專利名稱：：用于檢測(cè)遺傳物質(zhì)的方法和組合物的制作方法用于檢測(cè)遺傳物質(zhì)的方法和組合物相關(guān)串請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)根據(jù)美國(guó)法典第35篇第119(e)條要求獲得2009年11月25日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/264，591、2010年3月2日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/309，837、2010年3月2日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/309，845,2010年3月25日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/317，635,2010年3月25日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/317，639,2010年3月25日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/317，684、2010年3月25日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/341，065、2010年3月25日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/341，218、2010年9月8日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/380,981,2010年11月I日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/409，106,2010年11月2日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/409，473、2010年11月5日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/410，769的利益，其中每個(gè)申請(qǐng)都整體援引并入本文。
背景技術(shù)：
：胎兒非整倍性是染色體數(shù)的畸變，通常是由于卵子或精子發(fā)生期間的減數(shù)分裂不分離引起的；然而，某些非整倍性如三體性8更通常地是由于合子后有絲分裂分離導(dǎo)致的(Nicolaidis和Petersen(1998)HumanReproduction13:313-319)。這樣的畸變包括正常染色體數(shù)的減少和增加，并且可涉及常染色體以及性染色體。減少性非整倍性的一個(gè)例子是特納綜合征，其典型特征是存在單X性染色體。染色體數(shù)增加的例子包括唐氏綜合征(染色體21三體)、帕韜氏綜合征(染色體13三體)、愛德華氏綜合征(染色體18三體)和克氏綜合征(Kleinfelter'ssyndrome)(性染色體的XXY三體)。非整倍性通常導(dǎo)致顯著的身體和神經(jīng)損傷，這導(dǎo)致很高百分比的受影響個(gè)體不能存活至成年。事實(shí)上，除13、18或21之外其它染色體的常染色體非整倍性胎兒通常在子宮內(nèi)死亡。然而，某些非整倍性，如克氏綜合征，表現(xiàn)出的表型非常不明顯，并且那些受其它三體性如XXY和XXX影響者常常發(fā)育成熟為具有生育能力的成年人。在一些情況下，導(dǎo)致染色體一部分的拷貝數(shù)異常的部分非整倍性可能是由于不平衡的不分離引起的。采用侵入性檢測(cè)(例如通過羊膜穿刺術(shù)或絨毛膜絨毛取樣(CVS))對(duì)胎兒進(jìn)行非整倍性的產(chǎn)前診斷，這與O.5%-2%的流產(chǎn)操作相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)(D'Alton,Μ.E.，(1994)SeminPerinatol18:140-62;CaugheyAB(2006)ObstetGynecol108:612-6)。準(zhǔn)確篩查胎兒非整倍性的另一個(gè)障礙在于母親血漿中胎兒DNA濃度較低，尤其是在孕齡較早時(shí)。單路或低級(jí)多路檢測(cè)方法不可能提供足夠的靶標(biāo)數(shù)來(lái)區(qū)分整倍性胎兒和非整倍性胎兒(例如染色體21三體)。通常，本領(lǐng)域還需要用于檢測(cè)生物學(xué)樣品(不一定來(lái)自于母親血液)中拷貝數(shù)變異的方法和組合物。
發(fā)明內(nèi)容本公開文本提供了用于檢測(cè)遺傳物質(zhì)群體內(nèi)靶標(biāo)多核苷酸的拷貝數(shù)的方法和組合物?？梢岳梅峙鋵袠?biāo)多核苷酸細(xì)分到多個(gè)反應(yīng)體積。在一些情況下，針對(duì)靶標(biāo)多核苷酸的探針被細(xì)分到多個(gè)反應(yīng)體積。在一些情況下，所述方法包括如下步驟a.將第一連接探針與第一靶標(biāo)多核苷酸結(jié)合；b.將第二連接探針與第二靶標(biāo)多核苷酸結(jié)合；c.使所述第一和第二連接探針進(jìn)行連接反應(yīng)以獲得一種或多種連接產(chǎn)物；d.將所述一種或多種連接產(chǎn)物分配到兩個(gè)或更多個(gè)分區(qū)中；e.擴(kuò)增所述一種或多種連接產(chǎn)物內(nèi)的序列以獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；f.確定包含所述擴(kuò)增產(chǎn)物的所述分區(qū)的數(shù)目；以及g.計(jì)算所述第一靶標(biāo)多核苷酸的拷貝數(shù)。在一些情況下，靶標(biāo)多核苷酸沒有被分配到所述兩個(gè)或更多個(gè)分區(qū)中。分區(qū)可以包括多種類型的分區(qū)，包括固體分區(qū)(即孔、管等等)和流體分區(qū)(例如油相如連續(xù)油相中的水性小滴或至少兩種不混溶流體的混合物中的水性小滴)。分區(qū)也可以是穩(wěn)定的或不穩(wěn)定的。例如，在一些情況下，在擴(kuò)增過程期間，所述兩個(gè)或更多個(gè)分區(qū)基本上保持完整。在一些情況下，分區(qū)是油相中的水性小滴，且所述水性小滴在本方法的擴(kuò)增反應(yīng)期間基本保持完整。當(dāng)評(píng)價(jià)分區(qū)是否存在一種或多種靶標(biāo)多核苷酸(或針對(duì)所述多核苷酸的探針)時(shí)，在確定步驟期間所述分區(qū)(例如所述水性小滴)也可基本上保持完整。所述分區(qū)可能包含從所述連接產(chǎn)物起始的擴(kuò)增反應(yīng)。第一和第二連接探針可結(jié)合(或被設(shè)計(jì)為結(jié)合)多種靶標(biāo)多核苷酸；通常，第一連接探針結(jié)合第一靶標(biāo)多核苷酸，而第二連接探針結(jié)合第二多核苷酸。在一些情況下，第一和第二連接探針各自被設(shè)計(jì)為結(jié)合所述第一靶標(biāo)多核苷酸。在其它情況下，所述第一連接探針結(jié)合第一靶標(biāo)多核苷酸，該第一靶標(biāo)多核苷酸的序列不同于所述第二靶標(biāo)多核苷酸的序列。在一些情況下，第一連接探針被設(shè)計(jì)為結(jié)合在種內(nèi)個(gè)體間保守的多核苷酸序列。在一些情況下，第一連接探針被設(shè)計(jì)為結(jié)合在兩個(gè)或更多不同種間保守的多核苷酸序列。在一些情況下，連接探針結(jié)合染色體的非多態(tài)性區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括將多條連接探針連接于所述第一靶標(biāo)多核苷酸。例如，所述方法可包括將至少4條連接探針結(jié)合于所述第一靶標(biāo)多核苷酸。在其它情況下，此處提供的方法中使用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200、500、1000、5000、10，000,20,000,30,000,40,000,50,000,60,000,70,000,100,000、2，000，000,3,000，000,4,000，000,5,000，000,6,000，000,7,000，000,8,000，000、9，000,000或10，000，000條連接探針。通常，一條或更多的所述連接探針結(jié)合于不同多核苷酸(例如，不同染色體、相同染色體內(nèi)的不同區(qū)域)。在一些情況下，在本方法和組合物中，使用多個(gè)第一連接探針(例如靶標(biāo)連接探針)，并且使用多個(gè)第二連接探針(例如參照連接探針)。該方法可進(jìn)一步包括將至少4條連接探針結(jié)合于所述第一靶標(biāo)多核苷酸，并且將至少4條連接探針結(jié)合于所述第二靶標(biāo)多核苷酸。在一些情況下，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200、500、1000、5000、10，000,20,000,30,000、40，000,50,000,60,000,70,000、100，000,2,000，000,3,000，000,4,000，000,5,000，000、6，000，000,7,000，000,8,000，000,9,000，000或10，000，000條連接探針結(jié)合于所述第一或所述第二靶標(biāo)多核苷酸。第一連接探針可結(jié)合(或被設(shè)計(jì)為結(jié)合)所述第一靶標(biāo)多核苷酸中的第一區(qū)域，并且所述第二連接探針可結(jié)合(或被設(shè)計(jì)為結(jié)合)所述第一靶標(biāo)多核苷酸中的第二區(qū)域，其中所述第一和第二區(qū)域沒有相同序列。第一靶標(biāo)多核苷酸通常與所述第二靶標(biāo)多核苷酸不相同。在一些情況下，第一靶標(biāo)多核苷酸與所述第二靶標(biāo)多核苷酸相同。在一些例子中，所述第一靶標(biāo)多核苷酸是測(cè)試染色體，而所述第二靶標(biāo)多核苷酸是參照染色體。測(cè)試染色體的例子包括但不限于染色體21、染色體13、染色體18和X染色體。所述測(cè)試染色體還可選自染色體1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、X和Y。第一靶標(biāo)多核苷酸可以是染色體的區(qū)段，如與胎兒非整倍性相關(guān)的染色體的區(qū)段(該染色體或該區(qū)段可以與胎兒非整倍性相關(guān))。此處提供的方法和組合物通常涉及將探針與其自身連接、將兩條探針連接在一起，和/或所述連接反應(yīng)的連接產(chǎn)物。所述連接反應(yīng)可導(dǎo)致所述第一連接探針的5’區(qū)域與所述第一連接探針的3’區(qū)域的連接，以獲得環(huán)狀的連接產(chǎn)物。