xì)胞或來自該干細(xì)胞的分泌產(chǎn)物的用途及功能。為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明提供了一種用于誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞遷移的組合物，該組合物含有作為活性成分的脂肪源性成體干細(xì)胞和/或其分泌產(chǎn)物。本發(fā)明組合物中的脂肪源性成體干細(xì)胞分泌產(chǎn)物的實(shí)例包括RantesMCP-I (單核細(xì)胞趨化蛋白-1)、MIP_3P (單核細(xì)胞炎性蛋白-3P)、SDF_la (基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-I a )、BCA-1(B細(xì)胞吸引趨化因子-I)、CXCL16(趨化因子C-X-C基序配體16)、EGF(內(nèi)皮生長因子)、b-FGF (堿性成纖維細(xì)胞生長因子)、HGF (肝細(xì)胞生長因子)、TGF-0 I (轉(zhuǎn)化生長因子^ I)、IGF-I (胰島素樣生長因子I)、H)GF-AB(血小板源性生長因子AB) >TNF-a (腫瘤壞死因子- a )、脂聯(lián)素、瘦素以及前膠原的受體。優(yōu)選地，分泌產(chǎn)物可為脂聯(lián)素和/或瘦素。脂肪組織源性成體干細(xì)胞和/或其分泌產(chǎn)物可用作人脂肪組織源性成體干細(xì)胞的培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)液通過在含有特定成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人脂肪組織源性成體干細(xì)胞，收獲培養(yǎng)基，并從培養(yǎng)基中移除細(xì)胞碎片來獲得。此外，組合物可進(jìn)一步含有FBS。優(yōu)選地，組合物可含有大約30%的FBS。脂肪源性成體干細(xì)胞及其分泌產(chǎn)物表達(dá)一種或多種趨化因子或生長因子的受體，并隨所述趨化因子或生長因子遷移，所述趨化因子或生長因子選自由Rantes、MCP-I (單核細(xì)胞趨化蛋白-1)、MIP_3P (單核細(xì)胞炎性蛋白-3P)、SDF_la (基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-I a )、BCA-1(B細(xì)胞吸引趨化因子-I)、CXCL16(趨化因子C-X-C基序配體16)、EGF(內(nèi)皮生長因子)、b-FGF (堿性成纖維細(xì)胞生長因子)、HGF (肝細(xì)胞生長因子)、TGF-0 I (轉(zhuǎn)化生長因子3 I)、IGF-I (胰島素樣生長因子I)、PDGF-AB(血小板源性生長因子AB)以及TNF_a (腫瘤壞死因子-a)構(gòu)成的組。此外，本發(fā)明組合物中的脂肪源性成體干細(xì)胞可優(yōu)選源自哺乳動物，更優(yōu)選源自人。例如，脂肪源性成體干細(xì)胞可為人脂肪組織源性間充質(zhì)干細(xì)胞(AdMSC)。特別地，本發(fā)明中使用的脂肪組織源性成體干細(xì)胞優(yōu)選以含有趨化因子或生長因子的混合物(cocktail)進(jìn)行前處理。優(yōu)選地，該混合物可含有選自由Rantes、MCP-I (單核細(xì)胞趨化蛋白-I)、MIP-3 ^ (單核細(xì)胞炎性蛋白-3 ^ ) ,SDF-I a (基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-I a ) ,BCA-I (B細(xì)胞吸引趨化因子-I)、CXCL16 (趨化因子C-X-C基序配體16)、EGF (內(nèi)皮生長因子)、b_FGF(堿性成纖維細(xì)胞生長因子)、HGF (肝細(xì)胞生長因子)、TGF-P I (轉(zhuǎn)化生長因子P I)、IGF-I (胰島素樣生長因子I)、PDGF-AB (血小板源性生長因子AB)以及TNF- α (腫瘤壞死因子-α )構(gòu)成的組中的ー種或多種因子。特別地，該混合物更優(yōu)選可含有選自由Rantes、SDF-Ια (基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-I α )、HGF (肝細(xì)胞生長因子)、TNF_a (腫瘤壞死因子-a )、TOGF-AB (血小板源性生長因子AB)以及TGF-βΙ (轉(zhuǎn)化生長因子β )構(gòu)成的組中的ー種或多種因子。