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具有抗氧化作用的乳酸桿菌的制作方法

文檔序號(hào):494743閱讀:514來源:國知局
專利名稱:具有抗氧化作用的乳酸桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于包含用于預(yù)防或治療氧化應(yīng)激的益生菌的組合物的領(lǐng)域。
背景技術(shù)
所有活體均在其細(xì)胞內(nèi)維持還原環(huán)境。然而,由于線粒體的需氧代謝及其他因素,產(chǎn)生了諸如過氧化物和氧自由基的活性氧源性物質(zhì)(reactive oxygen-derivedspecies)。還原環(huán)境由諸如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶以及谷胱甘肽過氧化物酶的酶維持。如果正常的氧化還原狀態(tài)被破壞,活性氧物質(zhì)可破壞包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)且尤其是DNA的所有細(xì)胞組分。活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生與去除活性中間體毒性或修復(fù)由活性氧物質(zhì)引起的損害的能力之間的這種失衡被稱為氧化應(yīng)激。在人體內(nèi),氧化應(yīng)激是衰老和與衰老相關(guān)的退行性疾病的重要因素,所述退行性 疾病例如癌癥、關(guān)節(jié)炎、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、盧伽雷氏癥、帕金森氏病、心臟衰竭、阿爾茨海默病以及亨廷頓氏病。衰老的自由基理論認(rèn)為生物體衰老是由于細(xì)胞隨時(shí)間積累了由活性氧物質(zhì)導(dǎo)致的損害。本領(lǐng)域已知數(shù)株具有抗氧化特性的乳酸細(xì)菌(lactic acid bacteria)。例如,US6,884, 415公開了一種通過使含有具有Mn過氧化氫酶活性的植物乳酸桿菌(L. plantarum)菌株的食品在含錳的天然物質(zhì)存在下發(fā)酵而生產(chǎn)的抗氧化食品。該菌株的抗氧化特性依賴于錳的存在。WO 03/002131公開了發(fā)酵乳酸桿菌(L. fermentum)菌株(ME-3)及其用作抗氧化益生菌的用途。WO 00/20013公開了導(dǎo)致腸道中丙酸量增加的乳酸桿菌或丙酸桿菌菌株用于降低諸如IL-6、活性氧物質(zhì)以及粘附分子的氧化應(yīng)激因子水平的用途。該文獻(xiàn)中公開的優(yōu)選菌株是植物乳酸桿菌299v。Ikeda等人(2007,AEM 73:6404-6409)對(duì)飼喂乳酸細(xì)菌(乳酸桿菌和雙歧桿菌)的秀麗隱桿線蟲(C. elegans)與飼喂大腸桿菌(Escherichia coli)0P50 (秀麗隱桿線蟲的標(biāo)準(zhǔn)食物)的線蟲的壽命和沙門氏菌抗性進(jìn)行了比較。他們報(bào)道,與大腸桿菌0P50相比,所測(cè)試的所有乳酸桿菌或雙歧桿菌在提高壽命和沙門氏菌抗性方面均具有相似的作用。然而,未評(píng)價(jià)乳酸細(xì)菌對(duì)于經(jīng)受氧化應(yīng)激的線蟲的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人測(cè)試了與大腸桿菌飼喂對(duì)照相比乳酸細(xì)菌對(duì)經(jīng)受氧化應(yīng)激的秀麗隱桿線蟲的作用。他們發(fā)現(xiàn),與Ikeda等人對(duì)于有關(guān)壽命所觀察到的結(jié)果相比,僅非常少的特定乳酸桿菌菌株防止了這種施加的氧化應(yīng)激的損害作用。因此,本發(fā)明提供了本發(fā)明的發(fā)明人基于緩解過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對(duì)秀麗隱桿線蟲的影響的能力而篩選的乳酸桿菌菌株,當(dāng)其被體內(nèi)施用于受試者時(shí)用作抗氧化劑,并因此用于治療、緩解或預(yù)防氧化應(yīng)激相關(guān)的狀態(tài)(condition)或臨床表現(xiàn)。本發(fā)明的發(fā)明人所鑒定的乳酸桿菌菌株特別適于制備施用給(尤其以食物或膳食補(bǔ)充的形式)暴露于氧化應(yīng)激的哺乳動(dòng)物的抗氧化組合物,所述哺乳動(dòng)物特別是人,例如,老年人、輪班工作者、考試期間的學(xué)生、消防員、暴露于輻射或空氣污染的受試者。特別地,老年人是合適的目標(biāo)群體,這是因?yàn)槔匣哪c道和免疫衰老往往對(duì)氧化應(yīng)激和ROS的產(chǎn)生的有效抗性較低。因此,本發(fā)明的乳酸桿菌菌株特別適于通過營養(yǎng)干預(yù)而改善老年人的生