在一些情況下，連接反應(yīng)導(dǎo)致所述第一連接探針的5’區(qū)域與所述第二連接探針的3’區(qū)域的連接，以獲得包含所述第一和第二連接探針的至少一部分的線性連接產(chǎn)物。所述第一連接探針的所述5’區(qū)域和所述3’區(qū)域可各自結(jié)合(或被設(shè)計(jì)為結(jié)合)所述第一靶標(biāo)多核苷酸中的相鄰序列。所述相鄰序列被O個(gè)核苷酸分隔。所述第一連接探針的所述5’區(qū)域和所述3’區(qū)域可結(jié)合或被設(shè)計(jì)為結(jié)合所述第一靶標(biāo)多核苷酸中的鄰近序列。所述鄰近序列可被至少I個(gè)核苷酸分隔。在一些情況下，所述鄰近序列被至少5、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個(gè)核苷酸的缺口分隔。所述連接反應(yīng)可進(jìn)一步包括模板驅(qū)動(dòng)的缺口填補(bǔ)反應(yīng)，以便在所述第一連接探針的(或所述第二連接探針的)所述5’區(qū)域和所述3’區(qū)域間的缺口中引入核苷酸。連接探針可包括可被酶切割的位點(diǎn)。例如，可被酶切割的位點(diǎn)可包括一個(gè)或更多的尿嘧啶。在一些情況下，所述尿嘧啶可被其它核苷酸分隔?？杀幻盖懈畹奈稽c(diǎn)可包括限制性位點(diǎn)。第一連接探針可以是特定類型的，如分子倒置探針、鎖扣探針(padlockprobe),線性連接探針等。此處提供的方法可進(jìn)一步包括進(jìn)行酶反應(yīng)以去除線性多核苷酸或單鏈多核苷酸或雙鏈多核苷酸。例如，核酸外切酶(例如，Exo1、11和/或III)可用于此處描述的方法中。核酸外切酶處理經(jīng)常從樣品體積中去除所有或顯著量未結(jié)合的連接探針。此處提供的探針可與信號(hào)試劑偶聯(lián)。所述第一連接探針可被偶聯(lián)于第一信號(hào)試齊U，而第二連接探針被偶聯(lián)于第二信號(hào)試劑。通常，許多這樣的第一和第二連接探針用于此處的方法和組合物中，其中所述探針偶聯(lián)于相同的信號(hào)試劑(例如，相同的熒光團(tuán))或不同的信號(hào)試劑(例如，不同顏色的熒光團(tuán))。所述第一信號(hào)試劑可以是第一種顏色的熒光標(biāo)記物，而所述第二信號(hào)試劑可以是第二種顏色的熒光標(biāo)記物。檢測(cè)連接探針也常常是此處提供的方法中的步驟。所述方法可包括檢測(cè)具有第一信號(hào)試劑的所述第一連接探針以及檢測(cè)具有第二信號(hào)試劑的所述第二連接探針。所述第一連接探針可包含第一組連接探針，其中所述組內(nèi)的每條探針針對(duì)第一染色體的不同區(qū)域，其中所述第二連接探針包含第二組連接探針，其中所述組內(nèi)的每條探針針對(duì)第二染色體的不同區(qū)域。在一些情況下，所述第一靶標(biāo)多核苷酸是測(cè)試染色體，而所述第二靶標(biāo)多核苷酸是參照染色體。在一些情況下，所述第一和第二連接探針偶聯(lián)于相同的顏色。此處提供的方法和組合物還可涉及檢測(cè)遺傳物質(zhì)群體內(nèi)靶標(biāo)多核苷酸的拷貝數(shù)的方法，該方法包括a.將第一連接探針與第一靶標(biāo)多核苷酸結(jié)合；b.將第二連接探針與第二靶標(biāo)多核苷酸結(jié)合；c.使所述第一和第二連接探針進(jìn)行連接反應(yīng)以獲得一種或多種連接產(chǎn)物；d.將所述一種或多種連接產(chǎn)物分配到連續(xù)油相內(nèi)的兩個(gè)或更多個(gè)水性小滴中；e.擴(kuò)增所述一種或多種連接產(chǎn)物內(nèi)的序列以獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；f.確定包含所述擴(kuò)增產(chǎn)物的所述兩個(gè)或更多個(gè)水性小滴的數(shù)目；以及g.基于所述數(shù)目計(jì)算所述靶標(biāo)多核苷酸的拷貝數(shù)。在一些情況下，所述靶標(biāo)多核苷酸沒有被分配到所述兩個(gè)或更多個(gè)水性小滴中。在一些情況下，所述靶標(biāo)多核苷酸沒有被擴(kuò)增。在一些情況下，或在所述擴(kuò)增或確定步驟期間，所述兩個(gè)或更多個(gè)水性小滴基本上保持完整。在一些情況下，所述兩個(gè)或更多個(gè)水性小滴平均包含多于一條連接探針，且所述方法進(jìn)一步包括用算法計(jì)算每個(gè)水性小滴中靶標(biāo)連接探針的平均數(shù)。所述兩個(gè)或更多個(gè)水性小滴可能多于4，000個(gè)小滴。在一些情況下，所述兩個(gè)或更多個(gè)水性小滴可能多于I,000、10，000,20,000,50,000、100，000,200,000,500,000、1，000，000或5，000，000個(gè)小滴。在一些情況下，所述小滴以高小滴數(shù)/ml的密度存在于單室中。所述密度可高于100，000個(gè)水性小滴/ml。單室中小滴密度的例子包括10,000個(gè)小滴/ml,100,000個(gè)小滴/ml、200，000個(gè)小滴/ml、300，000個(gè)小滴/ml、400，000個(gè)小滴/ml、500，000個(gè)小滴/ml、600，000個(gè)小滴/ml、700，000個(gè)小滴/ml、800，000個(gè)小滴/ml、900，000個(gè)小滴/ml或1，000,000個(gè)小滴/ml。用于此處提供的任何方法或組合物的小滴可以是單分散小滴。小滴平均可具有50nm-300μm的直徑。在一些實(shí)施方案中，小滴直徑平均可以是約O.001、0.01、O.05,0.1、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、100、120、130、140、150、160、180、200、300、400或500微米。在一些情況下，小滴不包括偶聯(lián)于寡核苷酸的大量微珠。水性小滴可存在于油流體或油相中。油相可包含陰離子含氟表面活性劑，陰離子含氟表面活性劑的銨鹽，如Krytox。Krytox可選自KrytoxAS、KrytoxFSH和KrytoxFSH的嗎啉代衍生物。油相可包含氟化油。此處提供的方法(例如，使用小滴檢測(cè)拷貝數(shù))可用于檢測(cè)包含少于1，000個(gè)拷貝的所述第一靶標(biāo)多核苷酸的遺傳物質(zhì)群體內(nèi)的所述第一靶標(biāo)多核苷酸。在一些情況下，所述兩個(gè)或更多個(gè)水性小滴平均包含多于一條連接探針，且所述方法進(jìn)一步包括用算法計(jì)算每個(gè)水性小滴中靶標(biāo)連接探針的平均數(shù)。小滴可包含與遺傳病相關(guān)的染色體區(qū)段的第一靶標(biāo)多核苷酸。小滴可包含特定類型的連接探針(例如鎖扣探針、分子倒置探針、連接檢測(cè)反應(yīng)(LDR)探針等)。連接探針可進(jìn)行連接反應(yīng)，將連接探針的5’區(qū)域與連接探針的3’區(qū)域相連接。此處提供的方法和組合物也可涉及檢測(cè)胎兒遺傳狀況的方法，包括a.獲得包含靶標(biāo)多核苷酸的母親和胎兒遺傳物質(zhì)的混合物；b.將所述混合物與結(jié)合所述靶標(biāo)多核苷酸的靶向寡核苷酸組合；c.將所述靶向寡核苷酸細(xì)分到反應(yīng)體積內(nèi)，其中所述反應(yīng)體積中的至少一個(gè)不包含靶標(biāo)多核苷酸及靶向寡核苷酸；d.在所述反應(yīng)體積中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；e.檢測(cè)所述反應(yīng)體積內(nèi)所述靶標(biāo)多核苷酸或所述靶向寡核苷酸的存在；以及f.確定所述混合物中所述靶標(biāo)多核苷酸的相對(duì)水平以檢測(cè)胎兒的遺傳狀況。反應(yīng)體積可以是在連續(xù)油相中的水性小滴。靶向寡核苷酸可包含一個(gè)或更多引物對(duì)、連接探針、分子倒置探針、連接檢測(cè)反應(yīng)(LDR)探針、鎖扣探針及其任意組合。反應(yīng)體積可包含平均多于一個(gè)拷貝的靶向寡核苷酸和/或平均多于一個(gè)拷貝的靶標(biāo)多核苷酸。所述反應(yīng)體積可進(jìn)一步包含針對(duì)參照多核苷酸的引物。在一些情況下，所述反應(yīng)體積進(jìn)一步包含針對(duì)參照多核苷酸的連接探針。在一些實(shí)施方案，連接探針在所述反應(yīng)體積中擴(kuò)增。在檢測(cè)胎兒遺傳狀態(tài)的方法中使用的胎兒遺傳物質(zhì)可來(lái)源于針對(duì)胎兒遺傳物質(zhì)選擇性預(yù)先富集的細(xì)胞樣品。但是，在一些實(shí)施方案中，在檢測(cè)胎兒遺傳狀態(tài)的方法中使用的胎兒遺傳物質(zhì)并不來(lái)源于針對(duì)胎兒遺傳物質(zhì)選擇性預(yù)先富集的細(xì)胞樣品。靶標(biāo)多核苷酸可能在選自染色體18、13、21和X或選自染色體1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、X或Y的染色體中。在一些情況下，所述反應(yīng)體積是油相中的水性小滴，所述靶向寡核苷酸是連接探針，且所述確定步驟包括將包含所述連接探針的擴(kuò)增產(chǎn)物的小滴數(shù)與包含針對(duì)參照多核苷酸的連接探針的擴(kuò)增產(chǎn)物的小滴數(shù)進(jìn)行比較。在一些情況下，所述參照多核苷酸是與胎兒遺傳異常無(wú)關(guān)的染色體區(qū)域。如在此處提供的方法和組合物中所用的，所述靶向寡核苷酸可以是在與靶標(biāo)多核苷酸雜交后經(jīng)過連接而變成環(huán)狀的連接探針。本公開文本也提供了組合物如微膠囊組合物以及使用所述微膠囊組合物的方法。在一些情況下，組合物是包含連接探針的微膠囊，其中所述微膠囊通過如下步驟獲得a.選擇性地將多條連接探針與遺傳樣品內(nèi)的靶標(biāo)多核苷酸結(jié)合；b.將至少一條所述結(jié)合的連接探針的5’末端與同一或其它的結(jié)合的連接探針的3’末端連接，從而獲得至少一種連接產(chǎn)物；c.將包含所述至少一種連接產(chǎn)物的水溶液引入用于產(chǎn)生小滴的裝置中；d.用所述裝置產(chǎn)生包含所述至少一種連接產(chǎn)物的水性小滴，其中所述水性小滴在不混溶的流體中；以及e.將所述小滴轉(zhuǎn)化為包含固相外部的微膠囊。在一些情況下，所述轉(zhuǎn)化包括在50°C以上加熱或在70°C以上加熱。不混溶的液體(例如油)可包括氟化表面活性劑。在一些情況下，水相包含氟化表面活性劑。油可以是氟碳油。油相可包含陰離子表面活性劑。油相可包含Krytox銨。在一些情況下，所述微膠囊不包含結(jié)合于寡核苷酸的微珠。所述微膠囊可在高于70°C的溫度下基本上保持完整。微膠囊可包含能選擇性地結(jié)合與遺傳病相關(guān)的靶標(biāo)多核苷酸的連接探針。在一些情況下，所述連接探針能選擇性地結(jié)合與胎兒非整倍性相關(guān)的靶標(biāo)多核苷酸。在一些情況下，所述遺傳靶標(biāo)位于選自染色體21、染色體13、染色體18和X染色體的染色體內(nèi)。