人成體干細(xì)胞優(yōu)選含有總計約I X IO7至I X 101°的細(xì)胞，且更優(yōu)選為約I X IO8至IXio9的細(xì)胞。本發(fā)明也提供了ー種用于誘導(dǎo)脂肪組織源性成體干細(xì)胞遷移的方法，該方法包括以下步驟(a)以含有趨化因子或生長因子的混合物對脂肪組織源性成體干細(xì)胞進(jìn)行前處理；以及(b)將含經(jīng)前處理的脂肪組織源性成體干細(xì)胞及其分泌產(chǎn)物的組合物施用于不與疾病部位直接接觸的體內(nèi)部位。在這一方法中，組合物最優(yōu)選為進(jìn)行靜脈給藥。


圖I以圖表顯示了由多種趨化因子或生長因子誘導(dǎo)脂肪組織源性專能間充質(zhì)干細(xì)胞遷移的結(jié)果。圖2為在誘導(dǎo)細(xì)胞遷移后，脂肪組織源性專能間充質(zhì)干細(xì)胞的一組顯微圖片。圖3以圖表顯示了通過10%的FBS誘導(dǎo)以多種趨化因子或生長因子進(jìn)行前處理的脂肪組織源性專能間充質(zhì)干細(xì)胞遷移的結(jié)果。圖4以圖表顯示了通過多種趨化因子或生長因子誘導(dǎo)以TNF-α進(jìn)行前處理的脂肪組織源性專能間充質(zhì)干細(xì)胞遷移的結(jié)果。圖5以圖表顯示了以多種趨化因子或生長因子進(jìn)行前處理的脂肪組織源性專能間充質(zhì)干細(xì)胞，通過與用于前處理細(xì)胞相同的趨化因子或生長因子來誘導(dǎo)遷移的結(jié)果。圖6是顯示為確定各種趨化因子或生長因子受體是否在脂肪組織源性專能間充質(zhì)干細(xì)胞及A549細(xì)胞中表達(dá)而進(jìn)行的FACS結(jié)果的ー組圖片。圖7為是顯示為確定各種趨化因子或生長因子受體的mRNA是否在脂肪組織源性專能間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)而進(jìn)行的RT-PCR結(jié)果的ー組圖片。在圖7A中，泳道I :CCRl (380bp)，泳道 2 CCR2 (474bp)，泳道 3 CCR7 (46 lbp)，泳道 4 CXCR4 (489bp)，泳道5 CXCR5 (494bp)，泳道 6 CXCR6 (517bp)以及泳道 7 GAPDH (362bp)。在圖 7B 中，M :分子標(biāo)記，泳道 I EGFR (419bp)，泳道 2 TGFBR2 (498bp)，泳道 3 =PDGFRA (187bp)，泳道 4 :PDGFRB (508bp)，泳道 5 IGFlR (299bp)，泳道 6 c-MET (201bp)，泳道 7 TNFRSF1A (218bp)，泳道 8 FGFR1 (250bp)以及泳道 9 GAPDH (362bp)。圖8描繪了圖表及ー組顯微圖片，其顯示了通過1、10及100ng/ml的脂聯(lián)素誘導(dǎo)以脂聯(lián)素進(jìn)行前處理的脂肪組織源性多能間充質(zhì)干細(xì)胞遷移的結(jié)果。圖9是顯示為確定脂聯(lián)素受體I和2的mRNA是否在脂肪組織源性專能間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)而進(jìn)行的RT-PCR結(jié)果的ー組圖片。在圖9中，泳道I :ADIP0Rl(337bp)，泳道2 ADIP0R2 (538bp)，泳道 3 GAPDH (362bp)。
具體實(shí)施方式
除非另有定義，否則本文中使用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的含義相同。一般地，本文中使用的命名及將在下文描述的實(shí)驗方法是本領(lǐng)域公知且通常采用的。干細(xì)胞是指不僅具有自我復(fù)制能力，而且具有分化為至少兩種類型細(xì)胞的能力的細(xì)胞。成體干細(xì)胞是出現(xiàn)在發(fā)育過程后胚胎中各器官已形成的階段或成體階段的干細(xì)胞。已知成體干細(xì)胞是多潛能的，且能夠分化為組織及器官特異性細(xì)胞。這樣的多潛能干細(xì)、胞(專能干細(xì)胞)，是能夠分化為對含有這些細(xì)胞的組織及器官特異的細(xì)胞，且不但涉及胎JL、新生兒及成人時期中多種組織和器官的生長與發(fā)育，還涉及保持成體組織的體內(nèi)平衡，以及在組織損傷時誘導(dǎo)再生的功能。在本發(fā)明中，可采用源自脂肪組織或上皮組織如毛囊或羊膜的成體干細(xì)胞。