專利名稱：用于生產(chǎn)具有高含量中等鏈長單體的聚羥基脂肪酸酯共聚物的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及通過重組基因表達來生產(chǎn)具有高含量中等鏈長單體的聚羥基脂肪酸酯共聚物。
背景技術：
商用的復雜生物聚合物聚羥基脂肪酸酯是由大量細菌產(chǎn)生的細胞內(nèi)材料。聚羥基丁酸酯(PHB)基于該聚合物的化學和物理特性是有用的生物材料。PHB具有各種潛在的應用，包括用作可生物降解/熱塑性材料、作為用于某些抗生素有機合成的手性中心的來源，以及作為用于藥物遞送和骨替代的基質(zhì)。在體內(nèi)，該聚合物內(nèi)部降解為羥基丁酸，這是人血液的正常成分。聚羥基脂肪酸酷(PHA，包括PHB)和共聚物的生產(chǎn)的多種方面在例如美國專利5，534，432、美國專利5，663，063、美國專利5，798，235以及美國專利7，202，064中有所描述。作為ー個例子,眾所周知細菌真養(yǎng)雷氏菌(Ralstonia eutropha)用于積累高水平的聚羥基脂肪酸酷(PHA)生物塑料。該野生型生物典型地產(chǎn)生均聚物聚羥基丁酸酯(PHB)。該聚合物通過β-酮硫解酶(PhaA)、こ酰こ酰輔酶A還原酶(PhaB)以及聚羥基脂肪酸酷合酶(PhaC)的作用產(chǎn)生自こ酰輔酶A。PHB不是有用的生物塑料，因為其易碎并且熔解溫度接近其分解溫度。之前已經(jīng)證實將3-羥基己酸単體引入該聚合物鏈生產(chǎn)了比PHB更具韌性并且熔解溫度更低的材料，從而提高了塑料的性能并使其比PHB適于更多的應用。美國專利7，235，621描述了在很特定的條件下生產(chǎn)3_羥基丁酸與3_羥基己酸的共聚物。美國專利7，235，621描述了需要具有高月桂酸含量的特定植物油來作為碳源用于微生物來生產(chǎn)該共聚物。這些必需的油具有比在較常見的油(如棕櫚油、大豆油以及菜籽油)中發(fā)現(xiàn)的更短的脂肪酸。即便碳源要求有這樣的限制，在美國專利7，235，621中所公開的共聚物中3-羥基己酸的最高量為13. 8mol%。美國專利申請2009/0130731描述了在重組表達PHA合酶基因(phaC)和3_酮酯酰-ACP還原酶基因(fabG)的細菌中生產(chǎn)3-羥基丁酸與3-羥基己酸的共聚物。但是，在美國專利出版物2009/0130731中所公開的共聚物中的3-羥基己酸的最高量為4mol%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及通過重組基因表達生產(chǎn)具有高含量中等鏈長單體的聚羥基脂肪酸酷共聚物。在ー些方面中，本發(fā)明提供了以任意植物油作為碳源生產(chǎn)具有至少約4m0l%或5wt%的中等鏈長單體含量的聚羥基脂肪酸酯共聚物的細胞或生物。在一些實施方案中，所述細胞或生物用任意植物油作為碳源生產(chǎn)具有至少約4mol%或5wt% HHx含量的3-羥基丁酸與3-羥基己酸的共聚物(聚(HB-co-HHx))。在一些實施方案中，所述細胞中3-羥基丁酸的正常合成被破壞。在一些實施方案中，編碼こ酰こ酰輔酶A還原酶的基因被缺失。在一些實施方案中，所述細胞是真養(yǎng)雷氏菌細胞，并且PhaBl基因、phaB2基因和phaB3基因中的一種或更多種被破壞。在一些實施方案中，phaB3基因被破壞。在一些實施方案中，所述細胞或生物重組表達非內(nèi)源性PHA合酶基因。在ー些實施方案中，所述非內(nèi)源性PHA合酶基因是豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)PHA合酶基因或食醚紅球菌(Rhodococcus aetherivorans)PHA合酶基因。在一些實施方案中，所述食醚紅球菌PHA合酶基因是編碼SEQ ID NO 4的食醚紅球菌124 D12 PHA合酶基因或編碼SEQID NO :2的食醚紅球菌124 C09 PHA合酶基因。在一些實施方案中，所述食醚紅球菌124 D12 PHA合酶基因包含SEQ ID NO :3或由其組成和/或其中所述食醚紅球菌124 C09 PHA合酶基因包含SEQ ID NO: I或起始密碼子從TTG變?yōu)锳TG的SEQ ID NO :1，或由其組成。在一些實施方案中，所述細胞或生物重組表達烯脂酰輔酶A水合酶基因。在ー些實施方案中，所述烯脂酰輔酶A水合酶基因是豚鼠氣單胞菌烯脂酰輔酶A水合酶基因或銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)烯脂酰輔酶A水合酶基因。在一些實施方案中，所述銅綠假單胞菌烯脂酰輔酶A水合酶基因是銅綠假單胞菌phajl基因(基因PA3302)或銅綠假單胞菌phaJ2基因(基因PA1018)。在一些實施方案中，所述非內(nèi)源性PHA合酶基因和/或所述烯脂酰輔酶A水合酶基因被擴增。在一些實施方案中，所述單體含量是至少約5mol%，至少約6mol%，至少約711101%,至少約IOmol1^,至少約1511101%或至少約2011101%或更多。在一些實施方案中，所述單體含量是至少約6wt%,至少約8wt%,至少約10wt%,至少約15wt%,至少約IOwt%或至少約25wt%或更多。在一些實施方案中，所述細胞或生物是細菌細胞、真菌細胞(包括酵母細胞)、植物細胞、昆蟲細胞或動物細胞。在一些實施方案中，所述細胞是雷氏菌(Ralstonia spp.)、氣單胞菌(Aeromonas spp.)、根瘤菌(Rhizobium spp.)、產(chǎn)堿菌(Alcaligenes spp.)或假單胞菌(Pseudomonas spp.)細胞。在一些實施方案中，所述細胞是真養(yǎng)雷氏菌、豚鼠氣單胞菌、大豆根瘤菌(Rhizobium japonicum)、真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligenes eutrophus)或食油假單胞菌(Pseudomonas oleovorans)細胞。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述細胞是真養(yǎng)雷氏菌細胞。在一些實施方案中，所述非內(nèi)源性PHA合酶基因和/或所述烯脂酰輔酶A水合酶基因表達自質(zhì)粒。在一些實施方案中，所述非內(nèi)源性PHA合酶基因和/或所述烯脂酰輔酶A水合酶基因整合到所述細胞的基因組中。在另ー些方面中，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)具有高含量中等鏈長單體的聚羥基脂肪酸酯共聚物的方法。所述方法包括培養(yǎng)前述的細胞或生物以生產(chǎn)具有至少約4mol%或5wt%的中等鏈長單體含量的共聚物。在一些實施方案中，所述方法包括培養(yǎng)前述的細胞或生物以生產(chǎn)具有至少約4mol%或5wt%的HHx含量的聚(HB-co-HHx)，其中生產(chǎn)3-羥基丁酸與3_羥基己酸的共聚物(聚(HB-co-HHx))。在一些實施方案中，所述方法進ー步包括從所述細胞或生物中回收所述共聚物。在一些實施方案中，所產(chǎn)生共聚物的量為細胞干重的至少約20%，細胞干重的至少約30%，細胞干重的至少約40%，細胞干重的至少約50%，細胞干重的至少約60%或更多。在另ー些方面中，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)細胞的方法，所述細胞產(chǎn)生具有至少約4mol%或5wt%的中等鏈長單體含量的聚羥基脂肪酸共聚物。所述方法包括在所述細胞中重組表達至少ー種食醚紅球菌PHA合酶基因。在一些實施方案中，所述細胞產(chǎn)生具有至少約4mol %或5wt%的HHx含量的3-羥基丁酸與3-羥基己酸的共聚物(聚(HB-co-HHx))。在一些實施方案中，所述食醚紅球菌PHA合酶基因是編碼SEQ ID NO 4的食醚紅球菌124D12 PHA合酶基因和/或編碼SEQ ID NO :2的食醚紅球菌124 C09 PHA合酶基因。在ー些 實施方案中，所述食醚紅球菌124 D12 PHA合酶基因包含SEQ ID NO :3或由其組成和/或其中所述食醚紅球菌124 C09 PHA合酶基因包含SEQ ID NO : I或起始密碼子從TTG變?yōu)锳TG的SEQ ID NO :1，或由其組成。 在一些實施方案中，所述方法還包括重組表達烯脂酰輔酶A水合酶基因。在ー些實施方案中，所述烯脂酰輔酶A水合酶基因是豚鼠氣單胞菌烯脂酰輔酶A水合酶基因或銅綠假單胞菌烯脂酰輔酶A水合酶基因。