專利名稱：涉及編碼dtp21多肽的基因的耐旱植物、以及相關(guān)的構(gòu)建體和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明領(lǐng)域涉及植物育種和基因?qū)W，并且具體地講，涉及用于賦予植物耐旱性的重組DNA構(gòu)建體。
_2]
背景技術(shù)：
非生物脅迫是世界范圍內(nèi)作物損失的主要原因，它引起主要作物超過50%的平均產(chǎn)量損失(Boyer, J. S. (1982) Science 218 :443-448 ；Bray, E. A.等人(2000) Biochemistryand Molecular Biology of Plants,由 Buchannan, B. B.等人編輯，Amer. Soc. PlantBiol.，第1158-1249頁)。在多種非生物脅迫中，干旱是限制世界范圍內(nèi)作物產(chǎn)量的主要因素。在不同發(fā)育階段使植物暴露于水限制環(huán)境似乎激活了多個生理和發(fā)育變化。理解干旱脅迫感受、轉(zhuǎn)導(dǎo)和耐受性的基本生物化學(xué)和分子機制是生物學(xué)上的主要挑戰(zhàn)。已經(jīng)公布 了對非生物脅迫響應(yīng)的分子機制和干旱脅迫耐受性的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的回顧(Valliyodan，B.和 Nguyen, H. Τ· , (2006) Curr. Opin. Plant Biol. 9 :189-195 ；ffang, ff.等人(2003)Planta218 :1-14) ；Vinocur, B.和 Altman, A. (2005)Curr. Opin. Biotechnol. 16 123-132 ；Chaves, Μ. M.和 Oliveira, Μ. M. (2004) J. Exp. Bot. 55 :2365-2384 ；Shinozaki, K.等人(2003)Curr. Opin. Plant Biol. 6 :410-417 ；Yamaguchi-Shinozaki, K.和 Shinozaki,K. (2005)Trends Plant Sci. 10 :88-94)。熟知的是對非生物脅迫的響應(yīng)在不同植物種類和同一植物種類中的不同品種和變種之間有顯著差別。某些種類、品種或變種比其他品種對非生物脅迫如干旱更有耐受性。此類植物的基因型是涉及對非生物脅迫獨特響應(yīng)的有吸引力的基因來源。迄今已經(jīng)廣泛地嘗試鑒定轉(zhuǎn)基因植物中的基因應(yīng)激反應(yīng)以及它們的表達。然而，導(dǎo)入植物的應(yīng)激反應(yīng)基因經(jīng)常不被很好地表達。表達不良的原因可包括選擇的啟動子和/或其他調(diào)控元件不合適以及外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)的破壞。將保留天然啟動子、整個編碼區(qū)和完整的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)的植物基因組片段導(dǎo)入植物可為良好表達外源應(yīng)激反應(yīng)基因的有效方法。例如，報道了稻中涉及光合作用的酶從基因組克隆中的表達比從相應(yīng)的cDNA克隆中的表達要高得多(Ku 等人，Nature Biotechnol. 17 :76-80,1999)。近來開發(fā)了ー種有效篩選能夠提供植物農(nóng)學(xué)上有利的表型變型的基因組DNA片段的方法(美國專利公布US2008/0301832A1)。在這個方法中，用來自構(gòu)建自高等植物的基因組文庫的基因組片段轉(zhuǎn)化植物，并且篩選所得轉(zhuǎn)基因植物以獲得農(nóng)學(xué)上有利的表型變型?？珊Y選所得植物對非生物脅迫的獨特響應(yīng)如耐旱性，并且最后可鑒定可攜帯易于在植物中表達的應(yīng)激反應(yīng)基因的基因組片段。為了鑒定獨特的應(yīng)激反應(yīng)基因并在轉(zhuǎn)基因植物中利用這ー基因，需要進行大量的實驗。需考慮的多個因素包括如下因素從其中構(gòu)建基因組文庫的植物的選擇；如何篩選轉(zhuǎn)基因植物；如何檢查基因組片段；以及如何精確地找到、表征并利用應(yīng)激反應(yīng)基因。發(fā)明概沭本發(fā)明包括
在一個實施方案中，在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列選自(a)編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比對方法，使用逐對比對默認參數(shù)KTUPLE = 1，GAP PENALTY = 3，WINDOW = 5以及DIAGONALSSAVED = 5，所述多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85或87進行比較時具有至少60%、80%、85%、90%、95%或100%的序列同一性；(b)編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能夠在嚴格條件下與包含SEQ ID NO26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的全長互補序列的DNA分子雜交；(c)編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列通過選自刪除、取代、添加和插入的至少一種方法改變一個或多個核苷酸而衍生自SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84或86 ； (d)編碼多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85 或 87 ;和(e)包含 SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84 或 86 的核苷酸序列；并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出增強的耐旱性。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。在另一個實施方案中，在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物，所述重組DNA構(gòu)建·體包含可操作地連接至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列選自(a)編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比對方法，使用逐對比對默認參數(shù)KTUPLE = 1,GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5以及DIAGONALSSAVED = 5，所述多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85或87進行比較時具有至少60%、80%、85%、90%、95%或100%的序列同一性；(b)編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能夠在嚴格條件下與包含SEQ ID NO26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的全長互補序列的DNA分子雜交；(c)編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列通過選自刪除、取代、添加和插入的至少一種方法改變一個或多個核苷酸而衍生自SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84或86 ;(d)編碼多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85 或 87 ;和(e)包含 SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84 或 86 的核苷酸序列；并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出增加的產(chǎn)量。在水限制條件下，所述植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的所述對照植物進行比較時可表現(xiàn)出所述產(chǎn)量的提高。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。在另一個實施方案中，增強植物耐旱性的方法，包括(a)將重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入到可再生的植物細胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列選自(i)編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比對方法，使用逐對比對默認參數(shù)KTUPLE = 1,GAPPENALTY = 3，WINDOW = 5以及DIAGONALS SAVED = 5，所述多肽具有的氨基酸序列在與SEQID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85 或 87 進行比較時具有至少 60%,80%,85%,90% ,95%或100%的序列同一性；(ii)編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能夠在嚴格條件下與包含SEQ ID N0:26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的全長互補序列的DNA分子雜交；(iii)編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列通過選自刪除、取代、添加和插入的至少一種方法改變一個或多個核苷酸而衍生自SEQID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84或86 ;(iv)編碼多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列包含 SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85 或 87 ;和(V)包含 SEQ ID NO:
26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的核苷酸序列；以及(b)在步驟(a)之后，由所述可再生的植物細胞再生轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體并且在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出增強的耐旱性。所述方法還可包括(c)獲得來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體并且在與不包含該重組DNA構(gòu)建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出增強的耐旱性。在另ー個實施方案中，評價植物耐旱性的方法，包括(a)獲得轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少ー種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列選 自(i)編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比對方法，使用逐對比對默認參數(shù) KTUPLE = 1，GAP PENALTY = 3，WINDOW = 5 以及 DIAGONALS SAVED = 5，所述多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85或87進行比較時具有至少60%、80%、85%、90%、95%或100%的序列同一性；(ii)編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能夠在嚴格條件下與包含SEQ ID N0:26、31、44、55、
59、63、80、82、84或86的全長互補序列的DNA分子雜交；(iii)編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列通過選自刪除、取代、添加和插入的至少ー種方法改變ー個或多個核苷酸而衍生自SEQ ID N0:26、31、44、55、59、63、80、82、84_86;(iv)編碼多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85或 87 ;和(V)包含 SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84 或 86 的核苷酸序列；以及(b)獲得來源于(a)的轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(c)評價所述子代植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物相比的耐旱性。在另ー個實施方案中，測定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，包括(a)獲得轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少ー種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列選自(i)編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比對方法，使用逐對比對默認參數(shù) KTUPLE = 1,GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5 以及 DIAGONALS SAVED =5，所述多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85或87進行比較時具有至少60%、80%、85%、90%、95%或100%的序列同一性；(ii)編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能夠在嚴格條件下與包含SEQID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的全長互補序列的DNA分子雜交；(iii)編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列通過選自刪除、取代、添加和插入的至少ー種方法改變ー個或多個核苷酸而衍生自SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84或86 ;(iv)編碼多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85 或 87;和(V)包含 SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84 或 86 的核苷酸序列；以及(b)獲得來源于所述步驟(a)的轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(c)測定所述子代植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進行比較時是否表現(xiàn)出至少ー種農(nóng)學(xué)特性的改變。所述測定步驟(C)可包括在水限制條件下，測定所述轉(zhuǎn)基因植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進行比較時是否表現(xiàn)出至少ー種農(nóng)學(xué)特性的改變。所述至少一種農(nóng)學(xué)性狀可以是產(chǎn)量，并且進一步地，可以是產(chǎn)量的提高。在另ー個實施方案中，分離的多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列選自(a)編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比對方法，使用逐對比對默認參數(shù) KTUPLE = I, GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5 以及 DIAGONALS SAVED = 5，所述多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85或87進行比較時具有至少60 %、80 %、85 %、90%或95%的序列同一性；(b)編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能夠在嚴格條件下與包含SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的全長互補序列的DNA分子雜交；(c)編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其