優(yōu)選地，采用人脂肪組織源性成體干細(xì)胞?？刹捎瞄g充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)。特別地，可采用人脂肪組織源性間充質(zhì)干細(xì)胞(AdMSC)。所述脂肪組織或上皮組織優(yōu)選源自哺乳動物，更優(yōu)選源自人。在本發(fā)明的ー個實(shí)例中，采用了人脂肪組織源性間充質(zhì)干細(xì)胞(AdMSC)。本文中所使用的“脂肪組織源性成體干細(xì)胞”或“脂肪組織源性間充質(zhì)干細(xì)胞”是指從脂肪組織中分離的未分化成體干細(xì)胞，且在本文中也稱作“脂肪干細(xì)胞”。可根據(jù)本領(lǐng)域已知的任ー常規(guī)方法來獲得這些細(xì)胞。可采用本領(lǐng)域已知的適于干細(xì)胞培養(yǎng)的任一常規(guī)培養(yǎng)基來獲得脂肪干細(xì)胞。例如，本發(fā)明中采用了 DMEM(Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基)。培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)基可補(bǔ)充添加剤，該添加劑促進(jìn)脂肪干細(xì)胞未分化表型增殖，同時抑制細(xì)胞分化。并且，培養(yǎng)基一般可含有等滲溶液的中性緩沖液(如磷酸鹽和/或高濃度碳酸氫鹽)；蛋白營養(yǎng)物(例如，血清如FBS、血清替代品、白蛋白或必需及非必需氨基酸如谷氨酰胺)。此外，培養(yǎng)基可含有脂類(脂肪酸、膽固醇、血清HDL或LDL抽提物)以及在大部分這類培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的其他成分(如胰島素或轉(zhuǎn)鐵蛋白、核苷或核苷酸、丙酮酸、糖源如葡萄糖、呈任何離子形式或鹽的硒、糖皮質(zhì)激素如氫化可的松和/或還原劑如巰基こ醇)O此外，為了防止細(xì)胞彼此附著，附著在容器壁上或形成過大的聚簇，在培養(yǎng)基中包括抗凝劑如Invitrogen出售的抗凝劑(Cat#0010057AE)可能有益處。在這些中，采用下列ー種或多種添加劑可能是有利的 干細(xì)胞因子(SCF、Steel因子)、ニ聚化c_kit的其他配體或抗體，以及相同信號傳導(dǎo)通路的其他活化劑 其他酪氨酸激活酶相關(guān)受體的配體，例如血小板源性生長因子(TOGF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、Flt-3配體以及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)受體的配體·提高環(huán)腺苷酸cAMP水平的因子,如弗斯可林(forskolin)·誘導(dǎo)gpl30的因子，如LIF或制瘤素-M 造血生長因子，如血栓形成素(TPO)·轉(zhuǎn)化生長因子，如TGF β I 其他生長因子，如上皮生長因子(EGF)
·神經(jīng)生長因子，如CNTF· N-こ酰-L-半胱氨酸(NAC)·氫化可的松 抗壞血酸特別地，本發(fā)明ー個實(shí)施方式中用來培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)基優(yōu)選含有NAC、抗壞血酸、鈣、胰島素及氫化可的松。更優(yōu)選地,培養(yǎng)基含有FBS、NAC、抗壞血 酸、鈣、rEGF、胰島素及氫化可的松。本發(fā)明的組合物可含有作為活性成分的來自脂肪組織源性間充質(zhì)干細(xì)胞的分泌產(chǎn)物。分泌產(chǎn)物的實(shí)例包括多種趨化因子、氨基酸、生長因子及類似物。本發(fā)明組合物中可含有的分泌產(chǎn)物特定實(shí)例包括TGF、bFGF、IGF-U KGF, HGF、纖連蛋白、VEGF、脂聯(lián)素、瘦素及前膠原，以及它們的受體。在來自脂肪源性成體干細(xì)胞的這些分泌產(chǎn)物中，脂聯(lián)素或瘦素特別源自脂肪組織，且非常有助于誘導(dǎo)細(xì)胞遷移。人成體干細(xì)胞和/或其分泌產(chǎn)物可用作人脂肪組織源性成體干細(xì)胞的培養(yǎng)液，通過在含有特定成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人脂肪組織源性成體干細(xì)胞，收獲培養(yǎng)基，并從培養(yǎng)基中移除細(xì)胞碎片來獲得。