專利名稱：用于抑制vegf的組合物和方法
用于抑制VEGF的組合物和方法交叉參考相關申請本申請要求2009年12月4日提交的標題為“COMPOSITIONS AND METHODS FORINHIBITI ON OF VEGF”的美國臨時專利申請No. 61/266,645的優(yōu)先權權益，將其完整內容通過引用并入本文。政府利益不適用聯(lián)合研究協(xié)議的其他方不適用并入光盤上提交的參考材料不適用 背景I.發(fā)明領域不適用2.相關領域描述不適用發(fā)明概述血管生成(Angiogenesis),定義為新毛細血管的生長或“新血管形成(neovascularization) ”,在生長和發(fā)育中起著基礎性作用。在成熟的人中，起始血管生成的能力存在于所有組織中，但受到嚴格的控制。血管生成的關鍵調節(jié)劑是血管內皮生長因子(“VEGF”)，也稱為血管通透因子(vascular permeability factor,“VPF”)。當分泌的VEGF結合Flt-I和Flk-1/KDR受體(也稱為VEGF受體I和VEGF受體2)時，起始血管生成，所述受體在內皮細胞的表面上表達。Flt-I和Flk-1/KDR是跨膜蛋白酪氨酸激酶，并且VEGF的結合起始細胞信號級聯(lián)，從而最終導致周圍組織的新血管形成。在人中存在3種主要的不同的VEGF選擇性剪接形式(S卩，同種型)(VEGF121、VEGF165和 VEGF189)，然而還存在許多其它變體(VEGF2tl6、VEGF183、VEGF148、VEGF165b 和 VEGF145)。值得注意地，并非所有同種型都是促血管生成的。已證明，至少VEGF165b能夠抵消VEGF165誘導的血管生成效應。不受理論限制，VEGF165b似乎能夠阻止VEGF受體2的信號轉導。因此，VEGF165b的分泌可能能夠阻止或延遲病理狀態(tài)中的血管生成。異常血管生成或新血管的病理生長牽涉許多病況。這類病況包括糖尿病視網(wǎng)膜病變、銀屑病、滲出型老年性黃斑變性或濕性老年性黃斑變性(“ARMD ”)、類風濕性關節(jié)炎和其他炎性疾病以及大多數(shù)癌癥。與這些病況相關的患病組織或腫瘤表達異常高水平的VEGF，并且顯示高度的血管化或血管通透性。特別地，ARMD為臨床上重要的血管生成疾病。該病況的特征在于老齡化個體的一只或兩只眼中的脈絡膜新生血管化，并且是工業(yè)化國家中失明的主要原因。RNA干擾(在下文中稱為“RNAi”)是在許多真核生物中保守的轉錄后基因調控的方法。RNA i由存在于細胞中的短(即，少于30個核苷酸)雙鏈RNA(“dsRNA”)分子誘導。此類短dsRNA分子(稱為“短干擾RNA”或“siRNA”)引起與所述siRNA共有序列同一性(達到一個核苷酸的分辨率)的信使RNA ( “mRNA”)的破壞。據(jù)認為，siRNA和靶向的mRNA結合至“RNA誘導沉默復合體”或“RISC”，所述復合體切割靶向的mRNA。siRNA明顯被再循環(huán)，與多次周轉酶十分相似，I個siRNA分子能夠誘導約1000個mRNA分子的切割。siRNA介導的mRNA的RNAi降解從而比用于抑制靶基因的表達的目前可用的技術更有效。然而，此類方法并且不能直接轉變成用于治療疾病的治療劑。因此，所需要的是，在哺乳動物中以催化或亞化學計量的量選擇性抑制促血管生成VEGF的表達同時誘導或維持抗血管生成VEGF同種型的分泌的試劑。本公開內容涉及特異性靶向和引起來自VEGF及其同種型的mRNA的RNAi-誘導的降解的siRNA。本公開內容的siRNA化合物和組合物用于抑制血管生成，特別地用于治療癌性腫瘤、老年性黃斑變性及其它血管生成疾病。因此，本公開內容提供了靶向人VEGF mRNA或其選擇性剪接形式、突變體或同源物(cognate)的分離的siRNA。例如,在一個實施方案中，siRNA祀向促血管生成VEGF mRNA同種型例如 VEGF121、VEGF165、VEGF189、VEGF2tl6、VEGF183、VEGF148 和 / 或 VEGF145。在某些實施方案中，siRNA包含形成RNA雙鏈體的有義RNA鏈和反義RNA鏈。有義RNA鏈包含與靶mRNA中 的約19至約25個連續(xù)核苷酸的祀序列同一的核苷酸序列。本公開內容還提供了表達本文中公開的s iRNA的重組質粒和病毒載體，以及包含這樣的siRNA和藥學上可接受的載體的藥物組合物。本公開內容還提供了抑制人促血管生成VEGF mRNA或其選擇性剪接形式、突變體或同源物的表達，同時使抗血管生成VEGF mRNA免受降解的方法，包括給試者施用有效量的siRNA以便降解祀mRNA。本公開內容還提供了抑制受試者中的血管生成的方法，包括給受試者施用有效量的靶向促血管生成人VEGF mRNA或其選擇性剪接形式、突變體或同源物的siRNA。本公開內容還提供了治療血管生成疾病的方法,包括給有此治療需要的受試者施用有效量的靶向人促血管生成VEGF mRNA或其選擇性剪接形式、突變體或同源物的siRNA，以便與血管生成疾病相關的血管生成被抑制。附圖概述本申請的文件包含至少一張彩色照片或附圖。具有彩色附圖或照片的本專利的拷貝可在請求和支付必要的費用后由Patent and Trademark Office提供。