在一些情況下，所述遺傳靶標(biāo)位于染色體1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、X或Y內(nèi)。微膠囊可包含一種或更多種所述連接探針(例如鎖扣探針、分子倒置探針、連接檢測(cè)反應(yīng)(LDR)探針、環(huán)狀探針等)。微膠囊可包含通過在連接反應(yīng)后將先前環(huán)化的探針線性化而獲得的線性探針。在一些情況下，微膠囊包含環(huán)化的連接探針。在一些情況下，微膠囊包含連接檢測(cè)反應(yīng)(LDR)的線性產(chǎn)物。此處提供的組合物和方法也可涉及包含兩個(gè)或更多個(gè)水性小滴的油包水型混合物，其中所述兩個(gè)或更多個(gè)水性小滴中的至少一個(gè)包含針對(duì)第一靶標(biāo)多核苷酸的第一連接探針，而所述兩個(gè)或更多個(gè)水性小滴中的至少一個(gè)包含針對(duì)第二靶標(biāo)多核苷酸的第二連接探針。所述第一靶標(biāo)多核苷酸和所述第二靶標(biāo)多核苷酸可以是相同的分子，或是具有同樣的序列或結(jié)構(gòu)的不同分子，或是具有不同序列或結(jié)構(gòu)的不同分子。在一些情況下，所述第一靶標(biāo)多核苷酸具有與所述第二靶標(biāo)多核苷酸的序列不同的序列。在一些情況下，所述第一靶標(biāo)多核苷酸具有與所述第二靶標(biāo)多核苷酸相同的序列。所述第一靶標(biāo)多核苷酸可包含基因組區(qū)段內(nèi)的第一區(qū)域，而所述第二靶標(biāo)多核苷酸可包含所述基因組區(qū)段內(nèi)的第二區(qū)域，其中所述第一區(qū)域不具有與所述第二區(qū)域相同的序列。在一些情況下，所述油包水型混合物進(jìn)一步包含Krytox銨表面活性劑。所述Krytox表面活性劑可以以至少O.01%的濃度存在于所述混合物的油相中。在一些情況下，所述混合物包含的連接探針是環(huán)狀探針經(jīng)酶切的線性產(chǎn)物。在一些情況下，所述混合物包含環(huán)化的探針本身。在一些情況下，連接探針可包含酶切位點(diǎn)，在該處可以進(jìn)行如尿嘧啶-N-糖基化酶或限制性酶催化的酶切。本發(fā)明包括對(duì)母親和胎兒遺傳物質(zhì)混合物中的靶標(biāo)序列進(jìn)行差異檢測(cè)的方法，包括如下步驟a)獲得包含母親和胎兒遺傳物質(zhì)的母體組織；b)將遺傳物質(zhì)分配到離散樣品中，每份樣品平均包含不超過約一個(gè)靶標(biāo)序列/樣品，其中離散樣品包含一組針對(duì)已知靶標(biāo)序列的引物和/或一組針對(duì)已知參照序列的參照引物；c)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；d)檢測(cè)離散樣品中靶標(biāo)或參照序列的存在；以及e)比較被檢測(cè)的靶標(biāo)序列與被檢測(cè)的參照序列的比例，以確定靶標(biāo)序列的差異量。所述方法可進(jìn)一步包括比較被檢測(cè)的靶標(biāo)序列與被檢測(cè)的參照序列的比例以確定靶標(biāo)序列的差異量的步驟，其中被檢測(cè)的靶標(biāo)序列與被檢測(cè)的參照序列的差異表明胎兒遺傳異常。在一些實(shí)施方案中，所述方法是檢測(cè)胎兒非整倍性的方法。在一些情況下，所述靶標(biāo)序列是非整倍性的標(biāo)記物，而所述參照序列在母親和胎兒遺傳物質(zhì)中是二倍體。母體組織可以是母親的外周血、血漿或血清，或此處所述的其它組織。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)樣品是乳劑中的水相。在一些情況下，檢測(cè)靶標(biāo)或參照序列的存在進(jìn)一步包括將其與具有熒光標(biāo)記的核酸原位雜交。在一些情況下，反應(yīng)樣品的數(shù)目至少為約10，000個(gè)。在一些情況下，用針對(duì)不同靶標(biāo)序列的引物組重復(fù)步驟b)_e)。在一些情況下，反應(yīng)體積包含多于一個(gè)引物組，其中每個(gè)引物組針對(duì)特定靶標(biāo)序列。在一些情況下，反應(yīng)體積包含多于一個(gè)參照引物組，其中每個(gè)引物組針對(duì)特定參照序列?？梢允褂玫囊锝M的例子包括特異性針對(duì)人染色體21、人染色體18、人染色體13或人染色體X的引物組。在一些情況下，當(dāng)檢測(cè)到的靶標(biāo)序列與參照序列的比例大于I時(shí)，檢測(cè)到非整倍性。在一些情況下，當(dāng)檢測(cè)到的靶標(biāo)序列與參照序列的比例小于I時(shí)，檢測(cè)到非整倍性。在一些情況下，靶標(biāo)序列是CFTR、因子VIII(F8基因)、β珠蛋白、血色素沉著、G6PD、多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤、GAPDH、β淀粉樣蛋白或丙酮酸激酶基因的至少一部分。援引并入本說明書中提到的所有出版物和專利申請(qǐng)都在此處被完整地援引并入，其程度等同于每個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)被特定并單獨(dú)地援引并入。在隨附的權(quán)利要求中詳細(xì)闡述了本發(fā)明的新特征。通過參考描述說明性實(shí)施方案(其中采用了本發(fā)明的原理)的下列詳述和附圖可以更好地理解本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)，其附圖如下圖I概括示意圖是說明通過使用小滴數(shù)字PCR和連接探針檢測(cè)患者樣品中的拷貝數(shù)變異而可以采取的步驟。圖2示意圖是可以用來(lái)檢測(cè)樣品中染色體(或其部分)數(shù)變化的步驟的一個(gè)示例。圖3流程圖示出了用于診斷胎兒非整倍性的示例性方法。圖4不意圖是使用分子倒直探針(MIP)檢測(cè)兩種遺傳革巴標(biāo)。圖5示出了將MIP方法多重化以增強(qiáng)遺傳靶標(biāo)檢測(cè)的靈敏度。圖6示出了無(wú)需切割，使用通用引物和通用探針檢測(cè)小滴中的核酸的雙色系統(tǒng)。圖7示出了使用連接檢測(cè)反應(yīng)(LDR)及隨后在小滴中進(jìn)行的PCR，用兩種顏色檢測(cè)兩種遺傳靶標(biāo)的方案。圖8示出了使用多重化的寡核苷酸在小滴中進(jìn)行的LDR-PCR以增強(qiáng)檢測(cè)的靈敏度。圖9示出了用于顯示、存儲(chǔ)、檢索或計(jì)算通過此處所述的方法和組合物獲得的數(shù)據(jù)或結(jié)果的計(jì)算機(jī)。圖10示出了模板DNA的輸入拷貝數(shù)與陽(yáng)性小滴數(shù)(或計(jì)數(shù))之間的相關(guān)性，以及對(duì)于測(cè)試樣品，當(dāng)使用12-重MIP(下圖)時(shí)相比3-重MIP(上圖)增強(qiáng)的靈敏度。圖11示出了對(duì)于參照樣品，陽(yáng)性小滴數(shù)(或計(jì)數(shù))相對(duì)于模板拷貝數(shù)。圖12示出了對(duì)于不同模板拷貝數(shù)和不同水平的MIP多重化的雜交效率。圖13示出了針對(duì)染色體I內(nèi)不同區(qū)域的24條MIP(SEQIDN0:l_24)。圖14示出了針對(duì)染色體21內(nèi)不同區(qū)域的24條MIP(SEQIDNO:25-48)。圖15示出了針對(duì)染色體I內(nèi)不同區(qū)域的3-重MIP組(SEQIDNO:49_51)和針對(duì)染色體I內(nèi)不同區(qū)域的12-重MIP組(SEQIDNO:52-63)。圖16示出了針對(duì)染色體21內(nèi)不同區(qū)域的3-重MIP組(SEQIDNO64-66)和針對(duì)染色體21內(nèi)不同區(qū)域的12-重MIP組(SEQIDNO:67-78)。圖17示出了用于MIP檢測(cè)的示例性通用引物和探針(SEQIDNO:79_82)。發(fā)明詳述總體概述本公開文本提供了用于檢測(cè)生物樣品中遺傳變異的方法和組合物。在一些情況下，本公開文本提供了用于檢測(cè)生物樣品內(nèi)靶標(biāo)多核苷酸(例如，染色體、染色體片段、基因等)的拷貝數(shù)的方法和組合物。在一些情況下，也提供了用于檢測(cè)生物樣品內(nèi)遺傳突變和/或單核苷酸多態(tài)性(SNP)的方法和組合物。本公開文本還提供了用于檢測(cè)源自母體組織的生物樣品中胎兒非整倍性或其它遺傳異常的組合物和方法。這樣的生物樣品通常包括母親和胎兒核酸(例如DNA、RNA)的混合物。非整倍性是染色體異常，是指染色體或其片段或其部分的拷貝數(shù)異常。此處所述的方法和材料應(yīng)用一些技術(shù)，這些技術(shù)用于分析組織樣品如血液(全血或外周血)、血清或血漿中包含的大量核酸，這些組織樣品包含母親和胎兒DNA(和/或DNA片段)混合物，并且允許檢測(cè)可指示胎兒非整倍性的靶標(biāo)和參照DNA水平間的微小差別。此處所用的拷貝數(shù)變異(CNV)是指遺傳物質(zhì)的區(qū)段的獲得或丟失。在人類中有大量的CNV區(qū)域，在一般群體間有廣泛的遺傳多樣性。CNV在許多人類遺傳病中也起作用。該方法尤其可用于檢測(cè)易位、增加、擴(kuò)增、顛換、反轉(zhuǎn)、非整倍性、多倍性、單體性、三體性、21三體、13三體、14三體、15三體、16三體、18三體、22三體、三倍性、四倍性以及包括但不限于X0、XXY、XYY和XXX的性染色體異常。本方法也提供了用于確定胎兒DNA的序列以及鑒定胎兒DNA內(nèi)的突變的非侵入性技術(shù)。本公開文本提供了用于檢測(cè)CNV、遺傳變異和/或胎兒非整倍性的手段，例如通過使用數(shù)字PCR(例如，小滴數(shù)字PCR)以及專門化的探針，在此處通常稱為連接探針(例如，分子倒置探針和其它探針)，當(dāng)與靶標(biāo)多核苷酸雜交時(shí)能夠直接或間接地連接在一起。在此處提供的方法中，包含靶標(biāo)核苷酸的樣品或針對(duì)所述靶標(biāo)核苷酸的探針被分配到多個(gè)分區(qū)(例如，小滴)中。然后在分區(qū)(例如，小滴)進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)以促進(jìn)包含靶標(biāo)核苷酸或針對(duì)所述靶標(biāo)核苷酸的探針的分區(qū)中的PCR反應(yīng)，從而產(chǎn)生擴(kuò)增的產(chǎn)物(例如，擴(kuò)增的DNA、RNA或其它核酸)。在一些實(shí)施方案中，單個(gè)探針在與靶標(biāo)多核苷酸雜交后在其末端連接(例如，分子倒置探針)。在其它實(shí)施方案中，連接探針包括在與靶標(biāo)多核苷酸雜交后可以連接在一起的兩個(gè)分開的分子。此處所述的組合物包括含有兩種或更多的不混溶流體如油和水的混合物且包含一種類型的核酸探針(例如，分子倒置探針，連接探針等)的組合物。在其它情況下，此處所述的組合物包括包含一種類型的核酸探針(例如，分子倒置探針，連接探針等)的微膠囊。