專利名稱：全細(xì)胞生物催化劑的制作方法
全細(xì)胞生物催化劑

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種制備腈水解酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的方法，包括步驟(i)提供表面含所述腈水解酶的微生物和/或所述微生物的膜制劑；和(ii)在與腈水解酶活性相容的條件下使所述微生物和/或其膜制劑接觸一種或多種腈水解酶的底物。具體而言，本發(fā)明涉及一種制備羧酸的方法，包括步驟(i)提供表面含腈水解酶的微生物和/或其膜制劑；(ii)使該微生物和/或其膜制劑接觸腈，如此腈水解酶可催化腈轉(zhuǎn)變?yōu)轸人?。本發(fā)明還涉及采用展示腈水解酶的全細(xì)胞生物催化劑或其膜制劑處理外消旋扁桃腈制備光學(xué)純(R)-扁桃酸的方法。腈是制備羧酸、酰胺等多種產(chǎn)物的重要前體分子(Banerjee等人，2002年)。然而，由于腈非常穩(wěn)定，必須在強(qiáng)堿或強(qiáng)酸及高溫下才能使腈發(fā)生化學(xué)轉(zhuǎn)變(Banerjee等人，2002年；Nagasawa等人，1990年)。而且，提純各自反應(yīng)混合物中的這些產(chǎn)物非常令人厭煩。 腈水解酶(如EC 3. 5. 5. I)是能在一步反應(yīng)中將腈轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)羧酸和氨的酶(Thimann和Mahadevan，1964年)。因?yàn)橐环矫妫人岙a(chǎn)物常用作各種化學(xué)生產(chǎn)過(guò)程的中間體，采用腈水解酶的工業(yè)效益具有實(shí)質(zhì)性吸引力；另一方面，可利用腈水解酶給廢物解毒(Banerjee等人,2002年；Thuku等人,2009年)。此外,腈水解酶的選擇性高,能在溫和條件下產(chǎn)生光學(xué)純羧酸，而不需要常規(guī)化學(xué)過(guò)程中所需的高成本封閉和去封閉步驟和催化劑(Banerjee等人,2002年)。所述高度選擇性使采用常規(guī)方法不能或很難實(shí)現(xiàn)的產(chǎn)物合成成為可能。腈水解酶與量化有關(guān)的最重要工業(yè)應(yīng)用是將外消旋扁桃腈轉(zhuǎn)變?yōu)楣鈱W(xué)純(R)-扁桃酸(Rey等人，2004年)。利用(R)-扁桃酸可分離用非對(duì)映異構(gòu)體鹽(產(chǎn)生的)外消旋物中的對(duì)映體。此外，(R)-扁桃酸是化學(xué)合成新型活性制劑中的一種重要手性中間體產(chǎn)物。從文獻(xiàn)中可熟知，糞產(chǎn)堿桿菌(A. faecalis)的腈水解酶能以高對(duì)映選擇性將扁桃腈轉(zhuǎn)變?yōu)楸馓宜帷Ｊ中贼人?，如扁桃酸提供了有機(jī)化學(xué)所需的化合物，因?yàn)槠淇勺鳛槎喾N藥物制劑或植物保護(hù)劑的基礎(chǔ)產(chǎn)物。因此，例如，(R)-或(S)-扁桃酸可用于外消旋胺的外消旋體拆分。此外，可利用(R)-扁桃酸作為化學(xué)合成的中間體。然而，已特征鑒定了腈水解酶是公認(rèn)的不穩(wěn)定酶(Buchholz、Kasche和Bornscheuer, 2005年)，因此在工業(yè)中罕見采用其純化酶或采用其全細(xì)胞制劑。腈水解酶的活性中心含三個(gè)氨基酸殘基(催化三聯(lián)體)的催化序列，其所含的保守性活性位點(diǎn)半胱氨酸殘基(Kobayashi等人，1992年)對(duì)自身氧化敏感，易與許多化學(xué)物質(zhì)如含巰基試劑反應(yīng)(Kobayashi 等人，1992 年)。只要位于細(xì)胞內(nèi)，腈水解酶就受到細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)氧化還原環(huán)境的保護(hù)，處于還原狀態(tài)(Choi和Lee，2004年)而防止其巰基氧化。然而，已證明腈水解酶接觸氧時(shí)即喪失活性，此觀察歸因于其活性中心氧化還原敏感三聯(lián)體中的半胱氨酸的易感性(Mateo等人，2006年)。已采用了幾種方法來(lái)克服腈水解酶活性和/或穩(wěn)定性不足的缺點(diǎn)。
一種方法是采用表達(dá)腈水解酶的全細(xì)胞而不是純化的酶制劑，提供菌株特異性或重組形式的胞內(nèi)腈水解酶(Kaul等人，2007年)。例如，研究人員采用了表達(dá)腈水解酶的糞產(chǎn)堿桿菌(Kaul, A. Banerjee和U. C. Banerjee, 2006年)作為含腈水解酶的全細(xì)胞催化齊U。對(duì)映體過(guò)量達(dá)到了 97%。此法的原理是將該酶保持在其自然環(huán)境細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)中，通過(guò)其內(nèi)源性折疊機(jī)制和連續(xù)轉(zhuǎn)換及蛋白質(zhì)生物合成，保持該蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和活性水平的恒定。然而，這必須采用費(fèi)時(shí)費(fèi)力的加工過(guò)程制備全細(xì)胞催化劑，并將其附著于合適的基質(zhì)系統(tǒng)(藻酸鹽)。另外，待轉(zhuǎn)換的底物需要穿越所選細(xì)菌的細(xì)胞膜和表面，進(jìn)入胞質(zhì)后，將遭遇一系列具有替代活性的酶和競(jìng)爭(zhēng)性底物。最后，全細(xì)胞催化劑將會(huì)污染制備的所需產(chǎn)品，因此對(duì)于敏感的應(yīng)用，例如制藥、化妝品、衛(wèi)生用品及飲料和食物制品，不能采用這種產(chǎn)物。另一種制備可工業(yè)應(yīng)用的高水平功能性腈水解酶的方法涉及采用伴侶蛋白。GroEL家族伴侶蛋白是位于胞質(zhì)中的必需蛋白質(zhì)，為細(xì)胞通過(guò)多輪底物蛋白的ATP依賴性結(jié)合、包裹及釋放、產(chǎn)生正確折疊的蛋白質(zhì)所必需(Hartl, F. U.和Hayer-Hartl, M. , 2002年)。刪除GroEL最終不僅導(dǎo)致功能性底物蛋白水平降低，而且由于大量未折疊蛋白的積聚，可導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞死亡。已實(shí)現(xiàn)了伴侶蛋白，更具體說(shuō)是GroEL系統(tǒng)的多種特異性組分與 重組的腈水解酶在大腸桿菌胞質(zhì)中共表達(dá)(5，629，190號(hào)美國(guó)專利，圖9)。此方法產(chǎn)生的可溶性蛋白質(zhì)水平高于細(xì)胞的內(nèi)源性伴侶蛋白水平。然而，這種方法的前提條件是采用全細(xì)胞以提供折疊機(jī)制，或增加分離純化的伴侶蛋白及其輔因子，和增加腈水解酶制劑的底物。美國(guó)專利No. 5，629，190說(shuō)明了重組表達(dá)腈水解酶的大腸桿菌全細(xì)胞的使用方法。然而，由于大腸桿菌細(xì)胞含有特定的胞內(nèi)酶裝置，所產(chǎn)生的反應(yīng)很復(fù)雜，其結(jié)果無(wú)法預(yù)計(jì)，即使是重組表達(dá)的蛋白制劑，如GroEL，能否有助于微生物合成的多肽(例如重組表達(dá)的腈水解酶)折疊也無(wú)法預(yù)計(jì)。如美國(guó)專利No. 5，629，190所揭示的那樣，腈水解酶催化腈轉(zhuǎn)變?yōu)轸人?的反應(yīng))與腈水合酶催化反應(yīng)(導(dǎo)致酰胺的形成)相競(jìng)爭(zhēng)，致使產(chǎn)率降低，并產(chǎn)生很難去除的不良副產(chǎn)物。細(xì)胞中還存在可能修飾腈的腈基或其他部分的其他酶。另一種方法涉及交聯(lián)酶聚集體的制備和應(yīng)用，即制備可溶性重組酶和采用反應(yīng)活性雙功能化學(xué)試劑，如戊二醛或聚(乙烯亞胺)，作后續(xù)交聯(lián)。然而，Kaul等人(2007)證明，這種固定可導(dǎo)致顯著降低反應(yīng)速率和專一性常數(shù)。此外，化學(xué)交聯(lián)可導(dǎo)致對(duì)底物的特異性改變，觀察到這與產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分子被“鎖定”于特定構(gòu)象的交聯(lián)過(guò)程相關(guān)。而且，不能直接分離得到所需反應(yīng)產(chǎn)物中的各批固定酶及其降解產(chǎn)物和碎片。Yamamoto等人(1991年)測(cè)試了各種分離物(野生型菌株)轉(zhuǎn)化扁桃腈成為(R) - (_)-扁桃酸的能力。發(fā)現(xiàn)糞產(chǎn)堿桿菌ATCC 8750菌株從外消旋扁桃腈產(chǎn)生(R) _ _扁桃酸的活性和對(duì)映選擇性水平最高(Yamamoto等人，1991年)。具體而言，靜息細(xì)胞使扁桃腈產(chǎn)生(R)-(-)-扁桃酸的對(duì)映體過(guò)量達(dá)100%。糞產(chǎn)堿桿菌ATCC 8750含有R型對(duì)映選擇性腈水解酶和酰胺酶，分別用于加工扁桃腈和扁桃酰胺。由于從外消旋扁桃腈產(chǎn)生(R)_ _扁桃酸的廣率為91 ,而未留下(S)-扁桃臆，因此反應(yīng)中剩余的(S)-(-)-扁桃腈自發(fā)性外消旋，一方面是因?yàn)楸馓译娴?R)-和(S)-異構(gòu)體達(dá)到了化學(xué)平衡，另一方面是因?yàn)楸郊兹?氫氰酸(HCN)的作用。因此，幾乎所有的扁桃腈被消耗和轉(zhuǎn)變成(R)-(-)_扁桃酸。需要注意的是，按照Yamamoto等人(1991年)所述，用于制備(R)-扁桃酸的糞產(chǎn)堿桿菌細(xì)胞需要專門優(yōu)化的培養(yǎng)條件。有人克隆了細(xì)菌來(lái)源的不同腈水解酶，并在大腸桿菌中重組表達(dá)(Kiziak等人，2005年；Luo等人，2008年；Rustler等人，2008年；6，180, 359號(hào)美國(guó)專利；Ress-L6schke等人，1998年)。業(yè)已對(duì)腈水解酶進(jìn)行了生化特征鑒定(Kiziak等人,2005年)。也能在大腸桿菌中重組表達(dá)糞產(chǎn)堿桿菌ATCC8750的腈水解酶基因，純化后在固定實(shí)驗(yàn)中用作“交聯(lián)酶聚集體”(Rey等人，2004年)。此法必須分離宿主生物(即大腸桿菌)中的腈水解酶并進(jìn)行純化。此法相當(dāng)冗長(zhǎng)使人厭煩，而且在加工過(guò)程中腈水解酶可能失活。已將糞產(chǎn)堿桿菌亞組ATCC 8750的腈水解酶描述為由大約14個(gè)亞基(每個(gè)亞基分子量為32kD)組成的同質(zhì)寡聚酶，因此該天然蛋白質(zhì)的總合并分子量大約為460kD (Yamamoto等人，1992年)。腈水解酶一般是無(wú)活性的二聚體,通過(guò)自身締合形成活性寡聚體。然而，腈水解酶與腈水解酶之間活性所需要的亞基數(shù)目不相同(Thuku等人，2009年)?？傊嫠饷妇哂幸韵聨讉€(gè)缺點(diǎn)，阻礙了其在制備有機(jī)化合物中的應(yīng)用 腈水解酶對(duì)氧化敏感，導(dǎo)致其活性隨時(shí)間推移而降低。