中所述核苷酸序列通過選自刪除、取代、添加和插入的至少ー種方法改變ー個或多個核苷酸而衍生自SEQ ID勵26、31、44、55、59、63、80、82、84或86;((1)編碼多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85或87 ;和(e)包含 SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84 或 86 的核苷酸序列。在另ー個實施方案中，分離的多核苷酸包含本發(fā)明的核苷酸序列的全長互補序列，其中本發(fā)明的全長互補序列和核苷酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成并且是100%互補的。在另ー個實施方案中，重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少ー種調(diào)控元件的本發(fā)明的分離的多核苷酸。在另ー個實施方案中，包含本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體的細胞選自細菌細胞、酵母細胞、以及昆蟲細胞和植物細胞。在另ー個實施方案中，植物或種子包含本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體。所述植物或種子可為單子葉或雙子葉的植物或種子。在另ー個實施方案中，分離由本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體編碼的多肽的方法，其中所述方法包括以下步驟(a)用本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化細胞；(b)在適于所述重組DNA構(gòu)建體表達的條件下使所述步驟(a)的轉(zhuǎn)化的細胞生長；以及(c)從所述步驟(b)的轉(zhuǎn)化細胞中分離所述多肽。在另ー個實施方案中，分離的多肽選自(a)具有耐旱活性的多肽，其中基于Clustal V比對方法，使用逐對比對默認參數(shù)KTUPLE = 1，GAP PENALTY = 3，WINDOW = 5以及DIAGONALS SAVED = 5，所述多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85或87進行比較時具有至少60%、80 %、85 %、90 %或95 %的序列同一性；(b)具有耐旱活性的多肽，其中所述氨基酸序列通過選自刪除、取代、添加和插入的至少ー種方法改變ー個或多個氨基酸而衍生自SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85或87 ;和(c)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85或87。在另ー個實施方案中，載體包含本發(fā)明的多核苷酸。在另ー個實施方案中，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括用重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細胞，并且由所述轉(zhuǎn)化的植物細胞再生轉(zhuǎn)基因植物。在另ー個實施方案中，本發(fā)明包括本發(fā)明的任何植物，其中所述植物選自玉米、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉、小麥、苜蓿、棉花、稻、大麥、粟、甘蔗、柳枝稷、煙草、馬鈴薯和甜菜。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括本發(fā)明的任何方法，其中所述植物選自玉米、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉、小麥、苜蓿、棉花、稻、大麥、粟、甘蔗、柳枝稷、煙草、馬鈴薯和甜菜。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括本發(fā)明的任何植物的種子，其中所述種子在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，基于Clustal V比對方法，所述多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID N0:27、32、46、56、60、64、81、83、85或87進行比較時具有至少60%的序列同一性，并且其中由所述種子產(chǎn)生的植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出或者耐旱性的增強、或者產(chǎn)量的提高、或者兩者皆有。 附圖
簡沭和序列表根據(jù)以下的詳細描述和附圖以及序列表，可更全面地理解本發(fā)明，以下的詳細描述和附圖以及序列表形成本申請的一部分。圖I示出用于基因型稻的PCR引物對的位點和序列，所述稻用基因組片段IS125轉(zhuǎn)化。圖2示出基因組片段IS125的不同區(qū)域，將其亞克隆到稻中以確定導(dǎo)致耐旱表型的區(qū)域。圖3示出耐旱基因的結(jié)構(gòu)，該基因編碼209個氨基酸的SS-DTP21-1多肽。圖 4A-4E 示出如 SEQ ID NO :27、32、41、42、45、46、52、54、56、58、60、62、64、66、79、81、83、85和87所示的DTP21多肽的氨基酸序列的比對結(jié)果?？蛑邪ㄔ诮o定位點上與SEQID NO :27的殘基不同的殘基。示出了共有序列，其中如果所有序列中的殘基相同，顯示該殘基，否則用圓點表示。圖5給出圖4A-4E中給出的每對序列的序列同一性百分比和趨異值。圖6A-6B示出用PHP29675轉(zhuǎn)化的單個Gaspe Flint來源的玉米品系的評價。圖7A-7B示出用PHP29675轉(zhuǎn)化的Gaspe Flint來源的玉米品系的綜合評價。SEQ ID NO :1是重組DNA片段的核苷酸序列，所述片段包含基因組片段IS125的核苷酸位點10-40049。SEQ ID NO 2是圖I的Ml引物對的正向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 3是圖I的Ml引物對的反向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 4是圖I的M2引物對的正向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 5是圖I的M2引物對的反向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 6是圖I的M3引物對的正向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 7是圖I的M3引物對的反向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 8是圖I的M4引物對的正向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 9是圖I的M4引物對的反向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO :10是圖I的M5引物對的正向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 11是圖I的M5引物對的反向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 12是圖I的M6引物對的正向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO :13是圖I的M6引物對的反向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 14是圖I的M_hpt引物對的正向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 15是圖I的M_hpt引物對的反向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO :16是用于生成Sub8片段的正向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 17是用于生成Sub8片段的反向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO :18是用于生成Sub7片段的正向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 19是用于生成Sub7片段的反向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 20是由Sub7片段編碼的RT-PCR的轉(zhuǎn)錄物的正向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO 21是由Sub7片段編碼的RT-PCR的轉(zhuǎn)錄物的反向引物的核苷酸序列。SEQ ID N0:22是用于編碼SS-DTP21-1的轉(zhuǎn)錄物5' -RACE的初始引物的核苷酸序列。SEQ ID N0:23是用于編碼SS-DTP21-1的轉(zhuǎn)錄物5' -RACE的巢式引物的核苷酸序列。SEQ ID N0:24是用于編碼SS-DTP21-1的轉(zhuǎn)錄物3' -RACE的初始引物的核苷酸序列。SEQ ID N0:25是用于編碼SS-DTP21-1的轉(zhuǎn)錄物3' -RACE的巢式引物的核苷酸序列。SEQ ID NO :26是位于編碼SS-DTP21-1多肽的基因組片段IS125內(nèi)的核苷酸序列。SEQ ID NO 27是由SEQ ID NO 26編碼的SS-DTP21-1多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO :28是由Sub5片段編碼的RT-PCR轉(zhuǎn)錄物的正向引物的核苷酸序列(表17)。SEQ ID NO :29是由Sub5片段編碼的RT-PCR轉(zhuǎn)錄物的反向引物的核苷酸序列(表17)。SEQ ID NO 30是重組DNA片段的核苷酸序列，所述片段包含基因組片段IS127的核苷酸位點3075-37662。SEQ ID NO :31是基因組片段IS127的區(qū)域核苷酸序列，所述片段編碼SS-DTP21-2多肽，它是與SS-DTP21-1序列同源的多肽。SEQ ID NO 32是由SEQ ID NO 31編碼的SS-DTP21-2多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO 33是用于擴增編碼SS-DTP21-2區(qū)域的正向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 34是用于擴增編碼SS-DTP21-2區(qū)域的反向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO :35是用于制備線性載體的正向引物的核苷酸序列，所述載體用于克隆來自高梁的、編碼與SS-DTP21-1同源的多肽的區(qū)域。SEQ ID NO :36是用于制備線性載體的反向引物的核苷酸序列，所述載體用于克隆來自高梁的、編碼與SS-DTP21-1同源的多肽的區(qū)域。SEQ ID N0:37是正向引物的核苷酸序列，所述引物用于擴增來自高梁(Goldsorgho)的、編碼與SS-DTP21-1同源的多肽的區(qū)域。SEQ ID NO :38是反向引物的核苷酸序列，所述引物用于擴增來自高梁的、編碼與SS-DTP21-1同源的多肽的區(qū)域。SEQ ID N0:39是來自高梁(Gold sorgho)的核苷酸序列，其編碼與來自蘇丹草的SS-DTP21-1 同源的多肽 SB-DTP21-1。SEQ ID NO :40是來自高梁(Gold sorgho)的核苷酸序列，其編碼與來自蘇丹草的SS-DTP21-1 同源的多肽 SB-DTP21-2。SEQ ID NO :41 是來自高梁(Gold sorgho)的、由 SEQ ID NO :39編碼的 SB-DTP21-1
多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO :42 是來自高梁(Gold sorgho)的、由 SEQ ID NO :40 編碼的 SB-DTP21-2 多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO :43是來自高梁(B35)的核苷酸序列，其編碼與來自蘇丹草的SS-DTP21-1 同源的多肽 SB-DTP21-3。SEQ ID NO :44是來自高梁(B35)的核苷酸序列，其編碼與來自蘇丹草的SS-DTP21-1 同源的多肽 SB-DTP21-4。SEQ ID N0:45 是來自高梁(B35)的、由 SEQ ID NO :43 編碼的 SB-DTP21-3 多肽的
氨基酸序列。SEQ ID NO 46 是來自高梁(B35)的、由 SEQ ID NO :44 編碼的 SB-DTP21-4 多肽的
氨基酸序列。SEQ ID NO 47 是來自高梁克隆 SB_BBc0073F19 的 NCBI GI No. 124359063 的位點24904至25530的核苷酸序列。SEQ ID NO 48 是來自高梁克隆 SB_BBc0109L12 的 NCBI GI No. 124359064 的位點44114至44740的核苷酸序列。SEQ ID NO :49是由SEQ ID NO :47編碼并與SS-DTP21-1多肽同源的多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO :50是由SEQ ID NO :48編碼并與SS-DTP21-1多肽同源的多肽的氨基酸序列；然而，這個翻譯包括兩個框內(nèi)終止密碼子。SEQ ID NO :51是來自蘇丹草的核苷酸序列，其編碼與SS-DTP21-1同源的多肽SS-DTP21-3。SEQ ID NO :52是由SEQ ID NO 51編碼的多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO :53是來自蘇丹草的核苷酸序列，其編碼與SS-DTP21-1同源的多肽SS-DTP21-4。SEQ ID NO :54是由SEQ ID NO 53編碼的多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO :55是來自蘇丹草的核苷酸序列，其編碼與SS-DTP21-1同源的多肽SS-DTP21-5。SEQ ID NO :56是由SEQ ID NO 55編碼的多肽的氨基酸序列。SEQ ID N0:57是來自蘇丹草的核苷酸序列，其編碼與SS-DTP21-1同源的多肽SS-DTP21-7。SEQ ID NO 58是由SEQ ID NO 57編碼的多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO :59是來自約翰遜草的核苷酸序列，其編碼與SS-DTP21-1同源的多肽SH-DTP21-1。SEQ ID NO :60是由SEQ ID NO 59編碼的多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO :61是來自約翰遜草的核苷酸序列，其編碼與SS-DTP21-1同源的多肽SH-DTP2ト2。SEQ ID NO :62是由SEQ ID NO :61編碼的多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO :63是來自甘蔗的核苷酸序列，其編碼與SS-DTP21-1同源的多肽S0-DTP21-1。
