專利名稱：用于治療可卡因?yàn)E用的BChE白蛋白融合體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
無(wú)
背景技術(shù)：
可卡因(cocaine)濫用和依賴具有災(zāi)難性的醫(yī)學(xué)和社會(huì)后果，這些后果己使 得對(duì)有效治療的開(kāi)發(fā)尤為迫切(潘Y. (Pan，Y.)，高D. (Gao，D.)，楊W. (Yang, W.)，曹 H. (Cho, H.),楊 G. (Yang, G.),臺(tái) H. (Tai, H.)，詹 C. (Zhan, C.)，“用于抗可卡因藥物的人類丁酰膽堿酷酶的計(jì)算機(jī)重新設(shè)計(jì)(Computational redesign of humanbutyrylcholinesterase for anticocaine medication)，，，美國(guó)國(guó)豕科學(xué)院院干丨J(PNAS)，102(46) :16656-61, 2005)。然而，如布瑞米喬因(Brimi join)等人所述尚無(wú)可靠手段能治療可卡因過(guò)量或降低己實(shí)現(xiàn)戒斷成癮者的復(fù)發(fā)可能性。人類血漿丁酰膽堿酯酶(BChE)有助于正常的可卡因代謝且已被考慮用于治療可卡因毒性”(布瑞米喬因S. (Brimi join, S.)，高Y. (Gao, Y.)，安克 J. (Anker，J.)，格利登 L. (Gliddon, L.),拉弗勒 D. (LaFleur, D.)，沙哈 R. (Shah, R.),趙 Q. (Zhao, Q.)，辛格 M. (Singh, Μ.)，卡羅爾M. (Carroll, M.), “自人類丁酰膽堿酯酶工程化的可卡因水解酶在大鼠中選擇性阻斷可卡因毒性和藥物尋求的恢復(fù)(A Cocaine Hydrolase Engineered from HumanButyrylchoiinesterase Selectively Blocks Cocaine Toxicity and Reinstatement ofDrug Seeking in Rats)”，神經(jīng)精神藥理學(xué)(Neuropsychopharmacology)，33:2715-25，200野生型BChE雖然在體內(nèi)對(duì)于可卡因代謝很重要,但對(duì)可卡因的催化效率低。野生型BChE的低可卡因水解酶活性將需要使用不可承受的大量純化酶來(lái)治療可卡因?yàn)E用或過(guò)量。出于增強(qiáng)可卡因水解酶活性的目的對(duì)人類BChE執(zhí)行誘變導(dǎo)致開(kāi)發(fā)了雙突變體A328W/Y332A (相對(duì)于全長(zhǎng)BChE的殘基356和360)，這一突變體的keat為野生型BChE的40倍，且Km僅略微升高(孫H. (Sun H.)，沈M. (Shen Μ.)，彭Y. (Pang Y.)，洛克里奇0. (Lockridge 0.),布瑞米喬因S. (Brimi join, S.), “重新工程化的人類丁酰膽堿酯酶加速的可卡因代謝(Cocaine Metabolism Accelerated by a Re-Engineered HumanButyrylcholinesterase)w,藥理學(xué)與實(shí)驗(yàn)治療雜志(Journal of Pharmacology andExperimental Therapeutics)，302(2):710-716, 2002)。利用分子動(dòng)力學(xué)模擬可卡因受BChE催化水解的第一化學(xué)反應(yīng)步驟的過(guò)渡態(tài)的進(jìn)
6W. (Yang, W.),曹 H. (Cho, H.),楊 G. (Yang, G.),臺(tái) H. (Tai, H.)，詹 C. (Zhan, C.), “用于抗可卡因藥物的人類丁酰膽堿酷酶的計(jì)算機(jī)重新設(shè)計(jì)(Computational redesign ofhuman butyrylcholinesterase for anticocaine medication)，，，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院干1J(PNAS)，102 (46) : 16656-61, 2005)。為了獲得可適用于治療性用途的A227S/S315G/A356W/Y360G BChE突變體形式，將由潘(Pan)等人設(shè)計(jì)的BChE突變體的C端融合至人血清白蛋白(HSA)，因?yàn)橐延^察到，類似的融合體展現(xiàn)出穩(wěn)定性高且血漿半衰期延長(zhǎng)的有利藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。曾觀察到，包含上述突變的BChE-白蛋白融合體保有對(duì)可卡因的高催化效率且在對(duì)大鼠靜脈內(nèi)注射之后展現(xiàn)出8小時(shí)的血漿半衰期。(布瑞米喬因S. (Brimijoin，S.)，高Y. (Gao, Y.),安克 J. (Anker, J.)，格利登 L. (Gliddon, L )，拉弗勒 D. (LaFleur, D.)，沙哈R. (Shah，R.)，趙Q. (Zhao, Q.), “自人類丁酰膽堿酯酶工程化的可卡因水解酶在大鼠中選擇性阻斷可卡因毒性和藥物尋求的恢復(fù)(A Cocaine Hydrolase Engineered from HumanButyrylcholinesterase Selectively Blocks Cocaine Toxicity and Reinstatement ofDrug Seeking in Rats)”，神經(jīng)精神藥理學(xué)(Neuropsychopharmacology)，33:2715-25，200迄今為止，尚未開(kāi)發(fā)出利用包含突變A227S、S315G、A356W和Y360G的BChE-白蛋白融合體治療靈長(zhǎng)類動(dòng)物可卡因?yàn)E用或過(guò)量的有效方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種減弱靈長(zhǎng)類動(dòng)物由可卡因暴露所致的生物效應(yīng)的方法，其包含給予靈長(zhǎng)類動(dòng)物一定量的融合蛋白，所述融合蛋白包含(a)突變的丁酰膽堿酯酶(BChE)多肽，其包含序列EDDIIIATKNGKVRGMNLTVFGGTVTAFLGIPYAQPPLGRLRFKKPQSLTKWSDIWNATKYANSCCQNIDQSFPGFHGSEMWNPNTDLSEDCLYLNVWIPAPKPKNATVLIWIYGGGFQTGTSSLHVYDGKFLARVERVIVVSMNYRVGALGFLALPGNPEAPGNMGLFDQQLALQWVQKNIAAFGGNPKSVTLFGESSGAASVSLHLLSPGSHSLFTRAILQSGSFNAPWAVTSLYEARNRTLNLAKLTGCSRENETEIIKCLRNKDPQEILLNEAFVVPYGTPLGVNFGPTVDGDFLTDMPDILLELGQFKKTQILVGVNKDEGTWFLVGGAPGFSKDNNSIITRKEFQEGLKIFFPGVSEFGKESILFHYTDWVDDQRPENYREALGDVVGDYNFICPALEFTKKFSEWGNNAFFYYFEHRSSKLPWPEWMGVMHGYEIEFVFGLPLERRDNYTKAEEILSRSIVKRWANFAKYGNPNETQNNSTSWPVFKSTEQKYLTLNTESTRIMTKLRAQQCRFWTSFFPKV(SEQ ID NO 1),( b )人血清白蛋白(HSA )多肽,其包含序列DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVS
7
LAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL (SEQ ID NO :2),和(c)信號(hào)肽，其包含序列 MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG(SEQ ID NO :3)，其中所述融合蛋白的所述量有效引起靈長(zhǎng)類動(dòng)物由可卡因暴露所致的生物效應(yīng)減弱。