以全細(xì)胞生物催化劑形式應(yīng)用時(shí)，細(xì)胞中存在的其他酶(如腈水合酶)催化的不良副反應(yīng)可能干擾腈水解酶催化的反應(yīng)。 不能回收反應(yīng)混合物中的腈水解酶。自身展示(技術(shù))為在細(xì)菌表面展示重組蛋白質(zhì)提供了一種巧妙的工具，這種表達(dá)系統(tǒng)依據(jù)于屬于V型分泌系統(tǒng)的自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)家族的分泌機(jī)制。在革蘭陰性菌中，自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路已演變?yōu)榈鞍邹D(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面和蛋白分泌到胞外微環(huán)境中兩種通路(Jose和Meyer, 2007年)。合成的自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是前體蛋白質(zhì),含有轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面所需的所有結(jié)構(gòu)(JOSe，2006年)。合成的該前體蛋白的N-末端為信號(hào)肽(一般用于分泌途徑)能穿越內(nèi)膜。一旦進(jìn)入周質(zhì)中信號(hào)肽被截?cái)嗪?，該前體蛋白的C-末端部分就折疊入外膜中形成膜孔樣蛋白結(jié)構(gòu)(即所謂的￠-桶結(jié)構(gòu))。附著于N-末端的乘客結(jié)構(gòu)域可通過(guò)這種膜孔轉(zhuǎn)位至表面(JOSe，2002年)，經(jīng)蛋白酶自身水解作用或其他蛋白酶的水解作用被切斷，或者通過(guò)其轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域維持錨定于細(xì)胞被膜上。用重組蛋白取代該天然乘客蛋白可導(dǎo)致重組蛋白的正確表面轉(zhuǎn)位。為此目的，必須用遺傳工程構(gòu)建含有信號(hào)肽、重組乘客蛋白、￠-桶結(jié)構(gòu)和之間連接區(qū)的人工前體蛋白，這是實(shí)現(xiàn)完全的表面接近所需。已經(jīng)以此方式成功利用AIDA-I自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有效地表面展示了各種乘客蛋白結(jié)構(gòu)域(Henderson 等人，2004 年)。在這種自身展示系統(tǒng)中已觀察到，例如二聚體酶一山梨醇脫氫酶的二個(gè)亞基可自身締合形成活性酶(Jose, 2002年;Jose和von Schwichow, 2004年)。具體而言，這種自身展示技術(shù)是在大腸桿菌和其他革蘭陰性菌外膜表面表達(dá)預(yù)定蛋白質(zhì)的一種方法，其中這種自身展示系統(tǒng)依據(jù)于自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的天然分泌機(jī)制(Jose和Meyer, 2007年)。在此方法中，可采用基因工程的標(biāo)準(zhǔn)方法簡(jiǎn)單地在信號(hào)肽與自身展示載體轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域之間，框內(nèi)引入重組乘客蛋白的編碼序列，就可轉(zhuǎn)運(yùn)該重組乘客蛋白?？色@得霍亂毒素B亞基(CTB)的信號(hào)肽將其與人工啟動(dòng)子組合。因此，可將需要轉(zhuǎn)位通過(guò)外膜的乘客蛋白表達(dá)為與稱為大腸桿菌外膜自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的另一蛋白的重組融合蛋白質(zhì)(AIDA-I) (Jose, 2006年)。該自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的C-末端部分可在大腸桿菌外膜內(nèi)形成膜孔蛋白樣(￠-桶)結(jié)構(gòu)。這種膜孔蛋白樣結(jié)構(gòu)促進(jìn)了重組乘客蛋白轉(zhuǎn)位到大腸桿菌的外膜表面(Jose, 1995 年、2006 年、2007 年)。
本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供產(chǎn)生和制備易于接近底物分子處于活化狀態(tài)的腈水解酶的方法。而且，為防止不良副反應(yīng)，應(yīng)避免存在其他酶。本發(fā)明要解決的另一個(gè)問(wèn)題是提供用重組腈水解酶制備腈水解酶催化反應(yīng)產(chǎn)物(如羧酸)的方法，其中至少部分解決了酶活性隨時(shí)間推移而降低的問(wèn)題。本發(fā)明的另一個(gè)要解決的問(wèn)題是提供易于回收腈水解酶催化反應(yīng)產(chǎn)物(如羧酸)的方法。本發(fā)明人令人意外地發(fā)現(xiàn)，能在宿主細(xì)胞(如微生物)表面表達(dá)腈水解酶，這種腈水解酶功能完備，即能催化腈轉(zhuǎn)變形成羧酸。本發(fā)明的第一方面是制備腈水解酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的方法，包括以下步驟(i)提供表面含有所述腈水解酶的微生物和/或所述微生物的膜制劑，(ii)在與腈水解酶活性相容的條件下使所述微生物和/或其膜制劑接觸一種或 多種腈水解酶的底物。本發(fā)明的方法中，可采用腈水解酶的任何已知底物。所述產(chǎn)物可以是腈水解酶催化反應(yīng)產(chǎn)生的任何化合物。本說(shuō)明書所用的“與腈水解酶活性相容的條件”包括使腈水解酶處于活化狀態(tài)，即腈水解酶能夠?qū)⒁环N或多種底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的條件?？梢圆捎檬闺嫠饷副３只钚缘娜魏我阎獥l件。本發(fā)明方法所采用的一種或一種以上腈水解酶的底物優(yōu)選腈。也優(yōu)選本發(fā)明方法所獲得的產(chǎn)物為羧酸。“與腈水解酶活性相容的條件”是腈水解酶催化腈轉(zhuǎn)變形成羧酸的條件。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式是產(chǎn)生羧酸的方法，該方法包括以下步驟(i)提供表面含有腈水解酶的微生物和/或其膜制劑；(ii)使所述微生物和/或其膜制劑接觸腈，從而使腈水解酶催化腈轉(zhuǎn)變形成羧酸。本發(fā)明方法任選地還包括步驟(iii):回收步驟(ii)所用的微生物。本說(shuō)明書所用的“步驟⑴”、“步驟(ii) ”或“步驟(iii) ”指制備腈水解酶催化反應(yīng)產(chǎn)物方法的相應(yīng)步驟，以及如本說(shuō)明書所述制備羧酸的優(yōu)選方法的相應(yīng)步驟。本發(fā)明的根據(jù)是意外地發(fā)現(xiàn)以重組方式將細(xì)菌的腈水解酶融合于合適的自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)時(shí)，該酶可轉(zhuǎn)位到細(xì)菌細(xì)胞的表面，并以活性折疊構(gòu)象整合入細(xì)菌的細(xì)胞膜中，如此能保持其催化活性好幾天，從而可用于催化相關(guān)的工業(yè)反應(yīng)。這特別令人感到驚訝，因?yàn)榧?xì)菌細(xì)胞的外膜缺乏適合胞質(zhì)蛋白的蛋白折疊機(jī)制。而且，最令人感到驚訝的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)這種氧化還原敏感的酶從還原性細(xì)菌胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到含氧水平高因而產(chǎn)生高度氧化環(huán)境的外膜后或在轉(zhuǎn)移期間，該酶并未失活。不想受任何理論的束縛，本發(fā)明人設(shè)想腈水解酶通過(guò)自身展示固定在細(xì)菌細(xì)胞的表面后，形成的聚集體或三維結(jié)構(gòu)能保護(hù)其催化反應(yīng)活性氨基酸殘基避免失活，甚至當(dāng)接觸作為大量培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞常規(guī)方法組成部分的高水平氧和伴有劇烈振動(dòng)的強(qiáng)機(jī)械作用力時(shí)也能避免這些氨基酸殘基失活。本說(shuō)明書所述的全細(xì)胞生物催化劑第一次使得在革蘭陰性細(xì)胞如大腸桿菌表面提供活性腈水解酶成為可能，可利用這種細(xì)胞轉(zhuǎn)化腈產(chǎn)生相應(yīng)的羧酸。具體說(shuō)，本說(shuō)明書所述的展示腈水解酶的全細(xì)胞生物催化劑可用于腈的生物技術(shù)轉(zhuǎn)化。至關(guān)重要的是，所述反應(yīng)是在溫和條件下完成的，產(chǎn)率良好，不會(huì)產(chǎn)生毒性副產(chǎn)物。具體而言，在微生物表面重組表達(dá)的腈水解酶能在溫和條件下(如約PH 7.0)催化腈轉(zhuǎn)變。本說(shuō)明書所用的“全細(xì)胞生物催化劑”指包含天然催化劑，如蛋白酶(具體為腈水解酶)、能對(duì)有機(jī)化合物(具體為腈)進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)化的全細(xì)胞，具體為微生物細(xì)胞，其中所述天然催化劑優(yōu)選位于細(xì)胞表面。本發(fā)明的催化劑可以是重組表達(dá)的催化劑。細(xì)菌細(xì)胞包含很多由疏水膜互相分隔的小室。革蘭陽(yáng)性菌細(xì)胞所含的胞漿膜將胞質(zhì)限制在細(xì)胞內(nèi)。一層肽聚糖圍繞在胞漿膜周圍。相反，除胞漿膜外，革蘭陰性菌還有另一層稱為外膜的膜。本說(shuō)明書所用的術(shù)語(yǔ)“表面”宜指微生物與環(huán)境例如液體培養(yǎng)基接觸的那層膜。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述表面是革蘭陰性菌細(xì)胞與液體培養(yǎng)基接觸的側(cè)面。本說(shuō)明書所用的措詞“表面展示”與“表面表達(dá)”可互換使用，指腈水解酶位于細(xì)胞表面。本說(shuō)明書所用的“微生物”指宿主細(xì)胞。本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是原核微生物或真核微生物，優(yōu)選原核微生物，更優(yōu)選細(xì)菌細(xì)胞，還要優(yōu)選革蘭陰性菌細(xì)胞，最優(yōu)選的微生 物是大腸桿菌細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“微生物”與“宿主細(xì)胞”在本說(shuō)明書中可互換使用。本說(shuō)明書所用的“腈水解酶”指能催化腈轉(zhuǎn)變?yōu)轸人岷桶钡碾嫠饷?、其催化活性部分、其衍生物或類似物。?yīng)注意，本說(shuō)明書所用的某分子的“衍生物”或“類似物”指該分子的衍生部分或者修飾版本。在本發(fā)明中，腈水解酶可以是任何一種腈水解酶，例如，能夠催化腈轉(zhuǎn)變形成羧酸的腈水解酶。優(yōu)選的腈水解酶是EC 3. 5.5.1(也稱為“腈的氨基水解酶”)的酶。所述腈水解酶可以僅顯示腈水解酶活性。所述腈水解酶也可以是多功能酶，除其他活性外，顯示有腈水解酶活性。技術(shù)人員知道可提供腈水解酶的一些菌種，包括原核生物和真核生物。例如，本發(fā)明所用的腈水解酶可獲自包特菌屬、克雷伯菌屬、曲霉菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、酵母菌屬、伯克菌屬、鏈孢霉菌屬、芽殖酵母菌屬、德巴利酵母菌屬、耶羅威亞酵母菌屬、假絲酵母菌屬、克魯維酵母菌屬、紅球菌屬、諾卡菌屬和/或根瘤菌屬?？商峁┍景l(fā)明所用腈水解酶的示范性菌種有支氣管炎伯德特菌、肺炎克雷伯菌、黑曲霉菌、糞產(chǎn)堿桿菌、釀酒酵母菌、伯克霍爾德菌、煙曲霉菌、粗糙脈孢菌、耐熱芽殖酵母菌、漢遜德巴利酵母菌、耶羅威亞酵母菌、光滑假絲酵母菌、乳酸克魯維酵母菌、紫紅紅球菌、諾卡菌、豆科根瘤菌和/或皮諾卡菌。本發(fā)明的腈水解酶優(yōu)選獲自產(chǎn)堿桿菌屬、克雷伯菌屬和/或酵母菌屬。更優(yōu)選的腈水解酶選自糞產(chǎn)堿桿菌、肺炎克雷伯菌及釀酒酵母菌的腈水解酶。糞產(chǎn)堿桿菌可以是糞產(chǎn)堿桿菌的糞亞種。肺炎克雷伯菌可以是肺炎克雷伯菌的肺炎亞種。甚至更優(yōu)選的腈水解酶是糞產(chǎn)堿桿菌的腈水解酶。本發(fā)明的腈水解酶可選自以下一組菌，包括P_887662[GI :33600102,2009/05/01,支氣管炎博德特菌 RB50]、AAA25057 [GI : 149175，1993/04/26，肺炎克雷伯菌]、NP_943299 [GI :38639530, 2009/04/30，肺炎克雷伯菌]、P10045[GI :115192,2009/01/20，肺炎克雷伯菌的肺炎亞種]、XP_001389617[GI :145230706, 2008/02/28，黑曲霉菌]、ACS13754[GI :239738518, 2009/06/15，產(chǎn)堿桿菌屬 ECU0401]、BAA02684[GI 216203,2008/02/16,糞產(chǎn)堿桿菌]、CAK46957 [GI : 134083480，2007/03/24，黑曲霉菌]、EDV09642 [GI : 190406375，2008/06/16，釀酒酵母菌 RMll-la], YP_001945058 [GI 189349430,2009/05/07,伯克菌 ATCC 17616]、NP_012102[GI :6322027, 2008/06/16，釀酒酵母菌 RMl 1-la] UF89B [GI :16975400, 2001/11/19，釀酒酵母菌]、NP_012409[GI 6322335,2009/11/05,釀酒酵母菌]、EDN63257 [GI : 151945002，2007/07/13，釀酒酵母菌 YJM789]、EDN59257[GI : 151940875，2007/07/13，釀酒酵母菌 YJM789]、CAY80342 [GI 259147089，2009/09/23，釀酒酵母菌 EC1118]、EEU05439[GI :256270219,2009/08/20,釀酒酵母菌 JAY291]、P40447[GI :731891,2009/11/03,釀酒酵母菌]、XP_751200[GI 70992703，2008/02/27，煙曲霉菌 Af293]、CAD71250[GI :28950282, 2006/11/114，粗糙脈孢菌]、CAK48039 [GI : 134075478，2007/03/24，黑曲霉菌]、CAR23067 [GI :238934886,2009/10/08，耐熱芽殖酵母菌]、CAG86637 [GI : 199431326，2008/09/10，漢遜德巴利酵母菌]、XP_500602 [GI :50546150, 2008/10/29，耶羅維亞酵母菌]、CAG78819[GI 49651877，2008/10/23，耶羅維亞酵母菌]、CAG59341 [GI :49525722, 2008/12/16，光滑假絲酵母菌]、XP_454637[GI :50309261,2008/04/18,乳酸克魯維酵母菌]、P20960[GI 417386,2009/05/05,糞產(chǎn)堿桿菌]、AB046008 [GI : 134034945，2009/11/05，紫紅紅球菌]、AAX18182 [GI :60280369，2005/03/02，諾卡菌 C-14-1]、BAA02127 [GI :216932，2008/02/16，紫紅紅球菌]、Q02068[GI :417382, 2009/01/20，紫紅紅球菌]、CAK02877[G1 115259785，2009/05/13,豌豆根瘤菌 3841]、CAF05970 [GI :40882143, 2009/1010，粗糙脈 孢菌]、CAK08726[GI :115257629,2009/05/13,豌豆根瘤菌 3841]、BAD58116[GI :54016746,2008/05/10，皮諾卡菌 IFM 10152]以及 Q5Z1U0 [GI :81603033，2009/11/03，皮諾卡菌]的腈水解酶。