專利名稱：重組抗體載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)重組抗體，尤其是單鏈重組抗體的核酸載體。
背景技術(shù)：
在過去的10-15年，產(chǎn)生了將重組單克隆抗體(mAb)用作治療劑的巨大興趣。在2007年，僅在美國mAb的銷售就超過$140億，具有22%的逐年增長率(Aggarwal，2008)。批準(zhǔn)的mAb的數(shù)字接近30種，并且數(shù)百種新的候選者在準(zhǔn)備中，這種趨勢沒有顯示減緩的跡象。大多治療性重組mAb是IgG家族的成員，并由于它們巨大的尺寸和復(fù)雜的糖基化模式，這些分子目前是在哺乳動物細(xì)胞中生產(chǎn)的，其中絕大多數(shù)利用中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞作為生產(chǎn)宿主(Wurm，2004)。治療性的重組mAb的發(fā)現(xiàn)到臨床的途徑可以是很長且乏味的過程，通?；ㄙM數(shù) 年。這種過程的第一步涉及靶分子(比如腫瘤發(fā)生期間過表達(dá)的表面抗原)的高親和性結(jié)合分子(binder)的鑒別。相當(dāng)?shù)呐Ｗ⒂陉U明有助于分離目標(biāo)抗原的結(jié)合部分的方法。最初的mAb是利用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)的,然而獲得的鼠抗體不適于治療性應(yīng)用(Berger等人，2002)。隨后，開發(fā)了諸如CDR嫁接、噬菌體、酵母和核糖體展示的技術(shù)(綜述見(Hoogenboom,2005))0噬菌體展示是最常使用的方法。這種技術(shù)鑒別結(jié)合至靶分子的單鏈可變片段(scFv)或片段抗原結(jié)合(Fab)元件，其中靶分子分離自高復(fù)雜性的、模擬天然免疫組庫(Hdne immune repertoire)的文庫。這種文庫可含有鼠或人序列，并且最近,倉1J建了完全合成的文庫。最重要的是，由于這些片段含有抗體可變區(qū)，它們需要“重新格式化(reformatting)”至含有必要的恒定區(qū)序列以及用于在哺乳動物細(xì)胞中高水平表達(dá)的元件的表達(dá)載體中。這種重新格式化步驟可以是長期而復(fù)雜的過程，因為分離片段的序列是天然可變的。這使得傳統(tǒng)PCR和/或限制性內(nèi)切核酸酶克隆出現(xiàn)問題。例如分離自天然Fab免疫球蛋白基因文庫的抗TNF抗體通過三分連接(tripartite ligation)重新構(gòu)建成完整的抗體；含有前導(dǎo)序列和V (可變)結(jié)構(gòu)域氨基端的片段、含有V結(jié)構(gòu)域其余部分和C λ恒定區(qū)的第二片段以及表達(dá)載體。重新格式化需要使用片段特異性引物和兼容限制性位點的附加物(appendage)的PCR (Mahler等人，1997)?，F(xiàn)有的抗體重新格式化載體表現(xiàn)出有限的靈活性，并且限制性內(nèi)切核酸酶識別序列形成的密碼子往往導(dǎo)致若干“外來”氨基酸添加至原始序列中(Coloma 等人，1992 ；Persic 等人，1997 ；Jostock 等人，2004)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及用于重組抗體生產(chǎn)的載體，其消除或至少明顯減少“外來”或“多余”氨基酸在表達(dá)的重組抗體中的出現(xiàn)，“外來”或“多余”氨基酸可危害重組抗體的抗原結(jié)合。本發(fā)明提供了廣泛形式的用于單鏈重組抗體的重組抗體載體，該載體包括編碼氨基酸序列的核苷酸序列，其中氨基酸序列在多種不同免疫球蛋白可變區(qū)中是至少部分保守的并且由限制性內(nèi)切核酸酶位點編碼，在限制性內(nèi)切核酸酶位點中插入編碼免疫球蛋白可變區(qū)的核苷酸序列。
在第一個方面中，本發(fā)明提供包括這樣的核苷酸序列的重組抗體載體，所述核苷酸序列編碼(i)由限制性內(nèi)切核酸酶位點編碼的免疫球蛋白可變區(qū)的氨基酸序列；和
(ii)免疫球蛋白恒定區(qū)的氨基酸序列；其中核苷酸序列還包括一個或更多個有效地連接或連結(jié)至所述核苷酸序列的調(diào)節(jié)性核苷酸序列。適當(dāng)?shù)?，編碼(iii)免疫球蛋白可變區(qū)氨基酸序列的另一核苷酸序列在與(ii)相同的閱讀框中插入至重組抗體載體中，優(yōu)選地，不編碼除了和(iii)中的那些以外的一個或更多個氨基酸。在優(yōu)選實施方式中，(i)中的氨基酸序列包括在不同免疫球蛋白可變區(qū)中至少部分保守的多個氨基酸。典型地，(i)中的氨基酸序列包括兩個氨基酸，或由兩個氨基酸組成。優(yōu)選地，(i)中的氨基酸序列的第一個氨基酸是谷氨酸(E)。優(yōu)選地，(i)中的氨 基酸序列的第二個氨基酸是亮氨酸(L)。更優(yōu)選地，(i)中的氨基酸序列由EL組成。優(yōu)選地，根據(jù)第一個方面，限制性內(nèi)切核酸酶位點是SacI位點。合適地，(ii)的免疫球蛋白恒定區(qū)氨基酸序列以及(iii)的免疫球蛋白可變區(qū)氨基酸序列是，或來自不同的免疫球蛋白分子。合適地，所述重組抗體載體的核苷酸序列還編碼(iv)信號肽的氨基酸序列。應(yīng)當(dāng)理解，(ii)、(iii)及(V)中的氨基酸序列可能分別是免疫球蛋白恒定區(qū)、可變區(qū)和信號肽的片段。本發(fā)明的這一方面還提供一種重組抗體表達(dá)構(gòu)建物，其包括重組抗體載體和
(iii)中編碼免疫球蛋白可變區(qū)氨基酸序列的所述核苷酸序列。在第二個方面中，本發(fā)明提供一種試劑盒，其包括第一方面的重組抗體載體以及一種或更多種用于將編碼免疫球蛋白可變區(qū)氨基酸序列的另一核苷酸序列插入至載體的試劑。一種或更多種試劑可能包括限制性內(nèi)切核酸酶。優(yōu)選地，限制性內(nèi)切核酸酶位點是SacI。一種或更多種試劑可能包括酶以及任選一種或更多種用于將核苷酸序列非連接酶依賴性克隆(LIC)至載體的試劑。在第三個方面中，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)重組抗體表達(dá)構(gòu)建物的方法，其包括將編碼免疫球蛋白可變區(qū)氨基酸序列的另一核苷酸序列插入至第一個方面的重組抗體表達(dá)載體的步驟。優(yōu)選地，編碼免疫球蛋白可變區(qū)氨基酸序列的核苷酸序列利用非連接酶依賴性克隆(LIC)而插入。在第四個方面中，本發(fā)明提供根據(jù)第三個方面的方法生產(chǎn)的一種重組抗體表達(dá)構(gòu)建物。在第五個方面中，本發(fā)明提供一種宿主細(xì)胞，其包括第一個方面的重組抗體載體或第四個方面的重組抗體表達(dá)構(gòu)建物。在第六個方面中，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)重組抗體的方法，其包括從第四個方面的宿主細(xì)胞中分離、純化或富集重組抗體的步驟。在第七個方面中，本發(fā)明提供一種由第一個方面或第四個方面的重組抗體表達(dá)構(gòu)建物編碼的重組抗體。貫穿本說明書中，除非上下文另有指明，否則詞語“包括”、“包含”和“含有”將理解為意指納入所述的整體或整體的組，但不排除任何其它整體或整體的組。


圖I :mAbXpreSS載體系統(tǒng)。載體含有用于在哺乳動物細(xì)胞中高水平表達(dá)所需的所有元件以及包括分泌信號肽的IgG骨架序列。在In Fusion 介導(dǎo)的可變區(qū)的克隆之前，E-L密碼子形成用于載體線性化的SacI位點。可變區(qū)PCR產(chǎn)物在3’和5’處含有與SacI位點兩側(cè)的目標(biāo)載體插入位點精確同源的15bp。圖2 3C12IgGl表達(dá)和純化的分析。