為了更全面地理解本發(fā)明的性質和有利方面，應當結合附圖參考下列詳細描述，在所述附圖中圖IA和IB是不用siRNA( 、用非特異性siRNA( “非特異性”)或靶向人VEGFmRNA的siRNA ( “VEGF”)處理的缺氧293和HeLa細胞中的VEGF濃度(以pg/ml表示)的直方圖。還顯示了非缺氧293和HeLa細胞中的VEGF濃度(以pg/ml表示)。每一個條棒(bar)表示4個實驗的平均值，誤差為平均值的標準差。圖2是不用siRNA( 、用非特異性siRNA( “非特異性”)或靶向人VEGF mRNA的siRNA ( “VEGF”)處理的缺氧NIH 3T3細胞中的鼠VEGF濃度(以pg/ml表示)的直方圖。每一個條棒表示6個實驗的平均值，誤差為平均值的標準差。圖3是在GFP siRNA (深灰色條棒)或人VEGF siRNA (淺灰色條棒)存在的情況下，用表達人VEGF的腺病毒(“AdVEGF”)注射的小鼠的視網(wǎng)膜中的人VEGF濃度(pg/總蛋白)的直方圖。每一個條棒表不5只眼的平均值,誤差棒表不平均值的標準差。圖4是顯示視網(wǎng)膜下注射了 GFP siRNA的對照眼(N=9 ;“GFPsiRNA”)中和視網(wǎng)膜下注射了小鼠VEGF siRNA的眼(N=7;“小鼠VEGF siRNA”)中的激光誘導的CNV的平均面積(以mm2表不)的直方圖。誤差棒表不平均值的標準差。
圖5是pAAVsiRNA，用于產(chǎn)生本發(fā)明的重組AAV病毒載體的順式作用質粒的示意圖?！癐 TR” AAV末端反向重復；“U6” U6RNA啟動子；“sense” siRNA有義編碼序列；“Anti” : siRNA反義編碼序列;“PolyT” :聚胸苷(polythymidine)終止信號。圖6 顯示用小鼠抗-VEGF siRNA (“mVEGFl. siRNA”)或對照 siRNA (“GFP1. siRNA”)進行(A)視網(wǎng)膜下或⑶玻璃體內注射的小鼠眼的激光誘導的CNV的平均面積(以mm2表示)的直方圖。誤差棒表示平均值的標準差。(C)是在激光誘導后第I天用不具有siRNA的磷酸緩沖鹽溶液(“PBS” ;在激光誘導后第14天測量CNV面積)、在激光誘導后第14天用對照siRNA ( “GFP1. siRNA”;在激光誘導后第21天測量CNV面積)或在激光誘導后第14天用小鼠抗-VEGF siRNA( “mVEGFl. siRNA”;在激光誘導后第21天測量CNV面積)進行玻璃體內注射的小鼠眼中激光誘導的CNV的平均面積(以mm2表示)的直方圖。誤差棒表示平均值的標準差。圖7 是在注射后第 0(n=2 ;pre_siRNA 注射)、6 (n=3)、10 (n=3)和 14(n=3)天后用人抗-VEGF siRNA( “Cand5”)和對照siRNA( “GFP1. siRNA”)進行視網(wǎng)膜下注射的小鼠眼中的 VEGF 蛋白的百分比(“％VEGF”)的圖。％VEGF= (Cand5 眼中的[VEGF]/GFPI. siRNA 眼 中的[VEGF])*100。圖8是用人VEGF siRNA、非特異性siRNA (EGFP siRNA)轉染的293細胞中的hVEGF蛋白水平或無siRNA的模擬轉染的293細胞中的hVEGF蛋白水平的圖。圖 9 是利用 Cand5 (bevasrianib)、hVEGF#l、hVEGF#2、hVEGF#3、hVEGF#4、hVEGF#6和hVEGF#7進行的劑量響應研究的圖。

圖10是VEGF的不同同種型及其外顯子使用(usage)的示意圖。圖11是比較VEGF165與VEGF165b在外顯子7/8接合處上的同源性的示意圖。圖12描述了對于靶向VEGF165外顯子7/8接合處的不同siRNA，表達的VEGF蛋白的量。圖13描述了對于靶向VEGF165外顯子7/8接合處的不同siRNA，人VEGF蛋白的百分比敲低。圖14描述了對于靶向VEGF165外顯子7/8接合處的siRNA的二次篩選，表達的VEGF蛋白的量。圖15描述了對于靶向VEGF165外顯子7/8接合處的siRNA的二次篩選，人VEGF蛋白的百分比敲低。圖16描述了對于不同濃度的靶向VEGF165外顯子7/8接合處的siRNA的二次篩選，人VEGF蛋白的百分比敲低。圖17描述了對于靶向VEGF165外顯子7/8接合處的siRNA的二次篩選，在7天的時間中人VEGF蛋白的百分比敲低。圖18描述了使用RT-PCR測量的靶向VEGF165外顯子7/8接合處的siRNA對GAPDHmRNA表達的影響。圖19描述了使用RT-PCR測量的靶向VEGF165外顯子7/8接合處的siRNA對VEGF165mRNA表達的影響。圖20描述了使用RT-PCR測量的靶向VEGF外顯子7/8接合處的siRNA對VEGF189mRNA表達的影響。