活質(zhì)量。
具體實(shí)施例方式
_9] 乳酸桿菌菌株本發(fā)明的發(fā)明人所篩選的三種具體的乳酸桿菌菌株描述如下第一種菌株是干酪乳酸桿菌(Lactobacillus casei)菌株DN 114001,其根據(jù)布達(dá)佩斯條約于1994年12月30日以保藏號(hào)1-1518保藏于法國國家微生物保藏中心 (CNCM, Collection Nationale de Cultures de Microorganisms, 25Rue du Docteur Roux,Paris)。該菌株的詳細(xì)特征在PCT申請(qǐng)WO 96/20607中公開。第二種菌株是鼠李糖乳酸桿菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株DN 116010,其根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2006年11月19日以保藏號(hào)1-3690保藏于法國國家微生物保藏中心。該菌株的詳細(xì)特征在PCT申請(qǐng)WO 2009/122042中公開。第三種菌株是鼠李糖乳酸桿菌菌株DN 116063,其根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2009年12月16日以保藏號(hào)1-4271保藏于法國國家微生物保藏中心。根據(jù)PCR分型和API 50CHL試劑盒(Biomerieux, france)上的生化活性,該菌株被鑒定為屬于鼠李糖乳酸桿菌。根據(jù)Api 50CHL結(jié)果,1-4271菌株發(fā)酵下述糖類和醇類核糖、半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、L-山梨糖、鼠李糖、甘露醇、山梨醇、甲基-D葡萄糖苷、N-乙酰葡糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、七葉苷(esculine)、水楊苷、纖維素、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、松三糖、P -龍膽二糖、D-松二糖、D-塔格糖、葡萄糖酸鹽(酯)。本發(fā)明還包括衍生自母體菌株CNM 1-1518、1-3690以及1-4271中任一種且仍具有抗氧化活性(即,能夠緩解H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對(duì)秀麗隱桿線蟲的影響)的突變菌株或遺傳轉(zhuǎn)化菌株用于抗氧化目的的用途。這些突變菌株或遺傳轉(zhuǎn)化菌株可為這樣的菌株即,其中母體菌株的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源基因已經(jīng)被突變,例如,修飾其一些代謝特性(例如,其發(fā)酵糖的能力、其對(duì)于酸的抗性、其經(jīng)受胃腸道中的運(yùn)輸?shù)拇婊钚?、其后酸化作用或其代謝物的產(chǎn)生)。它們還可為一種或多種目的基因遺傳轉(zhuǎn)化母體菌株而產(chǎn)生的菌株,例如,賦予所述菌株其他生理特性,或使其表達(dá)具有人們期望通過所述菌株而賦予的治療或接種效果的蛋白。本發(fā)明還包括新菌株1-4271,以及上文所述的其衍生的突變菌株或遺傳轉(zhuǎn)化菌株。優(yōu)選地,這些突變菌株或遺傳轉(zhuǎn)化菌株仍舊具有菌株1-4271的抗氧化能力。組合物本發(fā)明還包括包含乳酸桿菌菌株CNCM 1-1518、1-3690以及1-4271中的一株或多株或其所衍生的突變菌株或遺傳轉(zhuǎn)化菌株的組合物,當(dāng)體內(nèi)施用于受試者時(shí)將其用作抗氧化劑。在本發(fā)明的組合物中,所述乳酸桿菌菌株可以以活菌或非活菌的完整細(xì)菌形式使用??蛇x地,它們可以以細(xì)菌裂解物形式或細(xì)菌級(jí)分形式使用,適于該用途的細(xì)菌級(jí)分的選擇可例如通過檢測(cè)其緩解過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對(duì)秀麗隱桿線蟲的影響的特性而進(jìn)行。本發(fā)明的組合物可為適于施用,特別是口服施用的任何形式。這包括例如固體、半固體、液體以及粉末。液體組合物通常優(yōu)選用于較容易的施用,例如作為飲料。當(dāng)所述細(xì)菌為活菌形式時(shí),所述組合物通??稍诿靠烁芍亟M合物中包含IO5至IO13菌落形成單位(cfu),優(yōu)選至少IO6Cfu,更優(yōu)選至少IO7Cfu,還更優(yōu)選至少IO8Cfu,且最優(yōu)選至少109cfu。