這樣的微膠囊可能抵抗合并，尤其在高溫時(shí)，因此使擴(kuò)增反應(yīng)能夠以非常高密度(例如，每個(gè)單位體積的反應(yīng)數(shù))進(jìn)行。圖I提供一個(gè)概括示意圖，示出了為通過使用小滴數(shù)字PCR(ddPCR)和連接探針檢測(cè)患者樣品中的拷貝數(shù)變異而可以采取的步驟。從由患者獲得的樣品(101)提取基因組核酸(例如，基因組DNA或RNA)的樣品(101)。使探針(如此處所述的連接探針)與患者樣品中的靶標(biāo)核苷酸序列雜交(103);雜交后，探針連接在一起(104)，然后樣品任選地進(jìn)行酶處理(例如，核酸外切酶)以分解基因組核酸和剩余的未連接的探針(105)。然后將PCR反應(yīng)組分(例如，引物、熒光檢測(cè)探針、聚合酶、dNTP等)加入樣品(106)，然后其被分配到多個(gè)小滴中(107)。形成小滴后，小滴進(jìn)行熱循環(huán)以擴(kuò)增樣品中的探針(108)。然后確定陽(yáng)性和陰性小滴的數(shù)目(109)，其被用于確定靶標(biāo)多核苷酸的相對(duì)拷貝數(shù)。盡管圖I描繪了小滴作為分配手段，但是也可以使用本領(lǐng)域已知的其它分配手段，例如在納米或微流體裝置內(nèi)的孔間分配等。并且，盡管圖I描繪了檢測(cè)拷貝數(shù)變異，但是也可以檢測(cè)其它遺傳狀況。樣品內(nèi)拷貝數(shù)的檢測(cè)可能涉及檢測(cè)染色體異常，包括非整倍性。圖2的概括示意圖是為了鑒定母體樣品中的胎兒非整倍性而可以采取的步驟。初始組織樣品(201)包含母親和胎兒DNA的混合物。提取DNA，與針對(duì)染色體I(202)(參照染色體)和染色體21(測(cè)試染色體)(203)的探針混合。探針與遺傳靶標(biāo)結(jié)合，然后分配到多個(gè)分區(qū)(204)。檢測(cè)分區(qū)中的探針，將包含測(cè)試染色體(例如，染色體21)的分區(qū)的數(shù)目與包含參照染色體(例如，染色體I)的分區(qū)的數(shù)目進(jìn)行比較(205)，隨后計(jì)算染色體21的相對(duì)拷貝數(shù)。本公開文本提供了針對(duì)遺傳狀況對(duì)母體組織(例如，血液、血清或血漿)進(jìn)行分析，其中分析母體組織中混合的胎兒和母體DNA以便將胎兒突變或遺傳異常與母體DNA的背景相區(qū)分。利用步驟的組合，可以分析含有母親和胎兒DNA(或RNA)的DNA樣品，以測(cè)定無(wú)細(xì)胞的在外周循環(huán)的DNA序列的相對(duì)濃度?？梢允褂眠@種濃度差異來(lái)區(qū)分在代表胎兒DNA的較小部分DNA中存在的遺傳狀況。該方法可采用數(shù)字分析，其中樣品中的DNA被翻譯為多個(gè)連接的探針，這些探針被分配成反應(yīng)體積中名義上的單個(gè)的連接探針分子，以生成樣品混合物。例如，反應(yīng)體積可以是小滴，如在不混溶的液體中分散的水相小滴，如美國(guó)專利號(hào)7，041，481(其在此處被完整地援引并入)中所述的。每個(gè)反應(yīng)體積都可能在其內(nèi)只分布有不到一個(gè)靶標(biāo)(例如，靶標(biāo)多核苷酸、靶向探針或其它靶標(biāo)分子)或一個(gè)或多個(gè)靶標(biāo)(例如，靶標(biāo)多核苷酸、靶向探針或其它靶向分子)?？梢詸z測(cè)每個(gè)反應(yīng)體積中的靶標(biāo)分子，優(yōu)選地作為被擴(kuò)增的靶標(biāo)序列來(lái)檢測(cè)，所述檢測(cè)可以包括對(duì)靶標(biāo)序列的起始拷貝數(shù)進(jìn)行量化(或定量)，即0、1、2、3個(gè)拷貝等?？梢允褂脜⒄招蛄袇^(qū)分靶標(biāo)序列中的異常增加，例如三體性。因此，可以相對(duì)于參照序列對(duì)靶標(biāo)序列進(jìn)行差異檢測(cè)，該差異檢測(cè)結(jié)果指示存在胎兒非整倍性。參照序列不一定是母體序列。此外，該方法也可采用范圍廣泛的方法以直接或間接地捕獲并檢測(cè)胎兒遺傳物質(zhì)。此處所述的一種方法包括以下的組合使用分子倒置探針(MIP)(或其它寡核苷酸探針)而不是一對(duì)引物來(lái)結(jié)合基因組DNA，隨后的步驟包括將MIP探針與靶標(biāo)多核苷酸內(nèi)的互補(bǔ)序列結(jié)合的雜交步驟，使結(jié)合的探針環(huán)化的連接反應(yīng)步驟，消化剩余的非環(huán)化MIP探針的核酸外切酶處理步驟，任選的處理步驟，其中使用酶如尿嘧啶-N-糖基化酶將環(huán)化的探針線性化；分配步驟，其中環(huán)化的探針或線性化的探針(其先前為環(huán)狀的)被分配或細(xì)分到兩個(gè)或更多的分區(qū)(例如，小滴)中；隨后的擴(kuò)增步驟涉及通過小滴數(shù)字PCR擴(kuò)增寡核苷酸探針獨(dú)特的序列。在一些情況下，此處使用多重化MIP(或其它寡核苷酸)以改進(jìn)檢測(cè)的靈敏度。例如，可以使用一組兩個(gè)或更多的MIP，其中這些MIP中的每一個(gè)與相同染色體(例如染色體21)上的不同序列結(jié)合。在一些情況下，識(shí)別例如靶標(biāo)和參照序列的多個(gè)MIP可以在擴(kuò)增期間用不同顏色的熒光團(tuán)進(jìn)行差異檢測(cè)。在一些情況下，單個(gè)線性探針與基因組DNA結(jié)合，隨后的連接反應(yīng)產(chǎn)生環(huán)狀的分子。在其它情況下，兩條線性探針結(jié)合基因組DNA的相鄰區(qū)域，隨后的連接反應(yīng)產(chǎn)生可以在連接檢測(cè)反應(yīng)(LDR)中被檢測(cè)到的連接依賴性分子。此處所用的術(shù)語(yǔ)連接是指兩個(gè)或更多的核酸例如寡核苷酸和/或多核苷酸之間的共價(jià)鍵或連接。通常，連接可包括多核苷酸(例如連接探針)的5’末端與另一多核苷酸(例如連接探針)的3’末端或與同一多核苷酸連接。鍵或連接的性質(zhì)可能變化很大，連接可以酶學(xué)或化學(xué)地進(jìn)行。通常酶學(xué)進(jìn)行連接以在一個(gè)寡核苷酸的末端核苷酸的5'碳與另一寡核苷酸的3'碳之間形成磷酸二酯鍵。許多結(jié)合驅(qū)動(dòng)的連接反應(yīng)在下列參考文獻(xiàn)中描述Whitely等，美國(guó)專利號(hào)4,883,750；Letsinger等，美國(guó)專利號(hào)5,476,930；Fung等，美國(guó)專利號(hào)5，593,826;Kool，美國(guó)專利號(hào)5,426，180。本公開文本提供了用于去除不期望的物質(zhì)(包括未結(jié)合的基因組DNA和未連接的探針)以及選擇或分離期望的物質(zhì)(包括連接產(chǎn)物)的方法和組合物。在連接產(chǎn)物為環(huán)狀的一些情況下，如在及MIP的反應(yīng)中，利用核酸外切酶處理去除未結(jié)合的基因組DNA和未連接的探針。在一些情況下，然后利用將探針中的尿嘧啶殘基脫嘌呤的酶，如尿嘧啶-N-糖基化酶處理，釋放環(huán)狀的連接產(chǎn)物。在這些情況下，加熱后切割無(wú)堿基位點(diǎn)，產(chǎn)生線性化的連接產(chǎn)物?？梢杂迷S多方法進(jìn)行檢測(cè)。在一些情況下，用小滴數(shù)字PCR反應(yīng)檢測(cè)連接產(chǎn)物，其中通過延伸在單個(gè)分子中包含熒光劑-猝滅劑對(duì)的至少一條檢測(cè)探針來(lái)合成DNA。熒光劑是指在吸收光或其它電磁輻射后發(fā)射可檢測(cè)光的分子(例如，熒光團(tuán))。猝滅劑是指降低物質(zhì)熒光強(qiáng)度的分子，在熒光劑-猝滅劑對(duì)的情況下，猝滅劑可通過吸收共價(jià)連接的熒光劑所發(fā)射的可檢測(cè)光而降低對(duì)熒光劑的檢測(cè)。在DNA合成過程中，聚合酶如Taq聚合酶的5’一3’核酸外切酶活性切割檢測(cè)探針，導(dǎo)致熒光劑從猝滅劑釋放。許多熒光檢測(cè)方法可以檢測(cè)到釋放的熒光劑，但不能檢測(cè)到熒光劑-猝滅劑對(duì)。在一些實(shí)施方案中，對(duì)連接產(chǎn)物的檢測(cè)提供了對(duì)存在的特定序列(如胎兒或母親遺傳物質(zhì)中的目標(biāo)或參照序列)的定量測(cè)定。本公開文本可進(jìn)一步提供用于檢測(cè)感興趣的核酸分子的組合物和方法，其中樣品可包含用小滴數(shù)字PCR檢測(cè)的來(lái)自任何生物的DNA、RNA或cDNA。在一些情況下，用連接反應(yīng)分離樣品，在一些情況下，其后用核酸外切酶處理以去除不想要的物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，通過對(duì)小滴數(shù)字PCR的熒光監(jiān)測(cè)進(jìn)行檢測(cè)，其中小滴包括懸浮于乳劑中的水相內(nèi)的PCR試劑以及可用PCR反應(yīng)檢測(cè)到的一種或多種連接產(chǎn)物。組織的獲得與制備本公開文本的方法和組合物提供了獲得胎兒或母體遺傳物質(zhì)的手段。所述方法和組合物提供了在不需要侵入性外科手術(shù)操作、羊膜穿刺術(shù)、絨毛膜絨毛采樣等的情況下，檢測(cè)靶標(biāo)多核苷酸的拷貝數(shù)差異。在其它情況下，所述方法和組合物提供了對(duì)樣品(例如血液樣品)中靶標(biāo)多核苷酸的拷貝數(shù)差異的檢測(cè)，其被用作隊(duì)更具侵入性的檢驗(yàn)如外科手術(shù)操作的添加、補(bǔ)充、預(yù)備步驟或輔助。通常，通過抽血或此處提供的其它方法獲得胎兒/母體遺傳物質(zhì)。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，起始材料是母體血漿或外周血如母體外周靜脈血。可針對(duì)特定細(xì)胞類型(例如，單核細(xì)胞；紅細(xì)胞；CD4+細(xì)胞；CD8+細(xì)胞；B細(xì)胞；T細(xì)胞；ΝΚ細(xì)胞等)對(duì)外周血細(xì)胞進(jìn)行富集。也可選擇性排除外周血細(xì)胞中的特定細(xì)胞類型(例如，單核細(xì)胞；紅細(xì)胞；CD4+細(xì)胞；CD8+細(xì)胞；B細(xì)胞；T細(xì)胞；ΝΚ細(xì)胞等)。起始材料也可以是骨髓來(lái)源的單核細(xì)胞。起始材料也可包括直接從胎盤(例如，胎盤細(xì)胞)或臍帶(例如，臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞、臍帶血細(xì)胞)提取的組織。起始材料也可直接源自成形的胎兒，例如胎兒組織，例如，胎兒成纖維細(xì)胞或血細(xì)胞。起始材料也可來(lái)自嬰兒或兒童，包括新生兒組織。在一些情況下，起始材料可能從醫(yī)院、實(shí)驗(yàn)室、臨床或醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室獲得。在一些實(shí)施方案中，從懷孕至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26周的個(gè)體(例如，孕婦)采集樣品。