(A)培養(yǎng)物上清(i、iii)的非還原(NR)和2-巰基乙醇還原的(R)樣本以及5μ g親和純化的材料(ii、iv)在4-12%SDS-PAGE上進(jìn)行分離并用考馬斯亮藍(lán)R250進(jìn)行染色。(B)蛋白A純化的重組3C12抗體以及凝膠過濾標(biāo)準(zhǔn)物的分析型尺寸排阻色譜。樣本顯示沒有檢測到聚集和145kDa的預(yù)測分子量。圖3 :純化的3C12、抗人CD83IgG的功能分析。(A) 25 μ g/ml的3C12IgGl與轉(zhuǎn)染有人⑶83的⑶83+細(xì)胞系KM-H2、L428和FDCPl細(xì)胞結(jié)合。在未轉(zhuǎn)染的FDCPl細(xì)胞上(⑶83-)，3C12和同種型IgGl對照之間沒有看到差異。(B)相對于通過體外⑶16-依賴性機制的赫塞汀(Here印tin)(陰性對照)，3C12IgGl誘導(dǎo)了 KM-H2細(xì)胞系的顯著裂解。誤差條代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖4 :顯示在哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)和選擇所需的特征的質(zhì)粒圖。A) IgG重鏈和B)輕鏈的實例。在各種情況中均表明了可變區(qū)插入點。
具體實施例方式本發(fā)明是根據(jù)發(fā)明人實現(xiàn)對這樣的重組抗體表達(dá)系統(tǒng)的需求而產(chǎn)生的，即將編碼免疫球蛋白可變區(qū)的核苷酸序列擴增的復(fù)雜性減小到最小程度的重組抗體表達(dá)系統(tǒng)，優(yōu)選提供擴增的核苷酸序列至載體中的非連接酶依賴性克隆，并且排除或減少外來或多余氨基酸的納入，外來或多余氨基酸可導(dǎo)致降低的抗原結(jié)合。有助于開發(fā)滿足這種需求的重組抗體載體的是發(fā)明人的這種發(fā)現(xiàn)，即氨基酸谷氨酸(E)在約10%的免疫球蛋白可變區(qū)的N-端處或其附近出現(xiàn)，以及氨基酸亮氨酸(L)在約10%的免疫球蛋白可變區(qū)的C-端處或其附近出現(xiàn)。本發(fā)明人已經(jīng)創(chuàng)建了一種包括編碼氨基酸序列EL的核苷酸序列GAGCTC( SEQ ID NOO的載體，其為限制性內(nèi)切核酸酶SacI提供識別和切割位點。通過包括這種核苷酸序列，重組抗體載體為編碼免疫球蛋白可變區(qū)的核苷酸序列的插入提供了方便的線性化位點，以使E殘基是免疫球蛋白可變區(qū)的N-端，而L殘基是免疫球蛋白可變區(qū)的C-端。這種部分保守的E和L殘基的定位在顯著比例的免疫球蛋白可變區(qū)中出現(xiàn)，從而不太可能產(chǎn)生對抗原識別和結(jié)合的負(fù)面影響。因此，在一個優(yōu)選的方面中，本發(fā)明提供一種單鏈重組抗體載體，其包括(a)核苷酸序列(i)其包括編碼免疫球蛋白可變區(qū)氨基酸序列的限制性內(nèi)切核酸酶位點；和(ii)其在與(i)相同的閱讀框中編碼免疫球蛋白恒定區(qū)氨基酸序列，其中編碼(iii)免疫球蛋白可變區(qū)氨基酸序列的另一核苷酸序列在與(ii)相同的閱讀框中插入至限制性內(nèi)切核酸酶位點；以及(b) —個或更多個有效地連接或連結(jié)至所述核苷酸序列的調(diào)節(jié)性核苷酸序列。適當(dāng)?shù)?，所述編碼(iii)免疫球蛋白可變區(qū)氨基酸序列的另一核苷酸序列在與(ii)相同的閱讀框中插入至重組抗體載體中，優(yōu)選地，不編碼除了和(iii)中的那些以外的一個或更多個氨基酸。本發(fā)明還提供一種重組抗體表達(dá)構(gòu)建物，其包括重組抗體載體和(iii)中編碼免疫球蛋白可變區(qū)氨基酸序列的所述核苷酸序列。適當(dāng)?shù)兀?ii)的免疫球蛋白恒定區(qū)氨基酸序列和(iii)的免疫球蛋白可變區(qū)氨基酸序列是，源自或衍生自，不同的、單獨的或區(qū)別的(即不相同)的免疫球蛋白分子。因此，重組抗體載體提供“通用的”、“平臺”或“骨架”免疫球蛋白恒定區(qū)，目標(biāo)免疫球蛋白可變區(qū)可包括或嫁接至其中。 如此處所用，“載體”是人工創(chuàng)建的核酸分子，其適用于目標(biāo)核苷酸序列的操作、增殖和/或表達(dá)。載體可以是質(zhì)粒、人工染色體、噬菌粒、粘粒或遺傳改造的病毒，然而不限于此?！氨磉_(dá)構(gòu)建物”是其中插入有待表達(dá)的核苷酸序列的載體。術(shù)語“核酸”包括DNA和RNA，包括單鏈和雙鏈的形式。優(yōu)選地，載體是雙鏈DNA質(zhì)粒。 通常情況下，限制性內(nèi)切核酸酶識別包括六個(6 )連續(xù)核苷酸的位點，六個連續(xù)核苷酸編碼免疫球蛋白可變區(qū)的兩個氨基酸。載體優(yōu)選包括編碼氨基酸的限制性內(nèi)切核酸酶識別位點的核苷酸序列，其中氨基酸在多種不同免疫球蛋白可變區(qū)中是至少部分保守的。優(yōu)選地，氨基酸在至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%的免疫球蛋白可變區(qū)中出現(xiàn)。在優(yōu)選實施方式中，在不同免疫球蛋白可變區(qū)N或C端處或附近的各自氨基酸是保守的。在尤其優(yōu)選的實施方式中，氨基酸序列是EL并且由核苷酸序列GAGCTC (SEQ IDNO :1)編碼，其為限制性內(nèi)切核酸酶SacI提供識別和切割位點。N端E氨基酸和C端L氨基酸在約10%的免疫球蛋白可變區(qū)氨基酸序列中出現(xiàn)。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，優(yōu)選包括形成限制性內(nèi)切核酸酶識別位點的編碼兩個或三個氨基酸的核苷酸序列或由形成限制性內(nèi)切核酸酶識別位點的編碼兩個或三個氨基酸的核苷酸序列組成的其它核苷酸序列，可對于抗體可變區(qū)氨基酸序列是特定的，而不一定必須是保守的或出現(xiàn)在其它抗體可變區(qū)氨基酸序列中。術(shù)語“蛋白質(zhì)”表示氨基酸聚合物，其可包括天然或者非天然氨基酸，D型或L型氨基酸。通常，“肽”是一種具有不超過60個連續(xù)氨基酸的蛋白質(zhì)。如此處所用，“抗體”是一種能夠特異性結(jié)合抗原的免疫球蛋白并至少包括免疫球蛋白恒定區(qū)氨基酸序列和免疫球蛋白可變區(qū)氨基酸序列。這些氨基酸序列可能構(gòu)成其所最初源自的各自免疫球蛋白恒定區(qū)和免疫球蛋白可變區(qū)的整個氨基酸序列的全部或部分或片段。適當(dāng)?shù)兀庖咔虻鞍卓勺儏^(qū)片段能夠結(jié)合抗原或表位。術(shù)語“免疫球蛋白恒定區(qū)”在其范圍內(nèi)包括鼠或人源的免疫球蛋白重鏈和輕鏈恒定區(qū)及其片段。片段可構(gòu)成整個免疫球蛋白恒定區(qū)的至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少 70%、至少 75%、至少 80%、至少 85%、至少 90%或 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%。恒定區(qū)序列的非限制實例在實施例中提供，盡管恒定區(qū)的其它實例可通過搜索NCBI上的序列數(shù)據(jù)庫(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/PubMed)或?qū)ｉT的數(shù)據(jù)庫比如Kabat (http://www. kabatdatabase. com/index, html)或 V BASE (http://vbase. mrc-cpe.cam, ac. uk/)找至丨J。術(shù)語“免疫球蛋白可變區(qū)”在其范圍內(nèi)包括鼠或人源的免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)。重鏈可以是任何同種型(包括IgM、IgG、IgD、IgE和IgA)或任何亞型(包括IgGpIgG2、IgG2a、IgG3 和 IgG4)ο輕鏈可以是λ或K輕鏈。