圖I (SEQ ID N0:4)展示 AlbuBChE,—種包含突變 A227S、S315G、A356W 和 Y360G的BChE-白蛋白融合蛋白的氨基酸序列。圖2展示在單次IM給予0. 2mg/kg、lmg/kg或5mg/kg AlbuBChE劑量之后個(gè)別稱猴(cynomolgus monkey)中的AlbuBChE血清濃度-時(shí)間分布(上圖為線性標(biāo)度，下圖為半
對(duì)數(shù)標(biāo)度)。圖3展示在單次IM給予0. 2mg/kg、lmg/kg或5mg/kg AlbuBChE劑量之后稱猴中的平均AlbuBChE血清濃度-時(shí)間分布(上圖為線性標(biāo)度,下圖為半對(duì)數(shù)標(biāo)度)。圖4展示對(duì)照動(dòng)物(n=2)和隨AlbuBChE給藥后時(shí)間推移的動(dòng)物(n=3)中的平均可卡因濃度相對(duì)于時(shí)間的分布。圖5展示對(duì)照動(dòng)物(n=2)和隨AlbuBChE給藥后時(shí)間推移的動(dòng)物(n=3)中的平均苯甲酰芽子堿濃度相對(duì)于時(shí)間的分布。圖6展示對(duì)照動(dòng)物(n=2)和隨AlbuBChE給藥后時(shí)間推移的動(dòng)物(n=3)中的平均芽子堿甲酯濃度相對(duì)于時(shí)間的分布。 圖7展示可卡因?qū)φ战M第I天與0. 2mg/kg、lmg/kg或5mg/kg AlbuBChE給藥后第11天(240小時(shí))的平均可卡因濃度-時(shí)間分布的比較。圖8展示在單次IM給予0. 2mg/kg、lmg/kg或5mg/kg AlbuBChE劑量之后稱猴的AlbuBChE PK/PD分析。在對(duì)照動(dòng)物或AlbuBChE給藥后2小時(shí)、48小時(shí)、96小時(shí)、120小時(shí)和240小時(shí)的動(dòng)物中IV給予lmg/kg劑量的可卡因。圖9展示可卡因代謝途徑。圖10展示在對(duì)照動(dòng)物(n=2)和隨AlbuBChE給藥后時(shí)間推移的動(dòng)物(n=3)中IV給予lmg/kg可卡因之后的平均可卡因AUC(()_t)。圖11展示在對(duì)照動(dòng)物(n=2)和隨AlbuBChE給藥后時(shí)間推移的動(dòng)物(n=3)中IV給予lmg/kg可卡因之后的平均苯甲酰芽子堿AUC(()_t)。圖12展示在單次IM給予5mg/kg AlbuBChE劑量之后個(gè)別松鼠猴的AlbuBChE血清濃度-時(shí)間分布(半對(duì)數(shù)標(biāo)度)。圖13展示對(duì)照動(dòng)物(n=2)和隨AlbuBChE給藥后時(shí)間推移的動(dòng)物(n=3)的平均可卡因濃度相對(duì)于時(shí)間的分布。
圖15展示在對(duì)照動(dòng)物(n=2)和隨AlbuBChE給藥后時(shí)間推移的動(dòng)物(n=3)中IV給予lmg/kg可卡因后5分鐘時(shí)的平均苯甲酰芽子堿濃度。圖16展示可卡因注射后5分鐘(上圖)和30分鐘(下圖)時(shí)可卡因以及可卡因代謝物芽子堿甲酯(EME)和苯甲酰芽子堿(BZ)的松鼠猴血液水平的匯總。圖17展示在單次IM給予5mg/kg AlbuBChE劑量之后松鼠猴的AlbuBChE PK/PD分析。在對(duì)照動(dòng)物(n=2)或在AlbuBChE給藥后2小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí)的動(dòng)物(n=3)中IV給予lmg/kg劑量的可卡因。圖18展示在單次IM給予15mg/kg AlbuBChE劑量或調(diào)配緩沖液之前和之后獼猴的平均心率相對(duì)于時(shí)間的分布。圖19展示在單次IM給予15mg/kg AlbuBChE劑量或調(diào)配緩沖液之前和之后獼猴的平均心率血壓乘積相對(duì)于時(shí)間的分布。 圖20展示在單次IM給予15mg/kg AlbuBChE劑量或調(diào)配緩沖液之前和之后獼猴的平均動(dòng)脈血壓相對(duì)于時(shí)間的分布。圖21展示在單次IM給予15mg/kg AlbuBChE劑量或調(diào)配緩沖液之前和之后獼猴的平均舒張壓(diastolic blood pressure)相對(duì)于時(shí)間的分布。圖22展示在單次IM給予15mg/kg AlbuBChE劑量或調(diào)配緩沖液之前和之后獼猴的平均收縮壓(systolic blood pressure)相對(duì)于時(shí)間的分布。圖23展示在單次IM給予15mg/kg AlbuBChE劑量或調(diào)配緩沖液之前和之后獼猴的平均體溫相對(duì)于時(shí)間的分布。圖24A展示在單次IM給予15mg/kg AlbuBChE劑量或調(diào)配緩沖液之前和之后獼猴的平均呼吸速率相對(duì)于時(shí)間的分布。雄性獼猴的數(shù)據(jù)展示于圖24B的上圖中，且雌性獼猴的數(shù)據(jù)展示于圖24B的下圖中。圖25A展示在單次IM給予15mg/kg AlbuBChE劑量或調(diào)配緩沖液之前和之后獼猴的平均SP02水平相對(duì)于時(shí)間的分布。雄性獼猴的數(shù)據(jù)展示于圖25B的上圖中，且雌性獼猴的數(shù)據(jù)展示于圖25B的下圖中。圖26展示在單次IM給予15mg/kg AlbuBChE劑量或調(diào)配緩沖液之前和之后獼猴的平均ETC02水平相對(duì)于時(shí)間的分布。雄性獼猴的數(shù)據(jù)展示于圖26B的上圖中，且雌性獼猴的數(shù)據(jù)展示于圖26B的下圖中。圖27展示在15mg/kg AlbuBChE劑量后3小時(shí)IV給予lmg/kg劑量的可卡因之后獼猴的平均動(dòng)脈血壓相對(duì)于時(shí)間的分布。在t=0時(shí)給予可卡因劑量。圖28展示在15mg/kg AlbuBChE劑量后3小時(shí)IV給予lmg/kg劑量的可卡因之后獼猴的平均舒張壓相對(duì)于時(shí)間的分布。在t=0時(shí)給予可卡因劑量。圖29展示在15mg/kg AlbuBChE劑量后3小時(shí)IV給予lmg/kg劑量的可卡因之后獼猴的平均收縮壓相對(duì)于時(shí)間的分布。在t=0時(shí)給予可卡因劑量。圖30展示在15mg/kg AlbuBChE劑量后3小時(shí)IV給予lmg/kg劑量的可卡因之后獼猴的平均心率相對(duì)于時(shí)間的分布。在t=0時(shí)給予可卡因劑量。圖31展示在15mg/kg AlbuBChE劑量后3小時(shí)IV給予lmg/kg劑量的可卡因之后
9獼猴的平均體溫相對(duì)于時(shí)間的分布。在t=0時(shí)給予可卡因劑量。圖33展示在可自行給予可卡因或鹽水的連續(xù)數(shù)天內(nèi)在自行給藥階段期間松鼠猴的反應(yīng)率(上圖)和注射次數(shù)(下圖)。在給予媒劑或AlbuBChE (5mg/kg)之后追蹤反應(yīng)持續(xù)5天。圖34展示在給予AlbuBChE或AlbuBChE媒劑之后可卡因自行給藥的恢復(fù)程度。肌肉內(nèi)給予AlbuBChE或媒劑。2小時(shí)、48和96小時(shí)后，在鹽水替代階段前5分鐘靜脈內(nèi)給予0. 3mg/kg可卡因(左圖)或靜脈內(nèi)給予0. lmg/kg可卡因(右圖)。圖35展示AlbuBChE對(duì)經(jīng)甲基苯丙胺訓(xùn)練的個(gè)體中可卡因區(qū)別性刺激效應(yīng)的調(diào)節(jié)。圖36展示AlbuBChE給藥后經(jīng)甲基苯丙胺訓(xùn)練的個(gè)體中的甲基苯丙胺區(qū)別性刺激效應(yīng)。圖37展示白蛋白融合體與非融合肽相比的相對(duì)血清濃度,其中白蛋白融合體每周給予一次且非融合肽每日給予。圖38展示自CHO細(xì)胞純化的AlbuBChE的SDSHPAGE。泳道I是分子量標(biāo)記物，且泳道2和泳道4分別展示在還原和非還原條件下的純化的AlbuBChE。圖39展示在可卡因給藥之前經(jīng)野生型BChE或AIbu-CocH處理的大鼠、僅給予可卡因劑量的大鼠和既未給予可卡因也未給予BChE的大鼠中的光束穿過(guò)次數(shù)(beamcrossing)相對(duì)于時(shí)間的分布。如布瑞米喬因(Brimijoin)等人中所述，通過(guò)檢測(cè)紅外線光束的斷開(kāi)數(shù)來(lái)評(píng)估自主活動(dòng)(Locomotor activity)。