可選地，培養(yǎng)液提取物可単獨(dú)或聯(lián)合使用。換言之，本發(fā)明的組合物可為含有脂肪源性成體干細(xì)胞及其分泌產(chǎn)物和培養(yǎng)基成分的組合物，或者含有細(xì)胞分泌產(chǎn)物及培養(yǎng)基成分的組合物，或者含有單獨(dú)的的細(xì)胞分泌產(chǎn)物或的細(xì)胞分泌產(chǎn)物與成體干細(xì)胞結(jié)合的組合物，或者僅含有在體內(nèi)產(chǎn)生分泌產(chǎn)物的脂肪源性成體干細(xì)胞的組合物。在ー個方面，本發(fā)明涉及脂肪組織源性成體干細(xì)胞和/或其分泌產(chǎn)物用于誘導(dǎo)干細(xì)胞遷移的用途。更特別地，本發(fā)明是基于發(fā)現(xiàn)了脂肪組織源性成體干細(xì)胞及其特定分泌產(chǎn)物顯示出趨化因子或生長因子受體的功能，它們在疾病部位表達(dá)。本文中所使用的短語“顯示出趨化因子或生長因子受體的功能”是指脂肪組織源性成體干細(xì)胞在細(xì)胞表面表達(dá)特異性結(jié)合特定趨化因子或生長因子的受體，或來自這些細(xì)胞的分泌產(chǎn)物為該受體或包括該受體。換言之，這意味著脂肪干細(xì)胞具有與特定趨化因子或生長因子反應(yīng)的能力。生長因子是指促進(jìn)各種細(xì)胞分裂、生長及分化的多肽的集合，且已知它們參與細(xì)胞信號。生長因子根據(jù)結(jié)構(gòu)相似性被分類為家族，并通過如自分泌、旁分泌、內(nèi)分泌及類似機(jī)制作用于目標(biāo)細(xì)胞。生長因子受體通常在胞內(nèi)區(qū)具有酪氨酸激酶活性，且當(dāng)它們與配體受體結(jié)合時，生長因子受體本身或胞內(nèi)蛋白的酪氨酸殘基磷酸化，并發(fā)生細(xì)胞増殖或分化。趨化因子由在炎癥中產(chǎn)生并調(diào)節(jié)白細(xì)胞募集的小細(xì)胞因子家族構(gòu)成。這些趨化因子能夠選擇性誘導(dǎo)血液有形成分(除了紅血球)的趨化性，包括白細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞及淋巴細(xì)胞，如T細(xì)胞和B細(xì)胞。除了刺激趨化性，可通過應(yīng)答細(xì)胞中與白細(xì)胞活化有關(guān)的趨化因子來選擇性誘導(dǎo)其他變化，包括細(xì)胞形狀的變化、胞內(nèi)游離鈣離子(Ca2+)濃度的瞬時上升、顆粒胞吐、上調(diào)整合、生物活性脂類(例如，白細(xì)胞三烯)的形成以及呼吸爆發(fā)。因此，趨化因子是炎癥反應(yīng)的早期觸發(fā)物，引發(fā)炎癥介質(zhì)釋放、趨向及外滲至感染或炎癥部位。總之，趨化因子/受體相互作用傾向于是混雜的，即ー個趨化因子能結(jié)合至許多趨化因子受體，并且相反地，單個趨化因子受體能與若干趨化因子相互作用。先前還未了解趨化因子受體信號以及對配體選擇性的許多方面?；谥驹葱猿审w干細(xì)胞及其分泌產(chǎn)物顯示出趨化因子受體功能的新發(fā)現(xiàn)，本申請旨在利用脂肪源性成體干細(xì)胞對在疾病部位表達(dá)的特定趨化因子反應(yīng)而遷移至感染或炎癥部位(例如，疾病部位)的功能(這遷移也稱作“目標(biāo)遷移”)。在本發(fā)明中，也考慮到了反應(yīng)不僅是對趨化因子，而且也對特定生長因子。特別地，脂肪源性成體干細(xì)胞對選自由Rantes, MCP-I (單核細(xì)胞趨化蛋白-I)、MIP-3 β (單核細(xì)胞炎性蛋白_3 β )、SDF-I α (基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-la)、BCA-I (B細(xì)胞吸引趨化因子-I)、CXCL16 (趨化因子C-X-C基序配體16)、EGF(內(nèi)皮生長因子)、b-FGF(堿性成纖維細(xì)胞生長因子)、HGF(肝細(xì)胞生長因子)、TGF-β I (轉(zhuǎn)化生長因子β I)、IGF-I (胰島素樣生長因子I)、I3DGF-AB (血小板源性生長因子AB)以及TNF-α (腫瘤壞死因子-α)構(gòu)成的組中的趨化因子或生長因子反應(yīng)極佳。為了通過趨化因子或生長因子與其受體相互作用來增強(qiáng)細(xì)胞遷移的能力，本發(fā)明的組合物可進(jìn)ー步含有FBS。優(yōu)選地，組合物含有大約30%的FBS。應(yīng)理解，即便組合物中不含F(xiàn)BS，施用至體內(nèi)時也能夠利用現(xiàn)存于體內(nèi)的FBS。