在一些實(shí)施方案中，個(gè)體受遺傳疾病影響、是遺傳疾病的攜帶者或有發(fā)生或傳遞遺傳疾病的風(fēng)險(xiǎn)，其中遺傳疾病是可能與遺傳變異如突變、插入、添加、刪除、易位、點(diǎn)突變、三核苷酸重復(fù)疾病和/或單核苷酸多態(tài)性(SNP)相關(guān)的任何疾病。在其它實(shí)施方案中，樣品取自育齡的女性患者，在一些情況下，女性患者未懷孕或未知懷孕狀態(tài)。在其它情況下，個(gè)體是男性患者、男性準(zhǔn)父親或有特定遺傳異常風(fēng)險(xiǎn)、被診斷為或具有特定遺傳異常的男性患者。在一些情況下，已知男性患者受遺傳疾病或遺傳變異的影響或是其攜帶者，或者有特定遺傳異常的風(fēng)險(xiǎn)、被診斷為或具有特定遺傳異常。在一些情況下，女性患者在遺傳疾病或遺傳變異方面的狀態(tài)可能未知。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，樣品取自任何已知或未知其遺傳序列拷貝數(shù)變異狀態(tài)的兒童或成年患者。在一些情況下，已知兒童或成年患者受遺傳疾病或遺傳變異的影響或是其攜帶者。此處提供的方法和組合物的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于它們可以支持在懷孕相對(duì)早期和母體血漿中胎兒核酸(例如，DNA、RNA)的總濃度較低的時(shí)候檢測(cè)胎兒核酸(例如，DNA、RNA)。起始材料中的胎兒DNA濃度可能是母體樣品中總的母體基因組DNA載量的至少O.I%、O.2%,0.5%,1%>1.5%,2%,2.5%,3%,3.5%,4%,4.5%,5%,5.5%,6%,6.5%,7%,7.5%,8%,8.5%,9%,9.5%U0%U0.5%U1%>11.5%U2%U2.5%U3%,13.514%U4.5%,15%,15.5%,16%,16.5%,17%,17.5%,18%,18.5%,19%,19.5%,20%,20.5%、21%、21·5%、22%、22·5%、23%、23·5%、24%、24·5%或25%，優(yōu)選為總的母體基因組DNA載量的至少3%。在一些情況下，胎兒DNA濃度可能低于母體樣品中總的母體基因組DNA載量的約O.1%,0.2%,0.5%,1%>1.5%,2%,2.5%,3%,3.5%,4%,4.5%,5%,5.5%,6%,6.5%,7%,7.5%,8%,8.5%,9%,9.5%U0%U0.5%U1%>11.512%,12.5%,13%,13.5%,14%,14.5%,15%,15.5%,16%,16.5%,17%,17.5%,18%,18.5%Λ9%Λ9.5%,20%,20.5%,21%,21.5%,22%,22.5%,23%,23.5%,2424.5%或25%。在起始材料包含以一種量(H)存在的一種類型多核苷酸(例如，DNA、RNA)以及以低于H的量(L)存在的一種類型的多核苷酸(例如，DNA、RNA等)的情況下，起始材料中L的濃度可能至少為樣品中H的總濃度的O.1%、0.2%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%,3%,3.5%,4%,4.5%,5%,5.5%,6%,6.5%,7%,7.5%,8%,8.5%,9%,9.5%,10%,10.5%,11%>11.5%,12%,12.5%,13%,13.5%,14%,14.5%,15%,15.5%,16%,16.5%,17%,17.5%,18%,18.5%,19%,19.5%,20%,20.5%,21%,21.5%,2222.5%,23%,23.5%,24%,24.5%或25%，優(yōu)選為H的至少3%。在一些情況下，L可能低于樣品中H的總量的約O.1%,0.2%,0.5%,1%>1.5%,2%,2.5%,3%,3.5%,4%,4.5%,5%,5.5%,6%,6.5%,7%,7.5%,8%,8.5%,9%,9.5%U0%U0.5%U1%>11.512%、12.5%、13%、13.5%、14%、14.5%,15%,15.5%,16%,16.5%,17%,17.5%,18%,18.5%U9%U9.5%,20%,20.5%,21%,21.5%,22%,22.5%,23%,23.5%,2424.5%或25%。在一些情況下，為了獲得用于測(cè)試的足夠核酸，采集至少為1、2、3、4、5、10、20、25、30、35、40、45或50mL的血液體積。這種血液體積可以提供至少1，000基因組當(dāng)量(GE)的總DNA。在懷孕早期，總DNA以大概1，000GE/mL母體血漿存在，胎兒DNA濃度約為總的血漿DNA的約3.5%。然而，可以采集更少的血液用于需要較低統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的基因篩選，或者針對(duì)胎兒DNA而富集DNA樣品。胎兒DNA濃度也可能根據(jù)胎兒的孕齡而變化。在一些實(shí)施方案中，可通過分離紅細(xì)胞，尤其是下面所述的胎兒有核紅細(xì)胞(其不同于無(wú)核成年紅細(xì)胞)而富集胎兒DNA或RNA。在其它實(shí)施方案中，可從母體血液樣品去除紅細(xì)胞，并且可從母體血漿獲得遺傳物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，起始材料可以是包含實(shí)體組織的組織樣品，非限制性的例子包括腦、肝、肺、腎、前列腺、卵巢、脾臟、淋巴結(jié)(包括扁桃體)、甲狀腺、胰腺、心臟、骨骼肌、腸、喉、食道和胃。在其它實(shí)施方案中，起始材料可以是包含核酸的細(xì)胞，包括結(jié)締組織、肌肉組織、神經(jīng)組織和上皮細(xì)胞，尤其是暴露的上皮細(xì)胞如皮膚細(xì)胞和毛發(fā)細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，起始材料可以是來(lái)自任何生物的包含核酸的樣品，可以從其中獲得遺傳物質(zhì)并用此處所述的小滴數(shù)字PCR檢測(cè)。胎兒物質(zhì)的富集胎兒細(xì)胞可以從包含胎兒和母體細(xì)胞的混合物的母體樣品中富集。在其中胎兒濃度是總母體基因組DNA(或RNA)載量的至少O.1%,0.2%,0.5%U%>1.5%,2%,2.5%,3%,3.5%,4%,4.5%,5%,5.5%,6%,6.5%,7%,7.5%,8%,8.5%,9%,9.5%,10%,10.5%,11%>11.5%,12%,12.5%,13%,13.5%,14%,14.5%,15%,15.5%,16%,16.5%,17%,17.5%,18%,18.5%,19%,19.5%,20%,20.5%,21%,21.5%,2222.5%、23%、23.5%、24%、24.5%或25%的一些情況下，這種富集可能發(fā)生。在其中胎兒濃度超過總母體基因組DNA(或RNA)載量的O.1%、0.2%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%,3%,3.5%,4%,4.5%,5%,5.5%,6%,6.5%,7%,7.5%,8%,8.5%,9%,9.5%,10%,10.5%,11%>11.5%,12%,12.5%,13%,13.5%,14%,14.5%,15%,15.5%,16%,16.5%,17%,17.5%,18%,18.5%,19%,19.5%,20%,20.5%,21%,21.5%,2222.5%、23%、23·5%、24%、24·5%或25%的一些情況下，這種富集可能發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，通過親和方法富集胎兒細(xì)胞，該方法可包括在偶聯(lián)有對(duì)胎兒細(xì)胞比對(duì)非胎兒細(xì)胞具有更大親和力的分子如胎兒特異性抗體的固體結(jié)構(gòu)上收集胎兒細(xì)胞。固體結(jié)構(gòu)的非限制性例子包括聚合物表面、磁性微珠、聚合物微珠和微流體通道的表面。在一些實(shí)施方案中，在此處所述的方法或組合物之前或作為其部分，不針對(duì)胎兒細(xì)胞富集生物樣品。在一些實(shí)施方案中，不通過親和方法富集胎兒細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，不通過使用胎兒特異性抗體富集胎兒細(xì)胞。在一些情況中，不通過將樣品加入微流體裝置中富集胎兒細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)也可以用于富集胎兒細(xì)胞(Herzenberg等，PNAS761453-1455(1979);Bianchi等，PNAS87:3279-3283(1990);Bruch等，PrenatalDiagnosis11:787-798(1991))。美國(guó)專利No.5，432，054也描述了使用由聚乙烯制成的具有寬頂部和狹窄毛細(xì)管底部的管來(lái)分離胎兒有核紅細(xì)胞的技術(shù)。在一些情況下，不使用流式細(xì)胞術(shù)富集用于本發(fā)明的方法或組合物分析的樣品中的胎兒細(xì)胞。使用可變速度程序的離心基于分子的密度導(dǎo)致紅細(xì)胞在毛細(xì)管中堆疊。回收包含低密度紅細(xì)胞(包括胎兒紅細(xì)胞)的密度部分，然后差異化溶血以優(yōu)先破壞母體紅細(xì)胞。用高滲介質(zhì)中的密度梯度分離紅細(xì)胞，此時(shí)相對(duì)于淋巴細(xì)胞和破裂的母體細(xì)胞富含胎兒紅細(xì)胞。使用高滲溶液縮小紅細(xì)胞，增加它們的密度，并且有助于從更高密度的淋巴細(xì)胞進(jìn)行純化。在分離胎兒細(xì)胞后，可使用此處詳述的本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化胎兒DNA。在一些實(shí)施方案中，可以處理母體血液以富集總DNA中的胎兒DNA濃度，如Li等，(2005)J.Amer.Med.Assoc.293:843-849中所述。簡(jiǎn)言之，可以用商售柱技術(shù)(例如，Roche高純模板DNA純化試劑盒；R0Che)結(jié)合真空泵從5-10mL母體血漿中提取循環(huán)DNA。提取后，可以通過瓊脂糖凝膠(1%)電泳(InvitiOgen)分離DNA，可以小心切出包含大小約為300個(gè)核苷酸的循環(huán)DNA的凝膠部分?？梢杂锰崛≡噭┖?QIAEXIIGelExtractionKit；Qiagen)從這個(gè)凝膠片中提取DNA，并洗脫至最終體積為40-μL的無(wú)菌10-mMTRIS-鹽酸，pH8.O(Roche)中。在一些實(shí)施方案中，從包含全細(xì)胞的母體血液樣品中分離游離的胎兒DNA。在優(yōu)選實(shí)施方案中，從母體血漿樣品中分離游離的胎兒DNA。在一些實(shí)施方案中，血漿樣品至少50^^75%或95%不含胎兒細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，血漿完全不含胎兒細(xì)胞。