在一些實施方案中，所述銅綠假單胞菌烯脂酰輔酶A水合酶基因是銅綠假單胞菌phajl基因(基因PA3302)或銅綠假單胞菌phaJ2基因(基因 PA1018)。在一些實施方案中，所述非內(nèi)源性PHA合酶基因和/或所述烯脂酰輔酶A水合酶基因被擴增。在一些實施方案中，所述細胞是細菌細胞、真菌細胞(包括酵母細胞)、植物細胞、昆蟲細胞或動物細胞。在一些實施方案中，所述細胞是雷氏菌中等鏈長、氣單胞菌、根瘤菌、產(chǎn)堿菌或假單胞菌細胞。在一些實施方案中，所述細胞是真養(yǎng)雷氏菌、豚鼠氣單胞菌、大豆根瘤菌、真養(yǎng)產(chǎn)堿菌或食油假單胞菌細胞。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述細胞是真養(yǎng)雷氏菌細胞。在一些實施方案中，所述非內(nèi)源性PHA合酶基因和/或所述烯脂酰輔酶A水合酶基因表達自質(zhì)粒。在一些實施方案中，將所述非內(nèi)源性PHA合酶基因和/或所述烯脂酰輔酶A水合酶基因整合到所述細胞的基因組中。在ー些方面中，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生具有至少約4mol%或5wt%的中等鏈長單體含量的一種或更多種聚羥基脂肪酸酯共聚物的方法。所述方法包括根據(jù)任何前述的方法生產(chǎn)細胞并培養(yǎng)所述細胞群體。在一些實施方案中，所述共聚物中的一種或更多種是3-羥基丁酸與3-羥基己酸的共聚物(聚(HB-co-HHx))。在一些實施方案中，所述方法還包括從所述細胞群體中收集ー種或更多種共聚物。在一些實施方案中，所述單體含量是至少約5mol %、至少約6mol %、至少約711101%、至少約IOmol%、至少約1511101%、至少約2011101%或更多。在一些實施方案中，所述單體含量是至少約6wt%、至少約8wt%、至少約10wt%、至少約15wt%、至少約20wt%、至少約25wt%或更多。在一些實施方案中，所產(chǎn)生共聚物的量是細胞干重的至少約20%、細胞干重的至少約30%、細胞干重的至少約40%、細胞干重的至少約50%、細胞干重的至少約60%或更多。在另ー些方面中，本發(fā)明提供分離的核酸分子，其編碼SEQ ID NO :2或SEQ ID NO
4。在一些實施方案中，所述分離的核酸分子包含SEQID NO :1或SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。在一些實施方案中，分離的核酸分子與SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3所示核苷酸序列具有至少80%的百分比同一性、至少90%的百分比同一性、至少95%的百分比同一性或至少98%的百分比同一性或更高。在一些實施方案中，本發(fā)明提供由前述分離的核酸分子編碼的分離的多肽。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供包含前述分離的核酸分子的載體。在一些實施方案中，本發(fā)明提供重組表達ー種或更多種前述分離的核酸分子的細胞。在一些實施方案中，所述核酸分子表達自載體。在一些實施方案中，所述核酸分子整合到所述細胞的基因組中。本發(fā)明的這些和其它方面以及其多種實施方案將根據(jù)附圖和本發(fā)明的詳細描述變得更為明顯。


附圖的目的不在于按比例繪制。在所述附圖中，在各圖中闡明的每ー相同或幾乎相同的組分用同樣的數(shù)字代表。為清楚的目的，不是每個組分都標記于每個附圖中。在所述附圖中圖I示出PHA聚合物的結(jié)構(gòu)和特性。上聚(HB);下聚(HB-co-HHx)。圖2示出在PHA共聚物合成途徑中PhaA、PhaB和PhaC的參與。圖3圖示脂肪酸β -氧化與PHA共聚物合成途徑的相互作用以及單體作為脂肪酸分解代謝的副產(chǎn)物而制得。圖4圖示阻斷PhaA和PhaB對PHA共聚物合成途徑的影響以及單體作為脂肪酸分解代謝的副產(chǎn)物而制得。圖5示出在果糖限定培養(yǎng)基中通過具有phaBl、phaB2和/或phaB3缺失的數(shù)種菌株實現(xiàn)的PHB合成。示出野生型以及具有單、雙和三突變的菌株的結(jié)果。圖6示出在果糖限定培養(yǎng)基中在具有phaBl、phaB2和/或phaB3缺失的數(shù)種菌株中用NADPH獲得的還原酶活性。示出野生型以及具有單、雙和三突變的菌株的結(jié)果。圖7示出在果糖限定培養(yǎng)基中在具有phaBl、phaB2和/或phaB3缺失的數(shù)種菌株中對NADH的還原酶活性。示出野生型以及具有單、雙和三突變的菌株的結(jié)果。圖8示出對還原酶突變的回補對phaB缺失菌株的影響。將phaBl、phaB2和phaB3基因各自回加到菌株Re2115(APhaB123)的基因組。另ー個菌株具有回加到Re2115的fabG。示出在野生型、突變型以及互補的菌株中PHB合成的結(jié)果。圖9示出圖8中所描述的菌株的PhaA活性。圖10示出由圖8中描述的菌株產(chǎn)生的PHB聚合物的分子量。圖11示出PhaB底物特異性。
圖12示出PhaJ底物特異性。圖13列出來自文獻的數(shù)種菌株顯示了使用的PHA合酶、碳源、PHA含量以及HHx的mol %。圖14列出所構(gòu)建的菌株和來自這些菌株的結(jié)果，顯示了基因型(包括使用的PHA合酶)、PHA含量(表示為細胞干重的％ )以及HHx的wt %。圖15示出用于菌株構(gòu)建的方法，在其中擴增構(gòu)建的PHA操縱子(phaCD12-phaA-phaJlPa)并克隆到質(zhì)粒中,將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到菌株Re2133中。發(fā)明詳述本發(fā)明部分涉及生產(chǎn)生物塑料(如具有高含量中等鏈長單體的聚羥基脂肪酸酷共聚物)和在細菌發(fā)酵物以及其它細胞和生物中提高生物塑料產(chǎn)生的方法。能夠發(fā)生共聚 合以產(chǎn)生聚羥基脂肪酸酯共聚物的単體包括3-羥基丁酸和碳鏈長度大于或等于5的3-羥基烴酸(參見，例如，美國專利7，341,856以及本文引用的參考文獻，其每一公開內(nèi)容通過引用合并到本文中用于這些指導)。作為其ー個例子，3-羥基丁酸與3-羥基己酸的共聚物(聚(HB-co-HHx))尤其是具有高HHx含量的共聚物是有用的，這是由于它們的物理特性。本發(fā)明還部分涉及細胞(如真養(yǎng)雷氏菌菌株)，所述菌株在用脂肪酸或任意植物油作為碳源培養(yǎng)時能夠積累高水平的具有高含量中等鏈長單體的聚羥基脂肪酸酯共聚物，如聚(3-羥基丁酸-co-3-羥基己酸)。由這些細胞產(chǎn)生的共聚物中的3-羥基己酸含量與文獻中所述產(chǎn)自植物油的任意材料相當或更高。與此相反，為了產(chǎn)生具有可接受HHx含量的共聚物，美國專利7，235，621中描述的方法需要使用在脂肪酸組成中具有月桂酸的特定植物油。即使如此，使用美國專利7，235，621中描述的方法生產(chǎn)的共聚物的HHx含量次于用本文描述的方法生產(chǎn)的所述共聚物的HHx含量。以下特征單獨以及組合地包括于本發(fā)明中。在一些實施方案中，細胞中PHB的正常合成被破壞。例如，在如下的實施例中所示，在真養(yǎng)雷氏菌中通過缺失編碼こ酰こ酰輔酶A還原酶的基因來破壞PHB。在本發(fā)明的某些實施方案中，phaB3被破壞；phaB3是之前沒有在文獻中表征并且不用于該特定目的的基因。但是，本發(fā)明不限于這些實施方案，并因而包括破壞正常PHB生物合成的其它方法，包括降低こ酰こ酰輔酶A還原酶的表達。在一些實施方案中，內(nèi)源性PHA合酶基因被破壞并用替換為新的PHA合酶。但是，本發(fā)明不限于這些實施方案，并因而包括破壞正常內(nèi)源性PHA合酶活性的其它方法，包括降低內(nèi)源性PHA合酶的表達。例如，在如下的實施例中所示，將真養(yǎng)雷氏菌中的野生型PHA合酶基因缺失并將新的合酶基因加入到所述菌株中。所述新的PHA合酶能夠摻入高比例的3-羥基己酸単體。在一些實施方案中，所述新的合酶基因來自食醚紅球菌124這種生物(在本文中也成為“紅球菌(Rhodococcus)C09合酶” (SEQ ID NO 1和2)或“紅球菌(Rhodococcus)D12合酶”(SEQ ID N0:3和4))。但是，本發(fā)明不限于這些實施方案，因此具有摻入高比例中等鏈長單體(尤其是3-羥基己酸単體)的相似能力的其他PHA合酶基因也能夠以相似的方式使用。在一些實施方案中，將特定的烯脂酰輔酶A水合酶基因引入細胞以提高待摻入所述共聚物中的單體的產(chǎn)生。