同吋，為了提高脂肪組織源性成體干細(xì)胞和/或脂肪組織源性成體干細(xì)胞的分泌產(chǎn)物受體的表達(dá)水平或反應(yīng)，脂肪組織源性成體干細(xì)胞優(yōu)選以含有趨化因子或生長因子的混合物進(jìn)行前處理。特別地，混合物可優(yōu)選含有選自由Rantes、MCP-I (單核細(xì)胞趨化蛋白-I)、ΜΙΡ-3 β (單核細(xì)胞炎性蛋白_3 β ) ,SDF-I α (基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-I a ) ,BCA-I (B細(xì)胞吸引趨化因子-1)、CXCL16(趨化因子C-X-C基序配體16)、EGF (內(nèi)皮生長因子)、b_FGF (堿性成纖維細(xì)胞生長因子)、HGF (肝細(xì)胞生長因子)、TGF-β I (轉(zhuǎn)化生長因子β I)、IGF-I (胰島素樣生長因子I)、TOGF-AB (血小板源性生長因子AB)以及TNF-α (腫瘤壞死因子-α)構(gòu)成的組中的ー種或多種因子?；旌衔锟筛鼉?yōu)選含有選自由RanteS、SDF-la (基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-I α )、HGF (肝細(xì)胞生長因子)、TNF_a (腫瘤壞死因子-a )、TOGF-AB (血小板源性生長因子AB)以及TGF-βΙ (轉(zhuǎn)化生長因子β )構(gòu)成的組中的ー種或多種因子。如本發(fā)明的實(shí)施例5所示，在以特定趨化因子或生長因子和/或細(xì)胞的分泌產(chǎn)物對脂肪組織源性成體干細(xì)胞進(jìn)行前處理的情形下，對趨化因子或生長因子反應(yīng)的細(xì)胞遷移顯著增加了。因此，在另一方面，本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)脂肪組織源性成體干細(xì)胞遷移的方法，該方法包括以下步驟(a)以含有趨化因子或生長因子的混合物對脂肪組織源性成體干細(xì)胞進(jìn)行前處理；以及(b)將含經(jīng)前處理的脂肪組織源性成體干細(xì)胞及其分泌產(chǎn)物的組合物施用于體內(nèi)部位，該部位不與疾病部位直接接觸。本發(fā)明的方法中，通過在含有趨化因子或生長因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)成體干細(xì)胞來實(shí)施以含有趨化因子或生長因子的混合物對成體干細(xì)胞進(jìn)行前處理的步驟(a)。成體干細(xì)胞的前處理約進(jìn)行20-60小時,優(yōu)選約20-50小時。本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，成體干細(xì)胞的前處理進(jìn)行24小吋。此外，在脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)之前、期間或之后實(shí)施以混合物對脂肪干細(xì)胞進(jìn)行前處理。優(yōu)選地，在脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)之后實(shí)施前處理。
混合物可優(yōu)選含有選自由Rantes、MCP-I (單核細(xì)胞趨化蛋白_1)、ΜΙΡ_3β (單核細(xì)胞炎性蛋白_3 β ) >SDF-1 α (基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-I a ) ,BCA-I (B細(xì)胞吸引趨化因子_1)、CXCL16(趨化因子C-X-C基序配體16)、EGF(內(nèi)皮生長因子)、b_FGF (堿性成纖維細(xì)胞生長因子)、HGF (肝細(xì)胞生長因子)、TGF- β I (轉(zhuǎn)化生長因子β I)、IGF-I (胰島素樣生長因子1)、H)GF-AB (血小板源性生長因子AB)以及TNF-α (腫瘤壞死因子-α)構(gòu)成的組中的ー種或多種因子。更優(yōu)選地，混合物可含有選自由Rantes、SDF-l α (基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-I α )、HGF (肝細(xì)胞生長因子)、TNF- α (腫瘤壞死因子-α )、PDGF-AB (血小板源性生長因子AB)以及TGF-β I (轉(zhuǎn)化生長因子β I)構(gòu)成的組中的ー種或多種因子。