免疫球蛋白可變區(qū)或其片段適當(dāng)?shù)匕ㄗ銐虻陌被嵝蛄衼硖禺愋越Y(jié)合抗原或表位。典型地，免疫球蛋白可變區(qū)包括至少一個“互補決定區(qū)(⑶R)”或其片段，其涉及在其中各重鏈和輕鏈主要負(fù)責(zé)結(jié)合抗原表位的高變區(qū)。在該上下文中，片段可構(gòu)成整個CDR或整個可變區(qū)的至少10 %、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少50%、至少55%、至少60%、至少有65%、至少有70%、至少75%、至少80%、至少 85%、至少 90% 或 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%。各鏈的⑶R通常被稱為⑶Rl、⑶R2和⑶R3，從N端開始按順序編號。優(yōu)選地，免疫球蛋白可變區(qū)包括相同的免疫球蛋白可變區(qū)的三個⑶R。適當(dāng)?shù)?，重組抗體載體還包括編碼信號肽氨基酸序列的核苷酸序列。信號肽序列的非限制性實例在實施例中提供，盡管信號肽序列的其它實例可在http://www.siRnalpeptide. de/ 中找至丨J。在一個特別優(yōu)選的實施例中，編碼免疫球蛋白可變區(qū)氨基酸序列的另一個核苷酸序列是可在與編碼免疫球蛋白恒定區(qū)氨基酸序列和信號肽氨基酸序列的核苷酸序列相同的閱讀框中插入至重組抗體載體中的，除了限制性內(nèi)切核酸酶位點編碼的那些以及所插入的編碼免疫球蛋白可變區(qū)氨基酸序列的核苷酸序列編碼的那些以及編碼信號肽和免疫球蛋白恒定區(qū)氨基酸序列的核苷酸序列編碼的以外，沒有因此編碼一個或更多個額外的氨基酸。因此，在一個重組抗體表達(dá)構(gòu)建物的優(yōu)選實施方式中，(a)中的所述核苷酸序列編碼連續(xù)的氨基酸序列，其中氨基酸序列包括如下序列或由如下序列組成，依次是在(i)中氨基酸序列的第一個氨基酸(iii)的氨基酸序列、(i)中氨基酸序列的第二個氨基酸以及
(ii)的氨基酸序列。優(yōu)選地，第一個氨基酸是E并且第二個氨基酸是L。重組抗體載體和表達(dá)構(gòu)建物適當(dāng)?shù)匕ㄒ粋€或更多個調(diào)節(jié)性核苷酸序列?！罢{(diào)節(jié)性核苷酸序列”表示有助于起始、控制或終止轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、剪接、翻譯或其它和所述核苷酸序列表達(dá)有關(guān)的事件的核苷酸序列。調(diào)節(jié)性核苷酸序列的非限制性實例包括啟動子、聚腺苷酸化序列、增強子、內(nèi)含子、核糖體結(jié)合位點、剪接供體/受體位點、翻譯起始和/或終止序列等。調(diào)節(jié)性核苷酸序列的選擇或多或少將依賴于宿主細(xì)胞或生物體的來源，在所述宿主細(xì)胞或生物體中要表達(dá)重組抗體。這種調(diào)節(jié)性核苷酸序列是本領(lǐng)域熟知的。重組抗體載體適當(dāng)?shù)匕ㄓ行У剡B接或連結(jié)至編碼抗體的核苷酸序列的啟動子。啟動子可以是組成性的、可調(diào)節(jié)的(即可誘導(dǎo)或可阻遏的)、組織特異性的或經(jīng)受其它所需的對啟動子活性的功能限制或影響。在有關(guān)哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的實施方式中，啟動子可以是可用于哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)的任何啟動子，包括但不限于，例如CMV啟動子、SV40啟動、延伸因子α啟動子(如PEF-BOS)、晶體蛋白啟動子(如αΑ晶體蛋白、β2晶體蛋白)或雜交啟動子(如SRa )。在優(yōu)選的實施方式中，重組抗體載體包括CMV啟動子。重組抗體載體還可包括一個或更多個可選的標(biāo)志物基因來允許轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在含有選擇試劑的培養(yǎng)基中的選擇。通常，可選的標(biāo)志物基因賦予對選擇試劑的抗性，選擇試劑比如氨節(jié)青霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素、新霉素、遺傳霉素(geneticin)、鏈霉素和慶大霉素，盡管不限于此。合適的基因在本領(lǐng)域中很容易獲得。通常，包括可選的標(biāo)志物基 因以有助于針對重組抗體載體的細(xì)菌增殖來選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。然而，在一些實施方式中，可包括另一種可選的標(biāo)志物基因以有助于針對重組抗體的表達(dá)選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。典型地，可選的標(biāo)志物基因?qū)⒂行У剡B接至適于可選的標(biāo)志物基因在所需宿主細(xì)胞中表達(dá)的啟動子。也應(yīng)當(dāng)了解的是，為了有助于在細(xì)菌宿主細(xì)胞中的重組操作和增殖，重組抗體載體可包括細(xì)菌的復(fù)制原點，比如fl細(xì)菌噬菌體、COlEl或PUC復(fù)制原點。特定的重組抗體質(zhì)粒載體的非限制性實例顯示于圖4A和圖4B中。本發(fā)明的重組抗體載體允許重組抗體的生產(chǎn)，重組抗體包括實際上任何可變區(qū)氨基酸序列，該生產(chǎn)具有相對簡單的“一步”擴增和克隆系統(tǒng)，該系統(tǒng)不引入潛在影響抗原識別和結(jié)合的外來氨基酸?？勺儏^(qū)氨基酸序列可源自scFv片段或Fab片段的噬菌體展示文庫、核糖體和mRNA展示文庫、微生物細(xì)胞展示文庫或定向進(jìn)化所生產(chǎn)的文庫(比如Hoogenboom所綜述的，2005),盡管不限于此?；蛘撸勺儏^(qū)氨基酸序列可源自生產(chǎn)抗體的雜交瘤或表達(dá)編碼免疫球蛋白可變區(qū)氨基酸序列的核酸分子的其它細(xì)胞。有利的是，本發(fā)明的重組抗體載體有利于編碼可變區(qū)的核苷酸序列的插入緊挨著編碼恒定區(qū)的核苷酸序列的5’，而不加入編碼任何外來氨基酸的核苷酸序列。在另一方面中，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)重組抗體表達(dá)構(gòu)建物的方法，包括步驟如此前所述，將編碼免疫球蛋白可變區(qū)氨基酸序列的另一核苷酸序列插入到重組抗體表達(dá)載體中。典型地，編碼所述免疫球蛋白可變區(qū)的核苷酸序列將從文庫或其它來源通過核苷酸序列擴增技術(shù)比如PCR進(jìn)行擴增。通常情況下，單獨的一對正向和反向PCR引物將包括正向5’至3’ 緊挨著重組抗體載體中限制性內(nèi)切核酸酶位點5’的核苷酸序列的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個連續(xù)的核苷酸；以及編碼可變區(qū)的核苷酸序列的5’部分。反向5’至3’ 互補于緊挨著重組抗體載體中限制性內(nèi)切核酸酶位點3’的核苷酸序列的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個連續(xù)的核苷酸；以及編碼可變區(qū)的核苷酸序列的3’部分。引物還可包括一個或更多個限制性位點序列的核苷酸以確保在表達(dá)的抗體中，相對于可變和保守區(qū)，編碼的氨基酸被正確的定位。