SEQ ID NO 64是由SEQ ID NO 63編碼的多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO :65是來自甘蔗的核苷酸序列，其編碼與SS-DTP21-1同源的多肽S0-DTP21-2。SEQ ID NO 66是由SEQ ID NO 65編碼的多肽的氨基酸序列。SEQ ID NOATiSS-DTPZl-I-S' attB正向引物的核苷酸序列，它包含attBl序列，用于擴增SS-DTP21-1蛋白編碼區(qū)。SEQ ID NO :68是SS-DTP21-1-3' attB反向引物的核苷酸序列，它包含attB2序列，用于擴增SS-DTP21-1蛋白編碼區(qū)。SEQ ID NO 69是attBl位點的核苷酸序列。SEQ ID NO 70是attB2位點的核苷酸序列。SEQ ID NO 71是pBC-yellow的核苷酸序列，pBC-yellow是用于擬南芥屬的目的載體。SEQ ID NO :72是SS-DTP21-2-5' attB正向引物的核苷酸序列，它包含attBl序列，用于擴增SS-DTP21-2蛋白編碼區(qū)。SEQ ID NO :73是SS-STP21-2-3' attB反向引物的核苷酸序列，它包含attB2序列，用于擴增SS-DTP21-2蛋白編碼區(qū)。SEQ ID NO :74 是 GENERACER 5'引物的核苷酸序列。SEQ ID NO :75是GENERACER 5'巢式引物的核苷酸序列。SEQ ID NO :76 是 GENERACER 3'引物的核苷酸序列。SEQ ID NO :77是GENERACER 3'巢式引物的核苷酸序列。SEQ ID N0:78是來自蘇丹草的核苷酸序列，其編碼與SS-DTP21-1同源的多肽SS-DTP2ト6。SEQ ID NO :79是由SEQ ID NO 78編碼的多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO :80是來自高梁(Gold sorgho)的核苷酸序列，其編碼與SS-DTP21-1同源的多肽SB-DTP21-5。SEQ ID NO 81是由SEQ ID NO 80編碼的多肽的氨基酸序列。SEQ ID N0:82是來自高梁(B35)的核苷酸序列，其編碼與SS-DTP21-1同源的多肽 SB-DTP21-6。SEQ ID NO 83是由SEQ ID NO 82編碼的多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO :84是來自高梁(hoki)的核苷酸序列，其編碼與SS-DTP21-1同源的多肽 SB-DTP21-9。SEQ ID NO 85是由SEQ ID NO 84編碼的多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO 86是來自高梁(hoki)的核苷酸序列，其編碼與SS-DTP21-1同源的多肽 SB-DTP21-10。SEQ ID NO 87是由SEQ ID NO 86編碼的多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO :88是用于擴增實施例20中的Sub8質(zhì)粒DNA區(qū)域的第一引物的核苷
酸序列。SEQ ID NO 89是用于擴增實施例20中的Sub8質(zhì)粒DNA區(qū)域的第二引物的核苷
酸序列。SEQ ID NO :90 是用于擴增實施例 20 中的 pSB31 (Ishida 等人，1996，NatureBiotechnology 14:745-750)質(zhì)粒DNA區(qū)域的第一引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 91是用于擴增實施例20中的pSB31質(zhì)粒DNA區(qū)域的第二引物的核苷
酸序列。 序列描述以及所附序列表遵循如37C. F. R. § I. 8211. 825所列出的關(guān)于專利申請中核苷酸和/或氨基酸序列公開的規(guī)定。此序列表中以單個字母表示核苷酸，以三字母表示氨基酸，如Nucleic AcidsRes. 13 :30213030(1985)和 Biochemical J.219(No. 2) :345373(1984)所描述的IUPACIUBMB標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定，它們引入本文以供參考。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號和格式遵循在37C. F. R. § I. 822中所列出的規(guī)定。發(fā)明詳沭本文中所列出的每篇參考文獻的公開內(nèi)容的全文以引用的方式并入本文。
本文以及所附權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式“一個”、“一種”和“所述”包括復(fù)數(shù)指代，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵義包括多株此類植物，“一個細胞”的涵義包括一個或多個細胞及本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的等同物等等。如本文所用“基因組片段IS125”指來自蘇丹草的基因組DNA片段Sugar Slim(蘇丹草)當(dāng)轉(zhuǎn)化時將耐旱表型遞送給Yukihikari品種稻?！癝S-DTP21-1多肽”指由基因組片段IS125編碼的209個氨基酸的多肽，它是耐旱候選蛋白?！盎蚪M片段127”指來自蘇丹草的基因組DNA片段Sugar Slim(蘇丹草)當(dāng)轉(zhuǎn)化時將耐旱表型遞送給Yukihikari品種稻?！癝S-DTP21-2多肽”指由基因組片段IS127編碼的209個氨基酸的多肽，它是一種與SS-DTP21-1高度同源的耐旱候選蛋白?！癝B-DTP21-1多肽”和“SB-DTP21-2多肽”指兩個由來自高梁(Gold sorgho)的基因組DNA編碼的多肽，它們每個與SS-DTP21-1多肽高度同源?！癝B-DTP21-3多肽”和“SB-DTP21-4多肽”指兩個由來自高梁(B35)的基因組DNA編碼的多肽，它們每個與SS-DTP21-1多肽高度同源?！癉TP21多肽”指具有與SS-DTP21-1同源的序列并且當(dāng)轉(zhuǎn)化時能夠在Yukihikari品種稻和/或其他植物種類或品種中遞送耐旱表型的蛋白。術(shù)語“DTP21多肽”和“DTP21蛋白”本文互換使用。多肽的“耐旱活性”指在轉(zhuǎn)基因植物中過表達所述多肽賦予轉(zhuǎn)基因植物相對于參照植物或?qū)φ罩参镌鰪姷哪秃敌?。術(shù)語“單子葉植物”和“單子葉的植物”本文互換使用。本發(fā)明的單子葉植物包括禾本科植物。術(shù)語“雙子葉植物”和“雙子葉的植物”本文互換使用。本發(fā)明的雙子葉植物包括以下家族十字花科植物、豆科植物和茄科植物。
術(shù)語“全長互補序列”和“全長的互補序列”本文互換使用，指給定核苷酸序列的互補序列，其中所述互補序列和核苷酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成并且是100%互補的。除非另外指明，“擬南芥屬”和“擬南芥”本文互換使用?！氨磉_序列標(biāo)簽”(“EST”)是得自cDNA文庫的DNA序列，并且因此是已經(jīng)被轉(zhuǎn)錄的序列。EST通常通過cDNA插入序列單程測序獲取。將完整的cDNA插入序列稱為“全長插入序列”(“FIS”)?！爸丿B群”序列是由選自，但不限于EST、FIS和PCR序列的兩個或更多個序列裝配成的序列。將編碼完整或功能性蛋白的序列稱為“完全基因序列”(“CGS”)，該序列能得自FIS或重疊群?！稗r(nóng)學(xué)特性”是可測量的參數(shù)，包括但不限干低溫脅迫下的綠度、產(chǎn)量、生長速率、生物量、成熟時的鮮重、成熟時的干重、果實產(chǎn)量、種子產(chǎn)量、總植物 含氮量、果實含氮量、種子含氮量、營養(yǎng)組織含氮量、總植物游離氨基酸含量、營養(yǎng)組織游離氨基酸含量、果實游離氨基酸含量、種子游離氨基酸含量、總植物蛋白質(zhì)含量、果實蛋白質(zhì)含量、種子蛋白質(zhì)含量、營養(yǎng)組織蛋白質(zhì)含量、耐旱性、氮攝取、根倒伏、收獲指數(shù)、莖倒伏、植株高度、穗高、穗長耐鹽性、早期幼苗活力和出苗“轉(zhuǎn)基因”指其基因組因異源核酸(如重組DNA構(gòu)建體)的存在而發(fā)生改變的任何細胞、細胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，包括那些最初的轉(zhuǎn)基因事件以及從最初的轉(zhuǎn)基因事件通過有性雜交或無性生殖而產(chǎn)生的那些。如本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”不涵蓋通過常規(guī)植物育種方法或通過諸如隨機異花受精、非重組病毒感染、非重組細菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或自發(fā)突變之類的自然發(fā)生事件導(dǎo)致的基因組(染色體基因組或染色體外基因組)改變。“基因組”在用于植物細胞時不僅涵蓋存在于細胞核中的染色體DNA，而且還包括存在于細胞的亞細胞組分(如線粒體、質(zhì)粒)中的細胞器DNA?！爸参铩卑ㄕ麄€植株、植物器官、植物組織、種子和植物細胞以及同一植株的子代。植物細胞包括但不限于得自下列物質(zhì)的細胞種子、懸浮培養(yǎng)物、胚、分生區(qū)域、愈傷組織、葉、根、芽、配子體、孢子體、花粉和小孢子?！白哟卑ㄖ参锏娜魏魏罄m(xù)世代?！稗D(zhuǎn)基因植物”包括在其基因組內(nèi)包含異源多核苷酸的植物。例如異源多核苷酸被穩(wěn)定地整合進基因組中，使得該多核苷酸傳遞至連續(xù)的世代。異源多核苷酸可単獨地或作為重組DNA構(gòu)建體的部分整合進基因組中。針對序列而言的“異源”意指來自外來物種的序列，或者如果來自相同物種，則指通過蓄意的人為干預(yù)而從其天然形式發(fā)生了組成和/或基因座的顯著改變的序列?！岸嗪塑账帷?、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互換使用并且是任選含有合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基的單鏈或雙鏈RNA或DNA聚合物。核苷酸(通常以它們的5'單磷酸形式存在)通過它們的單字母命名指代如下“A”指腺苷酸或脫氧腺苷酸(分別用于RNA或DNA)，“C”指胞苷酸或脫氧胞苷酸，“G”指鳥苷酸或脫氧鳥苷酸，“U”指尿苷酸，“T”指脫氧胸苷酸，“R”指嘌呤(A或G)，“Y”指嘧啶(C或T)，“K”指G或T，“H”指A或C或T，“ I ”指肌苷，“N”指任何核苷酸?！岸嚯摹?、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)類似物的氨基酸聚合物，以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。術(shù)語“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白質(zhì)”還可包括修飾，包括但不限于糖基化、脂質(zhì)連接、硫酸鹽化、谷氨酸殘基的Y羧化、羥化和ADP-核糖基化。“信使RNA(mRNA) ”指無內(nèi)含子并且可通過細胞翻譯成蛋白質(zhì)的RNA。“cDNA”指與mRNA模板互補并且利用逆轉(zhuǎn)錄酶從mRNA模板合成的DNA。cDNA可為單鏈的或者可用DNA聚合酶I的Klenow片段轉(zhuǎn)化成雙鏈形式?！俺墒臁钡鞍字附?jīng)翻譯后加工的多肽，即已經(jīng)去除了存在于初始翻譯產(chǎn)物中的任何前肽或肽原的多肽?！扒绑w”蛋白質(zhì)指mRNA的初級翻譯產(chǎn)物，即前肽和肽原仍然存在。前肽和原肽可為并且不限于細胞內(nèi)定位信號。
“分離的”指物質(zhì)，例如核酸和/或蛋白質(zhì)，該物質(zhì)基本上不含在天然存在的環(huán)境中通常伴隨該物質(zhì)或與其反應(yīng)的組分，或者說是該物質(zhì)被從所述組分移出。分離的多核苷酸可從它們天然存在于其中的宿主細胞純化。技術(shù)人員已知的常規(guī)核酸純化方法可用于獲得分離的多核苷酸。該術(shù)語也涵蓋重組多核苷酸和化學(xué)合成的多核苷酸?！爸亟M”指兩個分離的不同序列片段的人工組合，例如通過基因工程技術(shù)化學(xué)合成或通過操縱分離的核酸片段合成。“重組體”也包括細胞或載體，它們已經(jīng)通過導(dǎo)入異源核酸進行了修改，或者來源于進行如此修改的細胞，但是不涵蓋由自然發(fā)生事件(例如自發(fā)突變、自然轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)座)改變的細胞或載體，例如那些無蓄意的人為干預(yù)產(chǎn)生的細胞或載體?！爸亟MDNA構(gòu)建體”指在自然界中通常不會一起存在的核酸片段的組合。因此，重組DNA構(gòu)建體可包含源于不同來源的調(diào)控序列和編碼序列，或源于相同來源但以不同于通常天然存在的方式排列的調(diào)控序列和編碼序列。術(shù)語“入門克隆”和“入門載體”本文可互換使用?！罢{(diào)控序列”指位于編碼序列的上游(5'非編碼序列)、中間或下游(3'非編碼序列)，并且影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性或者翻譯的核苷酸序列。調(diào)控序列可包括但不限于啟動子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和多腺苷酸化識別序列。術(shù)語“調(diào)控序列”和“調(diào)控元件”在本文中可互換使用。“啟動子”指能夠控制另一核酸片段轉(zhuǎn)錄的核酸片段。“植物啟動子功能”是能夠控制植物細胞中的轉(zhuǎn)錄的啟動子，無論其是否來源于植物細胞?！敖M織特異性啟動子”和“組織優(yōu)選啟動子”可互換使用，并且指主要但非必須專一地在一種組織或器官中表達，而是也可在一種特定細胞中表達的啟動子?！鞍l(fā)育調(diào)控啟動子”指其活性由發(fā)育事件決定的啟動子。術(shù)語“可操作地連接”指核酸片段連接成單一片段，使得其中一個核酸片段的功能受到另一個核酸片段的調(diào)控。例如，在啟動子能夠調(diào)節(jié)核酸片段的轉(zhuǎn)錄時，該啟動子與該核酸片段進行了可操作地連接?！氨磉_”指功能產(chǎn)物的產(chǎn)生。因此，核酸片段的表達可指核酸片段的轉(zhuǎn)錄(如生成mRNA或功能RNA的轉(zhuǎn)錄)和/或RNA翻譯成前體或成熟蛋白質(zhì)?！氨硇汀币庵讣毎蛏矬w的可檢測的特征。
有關(guān)將核酸片段(例如重組DNA構(gòu)建體)插入細胞內(nèi)的“導(dǎo)入”意指“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”，并且包括指將核酸片段整合進真核或原核細胞中，在該細胞中核酸片段可整合進細胞的基因組(如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)內(nèi)，轉(zhuǎn)變成自主的復(fù)制子或瞬時表達(如轉(zhuǎn)染的mRNA)?！稗D(zhuǎn)化細胞”是將核酸片段(如重組DNA構(gòu)建體)導(dǎo)入其中的任何細胞。在此所用的“轉(zhuǎn)化”指穩(wěn)定轉(zhuǎn)化和瞬時轉(zhuǎn)化兩者?！胺€(wěn)定轉(zhuǎn)化”指將核酸片段導(dǎo)入宿主生物體的基因組中，導(dǎo)致基因穩(wěn)定遺傳。一旦穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，核酸片段穩(wěn)定地整合進宿主生物體和任何連續(xù)世代的基因組中。“瞬時轉(zhuǎn)化”指將核酸片段導(dǎo)入宿主生物體的核中或包含DNA的細胞器中，引起基因表達而沒有基因穩(wěn)定遺傳。 “等位基因”是占據(jù)染色體上給定位點的基因的幾種供選擇替代形式的其中ー種。當(dāng)二倍體植物中ー對同源染色體上給定基因座上存在的等位基因相同時，該植物在該基因座處是純合的。如果二倍體植物中ー對同源染色體上給定基因座上存在的等位基因不同，則該植物在該基因座處是雜合的。如果轉(zhuǎn)基因存在于二倍體植物中ー對同源染色體中的其中之一上，則該植物在該基因座處是半合子的?！叭~綠體轉(zhuǎn)運肽”是與蛋白質(zhì)共同被翻譯，并將該蛋白質(zhì)導(dǎo)向葉綠體或?qū)蛟摰鞍踪|(zhì)在其中被生成的細胞中的其他質(zhì)體類型的氨基酸序列?！叭~綠體轉(zhuǎn)運序列”是指編碼葉綠體轉(zhuǎn)運肽的核苷酸序列?！靶盘栯摹笔签`種與蛋白質(zhì)共同被翻譯并將蛋白導(dǎo)向分泌系統(tǒng)的氨基酸序列(Chrispeels (1991) Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 42 :2153)。如果將所述蛋白導(dǎo)向液泡，可另外加上液泡靶向信號(同上)，或者如果將所述蛋白導(dǎo)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，可加上內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留信號(同上)。如果將蛋白導(dǎo)向細胞核，將移除任何存在的信號肽并用以核定位信號替代(Raikhel (1992) Plant Phys. 100 :16271632)?！熬€粒體信號肽”是指導(dǎo)前體蛋白質(zhì)導(dǎo)進入線粒體中的氨基酸序列(Zhang和Glaser (2002) Trends Plant Sci 7 :14-21)。兩個氨基酸序列或核酸序列間的百分比同一性可通過目測和數(shù)學(xué)計算來測定。作為另外一種選擇，序列比對和同一性百分比可用設(shè)計用于檢測同源序列的多種比較方法來測定，這些方法包括但不限于LASERGENE 生物信息計算包(DNASTAR Inc.(Madison, WI))的MEGALIGN 程序。除非另外說明，本文提供的序列的多重比對用ClustalV比對方法(Higgins和Sharp (1989) CABI0S. 5 :151 153)進行序列的多重比對，默認參數(shù)(GAP PENALTY = 10,GAP LENGTH PENALTY = 10)。用 Clustal V 方法進行逐對比對和蛋白質(zhì)序列的百分比同一性計算的默認參數(shù)為KTUPLE = UGAP PENALTY = 3,WINDOW = 5以及DIAGONALSSAVED = 5。對于核酸，這些參數(shù)為 KTUPLE = 2，GAP PENALTY = 5，WINDOW = 4以及DIAGONALS SAVED = 4。