例如，在如下的實施例中所示，將稱作PhaJl的來自銅綠假單胞菌PAOl的(R)-特異性烯脂酰輔酶A水合酶基因(基因PA3302)引入所述真養(yǎng)雷氏菌菌株。所述PhaJl酶產(chǎn)生3-羥基丁酰輔酶A和3-羥基己酰輔酶A単體，之后由所述PHA合酶進行聚合。還可使用銅綠假單胞菌PAOl phaJ2基因(基因PA1018)。所述銅綠假單胞菌PAOl基因組的GenBank登錄號是AE004091。但是，本發(fā)明不限于這些實施方案，因此具有相似能力以產(chǎn)生3-羥基丁酰輔酶A和3-羥基己酰輔酶A単體的一種或更多種其它的烯脂酰輔酶A水合酶基因也能夠以相似的方式使用。在一些實施方案中，可以調(diào)節(jié)本文所述基因的拷貝數(shù)以改變所述細胞積累的PHA的量。例如，在如下的實施例中所示，首先將紅球菌(Rhodococcus)D12合酶和銅綠假單胞菌phajl基因整合到真養(yǎng)雷氏菌基因組中。然后如下提高所述基因的拷貝數(shù)將所述基因克隆到質(zhì)粒中，并將所述質(zhì)粒引入真養(yǎng)雷氏菌菌株中，其中已將こ酰こ酰輔酶A還原酶基因和天然PHA合酶基因從其基因組中缺失。帶有所述質(zhì)粒的菌株比所述基因僅在基因組中的菌株顯著地產(chǎn)生更多的聚合物。但是，本發(fā)明不限于這些實施方案，并因而包括調(diào)節(jié)(優(yōu)選為增加)所述基因拷貝數(shù)的其它方法。本發(fā)明的ー些方面涉及通過細胞中的重組基因表達而生產(chǎn)具有高含量中等鏈長単體的聚羥基脂肪酸酯共聚物(如具有高HHx含量的3-羥基丁酸與3-羥基己酸的共聚物(聚(HB-co-HHx)))的方法和組合物。在一個實施方案中，本文描述的是在重組表達非內(nèi)源性PHA合酶和烯脂酰輔酶A水合酶基因并且缺失編碼こ酰こ酰輔酶A還原酶之基因的細胞中由作為碳源的植物油產(chǎn)生HHx含量多于5wt% (多于4mol%)的聚(HB-co-HHx)。這個系統(tǒng)代表了用于生產(chǎn)具有高HHx含量的聚(HB-co-HHx)(其為具有廣泛的各種應用的分子)有效的新方法根據(jù)本發(fā)明的ー些方面，本發(fā)明提供重組表達一種或更多種酶的細胞以及這些細胞用于產(chǎn)生具有高含量中等鏈長單體的聚羥基脂肪酸酯共聚物(如具有高HHx含量的聚(HB-co-HHx))的用途。應理解，編碼這些酶的基因(包括PHA合酶基因)可得自各種來源。如本領域普通技術人員所知，這些酶的同源基因可得自其它的物種，并且能夠通過同源性檢索來鑒定，例如通過NCBI網(wǎng)站(www. ncbi.nlm.nih. gov)上可用的蛋白質(zhì)BLAST檢索?？梢酝ㄟ^PCR從包含特定基因的任何DNA來源的DNA中擴增這些基因。在一些實施方案中，基因序列是合成的和/或針對將引入細胞進行了密碼子優(yōu)化的。獲得編碼本文所述酶的基因的任何方法都與本發(fā)明相客。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)表達的優(yōu)化還可需要編碼酶的基因在引入細胞前進行修飾，如針對細菌細胞中的表達進行密碼子優(yōu)化。各種生物的密碼子使用(codon usage)可在密碼子使用數(shù)據(jù)庫(Codon Usage Database) (www.kazusa.or.jp/codon/)獲得。本發(fā)明描述的方法、酶、細胞和生物提供了具有高含量中等鏈長單體的聚羥基脂肪酸共聚物的生產(chǎn)。単體含量經(jīng)常表示為摩爾百分數(shù)(mol%)。在一些實施方案中，產(chǎn)生的共聚物具有的中等鏈長單體(如3-輕基己酸)含量至少有411101%%、7mol%、8mol%、9mol%、IOmol %、llmol%、12mol%、13mol%、14mol%、15mol%、16mol%、17mol % λ 18mol % Λ 19mol %、20mol %、26mol %、34mol %、35mol%或更多。具有這樣中等鏈長單體含量的共聚物可使用例如任意脂肪酸或油(例如，植物油)作為碳源產(chǎn)生。表達單體含量的另ー種方式是重量百分數(shù))。摩爾百分數(shù)可通過用重量百分數(shù)值乘以O. 8而從重量百分數(shù)進行近似；相似地，重量百分數(shù)可通過將所述摩爾百分數(shù)值乘以I. 25而從摩爾百分數(shù)進行近似。因而，在一些實施方案中，產(chǎn)生的共聚物具有的中等鏈長單體(如3-輕基己酸)含量至少有Swt^jwt^Jwt^^Swt^jwt^^lOwt^i、Ilwt %、12wt %、13wt %、14wt %、15wt %、16wt %、17wt %、18wt %、19wt % >20wt % >21wt %、22wt %、23wt %、24wt %、25wt %、26wt % >27wt % > 28wt %、29wt %、30wt % >3 Iwt %、32wt %、33wt %、34wt %、35wt %或更多。具有這樣中等鏈長單體含量的共聚物可使用例如任意脂肪酸或油(例如，植物油)作為生物或細胞的碳源而產(chǎn)生。在一些實施方案中，由細胞或生物產(chǎn)生的共聚體的量是所述細胞或生物干重(細胞干重)的至少約 20%、22%、24%、26%、28%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%或更多。如上述，為了產(chǎn)生具有可接受HHx含量的共聚物，美國專利7，235，621中描述的方 法需要使用在脂肪酸組成上具有一定量的月桂酸的特定植物油。在美國專利7，235，621中報道的共聚物的最大HHx含量為13.8mol%。在無需使用如由美國專利7，235，621需要的在所述油或脂肪的脂肪酸組成上具有所述月桂酸含量的碳源的情況下，本文描述的方法、酶、細胞和生物用于產(chǎn)生具有更高HHx含量的共聚物。所述聚合物的有用的分子量包括大于10，OOO道爾頓的那些，如在約10，000道爾頓和4百萬道爾頓之間，并且優(yōu)選為在約50，000和一百五十萬道爾頓之間。根據(jù)本發(fā)明，生產(chǎn)具有高含量中等鏈長單體的聚羥基脂肪酸酯共聚物。單體單元在本領域中已知，并包括羥基丁酸、羥基戊酸、羥基己酸、羥基庚酸、羥基辛酸、羥基壬酸、羥基癸酸、羥基十一酸以及羥基十二酸単元。在一些實施方案中，所述產(chǎn)生的共聚物包括羥基丁酸和羥基己酸単體，如聚(3-羥基丁酸-co-3-羥基己酸)。本發(fā)明包括表達由PHA合酶聚合之単體的基因的任何細胞類型，包括原核和真核細胞。在一些實施方案中，所述細胞是細菌細胞。在一些實施方案中，所述細菌細胞是雷氏菌、氣單胞菌、根瘤菌、產(chǎn)堿菌或假單胞菌細胞。在一些實施方案中，所述細胞是真養(yǎng)雷氏菌、豚鼠氣單胞菌、大豆根瘤菌、真養(yǎng)產(chǎn)堿菌或食油假單胞菌細胞。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述細胞是真養(yǎng)雷氏菌細胞。在另ー些實施方案中，所述細胞是真菌細胞如酵母細胞，例如，酵母(Saccharomyces spp·)、裂通酵母(Schizosaccharomyces spp·)、畢赤酵母(Pichia spp.)、法夫酵母(Phaffia spp.)、漢遜酵母(Hansenula spp·)、克魯維酵母(Kluyveromyces spp.)、假絲酵母(Candida spp.)、藍狀菌(Talaromyces spp·)、酒香酵母(Brettanomyces spp·)、許旺酵母(Schwanniomyces spp·)、管囊酵母(Pachysolenspp.)、德巴利氏酵母(Debaryomyces spp.)、亞羅酵母(Yarrowia spp.)以及エ業(yè)多倍體酵母菌株。用于生產(chǎn)共聚物的酵母物種和菌株的例子在美國專利7，083，972中有所描述，其公開內(nèi)容通過引用合并到本文中用于這些指導。真菌的其它例子包括曲霉(Aspergillusspp. ノ、## (Pennicilium spp. )> IftZI H (Fusarium spp. ノ 、豐艮# (Rhizopus spp.) >頂抱(Acremonium spp·)、麥抱菌(Neurospora spp.)、糞殼菌(Sordaria spp.)、巨座殼屬(Magnaporthe spp·)、異水霉(Allomyces spp·)、黑粉菌(Ustilago spp.)、葡萄孢(Botrytis spp.)