在一個有關(guān)重組抗體載體的特定實施方式中，所述重組抗體載體包括編碼氨基酸EL的SacI限制性內(nèi)切核酸酶位點，PCR引物包括正向5’至3’ 緊挨著重組抗體載體中的SacI限制性內(nèi)切核酸酶位點的5’和SacI位點的AG 二核苷酸的核苷酸序列的15個連續(xù) 核苷酸；以及編碼可變區(qū)的核苷酸序列的5'部分。反向5’至3’ 互補于緊挨著重組抗體載體中的SacI限制性內(nèi)切核酸酶位點的3’和SacI位點的AG 二核苷酸的核苷酸序列的15個連續(xù)核苷酸；以及編碼可變區(qū)的核苷酸序列的3’部分。在優(yōu)選實施方式中，通過非連接酶依賴性克隆(LIC)系統(tǒng)(比如ClontechIn-Fusion PCR克隆系統(tǒng))的方式，將編碼免疫球蛋白可變區(qū)氨基酸序列的核苷酸序列插入到重組抗體載體中。這種系統(tǒng)避免了在用于PCR擴增的引物中包括限制性內(nèi)切核酸酶位點的需求(即，將5’和3’限制性內(nèi)切核酸酶位點并入PCR擴增產(chǎn)物)，以及避免了用合適的限制性內(nèi)切核酸酶部分消化PCR擴增產(chǎn)物的需求。因此，本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)一步包括酶，比如In Fusion 。其它非連接酶依賴性克隆系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的并包括，例如，T4DNA聚合酶介導(dǎo)的克隆以及PCR產(chǎn)物的非連接酶依賴性克隆(LIC-PCR)，比如Aslanidis和de Jong,1990以及Aslanidis等人1994中所述的。由InFusion 連接生產(chǎn)的重組抗體序列的特定實例在實施例中提供。在替代的實施方式中，通過使用常規(guī)的DNA連接酶，編碼免疫球蛋白可變區(qū)氨基酸序列的核苷酸序列可連接至重組抗體載體。例如，用于擴增可變區(qū)的PCR引物可包括用于將5’和3’限制性內(nèi)切核酸酶位點并入至PCR擴增產(chǎn)物中的限制性內(nèi)切核酸酶位點，然后，PCR擴增產(chǎn)物在連接至重組抗體載體之前用合適的限制性內(nèi)切核酸酶進(jìn)行后續(xù)的部分消化。根據(jù)本實施方式,本發(fā)明的試劑盒可還包括DNA連接酶。擴增產(chǎn)物插入至重組表達(dá)載體之后，可以制備除了重組抗體載體和可變區(qū)提供的那些以外不包含額外的氨基酸殘基的重組抗體。適用于重組抗體生產(chǎn)的宿主細(xì)胞可以是真核或原核來源的，包括細(xì)菌、酵母、植物、昆蟲和比如哺乳動物的動物。例如，可使用革蘭氏陰性菌(比如大腸桿菌(E. coli))以及革蘭氏陽性菌(t匕如芽孢桿菌屬(Bacillus)物種，包括但不限于短芽孢桿菌(B. brevis)、枯草芽孢桿菌(B. subtilis)和巨大芽抱桿菌(B. megaterium))。適用于重組抗體生產(chǎn)的酵母細(xì)胞的非限制性實例包括巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)、釀酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)和微小畢赤酵母(Ogataea minuta),盡管不限于此。還可在轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中生產(chǎn)重組抗體。轉(zhuǎn)基因植物的非限制性實例包括物種，比如煙草(Nicoiania tabacum)、稻(Oryza sativa)、大豆(Glycine max)和馬鈴薯(Solanum tuberosum)。通過實例的方式,抗體的植物生產(chǎn)綜述于Hellwig, 2004 中。在優(yōu)選實施方式中，宿主細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。哺乳動物宿主細(xì)胞可包括中國倉鼠卵巢(CH0)、HEK293T、NS0、BHK和PER-6細(xì)胞，盡管不限于此。通過實例的方式，抗體的哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)綜述于Wurm，2004中。重組抗體表達(dá)構(gòu)建物可通過本領(lǐng)域熟知的“基因轉(zhuǎn)移”方法引入到宿主細(xì)胞中。這些包括電穿孔、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、熱休克和微粒轟擊法(microparticle bombardment),盡管不限于此。需要時,這些基因轉(zhuǎn)移方法可用于影響宿主細(xì)胞的重組抗體的穩(wěn)定或瞬時表達(dá)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域熟知的多種技術(shù)的任何一種從宿主細(xì)胞中分離、純化或富集重組抗體。這些包括蛋白A或蛋白G純化、硫酸銨沉淀和尺寸排阻色譜法，其可單獨或聯(lián)合使用?；蛘?，重組抗體可包括融合配偶體氨基酸序列(通常在C-端)來輔助純化。融合配偶體包括表位標(biāo)簽(如FLAG、HA、C-myC)，或輔助親和純化的氨基酸序列，比如金屬結(jié)合(如6XHis)、谷胱甘肽結(jié)合(如GST)或直鏈淀粉結(jié)合(如MBP)融合配偶體序列?？赏ㄟ^參考如下非限制性實施例容易地理解本發(fā)明并付諸實踐。 實施例實施例I重組抗體載體的設(shè)計和構(gòu)建Ig可變區(qū)經(jīng)鑒定在N端處或其附近包括谷氨酸(E)殘基，并且在C端處或其附近包括亮氨酸(L)。這種特征似乎在約10%的可變區(qū)中出現(xiàn)。通過去除間隔序列，可以構(gòu)建載體，其用核苷酸序列GAG CTC編碼氨基酸EL，從而形成SacI位點?？勺儏^(qū)核苷酸序列在SacI位點中的插入導(dǎo)致EL序列的“分開”，從而E殘基在可變區(qū)N端，而L在可變區(qū)C端。這避免了外來氨基酸的加入，E和L殘基通常在可變區(qū)N和C端處或其附近發(fā)現(xiàn)?！癿AbXpress”重組抗體載體的示意性描述在圖I中提供。方法在信號肽之后包括單個限制性位點來允許可變區(qū)的插入。然后設(shè)計與In Fusion 系統(tǒng)兼容的引物。 載體 I :IgGl HC 骨架 載體 2 :IgG4 HC 骨架·載體 3 Kappa LC 骨架載體I和2 :不帶插入的可變區(qū)的重鏈序列:IgGl重鏈的序列MGffSCIILFLVATATGVHSELTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSffNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNffYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDffLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEffESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*(SEQ ID NO :2)IgG4重鏈的序列MGffSCIILFLVATATGVHSELTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSffNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNffYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDffLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEffESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRffQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO :3)