于2004年7月15日公開的、名為"Methodsfordetectionofgeneticdisorders"的、Dhallan,RavinderS的美國(guó)專利申請(qǐng)20040137470描述了胎兒DNA的富集程序，其中血液被收集至9mlEDTAVacuette管(貨號(hào)NC9897284)，向每個(gè)管中加入0.225ml包含甲醛(4%w/v)的10%中性緩沖溶液，將每個(gè)管輕輕顛倒。將管儲(chǔ)存于4°C直至準(zhǔn)備用于處理?？梢韵蚬苤屑尤胱璧K細(xì)胞裂解或穩(wěn)定細(xì)胞膜的試劑，包括但不限于甲醛、甲醛的衍生物、福爾馬林、戊二醛、戊二醛衍生物、交聯(lián)劑、伯胺反應(yīng)性交聯(lián)劑、巰基反應(yīng)性交聯(lián)劑、巰基加成或二硫化物還原、碳水化合物反應(yīng)性交聯(lián)劑、羧基反應(yīng)性交聯(lián)劑、光反應(yīng)性交聯(lián)劑、可分解交聯(lián)劑等。可以加入任意濃度的穩(wěn)定細(xì)胞膜或阻礙細(xì)胞裂解的試劑。在優(yōu)選實(shí)施方案中，以不妨礙或阻礙后續(xù)反應(yīng)的濃度加入穩(wěn)定細(xì)胞膜或阻礙細(xì)胞裂解的試劑。在另一實(shí)施方案中，用顯著降低樣品中母體DNA量的技術(shù)和/或方案分離DNA，包括但不限于在將離心機(jī)的制動(dòng)力設(shè)置為O(離心機(jī)不使用制動(dòng))的情況下離心樣品，在最低程度地或不擾動(dòng)“血沉棕黃層”的情況下將上清液轉(zhuǎn)移至新的管中，以及將僅僅一部分上清液轉(zhuǎn)移至新的管中。在優(yōu)選實(shí)施方案中，離心機(jī)的加速力和制動(dòng)力都設(shè)置為O。在另一實(shí)施方案中，用顯著降低樣品中母體DNA的量的技術(shù)和/或方案分離DNA，包括但不限于在將離心機(jī)的加速力設(shè)置為O的情況下離心樣品，在最低程度地或不擾動(dòng)“血沉棕黃層”的情況下將上清液轉(zhuǎn)移至新的管中，以及將僅僅一部分上清液轉(zhuǎn)移至新的管中。在另一實(shí)施方案中，用任何適用的方法在取出上清液之前將“血沉棕黃層”從管中去除，包括但不限于使用注射器或針頭取出“血沉棕黃層”。在另一實(shí)施方案中，離心機(jī)的制動(dòng)力被設(shè)置為最大制動(dòng)力的一定的百分比，包括但不限于1-5%、5-10%、10-20%、20-30%、30-4040-50%、50-60%、60-70%、70-80%、80-90%、90-95%、95-99%。在另一實(shí)施方案中，離心機(jī)的加速力被設(shè)置為最大加速力的一定的百分比，包括但不限于1-5%、5-10%、10-20%、20-30%、30-40%、40-50%、50-60%、60-70%、70-80%、80-90%、90-95%、95-99%。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含游離胎兒DNA和游離母體DNA的組合物，其中該組合物包含的游離胎兒DNA和游離母體DNA的關(guān)系包括但不限于，至少約為15%的游離胎兒DNA、至少約為20%的游離胎兒DNA、至少約為30%的游離胎兒DNA、至少約為40%的游離胎兒DNA、至少約為50%的游離胎兒DNA、至少約為60%的游離胎兒DNA、至少約為70%的游離胎兒DNA、至少約為80%的游離胎兒DNA、至少約為90%的游離胎兒DNA、至少約為91%的游離胎兒DNA、至少約為92%的游離胎兒DNA、至少約為93%的游離胎兒DNA、至少約為94%的游離胎兒DNA、至少約為95%的游離胎兒DNA、至少約為96%的游離胎兒DNA、至少約為97%的游離胎兒DNA、至少約為98%的游離胎兒DNA、至少約為99%的游離胎兒DNA和至少約為99.5%的游離胎兒DNA。進(jìn)一步地，可以將穩(wěn)定細(xì)胞膜的試劑加入母體血液以減少母體細(xì)胞裂解，包括但不限于醛類、脲醛、苯酚甲醛、DMAE(二甲氨基乙醇)、膽固醇、膽固醇衍生物、高濃度的鎂、維生素E、維生素E衍生物、鈣、葡萄糖酸鈣、?；撬?、煙酸、羥胺衍生物、氯吡哌醇(bimoclomol)、鹿糖、奸青素、葡萄糖、阿米替林、藿燒四乙酸苯酯(hopanetetralphenylacetate)異構(gòu)體A、藿燒四乙酸苯酯異構(gòu)體B、胞磷膽堿、肌醇、維生素B、維生素B復(fù)合物、半琥珀酸膽固醇酯、山梨醇、鈣、輔酶Q、泛醌、維生素K、維生素K復(fù)合物、甲基萘醌、唑尼沙胺、鋅、銀杏提取物、二苯乙內(nèi)酰脲、perftoran、聚乙烯吡咯烷酮、磷脂酰絲氨酸、酰胺咪嗪、PABA、色甘酸二鈉、奈多羅米鈉、phenyloin、檸檬酸鋅、美西律、狄蘭汀、透明質(zhì)酸鈉或泊洛沙姆188。在另一實(shí)施方案中，可以使用保護(hù)或穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性的試劑以降低細(xì)胞裂解的量。在另一實(shí)施方案中，可以在獲得樣品之前使用降低母體血液中游離的母體DNA的量的任何方案。在另一實(shí)施方案中，在獲得樣品之前，懷孕的女性不進(jìn)行身體活動(dòng)，休息一段時(shí)間，包括但不限于0-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-120、120-180、180-240、240-300、300-360、360-420、420-480、480-540、540-600、600-660、660-720、720-780、780-840、840-900、900-1200、1200-1500、1500-1800、1800-2100、2100-2400、2400-2700、2700-3000、3000-3300、3000-3600、3600-3900,3900-4200,4200-4500以及超過4500分鐘。在另一實(shí)施方案中，在懷孕的女性機(jī)體達(dá)到放松狀態(tài)后，從其獲得樣品。在獲得樣品之前的休息期間可以降低樣品中母體核酸的量。在另一實(shí)施方案中，在上午(a.m.)從懷孕的女性獲得樣品，包括但不限于4-5am、5-6am、6-7am、7-8am、8-9am、9-10am、10-1Iam和11-12am。在另一實(shí)施方案中，在懷孕的女性已睡眠了包括但不限于0-1、1-2、2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10、10-11、11-12或超過12小時(shí)的一段時(shí)間之后從其獲得樣品。在另一實(shí)施方案中，在獲得樣品之前，懷孕的女性運(yùn)動(dòng)一段時(shí)間，隨后再休息一段時(shí)間。在另一實(shí)施方案中，運(yùn)動(dòng)的期間包括但不限于0-15、15-30、30-45、45-60、60-120、120-240或超過240分鐘。在另一實(shí)施方案中，可以向血液樣品中加入將防止DNA破壞的試劑，包括但不限于DNA酶抑制劑、氯化鋅、乙二胺四乙酸、鹽酸胍、異硫氰酸胍、N-月桂酰肌氨酸和十二烷基硫酸鈉。在另一實(shí)施方案中，從胎兒細(xì)胞獲得胎兒DNA，其中所述胎兒細(xì)胞可分離自包括但不限于母體血液、臍帶血、絨毛膜絨毛、羊水、胚胎組織和從母親的子宮頸或陰道獲得的粘膜等來(lái)源。在另一實(shí)施方案中，可以使用任何降低細(xì)胞裂解量的采血技術(shù)、方法、步驟或設(shè)備，包括但不限于大口徑針、長(zhǎng)度較短的針、增加層流的針涂層例如特氟龍、增加層流的針斜面的修改或降低血流速率的技術(shù)。胎兒細(xì)胞很可能在母體血液中被母體的免疫系統(tǒng)破壞。然而，很可能大部分的母體細(xì)胞裂解的發(fā)生是由于采血或血液樣品的處理。因此，防止或降低細(xì)胞裂解的方法將降低樣品中母體DNA的量，并且增加游離的胎兒DNA的相對(duì)百分比。使用這種試劑的方案的一個(gè)示例如下血液儲(chǔ)存于4°C直至處理。管在制動(dòng)力設(shè)置為O的離心機(jī)中以IOOOrpm離心10分鐘。管第二次以IOOOrpm離心10分鐘。將每份樣品的上清液(血漿)轉(zhuǎn)移至新的管中，在制動(dòng)力設(shè)置為O的情況下以3000rpm離心10分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移至新的管中并儲(chǔ)存于_80°C。將包含母體細(xì)胞的約2毫升的血沉棕黃層放入單獨(dú)的管中并儲(chǔ)存于_80°C。DNA或RNA的提取可以用本領(lǐng)域已知的技術(shù)從血漿(例如母體血漿)中分離基因組DNA，如使用從血細(xì)胞純化DNA的QiagenMidi試劑盒。DNA可以在100μI蒸餾水中洗脫。也使用QiagenMidi試劑盒從包含在血沉棕黃層中的母體細(xì)胞中分離DNA。QIAamp循環(huán)核酸試劑盒也可用于該目的，參見，例如http:"www.qiagen.com/products/qiaampcirculatingnucleicacidkit.aspx。提取多核苷酸(例如，DNA)的方法也可包括使用液體提取(例如，Trizol、DNAzol)技術(shù)。例如，起始樣品(例如血液或血漿)可具有15_30ml的起始體積，從其中可提取約100-200ulDNA或其它多核苷酸。然后可將被提取樣品的200ulDNA轉(zhuǎn)化(或濃縮)為更小體積的最終樣品，例如5ul、10ul。在一些情況下，起始樣品的體積可能聞?dòng)谧罱K樣品體積的2、5、10、20、30、40、50、75、100、500、1000、5000、10，000、50，000、100，000、500，000或1，000,000倍。最終樣品也可以是被加入用于生成小滴的裝置中的樣品。最終樣品的體積可以是l_20ul。在一些實(shí)施方案中，最終樣品超過1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75或lOOul。在一些實(shí)施方案中，最終樣品少于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75或lOOul。在一些實(shí)施方案中，最終樣品超過1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75或lOOnl。在一些實(shí)施方案中，最終樣品少于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50,75或IOOnl0在一些實(shí)施方案中，最終樣品超過1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75或IOOpl0在一些實(shí)施方案中，最終樣品少于1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75或IOOpl。在一些實(shí)施方案中，DNA可以通過已知的方法濃縮，包括離心和使用各種酶抑制劑(例如，針對(duì)DNase)。DNA可以結(jié)合于選擇性膜(例如二氧化硅)而將其與污染物分離。