圖40展示AlbuBChE給藥后小鼠中的AlbuBChE濃度相對(duì)于時(shí)間的分布，而且展示AlbuBChE給藥后可卡因水解(以可卡因給藥60分鐘內(nèi)可卡因轉(zhuǎn)化成苯甲酸的百分比(BA%)表示)相對(duì)于時(shí)間的分布。圖41展示自大鼠(n=6)收集的腦和心中的可卡因含量，所述大鼠通過(guò)尾靜脈給予AlbuBChE (3mg/kg)劑量或鹽水，接著10分鐘后同樣通過(guò)尾靜脈給予30 y Ci 3H-可卡因(3. 5mg/kg)o 3H-可卡因給藥后10分鐘收集腦和心。從左到右，對(duì)照數(shù)據(jù)是第I條和第3條，而AlbuBChE數(shù)據(jù)是第2條和第4條。圖42展示自大鼠收集的腦、心和血漿中的可卡因水平(左圖)和苯甲酸酯水平(右圖)，所述大鼠被給予3mg/kg AlbuBChE劑量或鹽水，10分鐘后給予30 u Ci 3H-可卡因劑量(3. 5mg/kg)?？煽ㄒ蚪o藥后10分鐘收集腦、心和血衆(zhòng)。圖43展示檢查AlbuBChE防止致命性過(guò)度劑量的能力的研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。圖44 展示應(yīng)答 0mg/kg、lmg/kg、3mg/kg 或 10mg/kg 劑量的 AlbuBChE 后 10 分鐘所給予的100mg/kg劑量的可卡因而展現(xiàn)出機(jī)能亢進(jìn)、癲癇和死亡的大鼠的百分比。圖45展示史泊格多利(Sprague Dawley)大鼠中可卡因濃度相對(duì)于時(shí)間的分布，所述大鼠被給予0mg/kg、2mg/kg和10mg/kg IV劑量的AlbuBChE，接著5分鐘后給予60mg/kg或100mg/kg IP劑量的可卡因。圖46展示成癮和復(fù)發(fā)的行為模型?！癝”和“D”分別表示鹽水和藥物可卡因。訓(xùn)練動(dòng)物觸發(fā)杠桿按壓以達(dá)成可卡因輸注。在穩(wěn)定(維持)之后，用鹽水替代可卡因且使行為消斷。用IV注射鹽水(S)、可卡因(C，10mg/kg)或苯丙胺(A,2mg/kg)來(lái)引發(fā)已先前自行給予可卡因且在可卡因置換為鹽水時(shí)消退的大鼠。在行為階段前2小時(shí)，IV給予AlbuBChE (E,
2mg/kg)o圖48展示在成癮階段和強(qiáng)迫戒斷后，在鹽水注射、可卡因注射(10mg/kg，IV)或是AlbuBChE (2mg/kg, IV)后給予可卡因(10mg/kg, IV)后，大鼠中每階段的杠桿按壓次數(shù)。圖49展示在單次靜脈內(nèi)(IV)、皮下(SC)或肌肉內(nèi)(IM)注射后獼猴的AlbuBChE生物可用性、半衰期和達(dá)到最大濃度的時(shí)間Tmax,相對(duì)于3mg/kg劑量水平下的IV計(jì)算IM和SC給藥途徑的AlbuBChE絕對(duì)生物可用性。
具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供一種減弱靈長(zhǎng)類動(dòng)物由可卡因暴露所致的生物效應(yīng)的方法，其包含給予靈長(zhǎng)類動(dòng)物一定量的融合蛋白，所述融合蛋白包含(a)突變的丁酰膽堿酯酶(BChE)多肽，其包含序列EDDIIIATKNGKVRGMNLTVFGGTVTAFLGIPYAQPPLGRLRFKKPQSLTKWSDIWNATKYANSCCQNIDQSFPGFHGSEMWNPNTDLSEDCLYLNVWIPAPKPKNATVLIWIYGGGFQTGTSSLHVYDGKFLARVERVIVVSMNYRVGALGFLALPGNPEAPGNMGLFDQQLALQWVQKNIAAFGGNPKSVTLFGESSGAASVSLHLLSPGSHSLFTRAILQSGSFNAPWAVTSLYEARNRTLNLAKLTGCSRENETEIIKCLRNKDPQEILLNEAFVVPYGTPLGVNF
GPTVDGDFLTDMPDILLELGQFKKTQILVGVNKDEGTWFLVGGAPGFSKDNNSIITRKEFQEGLKIFFPGVSEFGKESILFHYTDWVDDQRPENYREALGDVVGDYNFICPALEFTKKFSEWGNNAFFYYFEHRSSKLPWPEWMGVMHGYEIEFVFGLPLERRDNYTKAEEILSRSIVKRWANFAKYGNPNETQNNSTSWPVFKSTEQKYLTLNTESTRIMTKLRAQQCRFWTSFFPKV(SEQ ID NO 1),(b)人血清白蛋白(HSA)多肽，其包含序列DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVS
KLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKEMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL (SEQ ID N0:2)，和(c)信號(hào)肽，其包含序列 MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG(SEQ ID NO 3)，其中所述融合蛋白的所述量有效引起靈長(zhǎng)類動(dòng)物由可卡因暴露所致的生物效應(yīng)
11
MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARGEDDIIIATKNGKVRGMNLTVFGGTVTAFLGIPYAQPPLGRLRFKKPQSLTKWSDIWNATKYANSCCQNIDQSFPGFHGSEMWNPNTDLSEDCLYLNVWIPAPKPKNATVLIWIYGGGFQTGTSSLHVYDGKFLARVERVIVVSMNYRVGALGFLALPGNPEAPGNMGLFDQQLALQWVQKNIAAFGGNPKSVTLFGESSGAASVSLHLLSPGSHSLFTRAILQSGSFNAPWAVTS LYEARNRTLNLAKLTGCSRENETEIIKCLRNKDPQEILLNEAFVVPYGTPLGVNFGPTVDGDFLTDMPDILLELGQFKKTQILVGVNKDEGTWFLVGGAPGFSKDNNSIITRKEFQEGLKIFFPGVSEFGKESILFHYTDWVDDQRPENYREALGDVVGDYNFICPALEFTKKFSEWGNNAFFYYFEHRSSKLPWPEWMGVMHGYEIEFVFGLPLERRDNYTKAEEILSRSIVKRWANFAKYGNPNETQNNSTSWPVFKSTEQKYLTLNTESTRIMTKLRAQQCRFWTSFFPKVDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLEETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL(SEQ ID NO :4)。在方法的另一實(shí)施例中,在可卡因暴露之前給予融合蛋白。在另一實(shí)施例中,在可卡因暴露前至多一天給予融合蛋白。在另一實(shí)施例中,在可卡因暴露前至多216小時(shí)給予融合蛋白?？稍诳煽ㄒ虮┞肚?、2、3、4、5、6、7、8或9天給予融合蛋白。在方法的另一實(shí)施例中在可卡因暴露之后給予，融合蛋白。在另一實(shí)施例中，在可卡因暴露后至多六小時(shí)給予融合蛋白。在另一實(shí)施例中，在可卡因暴露后至多一小時(shí)給予融合蛋白。在方法的另一實(shí)施例中，可卡因暴露是單次可卡因暴露。在方法的另一實(shí)施例中，可卡因暴露是重復(fù)性可卡因暴露。在方法的另一實(shí)施例中，重復(fù)性可卡因暴露是可卡因?yàn)E用或可卡因依賴。在方法的另一實(shí)施例中，重復(fù)性可卡因暴露包含在12個(gè)月期間至少六次單次可卡因暴露。在方法的另一實(shí)施例中，重復(fù)性可卡因暴露包含在靈長(zhǎng)類動(dòng)物一生期間至少二十次單次可卡因暴露。在方法的另一實(shí)施例中，生物效應(yīng)由靈長(zhǎng)類動(dòng)物中可卡因過(guò)量引起，且減弱是治療或預(yù)防所述生物效應(yīng)。在方法的另一實(shí)施例中，生物效應(yīng)是血壓增高。
12