圖21描述了使用RT-PCR測量的靶向VEGF外顯子7/8接合處的siRNA對VEGF121mRNA表達的影響。圖22描述了使用RT-PCR測量的靶向VEGF165外顯子7/8接合處的siRNA對VEGF165bHiRNA表達的影響。在約600bp處的兩條帶是人工假像。圖23描述了在用選擇的s i RNA處理后ARPE19細胞的細胞因子譜。圖24描述了 siRNA對由ARPE19細胞分泌的總VEGF蛋白的影響。圖25描述了 siRNA對由ARPE19細胞分泌的總VEGF蛋白的影響。圖26描述了 siRNA對由ARPE19細胞分泌的總VEGF蛋白的影響。圖27描述了 siRNA對由ARPE19細胞分泌的總VEGF蛋白的影響。 圖28描述了在不同的溫度條件下隨時間過去bevasiranib的穩(wěn)定性。圖29描述了在不同的溫度條件下隨時間過去bevasiranib的穩(wěn)定性。圖30描述了在不同的溫度條件下隨時間過去0PK-HVB-004的穩(wěn)定性。圖31描述了在不同的溫度條件下隨時間過去0PK-HVB-009的穩(wěn)定性。圖32描述了在不同的溫度條件下隨時間過去0PK-HVB-010的穩(wěn)定性。圖33描述了在3’末端上人、大鼠和小鼠VEGF序列之間的同源性。圖34描述了 siRNA對C6細胞分泌大鼠VEGF的影響。圖35描述了 siRNA對NIH3T3細胞分泌小鼠VEGF的影響。圖36描述了 siRNA對ARPE19細胞分泌VEGF的影響。圖37描述了 siRNA對ARPE19細胞分泌VEGF的影響。圖38描述了 siRNA對ARPE19細胞分泌VEGF的影響。圖39描述了 siRNA對NIH3T3細胞分泌小鼠VEGF的影響。圖40描述了 s iRNA對ARPE19細胞中的VEGF mRNA信使的影響。圖41描述了 siRNA對C6細胞中的VEGF表達的影響。發(fā)明詳述在描述本發(fā)明的組合物和方法之前，應理解，本發(fā)明不限定于所描述的具體過程、組合物或方法，因為這些可以變化。還應理解，說明書中使用的術語僅僅是為了描述特定形式或實施方案，并且無意限定本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍將僅由所附權利要求限定。除非另外定義，否則本文中所用的所有技術和科學術語具有本領域技術人員通常理解的含義。雖然與本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料可用于實施或測試本發(fā)明的實施方案，但現(xiàn)描述優(yōu)選的方法、裝置和材料。將本文中提及的所有出版物通過引用整體并入本文。此處的任何信息都不能被解釋為承認，沒有權利通過在先發(fā)明而使本發(fā)明早于這樣的公開物。還必須指出，如本文和所附權利要求中使用的，除非上下文另外明確地指出，否則單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括復數(shù)所指物。因此，例如，“分子”是指一個或多個分子和本領域技術人員已知的其等同物等。如本文中所使用的，術語“約”意指，與其一起使用的數(shù)字的數(shù)值的正或負10%。因此，約50%意指在45%-55%的范圍內。如本文中所使用的，“受試者”包括人類或非人動物。在某些實施方案中，受試者是人類。如本文中所使用的，“有效量”的siRNA是足以引起細胞中的靶mRNA的RNAi介導的降解的量。術語臨床上有效量是，當給受試者施用時，將通過RNA沉默抑制受試者的血管生成的進展的量。如本文中所使用的，“分離的”意指通過人干預從天然狀態(tài)改變的或取出的。例如，天然存在于活動物中的siRNA不是“分離的”，但合成的siRNA或與其天然狀態(tài)的共存材料部分或完全分離的siRNA是“分離的”。分離的siRNA可以以大體上純的形式存在，或可存在于非天然環(huán)境(例如已將所述siRNA遞送入其中的細胞)中。如本文中所使用的，“靶mRNA”意指包含與siRNA反義鏈互補的有義序列的mRNA。這樣的靶mRNA不必與siRNA反義鏈具有100%同源性，只要siRNA能夠沉默靶mRNA或另外地與靶mRNA形成RISC復合物。特別用于本公開內容的方法的靶mRNA包括例如，促血管生成 VEGFmRNA 同種型例如 VEGF121、VEGF165 和 VEGF189、VEGF206, VEGF183、VEGF148 和 VEGF145 及其組合。在某些其它實施方案中，靶mRNA不包括抗血管生成VEGF165bmRNA，但 靶向至少一種其它的VEGF同種型。如本文中所使用的，術語“部分不互補”意欲表示這樣的siRNA序列，所述siRNA序列，雖然可能與非靶序列共有一定的序列同源性，但仍然充分不同以致對于非靶序列不發(fā)生RNA沉默。部分不互補包括與非靶序列具有90%同源性、85%同源性、80%同源性、75%同源性、70%同源性、65%同源性、60%同源性、55%同源性、50%同源性、45%同源性、40%同源性、35%同源性、30%同源性、25%同源性、20%同源性、15%同源性、10%同源性、5%同源性、2%同源性和1%同源性的序列。與非靶序列完全不同源的序列被認為是與序列不互補的。如本文中所使用的，基因或mRNA與人VEGF或來自另一個哺乳動物物種的與人VEGF具有同源性的mRNA“同源(cognate)”。例如，來自小鼠的同源VEGF mRNA示于SEQ IDNO: I 中。除非另外指出，否則本文中的所有核酸序列以5’至3’方向給出。