以及木霉(Trichoderma spp·)。在另ー些實施方案中，所述細胞是藻類細胞、哺乳動物細胞或植物細胞。應理解，與本發(fā)明相容的ー些細胞可表達與本發(fā)明相關的ー種或更多種基因的內(nèi)源性拷貝以及重組拷貝。在一些實施方案中，如果細胞具有與本發(fā)明相關的ー種或更多種所述基因的內(nèi)源性拷貝，那么所述方法將不一定需要加入所述內(nèi)源性表達基因的重組拷貝。在一些實施方案中，所述細胞可內(nèi)源性表達來自本文描述途徑的ー種或更多種酶并且可重組表達來自本文描述途徑的一種或更多種其它的酶。應理解，與本發(fā)明相容的ー些細胞可表達內(nèi)源性生化途徑以及該途徑、相似途徑或回補途徑的一種或更多種重組基因。例如，真養(yǎng)雷氏菌(R. eutropha)表達用于單體產(chǎn)生的基因。如實施例中示出，這些細胞還額外表達phaj，以增強通過PHA合酶聚合的單體產(chǎn)生。通過在植物中表達用于單體的產(chǎn)生和/或聚合的有關酶而生產(chǎn)PHA聚合物和共聚物的方法(包括使用組織專一性啟動子)在例如美國專利5，534，432和美國專利7，341,856中有所描述，每ー專利通過引用合并到本文中用于這些指導。生物和細胞中的基因表達為本領域所熟知，其包括表達自插入所述生物或細胞的 基因組的基因和/或表達自ー種或更多種染色體外的核酸上的基因，如載體(例如，質(zhì)粒)。用于構(gòu)建修飾的基因組、染色體外核酸和包含這些修飾的基因組或染色體外核酸的生物或細胞的方法、材料以及技術為本領域所熟知，其中ー些方法、材料和技術在本文中有所描述。在一些實施方案中，可以有利的是使用針對生產(chǎn)具有高含量中等鏈長單體的ー種或更多種聚羥基脂肪酸酯共聚物(如聚(HB-co-HHx)共聚物)進行了優(yōu)化的細胞。例如，可以有利的是突變生化途徑的一種或更多種組分，以消除競爭途徑并且產(chǎn)生更多具有高含量中等鏈長單體的聚羥基脂肪酸酯共聚物，如聚(HB-co-HHx)共聚物。例如，在一些實施方案中，如通過突變或缺失有助于3HB-CoA合成的ー種或更多種基因而降低3HB-CoA合成。在一些實施方案中，這可通過降低こ酰こ酰輔酶A還原酶活性來實現(xiàn)。例如，在真養(yǎng)雷氏菌中，こ酰こ酰輔酶A還原酶活性(PhaB)可通過降低phaB表達(例如通過突變或缺失(部分或全部)ー個或更多個PhaB基因)來降低。如本文所示例的，這通過從所述真養(yǎng)雷氏菌基因組中缺失所述phaBl、phaB2和phaB3基因來實現(xiàn)。在一些實施方案中，對引起增強產(chǎn)生具有高含量中等鏈長單體的ー種或更多種聚羥基脂肪酸酯共聚物(如聚(HB-co-HHx)共聚物)的突變體的篩選可通過隨機誘變篩選或通過已知突變的篩選來進行。在一些實施方案中，可以使用基因組片段的鳥槍克隆(shotgun cloning)來鑒定提高具有高含量中等鏈長單體的一種或更多種聚輕基脂肪酸酯共聚物(如聚(HB-co-HHx)共聚物)之產(chǎn)生的基因組區(qū)域，這通過對具有這些片段的細胞和生物篩選具有高含量中等鏈長單體的一種或更多種聚羥基脂肪酸酯共聚物(如聚(HB-co-HHx)共聚物)的生產(chǎn)的提高來進行。在一些情況下，可在同一細胞或生物中組合一種或更多種突變。用于培養(yǎng)本文所述各種細胞的培養(yǎng)基為本領域技術人員所熟知。例如，通過引用合并到本文的美國專利5，534，432提供了適于細菌細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基的例子。如本領域技術人員所理解的，用于ー種或更多種羥基酸及其共聚物生產(chǎn)的最佳培養(yǎng)條件可受到包括細胞類型、生長培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等許多因素的影響。培養(yǎng)溫度是所述生物或細胞能夠生長的溫度，并優(yōu)選為從20°C至40°C。例如，所述溫度可以是20攝氏度、21攝氏度、22攝氏度、23攝氏度、24攝氏度、25攝氏度、26攝氏度、27攝氏度、28攝氏度、29攝氏度、30攝氏度、31攝氏度、32攝氏度、33攝氏度、34攝氏度、35攝氏度、36攝氏度、37攝氏度、38攝氏度、39攝氏度或40攝氏度或其之間的任何值。培養(yǎng)時間沒有特殊限制，但可以是大約從I天至10天。為了優(yōu)化具有高含量中等鏈長單體的聚羥基脂肪酸酯共聚物(如聚(HB-co-HHx)共聚物)的生產(chǎn)，可通過常規(guī)實驗改變的其它非限制因素包括使用的特定碳源、培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)基pH以及在收獲聚(HB-co-HHx)之前的培養(yǎng)細胞時間。在一些實施方案中，在培養(yǎng)所述細胞數(shù)天(如3天至4天)后實現(xiàn)最佳生產(chǎn)。但是，應理解，改變并優(yōu)化上述參數(shù)以及其它這些相似的參數(shù)是常規(guī)的實驗。
將生物或細胞培養(yǎng)于包含允許產(chǎn)生共聚物的碳源的培養(yǎng)基中。在一些實施方案中，將任意油和/或脂肪酸用作碳源，如任意植物油、脂肪酸或脂肪酸衍生物或其組合。植物油的例子包括棕櫚油、大豆油、菜籽油、玉米油、棉籽油、花生油、椰子油和紅花油；其他的油和脂肪酸為本領域所熟知。用于最佳共聚物生產(chǎn)的碳源的組成可取決于所述使用的生物或細胞的特定株系。在一些實施方案中，如本領域技術人員所知，培養(yǎng)基的其它組分包括氮源、無機鹽、選擇性組分(如抗生素)或其它營養(yǎng)源等的多種組合。用于培養(yǎng)本發(fā)明相關細胞的液體培養(yǎng)基可封裝于本領域已知和使用的任何培養(yǎng)容器中。在一些實施方案中，可以利用通氣反應容器(如攪拌釜反應器)中的大規(guī)模生產(chǎn)來大量產(chǎn)生本發(fā)明具有高含量中等鏈長單體的聚羥基脂肪酸酯共聚物，如聚(HB-co-HHx)共聚物。對本領域技術人員而言在連續(xù)的基礎上生產(chǎn)PHA聚合物和共聚物的方法也是已知的；這些方法例如在美國專利5，534，432中有所描述，其通過引用合并到本文中用于指導。所述PHA共聚物可分離自生物、細胞或培養(yǎng)基，在它們中通過本領域已知的方法產(chǎn)生。一個例子在下文的實施例中有所描述，其中在氯仿中從凍干細胞提取聚合物48小時。還可參見，例如，美國專利 5，942，597,5, 918，747,5, 899，339,5, 849，854和 5，821，299 ；EP 859858A1 ；W0 97/07229、WO 97/07230 和 WO 97/15681 ;每ー專利都通過引用合并到本
文中用于這些指導。作為ー個非限制的例子，可使用在美國專利申請2009/0130731中描述的方法。培養(yǎng)后，通過離心分離器等將細菌細胞從培養(yǎng)基中分離，并且將細菌細胞用蒸餾水和甲醇等洗滌，并干燥。從干燥的細菌細胞中，使用有機溶劑如氯仿提取聚酷。通過過濾等將細菌細胞組分從該包含聚酯的有機溶劑溶液中移除，并且將不良溶劑(如甲醇或己烷)加入濾液以使所述聚酯沉淀。另外，將上清通過過濾或離心分離移除，并干燥。其它的方法將為本領域技術人員所知。根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的共聚物能夠用于任何本領域已知的許多用途。例如，美國專利7，455，999在題為“Applications for the Compositions”的章節(jié)中及其引用的參考文獻中對PHA聚合物的大量用途及該聚合物的物理特性進行了描述。每一公開內(nèi)容通過引用合并到本文中用于這些指導。在一些實施方案中，本發(fā)明包括分離的或基本上純化的PHA合酶核酸或多肽、包含或表達這些核酸或多肽的構(gòu)建體或載體以及包含這些核酸、多肽、構(gòu)建體或載體的細胞或生物。如本文所公開的，能夠摻入高比例3-羥基己酸單體的食醚紅球菌124的PHA合酶通過分子克隆的方法確定和分離。所分離的PHA合酶也在本文中也稱為如“紅球菌(Rhodococcus) C09 合酶” (SEQ ID NO 1 和 2)或紅球菌(Rhodococcus)D12 合酶” (SEQ IDNO 3 和 4)?！胺蛛x的”或“純化的”核酸分子或蛋白或者其生物活性部分基本上不含其它的細胞材料或培養(yǎng)基(當通過重組技術生產(chǎn)吋)，或者基本上不含化學前體或其它化學品(當化學合成吋)。