在序列比對后，使用Clustal V程序，通過參閱相同程序上的“序列距離”表可能獲得“百分比同一性”和“趨異度”值；除非另外說明，本文提供的和申明的同一性百分比和趨異度是以該方式計算。作為另外一種選擇，兩個蛋白序列的百分比同一性可通過比較序列信息來測定，該比較基于 Needleman，S. B.和 Wunsch，C. D. (J. Mol. Biol. , 48 =443-453,1970)的算法并使用購自 University of Wisconsin Genetics Computer Group (UffGCG)的 GAP 計算機程序。GAP程序的優(yōu)選默認參數(shù)包括(I)計分矩陣，blosum62,如Henikoff, S.和Henikoff,J.G. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA，89 :10915-10919，1992)所述；(2)空位權(quán)重為 12 ； (3)空位長度權(quán)重為4 ;以及(4)末端空位無罰分。也可使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員所用的其他序列比較程序。可通過比較序列信息測定百分比同一性，所述比較使用例如如Altschul等人(NucI. Acids. Res. , 25, % 3389-3402頁，1997)所述的BLAST程序。這個程序在因特網(wǎng)上的National Center for BiotechnologyInformation (NCBI)或 DNA Data Bank of Japan (DDBJ)網(wǎng)站上獲得。使用 BLAST 程序進行同一性搜索的多個條件(參數(shù))的詳細情況在這些網(wǎng)站上示出，并且常使用默認值搜索，然而可酌情改變部分設(shè)置。作為另外一種選擇，兩個氨基酸序列的百分比同一性可使用程序如遺傳學(xué)信息處理軟件GENETYX Ver. 7 (Genetyx Corporation, Japan)或使用算法如FASTA進行測定。在這種情況下，可使用默認值進行搜索。兩個核酸序列之間的百分比同一性可通過目測和數(shù)學(xué)計算進行測定，或者更優(yōu)選地，通過使用計算機程序比較序列信息完成比較。一個示例性的優(yōu)選程序是Genetic Computer Group (GCG ；Madison, WI)WISCONSIN PACKAGE 程序，版本 10. 0，“GAP” (Devereux 等人，1984, NucI. Acids Res.，12 :387)。除了 比較兩個核酸序列之外，這個“GAP”程序可用于比較兩個氨基酸序列以及比較一個核酸序列和一個氨基酸序列。 “GAP”的優(yōu)選默認參數(shù)包括(l)GCG 應(yīng)用一元比較矩陣(包含用于同一性的值I和用于非同一11"生的值0)用于核苷酸,并且應(yīng)用加權(quán)氨基酸比較矩陣(Gribskov和Burgess,Nucl.Acids Res. , 14 :6745,1986,如 Schwartz 和 Dayhoff (編輯)所述,“Atlas of PolypeptideSequence and Structure,，，National Biomedical Research Foundation,第 353-358 頁，1979)，或其他可比較的比較矩陣；(2)氨基酸序列的每個空位的罰分為30，并且在每個空位中的每個符號附加罰分為1，或者核苷酸序列的每個空位的罰分為50，并且在每個空位中的每個符號附加罰分為3 ;(3)末端空位無罰分；以及(4)長空位無最大罰分。也可使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用的其他序列比較程序例如獲取自National Library of Medicine網(wǎng)站的 BLASTN 程序 2. 2. 7 版，或者 WU-BLAST 2. O 算法(Advanced Biocomputing, LLC)。此外，BLAST算法使用BL0SUM62氨基酸計分矩陣，并且可使用的任選參數(shù)如下(A)包含過濾器以遮蔽具有組成低復(fù)雜性的查詢序列片段(通過Wootton和Federhen的SEG程序(Computers and Chemistry, 1993)測定；也參見Wootton和Federhen, 1996,“Analysis ofcompositionalIy biased regions in sequence databases,，，Methods EnzymoI. , 266 554-71)或由短周期內(nèi)部重復(fù)序列(通過Claverie和States的XNU程序(Computers andChemistry, 1993)進行測定)，以及(B)用于報告與數(shù)據(jù)庫序列匹配的統(tǒng)計學(xué)顯著性閾值，或E-score (根據(jù)Karlin和Altschul的隨機模型,僅偶然發(fā)現(xiàn)匹配的預(yù)期概率，1990 ;如果某一匹配的統(tǒng)計學(xué)顯著性大于這一 E-score閾值,將不報告該匹配);優(yōu)選的E_score閾值是 O. 5，或者按照優(yōu)先度遞增的順序0. 25,0. 1,0. 05,0. 01,0. 001,0. 0001、le_5、le_10、le-15、le-20、le-25、le-30、le-40、le-50、le_75 或 le-100。本文使用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的并且在如下文獻中有更全面的描述Sambrook, J. , Fritsch, E. F.和 Maniatis, T. Molecular Cloning A Laboratory Manual ；Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor,1989(下文稱為 “Sambrook”)?，F(xiàn)在來看實施方案實施方案包括分離的多核苷酸和多肽、用于提供耐旱性的重組DNA構(gòu)建體、包含這些重組DNA構(gòu)建體的組合物(例如植物或種子)，以及利用這些重組DNA構(gòu)建體的方法。分離的多核苷酸和多肽:本發(fā)明包括下列分離的多核苷酸和多肽分離的多核苷酸包含(i)編碼多肽的核酸序列，基于Clustal V比對方法，所述多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85或87進行比較時具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性；或(ii) (i)的核酸序列的全長互補序列，其中(i)的核酸序列的全長互補序列由相同數(shù)目的核苷酸組成并且是100%互補的。任一上述分離的多核苷酸可用于本發(fā)明的任何重組DNA構(gòu)建體。所述多肽優(yōu)選地為DTP21多肽。
分離的多肽，基于Clustal V比對方法，所述多肽具有的氨基酸序列在與SEQ IDNO :27、32、46、56、60、64、81、83、85 或 87 進行比較時具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%,56%,57%,58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或100%的序列同一性。所述多肽優(yōu)選地為DTP21多肽。分離的多肽，其中所述氨基酸序列通過選自刪除、取代、添加和插入的至少ー種方法改變ー個或多個氨基酸而衍生自SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85或87 ;和(c)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85或87。所述多肽優(yōu)選地為DTP21多肽。分離的多核苷酸，所述多核苷酸包括(i)核酸序列，基于Clustal V比對方法，所述核酸序列在與SEQ ID N0:26、31、44、55、59、63、80、82、84或86進行比較時具有至少50%,51 %,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性；或(ii)⑴的核酸序列的全長互補序列。任一上述分離的多核苷酸可用于本發(fā)明的任何重組DNA構(gòu)建體。分離的多核苷酸優(yōu)選地編碼DTP21多肽。分離的多核苷酸包含編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能夠在嚴格條件下與包含SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的全長互補序列的DNA分子雜交；分離的多核苷酸包含編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列通過選自刪除、取代、添加和插入的至少ー種方法改變ー個或多個核苷酸而衍生自SEQID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84 或 86。重組DNA構(gòu)津體:在ー個方面，本發(fā)明包括重組DNA構(gòu)建體。在一個實施方案中，重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少ー種調(diào)控序列(如在植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括(i)核酸序列，基于ClustalV比對方法，所述核酸序列編碼的氨基酸序列在與SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85 或 87 進行比較時具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%的序列同一性；或(ii)(i)核酸序列的全長互補序列。在另一個實施方案中，重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接到至少一種調(diào)控序列(如在植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括(i)核酸序列，基于Clustal V 比對方法，所述核酸序列在與 SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84 或 86 進行比較時具有至少 50%,51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,9192%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100%序列同一性；或(ii) (i)的核酸序列的全長互補序列。在另一個實施方案中，重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列(如在植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼DTP21多肽。DTP21多肽可來自擬南芥、玉米、大豆、煙豆、野大豆和短絨野大豆。應(yīng)當(dāng)理解(正如本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解的)，本發(fā)明不僅僅涵蓋這些具體的示例性序列。導(dǎo)致給定位點處產(chǎn)生化學(xué)上等價的氨基酸但不影響所編碼多肽的功能特性的核酸片段中的改變是本領(lǐng)域眾所周知的。因此，氨基酸丙氨酸(一種疏水性氨基酸)的密碼子可被編碼另一個疏水性較弱的殘基(例如甘氨酸)或疏水性較強的殘基(例如纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸)的密碼子取代。類似地，導(dǎo)致一個帶負電荷的殘基替換為另一個帶負電荷的殘基(例如，天冬氨酸替換谷氨酸)或者一個帶正電荷的殘基替換為另一個帶正電荷的殘基(例如，賴氨酸替換精氨酸)的改變也可預(yù)期產(chǎn)生功能上等價的產(chǎn)物。導(dǎo)致多肽分子的氮末端和碳末端部分改變的核苷酸變化也將預(yù)計不會改變多肽的活性。所提出的修飾中的每一種均完全在本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)內(nèi)，如測定編碼產(chǎn)物生物活性的保留情況。本發(fā)明的蛋白也可為包含在其中包括刪除、取代、插入和/或添加一個或多個氨基酸的氨基酸序列，所述氨基酸序列選自SEQ ID NO :27、32、41、42、45、46、52、54、56、58、
60、62、64和66。所述取代可為保守取代，它指某個氨基酸殘基用另一個具有相似物理和化學(xué)特性的殘基取代。保守取代的非限制性實例包括在包含脂族基團的氨基酸殘基如He、Val>Leu或Ala之間的取代，以及在極性殘基如Lys_Arg、Glu_Asp或Gln-Asn之間的取代。當(dāng)編碼它們的野生型蛋白的DNA經(jīng)受例如熟知的定點誘變時，可制備通過氨基酸刪除、取代、插入和/或添加獲得的蛋白質(zhì)(參見例如Nucleic Acid Research, Vol. 10,No. 20，第6487-6500頁，1982，其據(jù)此全文以引用方式并入)。如本文所用，術(shù)語“一個或多個氨基酸”旨在表示可通過定點誘變刪除、取代、插入和/或添加可能數(shù)目的氨基酸。可如下使用例如與將發(fā)生突變的單鏈?zhǔn)删wDNA互補、不同的是具有特定錯配(即，期望的突變)的合成寡核苷酸引物完成定點誘變。即，上述合成寡核苷酸用作引發(fā)噬菌體互補鏈合成的引物，并且然后所得雙工DNA用于轉(zhuǎn)化宿主細胞。將轉(zhuǎn)化的細菌培養(yǎng)物、置于瓊脂上，從而從包含噬菌體的單細胞形成菌斑。因此，理論上50%的新菌落包含具有突變的單鏈?zhǔn)删w，而剩余的50%具有初始序列。在允許與具有上述期望突變的DNA完全相同的DNA雜交、但是不與具有初始鏈的DNA雜交的溫度下，允許所得噬菌體與通過激酶處理標(biāo)記的合成探針雜交。隨后，挑取與探針雜交的菌斑并進行培養(yǎng)以收集它們的DNA。允許在生物活性肽如酶中刪除、取代、插入和/或添加一個或多個氨基酸，同時保留它們的活性的技術(shù)包括上文提到的定點誘變和其他技術(shù)如用誘變劑處理基因的那些，以及其中選擇性中斷基因以移除、取代、插入或添加選擇的一個或多個核苷酸、然后連接的那些。本發(fā)明的蛋白也可為由核酸編碼的蛋白，所述核酸包含的核苷酸序列在其中刪除、取代、插入和/或添加一個或多個氨基酸，所述核苷酸序列選自SEQ ID NO :26,31,39,40、43、44、51、53、55、57、59、60、63和65。核苷酸的刪除、取代、插入和/或添加可通過定點誘變或其他上文提到技術(shù)完成。 本發(fā)明的蛋白也可為由核酸編碼的蛋白，所述核酸包含的核苷酸序列能夠在嚴格條件下與選自 SEQ ID NO :26、31、39、40、43、44、51、53、55、57、59、60、63 和 65 的核苷酸序列的互補鏈雜交。術(shù)語“在嚴格條件下”指兩個序列在中或高嚴格條件下雜交。更具體地講，中嚴格可由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通過例如根據(jù)DNA長度來容易地測定?；緱l件如SambiOOk等人，Molecular Cloning A Laboratory Manual,第三版,第 6 章和第 7 章，Cold SpringHarbor Laboratory Press, 2001所示，并且包括使用硝化纖維濾膜的預(yù)洗漆溶液5 X SSC,O. 5 % SDS, I. OmM EDTA(pH8. 0)，雜交條件為約 50 % 的甲酰胺，2X SSC 至 6X SSC,在約40-50°C下進行(或其他類似的雜交溶液，例如Stark溶液，在約50%的甲酰胺中，在約42°C下進行)并且洗滌條件為例如約40-60°C，0. 5-6XSSC,0. 1% SDS0優(yōu)選地，中嚴格條件包括在約50°C和6XSSC條件下雜交(并洗滌)。高嚴格條件也可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過例如根據(jù)DNA長度來容易地測定。一般來講，此類條件包括在比中嚴格條件更高的溫度和/或更低的鹽濃度下雜交和/或洗滌(例如在約65 °C，6 X SSC至0. 2 X SSC,優(yōu)選地6 X SSC,更優(yōu)選地2 X SSC,最優(yōu)選地0. 2X SSC條件下雜交)。例如，高嚴格條件可包括如上所述雜交并在大約65-68°C，0. 2 X SSC, 0. 1% SDS條件下洗滌。在雜交和洗滌緩沖液中可以用SSC(1XSSC為0. 15MNaCl 和 15mM 檸檬酸鈉)取代 SSPE (I X SSPE 為 0. 15M NaCl，IOmM NaH2P04 和 I. 25mM EDTA,pH7. 4);在完成雜交后洗滌15分鐘。使用可商購獲得的雜交試劑盒也是可能的，所述試劑盒無放射性的底物作為探針。特異性的樣品包括與ECL直接標(biāo)記&檢測系統(tǒng)(Amersham)雜交。嚴格條件包括例如使用所述試劑盒包括的雜交緩沖液在42°C雜交4小時，所述緩沖液補充有5% (w/v)封閉液和0. 5M NaCl，并在0. 4% SDS，0. 