此名單采用的格式為“基因庫(kù)登錄號(hào)[基因庫(kù)標(biāo)識(shí)符，數(shù)據(jù)庫(kù)錄入日期，菌種/菌株]”。可以用基因庫(kù)登錄號(hào)、基因庫(kù)標(biāo)識(shí)符(GI)、基因庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)錄入日期和獲得腈水解酶序列的菌種和/或菌株，標(biāo)識(shí)此組腈水解酶的序列。本說(shuō)明書所用的術(shù)語(yǔ)“腈水解酶”包括與本說(shuō)明書公開的腈水解酶序列有至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %、至少98 %或至少99 %相同性的任何腈水解酶。技術(shù)人員知道測(cè)定氨基酸序列水平相同性程度的適當(dāng)方法，例如BLAST或PBLAST算法。如上所述，活性腈水解酶可以是由大約14個(gè)亞基組成的同質(zhì)寡聚酶。腈水解酶一般是無(wú)活性的二聚體。在本發(fā)明中，宿主細(xì)胞表面展示的腈水解酶可以是由三個(gè)或更多個(gè)相同亞基組成的同質(zhì)多聚體。具體而言,這種同質(zhì)多聚體包含7-16個(gè)相同的亞基，例如7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)或16個(gè)相同的亞基。優(yōu)選大約14個(gè)亞基，S卩11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)或16個(gè)亞基?？捎稍谒拗骷?xì)胞膜上展示的幾個(gè)相同的多肽亞基自發(fā)締結(jié)形成同質(zhì)多聚體(也稱為“同質(zhì)寡聚體”)。本說(shuō)明書所用的“腈”指至少包含一個(gè)-CN官能團(tuán)(腈基)的任何化合物。腈也可以包含I個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或更多個(gè)腈基?？墒闺婊c芳基分子,例如含6-14個(gè)碳原子,優(yōu)選6-10個(gè)碳原子的芳基稱合。芳基可包含I個(gè)、2個(gè)或3個(gè)縮合的芳環(huán)。更優(yōu)選芳基為苯基。芳基可被一個(gè)或多個(gè)取代基，例如I個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)或更多個(gè)取代基取代。可使腈基與脂族分子例如包含1-8個(gè)碳原子、1-6個(gè)碳原子、1-4個(gè)碳原子或1-3個(gè)碳原子的烷基耦合。這種烷基可以是直鏈或支鏈烷基。這種烷基可包含環(huán)狀部分。這種烷基可被一個(gè)或多個(gè)取代基例如I個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)或更多個(gè)取代基取代。所述腈可包含烷基芳基，其中烷基和芳基的含義如本說(shuō)明書所述。可使至少一個(gè)腈基耦合于烷基和/或芳基。烷基和/或芳基部分可被一個(gè)或多個(gè)取代基例如I個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)或更多個(gè)取代基取代。這里所用的一個(gè)或多個(gè)取代基可獨(dú)立地選自_0H、碘代、溴代、氯代、氟代、芳基、燒基、燒氧基等，其中燒基和芳基的含義如本說(shuō)明書所述，燒氧基含1_8個(gè)碳原子、1-6個(gè)碳原子、1-4個(gè)碳原子或1-3個(gè)碳原子。優(yōu)選的烷氧基是甲氧基。烷氧基可以是直鏈或支鏈烷氧基。烷氧基可包含環(huán)狀部分。烷基、芳香基和/或烷氧基可獨(dú)立地包含至少一個(gè)雜原子，例如I個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或更多個(gè)雜原子，如此至少一個(gè)雜原子取代了碳原子。所述雜原子可獨(dú)立地選自氮、氧和硫?？捎米鞅景l(fā)明腈水解酶底物的示范性腈是芳香腈，例如扁桃腈、芐腈(benzonitrile)、苯基丙腈(phenylpropionitrile)、苯基甘油腈、溴草腈、碘苯腈(ioxynile)、氯二甲腈(chloroxynile)、茴香腈、3_溴_4_輕基節(jié)腈、3_氟-4-輕基節(jié)腈 、4-羥基_3，5- 二甲氧基芐腈和野黑櫻苷；以及脂簇腈，如正丁腈、正戊腈、異丁腈及琥珀腈。本發(fā)明特別優(yōu)選的底物是扁桃腈。根據(jù)本發(fā)明，糞產(chǎn)堿桿菌腈水解酶的優(yōu)選底物是扁桃腈和野黑櫻苷。肺炎克雷伯菌腈水解酶的優(yōu)選底物是溴草腈(bromoxynile)、碘苯腈、氯二甲腈、茴香腈、3-溴-4-輕基芐腈、3-氟-4-羥基芐腈和4-羥基-3，5- 二甲氧基芐腈。釀酒酵母菌腈水解酶的優(yōu)選底物是節(jié)腈、苯基丙二腈(phenylprobionitrile)、扁桃腈、苯基甘油腈、正丁腈、正戍腈、異丁腈及琥拍腈。本發(fā)明的一個(gè)方面，已用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增糞產(chǎn)堿桿菌全DNA中腈水解酶的編碼基因并克隆。通過(guò)附著于PCR引物的合適限制性位點(diǎn)，將該基因與自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的閱讀框正確融合。可用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)方法顯示融合蛋白的表達(dá)。該酶在表面表達(dá)并固定，能在胞外轉(zhuǎn)變加入的底物(此例為外消旋扁桃腈)。在目前采用的培養(yǎng)和表達(dá)條件下，5天后的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到約50%，優(yōu)選約60%，更優(yōu)選約70%，甚至還要更優(yōu)選約80%。本發(fā)明方法可制備對(duì)映體過(guò)量的含不對(duì)稱碳原子的化合物。產(chǎn)物(具體為羧酸)的對(duì)映體過(guò)量ee)至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%，優(yōu)選至少約99%或更高。如手性HPLC所示，5天后(R)-扁桃酸的轉(zhuǎn)化率約為80%，對(duì)映體過(guò)量ee)高于99%。本說(shuō)明書所用的底物對(duì)映體過(guò)量(ee)是對(duì)底物光學(xué)純度的一種衡量?？蓽y(cè)定待分析化合物溶液中的對(duì)映體過(guò)量。合適的溶劑(如疏水性溶劑和親水性溶劑)和其混合液是已知的?？刹捎靡韵鹿接?jì)算對(duì)映體過(guò)量 ee%= 100* ([R] _ [S]) / ([R] + [S])式中[R]、[S]指菌種濃度；R和S分別指(R)-和⑶-異構(gòu)體。如此，在外消旋混合物中，即[R] = [S]中，ee%= 100*0/([R]+ [S]) = 0%,即R過(guò)量不超過(guò)S,或反之也然。因此，外消旋混合物的對(duì)映體過(guò)量為0%，而光學(xué)純化合物的對(duì)映體過(guò)量為100%。可用該領(lǐng)域已知的測(cè)定含不對(duì)稱碳原子化合物的任何方法來(lái)測(cè)定(R)-和(S)-異構(gòu)體的濃度，例如但不限于，測(cè)定該混合物的比旋光度，手性柱色譜(如手性HPLC)和核磁共振(NMR)光譜測(cè)定。本說(shuō)明書所述的本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)是腈水解反應(yīng)條件溫和與產(chǎn)物純化方法簡(jiǎn)易相結(jié)合，因?yàn)闉榇四康闹恍桦x心分離各批反應(yīng)的細(xì)胞。可在微生物中重組表達(dá)腈水解酶并將其轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面。微生物本身可獨(dú)立增殖并本身能產(chǎn)生該酶，不再需要費(fèi)力地純化這種生物催化劑。這類微生物的一個(gè)例子是本說(shuō)明書實(shí)施例I中所述的大腸桿菌菌株。本說(shuō)明書所用的術(shù)語(yǔ)“重組”指將天然狀態(tài)互相不連接的至少兩條核酸序列操作性彼此相連而制備的核酸序列。所述的至少兩條核酸序列可獲自同一微生物。例如，重組構(gòu)建物可包含產(chǎn)堿桿菌屬菌種的信號(hào)序列和同一產(chǎn)堿桿菌屬菌種的腈水解酶編碼序列，而此腈水解酶編碼序列通常不與所述信號(hào)序列相連。所述的至少兩條序列可獲自至少兩種不同的生物體。例如，可將大腸桿菌的信號(hào)肽、產(chǎn)堿桿菌的腈水解酶基因、大腸桿菌的跨膜接頭和大腸桿菌的自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域操作性相連。另一個(gè)例子是信號(hào)肽源自霍亂毒素3亞基(CTB)，自身轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域和跨膜接頭源自大腸桿菌，而腈水解酶源自產(chǎn)堿桿菌的重組多肽。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，術(shù)語(yǔ)“重組表達(dá)”也可與本說(shuō)明書所用的術(shù)語(yǔ)“以 重組方式表達(dá)”等同義使用，指重組核酸序列的表達(dá)。例如，在大腸桿菌或任何微生物中表達(dá)的核酸序列包含大腸桿菌的信號(hào)肽和產(chǎn)堿桿菌的腈水解酶序列，構(gòu)成了重組表達(dá)。優(yōu)選將腈水解酶融合于自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域可以是自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的任何轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選能形成￠-桶結(jié)構(gòu)?！?桶結(jié)構(gòu)和￠-桶自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白優(yōu)選實(shí)施例的詳細(xì)說(shuō)明可參見為了引用而納入本說(shuō)明書的專利TO97/35022中所述。Henderson等人(2004年)描述了含有合適的自身轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域的自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(概述參見Henderson等人(2004年)的表I)。Henderson等人(2004年)公開的內(nèi)容以引用方式納入本說(shuō)明書。