優(yōu)選地，“分離的”核酸不含在該核酸來源生物的基因組DNA中天然位于所述核酸的側(cè)翼(即，位于所述核酸的5’和3’端的序列)的序列(優(yōu)選為蛋白質(zhì)編碼序列)。例如，在多種實施方案中，分離的核酸分子可包含在所述核酸的來源細胞中基因組DNA中天然位于所述核酸側(cè)翼的少于約5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0. 5kb或O. Ikb的核酸序列?；旧喜缓毎牧系亩嚯?也被稱為蛋白質(zhì))包括多肽制備物，其具有少于約30%、20%、10%、5% (以干重計)的污染多肽。當所述多肽或其生物活性部分重組生產(chǎn)時，優(yōu)選地，培養(yǎng)基占不是所述多肽的化學前體物或其它組分的少于約(以干重計)。因此，本發(fā)明還包含所公開核酸分子及其編碼多肽的片段和變體。“片段”意為核 酸分子的核苷酸序列的一部分，或其編碼多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可編碼保持天然多肽的生物活性的多肽片段?；蛘撸塑账嵝蛄械钠慰捎米魍ǔ２痪幋a保持天然多肽生物活性的多肽片段的雜交探針。因而，核苷酸序列的片段可從約20個核苷酸、約50個核苷酸、約100個核苷酸一直到編碼本文公開的多肽的全長核苷酸序列。編碼多肽的生物活性部分的本發(fā)明核苷酸序列片段可編碼至少15個、25個、30個、50個、100個、150個、200個、250個、300個、350個、400個、450個、500個或550個連續(xù)的氨基酸，或一直到全長多肽中的全部數(shù)目的氨基酸(例如，對于SEQ ID NO :2而言為562個氨基酸或?qū)τ赟EQ ID NO :4而言為561個氨基酸)。多肽的生物活性部分可通過如下方式制備分離本文公開的核苷酸序列之一的一部分、表達所編碼的多肽部分(例如，通過體外重組表達)并且評價所編碼的多肽部分的活性。作為本文所述核苷酸序列片段的核酸分子(不論是否編碼多肽的生物活性片段)包含至少15個、20個、30個、45個、60個、75個、100 個、150 個、200 個、250 個、300 個、350 個、400 個、450 個、500 個、550 個、600 個、650 個、700 個、800 個、900 個、1000 個、1100 個、1200 個、1300 個、1400 個、1500 個或 1600 個核苷酸，或一直到本文公開的全長核苷酸序列中的核苷酸數(shù)目(例如，對于SEQ ID N0:1而言為1689個核苷酸或?qū)τ赟EQ ID NO 3而言為1686個氨基酸)?！白凅w”意為與本文公開的序列顯著相似的序列。對核苷酸序列而言，保守性變體包括由于遺傳密碼的簡并性而編碼參與本發(fā)明共聚物合成的多肽之ー或其它酶的氨基酸序列的那些序列。天然存在的等位基因變體(如這些)可用熟知的分子生物學技術確定，例如如下文所述用聚合酶鏈式反應(PCR)和雜交技術。變體核苷酸序列還包括合成產(chǎn)生的核苷酸序列，如通過例如使用定點誘變產(chǎn)生但仍然編碼如本文公開的多肽的那些。通常，本發(fā)明特定核苷酸序列的變體與該特定核苷酸序列將具有至少約50 %、60 %、65 %、70 %、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多的序列同一性，這通過使用默認參數(shù)的本文別處描述的序列比對程序而確定。本文描述的核苷酸序列可用于不僅從其它生物(尤其是其它細菌)而且從如本文所描述的其它生物或細胞中分離相應的序列。以這種方式，可以基于與本文所述序列的序列同源性，用如PCR、雜交等方法鑒定這些序列。本發(fā)明包括基于其與本文所述完整核苷酸序列或其片段的序列同一性而分離的序列。這些序列包括作為所公開的序列的直系同源物的序列?！爸毕低次铩币鉃樵醋怨餐淖嫦然虿⑶矣捎谖锓N形成而存在于不同物種中的基因。當它們的核苷酸序列和/或它們編碼的多肽序列具有如本文別處定義的顯著同一性吋，則認為發(fā)現(xiàn)于不同物種的基因是直系同源物。直系同源物的功能在物種間常常是高度保守的。在基于PCR的方法中，可以設計用于PCR反應的寡核苷酸引物，以從提取自任何目的生物的cDNA或基因組DNA中擴增相應的DNA序列。用于設計PCR引物或PCR克隆的方法通常為本領域公知并公開在例如Sambrook et al. (1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual (2d ed. , Cold bpring Harbor Laooratory Press, Plamview,N. Y. ) o 還參見，Innis et al. , ed. (1990)PCR Protocols A Guide to Methodsand Applications(Academic Press, New York) ；Innis and Gelfand ed. (1995)PCRStrategies (Academic Press,New York)以及 Innis and Gelfand ed. (1999) PCR MethodsManual (Academic Press, New York)。已知的PCR方法包括但不限于使用成對引物、巢式引物、單特異性引物、簡并引物、基因特異性引物、載體特異性引物、部分錯配引物等的方法。

在雜交技術中，將已知核酸序列的全部或一部分用作探針，所述探針與選定的生物或細胞的克隆的基因組DNA片段或cDNA片段群體(如基因組或cDNA文庫)中所存在的其它相應核苷酸序列選擇性雜交。如本領域所熟知的，雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，并且可用任何可檢測標志物進行標記。因此，例如用于雜交的探針可通過對基于本文所述核苷酸序列或其簡并序列的合成寡核苷酸進行標記而制得。用于制備雜交探針以及用于構(gòu)建cDNA和基因組文庫的方法為本領域所公知并公開于，例如 Sambrook et al. (1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual (2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)。這些序列的雜交可在嚴格條件下進行?！皣栏駰l件”或“嚴格雜交條件”意為這樣的條件，在該條件下探針與其目標序列以可檢測的更高程度(與其他序列相比)發(fā)生雜交(例如，至少超過背景的2倍)。嚴格條件是序列依賴性的，并且在不同的情況下也將不同。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴格度，可鑒定與所述探針100%互補的目標序列(同源雜交(homologous probing))。或者,可調(diào)節(jié)嚴格條件到允許在序列中ー些錯配以便檢測較低的相似度(異源雜交(heterologous probing))。通常,探針在長度上少于約1000個核苷酸，優(yōu)選地在長度上少于500個核苷酸。在嚴格雜交條件下用于雜交的各種技術、方法、條件和組合物為本領域所熟知并可發(fā)現(xiàn)于文獻,如Ti jssen (1993) Laboratory Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization witn Nucleic Acid Probes,Part I, Chapter 2 (Elsevier, N. Y.)和 Ausubel et al. ed. (1995)Current Protocolsin Molecular Biology, Chapter 2(Greene Publishing and ffiley-Interscience, NewYork) o 參見 Sambrook et al. (1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual (2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N. Y.)。本發(fā)明包括在嚴格條件下與本文公開的PHA合酶序列或其片段雜交的分離的序列。在一些實施方案中，這些序列將與本公開內(nèi)容的序列有至少約