5XSSC中，在55°C下洗滌兩次，每次20分鐘，然后在2XSSC中，在室溫下洗滌一次，時間5分鐘。本發(fā)明的蛋白優(yōu)選地為具有耐旱活性的蛋白?！耙种艱NA構(gòu)建體”是在轉(zhuǎn)化或穩(wěn)定整合進植物基因組時，導(dǎo)致該植物中的靶基因“沉默”的重組DNA構(gòu)建體。對該植物來說，該靶基因可以是內(nèi)源性的或是轉(zhuǎn)基因的。如本文針對靶基因所使用的，“沉默”通常指在由靶基因表達的mRNA或蛋白質(zhì)/酶的水平上的抑制，和/或在酶活性或蛋白質(zhì)功能性的水平上的抑制。本文中可交換使用的術(shù)語“抑制”、“抑制性”以及“沉默”包括降低、減少、減退、減小、抑制、消除或防止。“沉默”或“基因沉默”不確定機理并且包括但不限于反義、共抑制、病毒-抑制、發(fā)夾抑制、莖-環(huán)抑制、基于RNAi的方法以及基于小RNAi的方法。抑制DNA構(gòu)建體可包含源自所關(guān)注的靶基因的區(qū)域并且可包含所關(guān)注的靶基因的有義鏈(或反義鏈)的核酸序列的全部或部分。取決于所要采用的方法，該區(qū)域可與受關(guān)注基因的有義鏈(或反義鏈)的全部或部分100%相同或者具有少于100%的同一性(如，具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,9192%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性)。抑制DNA構(gòu)建體是本領(lǐng)域所熟知的，一旦選定所關(guān)注的靶基因就很容易構(gòu)建，并且包括但不限于共抑制構(gòu)建體、反義構(gòu)建體、病毒抑制構(gòu)建體、發(fā)夾抑制構(gòu)建體、莖環(huán)抑制構(gòu)建體、產(chǎn)生雙鏈RNA的構(gòu)建體，以及更通常的是，RNAi (RNA干擾)構(gòu)建體和小RNA構(gòu)建體，·例如siRNA (短干擾RNA)構(gòu)建體和miRNA (微RNA)構(gòu)建體。“反義抑制”指產(chǎn)生能夠抑制靶基因或基因產(chǎn)物表達的反義RNA轉(zhuǎn)錄物?！胺戳xRNA ”指與靶初級轉(zhuǎn)錄物或mRNA的全部或部分互補，并阻斷分離的靶核酸片段表達的RNA轉(zhuǎn)錄物(美國專利5，107,065)。反義RNA可與特定基因轉(zhuǎn)錄物的任何部分，即5'非編碼序列、3'非編碼序列、內(nèi)含子或編碼序列互補?！肮惨种啤敝府a(chǎn)生能夠抑制靶基因或基因產(chǎn)物表達的有義RNA轉(zhuǎn)錄物?！坝辛x”RNA指包括mRNA并且可在細胞內(nèi)或體外翻譯成蛋白質(zhì)的RNA轉(zhuǎn)錄物。此前，已通過著眼于以有義方向過表達與內(nèi)源mRNA具有同源性的核酸序列(其導(dǎo)致與過表達的序列具有同源性的所有RNA減少)設(shè)計出了植物中的共抑制構(gòu)建體(參見Vaucheret等人，Plant J. 16 651-659(1998);和 Gura，Nature 404:804-808(2000))。另一種變型描述了將植物病毒序列用于引導(dǎo)對近端mRNA編碼序列的抑制(于1998年8月20日公開的PCT公開WO 98/36083)。調(diào)控序列:本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體可包含至少一種調(diào)控序列。調(diào)控序列可為啟動子。多種啟動子可用于本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體中?？筛鶕?jù)所需結(jié)果來選擇啟動子，并且可包括用于在宿主生物體中表達的組成型啟動子、組織特異性啟動子、誘導(dǎo)型啟動子或其他啟動子。在多數(shù)情況下引起基因在大多數(shù)細胞型中表達的啟動子通常稱為“組成型啟動子”。雖然候選基因當(dāng)通過組成型啟動子驅(qū)動表達時可預(yù)測其效應(yīng)，但候選基因在35S或UBI啟動子控制下的高水平、組成型表達可具有多重效應(yīng)。使用組織特異和/或脅迫特異啟動子可消除不需要的效應(yīng)但保留耐旱性的能力。在擬南芥屬中已經(jīng)觀察到了該效應(yīng)(Kasuga 等人(1999) Nature Biotechnol. 17 :287-91)。適用于植物宿主細胞的組成型啟動子包括(例如)Rsyn7啟動子的核心啟動子和在TO 99/43838和美國專利6，072, 050中公開的其他組成型啟動子；CaMV 35S核心啟動子(Odell 等人,Nature 313 :810-812 (1985));稻肌動蛋白(McElroy 等人，Plant Cell
2:163-171(1990))；泛素(Christensen 等人，Plant Mol. Biol. 12 :619-632(1989)和Christensen 等人，Plant Mol. Biol. 18 :675-689(1992)) ；pEMU (Last 等人，Theor· AppI.Genet. 81 :581-588(1991)) ;MAS (Velten 等人，EMBO J. 3 :2723-2730 (1984)) ;ALS 啟動子(美國專利5，659，026)等。其他組成型啟動子包括例如在美國專利5，608，149,5,608, 144、5，604，121,5, 569，597,5, 466，785,5, 399，680,5, 268，463,5, 608，142 和 6，177，611 中公開的那些啟動子。在選擇啟動子用于本發(fā)明方法時，可能有利的是使用組織特異性啟動子或發(fā)育調(diào)控啟動子。組織特異性啟動子或發(fā)育調(diào)節(jié)啟動子是這樣的DNA序列該序列調(diào)節(jié)DNA序列選擇性地在對雄穗發(fā)育、結(jié)籽或兩者重要的植物細胞/組織中表達，并限制這種DNA序列只在植物的雄穗發(fā)育或種子成熟期間表達。任何引起所需時空表達的可鑒定啟動子均可用于本 發(fā)明的方法中?？捎糜诒景l(fā)明的種子或胚芽特異性啟動子包括大豆Kunitz胰蛋白酶抑制劑啟動子(Kti3, Jofuku 和 Goldberg，Plant Cell I : 1079-1093 (1989))、馬鈴薯塊莖特異蛋白啟云カ子(patatin 啟動子)(馬鈴薯塊莖)(Rocha-Sosa，Μ.等人，(1989)EMBO J. 8 :23-29)、convicilin啟動子、豌豆球蛋白啟動子和豆球蛋白啟動子(豌豆子葉)(Rerie, W. G.等人，(1991)Mol. Gen. Genet. 259 :149-157 ；Newbigin, E. J.等人，(1990)Planta 180 :461-470 ；Higgins, T. J. V.等人，(1988)Plant. Mol. Biol. 11 :683-695)、玉米蛋白啟動子(玉米胚乳)(Schemthaner，J. P.等人，(1988) EMBO J. 7 :1249-1255)、菜豆蛋白啟動子(菜豆子葉)(Segupta-Gopalan, C.等人，(1985)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82 :3320-3324)、植物血球凝集素啟動子(菜豆子葉)(Voelker，T.等人，(1987) EMBO J. 6 :3571-3577)、B-伴球蛋白啟動子和大豆球蛋白啟動子(大豆子葉)(Chen, Z-L等人，(1988)EMBO J. 7 =297-302)、谷蛋白啟動子(大米胚乳)、大麥醇溶蛋白啟動子(大麥胚乳)(Marris, C.等人，(1988)Plant Mol. Biol. 10 :359-366)、麥谷蛋白啟動子和麥醇溶蛋白啟動子(小麥胚乳)(Colot，V.等人，(1987) EMBO J. 6 =3559-3564)和甘薯貯藏蛋白啟動子(甘薯塊根)(Hattori，T.等人，(1990)Plant Mol. Biol. 14 :595-604)?？刹僮鞯剡B接至嵌合基因構(gòu)建體異源編碼區(qū)的種子特異性基因的啟動子在轉(zhuǎn)基因植物中保持它們的時空表達模式。這樣的實施例包括在擬南芥和甘藍型油菜種子中表達腦啡肽的擬南芥屬2S種子儲藏蛋白基因啟動子(Vanderkerckhove 等人，Bio/Technology 7 :L929_932 (1989))、表達突光素酶的菜 凝集素和菜豆蛋白啟動子(Riggs等人，Plant Sci. 63 :47-57 (1989))，以及表達氯霉素こ酰轉(zhuǎn)移酶的小麥谷蛋白啟動子(Colot等人，EMBO J6 :3559-3564(1987))?？烧T導(dǎo)啟動子響應(yīng)內(nèi)源性或外源性刺激的存在，例如，通過化合物(化學(xué)誘導(dǎo)劑)，或響應(yīng)環(huán)境、激素、化學(xué)信號和/或發(fā)育信號而選擇性表達可操作地連接的DNA序列?？烧T導(dǎo)的或受調(diào)控的啟動子包括(例如)受光、熱、脅迫、水澇或干旱、植物激素、創(chuàng)傷或諸如こ醇、茉莉酮酸酯、水楊酸或安全劑之類的化學(xué)品調(diào)控的啟動子。本發(fā)明使用的啟動子包括以下啟動子1)脅迫誘導(dǎo)型RD29A啟動子(Kasuga等人，(1999) Nature Biotechnol. 17 :287-91) ；2)大麥啟動子B22E ;B22E的表達是發(fā)育中的玉米桿粒中的柄所特異性的(“Primary Structure of a Novel Barley Gene DifferentiallyExpressed in Immature Aleurone Layers (在未成熟糊粉層中差異表達的新大麥基因的一級結(jié)構(gòu))”，Klemsdal，S. S.等人，Mol. Gen. Genet. 228(1/2) :9-16(1991));以及 3)玉米啟動子 Zag2 ( “ Identification and molecular characterization ofZAGl, themaize homo log of the Arabidopsis floral homeotic gene AGAMOUS (ZAG1-擬南芥花同源異形基因AGAMOUS的玉米同系物的鑒定和分子表征)”，Schmidt, R. J.等人，PlantCell 5(7) :729-737(1993) /‘Structural characterization,chromosomal localizationand phylogenetic evaluation of two pairs of AGAMOUS-Iike MADS-box genes frommaize (兩對來自玉米的AGAMOUS樣MADS-box基因的結(jié)構(gòu)表征、染色體定位及系統(tǒng)發(fā)育評價)，，，Theissen 等人，Gene 156(2) :155-166(1995) ；NCBI GenBank 登錄號 X80206))。Zag2轉(zhuǎn)錄物可在授粉前5天至授粉后(DAP)7天至8天被檢測到，并且引導(dǎo)Ciml在發(fā)育中的雌花序的心皮中表達，Ciml對發(fā)育中的玉米籽粒的籽仁而言是特異性的。Ciml轉(zhuǎn)錄物在授粉前4天至5天至授粉后6至8天被檢測到。其他可用的啟動子包括可源自其表達與發(fā)育中的雌小花母系相關(guān)的基因的任何啟動子。用于調(diào)控本發(fā)明的核苷酸序列在植物中表達的啟動子是莖特異性啟動子。這種莖特異性啟動子包括苜蓿S2A啟動子(GenBank登錄號ER)30816 ；Abrahams等人，PlantMol. Biol. 27 :513-528(1995))和 S2B 啟動子(GenBank 登錄號EF030817)等等，將這些文獻以引用的方式并入本文。啟動子可整體源于天然基因，或者由源于天然存在的不同啟動子的不同元件構(gòu)成，或者甚至可包含合成的DNA片段。用于本發(fā)明的啟動子可包括RIP2、mLIP15、ZmCORl、Rabl7、CaMV35S、RD29A、B22E、Zag2、SAM合成酶啟動子、泛素啟動子、CaMV 19S、nos、Adh、蔗糖合成酶啟動子、R-等位基因啟動子、維管組織優(yōu)選的啟動子S2A(Genbank登陸號ER)30816)和S2B(Genbank登錄號EF030817)及來自玉米的組成型啟動子G0S2。其他啟動子包括根優(yōu)選的啟動子，例如玉米NAS2啟動子、玉米Cyclo啟動子(US2006/0156439，公開于2006年7月13日)、玉米R00TMET2 啟動子(W005063998,公開于 2005 年 7 月 14 日)、CR1BI0 啟動子(W006055487,公開于 2006 年 5 月 26 日)、CRWAQ81 (W005035770,公開于 2005 年 4 月 21 日)和玉米 ZRP2. 47啟動子(NCBI 保藏號U38790 ；GI No. 1063664)，本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體也可包括其他調(diào)控序列，包括但不限于翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和多腺苷酸化識別序列。在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體還包括增強子或沉默子。內(nèi)含子序列可加至5'非翻譯區(qū)、蛋白編碼區(qū)或3'非翻譯區(qū)以增加積聚在胞漿中的成熟信息的量。已經(jīng)顯示，在植物和動物兩者的表達構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄單位中包含可剪接內(nèi)含子可使基因表達在mRNA和蛋白質(zhì)水平上均增強高達1000倍。參見Buchman和Berg，Mol. Cell Biol. 8 :4395-4405(1988) ;Callis 等人，Genes Dev. I :1183-1200 (1987)。任何植物都可以選擇用來鑒定將用于本發(fā)明重組DNA構(gòu)建體的調(diào)控序列和DTP21多肽基因。適用于分離基因和調(diào)控序列的靶植物的實例應(yīng)該包括但不限于苜蓿、蘋果、杏、擬南芥屬、洋薊、芝麻菜、蘆筍、鱷梨、香蕉、大麥、豆類、甜菜、黑莓、藍莓、西蘭花、抱子甘藍、卷心菜、卡諾拉、香瓜、胡蘿卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、櫻桃、菊苣、芫荽、柑桔類、克萊門氏小柑橘類、三葉草、椰子、咖啡、玉米、棉、蔓越莓、黃瓜、花旗松、茄子、菊苣、茅菜、桉樹、茴香、無花果、大蒜、葫蘆、葡萄、柚子樹、白蘭瓜、豆薯、獼猴桃、生菜、韭蔥、檸檬、酸橙、火炬松、亞麻子、芒果、甜瓜、蘑菇、油桃、堅果、燕麥、油棕、油菜、秋葵、橄欖樹、洋蔥、橙、觀賞植物、棕櫚、木瓜樹、歐芹、歐洲防風(fēng)草、豌豆、桃樹、花生、梨樹、胡椒、柿樹、松樹、菠蘿、大蕉、李樹、石榴樹、白楊、馬鈴薯、南瓜、溫柏、輻射松、紅菊苣、蘿卜、油菜、樹莓、稻、黒麥、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、楓香樹、柑橘、茶、煙草、蕃茄、黑小麥、草皮草、蕪菁、葡萄樹、西瓜、小麥、薯蕷和西葫蘆。 鉬合物 本發(fā)明的組合物是其基因組中包含本發(fā)明的任何 重組DNA構(gòu)建體(例如上面所討論的任何一種構(gòu)建體)的植物。組合物也包括任何植物的子代，以及獲取自植物或其子代的任何種子，其中所述子代或種子在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體。子代包括通過植物的自花授粉或異型雜交而獲得的連續(xù)世代。子代也包括雜交種和近交系。在雜交種子繁殖的農(nóng)作物中，成熟的轉(zhuǎn)基因植物可自花授粉而產(chǎn)生純合的自交系植物。該近交系植物產(chǎn)生含有新導(dǎo)入的重組DNA構(gòu)建體的種子。這些種子可生長而產(chǎn)生將會表現(xiàn)出改變的農(nóng)學(xué)特性(例如，任選地在水限制條件下農(nóng)學(xué)特性増加)的植物，或者可用于育種程序以產(chǎn)生雜交種子，這些雜交種子可生長而產(chǎn)生將會表現(xiàn)出如改變的農(nóng)學(xué)特性的植物。所述種子可為玉米種子。植物可為單子葉植物或雙子葉植物，例如玉米、稻或大豆植物，如玉米雜種植物或玉米自交系植物。所述植物也可為向日葵、高粱、卡諾拉、小麥、苜蓿、棉花、大麥、粟、甘蔗、柳枝稷、煙草、馬鈴薯和甜菜。重組DNA構(gòu)建體可穩(wěn)定地整合進植物的基因組中。具體實施方案包括但不限于下列的I.在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物(例如玉米、稻或大豆植物)，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少ー種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，基于Clustal V比對方法，所述多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID NO :27、32、46、56、