在方法的另一實(shí)施例中，生物效應(yīng)是心率或體溫增高。在方法的另一實(shí)施例中，減弱程度為45%到70%。在方法的另一實(shí)施例中,減弱程度為57%。在方法的另一實(shí)施例中，生物效應(yīng)是靈長(zhǎng)類動(dòng)物的可卡因?qū)で笮袨椤Ｔ诜椒ǖ牧硪粚?shí)施例中，可卡因?qū)で笮袨槌霈F(xiàn)在可卡因暴露之后的可卡因戒斷時(shí)期期間。在方法的另一實(shí)施例中，可卡因?qū)で笮袨榘橛袕?fù)發(fā)。在方法的另一實(shí)施例中，在復(fù)發(fā)前兩小時(shí)給予融合蛋白在復(fù)發(fā)后立即減弱靈長(zhǎng)類動(dòng)物的可卡因?qū)で笮袨椤Ｔ诜椒ǖ牧硪粚?shí)施例中，在可卡因暴露前兩小時(shí)給予融合蛋白引起靈長(zhǎng)類動(dòng)物的可卡因?qū)で笮袨闇p少50%到100%。 在方法的另一實(shí)施例中，在給予融合蛋白后至多四天觀察到可卡因?qū)で笮袨榈臏p在方法的另一實(shí)施例中,給予融合蛋白所產(chǎn)生的靈長(zhǎng)類動(dòng)物的總可卡因暴露比不給予時(shí)低。在方法的另一實(shí)施例中，減弱可卡因?qū)で笮袨楫a(chǎn)生靈長(zhǎng)類動(dòng)物的可卡因戒斷時(shí)期。在方法的另一實(shí)施例中，戒斷時(shí)期為2周到3周。在方法的另一實(shí)施例中，減弱可卡因?qū)で笮袨樗a(chǎn)生的靈長(zhǎng)類動(dòng)物不暴露于可卡因的天數(shù)比不給予時(shí)多。在方法的另一實(shí)施例中，減弱可卡因?qū)で笮袨樗a(chǎn)生的靈長(zhǎng)類動(dòng)物不暴露于可卡因的連續(xù)天數(shù)比不給予時(shí)多。在方法的另一實(shí)施例中，如利用可卡因選擇性嚴(yán)重程度評(píng)估(cocaine selectiveseverity assessment，CSSA)或精神疾病診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè) IV(Diagnostic and StatisticalManual of Mental Disorders IV，DSM-IV)所評(píng)估，減弱可卡因?qū)で笮袨橐鹂煽ㄒ蛞蕾嚮驗(yàn)E用的嚴(yán)重程度減弱。在方法的另一實(shí)施例中，融合蛋白的有效量為在靜脈內(nèi)給予lmg/kg可卡因約30分鐘內(nèi)使靈長(zhǎng)類動(dòng)物的血清可卡因水平降低到約Ong/ml的量。在方法的另一實(shí)施例中,給予融合蛋白在靜脈內(nèi)給予lmg/kg可卡因約5分鐘內(nèi)使靈長(zhǎng)類動(dòng)物的血清可卡因水平降低到低于不給予時(shí)血清可卡因水平的12%。在方法的另一實(shí)施例中,給予融合蛋白在靜脈內(nèi)給予lmg/kg可卡因約5分鐘內(nèi)使靈長(zhǎng)類動(dòng)物的血清可卡因水平降低到不給予時(shí)血清可卡因水平的7%。在方法的另一實(shí)施例中，僅一次、每日、每半周、每周、每?jī)芍芑蛎吭陆o予融合蛋白。在另一實(shí)施例中，每周一次或每周兩次給予融合蛋白。在另一實(shí)施例中，在可卡因暴露之后以單劑量形式給予融合蛋白。在另一實(shí)施例中,在可卡因過(guò)量之后以單劑量形式給予融合蛋白。在方法的另一實(shí)施例中，通過(guò)肌肉內(nèi)注射或皮下注射來(lái)給予融合蛋白。在方法的另一實(shí)施例中，融合蛋白是在包含IOmM磷酸鈉、200mM甘露糖醇、60mM海
13
在方法的另一實(shí)施例中,在給予融合蛋白后至多72小時(shí)觀察到生物效應(yīng)的減弱。在方法的另一實(shí)施例中,靈長(zhǎng)類動(dòng)物是人類。在方法的另一實(shí)施例中，可卡因暴露是IOmg到60mg的單次可卡因暴露；或是重復(fù)性可卡因暴露,其中重復(fù)性可卡因暴露中各單次可卡因暴露是IOmg到60mg。在方法的另一實(shí)施例中，融合蛋白的有效量是在靜脈內(nèi)給予40mg可卡因約30分鐘內(nèi)使人類的血清可卡因水平降低到約Ong/ml的量。在方法的另一實(shí)施例中，融合蛋白的有效量是0. 06mg/kg到5mg/kg。在方法的另—實(shí)施例中，融合蛋白的有效量是0. 06mg/kg、0. 3mg/kg、l. 6mg/kg或4. 8mg/kg。在方法的另一實(shí)施例中，融合蛋白的有效量是50mg到300mg。在方法的另一實(shí)施例中，融合蛋白的有效量是50mg、IOOmg> 15Omg或300mg。包含氨基酸取代A227S、S315G、A356W和Y360G的BChE-白蛋白融合蛋白的一個(gè)實(shí)施例展示于圖I中(SEQ ID N0:4)o圖I中所展示的氨基酸序列包含異源信號(hào)肽(通過(guò)加下劃線來(lái)展示)、包含人類BChE氨基酸E29到V529的BChE域和人血清白蛋白(HSA)(以斜體展示)。在圖I中，氨基酸取代A227S、S315G、A356W和Y360G以粗體展示并加下劃線。取代的編號(hào)是相對(duì)于全長(zhǎng)BChE的編號(hào)。由圖I氨基酸序列編碼的蛋白質(zhì)在本申請(qǐng)案中稱為“AlbuBChE，，。應(yīng)理解本發(fā)明上述實(shí)施例的所有組合均在本發(fā)明的范疇內(nèi)。如本文所用,“靈長(zhǎng)類動(dòng)物”是指哺乳綱的一個(gè)目中的任一者，這一目的特征尤其在于雙目視覺(jué)、抓握附屬肢體特化和大腦半球擴(kuò)大的高等發(fā)育，且包括人類、猿類、猴類及相關(guān)種類。如本文所用，“減弱程度”是指與缺乏BChE-白蛋白融合蛋白時(shí)所觀察到的由可卡因暴露所致的生物效應(yīng)相比，給予BChE-白蛋白融合蛋白之后所觀察到的由可卡因暴露所致的生物效應(yīng)的降低。減弱程度由下式計(jì)算
減弱程度=△缺乏BChE-lJ蛋^ ^ △苻在BChE-Cl蟲(chóng)U
缺乏BChE-白蛋白舉例來(lái)說(shuō)，如果在缺乏BChE-白蛋白融合蛋白時(shí)可卡因暴露使基線溫度38°C升高到38. 7°C,并且在存在BChE-融合蛋白時(shí)可卡因暴露使基線溫度38°C升高到38. 3°C，那么減弱程度是 57. 1% ((0. 70C -0. 30C )/0. 7oO0如本文所用，“單次可卡因暴露”是指孤立于任何其它可卡因暴露的一次可卡因暴露?！爸貜?fù)性可卡因暴露”是指一次以上的單次可卡因暴露。重復(fù)性可卡因暴露可以是從個(gè)體的第二次或后續(xù)單次可卡因暴露起定期或不定期模式的單次可卡因暴露。經(jīng)歷重復(fù)性可卡因暴露的個(gè)體可能符合精神疾病診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)IV (DSM-IV)的可卡因依賴或可卡因?yàn)E用準(zhǔn)則。如本文所用,術(shù)語(yǔ)“總可卡因暴露”是指在既定時(shí)間間隔期間的累計(jì)可卡因暴露?？偪煽ㄒ虮┞犊稍谥荚跍p弱可卡因?qū)で笮袨榛蚱渌煽煽ㄒ虮┞端碌纳镄?yīng)的治療期間或一段時(shí)期后測(cè)量。
如本文所用,術(shù)語(yǔ)“復(fù)發(fā)”是指在可卡因戒斷時(shí)期之后的可卡因暴露。應(yīng)理解當(dāng)提供參數(shù)范圍時(shí)，本發(fā)明所提供的所述范圍內(nèi)的整數(shù)精確到十分位。舉例來(lái)說(shuō)，“0. 2mg/kg 到 15mg/kg”包括 0. 2mg/kg、0. 3mg/kg、0. 4mg/kg、0. 5mg/kg 等直至并包括 15. Omg/kgo通過(guò)使用可見(jiàn)于出版物“行業(yè)指南針對(duì)成年健康志愿者治療估算初期臨床試驗(yàn)的最大安全起始齊丨J量(Guidance for Industry:Estimating the Maximum Safe StartingDose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)”，美國(guó)衛(wèi)生與人類服務(wù)部(U. S. Department of Health and Human Services),美國(guó)食品藥品管理局(Food and Drug Administration)藥品評(píng)估和研究中心(Center for DrugEvaluation and Research,CDER)，2005年7月中的換算表，可將動(dòng)物劑量換算成人類等效劑量(HED)。以mg/kg為單位的獼猴劑量可通過(guò)將獼猴劑量除以3. I來(lái)?yè)Q算成以mg/kg為單位的HED。以mg/kg為單位的松鼠猴(squirrel monkey)劑量可通過(guò)將松鼠猴劑量除以 5.3來(lái)?yè)Q算成以mg/kg為單位的HED?？s寫(xiě)清單