80%、85%、90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高的同源性。也就是說，所述序列的序列同一性可與本文公開的序列有至少約50 %、60 %、65 %、70 %、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多的序列同一,I"生。用于比較的序列比對方法為本領域所熟知。使用數(shù)學算法可以完成任何兩個序列之間序列同一性百分數(shù)的測定。這些數(shù)學算法的非限制性例子是Myers and Miller (1988)CABIOS 4 :11-17 的算法、Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2 :482 的局部同源性算法、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48 :443-453 的同源性比對算法、Pearsonand Lipman (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. 85 :2444-2448 的相似性檢索方法、如在 Karlinand Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 中修改的 Karlin andAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :2264-2268 的算法。這些數(shù)學算法的計算機工具可用于序列比較以確定序列同一性。這些工具包括但不限于PC/Gene 程序中的 CLUSTAL (購于 Intelligenetics, Mountain View,Calif.) ;ALIGN程序(2. O版)和第8版威斯康星遺傳學軟件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的 GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA 和 TFASTA (購于 Genetics Computer Group (GCG), 575Science Drive, Madison, ffis. , USA)。還可通過互聯(lián)網(wǎng)在美國國家生物技術信息中心(NCBI ；參見,例如，www. ncbi. nlm. nih. gov 或 blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast, cgi)的網(wǎng)站上利用BLAST和相關程序(如其它序列比較程序)。使用這些程序的比對可使用默認參數(shù)進行。Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215 :403的BLAST程序是基于Karlin和Altschul (1990)的算法。例如，BLAST核苷酸檢索可用BLASTN程序(分數(shù)=100，字長=12)進行以獲得與編碼本文所述多肽的核苷序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質(zhì)檢索可用BLASTX程序(分數(shù)=50，字長=3)進行以獲得與本文所述多肽的氨基酸序列同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的缺ロ比對，可使用如在Altschul et al. (1997)Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402 中描述的 Gapped BLAST(在 BLAST 2· O 中)?；蛘?，PSI-BLAST(在BLAST 2. O中)可用于進行檢測分子間遠親關系的迭代搜索。參見Altschulet al. (1997)。當使用 BLAST、Gapped BLAST、PSI_BLAST 時，可使用各自程序(例如，BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白質(zhì))的默認參數(shù)。在一些實施方案中，本文描述的ー種或更多種基因在一種或更多種重組表達載體中表達。這些載體可単獨地或組合地(如在操縱子排列中)包含基因。如本文所使用的“載體”可以是任何數(shù)量的核苷酸，其中可通過限制性酶處理和連接而將期望的序列插入，用于在不同遺傳環(huán)境中的轉(zhuǎn)移或用于在宿主細胞中的表達。載體通常由DNA構(gòu)成，但也有RNA載體可用。載體包括但不限于質(zhì)粒、福斯質(zhì)粒(fosmid)、曬粒(phagemid)、病毒基因組和人工染色體?？寺≥d體是能夠在宿主細胞中自主復制或整合到基因組中的載體，其進ー步特征在于所述載體可通過ー種或更多種限制性核酸內(nèi)切酶位點以確定的方式切開，并可將期望的DNA序列連接到其中，以使新的重組載體保持其在宿主細胞中復制的能力。對于質(zhì)粒的情況，期望序列的復制可隨著質(zhì)粒在宿主細胞(宿主細菌)中拷貝數(shù)的増加發(fā)生許多次，或在僅在宿主通過有絲分裂繁殖之前每個宿主僅發(fā)生一次。對于噬菌體的情況，復制可在裂解階段主動地發(fā)生，或在溶原階段被動地發(fā)生。表達載體是可通過限制性酶處理及連接將期望的DNA插入其中以使該序列與調(diào)控序列有效連接并可表達成RNA轉(zhuǎn)錄本的載體。載體可進ー步包含適于鑒別細胞是否轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)然染有該載體的一種或更多種標記序列。標記包括如編碼提高或降低對抗生素或其它化合物之抗性或敏感性的蛋白質(zhì)的基因、編碼可通過本領域已知的標準試驗檢測酶活性的酶(例如，β-半乳糖苷酶、螢光素酶或堿性磷酸酶)的基因和以可見方式影響轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細胞、宿主、克隆或菌斑(plaque)的表型的基因(例如，綠色熒光蛋白)。優(yōu)選的載體是這樣的載體，其能夠自主復制，并表達與該載體有效連接的DNA片段中存在的結(jié)構(gòu)基因產(chǎn)物。如本文所使用的，當編碼序列和調(diào)控序列以將所述編碼序列的表達或轉(zhuǎn)錄置于所述調(diào)控序列的影響或控制下的方式共價連接時，則稱它們是“有效”連接。如果期望將編碼序列翻譯成功能性蛋白質(zhì)，那么在這種情況下稱兩DNA序列為有效連接，即在對5’調(diào)控序列中啟動子的誘導引起編碼序列轉(zhuǎn)錄，并且兩DNA序列之間連接的性質(zhì)不會⑴引起移碼突變的引入，(2)干涉啟動子區(qū)指導所述編碼序列轉(zhuǎn)錄的能力或(3)干涉相應RNA轉(zhuǎn)錄本翻譯成蛋白質(zhì)的能力。因而，如果啟動子區(qū)能夠?qū)崿F(xiàn)該DNA序 列的轉(zhuǎn)錄以致所得轉(zhuǎn)錄物能翻譯成期望的蛋白質(zhì)或多肽，那么啟動子區(qū)就是與編碼序列有效連接的。在細胞中表達編碼本發(fā)明的任何酶的核苷酸分子時，各種轉(zhuǎn)錄控制序列(例如，啟動子/增強子序列)可用于指導其表達。所述啟動子可以是天然啟動子，即所述基因在其內(nèi)源環(huán)境中的啟動子，其提供所述基因表達的正常調(diào)控。在一些實施方案中，所述啟動子可以是組成型的，即所述啟動子不受調(diào)控，以允許其相關基因的持續(xù)表達。還可使用多種條件性啟動子，如通過分子的存在與否來控制的啟動子?；虮磉_所需調(diào)控序列的確切性質(zhì)在物種或細胞類型之間可以不同，但是必要時一般應包括分別涉及轉(zhuǎn)錄和翻譯起始的5’非轉(zhuǎn)錄和5’非翻譯序列，如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。尤其是，這些5’非轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列將包含啟動子區(qū)，其包含用于有效連接之基因的轉(zhuǎn)錄控制的啟動子序列。調(diào)控序列還可包括如期望的增強子序列或上游激活序列。本發(fā)明的載體可任選地包括5’前導或信號序列。合適載體的選擇和設計在本領域技術人員的能力和判斷之內(nèi)。包含用于表達的所有必需元件的表達載體是市售的，并為本領域技術人員所知。參見，例如，SambrooK: et al. , Molecular Cloning A Laboratory Manual, SecondEdition,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。通過將外源DNA(RNA)引入到細胞中而對細胞進行基因工程。所述外源DNA (RNA)置于轉(zhuǎn)錄元件的有效控制下，以允許在所述宿主細胞中表達所述外源DNA。在實施例章節(jié)顯示了基因序列的外源表達，以促進生產(chǎn)具有高含量中等鏈長單體的聚羥基脂肪酸酯共聚物，尤其是具有高HHx含量的聚(HB-co-HHx)。用于生產(chǎn)具有高含量中等鏈長單體的聚羥基脂肪酸酯共聚物(如具有高HHx含量的聚(HB-co-HHx))的新方法還可在其它細菌細胞、古細菌細胞、真菌(包括酵母細胞)、哺乳動物細胞、植物細胞等中進行。可使用本領域中的標準方法和技術將編碼本文所述酶的核酸分子引入細胞。例如，可通過標準的方案(如轉(zhuǎn)化包括化學轉(zhuǎn)化和電穿孔、轉(zhuǎn)導、粒子轟擊等)將核酸分子引入。編碼本發(fā)明酶的ー種或更多種核酸分子的表達還可通過將所述核酸分子整合到細胞的基因組中來實現(xiàn)。