也可以針對(duì)在血漿中循環(huán)的長(zhǎng)度小于1000、500、400、300、200或100個(gè)堿基對(duì)的片段富集DNA。這種大小選擇可以在DNA大小分離介質(zhì)上進(jìn)行,如電泳凝膠或色譜材料(Huber等.(1993)NucleicAcidsRes.21:1061-6)、凝膠過濾色譜、TSK凝膠(Kato等.(1984)J.Biochem,9583-86)。在一些情況下，多核苷酸(例如，DNA、RNA)可能被選擇性沉淀、濃縮(例如，樣品可以經(jīng)歷蒸發(fā))或使用固相介質(zhì)選擇性捕獲。沉淀后，DNA或其它多核苷酸可被重構(gòu)或溶解于小體積中。小體積可支持探針與靶標(biāo)多核苷酸的雜交，或改善探針與靶標(biāo)多核苷酸的雜父。在一些實(shí)施方案中，起始材料可包含細(xì)胞或組織，包括結(jié)締組織、肌肉組織、神經(jīng)組織、血細(xì)胞或上皮細(xì)胞。在一些情況下，可以用酶處理(如蛋白酶消化)將非核酸物質(zhì)從起始材料中去除。在一些情況下，可以通過用破壞膜的去污劑和/或裂解方法(例如，超聲處理、弗氏壓碎法(Frenchpress)、凍/融、dounce勻衆(zhòng))處理而去除其它非核酸物質(zhì)，隨后可離心以便將包含核酸的部分與不含核酸的部分分離。采用本領(lǐng)域完善建立的方案，提取的核酸可以來(lái)自任何合適的樣品，包括但不限于包含核酸的組織樣品、體液(例如，血液、血清、血漿、唾液、尿液、眼淚、腹膜液、腹水、陰道分泌物、乳腺液、乳汁、淋巴液、腦脊液或黏膜分泌物)、臍帶血、絨毛膜絨毛、羊水、胚胎、兩個(gè)細(xì)胞的胚胎、四個(gè)細(xì)胞的胚胎、八個(gè)細(xì)胞的胚胎、16個(gè)細(xì)胞的胚胎、32個(gè)細(xì)胞的胚胎、64個(gè)細(xì)胞的胚胎、128個(gè)細(xì)胞的胚胎、256個(gè)細(xì)胞的胚胎、512個(gè)細(xì)胞的胚胎、1024個(gè)細(xì)胞的胚胎、胚胎組織、淋巴液、腦脊液、黏膜分泌物或其他身體分泌物、排泄物、單個(gè)細(xì)胞，或包含它們的核酸的這些來(lái)源的提取物，和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)如線粒體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以將血液收集到包含包括但不限于EDTA的鎂螯合劑的裝置中并儲(chǔ)存于4°C。任選地，可以加入鈣螯合劑，包括但不限于EGTA。在另一實(shí)施方案中，可以向母體血液加入細(xì)胞裂解抑制劑，包括但不限于甲醛、甲醛衍生物、福爾馬林、戊二醛、戊二醛衍生物、蛋白質(zhì)交聯(lián)劑、核酸交聯(lián)劑、蛋白質(zhì)和核酸交聯(lián)劑、伯胺反應(yīng)性交聯(lián)劑、巰基反應(yīng)性交聯(lián)劑、巰基加成或二硫鍵還原、碳水化合物反應(yīng)性交聯(lián)劑、羧基反應(yīng)性交聯(lián)劑、光反應(yīng)性交聯(lián)劑、可裂解交聯(lián)劑。血衆(zhòng)RNA提取在Enders等·(2003),ClinicalChemistry49:727-731中描述。簡(jiǎn)言之，在離心步驟后收獲的血衆(zhòng)可與TrizolLS試劑(Invitrogen)和氯仿混合?？呻x心混合物，并將水層轉(zhuǎn)移至新的管中。將乙醇加至水層。然后根據(jù)廠商推薦將混合物加于RNeasy微型柱(Qiagen)并處理。在一些情況下，當(dāng)提取的物質(zhì)包含單鏈RNA、雙鏈RNA或DNA-RNA雜合物時(shí)，可用本領(lǐng)域已知的技術(shù)將這些分子轉(zhuǎn)化為雙鏈DNA。例如，可能采用逆轉(zhuǎn)錄酶從RNA分子合成DNA。在一些情況下，RNA向DNA的轉(zhuǎn)化可能需要預(yù)先的連接步驟以將連接體片段連接至RNA，從而允許使用通用引物起始逆轉(zhuǎn)錄。在其它情況下，例如可使用mRNA分子的多聚A尾來(lái)起始逆轉(zhuǎn)錄。在一些情況下，在轉(zhuǎn)化為DNA后，可能使用此處詳述的方法進(jìn)一步捕獲、選擇、標(biāo)記或分離期望的序列。盡管本說明書始終提到胎兒DNA，但也可以分析在母體血液中發(fā)現(xiàn)的胎兒RNA(以及通常的RNA)。如前面所述，"mRNAofplacentaloriginisreadilydetectableinmaternalplasma,"(Ng等·(2003)Proc.Nat.Acad.Sci.100:4748-4753),當(dāng)用各自的實(shí)時(shí)PCR試驗(yàn)分析時(shí)，在母體血漿中檢測(cè)到了hPL(人胎盤催乳素)和hCG(人絨毛膜促性腺激素)mRNA轉(zhuǎn)錄本。在本方法中，可以使用在胎盤中表達(dá)并存在于感興趣的染色體上的mRNA編碼基因。例如，DSCR4(唐氏綜合征關(guān)鍵區(qū)域4)在染色體21上發(fā)現(xiàn)并且主要在胎盤中表達(dá)。其mRNA序列可見于GenBankNM_005867。在這種情況下,優(yōu)選使用RNaseHminus(RNaseaO逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)來(lái)制備用于檢測(cè)的cDNA。RNaseHlT可以從數(shù)個(gè)廠商獲得，如SuperScript(TM)II(Invitrogen)。逆轉(zhuǎn)錄酶PCR可以如此處針對(duì)染色體DNA所述使用。RNA可包括siRNA、miRNA,cRNA、tRNA、rRNA、mRNA或任何其它類型的RNA。連接探針在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，通過使用一條或更多條連接探針(在此有時(shí)也被稱為“可連接的探針”)標(biāo)記、選擇、捕獲、分離和/或處理靶標(biāo)多核苷酸。連接探針包括(1)“可環(huán)化的探針”，其中單個(gè)多核苷酸(或寡核苷酸)的每個(gè)末端(5’和3’)結(jié)合靶標(biāo)多核苷酸的相近或相鄰區(qū)域，其中在這種結(jié)合后，連接反應(yīng)可以將探針的5’末端與3’末端連接，從而環(huán)化該探針；或者(2)兩條多核苷酸(或寡核苷酸)探針，其中在兩條探針結(jié)合至靶標(biāo)多核苷酸內(nèi)的區(qū)域后，一條探針的5’末端可以與另一的探針的3’末端連接。在兩條這樣的探針與靶標(biāo)多核苷酸的相鄰或相近序列雜交后，連接反應(yīng)導(dǎo)致兩條探針連接在一起成為一條線性探針。在一些實(shí)施方案中，連接探針也可包含酶切位點(diǎn)、通用引物位點(diǎn)和/或通用探針結(jié)合位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，連接探針在其5’末端被磷酸化。在其它實(shí)施方案中，連接探針在其5’末端沒有被磷酸化。這樣的5’末端的磷酸化可允許該5’末端連接于與靶標(biāo)多核苷酸的相鄰區(qū)域結(jié)合的同一(或不同)連接探針的3’末端，而不需要缺口填補(bǔ)反應(yīng)。在其它情況下，合成在5’末端未磷酸化的探針。在這種情況下，設(shè)計(jì)探針而使5’末端的結(jié)合區(qū)域鄰近但不直接鄰接同一(或不同)探針的3’末端的結(jié)合位點(diǎn)。連接這種探針可能還需要缺口填補(bǔ)或延伸反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，連接探針是分子倒置探針。美國(guó)專利7，368，242描述了分子倒置探針以及它如何用來(lái)在與樣品中的靶標(biāo)多核苷酸相互作用后產(chǎn)生擴(kuò)增子。在允許遺傳靶標(biāo)中的相鄰區(qū)域與其在分子倒置探針(或其它連接探針)中的互補(bǔ)區(qū)域形成穩(wěn)定的雙鏈體的條件下，探針的線性形式與包含靶標(biāo)多核苷酸的樣品結(jié)合。通常，探針的5’末端與靶標(biāo)序列之一結(jié)合，而探針的3’末端與相鄰的序列結(jié)合，從而形成環(huán)結(jié)構(gòu)。目標(biāo)特異性區(qū)域的末端可能彼此鄰接(被切口分隔)，或者它們之間可能有數(shù)個(gè)核苷酸(例如1-10個(gè)核苷酸)的缺口。在一些實(shí)施方案中，缺口超過5、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500個(gè)核苷酸。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，靶標(biāo)特異性區(qū)域直接相鄰(例如，間隔O個(gè)核苷酸)。無(wú)論何種情況，在靶標(biāo)特異性區(qū)域雜交后，兩個(gè)靶標(biāo)特異性區(qū)域的末端通過以下方式被共價(jià)連接利用缺口填補(bǔ)反應(yīng)的連接反應(yīng)、或利用缺口填補(bǔ)反應(yīng)的多重延伸反應(yīng)及隨后的連接反應(yīng)。圖4是使用分子倒置探針(MIP)檢測(cè)兩種遺傳靶標(biāo)的圖示。一個(gè)遺傳靶標(biāo)被一條探針(MIPl-I)識(shí)別，而第二個(gè)遺傳靶標(biāo)被第二條探針(MIP2-1)所識(shí)別。在MIP結(jié)合至遺傳靶標(biāo)后，進(jìn)行連接反應(yīng)將結(jié)合的MIP探針的5’末端連接于3’末端，從而形成環(huán)狀MIP。在一些情況下，MIP探針結(jié)合被一個(gè)或兩個(gè)核苷酸分隔的兩個(gè)相鄰的DNA序列。在這種情況下，進(jìn)行缺口填補(bǔ)(或延伸)反應(yīng)以便使用靶標(biāo)DNA為模板來(lái)填補(bǔ)缺口。在MIP結(jié)合其靶標(biāo)序列后，MIP形成環(huán)，探針的序列可能倒置(見圖4)。這種倒置之后可進(jìn)行連接反應(yīng)，其中倒置分子的末端連接起來(lái)形成環(huán)化的探針。在MIP探針與DNA結(jié)合(以及，任選地缺口填補(bǔ)反應(yīng))之后，用連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)以環(huán)化MIP探針。然后在核酸外切酶消化過程中保留環(huán)狀的MIP探針，該核酸外切酶消化未使用的線性單鏈探針、單鏈線性基因組DNA和雙鏈線性基因組DNA。然后環(huán)狀MIP與PCR試劑組合到小滴中，以便通過小滴數(shù)字PCR進(jìn)行分析。在一些實(shí)施方案中，在PCR反應(yīng)之前或期間將環(huán)狀探針線性化。如圖4所示，探針可包含含有酶切位點(diǎn)(例如，對(duì)尿嘧啶-N-糖基化酶酶切敏感的一系列尿嘧啶殘基)的位點(diǎn)。在一些情況下，存在酶切步驟，其中多核苷酸被切割并形成線性分子。在其它情況中，在所述步驟中沒有酶切步驟，多核苷酸維持環(huán)狀狀態(tài)。