AUC(Ct)從時(shí)間零點(diǎn)直到最后可檢測(cè)濃度的時(shí)間(tZ)的血漿濃度-時(shí)間曲線下面積
AUC{0-t)從時(shí)間零點(diǎn)到無(wú)窮大的血漿濃度-時(shí)間曲線下面積
AUCex%由tz外推到無(wú)窮大而得到的AUC百分比
BChE 丁酰膽堿酯酶
BQL 低于定量限
CL 清除率
Cmax 最大濃度
CocH 可卡因水解酶
ELISA 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定
GFR 腎小球?yàn)V過(guò)率
hr小時(shí)
HRP 辣根過(guò)氧化物酶
IM肌肉內(nèi)
IV 靜脈內(nèi)
LLOQ 定量下限

15H卜干-jj in
NIDA國(guó)家藥物濫用研究所(National Institute on Drug Abuse)
PBS磷酸鹽緩沖鹽水
PD藥效學(xué)
PK藥代動(dòng)力學(xué)
RT室溫
Rsq決定系數(shù)
RSD%相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差百分比
SD標(biāo)準(zhǔn)偏差
SC皮下
SOP標(biāo)準(zhǔn)操作方案
tl/2末端相半衰期
tmax最大濃度的時(shí)間
Vz末端相分布容積將圖I所示的BChE-白蛋白融合蛋白(AlbuBChE)應(yīng)用于如以下實(shí)例中所述的試實(shí)例I-獼猴單次肌肉內(nèi)給予AlbuBChE并多次靜脈內(nèi)給予可卡因之后的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)研究目的這一試驗(yàn)的目的在于測(cè)定雄性獼猴單次肌肉內(nèi)給予0. 2mg/kg,lmg/kg或5mg/kgAlbuBChE劑量水平后的AlbuBChE藥代動(dòng)力學(xué)(PK)分布，和通過(guò)在給予AlbuBChE劑量后2小時(shí)、48小時(shí)、96小時(shí)、120小時(shí)和240小時(shí)靜脈內(nèi)給予lmg/kg劑量的可卡因來(lái)測(cè)定AlbuBChE隨時(shí)間推移的活性。基本原理AlbuBChE是人血清白蛋白(HSA)和遺傳改良型人類丁酰膽堿酯酶(BChE)的融合蛋白，其對(duì)可卡因水解成苯甲酸展現(xiàn)出高催化效率。AlbuBChE作為一種預(yù)防藥物尋求行為復(fù)發(fā)的潛在介入術(shù)正在開(kāi)發(fā)中。己顯示蛋白質(zhì)與白蛋白的融合通過(guò)降低清除率和延長(zhǎng)半衰期來(lái)改良所述蛋白質(zhì)的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。預(yù)期較長(zhǎng)的半衰期將意味著較長(zhǎng)的給藥間隔以及對(duì)藥物方案的較佳順應(yīng)性。物種選擇的基本原理基于解剖學(xué)、生理學(xué)和生化方面與人類的相似性選擇獼猴(Cynomolgus monkey/macaca mulatta)用于本研究,這些相似性會(huì)有助于將所觀察到的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)性質(zhì)外推到人類。己知猴可表達(dá)丁酰膽堿酯酶，丁酰膽堿酯酶是這一藥物的組分。猴在生理上對(duì)可卡因也有反應(yīng)。SC (7. 8mg/kg、2. 4mg/kg 和 0. 78mg/kg)、IM (2. 4mg/kg)和 IV (2. 4mg/kg)給予測(cè)試物品。AlbuBChE的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)在所有所測(cè)量的SC劑量下呈線性。本研究選擇IM是基于在先前研究中觀察到與SC相比IM的生物可用性較大(分別為35%到39%和79%)。此外，選擇0. 2mg/kg、lmg/kg和5mg/kg的AlbuBChE IM劑量水平來(lái)定義稱猴的AlbuBChE藥效學(xué)范圍。lmg/kg IV可卡因劑量被選擇為足以產(chǎn)生生理相關(guān)反應(yīng)并在血液中達(dá)到可測(cè)量濃度可卡因同時(shí)不過(guò)度剌激動(dòng)物的劑量。各組中的動(dòng)物數(shù)目是評(píng)估動(dòng)物間變異性所必需的每組動(dòng)物的最低數(shù)目。由于這是初步研究，因此僅評(píng)估一種性別(雄性)。測(cè)試溶液 測(cè)試物品AlbuBChE在-70± 15°C下以濃度為29. 9mg/mL的冷凍液體調(diào)配物的形式儲(chǔ)存在儲(chǔ)備溶液中。給藥前，在室溫下解凍測(cè)試物品調(diào)配物。當(dāng)測(cè)試物品調(diào)配物完全解凍時(shí)，通過(guò)輕輕翻轉(zhuǎn)來(lái)混合容器,且用適當(dāng)體積的測(cè)試物品稀釋劑稀釋以獲得20mg/mL的濃度。用測(cè)試物品稀釋劑連續(xù)稀釋這一調(diào)配物以獲得4mg/mL和0. 8mg/mL的濃度。鹽酸可卡因、藥效學(xué)測(cè)試物品是購(gòu)自西格瑪公司(Sigma)。劑量水平以鹽酸鹽的形
o實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)研究包括總共11只未經(jīng)任何處理的成年雄性獼猴,分成以下四個(gè)劑量組對(duì)照組，兩只獼猴，僅接受單次IV劑量可卡因；三個(gè)劑量組，用0. 2mg/kg、lmg/kg或5mg/kg單次IM劑量AlbuBChE處理。各劑量組中使用三只未經(jīng)任何處理的成年雄性獼猴。AlbnBChE處理后,在AlbuBChE劑量給予后2小時(shí)、48小時(shí)、96小時(shí)、120小時(shí)和240小時(shí)給予lmg/kg IV劑量可卡因。劑量設(shè)計(jì)和劑量水平的匯總可見(jiàn)于表I中。個(gè)體劑量基于劑量給予當(dāng)天所記錄的體重加以計(jì)算。動(dòng)物在劑量給予之前不禁食。表I :組設(shè)計(jì)和劑量水平
17丁單次IV劑量可卡因I1.0~ I ~1~
單次 IM 劑量 AlbuBChE__02___08__0.25
2在AlbuBChE劑量給予后2小時(shí)、48
小時(shí)、96小時(shí)、120小時(shí)和240小時(shí)給I1.0I
__予單次W劑量可卡因〖_____
—單次 IM 劑量 AlbuBChE 一I40.25
3在AlbuBChE劑量給予后2小時(shí)、483
小時(shí)、96小時(shí)、120小時(shí)和240小時(shí)給I1.0I
__予單次IV劑量可卡因1_____
單次 IM 劑量 AIbuBChE__5__20__0.25
4在AlbuBChE劑量給予后2小時(shí)、483
小時(shí)、％小時(shí)、120小時(shí)和240小時(shí)給I1.0I
予單次IV劑量可卡因1____1所有時(shí)間將均在所列時(shí)間的±5分鐘內(nèi)針對(duì)AlbuBChE的樣品收集在研究第I天時(shí)執(zhí)行AlbuBChE的單次肌肉內(nèi)(IM)給藥，且在表2中匯總的時(shí)間點(diǎn)下收集血液。將約0.5mL全血自股靜脈中收集到血清分離管(SST)中。表2 AlbuBChE的藥代動(dòng)力學(xué)
時(shí)間點(diǎn)樣品體積收集裝置
給藥前，給藥后I小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、