此外，用于步驟(b)的含經(jīng)前處理的脂肪源性成體干細(xì)胞和/或其分泌產(chǎn)物的組合物可為含有所有經(jīng)前處理的脂肪干細(xì)胞、分泌產(chǎn)物及培養(yǎng)基的組合物，或者含有分泌產(chǎn)物和未經(jīng)前處理的脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)基的組合物，或者含有無分泌產(chǎn)物的經(jīng)前處理的脂肪干細(xì)胞及培養(yǎng)基的組合物。因此，可以各種方式使用經(jīng)前處理的脂肪干細(xì)胞、分泌產(chǎn)物及培養(yǎng)基，但無特別限制。進(jìn)ー步，本文中所使用的短語“將組合物施用于體內(nèi)部位，該部位不與疾病部位直 接接觸”意味著通過誘導(dǎo)干細(xì)胞的至少部分定位于疾病部位外的部位的方法或途徑，排除移植干細(xì)胞至疾病部位的方法，來在受試者中定位干細(xì)胞。本發(fā)明的組合物能通過任ー適合途徑來施用于受試者，以便將其遞送至受試者的期望位置，在該位置中細(xì)胞的ー些成分仍存活。本文中所使用的術(shù)語“施用”可與“引入”、“遞送”、“定位”或類似語互換使用。在臨床施用上，本發(fā)明的組合物可腸道外施用，例如，通過肌肉內(nèi)或靜脈注射。最優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物通過靜脈注射施用。因此，本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)脂肪組織源性成體干細(xì)胞遷移的方法，該方法包括靜脈內(nèi)施用含有以趨化因子或生長因子和/或其分泌產(chǎn)物進(jìn)行前處理的脂肪組織源性成體干細(xì)胞的組合物。再一方面，本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)脂肪組織源性成體干細(xì)胞目標(biāo)遷移的方法，使得細(xì)胞到達(dá)疾病部位，從而治療該疾病部位。因此，本發(fā)明涉及含有脂肪組織源性成體干細(xì)胞及其分泌產(chǎn)物作為活性成分的細(xì)胞治療劑，以及利用該細(xì)胞治療劑治療疾病部位的方法。除非另有指示，否則本文中所使用的術(shù)語“治療”意味著逆轉(zhuǎn)、緩和、抑制該術(shù)語所適用的失調(diào)或病癥或者這種失調(diào)或病癥的ー種或多種癥狀的進(jìn)展，或防止它們。本文中所使用的術(shù)語“治療(treatment)”是指如上述定義的“進(jìn)行治療”這樣的治療行為。因此，本文中所使用的，對哺乳動物“進(jìn)行治療”疾病或疾病“治療”包括以下ー種或多種(I)抑制疾病的生長，例如，阻止它的發(fā)展；(2)防止疾病的擴(kuò)散，例如，防止轉(zhuǎn)移；(3)減輕疾病，例如，使癌癥消退；(4)防止疾病復(fù)發(fā)；以及(5)緩和疾病癥狀。為了通過使干細(xì)胞遷移至疾病部位來治療疾病部位，本發(fā)明的組合物以藥物有效量進(jìn)行施用。本文中所使用的術(shù)語“治療有效量”意味著待施用化合物緩和所治療疾病的ー種或多種癥狀至某種程度的劑量。因此，治療有效量是指具有以下效果的劑量(I)逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)展的速度；(2)抑制疾病進(jìn)展至某種程度；或者(3)減輕(優(yōu)選消除)與疾病相關(guān)的ー種或多種癥狀至某種程度。本發(fā)明的組合物(細(xì)胞治療劑)在臨床上可由腸胃外施用，如肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)。最優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物通過靜脈注射施用。為了注射，本發(fā)明的組合物優(yōu)選地可用藥學(xué)上可接受的緩沖液配制，如Hank溶液，Ringer溶液或生理鹽水緩沖液。為了穿過黏液(transmucous)施用，制劑中采用適于穿過組合物待通過的屏障的非侵入試劑。這些非侵入試劑是本領(lǐng)域中通常已知的。腸道外施用的制劑包括無菌水溶液、非水性溶剤、懸浮劑、乳化剤?？捎糜诒景l(fā)明的懸浮劑及乳化劑包括植物油，如丙ニ醇、聚こニ醇和橄欖油，以及可注射酯如油酸こ酷。