同樣地，核酸序列中的所有脫氧核糖核苷酸由大寫字母顯示(例如，脫氧胸苷為“T”)，并且核酸序列中的核糖核苷酸由小寫字母顯示(例如，尿苷為“U”)。包含靶向VEGF及其各種同種型的siRNA的組合物和方法可用于抑制血管生成，特別地用于治療血管生成疾病。siRNA據(jù)認為引起此類mRNA的RNAi介導的降解，以致不產(chǎn)生或以減少的量產(chǎn)生VEGF和及其同種型的蛋白質產(chǎn)物。因為VEGF對Flt-I或Flk-1/KDR受體的結合是起始和維持血管生成所需的，VEGF及其同種型以及Flt-I或Flk-1/KDRmRNA的siRNA介導的降解還可用于抑制血管生成過程。因此，本公開內容的一個方面提供了靶向靶mRNA的分離的siRNA，其包含長度為約17個核苷酸至約29個核苷酸，以及在某些實施方案中長度為約19至約25個核苷酸的短雙鏈RNA。siRNA包含通過標準Watson-Crick堿基-配對相互作用退火在一起的(在下文中稱為“堿基-配對的”)有義RNA鏈和互補反義RNA鏈。如在下文中更詳細地描述的，有義鏈包含與祀mRNA內包含的祀序列同一或充分同源的核酸序列。siRNA的有義和反義鏈可包含兩個互補的單鏈RNA分子,或可包含其中兩個互補部分是堿基配對的并且通過單鏈“發(fā)夾”區(qū)域共價連接的單個分子。不希望受任何理論束縛，據(jù)認為，后一種類型的siRNA分子的發(fā)夾區(qū)域被“Dicer”蛋白(或其等同物)細胞內切害I]，形成包含兩個單獨的、堿基配對的RNA分子的siRNA。人VEGF的剪接變體是已知的，包括促血管生成VEGF mRNA同種型例如VEGF121 (SEQID NO :2), VEGF165 (SEQ ID NO :3)和 VEGF189 (SEQ ID NO :4), VEGF206 (SEQ ID NO :5 ；GenBank登錄號 CS245579) ,VEGF183 (GenBank 登錄號 AJ010438) ,VEGF148 (GenBank 登錄號 AF 091352)和 VEGF145 (GenBank 登錄號 CS245578)，以及抗血管生成 VEGF165bmRNA (GenBank 登錄號AF430806)?？墒褂帽绢I域公知的技術分析從人VEGF及其同種型以及Flt-I (SEQ ID NO:6)或Flk-1/KDR(SEQ ID NO: 7)基因轉錄的mRNA的其它選擇性剪接形式。此類技術包括逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、northern印跡法和原位雜交。用于分析mRNA序列的技術描述于例如，Busting SA(2000), J. Mol. Endocrinol. 25:169-193中，其完整公開內容通過引用并入本文。用于鑒定選擇性剪接的mRNA的代表性技術也描述于下文中。例如，包含與給定的疾病基因相關的核苷酸序列的數(shù)據(jù)庫可用于鑒定選擇性剪接的 mRNA。此類數(shù)據(jù)庫包括 GenBank、Embase 和 Cancer Genome Anatomy Project (CGAP)數(shù)據(jù)庫。CGAP數(shù)據(jù)庫例如包含來自各種類型的人癌癥的表達序列標簽(EST)。來自VEGF及其同種型以及Flt-I或Flk-1/KDR基因的mRNA或基因序列可用于查詢這樣的數(shù)據(jù)庫，以確定是否已發(fā)現(xiàn)這些基因的代表選擇性剪接的mRNA的EST。
稱為“RNA酶保護”的技術也可用于鑒定選擇性剪接的VEGF及其同種型以及Flt-I或Flk-l/KDR mRNA。RNA酶保護包括，基因序列至合成的RNA的翻譯，所述合成的RNA與來源于其它細胞(例如來自新血管形成的位置上或其附近的組織的細胞)的RNA雜交。隨后將雜交的RNA與識別RNA:RNA雜交體錯配的酶一起溫育。小于預期的片段表示存在選擇性剪接的mRNA?？衫帽绢I域技術人員公知的方法克隆假定的選擇性剪接的mRNA并且對其進行測序。RT-PCR也可用于鑒定選擇性剪接的VEGF及其同種型以及Flt-I或F I k-1/KDRmRNA。在RT-PCR中，使用本領域技術人員公知的方法，利用逆轉錄酶將來自組織或細胞的mRNA轉化成cDNA。隨后使用位于5’翻譯區(qū)的正向引物和位于3’翻譯區(qū)的反向引物通過PCR擴增cDNA的編碼序列。在一些實施方案中，擴增編碼cDNA的所有堿基?？梢岳缤ㄟ^將擴增產(chǎn)物的大小與來自正常剪接的mRNA的預期產(chǎn)物的大小相比較(例如，通過瓊脂糖凝膠電泳)，分析擴增產(chǎn)物的選擇性剪接形式。擴增產(chǎn)物的大小的任何改變可表示選擇性剪接。從突變的VEGF及其同種型以及Flt-I或Flk-1/KDR基因產(chǎn)生的mRNA也可通過上述用于鑒定選擇性剪接形式的技術來容易地鑒定。如本文中所使用的，“突變的”VEGF及其同種型以及Flt-I或Flk-1/KDR基因或mRNA包括在序列上與本文中所示的VEGF及其同種型以及Flt-I或Flk-1/KDR序列不同的人VEGF及其同種型以及Flt-I或Flk-1/KDR基因或mRNA。因此，為了本發(fā)明的目的，這些基因的等位基因形式以及從其產(chǎn)生的mRNA被認為是“突變體”。應理解，人VEGF及其同種型以及Flt-I或Flk-l/KDR mRNA可包含與它們各自的選擇性剪接形式、同源物或突變體共有的靶序列。因此，包含這樣的共有靶向序列的單個siRNA可誘導包含共有靶向序列的不同RNA類型的RNAi介導的降解。例如，如圖10中所顯示的，所有VEGF同種型共有外顯子1-5。然而，在VEGF121 (SEQ ID NO:2)中，外顯子6和