例如，自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域可選自Ssp (P09489,黏質(zhì)沙雷菌)、Ssp-hl (BAA33455,黏質(zhì)沙雷菌)、Ssp_h2 (BAA11383,黏質(zhì)沙雷菌)、PspA(BAA36466，熒光假單胞菌)、PspB (BAA36467，熒光假單胞菌)、Ssal (AAA80490,溶血多斯德菌)、SphBl (CAC44081，百日咳桿菌)、AspA/NalP (AAN71715,腦膜炎奈瑟菌)、VacA(Q48247，幽門螺桿菌)、AIDA-I (Q03155，大腸桿菌)、IcsA (AAA26547，福氏志賀菌)、MisL(AAD16954，腸道沙門菌)、TibA(AAD41751，大腸桿菌)、Ag43(P39180,大腸桿菌)、ShdA(AAD25110,腸道沙門菌)、AutA(CAB89117，腦膜炎奈瑟菌)、Tsh(154632，大腸桿菌)、S印A(CAC05786，福氏志賀菌)、EspC(AAC44731，大腸桿菌)、EspP (CAA66144，大腸桿菌)、Pet ((AAC26634,大腸桿菌)、Pic (AAD23953,大腸桿菌)、SigA (AAF67320,福氏志賀菌)、Sat (AAG30168,大腸桿菌)、Vat (AA021903,大腸桿菌)、EpeA (AAL18821，大腸桿菌)、EatA(AA017297,大腸桿菌)、EspI (CAC39286,大腸桿菌)、EaaA(AAF63237,大腸桿菌)、EaaC((AAF63038,大腸桿菌)、百日咳桿菌粘附素(Pertactin) (P14283，，百日咳桿菌)、BrkA(AAA51646,，百日咳桿菌)、Tef (AAQ82668,百日咳桿菌)、Vag8 (AAC31247,百日咳桿菌)、PmpD (084818，砂眼披衣菌)、Pmp20 (Q9Z812，肺炎披衣菌)、Pmp21 (Q9Z6U5，肺炎披衣菌)、IgAl蛋白酶(NP_283693，腦膜炎奈瑟菌)、App(CAC14670，腦膜炎奈瑟菌)、IgAl蛋白酶(P45386，流感嗜血桿菌)、Hap(P45387，流感嗜血桿菌)、r0mpA(P15921，立氏立克次體)、rOmpB (Q53047，立氏立克次體)、ApeE (AAC38796，腸道沙門菌)、EstA (AAB61674,綠膿桿菌)、Lip-I (P40601，發(fā)光致病桿菌)、McaP (AAP97134,卡他莫拉菌)、BabA (AAC38081，幽門螺桿菌)、SabA (AAD06240,幽門螺桿菌)、AlpA (CAB05386,幽門螺桿菌)、Aae (AAP21063,伴放線放線桿菌)、NanB(AAG35309，溶血巴德斯菌)以及這些自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的變體。括號(hào)中給出的各示范性自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是相應(yīng)基因庫(kù)登錄號(hào)和獲得該自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的菌種的示范例。自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域優(yōu)選為大腸桿菌AIDA-I蛋白或其變體,例如Niewert U.、Frey A. >Voss T. >Le Bouguen C. >Baljer G. >Franke S. >Schmidt MA 所述的。AIDA 自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)可與分離自診斷為水腫病和斷奶仔豬腹瀉患豬的大腸桿菌中的F18和Stx2e相結(jié)合。Clin Diagn Lab Immunol, 2001 年 I 月，8 (I) :143-149 ;9。例如，可通過(guò)改變P -桶的環(huán)結(jié)構(gòu)(不是其跨膜結(jié)構(gòu)的組成部分)中的氨基酸序列獲得上述自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列的變體?？扇芜x地完全刪除該表面環(huán)的編碼核酸部分。而且，可在兩親性3 -折疊中進(jìn)行保守氨基酸交換，即將一個(gè)親水氨基酸換成另一個(gè)親水氨基酸和/或?qū)⒁粋€(gè)疏水氨基酸換成另一個(gè)疏水氨基酸。優(yōu)選在氨基酸水平上，變體序列與該自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域各自的天然序列，具體在￠-折疊范圍內(nèi)，至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%相同。本發(fā)明方法的步驟(I)優(yōu)選包括以下步驟 (a)提供含有操作性連接于表達(dá)調(diào)控序列的核酸序列的微生物，所述核酸序列包含(I)信號(hào)肽的編碼部分；(2)要展示的重組腈水解酶的編碼部分；(3)任選的蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的編碼部分；(4)跨膜接頭的編碼部分；和(5)自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域的編碼部分；(b)培養(yǎng)該微生物,培養(yǎng)條件應(yīng)能表達(dá)(a)所述的核酸序列，并在微生物表面展不該核酸序列的表達(dá)產(chǎn)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員能設(shè)計(jì)出表達(dá)這種核酸序列的條件，只涉及常規(guī)實(shí)驗(yàn)，例如，可測(cè)試各種溫度、培養(yǎng)基、細(xì)胞密度和/或誘導(dǎo)表達(dá)的化學(xué)試劑的濃度?？赏ㄟ^(guò)用操作性相連于表達(dá)調(diào)控序列的核酸序列轉(zhuǎn)化，而獲得步驟(a)所提供的微生物，其中所述核酸包含(I)信號(hào)肽的編碼部分；(2)要展示的重組腈水解酶的編碼部分；(3)任選的蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的編碼部分；(4)跨膜接頭的編碼部分；和(5)自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域的編碼部分；其中，組分(1)-(5)是下文所述的核酸序列?？刹捎萌魏我阎霓D(zhuǎn)化方法。本說(shuō)明書所用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”宜指在細(xì)胞中，優(yōu)選在細(xì)菌細(xì)胞中引入外源構(gòu)建物，下面稱為細(xì)胞被轉(zhuǎn)化。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道關(guān)于轉(zhuǎn)化的方案和步驟，例如，感受態(tài)細(xì)胞的電轉(zhuǎn)化或化學(xué)轉(zhuǎn)化。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明方法還包括步驟(C):制備(b)所述微生物的膜制劑。本發(fā)明所用的膜制劑包含催化活性腈水解酶。本說(shuō)明書所用的術(shù)語(yǔ)“膜制劑”優(yōu)選指富含膜組分的產(chǎn)品。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知可用于獲得膜制劑的方案和步驟。例如，收獲培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞，通過(guò)反復(fù)凍融、超聲，重懸浮于裂解緩沖液中使之裂解，然后差速離心，分離得到細(xì)胞的膜組分。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述膜制劑是外膜制劑，即所含的外膜組分比其他膜組分和腔室，例如胞液、內(nèi)膜和周質(zhì)更豐富的制劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知可用于分離得到外膜的方案和步驟，例如，用溶菌酶處理細(xì)菌細(xì)胞，然后離心的步驟。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述膜制劑是包含催化活性腈水解酶的外膜制劑，該膜制劑由在胞液中合成所述腈水解酶，然后將其轉(zhuǎn)運(yùn)到外膜的細(xì)胞制備。在另一個(gè)實(shí)施方式中，例如，將膜蛋白，如腈水解酶融合蛋白摻入到人工囊泡中，以適當(dāng)處理所述膜制劑。本屬領(lǐng)域技術(shù)人員有辦法在囊中泡重建功能性膜蛋白，例如，采用合適的洗滌劑。本發(fā)明方法的步驟(a)指提供微生物。所述微生物可以是本說(shuō)明書所述的任何微生物。在步驟(a)中，提供一種宿主細(xì)胞，具體為宿主細(xì)菌，其含有與表達(dá)調(diào)控序列(即，啟動(dòng)子)操作性相連的核酸序列，和任選還包含在相應(yīng)宿主細(xì)胞中表達(dá)基因所需的序列。本說(shuō)明書所用的“與表達(dá)調(diào)控序列操作性相連的核酸序列”指核酸序列與表達(dá)調(diào)控序列在功能上相關(guān)連。技術(shù)人員知道合適的啟動(dòng)子和表達(dá)調(diào)控序列。啟動(dòng)子和/或表達(dá)調(diào)控序列可以與宿主細(xì)胞同源或異源。 優(yōu)選所述核酸序列位于重組載體，如質(zhì)粒載體上。步驟(a)所述的核酸序列包含(I)信號(hào)肽的編碼部分，優(yōu)選革蘭陰性菌信號(hào)肽的編碼部分，而能通過(guò)細(xì)胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)至周質(zhì)中。信號(hào)肽可以是宿主細(xì)胞的同源信號(hào)肽。信號(hào)肽也可以是宿主細(xì)胞的異源信號(hào)肽。所述核酸序列還包含(2)要展示的腈水解酶(“乘客多肽”或“乘客”)的編碼部分。可采用編碼本說(shuō)明書所述任何腈水解酶的核酸。所述核酸序列任選包含(3)蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的編碼部分。本說(shuō)明書所用的術(shù)語(yǔ)“蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)”指特異性蛋白酶識(shí)別的特異性氨基酸序列，蛋白酶隨后通過(guò)水解蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)標(biāo)記的酰胺鍵切斷該多肽。蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)可以是內(nèi)源性蛋白酶(即宿主細(xì)胞天然產(chǎn)生的蛋白酶)的識(shí)別位點(diǎn)，或是外源加入的蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)。例如，外源加入的蛋白酶可以是IgA蛋白酶(參見EP-A-O 254 090)、凝血酶或因子X。內(nèi)源性蛋白酶可以是，例如選自O(shè)mpT、OmpK或蛋白酶X。蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)可以與宿主細(xì)胞同源，蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)也可以與宿主細(xì)胞異源。此外，所述核酸序列還包含(4)遞呈乘客多肽，即宿主細(xì)胞外膜外表面上的重組腈水解酶(2)所需的跨膜接頭的編碼部分?？刹捎门c自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源的跨膜接頭結(jié)構(gòu)域，即直接融合于自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域編碼核酸序列5’端的核酸部分編碼的跨膜接頭結(jié)構(gòu)域。也可采用與自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白異源的跨膜接頭結(jié)構(gòu)域?？缒そ宇^的長(zhǎng)度優(yōu)選30-160個(gè)氨基酸。此外，所述核酸序列包含(5)自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域的編碼部分。在本發(fā)明中，自身展示可以是通過(guò)革蘭陰性菌的自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白實(shí)現(xiàn)的蛋白或多肽的重組表面展示。轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域可以是本說(shuō)明書所述的任何轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明核酸序列中的(1)-(5)組分的取向優(yōu)選從5’到3’。