36小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、128小時(shí)、144小時(shí)、 約0.5 mL SST_168小時(shí)、216小時(shí)和264小時(shí)___針對(duì)可卡因的樣品收集在可卡因各次給藥(對(duì)照組的研究第I天以及AlbuBChE劑量給予后的第I天(2小時(shí))、第3天(48小時(shí))、第5天(96小時(shí))、第6天(120小時(shí))和第11天(240小時(shí)))后5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘和60分鐘時(shí)自股靜脈中收集約0. 5mL全血。將血液放入具有酯酶抑制劑氟磷酸二異兩酯(diisopropylfluorophosphate，DFP)的K2EDTA血液收集管中。收集后將管翻轉(zhuǎn)數(shù)次且置于濕冰上。在收集的45分鐘內(nèi)在2°C到 8°C下離心樣品?；厥账醚獫{，且將血漿的單份200 u L等分試樣置于聚丙烯管中。血漿樣品在干冰上冷凍且儲(chǔ)存在-75±15°C下。測(cè)定方法以下概要描述了在給藥前和給藥后不同時(shí)間所獲得的猴血清樣品之AlbuBChE濃度測(cè)量中所用的基于ELISA的測(cè)定。在4°C下用IOOu L含 Iu g/mL抗BChE mAb 002-01(艾碧康公司(Abcam)abl7246)的PBS涂布Immulon 4HBX板過(guò)夜。在室溫下用含2%酪蛋白的IXPBS以200微升/孔阻斷2小時(shí)。洗滌后，向板中添加IOOu L經(jīng)稀釋的血清樣品以及標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)品是通過(guò)將AlbuBChE從2000ng/mL以3. 64倍連續(xù)稀釋到3. Ing/mL產(chǎn)生的。通過(guò)用含有合并的獼猴血清的緩沖液稀釋來(lái)使血清樣品和標(biāo)準(zhǔn)品維持在10%血清下。在洗滌步驟后,用IOOuL
18下讀數(shù)。通過(guò)內(nèi)推由AlbuBChE標(biāo)準(zhǔn)品的4參數(shù)擬合所生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算未知血清樣品的值。獼猴血清的定量限是21.1ng/mL。血清中可卡因的LC-MS定量以下概要描述了血漿樣品之可卡因測(cè)量中所用的基于LC-MS的測(cè)定。在MS分析之前，使用支撐式液體萃取(SLE-IS0LUTE，寶他公司(Biotage))來(lái)萃取血漿樣品、校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照品。25微升樣品(25uL)接受150ul 5%氫氧化銨和25u I內(nèi)標(biāo)溶液(可卡因-d3)。在混合和轉(zhuǎn)移到SLE板之后,用二氯甲烷洗脫樣品,且蒸發(fā)到干燥。再懸浮于50 u I復(fù)原溶液(含5%ACN的IOmM乙酸銨水溶液)中后，以0. 5ml/min將IOu I進(jìn)樣到ThermoHypercarb柱上。流動(dòng)相是雙相流動(dòng)相。使用APCI正離子界面(positive interface)且多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)的Api 4000執(zhí)行質(zhì)譜檢測(cè)。使用這一測(cè)定來(lái)測(cè)定可卡因、苯甲酰芽子堿(benzoylecgonine)和芽子堿甲酯(ecgonine methyl ester)的血衆(zhòng)濃度。AlbuBChE 的 PK 分析 使用個(gè)別動(dòng)物的血清濃度-時(shí)間分布來(lái)測(cè)定AlbuBChE藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值。使用計(jì)算機(jī)軟件專業(yè)版 WinNonlin (4. 0. I 版，藥視公司(Pharsight Corporation),美國(guó)(USA))。具體地說(shuō)，應(yīng)用伴以血管外輸入(extravascular input)的非房室分析模型。如果血清濃度曲線末端相中的數(shù)據(jù)點(diǎn)少于3個(gè)，那么不計(jì)算所述分布的末端相半衰期和由所述半衰期得出的PK參數(shù)。計(jì)算所分析的參數(shù),包括tmax，、Cmax、t1/2, AUC(0-t)和AUC(q_^)?？煽ㄒ虻腜K分析當(dāng)數(shù)據(jù)允許時(shí)，使用可卡因給藥的所有研究日個(gè)別動(dòng)物的血漿濃度-時(shí)間分布來(lái)測(cè)定可卡因和其代謝物的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)值。使用計(jì)算機(jī)軟件專業(yè)版WinNorilin (4.0.1版,藥視公司(Pharsight Corporation),美國(guó)(USA))。具體地說(shuō)，針對(duì)可卡因使用伴以IV推注輸入(IV bolus input)的非房室分析模型，且針對(duì)代謝物使用伴以血管外輸入的非房室分析模型。如果血漿濃度曲線末端相中的數(shù)據(jù)點(diǎn)少于3個(gè),那么不計(jì)算所述分布的末端相半衰期和由所述半衰期得出的PK參數(shù)。PK/PD 分析使用計(jì)算機(jī)軟件專業(yè)版WinNonlin (4. 0. I版，藥視公司(PharsightCorporation),美國(guó)(USA))來(lái)定義AlbuBChE PK/PD關(guān)系。具體地說(shuō)，使用直接S形抑制效應(yīng)Emax模型，其中假設(shè)如由可卡因AUC測(cè)量為最大效應(yīng)(Emax)時(shí)，AlbuBChE濃度為零。可如下描述模型方程抑制效應(yīng)S形Emax，Eraax時(shí)，C=O ；E0時(shí)，C=無(wú)窮大E=Emax-(Emax-EO) X (Cy/(CV +EC50y))由于在48小時(shí)時(shí)間點(diǎn)時(shí)觀察到的活性比2小時(shí)時(shí)間點(diǎn)時(shí)高,因此選擇S形模型。用于分析的PD參數(shù)是可卡因AUC。模型中所用的PK參數(shù)是AlbuBChE給藥后2小時(shí)、48小時(shí)、96小時(shí)、120小時(shí)和240小時(shí)的AlbuBChE血漿濃度。由于在AlbuBChE給藥后2小時(shí)未測(cè)量到AlbuBChE濃度，因此分析中使用給藥后3小時(shí)的濃度，且假設(shè)AlbuBChE給藥后3小時(shí)的AlbuBChE濃度可反映AlbuBChE給藥后2小時(shí)的AlbuBChE濃度。統(tǒng)計(jì)方法
19
結(jié)果AlbuBChE 濃度分布AlbuBChE濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)和匯總統(tǒng)計(jì)列于表3和表4中。單次0. 2mg/kg、lmg/kg或5mg/kg AlbuBChE IM注射之后個(gè)別動(dòng)物AlbuBChE血清濃度-時(shí)間分布展示于圖2中。三個(gè)AlbuBC hE劑量組的平均血清濃度-時(shí)間分布展示于圖3中。在IM注射之后，所有動(dòng)物均具有可測(cè)量的AlbuBChE濃度。如由所有時(shí)間點(diǎn)的CV%均在8. 2到78. 4范圍內(nèi)所指示，每個(gè)劑量組的動(dòng)物間變異性看似合理。AlbuBChE血清濃度隨劑量增加而增大。表3 :在單次IM給予每只動(dòng)物0. 2mg/kg、lmg/kg或5mg/kg AlbuBChE劑量之后，獼猴的個(gè)別和平均AlbuBChE血清濃度(ng/mL)相對(duì)于時(shí)間(hr)的分布。
0 ! AlbuBC^hE 劑量0.2 mg/kg IM ~| 平均值~cy%
(hr)176911769217693(ng/mL)、、"
0— <LLOQ <LLOQ~ <LLOQ<LLOQ —--
1~ 37.1 — 235.4111.0128IQQ 78.4 " 3 — 176.1 — 278.5 280.7 — 245 ~ 59.8 24.4
6 — 144.0212.1272.4210 — 64.2 — 30.7
12~ 88.4 — 143.1197.9143 _ 54.8 — 38.3