對于人，本發(fā)明的細(xì)胞治療劑通?？梢訧O4-IOltl細(xì)胞/個體，且優(yōu)選以IO6-IO8細(xì)胞/個體的劑量施用一次或若干次。特別地，本發(fā)明的組合物優(yōu)選含有濃度為IXlO8細(xì)胞/100 μ I至I X IO9細(xì)胞/100 μ I的成體干細(xì)胞。 然而，應(yīng)當(dāng)理解組合物活性成分的實(shí)際劑量應(yīng)根據(jù)多種相關(guān)因素來確定，包括待治療的疾病，施用途徑，患者年齡、性別及體重，以及疾病的嚴(yán)重程度。因此，上述劑量不應(yīng)以任何方式限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例下文中，將參考實(shí)施例進(jìn)ー步詳細(xì)描述本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見，這些實(shí)例僅作為示意用途，且不構(gòu)成對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。下表I顯示了實(shí)施例中使用的培養(yǎng)基及試劑的來源。表I
廣品品牌
抗壞血酸SigmaUSA
CaCl2SigraaUSA
I型膠原酶GibcoUSA
DMEMGibcoUSADPBSVVelgeneKorea---
EGFGibcoUSAFBSGibcoUSA
氫化可的松SigmaUSA
脇島素GibcoUSA
K-SFMGibcoUSANACSigmaUSA
實(shí)施例I :源自人脂肪組織的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離通過吸脂術(shù)從腹部脂肪中分離人脂肪組織，并用PBS洗滌。細(xì)致切割分離的組織，且之后用補(bǔ)充了 I型膠原酶(lmg/ml)的DMEM培養(yǎng)基在37°C消化2小吋。用PBS洗滌后，將消化的組織以IOOOrpm離心5分鐘。吸掉上清液，并用PBS洗滌殘留在底部的沉淀，且之后以IOOOrpm離心5分鐘。留下的細(xì)胞通過100-μ m網(wǎng)狀過濾器過濾來移除碎片，然后用PBS洗滌細(xì)胞且之后在DMEM(10% FBS、2mM NAC、O. 2mM抗壞血酸)中培養(yǎng)過夜。隨后，通過PBS洗滌來移除非附著細(xì)胞，且傳代培養(yǎng)殘留的細(xì)胞，同時每隔兩天以 Keratinocyte-SFM 培養(yǎng)基(含有 5% FBS、2mM NAC,O. 2mM 抗壞血酸、O. 09mM 鈣、5ng/mlrEGF,5 μ g/ml胰島素以及74ng/ml氫化可的松)替代培養(yǎng)基，由此分離脂肪組織源性專能間充質(zhì)干細(xì)胞。實(shí)施例2 :誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞的遷移2-1 :通過表2中示出的趨化因子或生長因子誘導(dǎo)細(xì)胞遷移將實(shí)施例I中分離的脂肪組織源性多潛能間充質(zhì)干細(xì)胞以2X IO4細(xì)胞/200 μ I的濃度接種至各孔，并通過下表2中示出的趨化因子或生長因子誘導(dǎo)遷移。以30%的FBS作為陽性對照組。表權(quán)利要求
1.一種誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞遷移的組合物，其中所述組合物含有作為活性成分的一種或多種脂肪組織源性成體干細(xì)胞及其分泌產(chǎn)物。
2.如權(quán)利要求I所述的組合物，其中所述脂肪組織源性成體干細(xì)胞在細(xì)胞表面表達(dá)趨化因子或生長因子受體，或者來自這些干細(xì)胞的分泌產(chǎn)物包含所述趨化因子或生長因子受體。
3.如權(quán)利要求I所述的組合物，其中所述脂肪組織源性成體干細(xì)胞的所述分泌產(chǎn)物為脂聯(lián)素和/或瘦素。
4.如權(quán)利要求I所述的組合物,進(jìn)一步含有FBS(胎牛血清)。
5.如權(quán)利要求I或4所述的組合物，其中所述趨化因子或生長因子受體是選自由Rantes、MCP-I (單核細(xì)胞趨化蛋白-I)、MIP_3 P (單核細(xì)胞炎性蛋白_3 P )、SDF-I a (基質(zhì)細(xì)胞衍生因子_la)、BCA-I (B細(xì)胞吸引趨化因子-I)、CXCL16 (趨化因子C_X_C基序配體16)、EGF(內(nèi)皮生長因子)、b-FGF (堿性成纖維細(xì)胞生長因子)、HGF (肝細(xì)胞生長因子)、TGF-^ I (轉(zhuǎn)化生長因子P I)、IGF-I (胰島素樣生長因子I)、I3DGF-AB (血小板源性生長因子AB)以及TNF-a (腫瘤壞死因子-a)構(gòu)成的組。