注解
_6]信號肽帶有粗體的E和L殘基的可變區(qū)恒定區(qū)為了插入，利用了存在于可變區(qū)第一位的殘基E和倒數(shù)第五位的殘基L之間的單個SacI位點VHS E-PCR 產(chǎn)物插入和 IN FUSION 克隆位點-L TVSSASTKG
EL密碼子是GAG CTC并形成SacI位點。然后，設(shè)計引物以允許免疫球蛋白可變區(qū)的框內(nèi)插入。對于IgGl和4序列，這是相同的情況。載體3 :輕鏈MGffSCIILFLVATATGVHSELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQffKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*(SEQ ID NO :4)注解信號肽帶有粗體的E和L殘基的可變區(qū)恒定區(qū)In Fusion引物載體重疊核苷酸用斜體表示SacI限制性位點核苷酸是粗體為了插入，利用了存在于可變區(qū)第一位的殘基E和倒數(shù)第二位的殘基L之間的單個SacI位點VHS E-PCR產(chǎn)物插入和IN FUSION克隆位點-LKRTVAAEL密碼子是GAG CTC并形成SacI位點。然后，設(shè)計引物以允許免疫球蛋白可變區(qū)的框內(nèi)插入。“In Fusion 系統(tǒng)”的引物重鏈克隆-可變區(qū)正向引物起始于可變區(qū)氨基酸2(E)0-設(shè)計反向引物以使開始的堿基編碼可變區(qū)的倒數(shù)第五位的(L)氨基酸-引物將在IgGl和4中都發(fā)揮作用IgG HC克降載體:具有SacI線性化位點(下劃線)的載體序列MGffSCI ILFLVATATGVHSELTVatgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtgtccactccgagctcaccgtgSSASTKGPSVFPLAPSS (SEQ ID NO 5)Tcctccgcctccaccaagggcccttccgtgttccctctggccccttcctccaagtc(SEQ ID NO 6)Atgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtgtccactcc(SEQ ID NO 7)Atgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtgtccactccgagctc (SEQIDNO 8)IgGl和4HC的In Fusion克降所所需的同源區(qū)正向CAGGTGTCCACTCCGAG 基因特異性引物(SEQ ID NO 9)反向GCGGAGGACACGGTGAG 基因特異性引物(SEQ ID NO :10)可變區(qū)IgGl和4HC In Fusion克隆的實例Agen Ab2 HC的實例基因特異性引物正向AGGTGCAGCTGAAGGAGTCCGGC(SEQ ID NO :11)反向AGTGTGGTGCCCTGGCCCCAGTAG(SEQ ID NO :12) (CTACTGGGGCCAGGGCACCACA 的反向互補；SEQ ID NO :13)AG序列確保E復(fù)位于5’端且L復(fù)位于3’端infusion_l CAGGTGTCCACTCCGAGGTGCAGCTGAAGGAGTCCGGC(SEQ IDNO :14)infusion_2 GCGGAGGACACGGTGAGTGTGGTGCCCTGGCCCCAGTAG(SEQ IDNO :15)克隆圖表I. PCR 產(chǎn)物per (+)CAGGTGTCCACTCCGAGGTGC.....ACCACACTCACCGTGTCCTCCGC(SEQ ID NO 16)per (-)GTCCACAGCTGAGGCTCCACG.....TGGTGTGAGTGGCACAGGAGGCG(SEQ ID NO :17)2.線性化載體TGVHSELTVSSAS (SEQ IDNO :18)vec (+)··· ACCGCCACCGGAGTGCATTCCGAGCT. CACCGTGTCCTCCGCCTCCACCAAGG. · · (SEQID NO19)vec (-)··· TGGCGGTGGCCTCACGTAAGGC. TCGAGTGGCACAGGAGGCGGAGGTGGTTCC. · · (SEQID NO20)3.退火per(+)CAGGTGTCCACTCCGAGGTGC. · · ACCACACTvec (+)··TGGTGGCCACCGCCA| | | | | | | | | | | | | | | · · · CACCGTGTCCTCCGCCTCCACCAAGG...vec(-)____TGGCGGTGTCCACAGGTGAGGC.........I I I I I I I I I I I I I I I GAGGTGGTTC
C...per (-)TCCACG. · · TGGTGTGAGTGGCACAGGAGGCGper (+) = (SEQ ID NO :22 ；vec(+) = (SEQ ID NO :23) ；vec(-) = (SEQ IDNO :24)；per (-) = (SEQ ID NO :25)IrG Kappa LC 克隆載體具有SacI線性化位點(下劃線)的載體序列(SEQ ID NO 26&27)MGffSCI ILFLVATATGVHSELKRatgggctggtcctgcatcatcctgtttctggtggccaccgccaccggcgtgcactccgagctcaagcggTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTaccgtggccgctccttccgtgttcatcttccctccctccgacgagcagctgaagtccggcaccKappa LC的In Fusion克隆所需要的同源區(qū)正向CCGGCGTGCACTCCGAG 基因特異性引物(SEQ ID NO :28)
反向GCCACGGTCCGCTTGAG 基因特異性引物(SEQ ID NO :29)在同源區(qū)之后的“AG” 二核苷酸確保插入位于框內(nèi)并且在可變區(qū)序列中保留E和
L氨基酸?？勺儏^(qū)的IgG Kappa LC In Fusion 克隆實例Agen Ab2Kappa的實例基因特異性引物正向-MATCGTGATGACCCAGTCCCAG(SEQ ID NO 30)反向AGCTCCAGCTTGGTGCCAGCGC(SEQ ID NO :31)(GCGCTGGCACCAAGCTGGAG 的反向互補；SEQ ID NO :32) AG序列確保E重位于5’端且L重位于3’端In Fusion引物斜體是載體重疊，且加黑的是基因特異性的infusion_l CCGGCGTGCACTCCG AGATCGTGATGACCCAGTCCCAG (SEQ ID NO :33)infusion_2 GCCACGGTCCGCTTG AGCTCCAGCTTGGTGCCAGCGC (SEQ ID NO :34)克隆圖表I. PCR 產(chǎn)物per (+)CCGGCGTGCACTCCGAGATCGTGATGACCCAGTCCCAG. · · · GCGCTGGCACCAAGCTGGAGCTCAAGCGGACCGTGGC(SEQ ID NO :35)per (-)GGCCGCACGTGAGGCTCTAGCACTACTGGGTCAGGGTC. · · · CGCGACCGTGGTTCGACCTCGAGTTCGCCTGGCACCG(SEQ ID NO :36)2.