7(7a 和 7b)缺失。^ VEGF165 (SEQ ID NO: 3)，外顯子 6 (6a 和 6b)缺失。^ VEGF189 (SEQ IDNO: 4)中，外顯子6b缺失。在VEGF183中，外顯子6a的一部分以及完整的外顯子6b序列缺失。VEGF148具有外顯子6 (6a和6b)以及外顯子7b和部分外顯子8的缺失。在VEGF145中，外顯子6b和外顯子7(7a和7b)缺失。VEGF的唯一已知的抗血管生成同種型，VEGF165b缺乏外顯子6 (6a和6b),但額外地包含假外顯子(pseudo-exon) 9。假外顯子9是由缺失終止密碼子(從而允許一部分3’UTR被翻譯成蛋白質)產(chǎn)生的讀框移位的結果。參見例如，Bates等人，Can. Res. 62:4123(2002)，通過引用整體并入本文。VEGF206 (SEQ ID NO:5)是不具有缺失的全長序列VEGF。因此，在某些實施方案中，siRNA靶向一個或多個同種型，例如VEGF121 (SEQID NO:2)、VEGF165(SEQ ID NO:3)和 VEGF189(SEQ ID NO:4)、VEGF2tl6(SEQ ID NO:5 ；GenBank登錄號 CS245579)、VEGF183 (GenBank 登錄號 AJ010438)、VEGF148 (GenBank 登錄號 AF091352)和/或VEGF145 (GenBank登錄號CS245578)，但不靶向其它同種型，例如VEGF165b,因為siRNA靶向某些同種型(而非其它同種型)之間共有的外顯子。在一個實施方案中，提供了包含第一 RNA鏈和第二 RNA鏈的雙鏈體的分離的siRNA，所述第一 RNA鏈包含與血管內皮生長因子(VEGF)同種型的約19至約25個連續(xù)核苷酸的靶序列同一的核苷酸序列，所述同種型選自人VEGF121、VEGF165、VEGF189、VEGF206、VEGF183、VEGF148, VEGF145及組合；此外其中所述siRNA至少部分不互補于VEGF165b,前提是人VEGFmRNA不是SEQ ID NO. 42。其它實施方案包括，使用此類siRNA抑制血管生成的方法和包含 治療有效量的抑制血管生成的此類siRNA的藥物組合物。s iRNA可包含部分純化的RNA、大體上純的RNA、合成的RNA或重組產(chǎn)生的RNA以及與天然存在的RNA相異在于一個或多個核苷酸的添加、缺失、置換和/或改變的改變的RNA。此類改變可包括非核苷酸材料例如至siRNA的末端或至siRNA的一個或多個內部核苷酸的添加，包括使siRNA抗核酸酶降解的修飾。siRNA的一條或兩條鏈還可包含3’懸突。如本文中所使用的，“3’懸突”是指從雙鏈化RNA鏈的3’末端延伸的至少一個未配對的核苷酸。在一些實施方案中，siRNA不包含懸突并且具有平端。在一些實施方案中，siRNA的兩個末端都包含平端。在一些實施方案中，siRNA包含與靶mRNA鄰接的17聚體和dTdT懸突。在一些實施方案中，siRNA為可抑制VEGF從來自不同物種的細胞分泌或產(chǎn)生的siRNA。例如，在一些實施方案中，siRNA可抑制從人細胞、大鼠細胞和/或小鼠細胞分泌或產(chǎn)生VEGF。在一些實施方案中，siRNA可抑制從小鼠細胞和人細胞分泌或產(chǎn)生VEGF，但不抑制從大鼠細胞分泌或產(chǎn)生VEGF。在一些實施方案中，siRNA可抑制VEGF從大鼠細胞和人細胞的分泌或產(chǎn)生，但不抑制VEGF從小鼠細胞的分泌或產(chǎn)生。在一些實施方案中，siRNA可抑制VEGF從人細胞、小鼠細胞和大鼠細胞的分泌或產(chǎn)生。siRNA的選擇性可基于不同序列之間的同源性。例如，圖33顯示編碼人、小鼠和大鼠VEGF的末端密碼子之間的同源性。這些差異可用于產(chǎn)生可選擇性抑制從一個或多個物種產(chǎn)生VEGF的siRNA。在一些實施方案中，包含少于21個核苷酸，例如17、18、19或20個核苷酸的siRNA可用于避免任何潛在的非特異性體內應答。(參見，Ambati, Nature, 452，591-597(2008年4月3日))。例如，包含少于21個核苷酸的siRNA可用于避免激活體內TLR3應答。因此，在一個實施方案中，siRNA包含至少一個長度為I至約6個核苷酸(其包含核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸)，優(yōu)選長度為I至約5個核苷酸，更優(yōu)選長度為I至約4個核苷酸和特別優(yōu)選長度為約2至約4個核苷酸的3’懸突。在其中siRNA分子的兩條鏈都包含3’懸突的實施方案中，對于每一條鏈，懸突的長度可以是相同的或不同的。