在液體組合物的情況下,這通常對(duì)應(yīng)于每毫升為IO4至IO12菌落形成單位(cfu),優(yōu)選至少IO5Cfu,更優(yōu)選至少IO6Cfu,還更優(yōu)選至少IO7Cfu,且最優(yōu)選至少109cfu。本發(fā)明的組合物的實(shí)例為營養(yǎng)組合物,包括食品,特別是乳制品。發(fā)酵乳制品形式的施用具有提供低氧化還原電位的食品的優(yōu)點(diǎn),該低氧化還原電位不僅有利于乳酸桿菌菌株生長或存活,還有利于消耗所述食品的人受試者的氧化應(yīng)激的進(jìn)一步治療和/或預(yù)防。 本發(fā)明的營養(yǎng)組合物還包括食物補(bǔ)充劑以及功能性食物?!笆澄镅a(bǔ)充劑”是指由通常用于食品的化合物制成的產(chǎn)品,但是該產(chǎn)品為片劑、粉末、膠囊、飲劑或通常與食物無關(guān)的任何其他形式,且對(duì)人們的健康具有益處?!肮δ苄允澄铩笔菍?duì)人們的健康也有益處的食物。特別地,食物補(bǔ)充劑和功能性食物可對(duì)疾病(例如慢性疾病)具有保護(hù)性或治愈性生理作用。本發(fā)明的組合物的其他實(shí)例為藥物組合物或化妝品組合物。本發(fā)明的組合物還可包含益生或非益生性乳酸細(xì)菌中的一種或多種其他菌株,例如選自乳酸桿菌屬、乳球菌屬、鏈球菌屬以及雙歧桿菌屬的一種或多種菌株。特別地,所述一種或多種其他菌株可包括一種或多種嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)菌株和/或一種或多種保加利亞乳酸桿菌(Lactobacillus bulgaricus)菌株。應(yīng)思本發(fā)明的乳酸桿菌菌株和組合物可用于抵御氧化應(yīng)激和/或預(yù)防氧化應(yīng)激導(dǎo)致的損害。因此,它們可用作被施用以用于治療或預(yù)防涉及氧化應(yīng)激的疾病的抗氧化劑。優(yōu)選地,所述乳酸桿菌菌株和組合物被施用于人,特別是遭受氧化應(yīng)激的人,更優(yōu)選老年人、輪班工作者、考試期間的學(xué)生、消防員以及暴露于輻射和/或空氣污染的受試者。因此,本發(fā)明提供了一種用于治療、緩解或預(yù)防有相應(yīng)需要的受試者的氧化應(yīng)激相關(guān)狀態(tài)的方法,其中,所述方法包括向所述受試者施用本發(fā)明的乳酸桿菌菌株或組合物。特別地,老年人是合適的目標(biāo)群體,這是因?yàn)槔匣哪c道和免疫衰老往往對(duì)氧化應(yīng)激和ROS的產(chǎn)生的有效抗性較低。氧化應(yīng)激也是衰老的重要因素衰老的自由基理論認(rèn)為生物體衰老是由于細(xì)胞隨時(shí)間積累了由活性氧物質(zhì)導(dǎo)致的損害。因此,本發(fā)明的乳酸桿菌菌株特別適于通過營養(yǎng)干預(yù)而改善老年人的生活質(zhì)量。老年人是年齡為55歲以上的人,特別是年齡為65歲以上的人。在人體中,氧化應(yīng)激還是退行性疾病的重要病原因素,所述退行性疾病例如癌癥、關(guān)節(jié)炎、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、盧伽雷氏癥、帕金森氏病、心臟衰竭、阿爾茨海默病以及亨廷頓氏病。因此,本發(fā)明的菌株和組合物可有利地施用于患有選自癌癥、關(guān)節(jié)炎、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、盧伽雷氏癥、帕金森氏病、心臟衰竭、阿爾茨海默病以及亨廷頓氏病組成的組中的疾病和/或具有患這些疾病的風(fēng)險(xiǎn)的人受試者。實(shí)施例I :在液體培養(yǎng)基中存在或不存在氧化應(yīng)激的情況下乳酸細(xì)菌對(duì)于秀麗隱桿線蟲存活的影響使用秀麗隱桿線蟲突變株(BA17fem-l(hcl7))進(jìn)行試驗(yàn),該突變株在25° C下不增殖但仍保留野生型的壽命特征。如下進(jìn)行BA17線蟲的同步化在20° C下從妊娠成蟲分離蟲卵,在加有5ug/ml膽固醇的M9培養(yǎng)基(10vol%MRS,氟代脫氧尿苷110ug/ml)中過夜孵化蟲卵,并在微滴定板的孔中分離L1期線蟲。在不振蕩的情況下于25° C和80-85%的相對(duì)濕度下培養(yǎng)線蟲3天。將這些幼蟲轉(zhuǎn)移至包含加有膽固醇的M9培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中,并于25° C和80-85%的濕度下培養(yǎng)3天,同時(shí)進(jìn)行對(duì)照或試驗(yàn)性飼喂。每孔中具有至少50條線蟲。3天后,當(dāng)線蟲達(dá)到成蟲期時(shí),通過添加5mM濃度的過氧化氫(H2O2)施加氧化應(yīng)激。