6.如權(quán)利要求I所述的組合物，其中所述脂肪組織源性成體干細(xì)胞以含有趨化因子或生長因子的混合物進(jìn)行前處理。
7.如權(quán)利要求6所述的組合物，其中所述混合物含有選自由Rantes、MCP-I(單核細(xì)胞趨化蛋白-I)、MIP-3 P (單核細(xì)胞炎性蛋白-33)、SDF-I a (基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-I a )、BCA-1(B細(xì)胞吸引趨化因子-I)、CXCL16(趨化因子C-X-C基序配體16)、EGF(內(nèi)皮生長因子)、b-FGF (堿性成纖維細(xì)胞生長因子)、HGF (肝細(xì)胞生長因子)、TGF-0 I (轉(zhuǎn)化生長因子^ I)、IGF-I (胰島素樣生長因子I)、H)GF-AB(血小板源性生長因子AB)以及TNF-a (腫瘤壞死因子-a)構(gòu)成的組中的一種或多種因子。
8.如權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述混合物含有選自由Rantes、SDF-la (基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-I a )、HGF (肝細(xì)胞生長因子)、TNF_a (腫瘤壞死因子-a )、TOGF-AB (血小板源性生長因子AB)以及TGF-0 1(轉(zhuǎn)化生長因子￠1)構(gòu)成的組中的一種或多種因子。
9.如權(quán)利要求I所述的組合物，其中所述脂肪組織源性成體干細(xì)胞為人脂肪組織源性間充質(zhì)干細(xì)胞(AdMSC)。
10.如權(quán)利要求I所述的組合物，其中所述組合物中含有大約IX IO7個細(xì)胞至I X IO10個細(xì)胞量的所述脂肪組織源性成體干細(xì)胞。
11.一種誘導(dǎo)脂肪組織源性成體干細(xì)胞遷移的方法，所述方法包括以下步驟 (a)以含有趨化因子或生長因子的混合物對脂肪組織源性成體干細(xì)胞進(jìn)行前處理；以及 (b)將含有經(jīng)前處理的脂肪組織源性成體干細(xì)胞及其分泌產(chǎn)物的組合物施用于體內(nèi)部位，該體內(nèi)部位不與疾病部位直接接觸。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中步驟(a)進(jìn)一步包括以FBS對成體干細(xì)胞進(jìn)行前處理。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述混合物含有選自由Rantes、SDF-la (基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-I a )、HGF (肝細(xì)胞生長因子)、TNF_a (腫瘤壞死因子-a )、TOGF-AB (血小板源性生長因子AB)以及TGF-0 1(轉(zhuǎn)化生長因子￠1)構(gòu)成的組中的一種或多種因子。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述施用的步驟是通過靜脈給藥實(shí)施。
全文摘要
本發(fā)明涉及脂肪組織源性成體干細(xì)胞遷移的性能，且尤其是涉及以特定趨化因子或生長因子前處理的脂肪組織源性成體干細(xì)胞及其特定分泌產(chǎn)物的新型用途，所述成體干細(xì)胞及其特定分泌產(chǎn)物更有效地遷移至體內(nèi)疾病部位。本發(fā)明組合物含有脂肪組織源性成體干細(xì)胞或以特定趨化因子或生長因子前處理的脂肪組織源性成體干細(xì)胞，可通過簡單方式如靜脈給藥來施用，且能夠誘導(dǎo)干細(xì)胞靶向疾病部位。因此，組合物可用作細(xì)胞治療劑。
文檔編號C12N5/071GK102666840SQ201080058811
公開日2012年9月12日 申請日期2010年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月23日
發(fā)明者姜成根, 白善軫, 羅廷燦 申請人:Rnl生物技術(shù)株式會社