2452.3 — 95.2 _ 135.794.4 ~ 41.7 44.2
3629.8 — 68.387.461.8 — 29.3 ~ 47.4
48 _ <LLOQ 66.480.773.6 — n = 2~ -
72 " <LLOQ 44.5 ~ 39.542.0 — n = 2 -
96 — <LLQQ~ 30.1<LLQQ — <LLOQ ~一
12S " <LLOQ <LLOQ <LLOQ<LLOQ- _ -
144<LLQQ~ <LLQQ~ <LLQQ<LLQQ--
168 一 <LLQQ 一 <LLOQ__<LLOQ__<LLOQ
216 ~ <LLQQ~ <LLOQ <LLOQ<LLOQ-— -
264<LLQQ <LLOQ <LLQQ<LLQQ 丨一丨一
20
權(quán)利要求
1.一種減弱靈長(zhǎng)類動(dòng)物由可卡因(cocaine)暴露所致的生物效應(yīng)的方法，其包含給予 所述靈長(zhǎng)類動(dòng)物一定量的融合蛋白，所述融合蛋白包含(a)突變的丁酰膽堿酯酶(BChE)多肽，其包含序列 EDDIIIATKNGKVRGMNLTVFGGTVTAFLGIPYAQPPLGRLRFKKPQSLTKWSDIWNA TKYANSCCQNIDQSFPGFHGSEMWNPNTDLSEDCLYLNVWIPAPKPKNATVLIWIYGG GFQTGTSSLHVYDGKFLARVERVIVVSMNYRVGALGFLALPGNPEAPGNMGLFDQQLA LQWVQKNIAAFGGNPKSVTLFGESSGAASVSLHLLSPGSHSLFTRAILQSGSFNAPWA VTSLYEARNRTLNLAKLTGCSRENETEIIKCLRNKDPQEILLNEAFVVPYGTPLGVNF GPTVDGDFLTDMPDILLELGQFKKTQILVGVNKDEGTWFLVGGAPGFSKDNNSIITRK EFQEGLKIFFPGVSEFGKESILFHYTDWVDDQRPENYREALGDVVGDYNFICPALEFT KKFSEWGNNAFFYYFEHRSSKLPWPEWMGVMHGYEIEFVFGLPLERRDNYTKAEEILS RSIVKRWANFAKYGNPNETQNNSTSWPVFKSTEQKYLTLNTESTRIMTKLRAQQCRFW TSFFPKV(SEQ ID NO 1),(b)人血清白蛋白(HSA)多肽，其包含序列DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADES AENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLV RPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADK AACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVS KLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCI AEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLR LAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNA LLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLH EKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQ IKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQ AALGL(SEQ ID NO :2)，和(c)信號(hào)肽，其包含序列MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG(SEQ ID NO 3),其中所述融合蛋白的所述量有效引起所述靈長(zhǎng)類動(dòng)物由所述可卡因暴露所致的所述 生物效應(yīng)減弱。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述融合蛋白包含序列 MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARGEDDIIIATKNGKVRGMNLTVFGGTVTAFLGIPYAQ PPLGRLRFKKPQSLTKWSDIWNATKYANSCCQNIDQSFPGFHGSEMWNPNTDLSEDCL YLNVWIPAPKPKNATVLIWIYGGGFQTGTSSLHVYDGKFLARVERVIVVSMNYRVGAL GFLALPGNPEAPGNMGLFDQQLALQWVQKNIAAFGGNPKSVTLFGESSGAASVSLHLL SPGSHSLFTRAILQSGSFNAPWAVTSLYEARNRTLNLAKLTGCSRENETEIIKCLRNK DPQEILLNEAFVVPYGTPLGVNFGPTVDGDFLTDMPDILLELGQFKKTQILVGVNKDE GTWFLVGGAPGFSKDNNSIITRKEFQEGLKIFFPGVSEFGKESILFHYTDWVDDQRPE NYREALGDVVGDYNFICPALEFTKKFSEWGNNAFFYYFEHRSSKLPWPEWMGVMHGYE IEFVFGLPLERRDNYTKAEEILSRSIVKRWANFAKYGNPNETQNNSTSWPVFKSTEQK YLTLNTESTRIMTKLRAQQCRFWTSFFPKVDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFARHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL(SEQ ID NO :4)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法,其中所述融合蛋白在所述可卡因暴露之前給予。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,其中所述融合蛋白在所述可卡因暴露前至多一天給
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述融合蛋白在所述可卡因暴露前至多216小時(shí)給予。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中所述融合蛋白在所述可卡因暴露之后給予。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法,其中所述融合蛋白在所述可卡因暴露后至多一小時(shí)給
8.根據(jù)權(quán)利要求I至7中任一權(quán)利要求所述的方法,其中所述可卡因暴露是單次可卡因暴露。
9.根據(jù)權(quán)利要求I至7中任一權(quán)利要求所述的方法,其中所述可卡因暴露是重復(fù)性可卡因暴露。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法,其中所述重復(fù)性可卡因暴露為可卡因?yàn)E用或可卡因依賴。
11.根據(jù)權(quán)利要求9至10中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述重復(fù)性可卡因暴露包含在12個(gè)月期間至少六次的單次可卡因暴露。
12.根據(jù)權(quán)利要求9至10中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述重復(fù)性可卡因暴露包含在所述靈長(zhǎng)類動(dòng)物的一生期間至少二十次的單次可卡因暴露。
13.根據(jù)權(quán)利要求I至12中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述生物效應(yīng)由所述靈長(zhǎng)類動(dòng)物中可卡因過(guò)量引起，且所述減弱是治療或預(yù)防所述生物效應(yīng)。
14.根據(jù)權(quán)利要求I至13中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述生物效應(yīng)是血壓增高。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述血壓增高的持續(xù)時(shí)間被降低60%到90%。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述血壓增高的持續(xù)時(shí)間被降低約78%。