對(duì)照則不使用H202。抗氧化抗性用5小時(shí)后通過顯微鏡評(píng)價(jià)的存活力(viability)表示。將線蟲在這些條件下溫育5小時(shí)。為了評(píng)價(jià)抗氧化能力 ,如果線蟲不能活動(dòng),則認(rèn)為它們死亡(受應(yīng)激)。給線蟲飼喂4*106cfu/ml的標(biāo)準(zhǔn)飼料大腸桿菌0P50或?qū)儆陔p歧桿菌屬、乳酸桿菌屬或鏈球菌屬的乳酸細(xì)菌的不同菌株。添加30 y g/ml的卡那霉素以防止測(cè)定過程中大腸桿菌0P50或所試驗(yàn)的乳酸細(xì)菌的生長。不存在氧化應(yīng)激下的存活在溫育期間不存在氧化應(yīng)激的情況下,飼喂大腸桿菌的線蟲的存活力在100%至約90%之間變化。如表I對(duì)于一些測(cè)試菌株所顯示的,乳酸細(xì)菌產(chǎn)生相似或更好的存活率,這提不具有相似或提聞的壽命。表I :飼喂乳酸細(xì)菌對(duì)秀麗隱桿線蟲壽命的影響
株-種存活力(%)
S2A-嗜熱鏈球菌95 7
SlB-嗜熱鏈球菌9870
S2B-嗜熱鏈球菌M~l
SlC-嗜熱鏈球菌9H
S ID-嗜熱鏈球菌9872
SlE-嗜熱鏈球菌100. 0
SlF-嗜熱鏈球菌95!
SlG-嗜熱鏈球菌98 2
SlH-嗜熱鏈球菌9771
L2A-嗜酸乳酸桿菌(L. acidophilus)91. 9
權(quán)利要求
1.乳酸桿菌(Lactobacillus)菌株,所述菌株能夠緩解由過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對(duì)秀麗隱桿線蟲(C. eIegans)的影響,用作治療、預(yù)防或緩解與氧化應(yīng)激相關(guān)的狀態(tài)的抗氧化齊Li,其中,所述菌株選自干酪乳酸桿菌(Lactobacillus casei )菌株CNCM-I 1518、鼠李糖乳酸桿菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株CNCM 1-3690以及鼠李糖乳酸桿菌菌株CNCM1-4271。
2.組合物,其包含權(quán)利要求I所述的一種或多種乳酸桿菌菌株,用作治療、預(yù)防或緩解氧化應(yīng)激狀態(tài)的抗氧化劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的乳酸桿菌菌株或權(quán)利要求2所述的組合物,其用作治療、預(yù)防或緩解受試者的氧化應(yīng)激狀態(tài)的抗氧化劑,所述受試者選自老年人、輪班工作者、考試期間的學(xué)生、消防員、暴露于輻射和/或空氣污染的受試者。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的乳酸桿菌菌株或權(quán)利要求2所述的組合物,其用作治療、預(yù)防或緩解選自癌癥、關(guān)節(jié)炎、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、盧伽雷氏癥、帕金森氏病、心臟衰竭、阿爾茨海默病以及亨廷頓氏病的氧化應(yīng)激狀態(tài)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物,其中,所述組合物是液體產(chǎn)品。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或5任一項(xiàng)所述的組合物,其中,所述組合物是乳制品。
7.根據(jù)權(quán)利要求2、5或6任一項(xiàng)所述的組合物,其中,所述組合物是發(fā)酵產(chǎn)品。
8.根據(jù)權(quán)利要求2或5-7任一項(xiàng)所述的組合物,其中,所述組合物每克干重包含IO5至1013cfu。
9.鼠李糖乳酸桿菌菌株CNCM1-4271。
10.包含權(quán)利要求9所述菌株的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有抗氧化作用的特定乳酸桿菌菌株。
文檔編號(hào)C12R1/245GK102858948SQ201080060947
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2010年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月8日
發(fā)明者詹弗蘭科·格龍波內(nèi), 瑪麗-克里斯蒂娜·德吉弗里, 索菲·勒格蘭-拉斯波, 伊莎貝爾·尚博, 拉斐爾·布爾代-西卡爾 申請(qǐng)人:熱爾韋·達(dá)諾尼公司
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