60、64、81、83、85 或 87 進行比較時具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性，并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出增強的耐旱性。所述植物與所述對照植物進行比較時還可表現(xiàn)出至少ー種農(nóng)學(xué)特性的改變。2.在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物(例如玉米、稻或大豆植物)，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少ー種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼DTP21多肽序列，并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出增強的耐旱性。所述植物在與所述對照植物進行比較時還可表現(xiàn)出至少ー種農(nóng)學(xué)特性的改變。3.在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物(在例如玉米、稻或大豆植物)，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少ー種調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼DTP21多肽序列，并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。4.其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物(例如玉米、稻或大豆植物)，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，基于Clustal V比對方法，所述多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID NO :27、32、46、56、
60、64、81、83、85 或 87 進行比較時具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性，并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。5.在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物(例如玉米、稻或大豆植物)，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含編碼 具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列(a)能夠在嚴格條件下與包含SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84 或 86 的全長互補序列的 DNA 分子雜交；或(b)通過選自刪除、取代、添加和插入的至少一種方法改變一個或多個核苷酸而衍生自SEQ IDNO :26、31、44、55、59、63、80、82、84或86 ;并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。6.在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物(例如玉米、稻或大豆植物)，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列(a)能夠在嚴格條件下與包含SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84 或 86 的全長互補序列的 DNA 分子雜交；或(b)通過選自刪除、取代、添加和插入的至少一種方法改變一個或多個核苷酸而衍生自SEQ IDNO :26、31、44、55、59、63、80、82、84或86 ;并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。7.在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物(例如玉米、稻或大豆植物)，所述重組DNA構(gòu)建體包含多核苷酸其中所述多核苷酸包含至少一種核苷酸序列，所述核苷酸序列選自(a)基因組片段IS125 ； (b)基因組片段IS125的Sub2 ； (c)基因組片段IS125的Sub3 ；
(d)基因組片段IS125的Sub5 ； (e)基因組片段IS125的Sub7 ； (f)基因組片段IS125的Sub8 ;和(g)基因組片段IS127。8.上述實施方案1-7中的植物的任何子代、上述實施方案1-7中的植物的任何種子、上述實施方案1-7中的植物的子代的任何種子以及來自上述實施方案1-6中的植物以及它們的子代的細胞。在上述實施方案1-8或本發(fā)明的任一其他實施方案中的任一項中，DTP21多肽序列可來自擬南芥、玉米、大豆、煙豆、野大豆或短絨野大豆。在前述實施方案1-8中的任一項或本發(fā)明的任何其他實施方案中，所述重組DNA構(gòu)建體可包含至少一種在植物中有功能的啟動子作為調(diào)控序列。在前述實施方案1-8中的任一項或本發(fā)明的任何其他實施方案中，所述至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變是增加或減少。在前述實施方案1-8中的任一項或本發(fā)明的任何其他實施方案中，所述至少一種農(nóng)學(xué)特性可選自綠度、產(chǎn)量、生長速率、生物量、成熟時的鮮重、成熟時的干重、果實產(chǎn)量、種子產(chǎn)量、總植物含氮量、果實含氮量、種子含氮量、營養(yǎng)組織含氮量、總植物氨基酸含量、營養(yǎng)組織游離氨基酸含量、果實游離氨基酸含量、種子游離氨基酸含量、總植物蛋白質(zhì)含量、果實蛋白質(zhì)含量、種子蛋白質(zhì)含量、營養(yǎng)組織蛋白質(zhì)含量、耐旱性、氮攝取、根倒伏、收獲指數(shù)、莖倒伏、植株高度、穗高、穗長、鹽耐受性、早期幼苗活力和在低溫脅迫下的出苗。例如，至少ー種農(nóng)學(xué)特性的改變可為產(chǎn)量、綠度或生物量的増加。在任一上述實施方案1-8或本發(fā)明的任一其他實施方案中，在與不包含所述重組DNA構(gòu)建的對照植物在水限制條件下進行比較時，植物可表現(xiàn)出至少ー種農(nóng)學(xué)特性的改變?！案稍纭敝钢参锟衫玫乃蛔?，尤其是當(dāng)時間延長時，能夠引起植物損傷或阻止其正常發(fā)育(例如限制植物生長或種子產(chǎn)量)。
“耐旱性”指植物在干旱條件下存活較長時間并且基本上不表現(xiàn)出生理或物理退化的特性。植物的“耐旱性増加”相對于參比植物或?qū)φ罩参镞M行測量，它是植物在干旱條件下存活較長時間，并且相對于在相似干旱條件下生長的參比或?qū)φ罩参锘旧喜槐憩F(xiàn)出相同程度的生理或物理退化的特性。通常當(dāng)轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含重組構(gòu)建吋，它相對于參比或?qū)φ罩参锉憩F(xiàn)出增強的耐旱性，所述參比或?qū)φ罩参镌谄浠蚪M中不包含重組構(gòu)建體。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟悉模擬干旱條件并評價植物耐旱性的規(guī)程，所述植物已經(jīng)遭受了模擬的或天然存在的干旱條件。例如，技術(shù)人員可通過向植物提供比正常需求較少的水或在一定時期內(nèi)不提供水來模擬干旱條件，并且技術(shù)人員可通過尋找在生理和/或物理條件上的差異來評價耐旱性，包括但不限于活力、生長、大小、或根長、或具體地講葉片顔色或葉片面積大小。用于評價耐旱性的其他技術(shù)包括測量葉綠素?zé)晒?、光合作用速率和換氣速率。干旱脅迫實驗可涉及慢性脅迫(即緩慢干燥)和/或可涉及兩種急性脅迫(即突然除去水)，它們由一天或兩次恢復(fù)分開。慢性脅迫可持續(xù)8-10天。急性脅迫可持續(xù)3-5天。在對轉(zhuǎn)基因植物和相應(yīng)對照植物進行干旱脅迫以及良好灌溉處理期間可測量以下變量變量“ ％面積chg_慢性開始-急性2”是介于慢性脅迫第一天和第二次急性脅迫那一天之間的、通過遠可見光譜成像測定的總面積百分比變化的量度變量“ ％面積chg_慢性開始-慢性結(jié)束”是介于慢性脅迫第一天和慢性脅迫最后一天之間的、通過遠可見光譜成像測定的總面積百分比變化的量度。變量“ ％面積chgjg性開始-收獲”是介于慢性脅迫第一天和收獲那一天之間的、通過遠可見光譜成像測定的總面積百分比變化的量度。變量“ ％面積chg_慢性開始-恢復(fù)24小吋”是介于慢性脅迫第一天和恢復(fù)24小時(急性脅迫2之后24小時)之間的、通過遠可見光譜成像測定的總面積百分比變化的量度。變量“psii_急性I”是在第一次急性脅迫末期的光系統(tǒng)II (PSII)效率的量度。它提供對PSII天線吸光效率的評價，并且直接涉及葉片內(nèi)部的ニ氧化碳同化。變量“psii_急性2”是在第二次急性脅迫末期的光系統(tǒng)II (PSII)效率的量度。它提供對PSII天線吸光效率的評價，并且直接涉及葉片內(nèi)部的二氧化碳同化。變量急性I”是在第一次急性脅迫末期的最佳量子產(chǎn)率(Fv/Fm)的量度_(最大和最小熒光之間的可變熒光差值/最大熒光)。變量急性2”是在第二次急性脅迫末期的最佳量子產(chǎn)率(Fv/Fm)的量度_(最大和最小熒光之間的可變熒光差值/最大熒光)。變量“葉片卷曲_收獲”是在收獲日的頂部圖像對側(cè)面圖像的比率的量度。變量“葉片卷曲_恢復(fù)24小時”是恢復(fù)24小時頂部圖像對側(cè)面圖像的比率的量度。變量“比生長速率(SGR) ”指植物總表面積經(jīng)過單獨一天的變化(通過Lemna TecInstrument 測量)(Y(t) = YO^er*1) Y(t) = YC^erit 等同于 Y/Δ t 的 ％變化,其中各個術(shù) 語含義如下Y⑴=t時的總表面積；Y0 =初始總表面積(估計值)；r =比生長速率,天數(shù)―1，以及t =種植后的天數(shù)(“DAP”)變量“苗干重”是將苗置于104°C烘箱96小時后的苗重量的量度。變量“苗鮮重”是從植物切除后立即稱重的苗重量的量度。下文實例描述一些用于模擬干旱條件和/或評價耐旱性的代表性規(guī)程和技術(shù)。也可通過在田間測試中比較植物在模擬的或天然存在的干旱條件下(例如通過測量與非干旱條件下相比，在干旱條件下基本等同的產(chǎn)量，或測量與對照或參比植物相比，在干旱條件下更少的產(chǎn)量損失)保持足夠產(chǎn)量(至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、81 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 92%,93%,94%,95%,96%、97%、98%、99%或100%產(chǎn)量)的能力來評價耐旱性。在評價或測量其中利用了對照或參照植物的本發(fā)明任何實施方案(例如，如本文描述的組合物或方法)中的轉(zhuǎn)基因植物的農(nóng)學(xué)特性或表型時，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將很容易認識到要利用的合適對照植物。例如，通過如下非限制性示例來說明I.轉(zhuǎn)化的植物的子代，該轉(zhuǎn)化的植物對于重組DNA構(gòu)建體來說是半合子的，使得該子代分離成包含或不包含該DNA構(gòu)建體的植株包含該重組DNA構(gòu)建體的子代將通常相對于不包含該重組DNA構(gòu)建體的子代來進行測量(即，不包含該重組DNA構(gòu)建體的子代是對照或參照植物)。2.重組DNA構(gòu)建體基因滲入至近交系中，例如在玉米中，或基因滲入進變種中，例如在大豆中基因滲入品系將通常相對于親本近交系或變種品系進行測量(即，親本近交系或品種品系是對照或參照植物)。3.雙雜交系，其中第一雜交系由兩個親本近交系產(chǎn)生，而第二雜交系由相同的兩個親本近交系產(chǎn)生，不同的是其中一個親本近交系含有重組DNA構(gòu)建體第二雜交系通常將相對于第一雜交系進行測量(即第一雜交系為對照植物或參照植物)。4.包含重組DNA構(gòu)建體的植物該植株可以相對于這樣的對照植物進行評價或測量，該對照植物不包含重組DNA構(gòu)建體，但具有與該植株相當(dāng)?shù)倪z傳背景(例如，與包含重組DNA構(gòu)建體的植株相比較，核遺傳物質(zhì)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。存在許多可用于分析、比較和表征植物遺傳背景的基于實驗室的技術(shù)；其中這些技術(shù)是同工酶電泳、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)、任何引物聚合成酶鏈反應(yīng)(AP-PCR)、DNA擴增指紋(DAF)、序列特異擴增區(qū)域(SCAR)、擴增片段長度多態(tài)性(AFLP )和也稱為微衛(wèi)星的簡單序列重復(fù)(SSR)。此外，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將容易認識到，評價或測量轉(zhuǎn)基因植物的農(nóng)學(xué)特性或表型時合適的對照或參照植物將不包括先前已經(jīng)針對所需的農(nóng)學(xué)特性或表型，通過誘變或轉(zhuǎn)化而選擇的植物。施:方法包括但不限于用于增強植物耐旱性的方法、用于評價植物耐旱性的方法、用于改變植物農(nóng)學(xué)特性的方法、用于測定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法和用于制備種子的方法。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物，例如玉米、稻或大豆植物。植物還可以是向日葵、高梁、卡諾拉、小麥、苜蓿、棉花、大麥或黍。所述種子可為玉米、稻或大豆種子，例如玉米雜交種子或玉米自交系種子。
方法包括但不限于如下方法轉(zhuǎn)化細胞的方法包括用本發(fā)明的任何分離的多核苷酸轉(zhuǎn)化細胞。也包括通過這種方法轉(zhuǎn)化的細胞。在具體實施方案中，所述細胞是真核細胞，例如酵母、昆蟲或植物細胞，或原核細胞例如細菌細胞。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括用本發(fā)明的任何分離的多核苷酸或重組DNA構(gòu)建體來轉(zhuǎn)化植物細胞并由轉(zhuǎn)化的植物細胞再生轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明也涉及由該方法制備的轉(zhuǎn)基因植物，以及從該轉(zhuǎn)基因植物中獲取的轉(zhuǎn)基因種子。用于從細胞或細胞培養(yǎng)基中分離本發(fā)明多肽的方法，其中所述細胞包含具有本發(fā)明多核苷酸的重組DNA構(gòu)建體，所述多核苷酸可操作地連接到至少ー種調(diào)控序列，并且其中轉(zhuǎn)化的宿主細胞在適于重組DNA構(gòu)建體表達的條件下生長。改變宿主細胞中本發(fā)明多肽表達水平的方法，包括(a)用本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細胞；以及(b)在適于表達所述重組DNA構(gòu)建體的條件下使轉(zhuǎn)化的細胞生長，其中重組DNA構(gòu)建體的表達導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的宿主細胞中的本發(fā)明多肽含量改變。增強植物耐旱性的方法，包括(a)將重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入到可再生的植物細胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少ー種調(diào)控序列(例如在植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，基于Clustal V比對方法，所述所述多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85或87進行比較時具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性；和(b)在步驟(a)之后，由所述可再生的植物細胞再生轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體并且在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出增強的耐旱性。所述方法還可包括(c)獲得來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體并且在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出增強的耐旱性。