在最優(yōu)選的實施方案中，3’懸突存在于siRNA的兩條鏈上，并且長度為2個核苷酸。例如，siRNA的每一條鏈可包含二胸苷酸(“TT”)或二尿苷酸(“皿”)的3’懸突。為了增強本發(fā)明的siRNA的穩(wěn)定性，還可穩(wěn)定3’懸突以抗降解。在一個實施方案中，通過包含嘌呤核苷酸例如腺苷或鳥苷核苷酸來穩(wěn)定懸突?；蛘撸眯揎椀念愃莆镏脫Q嘧啶核苷酸，例如用2’ -脫氧胸苷置換3’懸突中的尿苷核苷酸是耐受的并且不影響RNAi降解的效率。特別地，2’-脫氧胸苷中2’羥基的不存在顯著增強了 3’懸突在組織培養(yǎng)基中的核酸酶抗性。在某些實施方案中，siRNA包含序列AA (N19) TT或NA (N21)，其中N為任意核苷酸。此類siRNA包含約30-70%的GC，優(yōu)選包含約50%的G/C。有義siRNA鏈的序列分別相應于(N19)TT或N21(即，位置3至23)。在后一種情況下，有義siRNA的3’末端被轉化成TT。該序列轉化的原理是，在有義和反義鏈3’懸突的序列組成方面產(chǎn)生對稱雙鏈體。隨后將反 義RNA鏈合成為有義鏈的位置I至21的互補序列。因為這些實施方案中的23-nt有義鏈的位置I不被反義鏈以序列特異性的方式識另IJ，因此，可有意地選擇反義鏈的最3’核苷酸殘基。然而，反義鏈的倒數(shù)第二個核苷酸(在任一實施方案中與23-nt有義鏈的位置2互補)通常與靶向的序列互補。在另一個實施方案中，siRNA包含序列NAR(N17)YNN，其中R為嘌呤(例如，A或G)并且Y為嘧啶(例如，C或U/T)。因此，該實施方案的各自21-nt的有義和反義RNA鏈通常始于嘌呤核苷酸。這樣的siRNA可從pol III表達載體表達而無靶向位點的改變，因為僅當?shù)谝粋€轉錄的核苷酸為嘌呤時，RNA從pol III啟動子的表達被認為是有效的。在其它實施方案中，siRNA包含具有不超過五(5)個的連續(xù)嘌呤或嘧啶的序列。在其它實施方案中，siRNA包含具有不超過五個(5)的具有相同核堿基(即，A、C、G或U/T)的連續(xù)核苷酸的序列。siRNA可靶向任何靶mRNA序列(“靶序列”)中的約19_25個連續(xù)核苷酸的任何區(qū)段。例如，在Tuschl T等人，“The siRNA User Guide”(于2002年10月11日修訂，將其完整公開內容通過引用并入本文)中給出了用于選擇siRNA的靶序列的技術。“ThesiRNA User Guide”可在由 Dr. Thomas Tuschl, Department of Cellular Biochemistry, AG
105, Max-Planck-Institute for Biophysical Chemistry, 37077 Gdt t illgSIl, Germany
維持的網(wǎng)站上在萬維網(wǎng)上獲得，并且可通過訪問Max Planck Institute的網(wǎng)站并且用關鍵詞“siRNA”搜索而尋找到。因此，本發(fā)明的siRNA的有義鏈包含與靶mRNA中的約19至約25個核苷酸的任何連續(xù)區(qū)段同一的核苷酸序列。在一些實施方案中，siRNA為19個核苷酸并且包含與靶mRNA同一的17個核苷酸。在一些實施方案中，siRNA長度為19個核苷酸，包含至少一個平端。在一些實施方案中，19聚體的每一個末端具有平端。在一些實施方案中，19聚體包含至少一個dT懸突。在一些實施方案中，19聚體包含兩個dT懸突。通常，靶mRNA上的靶序列可選自相應于靶mRNA的給定的cDNA序列，優(yōu)選始于起始密碼子下游(即，在3’方向)的50至100nt。然而，靶序列可位于5’或3’非翻譯區(qū)域中，或位于起始密碼子附近的區(qū)域中(參見,例如,下文表I中的SEQ ID N0S:73和74的靶序列，其在VEGFl2IcDNA的5’末端的IOOnt內)。在本發(fā)明的其它實施方案中，靶mRNA序列包含不超過五(5)個的連續(xù)嘌呤或嘧啶。例如，VEGF121cDNA序列中的合適的靶序列為TCATCACGAAGTGGTGAAG(SEQ ID NO 8)因此，靶向該序列并且在每一條鏈上具有3’mi懸突(懸突以粗體顯示)的siRNA為5，-ucaucacgaaguggugaag _3，(SEQ ID NO 9)3，-_1 aguagugcuucaccacuuc-5，(SEQ ID NO :10)靶向該相同序列但在每一條鏈上具有3’ TT懸突(懸突以粗體顯示)的siRNA為5，-ucaucacgaaguggugaag TT _3’ (SEQ ID NO 11)3’ - TT aguagugcuucaccacuuc-5J (SEQ ID NO 12) 表I中給出了 siRNA可源自于其的其它VEGF121靶序列。應理解，表I中所列的所有VEGF121靶序列在VEGF121選擇性剪接形式的與所有人VEGF選擇性剪接形式共同的部分內。因此，表I中的VEGF121靶序列還可靶向VEGF165、VEGF189和VEGF2(l6mRNA。還可容易地鑒定靶向特定VEGF同種型的靶序列。