線性化載體TGVHSEL KRTVAAPS (SEQ ID NO :37)vec (+)··· ACCGCCACCGGAGTGCATTCCGAGCT. CAAGCGGACCGTGGCCGCTCCTTCCG. · · (SEQID NO38)vec (-)··· TGGCGGTGGCCTCACGTAAGGC. TCGAGTTCGCCTGGCACCGGCGAGGAAGGC. · · (SEQID NO39)3.退火per (+)...................CCGGCGTGCACTCCGAGATCGTGA. · · · CTGGAGCTvec(+)··· TGGTGGCCACCGCCA| | | | | | | | | | | | | | | · · · · CAAGCGGACCGTG...vec (-)TGGCGGTGGCCGCACGTGAGGC. . | | | | | | | | | | | | | | GCGAGGper (-)..........................TCTAGCACT. . . . GACCTCGAGTTCGCCTGGCACCGper (+) = (SEQ ID NO :40 ；vec(+) = (SEQ ID NO :41) ；vec(-) = (SEQ IDNO :42)；per (-) = (SEQ ID NO :43)實施例2抗⑶83重組抗體的生產(chǎn)I.方法和材料I. I表達(dá)載體的設(shè)計。如實施例I中所述，使用公開可獲得的人恒定區(qū)重鏈(IgGl和IgG4亞型)和輕鏈(K )序列來組裝mAbXpress載體。合成需要的DNA并且利用Geneart AG (德國)優(yōu)化哺乳動物表達(dá)的密碼子。然后這些序列盒置于含有用于在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)、選擇和擴增的序列的哺乳動物表達(dá)載體中(圖I)。單個SacI位點包含在表達(dá)載體中以便有助于可變區(qū)的線性化和In Fusion 克隆(細(xì)節(jié)見第3部分)。I. 2針對⑶83的噬菌體展示篩選(panning)以及scFV的非連接依賴性的、InFusion 克隆人CD83的胞外結(jié)構(gòu)域表達(dá)于CHO細(xì)胞中并通過固定化金屬親和色譜進(jìn)行純化。這種制備用于從Sheets的人scFv卩遼菌體展示文庫中分離結(jié)合因子(Sheets等人，1998),其由James D. Marks博士友情提供(加利福尼亞大學(xué),San Francisco)。分離出多種重組⑶83的獨特結(jié)合因子，選擇克隆3C12用于克隆和表達(dá)。從噬菌粒載體中使用針對各鏈5’和3’保守區(qū)的引物對重鏈和kappa輕鏈的可變區(qū)進(jìn)行PCR擴增。對應(yīng)著目標(biāo)載體的上游和下游堿基的額外15bp包含在各引物中以便能夠進(jìn)行非連接依賴性的In FusionTM克隆。重鏈的實例引物是3C12_Vh正向5' -CAGGTGT CCACTCCGAGGTGCAGCTGCAGGAG-3’ (SEQ ID NO 44)和 3C12_Vh 反向 5’ - GCGGAGGACACGGTGAGCGTGGTCCCTTGGCCC-3’ (SEQ ID NO :45)，并且 Kappa 鏈引物是3C12_Vk 正向 5’ - CCGGCGTGCACTCCGAGATCGTGATGACCCAG-3’，(SEQ ID NO 46)和 3C12_Vk 反向 5’ - GCCACGGTCCGCTTGAGTTCCAGCTTGGTCCC-3’，(SEQ ID NO :47)。下劃線區(qū)代表scFv特異性序列，其在克隆之間不同。使用InFusion 系統(tǒng)(Clontech)將PCR產(chǎn)物插入至mAbXpress重鏈和輕鏈載體中。I. 3哺乳動物細(xì)胞表達(dá)和純化使用線性PEI-Max (在水中制備的)(Polysciences Inc)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到適于懸浮的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中。對于瞬時表達(dá)研究，每毫升細(xì)胞(I. 5 X IO6細(xì)胞/mL)用
I.6μ gDNA和5. 6μ gPEI進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在OptiPro SFM培養(yǎng)基(Invitrogen)中制備。加入細(xì)胞懸液之前，復(fù)合物在室溫下不間斷地孵育15分鐘。轉(zhuǎn)染后4小時，通過加倍總體積來稀釋細(xì)胞，在培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至32° C之前，以O(shè). lmg/L加入IGF-1。分泌的抗體使用蛋白質(zhì)A色譜進(jìn)行純化。然后，純化的抗體(3C12)通過SDS-PAGE以及在Agilent 1200系列LC上使用BioSep-SEC_S3000 (Phenomenex)的分析型尺寸排阻色譜(SEC)進(jìn)行分析。使用凝膠過濾標(biāo)準(zhǔn)(Bio-Rad)進(jìn)行校準(zhǔn)。I. 4利用流式細(xì)胞儀分析抗體結(jié)合用2. 5 μ g/mL純化的3C12mAb或同種型對照(人IgGl κ ；Sigma)對一百萬個活細(xì)胞(KH-H2、L428和FDCP1)在4° C染色I(xiàn)小時。使用經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS) 1:50稀釋的FITC綴合的抗人Fe抗體(Cappel, ICN Pharmaceuticals Inc)檢測結(jié)合的抗體。在FACSCalibur (Becton Dickinson)上進(jìn)行流式細(xì)胞分析，并在 FCS Express 版本 3 (De NovoSoftware)上進(jìn)行分析。I. 5淋巴因子激活的殺傷(LAK)細(xì)胞的產(chǎn)生使用Ficol-Paque密度梯度分離來分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。根據(jù)制造商說明書用CD56微珠(Miltenyi )在VarioMACS分離器上純化NK細(xì)胞。在具有6000IU/mL人IL-2(Boehringer Mannheim)的 RPMI-10 (100U/mL 青霉素、100 μ g/mL 鏈霉素、I XGlutaMAX 和10%胎牛血清(均來自Invitrogen))中，在37° C、5%C02培養(yǎng)細(xì)胞48小時。去除上清之前，通過在冰上孵育30分鐘來收獲細(xì)胞，隨后在含有296EDTA的冰冷的PBS中孵育30分鐘；重懸于RPMI-IO中之前將所有收獲的細(xì)胞洗滌兩次。I. 651-鉻釋放分析用CD83+人細(xì)胞系進(jìn)行功能分析來確定淋巴因子激活的殺傷(LAK)細(xì)胞在人抗h⑶83IgGl存在時是否可以誘導(dǎo)抗體依賴性的細(xì)胞的細(xì)胞毒(ADCC)裂解。用100 μ Ci51Cr在 TD 緩沖液(140mM NaCl, 5 μ MKCl、25y MTris-HCl [ρΗ7· 4]、0· 6 μ M Na2HPO4、1% 人血清白蛋白)中在37° C時對KM-H2細(xì)胞(le6細(xì)胞/mL)標(biāo)記45分鐘。用完全RPMI-10洗滌細(xì)胞兩次。在具有I X IO3 51Cr標(biāo)記的KM-H2細(xì)胞的V型底96孔板(Nunc)的每孔中放置5e4細(xì)胞/mL的LAK細(xì)胞。用5μ g/mL 3C12或作為人IgGl同種型對照的赫塞汀(Roche)處理細(xì)胞。各孔包含15 μ g/mL抗人CD16克隆3G8或鼠IgGl κ同種型對照(均來自BD Biosciences)至終體積150 μ I。