在步驟(b)得到的表達(dá)產(chǎn)物中，核酸序列(1)-(5)編碼的氨基酸序列排列優(yōu)選從N末端到C末端。本發(fā)明方法的步驟(b)指培養(yǎng)微生物，培養(yǎng)條件應(yīng)能表達(dá)步驟(a)所述的核酸序列，在微生物表面展示的表達(dá)產(chǎn)物含重組腈水解酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道合適的培養(yǎng)條件。本發(fā)明方法采用液體培養(yǎng)基可在微生物，具體為大腸桿菌或其他革蘭陰性菌細(xì)胞表面有效表達(dá)乘客蛋白質(zhì)，每個(gè)細(xì)胞可表達(dá)10萬(wàn)或更多個(gè)分子，液體培養(yǎng)基包含以下組分5-20g/1，優(yōu)選約10g/l胰化酪蛋白胨；2-10g/l，優(yōu)選約5g/l酵母提取物；5-20g/l，具體約10g/l的NaCl ;其余為水。此培養(yǎng)基應(yīng)含有盡可能低含量的二價(jià)陽(yáng)離子，因此優(yōu)選采用雙蒸水或高純水，如Millipore水。此液體培養(yǎng)基還優(yōu)選含濃度2-20 u M，具體為10 y M的乙二胺四乙酸(EDTA)。另外，優(yōu)選含有還原劑，如優(yōu)選濃度為2-20mM的2-巰基乙醇或二硫蘇糖醇或二硫赤蘚糖醇。這種還原劑有利于多肽以非折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)運(yùn)。該液體培養(yǎng)基還可含有含量10g/l的其他碳源，優(yōu)選葡萄糖，以有利于分泌，即把乘客蛋白轉(zhuǎn)移至周圍培養(yǎng)基。對(duì)于表面展示，宜不加入其他碳源。革蘭陰性菌細(xì)胞(如大腸桿菌)的優(yōu)選培養(yǎng)條件在“實(shí)施例”中有所描述?？稍谟醒鹾?或氧化條件下執(zhí)行步驟(i 1)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，術(shù)語(yǔ)“有氧條件”指特征為存在氧的條件。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，術(shù)語(yǔ)“有氧條件”指存在的氧水平比給定溫度和液體時(shí)的通常水平高。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，術(shù)語(yǔ)“有氧條件”指液體 (例如培養(yǎng)液)與周圍含氧環(huán)境(例如空氣)之間氣體交換水平提高為特征的條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員有能力通過(guò)采用(例如)合適的氧敏感電極測(cè)量氧水平。而且，本領(lǐng)域技術(shù)人員有能力創(chuàng)造有氧條件，例如用空氣或氧氣給緩沖液或培養(yǎng)基充氣，加入能釋放氧的化學(xué)試劑，或在氧氣或空氣存在下強(qiáng)力振搖緩沖液或培養(yǎng)液。相反，本領(lǐng)域技術(shù)人員也能創(chuàng)造厭氧條件，例如，用氬氣或氮?dú)饨o培養(yǎng)基或緩沖液徹底充氣，或密封培養(yǎng)器皿以最大程度減少氣體交換。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本說(shuō)明書所用的術(shù)語(yǔ)“氧化條件”指在培養(yǎng)基或緩沖液中加入氧化劑或存在氧化劑，即能引起其他化學(xué)物質(zhì)釋放電子的化學(xué)試劑，而使酶易被氧化。例如，已還原的氧化還原酶在氧存在下易被氧化。相反，本說(shuō)明書所用的術(shù)語(yǔ)“還原”或“還原條件”指在培養(yǎng)基或緩沖液中加入還原劑或存在還原劑，即能引起其他化學(xué)物質(zhì)吸收電子的化學(xué)試劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員有能力創(chuàng)造所選擇的氧化還原環(huán)境，例如，通過(guò)加入氧化齊U，如氧氣；和加入還原劑，例如含巰基的試劑，如巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)。此外，本領(lǐng)域通技術(shù)人員有能力測(cè)量溶液的氧化還原電勢(shì)，例如通過(guò)采用氧化還原電極。在革蘭陰性菌宿主細(xì)胞，如大腸桿菌中，重組乘客蛋白轉(zhuǎn)位后，乘客蛋白通過(guò)￠-桶結(jié)構(gòu)(其作用為錨定于外膜中)維持附著于外膜表面。由于￠-桶結(jié)構(gòu)控制整合入外膜中，￠-桶結(jié)構(gòu)的C-末端部分朝向外膜的內(nèi)側(cè)，而與重組乘客蛋白共價(jià)結(jié)合的接頭的N-末端部分朝向外膜的外表面，即朝向環(huán)境。任選的步驟(C)指制備步驟(b)所述的微生物膜制劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知獲得膜制劑的合適方法。本說(shuō)明書所用的膜制劑優(yōu)選外膜制劑。本發(fā)明方法的步驟(ii)指在與腈水解酶活性相容的條件下，使微生物和/或其膜制劑接觸一種或多種腈水解酶的底物。如上所述，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟(ii)指在腈水解酶催化腈轉(zhuǎn)化形成羧酸的條件下，使微生物和/或其膜制劑接觸腈?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的任何合適條件。具體而言，在液體介質(zhì)中進(jìn)行反應(yīng)。在液體介質(zhì)中微生物可形成懸浮液。也可固定微生物。如果采用膜制劑，可將膜制劑分散在液體介質(zhì)中形成顆粒。在PH約5. 0-9. 0范圍內(nèi)，優(yōu)選約6. 0-8. 0，更優(yōu)選約6. 5-7. 5時(shí)進(jìn)行該反應(yīng)。本發(fā)明方法的步驟(iii)指回收步驟(ii)所用的微生物。如本發(fā)明實(shí)施例所示，經(jīng)24小時(shí)反應(yīng)循環(huán)后，細(xì)菌細(xì)胞仍然顯示有顯著的(酶)活性。因此，該細(xì)胞可用于下一步反應(yīng)循環(huán)?？赏ㄟ^(guò)離心反應(yīng)混合物進(jìn)行回收。如需要可洗滌細(xì)胞。本發(fā)明另一方面涉及利用表面表達(dá)腈水解酶的微生物和/或其膜制劑來(lái)制備腈水解酶催化反應(yīng)產(chǎn)物，具體是制備羧酸。制備的羧酸優(yōu)選為扁桃酸，特別是(R)-扁桃酸。本發(fā)明另一方面涉及表面展示重組腈水解酶的微生物，該微生物是本說(shuō)明書所述的微生物，腈水解酶是本說(shuō)明書所述的腈水解酶。具體而言，該微生物表面展示有一種融合多肽，其包含信號(hào)肽、重組腈水解酶、任選的蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)、跨膜接頭和自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域，其中該融合蛋白的諸組分如本說(shuō)明書所述。本發(fā)明另一方面涉及包含腈水解酶的膜制劑?？蓮谋菊f(shuō)明書所述微生物，例如本發(fā)明方法步驟(C)所述的微生物獲得這種膜制劑。所述腈水解酶可以是本說(shuō)明書所述的任何腈水解酶。本發(fā)明還有一方面是制備表面展示有重組腈水解酶的微生物的方法，包括在所述 微生物中弓I入一種核酸序列，所述核酸序列包含(I)信號(hào)肽的編碼部分；(2)要展示的重組腈水解酶的編碼部分；(3)任選的蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的編碼部分；(4)跨膜接頭的編碼部分；和(5)自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域的編碼部分。其中，所述核酸操作性連接于表達(dá)調(diào)控序列。組分(1)-(5)是本說(shuō)明書上述的核酸序列。所述微生物可以是本說(shuō)明書所述的任何微生物，例如細(xì)菌，更具體說(shuō)是革蘭陰性菌，甚至更具體說(shuō)是大腸桿菌。所述腈水解酶可以是本說(shuō)明書所述的任何腈水解酶?！皩⒑怂嵋胨鑫⑸铩卑ū菊f(shuō)明書所述的轉(zhuǎn)化?，F(xiàn)通過(guò)以下附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，不應(yīng)認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明范圍的限制圖I :pAT_NitAf編碼的自身轉(zhuǎn)運(yùn)融合蛋白示意圖。給出了融合位點(diǎn)周圍的序列。黑體斜字表示通過(guò)克隆方法在N-端加入的兩個(gè)氨基酸。標(biāo)出了信號(hào)肽酶的切割位點(diǎn)。SP為信號(hào)肽。圖2 :大腸桿菌BL21 (DE3)pAT-NitAf外膜組分的SDS-PAGE電泳圖，包括泳道(I)過(guò)表達(dá)的自身轉(zhuǎn)運(yùn)融合蛋白AFP，泳道(2):用蛋白酶K消化的全細(xì)胞過(guò)表達(dá)自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，和泳道(M):標(biāo)志物。圖3 :腈水解酶活性的證明從(R，S)_扁桃腈產(chǎn)生(R)-扁桃酸。反應(yīng)混合物(總體積Iml)包含磷酸鈉緩沖液(50mM、pH 7. 5)、(R，S)-扁桃腈(IOmM)和與0D578 = 10相對(duì)應(yīng)的大腸桿菌BL21 (DE3)pAT-NitAf細(xì)胞。數(shù)據(jù)點(diǎn)是三次實(shí)驗(yàn)的平均值；表示標(biāo)準(zhǔn)差的條棒太小無(wú)法看見。實(shí)心符表示在0D578 = I時(shí)誘導(dǎo)，空心符表示在0D578 = 0. 5時(shí)誘導(dǎo)。Tris-HCl 緩沖液 pH 7 ( ▼ / ▽)、磷酸鹽緩沖液 pH 7. 5 ( ■ / □)。圖4 :(R)_扁桃酸的手性HPLC檢測(cè)。溶于甲醇中的純(R)-扁桃酸(IOmM)(前)，用大腸桿菌BL2IpAT-NitAf轉(zhuǎn)化外消旋扁桃腈提取的扁桃酸(后)。圖5 : (R，S)-扁桃腈轉(zhuǎn)化為R-扁桃酸的pH依賴速率。在50mM醋酸鹽緩沖液(空心條)或50mM Tris-HCl緩沖液(實(shí)心條)中進(jìn)行反應(yīng)。37°C反應(yīng)時(shí)間48小時(shí)。
圖6 :_18°C儲(chǔ)存時(shí)全細(xì)胞生物催化劑的穩(wěn)定性。用含20%甘油的介質(zhì)凍存細(xì)胞，37°C融化后開始用大腸桿菌BL21 (DE3)pAT-NitAf在50mM磷酸鹽緩沖液(pH7. 5)中轉(zhuǎn)化IOmM扁桃腈120小時(shí)產(chǎn)生扁桃酸。圖7 :在不同緩沖液和溫度條件下大腸桿菌BL21 (DE3)pAT-NitAf的重復(fù)使用性。每輪循環(huán)對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)化時(shí)間為24小時(shí)。然后離心(60秒，13000轉(zhuǎn)/分)去除生物催化劑，重懸于新鮮的緩沖液中，與新鮮的底物液混和(終濃度IOmM)再培養(yǎng)24小時(shí)。實(shí)心符表示Tris-HCl緩沖液(50mM,pH 7)，空心符表示磷酸鈉緩沖液(50mM,pH 7. 5)。45°C ( /〇)、42 0C ( □ / ■ ) >37 0C ( ▲ / A ) >30 0C ( ▼ / ▽)。圖8 :用Kpn Xhol限制性酶消化的質(zhì)粒DNA0泳道I) lkb標(biāo)志物；泳道2-12):用KpnI/XhoI消化轉(zhuǎn)化菌的質(zhì)粒DNA ;泳道13) lkb標(biāo)志物。圖9 :胰蛋白酶消化克隆的大腸桿菌UT 5600(DE3)pAT-NitAf和pAT-NitSc后分 離得到的外膜。泳道1)胰蛋白酶消化的pAT-NitSc，2)未消化的pAT-NitSc，3)蛋白酶K消化的pAT-NitAf，4)未消化的pAT-NitAf，5)分子量標(biāo)準(zhǔn)(kDa)。