例如，靶向VEGF165mRNA但非VEGF121mRNA的靶序列為AACGTACTTGCAGATGTGACA(SEQ ID NO: 13)。相反地，靶向促血管生成VEGF mRNA同種型例如VEGF121、VEGF165 和 VEGF189、VEGF2tl6、VEGF183、VEGF148 和 VEGF145 及其組合但不靶向抗血管生成VEGF165bHiRNA的靶序列包括表2中發(fā)現(xiàn)的序列，前提是VEGF mRNA不為SEQ ID No. 42。在某些實施方案中，所述人VEGF mRNA選自 SEQ ID NO:86 ；SEQ ID NO:87 ；SEQ ID NO:88 ；SEQID NO:89 ；SEQ ID NO:90 ；SEQ ID N0:91 ；SEQ ID NO:92 ；SEQ ID NO:93 ；SEQ ID NO:94 ；SEQID NO:95 ；SEQ ID NO:96 ;SEQ ID N0:97 和 SEQ ID NO:98。在某些實施方案中，所述人VEGFmRNA 選自 SEQ ID NO. 88 和 SEQ ID NO. 94。通過選擇性靶向VEGF的血管生成同種型，而不靶向抗-血管生成同種型，可以增強siRNA處理的抗血管生成作用。如圖11中顯示的，外顯子7與9之間的區(qū)域在血管生成與抗血管生成序列之間不同。根據(jù)不同的實施方案，可以選擇性靶向該區(qū)域，其中siRNA與血管生成同種型至少部分互補，但與抗血管生成同種型至少部分或完全不互補。因此，在某些實施方案中，siRNA不抑制抗血管生成同種型VEGF165b的表達，前提是VEGF mRNA不是SEQ ID No. 42o 在某些實施方案中，所述人 VEGF mRNA 選自 SEQ ID NO: 86 ；SEQ ID NO: 87 ；SEQ ID NO:88 ；SEQ ID NO:89 ；SEQ ID NO:90 ；SEQ ID N0:91 ；SEQ ID NO:92 ；SEQ ID NO:93 ；SEQ ID NO:94 ；SEQ ID NO:95 ;SEQ ID NO:96 ;SEQ ID NO:97 ;SEQ ID NO:98, SEQ ID NO99，SEQ ID NO 100，SEQID NO 101，SEQ ID NO:102，SEQ ID NO:103，SEQ ID NO:104，SEQIDNO:105，SEQ ID NO:106，SEQ ID NO:107，SEQ ID NO:108，SEQID NO:109，SEQ ID NO:110，SEQID NO:111,SEQ ID NO:112，SEQID NO:113，SEQ ID NO:114，SEQ ID NO:115，SEQ IDNO: 116, SEQID N0:117和SEQ ID N0:118。在某些實施方案中，所述人VEGF mRNA選自SEQID NO. 88 和 SEQ ID NO. 94。人Flk-1/KDR的人Flt-I的示例性靶序列示于2003年7月18日提交的PCT/US2003/0022444(通過引用整體并入本文)中。表I-VEGF靶序列
權利要求
1.一種包含有義RNA鏈和反義RNA鏈的分離的siRNA，其中所述有義和反義RNA鏈形成RNA雙鏈體，并且其中所述有義RNA鏈包含與人VEGF mRNA中的約19至約25個連續(xù)核苷酸的祀序列同一的核苷酸序列，其中所述有義RNA鏈包含由SEQ ID NO: 119組成的核苷酸序列，并且反義鏈包含由SEQ ID NO: 120組成的核苷酸序列。
2.權利要求I的siRNA，其中形成RNA雙鏈體的第一和第二RNA鏈通過單鏈發(fā)夾共價連接。
3.權利要求I的siRNA，其中所述siRNA還包含非核苷酸材料。
4.權利要求I的siRNA，其中第一和第二RNA鏈經(jīng)穩(wěn)定以抗核酸酶降解。
5.一種包含有效量的分離的siRNA的藥物組合物，所述分離的siRNA包含有義RNA鏈和反義RNA鏈，其中所述有義和反義RNA鏈形成RNA雙鏈體，并且其中所述有義RNA鏈包含由SEQ ID NO: 119組成的核苷酸序列，并且其中所述反義鏈包含由SEQ ID NO: 120組成的核苷酸序列?！?br> 6.權利要求5的藥物組合物，其中第一和第二RNA鏈經(jīng)穩(wěn)定以抗核酸酶降解。
7.一種治療受試者的血管生成疾病的方法，包括給受試者施用有效量的包含有義RNA鏈和反義RNA鏈的短干擾核糖核酸(siRNA)，其中所述有義和反義RNA鏈形成RNA雙鏈體，并且其中所述有義RNA鏈包含與人血管內皮生長因子(VEGF)mRNA中的約19至約25個連續(xù)核苷酸的靶序列同一的核苷酸序列，并且其中所述有義RNA鏈包含由SEQ ID NO: 119組成的核苷酸序列，并且所述反義鏈包含由SEQ ID NO: 120組成的核苷酸序列，以便與血管生成疾病相關的血管生成被抑制。
8.權利要求7的方法，其中所述血管生成疾病包括與癌癥相關的腫瘤。
9.權利要求8的方法，其中所述癌癥選自乳腺癌、肺癌、頭頸癌、腦癌、腹部癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃腸癌、神經(jīng)膠質瘤、肝癌、舌癌、神經(jīng)母細胞瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、視網(wǎng)膜母細胞瘤、Wilm’ s腫瘤、多發(fā)性骨髓瘤、皮膚癌、淋巴瘤和血癌。