實施例實施例I :具有降低PhaB活性的菌株
単體3-羥基丁酰-輔酶A(3HB_CoA)通過β -酮硫酶(PhaA)和こ酰こ酰輔酶A還原酶(PhaB)合成自こ酰輔酶Α。真養(yǎng)雷氏菌基因組中的蛋白質(zhì)序列分析預測到了這些蛋白的已充分研究形式的許多潛在同源物(PhaA，H16_A1438 ；PhaBI, H16_A1439)。為了防止3HB-CoA合成，我們干凈地從真養(yǎng)雷氏菌基因組中缺失了基因phaBl、phaB2和phaB3。使用修改自York[l]的方法進行無標記缺失。通過PCR擴增目的基因的上游和下游DNA序列。通過重疊(overlap)PCR將該序列組合成單個連續(xù)DNA區(qū)段。設計這個過程期間使用的引物，使得將BamHI位點加入到該DNA的末端并且將SwaI位點插入該上游和下游區(qū)域之間。將該構(gòu)建體克隆到PGY46骨架的BamHI位點，以產(chǎn)生可用于在真養(yǎng)雷氏菌中產(chǎn)生目的基因的無標記缺失的質(zhì)粒[2]。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E.coli)S17-l中并通過接合引入到真養(yǎng)雷氏菌中。使用能與目的基因的上游和下游雜交的診斷引物(diagnosticprimer)通過PCR確認缺失。構(gòu)建了一系列菌株，在其中所有的phaB基因都各自地或組合地缺失(參見下文表I)。之后將這些菌株在果糖是唯一的碳源的限定培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過氮限制來誘導PHB積累。表I :菌株列表
權利要求
1.一種細胞，其使用任意植物油作為碳源產(chǎn)生具有至少約4mol%或5wt%的中等鏈長単體含量的聚羥基脂肪酸酯共聚物。
2.根據(jù)權利要求I所述的細胞，其中所述細胞使用任意植物油作為碳源產(chǎn)生具有至少約4mol %或5wt% HHx含量的3-羥基丁酸與3-羥基己酸的共聚物(聚(HB-co_HHx))。
3.根據(jù)權利要求I或2所述的細胞，其中所述細胞中3-羥基丁酸的正常合成被破壞。
4.根據(jù)權利要求3所述的細胞，其中編碼こ酰こ酰輔酶A還原酶的基因被缺失。
5.根據(jù)權利要求4所述的細胞,其中所述細胞是真養(yǎng)雷氏菌(Ralstoniaeutropha)細胞，并且PhaBl基因、phaB2基因和phaB3基因中的ー種或更多種破壞。
6.根據(jù)權利要求5所述的細胞，其中phaB3基因被破壞。
7.根據(jù)權利要求I至6中任一項所述的細胞，其中所述細胞重組表達非內(nèi)源性PHA合酶基因。
8.根據(jù)權利要求7所述的細胞，其中所述非內(nèi)源性PHA合酶基因是豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae) PHA合酶基因或食醚紅球菌(Rhodococcus aetherivorans) PHA合酶基因。
9.根據(jù)權利要求8所述的細胞，其中所述食醚紅球菌PHA合酶基因是編碼SEQID NO4的食醚紅球菌124 D12 PHA合酶基因或編碼SEQ ID NO :2的食醚紅球菌124 C09 PHA合酶基因。
10.根據(jù)權利要求9所述的細胞，其中所述食醚紅球菌124D12 PHA合酶基因包含SEQID NO :3或由其組成，和/或其中所述食醚紅球菌124 C09 PHA合酶基因包含SEQ ID NO:I或起始密碼子從TTG變?yōu)锳TG的SEQ ID NO :I或者由其組成。
11.根據(jù)權利要求I至10中任一項所述的細胞，其中所述細胞重組表達烯脂酰輔酶A水合酶基因。
12.根據(jù)權利要求11所述的細胞，其中所述烯脂酰輔酶A水合酶基因是豚鼠氣單胞菌烯脂酰輔酶A水合酶基因或銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)烯脂酰輔酶A水合酶基因。
13.根據(jù)權利要求12所述的細胞，其中所述銅綠假單胞菌烯脂酰輔酶A水合酶基因是銅綠假單胞菌PhaJl基因(基因PA3302)或銅綠假單胞菌phaJ2基因(基因PA1018)。
14.根據(jù)權利要求7至13中任一項所述的細胞，其中所述非內(nèi)源性PHA合酶基因和/或所述烯脂酰輔酶A水合酶基因是經(jīng)擴增的。
15.根據(jù)權利要求I至14中任一項所述的細胞，其中所述單體含量為至少約5mol%。
16.根據(jù)權利要求15所述的細胞，其中所述單體含量為至少約6mol%。
17.根據(jù)權利要求16所述的細胞，其中所述單體含量為至少約7mol%。
18.根據(jù)權利要求17所述的細胞，其中所述單體含量為至少約10mol%。
19.根據(jù)權利要求18所述的細胞，其中所述單體含量為至少約15mol%。
20.根據(jù)權利要求19所述的細胞，其中所述單體含量為至少約20mol%。
21.根據(jù)權利要求I至14中任一項所述的細胞，其中所述單體含量為至少約6wt%。
22.根據(jù)權利要求21所述的細胞，其中所述單體含量為至少約Swt%。
23.根據(jù)權利要求22所述的細胞，其中所述單體含量為至少約10wt%。
24.根據(jù)權利要求23所述的細胞，其中所述單體含量為至少約15wt%。
25.根據(jù)權利要求24所述的細胞，其中所述單體含量為至少約20wt%。
26.根據(jù)權利要求25所述的細胞，其中所述單體含量為至少約25wt%。
27.根據(jù)權利要求I至26中任一項所述的細胞，其中所述細胞是細菌細胞、真菌細胞(包括酵母細胞)、植物細胞、昆蟲細胞或動物細胞。
28.根據(jù)權利要求27所述的細胞，其中所述細胞是細菌細胞或真菌細胞。
29.根據(jù)權利要求28所述的細胞,其中所述細胞是雷氏菌(Ralstoniaspp.)、氣單胞菌(Aeromonas spp.)、根瘤菌(Rhizobium spp.)、產(chǎn)堿菌(Alcaligenes spp.)或假單胞菌(Pseudomonas spp.)的細胞。
30.根據(jù)權利要求29所述的細胞，其中所述細胞是真養(yǎng)雷氏菌、豚鼠氣單胞菌、大豆根瘤菌(Rhizobium japonicum)、真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligenes eutrophus)或食油假單胞菌(Pseudomonas oleovorans)的細胞。
31.根據(jù)權利要求30所述的細胞，其中所述細胞是真養(yǎng)雷氏菌細胞。
32.根據(jù)權利要求7至31中任一項所述的細胞，其中所述非內(nèi)源性PHA合酶基因和/或所述烯脂酰輔酶A水合酶基因表達自質(zhì)粒。
33.根據(jù)權利要求7至31中任一項所述的細胞，其中所述非內(nèi)源性PHA合酶基因和/或所述烯脂酰輔酶A水合酶基因整合到所述細胞的基因組中。
34.用于生產(chǎn)具有高含量中等鏈長單體的聚羥基脂肪酸酯共聚物的方法，所述方法包括培養(yǎng)根據(jù)權利要求I至33中任一項所述的細胞以生產(chǎn)具有至少4mol%或5wt%的中等鏈長單體含量的共聚物。
35.根據(jù)權利要求34所述的方法，其中所述方法包括培養(yǎng)根據(jù)權利要求2至33中任一項所述的細胞以生產(chǎn)具有至少約4mol%或5wt%的HHx含量的聚(HB-co-HHx)，其中生產(chǎn)3-羥基丁酸與3-羥基己酸的共聚物(聚(HB-co-HHx))。
36.根據(jù)權利要求34或35所述的方法，其還包括從所述細胞中回收所述共聚物。
37.根據(jù)權利要求35或36所述的方法，其中產(chǎn)生的共聚物的量為細胞干重的至少約20%。