圖10 :大腸桿菌BL21 (DE3)pAT-NitAf轉(zhuǎn)化扁桃腈后的HPLC分析。A)陰性對(duì)照大腸桿菌 BL21 (DE3)，0D578 = 10，培養(yǎng)時(shí)間 120h/30°C。1)HPLC的溶劑前沿2)扁桃腈3)苯甲醛B)用大腸桿菌 BL21 (DE3)pAT-NitAf 轉(zhuǎn)化，0D578 = 10，培養(yǎng)時(shí)間 120h/30°C。1)HPLC的溶劑前沿2)扁桃腈，3)苯甲醛圖11 :用重組全蛋白生物催化劑大腸桿菌BL21 (DE3)pAT-NitAfu產(chǎn)生的扁桃酸。圖12 :在磷酸鹽緩沖液(pH 7. 5)中，分別在30。。和37°C用大腸桿菌BL21 (DE3)pAT-NitAf產(chǎn)生的扁桃酸。當(dāng)0D578 = I時(shí)，30°C用ImM IPTG誘導(dǎo)細(xì)胞I小時(shí)。時(shí)間t =0時(shí)，底物扁桃腈的濃度為10mM。圖13 :37°C用不同濃度的底物，大腸桿菌BL21(DE3)pAT-NitAf在磷酸鹽緩沖液(pH 7. 5)中所產(chǎn)生的扁桃酸。0D578 = I時(shí)，30°C用ImM IPTG誘導(dǎo)細(xì)胞I小時(shí)，轉(zhuǎn)化120小時(shí)。圖14 :37°C大腸桿菌BL21(DE3)pAT-NitAf在不同的緩沖液系統(tǒng)中所產(chǎn)生的扁桃酸(圖中標(biāo)示的除外)。0D578 = I時(shí)，30°C用ImM IPTG誘導(dǎo)細(xì)胞I小時(shí)。時(shí)間t = O時(shí)，底物扁桃腈的濃度為10mM，轉(zhuǎn)化120小時(shí)。圖15 :檢測(cè)和鑒定用大腸桿菌BL21(DE3)pAT-NitAf處理5天后產(chǎn)生的(R)-扁桃酸。采用手性-OM柱(CS-色譜服務(wù)公司)與己烷2-丙醇TFA (90 10 0.1)，流速
0.5ml/min。檢測(cè)2IOnm(吸光度)。A)用乙酸乙酯提取的大腸桿菌BL21 (DE3) pAT-NitAf細(xì)胞上清液的分析。B)外消旋扁桃酸與A)的轉(zhuǎn)化物混和。圖16 :在6°C儲(chǔ)存不同時(shí)間后產(chǎn)生的扁桃酸(圖16)。在50mM磷酸鹽緩沖液(pH7. 5)中，371用大腸桿菌此21(0￡3441'-祖七4€轉(zhuǎn)化IOmM扁桃腈120小時(shí)。圖17 :在轉(zhuǎn)速IOOOrpm的恒溫混合儀中，在不同緩沖液中和不同溫度下各24小時(shí)，大腸桿菌BL21 (DE3) pAT-NitAf轉(zhuǎn)化IOmM扁桃腈所產(chǎn)生的扁桃酸。圖18:檢測(cè)大腸桿菌1321 么1'-祖認(rèn)？所產(chǎn)生的3，5-二溴-4-羥基-苯甲酸。培養(yǎng)時(shí)間120小時(shí)，0D578 = 10，底物為2. 5mM溴草腈。
實(shí)施例以下實(shí)施例可證明本發(fā)明人能鑒定三種不同生物體的腈水解酶基因，并能將所述基因克隆到自身展示系統(tǒng)中。實(shí)施例I :糞產(chǎn)堿桿菌的腈水解酶全細(xì)胞生物催化劑是用于制備大量和稀有化學(xué)物質(zhì)的有吸引力的技術(shù)工具，特別是當(dāng)需要合成區(qū)域選擇性或?qū)τ丑w選擇性化學(xué)物質(zhì)時(shí)。在本項(xiàng)研究中，構(gòu)建了以扁桃腈作為底物的可合成(R)-扁桃酸的全細(xì)胞生物催化劑。為此目的，用自身展示法在大腸桿菌表面表達(dá)糞產(chǎn)堿桿菌糞亞種ATCC 8750的腈水解酶。此自身展示系統(tǒng)是革蘭陰性菌的強(qiáng)大表 面展示系統(tǒng)，其基礎(chǔ)是自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路。用這種技術(shù)，有可能在大腸桿菌表面表達(dá)活性形式的多個(gè)同質(zhì)聚合腈水解酶，而產(chǎn)生對(duì)映體過(guò)量超過(guò)99%的光學(xué)純(R)-扁桃酸。SDS-PAGE監(jiān)測(cè)到腈水解酶-自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的融合蛋白已整合入到外膜中，并用蛋白酶可接近試驗(yàn)證實(shí)了該酶暴露于表面。在優(yōu)化條件下能夠用0D578 = 10的細(xì)菌懸浮液在24小時(shí)內(nèi)小規(guī)模生物轉(zhuǎn)化(Iml)產(chǎn)生2. 6mM(R)-扁桃酸。作為多個(gè)同質(zhì)聚合酶的模型，采用了糞產(chǎn)堿桿菌糞亞種ATCC 8750的腈水解酶。在全細(xì)胞消化過(guò)程中該腈水解酶能接近蛋白酶切割(位點(diǎn))，對(duì)苯甲醛顯示出與游離酶相同的底物抑制作用。結(jié)果融合蛋白的構(gòu)建采用從公布的序列數(shù)據(jù)(參見“實(shí)驗(yàn)”章節(jié))推斷出的寡核苷酸(作為引物)，以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增糞產(chǎn)堿桿菌糞亞種ATCC 8750基因組DNA中的腈水解酶基因。該P(yáng)CR引物在腈水解酶編碼區(qū)的5’端添加一個(gè)Xhol位點(diǎn)，在3’端添加一個(gè)KpnI位點(diǎn)，此為腈水解酶與自身展示需要的自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域框內(nèi)融合所需。按前人(JOSe，2001年)所述，采用PET-Adx作為編碼自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白框架的載體骨架。將得到的PCR產(chǎn)物連接入用XhoI/KpnI切割的pET-Adx中，取代先前的Adx乘客，產(chǎn)生pAT-NitAf。得到的自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白融合蛋白顯示了典型結(jié)構(gòu)，包含信號(hào)肽、作為乘客的腈水解酶、跨膜接頭和￠-桶結(jié)構(gòu)(圖I)。利用霍亂毒素P亞基(CTB)的信號(hào)肽轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)內(nèi)膜。源自AIDA-I的￠-桶結(jié)構(gòu)(自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域)將乘客蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)外膜和連接區(qū)域(跨膜接頭)，從而實(shí)現(xiàn)完全的表面可接近(Jose，2001年)。經(jīng)信號(hào)肽酶處理后，得到pAT-NitAf編碼的成熟融合蛋白具有預(yù)計(jì)的約90kDa分子量。將pAT-NitAf轉(zhuǎn)化入OmpT陰性突變株一大腸桿菌BL21 (DE3)中，防止了對(duì)展示的腈水解酶的切割。該菌株稱為大腸桿菌BL21 (DE3) pAT-NitAf。表達(dá)腈水解酶與自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的融合蛋白按實(shí)驗(yàn)章節(jié)所述通過(guò)加入ImM IPTG起動(dòng)人工融合蛋白的蛋白生物合成。為了研究腈水解酶是否完全暴露在周質(zhì)表面，進(jìn)行了大腸桿菌BL21 (DE3) pAT-NitAf完整細(xì)胞的全細(xì)胞消化。因?yàn)榈鞍酌福绲鞍酌窴、胰蛋白酶，不能滲透大腸桿菌的外膜，所以外加蛋白酶導(dǎo)致的蛋白降解必然是由于其表面暴露之故。用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)監(jiān)控表達(dá)和全細(xì)胞消化。然后考馬斯亮藍(lán)染色表明加入蛋白酶K導(dǎo)致極大地減少了融合蛋白條帶(圖2)。Omp F/C和OmpA蛋白條帶的強(qiáng)度是被分析細(xì)胞是否完整的敏感標(biāo)志。消化和未消化樣品中這兩種Omp條帶的比例應(yīng)無(wú)變化。如果OmpA條帶消失,表明外膜有滲漏,和OmpA的周質(zhì)部分被蛋白酶K降解。在我們的實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)蛋白酶處理和未處理的細(xì)胞中OmpA的大小和含量相同。小結(jié)我們的結(jié)論是幾乎所有的乘客酶都暴露在細(xì)菌表面。表面展示的腈水解酶的酶活性為了檢驗(yàn)含有pAT-NitAf質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 (DE3)細(xì)胞，將用50mM磷酸鈉(pH7. 5)緩沖液配的總體積Iml的細(xì)胞懸液的578nm(0D578)光密度調(diào)整為10。因?yàn)橐衙枋鲈撁笇?duì)羥基腈具有底物特異性，故采用最終濃度IOmM的外消旋扁桃腈作為底物。用HPLC分 析生物轉(zhuǎn)化，計(jì)算出產(chǎn)生的扁桃酸。在0D578 = 0. 5時(shí)用IPTG誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行第一次生物轉(zhuǎn)化。生物轉(zhuǎn)化72h后導(dǎo)致產(chǎn)生2. ImM扁桃酸。再培養(yǎng)至120小時(shí)不進(jìn)一步增加扁桃酸的產(chǎn)生。在0D578 = I時(shí)用IPTG誘導(dǎo)使生物轉(zhuǎn)化顯著提高了兩個(gè)數(shù)量級(jí)。含這種修飾的細(xì)胞，其生物轉(zhuǎn)化到72小時(shí)時(shí)趨于平穩(wěn)，但到120小時(shí)觀察期反而升高使扁桃酸總量達(dá)到6. 6mM(圖3)。由于扁桃腈降解自發(fā)形成的游離苯甲醛可導(dǎo)致酶抑制，因此限制了加入的底物量(Yamamoto 等人，1992)。扁桃腈轉(zhuǎn)變?yōu)楸馓宜嵋呀⒌腍PLC方法可使底物(扁桃腈)與產(chǎn)物(扁桃酸)分離并去除底物。證實(shí)了采用大腸桿菌BL21(DE3)pAT-NitAf可將扁桃腈轉(zhuǎn)變?yōu)楸馓宜?圖10)。HPLC分析揭示，如預(yù)期的那樣水系統(tǒng)中的扁桃腈與苯甲醛(+HCN)存在平衡(圖10)。當(dāng)采用0D578 =10的細(xì)胞懸浮液時(shí)，從底物濃度5mM開始反應(yīng)120小時(shí)后，采納的幾種反應(yīng)參數(shù)導(dǎo)致產(chǎn)生濃度2. 4mM的產(chǎn)物，對(duì)應(yīng)于每毫升樣品可產(chǎn)生0. 36mg質(zhì)量的產(chǎn)物(圖11)。對(duì)映體過(guò)量下一步是驗(yàn)證產(chǎn)生的扁桃酸是否對(duì)映體過(guò)量。為此目的，用乙酸乙酯作溶劑提取水性緩沖液中的扁桃酸。將提取得到的扁桃酸溶于甲醇，直接用于手性HPLC分析。測(cè)得的37°C生物轉(zhuǎn)化對(duì)映體過(guò)量(ee)超過(guò)99% (圖4和圖15A)。這表明，糞產(chǎn)堿桿菌表面展示的腈水解酶能夠產(chǎn)生光學(xué)高純度的(R)-扁桃酸。圖15A證明，幾乎唯一可檢測(cè)到的是扁桃酸(R)-對(duì)映體的保留時(shí)間特征峰。計(jì)算出的光學(xué)純度超過(guò)99%。圖15B顯示純(R)-和
(S)-對(duì)映體加強(qiáng)了圖15A轉(zhuǎn)化的(R)-扁桃酸身份的確定。pH值的優(yōu)化雖然先前已公布了糞產(chǎn)堿桿菌腈水解酶的最佳pH為7. 5，但我們研究了表面暴露是否會(huì)導(dǎo)致最佳pH漂移。將細(xì)胞重懸于醋酸緩沖液或Tris-HCl緩沖液(濃度均為50mM)中，使最終0D578 = 10。37°C培養(yǎng)120小時(shí)后，用HPLC分析上清液，計(jì)算出轉(zhuǎn)化的扁桃酸量。在最佳pH值=pH7時(shí)，我們測(cè)得轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了 5. 5mM扁桃酸。在pH7與pH8之間檢測(cè)到活性強(qiáng)烈損失。附加研究表明在相同條件下PH7. 5的磷酸鹽緩沖液導(dǎo)致只轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了 4. 4mM扁桃酸(數(shù)據(jù)未顯示)(圖5)。采用最佳反應(yīng)溫度和pH值，可在24小時(shí)內(nèi)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生2. 6mM扁桃酸。任何時(shí)間都檢測(cè)不到扁桃酰胺。動(dòng)力學(xué)在一系列實(shí)驗(yàn)中，分析了幾種參數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)室規(guī)模制備扁桃酸的影響。圖12表示不同溫度時(shí)扁桃酸產(chǎn)生的動(dòng)力學(xué)。37°C轉(zhuǎn)化測(cè)得的產(chǎn)物濃度比30°C轉(zhuǎn)化提高約20%。30°C和37°C的轉(zhuǎn)化進(jìn)程還表明經(jīng)約144小時(shí)轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生的扁桃酸濃度只緩慢增加。底物濃度另外分析了底物濃度對(duì)扁桃酸產(chǎn)生的影響。在水溶液中，底物扁桃腈與苯甲醛和HCN處于平衡。但是，如圖13所示，過(guò)量濃度的苯甲醛對(duì)細(xì)胞顯示有毒性作用，從而限制了底物濃度的增加。進(jìn)一步將腈的濃度降至IOmM以下不導(dǎo)致產(chǎn)率進(jìn)一步下降，提示采用IOmM的扁桃腈是最佳的底物濃度。