10.權利要求7的方法，其中所述血管生成疾病選自糖尿病視網(wǎng)膜病變、老年性黃斑變性和炎性疾病。
11.權利要求10的方法，其中所述炎性疾病為銀屑病或類風濕性關節(jié)炎。
12.權利要求7的方法，其中所述血管生成疾為老年性黃斑變性。
13.權利要求7的方法，其中將所述藥物組合物與用于治療血管生成疾病的藥劑聯(lián)合施用，所述藥劑與所述短干擾核糖核酸(siRNA)不同。
14.權利要求7的方法，其中所述血管生成疾病為癌癥，并且所述藥劑包括化學治療劑。
15.權利要求14的方法，其中所述化學治療劑選自順鉬、卡鉬、環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶、阿霉素、柔紅霉素和他莫昔芬。
16.權利要求7的方法，其中將所述組合物與另一種經(jīng)設計用以治療血管生成疾病的治療方法組合施用給受試者。
17.權利要求7的方法，其中所述血管生成疾病為癌癥，并且將所述藥物組合物與放射療法、化學療法或手術組合施用。
18.—種抑制人血管內皮生長因子(VEGF)的表達的方法，包括給受試者施用有效量的包含有義RNA鏈和反義RNA鏈的短干擾核糖核酸(siRNA)，其中所述有義RNA鏈和反義RNA鏈形成RNA雙鏈體，并且其中所述有義RNA鏈包含與人血管內皮生長因子(VEGF)mRNA中的約19至約25個連續(xù)核苷酸的靶序列同一的核苷酸序列，并且其中所述有義RNA鏈包含由SEQ ID NO: 119組成的核苷酸序列，并且所述反義鏈包含由SEQ ID NO: 120組成的核苷酸序列。
19.權利要求18的方法，其中所述有效量包括約InM至約IOOnM的短干擾核糖核酸(siRNA)。
20.權利要求18的方法，其中所述藥物組合物還包含遞送試劑。
21.權利要求18的方法，其中所述遞送試劑選自lipofectin、lipofectamine、cel lfect in、聚陽離子和脂質體。
22.權利要求21的方法，其中所述遞送試劑為脂質體。
23.權利要求22的方法，其中所述脂質體包含將脂質體靶向血管生成位置上或其附近的細胞的配體。
24.權利要求23的方法，其中所述配體結合腫瘤細胞或血管內皮細胞上的受體。
25.權利要求23的方法，其中所述配體包含單克隆抗體。
26.權利要求22的方法，其中用調理素作用-抑制部分修飾所述脂質體。
27.權利要求26的方法，其中所述調理素作用-抑制部分包含PEG、PPG或其衍生物。
28.權利要求18的方法，其中所述短干擾核糖核酸(siRNA)是從重組質粒表達的。
29.權利要求18的方法，其中所述短干擾核糖核酸(siRNA)是從重組病毒載體表達的。
30.權利要求29的方法，其中所述重組病毒載體包括腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、慢病毒載體、逆轉錄病毒載體或皰疫病毒載體。
31.權利要求30的方法，其中利用來自水皰性口炎病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒或莫科拉病毒的表面蛋白假型化所述重組病毒載體。
32.權利要求29的方法，其中所述重組病毒載體包括腺伴隨病毒載體。
33.權利要求18的方法，其中通過經(jīng)腸施用途徑施用所述藥物組合物。
34.權利要求33的方法，其中所述經(jīng)腸施用途徑選自口服、經(jīng)直腸和鼻內施用途徑。
35.權利要求18的方法，其中通過胃腸外施用途徑施用所述藥物組合物。
36.權利要求35的方法，其中所述胃腸外施用途徑選自血管內施用、組織旁和組織內注射、皮下注射或沉積、皮下輸注和在新血管形成的位置上或其附近的直接施用。
37.權利要求35的方法，其中血管內施用選自靜脈內快速濃注、靜脈內輸注、動脈內快速濃注、動脈內輸注和至脈管系統(tǒng)內的導管滴注。
38.一種降解人血管內皮生長因子(VEGF)mRNA的方法，包括給受試者施用有效量的包含有義RNA鏈和反義RNA鏈的短干擾核糖核酸(siRNA)，其中有義RNA鏈和反義RNA鏈形成RNA雙鏈體，并且其中所述有義RNA鏈包含與人血管內皮生長因子(VEGF)mRNA中的約19至約25個連續(xù)核苷酸的靶序列同一的核苷酸序列，并且其中所述有義RNA鏈包含由SEQID NO: 119組成的核苷酸序列，以及所述反義鏈包含由SEQ ID NO: 120組成的核苷酸序列。
全文摘要
本文中公開了用于抑制血管內皮生長因子(VEGF)同種型表達的siRNA組合物和方法。牽涉受VEGF的過表達刺激的血管生成的疾病例如糖尿病視網(wǎng)膜病變、老年性黃斑變性和許多類型的癌癥可通過施用公開的小干擾RNA來進行治療。
文檔編號C12N15/113GK102812126SQ201080061019
公開日2012年12月5日 申請日期2010年12月6日 優(yōu)先權日2009年12月4日
發(fā)明者N·德納卡 申請人:奧普科制藥有限責任公司