增強植物耐旱性的方法，包括(a)將重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入到可再生的植物細胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少ー種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列(a)能夠在嚴格條件下與包含SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的全長互補序列的DNA分子雜交；或(b)通過選自刪除、取代、添加和插入的至少一種方法改變一個或多個核苷酸而衍生自 SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84 或 86 ;以及(b)在步驟(a)之后，由所述可再生的植物細胞再生轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體并且在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出增強的耐旱性。所述方法還可包括(c)獲得來源于該轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體并且在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出增強的耐旱性。評價植物耐旱性的方法，包括(a)獲得轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列(例如在植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，基于ClustalV比對方法，所述多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85或87 進行比較時具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、 61 62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性；(b)獲得來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(c)評價所述子代植物與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物相比的耐旱性。評價植物耐旱性的方法，包括(a)獲得轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列(a)能夠在嚴格條件下與包含SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的全長互補序列的DNA分子雜交；或(b)通過選自刪除、取代、添加和插入的至少一種方法改變一個或多個核苷酸而衍生自SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84或86 ;以及(b)獲 得來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(c)評價所述子代植物與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物相比的耐旱性。測定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，包括(a)獲得轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控序列(例如在植物中有功能的啟動子)的多核苷酸，其中基于Clustal V比對方法，所述多核苷酸編碼的多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID N0:27、32、46、56、60、64、81、83、85或87 進行比較時具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61 62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性；(b)獲得來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(c)任選地在水限制條件下，測定所述子代植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進行比較時是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。
測定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，包括(a)獲得轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少ー種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列(a)能夠在嚴格條件下與包含SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的全長互補序列的DNA分子雜交；或(b)通過選自刪除、取代、添加和插入的至少ー種方法改變ー個或多個核苷酸而衍生自SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84或86 ; (b)獲得來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(c)任選地在水限制條件下，測定所述子代植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進行比較時是否表現(xiàn)出至少ー種農(nóng)學(xué)特性的改變。產(chǎn)生種子(例如可作為提供耐旱性的產(chǎn)品銷售的種子)的方法，該方法包括任一上述的方法，并且還包括從所述子代植物獲得種子，其中所述種子在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體。在任一前述方法或本發(fā)明方法的任一其他實施方案中，在所述導(dǎo)入步驟中所述可再生的植物細胞可包括愈傷組織細胞、胚胎愈傷組織細胞、配子細胞、分生細胞或未成熟胚 芽細胞?？稍偕闹参锛毎蓙碜越幌涤衩字参铩Ｔ谌我磺笆龇椒ɑ虮景l(fā)明方法的任一其他實施方案中，所述再生步驟可包括(i)在包含促胚發(fā)生激素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的植物細胞，直至觀察到愈傷組織；(ii)將步驟(i)的所述轉(zhuǎn)化植物細胞轉(zhuǎn)移到第一培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基包括促組織形成激素；以及(iii)在第二培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)步驟(ii)后的所述轉(zhuǎn)化的植物細胞，以允許嫩芽伸長、根發(fā)育或這兩者同時發(fā)生。在任何前述方法或本發(fā)明的方法的任何其他實施方案中，所述至少一種農(nóng)學(xué)特性可選自綠度、產(chǎn)量、生長速率、生物量、成熟時的鮮重、成熟時的干重、果實產(chǎn)量、種子產(chǎn)量、總植物含氮量、果實含氮量、種子含氮量、營養(yǎng)組織含氮量、總植物游離氨基酸含量、營養(yǎng)組織游離氨基酸含量、果實游離氨基酸含量、種子游離氨基酸含量、總植物蛋白質(zhì)含量、果實蛋白質(zhì)含量、種子蛋白質(zhì)含量、營養(yǎng)組織蛋白質(zhì)含量、耐旱性、氮攝取、根倒伏、收獲指數(shù)、莖倒伏、植株高度、穗高、穗長、鹽耐受性、早期幼苗活力和在低溫脅迫下的出苗。至少ー種農(nóng)學(xué)特性的改變可為產(chǎn)量、綠度或生物量的増加。在任一上述方法或本發(fā)明的任一其他方法中，在水限制條件下，所述植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進行比較時可表現(xiàn)出至少ー種農(nóng)學(xué)特性的改變。在任一前述方法或本發(fā)明方法的任何其他實施方案中，存在供選擇的替代方案用于將包含可操作地連接到至少ー種調(diào)控序列的多核苷酸的重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入到可再生的植物細胞中。例如，可將調(diào)控序列(例如一種或多種增強子、任選地作為轉(zhuǎn)位因子的部件)導(dǎo)入到可再生的植物細胞中，然后篩選其中將所述調(diào)控序列可操作地連接至編碼本發(fā)明多肽的內(nèi)源基因的事件。將本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入植物可通過任何合適的技術(shù)來進行，這些技術(shù)包括但不限于引導(dǎo)DNA攝取、化學(xué)處理、電穿孔、微注射、細胞融合、感染、載體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移、轟擊或農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。植物轉(zhuǎn)化和再生技術(shù)已經(jīng)在國際專利公布WO 2009/006276中進行了描述，其內(nèi)容以引用方式并入本文。含有編碼所關(guān)注蛋白質(zhì)的外來的外源性分離核酸片段的植物的發(fā)育或再生是本領(lǐng)域所熟知的?？蓪⒃偕闹参镞M行自花授粉以產(chǎn)生純合的轉(zhuǎn)基因植物?；蛘?，將得自再生植物的花粉與農(nóng)學(xué)上重要的品系的產(chǎn)生種子的植株進行雜交。相反，將來自這些重要品系植物的花粉用于給再生植物授粉。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法培育含有所需多肽的本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。
實施例本發(fā)明將在下面的實施例中進一步說明，其中份數(shù)和百分比是以重量計并且度數(shù)是攝氏度，除非另外說明。應(yīng)當(dāng)理解，盡管這些實施例說明了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但僅是以例證的方式給出的。根據(jù)上面的論述和這些實施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠確定本發(fā)明的基本特征，并且在不脫離其實質(zhì)和范圍的情況下，能夠?qū)Ρ景l(fā)明做出各種變化和修改以使其適用于各種用法和條件。因此，除了那些本文所示和所述的那些之外，根據(jù)前文所述，本發(fā)明的各種修改形式對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說將是顯而易見的。這些修改形式也旨在涵蓋于所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。實施例I 制備蘇丹草粘粒文庫蘇丹草(Sorghumsudanense/Sugar Slim/Sugar Slim)購自 Kaneko Seeds Co.，Ltd.并將其種植在溫室中以進行培養(yǎng)。從植物葉片中提取基因組DNA。用限制性酶TaqI部分消化提取的基因組DNA，并且隨后通過蔗糖密度梯度離心法制備包含30kb至50kb的DNA的片段。將來自那些片段的DNA克隆進粘粒載體pSB200中，該載體已經(jīng)經(jīng)Nsp (7524) V (本文也稱為“ NspV ”)消化以構(gòu)建基因組DNA文庫?？寺≥d體pSB200 構(gòu)建自 pSBll (Komari 等人，Plant J. 10 :165-174，1996)。具體地講，將玉米泛素啟動子置于潮霉素抗性基因和NOS基因的3'末端信號之前。將一個Nsp (7524) V裂解位點加到該構(gòu)建體上，然后將其插入pSBll，從而構(gòu)建pSB200。使用PSB200，人們能夠構(gòu)建基因組DNA文庫，其具有約40kb的平均片段長度。載體pSB200也是高等植物的轉(zhuǎn)化載體并且包含用作選擇標(biāo)記的潮霉素抗性基因?？寺∵M文庫的大多數(shù)DNA片段具有約30kb至約50kb的長度并且克隆總數(shù)為約30，000。使用的大腸桿菌菌株是DH5 GENEH0GS 。實施例2篩選以鑒定具有增強的耐旱性的轉(zhuǎn)基因稻品系Yukihikari品種稻的原種購自食品零售商，并且子代種子在溫室中收獲。Suweon287 品種稻的原種得自 National Institute of Agribiological Resources of Japan,并且子代種子在溫室中收獲。通過以下方法檢查小容器中的稻植株經(jīng)重度缺水后仍存活的能力。I)將六株轉(zhuǎn)基因植物和對照植物Suweon 287和Yukihikari每種各一株一起在小罐內(nèi)的土壤中培養(yǎng)(小罐直徑10. 5cm,高9cm,體積570mL)。Suweon 287是耐旱對照品種，而Yukihikari是不耐旱的對照品種。在這個條件下，將根系包含在有限空間中以便根系深入到土壤中的能力差異不成為該測定法的影響因素。這個方法中的總體植株狀況是相當(dāng)均勻的，因為罐內(nèi)土壤的水含量變化非常小。2)當(dāng)?shù)诹~片伸展開時，在第三和第四天中止灌溉直至對照Yukihikari的葉片喪失任何明顯的生存信號。罐與罐之間的脫水水平可能在某些程度上不同，但是對照Yukihikari的外觀提供了罐內(nèi)干旱脅迫水平的良好指示。3)為了有利于評分，再次灌溉植株并在次日檢查。4)在次日，目測植株并根據(jù)表I所述的標(biāo)準(zhǔn)評分。M I稻干旱測定中的評分標(biāo)準(zhǔn)
權(quán)利要求
1.在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列選自 (a)編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中基于ClustalV比對方法，使用逐對比對默認參數(shù) KTUPLE = 1，GAP PENALTY = 3，WINDOW = 5 以及 DIAGONALS SAVED = 5，所述多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85或87進行比較時具有至少60%的序列同一性； (b)編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能夠在嚴格條件下與包含SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的全長互補序列的DNA分子雜交； (c)編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列通過選自刪除、取代、添加和插入的至少一種方法改變一個或多個核苷酸而衍生自SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84 或 86 ； (d)編碼多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQID NO :27,32,46,56、60、64、81、83、85 或 87 ;和 (e)包含SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84 或 86 的核苷酸序列； 并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出增強的耐旱性。
2.在基因組中包含重組DNA構(gòu)建體的植物，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列選自 (a)編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中基于ClustalV比對方法，使用逐對比對默認參數(shù) KTUPLE = 1，GAP PENALTY = 3，WINDOW = 5 以及 DIAGONALS SAVED = 5，所述多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85或87進行比較時具有至少80%的序列同一性； (b)編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能夠在嚴格條件下與包含SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的全長互補序列的DNA分子雜交； (c)編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列通過選自刪除、取代、添加和插入的至少一種方法改變一個或多個核苷酸而衍生自SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84 或86 ； (d)編碼多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQID NO :27,32,46,56、60、64、81、83、85 或87 ;和 (e)包含SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84 或 86 的核苷酸序列； 并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出產(chǎn)量的提聞。