不同的緩沖液系統(tǒng)還利用全細(xì)胞催化劑大腸桿菌BL21 (DE3) pAT-NitAf,采用不同的緩沖液系統(tǒng)進(jìn)行了扁桃酸產(chǎn)生的比較性研究。圖14表明，與所用的任何其他緩沖液相比，采用pH6.5Tris-緩沖液所達(dá)到的效果最佳。儲(chǔ)存穩(wěn)定性為測(cè)定構(gòu)建的全細(xì)胞生物催化劑的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，將懸浮于含20% (v/v)甘油50mM磷酸鈉緩沖液(PH7. 5)中的經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌BL21 (DE3) pAT-NitAf細(xì)胞調(diào)整至0D578 = 50，儲(chǔ)存在-18°C。在_18°C保存的樣品中加入防凍劑甘油可防止細(xì)胞裂解。在不同的時(shí)間間隔后，用磷酸鈉緩沖液洗滌樣品一次，調(diào)整到0D578 = 10。或者，在IPTG誘導(dǎo)后，將細(xì)胞分成等分存放在6°C冰箱內(nèi)，存放不同時(shí)間后作腈水解酶試驗(yàn)。加入IOmM扁桃腈啟動(dòng)反應(yīng)，37°C培育樣品120小時(shí)。在-18°C儲(chǔ)存35天后細(xì)胞仍然保留了最初活性的72%(圖6)。在+6°C—周后，全細(xì)胞催化劑的活性僅為最初活性的約50% (圖16)。還有在這些實(shí)驗(yàn)中，這與觀察到的細(xì)胞裂解相關(guān)。再次證明，隨測(cè)量時(shí)間的推移一部分細(xì)胞顯示的殘余活性相對(duì)穩(wěn)定。全細(xì)胞催化劑的溫度依賴性已描述純化的糞產(chǎn)堿桿菌腈水解酶的最佳溫度是40_45°C。圖17所述的測(cè)試溫度范圍30°C 45°C證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)。反應(yīng)混合物中所用的磷酸鹽緩沖液或Tris緩沖液看來(lái)無(wú)特殊影響。全細(xì)胞催化劑的可重復(fù)使用性(圖7)為研究全細(xì)胞生物催化劑的可重復(fù)使用性和穩(wěn)定性，在不同的緩沖液和溫度條件下進(jìn)行了 5輪24小時(shí)循環(huán)轉(zhuǎn)化反應(yīng)。一輪“循環(huán)”為24小時(shí)轉(zhuǎn)化反應(yīng)，然后離心得到大腸桿菌細(xì)胞，加入新鮮底物進(jìn)行下一輪循環(huán)。在磷酸鈉緩沖液(pH 7.5，45°C)中大腸桿菌BL21 (DE3) pAT-Ni tAf反應(yīng)在24小時(shí)內(nèi)達(dá)到了最高產(chǎn)量，產(chǎn)生了 2. 62mM扁桃酸，但5輪循環(huán)使用后，酶活性快速下降到最低，僅為最初活性的10%。采用Tris-HCl緩沖液(pH 7，45°C )，在24小時(shí)內(nèi)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了 2. 53mM扁桃酸，5輪循環(huán)使用后，可獲得超過(guò)33%的初始轉(zhuǎn)化率。在Tris-HCl (370C )緩沖液中細(xì)胞酶活性從第一輪循環(huán)的2. 24mM下降至5輪循環(huán)使用后的I. 25禮，表明有55%以上的殘余活性。在第一輪循環(huán)中，重懸于磷酸鈉緩沖液或Tris-HCl緩沖液中的細(xì)胞之間產(chǎn)率只有較小差異，但相反，采用Tris-HCl緩沖液的測(cè)試樣品始終表現(xiàn)出較好的整體性能。
實(shí)驗(yàn)章節(jié)細(xì)菌菌株和質(zhì)粒為了亞克隆，采用了英杰(Invitrogen)公司(美國(guó)加州卡爾斯巴德)的大腸桿菌 TOPlO[F-mcrAA (mrr-hsd RMS-mcrBC)O 80/acZ A Ml5 AlacX74 recAl araD139A (ara-leu) 7697ga/U ga/K rpsL(StrR) endAl nupG]。自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白融合蛋白的表達(dá)采用大腸桿菌 BL21 (DE3) [B, F-, dcm, ompT, Ion, hsdS (rB- mB_)，gal,入(DE3)]。37 0C在強(qiáng)烈震蕩(200rpm)下，在含氨芐青霉素(100 y g/mL)的Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)大腸桿菌菌株。在該培養(yǎng)基中加入瓊脂(1.5%，w/v)制備固體培養(yǎng)基。采用英杰公司(美國(guó)加州卡爾斯巴德)的質(zhì)粒pCR 4-T0P0 亞克隆腈水解酶基因。如前文(Rustler等人，2008 ;6，180，359號(hào)美國(guó)專利)所述構(gòu)建AIDA-I自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋 白框架編碼質(zhì)粒pET-Adx04。圖8顯示從11個(gè)轉(zhuǎn)化株中分離得到的質(zhì)粒,其中用Kpnl和Xhol消化后，在7個(gè)克隆的正確自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)拉(約7kb)中檢測(cè)到與PCR片段對(duì)應(yīng)的約Ikb的正確DNA片段。重組DNA技術(shù)擴(kuò)增糞產(chǎn)堿桿菌糞亞種ATCC 8750(德國(guó)韋塞爾LGC Standards GmbH)基因組DNA中的腈水解酶編碼基因。擴(kuò)增腈水解酶基因用的引物得自已公布的糞產(chǎn)堿桿菌腈水解酶基因序列的信息(Kaul 等人，2007 年)。用正向引物 Nit-Xhol (5 ' -CCGCTCGAGCAGACAAGAAAAATCGTCC)和反向引物Nit-Kpnl (3 ' -GGGGTACCGGACGGTTCTTGCACC)擴(kuò)增含腈水解酶基因的1073bp片段。為了方便PCR產(chǎn)物的克隆，加入XhoI和KpnI限制性位點(diǎn)(引物序列中加下劃線部分表示相應(yīng)酶的限制性位點(diǎn))。PCR反應(yīng)的10 ii L體積中含IOng基因組DNA、Eppendorf公司(德國(guó)漢堡)的適量Eppendorf PCR Mastermix、正向引物和反向引物(美國(guó)密爾沃基Sigma-Aldrich化學(xué)公司)各I ii L (10 ii M原液)。在Eppendorf公司(德國(guó)漢堡)的Eppendorf Mastercycler梯度儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR方法包括先95°C變性5分鐘,然后94°C 30秒、64°C I分鐘、72° I分鐘30輪循環(huán)，最后72°C延伸6分鐘。按照產(chǎn)商使用說(shuō)明書直接將PCR產(chǎn)物亞克隆到pCR 4_T0P0 載體中。按本說(shuō)明書他處所述方法制備質(zhì)粒DNA。用Xhol/Kpnl消化得到的質(zhì)粒，用瓊脂糖凝膠電泳和Qiagen凝膠抽提試劑盒(德國(guó)希爾登Qiagen公司)純化。將得到的片段插入用Xhol/Kpnl切割的pET_AdX04載體中，取代Adx04編碼基因得到 pAT-Ni tA o外膜制劑和SDS-PAGE培養(yǎng)大腸桿菌細(xì)胞過(guò)夜，取合適量的培養(yǎng)菌接種含2-巰基乙醇(IOmM)和氨芐青霉素(lOOiig/mL)的LB培養(yǎng)基。37°C (200rpm)培養(yǎng)細(xì)胞直至光密度(0D578)達(dá)到0. 5或
I。為誘導(dǎo)表達(dá)，加入購(gòu)自Roth公司(德國(guó)卡爾斯魯厄)的IPTG(終濃度ImM)。30°C培養(yǎng)60分鐘后，收獲細(xì)胞用Tris-HCl (0. 2M，pH 8. 2)液洗滌。對(duì)于蛋白酶可接近試驗(yàn)，將細(xì)胞重懸于含25 ii L蛋白酶K溶液(2%)的2ml Tris-HCl (0. 2M,pH 6.8)液中，37°C水浴培養(yǎng)60分鐘。按照改良的Hantke (Hantke, 1981年)方法進(jìn)行差速細(xì)胞分級(jí)分離。對(duì)于SDS-PAGE 電泳，用含Tris-HCl (100mM,pH 6. 8)、十二烷基硫酸鈉(4% )、溴酚藍(lán)(O. 2% )、2_巰基乙醇(2% )、二硫蘇糖醇(O. 2M)和甘油(20% )的樣品緩沖液以I : 2比例稀釋分離的外膜，煮沸5分鐘，在10 %聚丙烯酰胺凝膠上作電泳分析。用考馬斯亮藍(lán)染色蛋白質(zhì)，用購(gòu)自Fermentas公司(德國(guó)St. Leon-Rot)的Pageruler未染色梯度蛋白(作標(biāo)準(zhǔn))測(cè)定其大小。實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)化按以下步驟實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)用預(yù)先培養(yǎng)的重組大腸桿菌BL21 (DE3)pAT-NitAf菌株，以I : 100比率，接種主培養(yǎng)物，37°C在200rpm轉(zhuǎn)速搖床中培養(yǎng)。0D578達(dá)到I時(shí)，加入終濃度ImM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。30°C 200rpm誘導(dǎo)I小時(shí)。用50mM磷酸鹽緩沖液(pH 7. 5)洗滌細(xì)胞一次后，用同一緩沖液將0D578調(diào)整為10。然后，取Iml等份的所述細(xì)胞懸浮液與20 μ I扁桃腈(O. 5Μ)混和，在轉(zhuǎn)速IOOOrpm或200rpm的恒溫混合儀中不同溫度(特別是37°C )下培養(yǎng)。提取不同時(shí)間間隔的樣品，離心(6000x g，5min)分離，用購(gòu)自VWR公司(德國(guó)達(dá)姆施塔特)的O. 2 μ m聚醚砜膜過(guò)濾除菌。用HPLC直接分析上清液。除菌過(guò)濾后未檢測(cè)到進(jìn)一步的生物轉(zhuǎn)化。 分析方法采用配備二極管陣列檢測(cè)器996和Waters公司(美國(guó)馬薩諸塞州)的2695分離模塊的HPLC(Millenium Chromatography Manager 3. 2)分析腈轉(zhuǎn)化。對(duì)于手性分析，采用惠普公司(德國(guó)布林根)的反相柱[100mm X 4. 6mm (內(nèi)徑)，填充Hypersil ODS 5μηι直徑顆粒]以分光光度法檢測(cè)210nm處轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的身份。用甲醇(40% v/v)和磷酸(O. I % )水溶液作為HPLC分離的流動(dòng)相。扁桃酸對(duì)映體的分離采用CS-色譜服務(wù)公司(德國(guó)Langerwehe)的手相柱[150mm x 4. 6mm (內(nèi)徑)，填充 Reprosil 手性-OM 5μηι 直徑顆粒]。移動(dòng)相由己燒(90% v/v)、異丙醇(10% v/v)和三氟乙酸(O. I % v/v)組成。按其他文獻(xiàn)所述作輕微修改用乙酸乙酯代替二氯甲烷(Yamamoto，1991年)，提取生物轉(zhuǎn)化樣品中的扁桃酸。實(shí)施例2 :肺炎克雷伯菌的腈水解酶按實(shí)施例I所述，在中間克隆入大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)載體中和序列分析后，用PCR擴(kuò)增肺炎克雷伯菌腈水解酶基因，將其插入相應(yīng)的自身展示載體中。該自身展示構(gòu)建物編碼的融合蛋白包含肺炎克雷伯菌腈水解酶、自身轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域、跨膜接頭和信號(hào)肽，如實(shí)施例I的pAT-NitAf所述,將其稱為pAT-NitKp。