17.根據(jù)權(quán)利要求I至13中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述生物效應(yīng)是心率或體 溫增高。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法,其中所述減弱程度為45%到70%。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法,其中所述減弱程度為57%。
20.根據(jù)權(quán)利要求I至13中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述生物效應(yīng)是所述靈長(zhǎng)類動(dòng)物的可卡因?qū)で笮袨椤?br> 3
21. 根據(jù)權(quán)利要求書(shū)20所述的方法，其中所述可卡因?qū)で笮袨槌霈F(xiàn)在所述可卡因暴露之后的可卡因戒斷時(shí)間期間。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述可卡因?qū)で笮袨榘橛袕?fù)發(fā)。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中在所述復(fù)發(fā)前兩小時(shí)給予所述融合蛋白在所述復(fù)發(fā)后立即減弱所述靈長(zhǎng)類動(dòng)物的可卡因?qū)で笮袨椤?br> 24.根據(jù)權(quán)利要求20至23中任一權(quán)利要求所述的方法，其中在所述可卡因暴露前兩小時(shí)給予所述融合蛋白引起所述靈長(zhǎng)類動(dòng)物的所述可卡因?qū)で笮袨闇p少50%到100%。
25.根據(jù)權(quán)利要求20至24中任一權(quán)利要求所述的方法，其中可卡因?qū)で笮袨榈臏p弱在給予所述融合蛋白后至多四天觀察到。
26.根據(jù)權(quán)利要求20至25中任一權(quán)利要求所述的方法,其中給予所述融合蛋白所產(chǎn)生的所述靈長(zhǎng)類動(dòng)物的總可卡因暴露比不給予時(shí)低。
27.根據(jù)權(quán)利要求20至26中任一權(quán)利要求所述的方法，其中減弱可卡因?qū)で笮袨楫a(chǎn)生2周到3周的可卡因戒斷時(shí)期。
28.根據(jù)權(quán)利要求20至27中任一權(quán)利要求所述的方法，其中減弱可卡因?qū)で笮袨樗a(chǎn)生的所述靈長(zhǎng)類動(dòng)物不暴露于可卡因的天數(shù)比不給予時(shí)多。
29.根據(jù)權(quán)利要求20至28中任一權(quán)利要求所述的方法，其中減弱可卡因?qū)で笮袨樗a(chǎn)生的所述靈長(zhǎng)類動(dòng)物不暴露于可卡因的連續(xù)天數(shù)比不給予時(shí)多。
30.根據(jù)權(quán)利要求20至29中任一權(quán)利要求所述的方法,其中如利用可卡因選擇性嚴(yán)重程度評(píng)估(CSSA)或精神疾病診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)IV (DSM-IV)所評(píng)估，減弱可卡因?qū)で笮袨橐鹂煽ㄒ蛞蕾嚮驗(yàn)E用的嚴(yán)重程度減弱。
31.根據(jù)權(quán)利要求I至30中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述融合蛋白的有效量為在靜脈內(nèi)給予lmg/kg可卡因約30分鐘內(nèi)使所述靈長(zhǎng)類動(dòng)物的血清可卡因水平降低到約Ong/ml 的量。
32.根據(jù)權(quán)利要求I至31中任一權(quán)利要求所述的方法，其中給予所述融合蛋白在靜脈內(nèi)給予lmg/kg可卡因約5分鐘內(nèi)使所述靈長(zhǎng)類動(dòng)物的血清可卡因水平降低到低于不給予時(shí)血清可卡因水平的12%。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中給予所述融合蛋白在靜脈內(nèi)給予lmg/kg可卡因約5分鐘內(nèi)使所述靈長(zhǎng)類動(dòng)物的血清可卡因水平降低到不給予時(shí)血清可卡因水平的7%。
34.根據(jù)權(quán)利要求I至33中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述融合蛋白每周一次或每周兩次給予。
35.根據(jù)權(quán)利要求I至34中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述融合蛋白通過(guò)肌肉內(nèi)注射或皮下注射來(lái)給予。
36.根據(jù)權(quán)利要求I至35中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述融合蛋白是在包含IOmM磷酸鈉、200mM甘露糖醇、60mM海藻糖和0. 01% (w/v)聚山梨醇酯80，pH值為7. 2的調(diào)配緩沖液中。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述融合蛋白在所述調(diào)配物中的濃度為至少30mg/mlo
38.根據(jù)權(quán)利要求I至37中任一權(quán)利要求所述的方法,其中所述生物效應(yīng)的減弱在給予所述融合蛋白后至多72小時(shí)觀察到。
39.根據(jù)權(quán)利要求1至38中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述靈長(zhǎng)類動(dòng)物是人類。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述可卡因暴露是10mg到60mg的單次可卡因暴露；或是重復(fù)性可卡因暴露，其中所述重復(fù)性可卡因暴露中各單次可卡因暴露是IOmg到60mgo
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述融合蛋白的有效量是在靜脈內(nèi)給予40mg可卡因約30分鐘內(nèi)使所述人類的血清可卡因水平降低到約Ong/ml的量。
42.根據(jù)權(quán)利要求39至41中任一權(quán)利要求所述的方法,其中所述融合蛋白的有效量是0.06mg/kg 到 5mg/kgo
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述融合蛋白的有效量是0.06mg/kg、0. 3mg/kg、I. 6mg/kg 或 4. 8mg/kg0
44.根據(jù)權(quán)利要求39至41中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述融合蛋白的有效量是5Omg 到 300mgo
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述融合蛋白的有效量是50mg、lOOmg、15Omg或300mgo 全文摘要
本發(fā)明提供一種減弱靈長(zhǎng)類動(dòng)物由可卡因(cocaine)暴露所致的生物效應(yīng)的方法。所述方法包括給予所述靈長(zhǎng)類動(dòng)物一定量的包含氨基酸取代A227S、S315G、A356W和Y360G的BChE-白蛋白融合蛋白，其中所述融合蛋白的所述量有效引起所述靈長(zhǎng)類動(dòng)物由所述可卡因暴露所致的所述生物效應(yīng)減弱。
文檔編號(hào)C12P21/04GK102711795SQ201080061221
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2010年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月8日
發(fā)明者D·拉弗爾, H·哈拉克, L·斯克萊爾-泰維恩, L·示麥?zhǔn)?達(dá)維什, M·羅森斯托克, V·帕爾雅汀斯蓋, V·諾斯奇 申請(qǐng)人:泰華制藥工業(yè)有限公司