用50 μ I RPMI-IO(自發(fā)釋放)或50 μ I 5%Triton-X_100(總釋放)制備含有l(wèi)e3細(xì)胞/mL KM-H2細(xì)胞的額外孔。各條件運行五個重復(fù)。在24° C、300Xg下離心5分鐘之前,各板在37° C、5%C02中孵育4小時。50 μ L上清與150 μ L OptiPhaseiiSuperMix^ 混合，并且用1450-MicroBeta閃爍計數(shù)器(均來自Wallac)分析每分鐘51Cr計數(shù)(cpm)。使用標(biāo)準(zhǔn)公式計算特異性細(xì)胞裂解％裂解=[(測試樣本cpm-自發(fā)cpm) / (總cpm-自發(fā)cpm) *100]。GraphPad Prism版本5. 01軟件用于進(jìn)行兩因素ANOVA02.結(jié)果與討論此處所述載體(圖I)克服了關(guān)于可變序列插入恒定區(qū)骨架的抗體片段重新格式化所面臨的多個主要挑戰(zhàn)。首先，這種方法是非序列依賴性的。由于scFv構(gòu)建物含有鄰近高變區(qū)的半保守框架，半保守框架序列可用作PCR的模板。這潛在地允許使用單個引物對來構(gòu)建完整的、充分組裝的抗體。最重要的是，這種特征意味該系統(tǒng)直接適用于高通量應(yīng)用和自動化。其次，不像很多重新格式化載體，插入位點不需要任何多余的堿基。這種額外的氨基酸引入至原始序列具有干擾抗體折疊和/或分子的功能、免疫原性和穩(wěn)定性的可能。我們已經(jīng)鑒別了半保守的谷氨酸(E)和亮氨酸(L)殘基，其分別在很多IgG可變區(qū)的N端和C端處出現(xiàn)(圖I)。編碼這兩種氨基酸的序列(GAGCTC)形成酶SacI的識別位點。這創(chuàng)建了一種線性化表達(dá)載體的理想方法，有助于使用非連接依賴性克隆通過In Fusion 系統(tǒng)(Clontech)插入可變區(qū)PCR產(chǎn)物。這種高效方法允許抗體快速重新格式化至最終的表達(dá)構(gòu)建物中。通過三次生物篩選(biopanning)針對重組hO)83胞外結(jié)構(gòu)域(AA1-144)的人scFv免疫球蛋白基因庫來獲得scFv噬菌體克隆(Sheets等人，1998)。這種克隆證明了對人霍奇金病衍生細(xì)胞系(KM-H2)表達(dá)的細(xì)胞表面⑶83的特異性結(jié)合(圖3)。對于各可變區(qū)使用與半保守框架兩側(cè)區(qū)域結(jié)合的引物，引物還含有所需的載體重疊，通過PCR擴增這種克隆，并使用In Fusion 系統(tǒng)(第2. 2部分)克隆至mAbXpress載體中。我們在CHO細(xì)胞中表達(dá)重新格式化的IgGlmAb，隨后是基于蛋白質(zhì)A的純化。SDS-PAGE和SEC分析(圖2)顯示，分子在我們的瞬時表達(dá)系統(tǒng)中良好表達(dá)，沒有可觀察到的降解或聚集。為了顯示獲得的抗體是有功能的，我們用重組抗⑶83分子(3C12mAb)的純化樣品來證明對CD83+人細(xì)胞系和hCD83-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的結(jié)合(圖3A)。此外，在鉻釋放功能分析中，在激活的自然殺傷(NK)效應(yīng)細(xì)胞存在時，3C12mAb誘導(dǎo)KM-H2細(xì)胞的顯著細(xì)胞裂解(圖3B )。然而這種抗體誘導(dǎo)的裂解在用抗⑶16mAb (3G8)封閉Fe Y IIIRa時被廢除。這表明純化的3C12mAb能夠介導(dǎo)ADCC，因為Fe γIIIRa表達(dá)在這種機制中的作用已被充分鑒定(PeI'USSia和Trinchieri，1984)。此外，為了測試這種系統(tǒng)的耐用性，我們還可以使用分離自鼠展示文庫的scFv克隆重復(fù)這一過程，其導(dǎo)致完整的嵌合單克隆的產(chǎn)生(數(shù)據(jù)未顯示)。目前，沒有簡單的、通用的方法用于將抗體片段(Fab、scFv.dAb)重新格式化為完整的、充分組裝的抗體?？贵w重新格式化的常規(guī)方法是抗體/實驗室特異性的并依賴于小心的、耗時間的序列分析和限制性酶切割和連接介導(dǎo)的克隆。這些方法也可以導(dǎo)致外來氨基酸的引入，其可能對蛋白質(zhì)折疊和/或生物活性有深遠(yuǎn)的影響。此外，所需載體的公共可用性有限(Persic等人，1997)。我們在本發(fā)明中描述了一種用于功能性重組單克隆抗體的快速重新格式化和表達(dá)的載體系統(tǒng)，其操作基本上不依賴于可變區(qū)序列。這在藥物發(fā)現(xiàn)和篩選期間對于需要大量可變區(qū)克隆的應(yīng)用尤其有吸引力。貫穿本說明書，目的是要描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方式而非將本發(fā)明限制于任何一個實施方式或特征的特定組合?？蓪Υ颂幩龊驼f明的實施方式進(jìn)行各種變化和改進(jìn)，而 并不悖于本發(fā)明的廣泛精神和范圍。本說明書引用的所有計算機程序、算法、專利和科學(xué)文獻(xiàn)通過引用將其全部納入此處。參考文獻(xiàn)Aggarwalj S. 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權(quán)利要求
1.一種重組抗體載體，其包括(a)核苷酸序列(i)其包括編碼免疫球蛋白可變區(qū)氨基酸序列的限制性內(nèi)切核酸酶位點；和(ii)其在和(i)相同的閱讀框中編碼免疫球蛋白恒定區(qū)氨基酸序列，其中編碼(iii)免疫球蛋白可變區(qū)氨基酸序列的另ー核苷酸序列在與(ii)相同的閱讀框中插入至限制性內(nèi)切核酸酶位點；以及(b) —個或更多個有效地連接或連結(jié)至所述核苷酸序列的調(diào)節(jié)性核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組抗體載體，其中(i)中的氨基酸序列包括在不同的免疫球蛋白可變區(qū)中至少部分保守的多個氨基酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或權(quán)利要求2所述的重組抗體載體，其中(i)中的氨基酸序列包括谷氨酸(E)和/或亮氨酸(L)殘基。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的重組抗體載體，其中(i)中的氨基酸序列是EL。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的重組抗體載體，其中限制性內(nèi)切核酸酶位點是SacI位點。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的重組抗體載體，其中(ii)中的免疫球蛋白恒定區(qū)氨基酸序列包括免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)氨基酸序列或免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組抗體載體，其中(ii)中的免疫球蛋白恒定區(qū)氨基酸序列是IgG恒定區(qū)氨基酸序列。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的重組抗體載體，其中所述重組抗體載體的核苷酸序列還編碼(iv)信號肽氨基酸序列。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的重組抗體載體，其中編碼(iii)的免疫球蛋白可變區(qū)氨基酸序列的所述另ー核苷酸序列在與(ii)相同的閱讀框中插入至重組抗體載體中的限制性內(nèi)切核酸酶位點，而除了(i)、(ii)和(iii)中存在的那些以外，不編碼任何額外的氨基酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組抗體載體，其中(iii)中的所述另ー核苷酸序列插入至重組抗體載體，以便(a)中的所述核苷酸序列編碼連續(xù)的氨基酸序列，其包括(i)中的氨基酸序列的第一個氨基酸、(iii)的氨基酸序列、(i)中的氨基酸序列的第二個氨基酸以及(ii)的氨基酸序列。