38.根據(jù)權利要求37所述的方法，其中產(chǎn)生的共聚物的量為細胞干重的至少約30%。
39.根據(jù)權利要求38所述的方法，其中產(chǎn)生的共聚物的量為細胞干重的至少約40%。
40.根據(jù)權利要求39所述的方法，其中產(chǎn)生的共聚物的量為細胞干重的至少約50%。
41.根據(jù)權利要求40所述的方法，其中產(chǎn)生的共聚物的量為細胞干重的至少約60%。
42.用于產(chǎn)生細胞的方法,所述細胞產(chǎn)生具有至少約4mol%或5wt%的中等鏈長單體含量的聚羥基脂肪酸共聚物，所述方法包括在所述細胞中重組表達至少ー種食醚紅球菌PHA合酶基因。
43.根據(jù)權利要求42所述的方法，其中所述細胞產(chǎn)生具有至少約4mol%或5 セ％的HHx含量的3-羥基丁酸與3-羥基己酸的共聚物(聚(HB-co-HHx))。
44.根據(jù)權利要求42或43所述的方法，其中所述食醚紅球菌PHA合酶基因是編碼SEQID NO 4的食醚紅球菌124 D12 PHA合酶基因和/或編碼SEQ ID NO 2的食醚紅球菌124C09 PHA合酶基因。
45.根據(jù)權利要求42至44中任一項所述的方法，其中所述食醚紅球菌I24D12PHA合酶基因包含SEQ ID NO :3或由其組成，和/或其中所述食醚紅球菌124 C09 PHA合酶基因包含SEQ ID NO :1或起始密碼子從TTG變?yōu)锳TG的SEQ ID NO :I或者由其組成。
46.根據(jù)權利要求42至45中任一項所述的方法，其還包括重組表達烯脂酰輔酶A水合酶基因。
47.根據(jù)權利要求46所述的方法，其中所述烯脂酰輔酶A水合酶基因是豚鼠氣單胞菌烯脂酰輔酶A水合酶基因或銅綠假單胞菌烯脂酰輔酶A水合酶基因。
48.根據(jù)權利要求47所述的細胞，其中所述銅綠假單胞菌烯脂酰輔酶A水合酶基因是銅綠假單胞菌PhaJl基因(基因PA3302)或銅綠假單胞菌phaJ2基因(基因PA1018)。
49.根據(jù)權利要求42至48中任一項所述的方法，其中所述非內(nèi)源性PHA合酶基因和/或所述烯脂酰輔酶A水合酶基因是經(jīng)擴增的。
50.根據(jù)權利要求42至49中任一項所述的方法，其中所述細胞是細菌細胞、真菌細胞(包括酵母細胞)、植物細胞、昆蟲細胞或動物細胞。
51.根據(jù)權利要求50所述的方法，其中所述細胞是細菌細胞或真菌細胞。
52.根據(jù)權利要求51所述的方法，其中所述細胞是雷氏菌、氣單胞菌、根瘤菌、產(chǎn)堿菌或假單胞菌的細胞。
53.根據(jù)權利要求52所述的方法，其中所述細胞是真養(yǎng)雷氏菌、豚鼠氣單胞菌、大豆根瘤菌、真養(yǎng)產(chǎn)堿菌或食油假單胞菌的細胞。
54.根據(jù)權利要求53所述的方法，其中所述細胞是真養(yǎng)雷氏菌細胞。
55.根據(jù)權利要求42至54中任一項所述的方法，其中所述非內(nèi)源性PHA合酶基因和/或所述烯脂酰輔酶A水合酶基因表達自質(zhì)粒。
56.根據(jù)權利要求42至54中任一項所述的方法，其中所述非內(nèi)源性PHA合酶基因和/或所述烯脂酰輔酶A水合酶基因整合到所述細胞的基因組中。
57.用于生產(chǎn)具有至少約4m0l%或5wt%的中等鏈長單體含量的一種或更多種聚羥基脂肪酸酯共聚物的方法，所述方法包括根據(jù)權利要求Cl至C14中任一項所述方法產(chǎn)生細胞，以及培養(yǎng)所述細胞的群體。
58.根據(jù)權利要求57所述的方法，其中所述共聚物中的一種或更多種是3-羥基丁酸與3-羥基己酸的共聚物(聚(HB-co-HHx))。
59.根據(jù)權利要求57或58所述的方法，其還包括從所述細胞的群體中收集ー種或更多種 共聚物。
60.根據(jù)權利要求57至59中任一項所述的方法，其中所述單體含量為至少約5mol%。
61.根據(jù)權利要求60所述的方法，其中所述單體含量為至少約6mol%。
62.根據(jù)權利要求61所述的方法，其中所述單體含量為至少約7mol%。
63.根據(jù)權利要求62所述的方法，其中所述單體含量為至少約IOmol%。
64.根據(jù)權利要求63所述的方法，其中所述單體含量為至少約15m0l%。
65.根據(jù)權利要求64所述的方法，其中所述單體含量為至少約20mol%。
66.根據(jù)權利要求57至59中任一項所述的方法，其中所述單體含量為至少約6wt%。
67.根據(jù)權利要求66所述的方法，其中所述單體含量為至少約Swt%。
68.根據(jù)權利要求67所述的方法，其中所述單體含量為至少約10wt%。
69.根據(jù)權利要求68所述的方法，其中所述單體含量為至少約15wt%。
70.根據(jù)權利要求69所述的方法，其中所述單體含量為至少約20wt%。
71.根據(jù)權利要求70所述的方法，其中所述單體含量為至少約25wt%。
72.根據(jù)權利要求57至71中任一項所述的方法，其中產(chǎn)生的共聚物的量為細胞干重的至少約20%。
73.根據(jù)權利要求72所述的方法，其中產(chǎn)生的共聚物的量為細胞干重的至少約30%。
74.根據(jù)權利要求73所述的方法，其中產(chǎn)生的共聚物的量為細胞干重的至少約40%。
75.根據(jù)權利要求74所述的方法，其中產(chǎn)生的共聚物的量為細胞干重的至少約50%。
76.根據(jù)權利要求75所述的方法，其中產(chǎn)生的共聚物的量為細胞干重的至少約60%。
77.一種分離的核酸分子，其編碼SEQ ID NO:2。
78.一種分離的核酸分子，其包含SEQ ID NO : I或?qū)⑵鹗济艽a子從TTG改變?yōu)锳TG的SEQ ID NO :I所示的核苷酸序列。
79.—種分尚的核酸分子,其與SEQ ID NO :I所不核苷酸序列具有至少80%的百分比同一,I"生。
80.根據(jù)權利要求79所述的分尚的核酸分子,其中所述分尚的核酸分子與SEQID NO:I所示核苷酸序列具有至少90%的百分比同一性。
81.根據(jù)權利要求80所述的分尚的核酸分子,其中所述分尚的核酸分子與SEQID NO:I所示核苷酸序列具有至少95%的百分比同一性。
82.根據(jù)權利要求81所述的分尚的核酸分子,其中所述分尚的核酸分子與SEQID NO:I所示核苷酸序列具有至少98%的百分比同一性。
83.一種分離的多肽，其由根據(jù)權利要求77至82中任一項所述的核酸分子編碼。
84.ー種載體，其包含根據(jù)權利要求77至82中任一項所述的分離的核酸分子。
85.一種細胞，其重組表達根據(jù)權利要求77至82中任一項所述的分離的核酸分子。
86.根據(jù)權利要求85所述的細胞，其中所述核酸分子表達自載體。
87.根據(jù)權利要求85所述的細胞，其中所述核酸分子整合到所述細胞的基因組中。
88.一種分離的核酸分子，其編碼SEQ ID N0:4。
89.—種分尚的核酸分子,其包含SEQ ID NO :3所不核苷酸序列。
90.—種分尚的核酸分子,其與SEQ ID NO :3所不核苷酸序列具有至少80%的百分比同一,I"生。
91.根據(jù)權利要求90所述的分尚的核酸分子,其中所述分尚的核酸分子與SEQID NO:3所示核苷酸序列具有至少90%的百分比同一性。
92.根據(jù)權利要求91所述的分尚的核酸分子,其中所述分尚的核酸分子與SEQID NO:3所示核苷酸序列具有至少95%的百分比同一性。
93.根據(jù)權利要求92所述的分尚的核酸分子,其中所述分尚的核酸分子與SEQID NO:3所示核苷酸序列具有至少98%的百分比同一性。
94.一種分離的多肽，其由根據(jù)權利要求88至93中任一項所述的核酸分子所編碼。
95.ー種載體，其包含根據(jù)權利要求88至93中任一項所述的分離的核酸分子。
96.一種細胞，其重組表達根據(jù)權利要求88至93中任一項所述的分離的核酸分子。
97.根據(jù)權利要求96所述的細胞，其中所述核酸分子表達自載體。
98.根據(jù)權利要求96所述的細胞，其中所述核酸分子整合到所述細胞的基因組中。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過重組基因表達生產(chǎn)具有高3-羥基己酸單體含量的聚羥基脂肪酸酯共聚物。
文檔編號C12P7/62GK102822349SQ201080061115
公開日2012年12月12日 申請日期2010年11月10日 優(yōu)先權日2009年11月11日
發(fā)明者查爾斯·福里斯特·布德, 超坤·瑞哈, 安東尼·約翰·辛斯基 申請人:麻省理工學院