表面展示該融合多肽的相應(yīng)大腸桿菌菌株稱為大腸桿菌 BL21 (DE3)pAT-NitKp。對(duì)肺炎克雷伯菌腈水解酶的表達(dá)和表面定位進(jìn)行檢測(cè)，方法與糞產(chǎn)堿桿菌腈水解酶類似(參見實(shí)施例I)。從文獻(xiàn)可熟知，所述腈水解酶對(duì)于底物溴草腈顯示有很高的特異性。所述毒性化合物(溴草腈)廣泛用作農(nóng)業(yè)除草劑，在德國(guó)每年都以工業(yè)規(guī)模施用。而其對(duì)應(yīng)的羧酸毒性較低，在自然環(huán)境中穩(wěn)定。圖18顯示大腸桿菌JK321 pAT-NitKp通過(guò)溴草腈產(chǎn)生的3，5_ 二溴_4_羥基-苯甲酸。該圖表明，在大腸桿菌細(xì)胞表面表達(dá)的肺炎克雷伯菌腈水解酶能把腈轉(zhuǎn)變成其相應(yīng)的羧酸。實(shí)施例3 :釀酒酵母菌的腈水解酶如實(shí)施例I所述，用PCR擴(kuò)增釀酒酵母菌的腈水解酶基因并克隆。序列分析揭示，其與獲自數(shù)據(jù)庫(kù)的釀酒酵母菌腈水解酶序列100%相同。如實(shí)施例I所述，將該腈水解酶克隆到大腸桿菌中，產(chǎn)生的融合蛋白包含自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域、跨膜接頭和信號(hào)肽。序列分析還揭示與數(shù)據(jù)庫(kù)的序列100%相同。用實(shí)施例I所述類似方法檢測(cè)表達(dá)。對(duì)編碼包含釀酒酵母菌腈水解酶、自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域、跨膜接頭和信號(hào)肽的融合蛋白的自身展示構(gòu)建物，如實(shí)施例I的PAT-NitAf所述，將其稱為pAT-NitSc。表面展示該融合多肽的相應(yīng)大腸桿菌菌株稱為大腸桿菌BL21 (DE3)pAT-NitSc。發(fā)現(xiàn)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，包含釀酒酵母菌腈水解酶的該融合蛋白位于酵母菌細(xì)胞表面。采用如實(shí)施例I所述經(jīng)胰蛋白酶消化的全細(xì)胞。結(jié)果小結(jié)于圖9中。參考文獻(xiàn)I. Jose J、Meyer TF(2007年)；《自身展示的介紹，從發(fā)現(xiàn)到生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用》；Microbiol Mol Biol Rev(微生物學(xué)與分子生物學(xué)評(píng)論)；71(4) :600-19 2. Nagasawa T、Mauger J、Yamada H(1990 年)；《一種新型腈水解酶，糞產(chǎn)堿桿菌JM3芳基乙腈水解酶，提純和特征鑒定》；Eur J Biochem(歐洲生物化學(xué)雜志)194(3)765-723. Yamamoto K、Oishi K、Fujimatsu I、Komatsu K(1991 年);《用幾產(chǎn)喊菌 ATCC8750從扁桃腈產(chǎn)生R-(-)_扁桃酸》；Appl Environ Microbiol (應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué))； 57(10) =3028-324. Rey P、Rossi JC、Taillades J、Gros G、Nore 0(2004 年)；《用固定的臆水解酶水解腈在甲硫氨酸輕基類似衍生物合成中的應(yīng)用》J Agric Food Chem(農(nóng)業(yè)食品化學(xué)雜志)52(26) :8155-625. Kiziak C、Conradt D、Stolz A、Mattes R、Klein J(2005 年);《突光假單胞菌EBC191的腈水解酶基因的克隆和異源表達(dá)以及重組酶的生化特征分析》，Microbiology (微生物學(xué))151 (Pt 11) :3639-486. Kaul P、Stolz A>Baner jee UC(2007年)；《用于對(duì)映體選擇性腈水解的交聯(lián)無(wú)定形腈水解酶聚集體》；Adv Synth Catal, 349 =2167-21767. Banerjee A、Dubey S、Kaul P、Barse B、Piotrowski M> Banerjee UC (2008年)；《惡臭假單胞菌的對(duì)映體選擇性腈水解酶克隆、異源表達(dá)與生物反應(yīng)器研究》；MolBiotechnol (分子生物技術(shù))[印刷前電子發(fā)布]8. Luo H、Fan L、Chang Y、Ma J、Yu H、Shen Z (2008 年)；《玫瑰紅紅球菌 tgl_A6腈水解酶基因在大腸桿菌中的克隆、過(guò)表達(dá)及特征分析》；ApplBiochem Biotechnol (應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù)》[印刷前電子發(fā)布]oxynitrilase9. Rustler S、Motejadded H、Altenbuchner J、Stolz A(2008 年)；《用于(S)-扁桃酸合成的熒光假單胞菌芳基乙腈水解酶與木薯(S)-醇腈醛化酶在巴氏畢赤酵母菌中的同時(shí)表達(dá)》；Appl Microbiol Biotechnol (應(yīng)用微生物學(xué)生物技術(shù))80 (I) :87-9710.采用腈水解酶制備2-羥基-4-甲基丁酸的工業(yè)規(guī)模方法，美國(guó)專利618035911. Ress- Loschke M. Friedrich T、Hauer B、Mattes R(1998 年)；Verfahrenzur Herstellung chiraler Carbonsauren aus Nitrilen mit Hilfe einer Nitrilaseoder Mikroorganismen, dieein Gen f iir eine Nilrilase enthalten.德國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)朌E 19848129A1
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權(quán)利要求
1.一種制備腈水解酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的方法，包括以下步驟 (i)提供表面含有所述腈水解酶的微生物和/或所述微生物的膜制劑； (ii)在與腈水解酶活性相容的條件下，使所述微生物和/或其膜制劑接觸一種或多種腈水解酶的底物。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中腈水解酶催化反應(yīng)產(chǎn)物是羧酸，至少一種腈水解酶的底物是臆。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其中腈水解酶在微生物中重組表達(dá)，并轉(zhuǎn)運(yùn)至微生物表面。
4.如權(quán)利要求1-3任何一項(xiàng)所述的方法，其中腈水解酶融合于自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域。
5.如權(quán)利要求1-4任何一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(i)包括 (a)提供含有操作性連接于表達(dá)調(diào)控序列的核酸序列的微生物，所述核酸序列包含 (1)信號(hào)肽的編碼部分； (2)要展示的重組腈水解酶的編碼部分； (3)任選的蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的編碼部分； (4)跨膜接頭的編碼部分；和 (5)自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域的編碼部分； (b)培養(yǎng)該微生物,培養(yǎng)條件為能表達(dá)(a)所述的核酸序列，并在微生物表面展不該核酸序列的表達(dá)產(chǎn)物。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，還包括步驟(c):制備(b)所述微生物的膜制劑。
7.如權(quán)利要求4-6任何一項(xiàng)所述的方法，其中自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域選自下面的組，包括Ssp、Ssp-hl、Ssp_h2、PspA、PspB、Ssal、SphBl、AspA/NalP、VacA、AIDA-I> IcsA、MisL、TibA、Ag43、ShdA、AutA、Tsh、SepA、EspC、EspP、Pet、Pic、SigA、Sat、Vat、EpeA、EatA、EspI、EaaA、EaaC、Pertactin、BrkA、Tef、Vag8、PmpD、Pmp20、Pmp21、IgAl 蛋白酶、App、Hap、rOmpA、rOmpB、ApeE> EstA、Lip-1、McaP、BabA> SabA> AlpA、Aae> NanB 及它們的變體。
8.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其中腈水解酶選自產(chǎn)堿桿菌屬的腈水解酶、克雷伯菌屬和酵母菌屬的腈水解酶。
9.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其中微生物是革蘭陰性細(xì)菌，特別是大腸桿菌。
10.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其中在pH約6.5-7. 5的范圍內(nèi)實(shí)施步驟(ii)。
11.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其中在有氧和/或氧化條件下實(shí)施步驟(ii)。
12.如權(quán)利要求2-11任何一項(xiàng)所述的方法，其中腈選自下組，包括扁桃腈、野黑櫻苷、溴草臆、碘苯臆、氯二甲臆、茴香臆、3-溴-4-輕基節(jié)臆、3-氟-4-輕基節(jié)臆、4-輕基-3, 5- 二甲氧基節(jié)臆、節(jié)臆、苯基丙臆、苯基甘油臆、正丁臆、正戍臆、異丁臆和玻拍臆。
13.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其中腈水解酶催化反應(yīng)產(chǎn)物是羧酸，產(chǎn)生的所述羧酸的對(duì)映體過(guò)量至少約為70%。
14.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，還包括步驟(iii):回收步驟(ii)中所用的微生物。
15.一種在其表面展示重組腈水解酶的微生物。
16.一種包含獲自權(quán)利要求15所述微生物的重組腈水解酶的膜制劑。
17.權(quán)利要求15所述微生物和/或權(quán)利要求16所述膜制劑在產(chǎn)生腈水解酶催化反應(yīng)產(chǎn)物中的應(yīng)用。
18.—種制備表面展示重組腈水解酶的微生物的方法，包括在所述微生物中引入核酸序列，所述核酸序列包含 (1)信號(hào)肽的編碼部分； (2)要展示的重組腈水解酶的編碼部分； (3)任選的蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的編碼部分； (4)跨膜接頭的編碼部分；和 (5)自身轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域的編碼部分，其中，所述核酸序列與表達(dá)調(diào)控序列操作性相連。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備腈水解酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的方法，包括步驟(i)提供表面含所述腈水解酶的微生物和/或所述微生物的膜制劑；和(ii)在與腈水解酶活性相容的條件下使所述微生物和/或微生物膜制劑接觸一種或多種腈水解酶的底物。本發(fā)明還涉及采用展示腈水解酶的全細(xì)胞生物催化劑或其膜制劑轉(zhuǎn)化外消旋扁桃腈制備光學(xué)純(R)-扁桃酸的方法。
文檔編號(hào)C12N9/78GK102791855SQ201080061731
公開日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2010年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月16日
發(fā)明者喬基姆·何塞, 克里斯蒂安·德策爾, 露絲·馬斯 申請(qǐng)人:希魯士股份有限公司與帕滕特有限合資公司