11.ー種試劑盒，其包括根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項所述的重組抗體載體以及用于將編碼免疫球蛋白可變區(qū)氨基酸序列的所述另ー核苷酸序列插入至載體的ー種或更多種試劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的試劑盒，其中一種或更多種試劑包括限制性內(nèi)切核酸酶和/或一種或更多種用于將核苷酸序列插入至載體中的酶。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的試劑盒，其包括用于將編碼免疫球蛋白可變區(qū)氨基酸序列的(iii)的所述另ー核苷酸序列非連接酶依賴性克隆(LIC)至所述載體的酶。
14.ー種生產(chǎn)重組抗體表達(dá)構(gòu)建物的方法，其包括將編碼免疫球蛋白可變區(qū)氨基酸序列的(iii)的所述另ー核苷酸序列插入至根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項所述的重組抗體表達(dá)載體的步驟。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中編碼免疫球蛋白可變區(qū)氨基酸序列的(iii)的所述另ー核苷酸序列通過非連接酶依賴性克隆(LIC)插入至重組抗體表達(dá)載體。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或權(quán)利要求15所述的方法，其中(iii)的插入的核苷酸序列編碼免疫球蛋白重鏈可變區(qū)氨基酸序列或免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)氨基酸序列的免疫球蛋白可變區(qū)氨基酸序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求14至16任一項所述的方法，其中(iii)的所述另ー核苷酸序列編碼免疫球蛋白可變區(qū)的至少ー個互補決定區(qū)(CDR)的氨基酸序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中(iii)的所述另ー核苷酸序列編碼免疫球蛋白可變區(qū)⑶Rl、⑶R2和⑶R3區(qū)的各自氨基酸序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求14至18任一項所述的方法，其中由(iii)的所述另ー核苷酸序列編碼的免疫球蛋白可變區(qū)氨基酸序列是IgG可變區(qū)氨基酸序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求14至19任一項所述的方法，其中所述另ー核苷酸序列插入至重組抗體載體，以使(a)中的所述核苷酸序列編碼連續(xù)的氨基酸序列，其包括(i)中的氨基酸序列的第一個氨基酸、(iii)的氨基酸序列、(i)中的氨基酸序列的第二個氨基酸以及(ii)的氨基酸序列。
21.ー種根據(jù)權(quán)利要求14至20任一項所述的方法生產(chǎn)的重組抗體表達(dá)構(gòu)建物。
22.—種重組抗體表達(dá)構(gòu)建物，其包括根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項所述的重組抗體載體，以及編碼免疫球蛋白可變區(qū)氨基酸序列或其片段的(iii)的所述核苷酸序列。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的重組抗體表達(dá)構(gòu)建物，其中(iii)的核苷酸序列編碼免疫球蛋白重鏈可變區(qū)氨基酸序列或免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)氨基酸序列的免疫球蛋白可變區(qū)氨基酸序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的重組抗體表達(dá)構(gòu)建物，其中(iii)的所述另ー核苷酸序列編碼免疫球蛋白可變區(qū)的至少ー個互補決定區(qū)(CDR)的氨基酸序列。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的重組抗體表達(dá)構(gòu)建物，其中(iii)的所述另ー核苷酸序列編碼免疫球蛋白可變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3區(qū)的各自氨基酸序列。
26.根據(jù)權(quán)利要求22至25任一項所述的重組抗體表達(dá)構(gòu)建物，其中由(iii)的所述另一核苷酸序列編碼的免疫球蛋白可變區(qū)氨基酸序列是IgG可變區(qū)氨基酸序列。
27.根據(jù)權(quán)利要求22-26任一項所述的重組抗體表達(dá)構(gòu)建物，其中(a)中的所述核苷酸序列編碼連續(xù)的氨基酸序列，其包括(i)中的氨基酸序列的第一個氨基酸、(iii)的氨基酸序列、(i)中的氨基酸序列的第二個氨基酸以及(ii)的氨基酸序列。
28.—種宿主細(xì)胞，其包括根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項所述的重組抗體載體或根據(jù)權(quán)利要求21至27任一項所述的重組抗體表達(dá)構(gòu)建物。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的宿主細(xì)胞，其是植物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞。
30.ー種生產(chǎn)重組抗體的方法，其包括從根據(jù)權(quán)利要求28或權(quán)利要求29所述的宿主細(xì)胞中分離、純化或富集重組抗體的步驟。
31.一種由根據(jù)權(quán)利要求21至28任一項所述的重組抗體表達(dá)構(gòu)建物編碼的，或者根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法生產(chǎn)的重組抗體。
全文摘要
用于生產(chǎn)單鏈重組抗體的重組抗體載體包括(a)連續(xù)核苷酸序列；(i)其包括編碼免疫球蛋白可變區(qū)氨基酸序列的限制性內(nèi)切核酸酶位點；和(ii)其在和(i)相同的閱讀框中編碼免疫球蛋白恒定區(qū)氨基酸序列，其中編碼(iii)免疫球蛋白可變區(qū)氨基酸序列的另一核苷酸序列可插入至在與(ii)相同的閱讀框中的限制性內(nèi)切核酸酶位點；以及(b)一個或更多個有效地連接(linked)或連結(jié)(connected)至所述核苷酸序列的調(diào)節(jié)性核苷酸序列，其中(i)中的氨基酸序列包括在不同免疫球蛋白可變區(qū)中保守的氨基酸。限制性內(nèi)切核酸酶位點可以是編碼保守氨基酸谷氨酸和亮氨酸的SacI位點。利用非連接酶依賴性的克隆有助于(iii)的核苷酸序列的框內(nèi)插入。
文檔編號C12N15/13GK102686730SQ201080060786
公開日2012年9月19日 申請日期2010年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月16日
發(fā)明者M·G·斯梅德, M·L·瓊斯, T·P·芒羅 申請人:亞賽特生物技術(shù)私人有限公司