3.權(quán)利要求3的植物，其中在水限制條件下，所述植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的所述對照植物進行比較時表現(xiàn)出所述產(chǎn)量的提高。
4.權(quán)利要求1、2或3中的任一項的植物，其中所述植物是單子葉植物或雙子葉植物。
5.權(quán)利要求4的植物，其中所述植物選自玉米、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉、小麥、苜蓿、棉花、稻、大麥、粟、甘蔗、柳枝稷、煙草、馬鈴薯和甜菜。
6.增強植物耐旱性的方法，包括 (a)將重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入到可再生的植物細胞中，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少ー種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列選自 (i)編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中基于ClustalV比對方法，使用逐對比對默認參數(shù) KTUPLE = 1，GAP PENALTY = 3，WINDOW = 5 以及 DIAGONALS SAVED = 5，所述多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85或87進行比較時具有至少80%的序列同一性； ( )編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能夠在嚴格條件下與包含SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的全長互補序列的DNA分子雜交； (iii)編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列通過選自刪除、取代、添加和插入的至少ー種方法改變ー個或多個核苷酸而衍生自SEQ ID NO :26、31、44、55、.59、63、80、82、84 或 86 ； (iv)編碼多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQID NO :27,32,46,.56、60、64、81、83、85 或 87 ;和 (V)包含 SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84 或 86 的核苷酸序列;以及 (b)在步驟(a)之后，由所述可再生的植物細胞再生轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體并且在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出增強的耐旱性。
7.權(quán)利要求6的方法，還包括 (C)獲得來源于所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體并且在與不包含所述DNA構(gòu)建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出增強的耐旱性。
8.評價植物耐旱性的方法,包括 (a)獲得轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少ー種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列選自 (i)編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比對方法，使用逐對比對默認參數(shù) KTUPLE = 1，GAP PENALTY = 3，WINDOW = 5 以及 DIAGONALS SAVED = 5，所述多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85或87進行比較時具有至少80%的序列同一性； ( )編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能夠在嚴格條件下與包含SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的全長互補序列的DNA分子雜交； (iii)編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列通過選自刪除、取代、添加和插入的至少ー種方法改變ー個或多個核苷酸而衍生自SEQ ID NO :26、31、44、55、.59、63、80、82、84 或 86 ； (iv)編碼多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQID NO :27,32,46,.56、60、64、81、83、85 或 87 ;和 (V)包含 SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84 或 86 的核苷酸序列;以及 (b)獲得來源于所述(a)的轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及(C)評價所述子代植物與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物相比的耐旱性。
9.測定植物農(nóng)學(xué)特性改變的方法，包括 (a)獲得轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列選自 (i)編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中基于Clustal V比對方法，使用逐對比對默認參數(shù) KTUPLE = 1，GAP PENALTY = 3，WINDOW = 5 以及 DIAGONALS SAVED = 5，所述多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85或87進行比較時具有至少80%的序列同一性； ( )編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能夠在嚴格條件下與包含SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的全長互補序列的DNA分子雜交； (iii)編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列通過選自刪除、取代、添加和插入的至少一種方法改變一個或多個核苷酸而衍生自SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84 或 86 ； (iv)編碼多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQID NO :27,32,46,56、60、64、81、83、85 或 87 ;和 (V)包含 SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84 或 86 的核苷酸序列;以及 (b)獲得來源于所述步驟(a)的轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及 (c)測定所述子代植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進行比較時是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述至少一種農(nóng)學(xué)性狀是產(chǎn)量，并且進一步地，其中所述改變是提高。
11.權(quán)利要求9或10中的任一項的方法，其中所述測定步驟(C)包括在水限制條件下，測定所述轉(zhuǎn)基因植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進行比較時是否表現(xiàn)出至少一種農(nóng)學(xué)特性的改變。
12.權(quán)利要求6至11中的任一項的方法，其中所述植物是單子葉植物或雙子葉植物。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述植物選自玉米、大豆、向日葵、高粱、卡諾拉、小麥、苜蓿、棉花、稻、大麥、粟、甘蔗、柳枝稷、煙草、馬鈴薯和甜菜。
14.分離的多核苷酸，包含核苷酸序列，所述核苷酸序列選自 (a)編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中基于ClustalV比對方法，使用逐對比對默認參數(shù) KTUPLE = 1，GAP PENALTY = 3，WINDOW = 5 以及 DIAGONALS SAVED = 5，所述多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85或87進行比較時具有至少60%的序列同一性； (b)編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列能夠在嚴格條件下與包含SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84或86的全長互補序列的DNA分子雜交； (c)編碼具有耐旱活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列通過選自刪除、取代、添加和插入的至少一種方法改變一個或多個核苷酸而衍生自SEQ ID NO :26、31、44、55、.59、63、80、82、84 或86 ；(d)編碼多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQID NO :27,32,46,.56、60、64、81、83、85 或 87 ;和 (e)包含SEQ ID NO :26、31、44、55、59、63、80、82、84 或 86 的核苷酸序列。
15.分離的多核苷酸,包含權(quán)利要求14的核苷酸序列的全長互補序列，其中權(quán)利要求.14的全長互補序列和核苷酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成并且是100%互補的。
16.權(quán)利要求14的多核苷酸，其中基于ClustalV比對方法，使用所述逐對比對默認參數(shù)，所述(a)部分的多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85或87進行比較時具有至少80%的序列同一性。
17.權(quán)利要求14的多核苷酸，其中基于ClustalV比對方法，使用所述逐對比對默認參數(shù)，所述(a)部分的多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85或87進行比較時具有至少85%的序列同一性。
18.權(quán)利要求14的多核苷酸，其中基于ClustalV比對方法，使用所述逐對比對默認參數(shù)，所述(a)部分的多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85或87進行比較時具有至少90%的序列同一性。
19.權(quán)利要求14的多核苷酸，其中基于ClustalV比對方法，使用所述逐對比對默認參數(shù)，所述(a)部分的多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85或87進行比較時具有至少95%的序列同一性。
20.重組DNA構(gòu)建體，包含可操作地連接至少ー種調(diào)控元件的權(quán)利要求14的分離的多核苷酸。
21.包含權(quán)利要求20的重組DNA構(gòu)建體的細胞，其中所述細胞選自細菌細胞、酵母細胞、以及昆蟲細胞和植物細胞。
22.包含權(quán)利要求20的重組DNA構(gòu)建體的植物。
23.包含權(quán)利要求20的重組DNA構(gòu)建體的種子。
24.分離由權(quán)利要求20的重組DNA構(gòu)建體編碼的多肽的方法，其中所述方法包括以下步驟 (a)用權(quán)利要求20的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化細胞； (b)在適于所述重組DNA構(gòu)建體表達的條件下使所述步驟(a)的轉(zhuǎn)化的細胞生長；以及 (c)從所述步驟(b)的轉(zhuǎn)化的細胞中分離所述多肽。
25.分離的多肽，選自 (a)具有耐旱活性的多肽，其中基于ClustalV比對方法，使用逐對比對默認參數(shù)KTUPLE = 1,GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5 以及 DIAGONALS SAVED = 5，所述多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID N0:27、32、46、56、60、64、81、83、85或87進行比較時具有至少60%的序列同一注; (b)具有耐旱活性的多肽，其中所述氨基酸序列通過選自刪除、取代、添加和插入的至少ー種方法改變ー個或多個氨基酸而衍生自SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85或.87 ;和 (c)多肽，其中所述多肽的氨基酸序列包含SEQID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85或87。
26.權(quán)利要求25的多肽，其中基于ClustalV比對方法，使用所述逐對比對默認參數(shù)，所述(a)部分的多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85或87進行比較時具有至少80%的序列同一性。
27.權(quán)利要求25的多肽，其中基于ClustalV比對方法，使用所述逐對比對默認參數(shù)，所述(a)部分的多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85或87進行比較時具有至少85%的序列同一性。
28.權(quán)利要求25的多肽，其中基于ClustalV比對方法，使用所述逐對比對默認參數(shù)，所述(a)部分的多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85或87進行比較時具有至少90%的序列同一性。
29.權(quán)利要求25的多肽，其中基于ClustalV比對方法，使用所述逐對比對默認參數(shù)，所述(a)部分的多肽具有的氨基酸序列在與SEQ ID NO :27、32、46、56、60、64、81、83、85或87進行比較時具有至少95%的序列同一性。
30.包含權(quán)利要求14的多核苷酸的載體。
31.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括用權(quán)利要求20的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細胞，并且由所述轉(zhuǎn)化的植物細胞再生轉(zhuǎn)基因植物。
32.權(quán)利要求I至5中的任一項的植物的種子，其中所述種子在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至少一種調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，基于Clustal V比對方法，所述多肽具有的氨基酸序列在與SEQ IDNO :27、32、46、56、60、64、81、83、85或87進行比較時具有至少60%的序列同一性，并且其中由所述種子產(chǎn)生的植物在與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出或者耐旱性的增強、或者產(chǎn)量的提高、或者兩者皆有。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離的多核苷酸和多肽，以及用于提供耐旱性的重組DNA構(gòu)建體、包含這些重組DNA構(gòu)建體的組合物(例如植物或種子)，以及利用這些重組DNA構(gòu)建體的方法。所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至植物中有功能的啟動子的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼DTP21多肽。
文檔編號C12N15/82GK102725307SQ201080060302
公開日2012年10月10日 申請日期2010年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月30日
發(fā)明者H·薩凱, I·奧卡, M·C·阿爾伯森, M·卡施哈拉, N·卡托, S·V·廷蓋, S·烏薩米, S·盧克, T·伊馬亞馬, T·科莫里, T·科馬里, Y·塔卡庫拉, Y·希埃 申請人:先鋒國際良種公司, 日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會社, 納幕爾杜邦公司