接下來(lái)，連接的MIP探針(或環(huán)狀，或線性，或兩者的混合物)被細(xì)分到多個(gè)分區(qū)之一中。優(yōu)選地，該分區(qū)是小滴(例如，油相中的水性小滴)。然后小滴進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)。在熱循環(huán)反應(yīng)期間，線性化的MIP(或者，在一些情況下，環(huán)狀的MIP)作為反應(yīng)模板被通用正向引物(UFl或UF2)和通用反向引物(URl或UR2)起始擴(kuò)增。在擴(kuò)增期間，切割與每條MIP中的序列雜交的通用探針(UPl或UP2)，以使探針的熒光側(cè)與探針的猝滅側(cè)相分離。作為這種切割的結(jié)果，來(lái)自探針的熒光劑側(cè)的熒光增加。在一些實(shí)施方案中，通過具有5’->3’聚合活性的聚合酶進(jìn)行缺口填補(bǔ)反應(yīng)?？捎糜谶@種方法中的聚合酶包括在切口位點(diǎn)處起始5'-3'聚合的那些聚合酶。聚合酶也可移去切口下游的聚合的鏈。在一些實(shí)施方案中，用于缺口填補(bǔ)反應(yīng)的聚合酶缺乏任何5’->3’核酸外切酶活性。在以下情況下，通常具有這種核酸外切酶活性的聚合酶可缺乏這種活性加入封閉劑阻斷該活性；行使5’->3’核酸外切酶活性的聚合酶的結(jié)構(gòu)域或片段缺失、突變或修飾；聚合酶被化學(xué)修飾；或者本領(lǐng)域已知的任何其它方法。在一些實(shí)施方案中，用于缺口填補(bǔ)反應(yīng)的聚合酶包含3'->5/編輯核酸外切酶活性。合適的聚合酶的示例包括DNA聚合酶I的klenow片段、核酸外切酶缺失的DNA聚合酶I的klenow片段以及來(lái)自Bst聚合酶的相似片段(Bio-Rad,Richmond,Calif.)。SEQUENASEI.O,SEQUENASE2.0(USBiochemical)、TOTNA聚合酶以及Phi29DNA聚合酶也起作用，如同AmpliTaqDNA聚合酶的Stoffel片段一樣(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)。盡管本公開文本描述了包含DNA的連接探針(例如，MIP探針)，此處所述的連接探針可包含任何其它的核酸(例如，RNA,mRNA,cDNA、rRNA、tRNA、siRNA、miRNA等)、多肽、合成的核酸或合成的多肽。在一些情況下，連接探針可包含兩種或更多的不同類型的多核苷酸(例如，既包含RNA又包含DNA)，或者連接探針可包含多核苷酸和多肽(例如，RNA+多肽；DNA+多肽)。在特定的其它應(yīng)用中，在此處所述的方法中，連接探針(例如，MIP探針)可偶聯(lián)至熒光染料、固體支持物或微珠。核酸是指天然存在的和非天然存在的核酸，以及以與天然存在的核酸相似的方式起作用的核酸類似物。核酸可選自RNA、DNA或核酸類似物分子，如糖或骨架修飾的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。其它核酸類似物如肽核酸(PM)或鎖定核酸(LNA)也是適用的。非天然存在的核酸的示例包括鹵素取代的堿基、烷基取代的堿基、羥基取代的堿基、巰基取代的堿基以及5-丙炔基-尿嘧啶、2-硫代-5-丙炔基-尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、異鳥嘌呤、異胞嘧啶、假異胞嘧啶、4-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶和2-硫胸腺嘧啶、肌苷、2-氨基嘌呤、N9-(2-氨基-6-氯嘌呤)、N9-(2,6-二氨基嘌呤)、次黃嘌呤、N9-(7-脫氮-鳥嘌呤)、N9(7-脫氮-8-氮雜鳥嘌呤)、N8(7-脫氮-8-氮雜鳥嘌呤)、2_氨基-6-“h”-嘌呤、6-氨基-2-“h”_嘌呤、6-氧代-2-“h”_嘌呤、2-氧代-4-“h”_嘧啶、2-氧代-6-“h”_嘌呤、4-氧代-2-“h”-嘧啶。那些將與非巰基化和巰基化堿基形成兩個(gè)氫鍵的堿基對(duì)；分別為2,4-二氧代和4-氧代-2-硫代喃唳、2，4-二氧代和2-氧代-4-硫代喃唳、4-氨基-2-氧代和4-氨基-2-硫代嘧啶、6-氧代-2-氨基和6-硫代-2-氨基嘌呤、2-氨基-4-氧代和2-氨基-4-硫代喃唳、6-氧代-2-氨基和6-硫代-2-氨基嘌呤。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，本方法包括通過選擇性地保護(hù)期望的序列免于酶消化(如核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶的酶)而從基因組DNA中選擇、標(biāo)記、捕獲和/或分離期望的序列。例如，MIP探針的環(huán)化(在它結(jié)合其目標(biāo)后)保護(hù)探針免受某些酶(例如，exoI>exoIII)的消化。也可使用其它在探針結(jié)合其目標(biāo)后保護(hù)探針的方法。在一些情況下，連接反應(yīng)后可以是酶消化，如核酸外切酶處理(例如，核酸外切酶I、核酸外切酶III)，以消化未結(jié)合的基因組DNA和未結(jié)合的探針，但不消化環(huán)狀DNA，從而分離代表期望序列的環(huán)狀MIP。在一些情況下，當(dāng)多于I條探針結(jié)合期望的遺傳靶標(biāo)并進(jìn)行連接以形成環(huán)狀MIP時(shí)，MIP允許多重化。于是，多個(gè)MIP可代表給定的遺傳靶標(biāo)，增強(qiáng)了檢測(cè)的靈敏度。在產(chǎn)生環(huán)狀MIP以代表感興趣的序列的一些情況下，可在PCR反應(yīng)檢測(cè)之前(或期間)將這些環(huán)狀MIP線性化。在一些情況下，MIP包含可用酶如尿嘧啶-N-糖基化酶酶處理而脫嘌呤化的尿嘧啶堿基，并且環(huán)狀分子可在加熱后在無(wú)堿基位點(diǎn)變?yōu)榫€性化。在其它情況下，MIP可包含位點(diǎn)特異性限制性酶所針對(duì)的限制性酶切位點(diǎn)，切割環(huán)狀探針以形成線性DNA分子。在其中環(huán)狀的MIP被線性化的一些實(shí)施方案中，在MIP線性化之前，通過如熱滅活、PH變性或物理分離等方法將包含MIP的溶液中的酶(包括核酸外切酶)滅活。在一些情況下，可用凝膠純化或乙醇沉淀從蛋白質(zhì)分離DNA，或者可用有機(jī)溶液如三氯乙酸沉淀來(lái)從溶液中去除蛋白質(zhì)。限制性酶的示例包括AatII、Acc65I、AccI、AciI、AclI、AcuI、AfeI、AflII、AflIII、AgeI、AhdI、AleI、AluI、AlwI、AlwNI、ApaI、ApaLI、ApeKI、ApoI、AscI、AseI、AsiSI、Aval、Avail、AvrIKBaeGI、Bael、BamHI、BanI、Banll、Bbsl、BbvCI、Bbvl、BccI、BceAI、Bcgl、BciVI、Bell、Bfal、BfuAI、BfuCI、Bgll、Bglll、BlpI、BmgBI、Bmrl、Bmtl、Bpml、BpulOI、BpuEIλBsaAIΛBsaBI、BsaHI、Bsal、BsaJIΛBsaWIΛBsaXI、BseRI、BseYIΛBsgIΛBsiEI、BsiHKAI、BsiWI、BslI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BsmI、BsoBI、Bsp12861、BspCNI、BspDI、BspEI、BspHI、BspMI、BspQI、BsrBIΛBsrDI、BsrFI、BsrGI、BsrI、BssHII、BssKI、BssSI、BstAPI、BstBI、BstEII、BstNI、BstUI、BstXI、BstYI、BstZ17I、Bsu36I、Btgl、BtgZI、BtsCI、BtsI、Cac8I、ClaI、CspCI、CviAII、CviKI-l、CviQI、DdeI、DpnI、DpnII、DraI、DraIII、DrdI、EaeI、EagI、Earl、EciI、Eco53kI、EcoNI、Eco0109I、EcoP15I、EcoRI、EcoRVΛFatI、FauI、Fnu4HI、FokI、FseI、FspI、HaeII、HaeIII、HgaI、HhaI、HincII、HindIII、HinfI、HinPlI、HpaI、HpaII、HphI,Hpyl66II、Hpyl88I、Hpyl88III、Hpy99I、HpyAV、HpyCH4III、HpyCH4IV、HpyCH4V、KasI、KpnI、MboI、MboII、MfeI、MluI、MlyI、MmeI、MnlI、MscI、MseI、MslI、MspAlI、MspI、MwoI、NaeI、NarI、Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、NciI、NcoI、NdeI、NgoMIV、NheI、NlaIII、NlalV、NmeAIII、NotI、NruI、NsiI、NspI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII、PacI、PaeR7I、PciI、PflFI、PflMI、PhoI、PleI、PmeI、PmlI、PpuMI、PshAI>Psil、PspGI>PspOMI>PspXI>PstI、PvuI>PvuII>RsaI>RsrII>SacI、SacII、Sail、SapI、Sau3AI、Sau96I、SbfI、Seal、ScrFI、SexAI、SfaNI、SfcI、SfiI、SfoI、SgrAI、SmaI、SmlI,SnaBI,Spel、SphI,SspI、StuI,StyD4I、Styl、SwaI,T、TaqaI、Tfil、Tlil、Tsel、Tsp45I、Tsp509I、TspMI、TspRI、Tthl111、XbaI、XcmI、XhoI、XmaI、XmnI和ZraI。其它類型的探針和其它篩選基因探針的方法也可用于此處所述的方法和組合物中。例如，盡管MIP探針的使用通常涉及單連接探針的環(huán)化，但是環(huán)化步驟不總是必要的。例如，可以使用連接檢測(cè)PCR技術(shù)，其中兩條不同的探針(其中每條與相鄰DNA(或鄰近DNA)雜交)連接在一起，隨后加入通用引物和探針以檢測(cè)連接的片段。圖7顯示用連接檢測(cè)反應(yīng)(LDR)及隨后的小滴中的PCR，以兩種顏色檢測(cè)兩種遺傳靶標(biāo)。兩條線性寡核苷酸結(jié)合于遺傳靶標(biāo)上相鄰或鄰近的區(qū)域。這些區(qū)域可以直接相鄰或被缺口隔開。另外，區(qū)域可以被缺口隔開，該缺口可以用聚合酶反應(yīng)補(bǔ)平，該反應(yīng)延伸第一探針的3’末端的長(zhǎng)度而使其3’末端直接與第二探針的5’末端相鄰。然后兩條探針彼此相連(如圖7所示)。在連接期間，兩條線性的寡核苷酸連接起來(lái)形成單模板寡核苷酸(LDR1-1或LDR2-1)。這種單模板寡核苷酸，而不是形成單模板寡核苷酸的寡核苷酸對(duì)，可以在使用通用正向(UFl或UF2)和通用反向(URl或UR2)引物的PCR反應(yīng)中產(chǎn)生產(chǎn)物。此夕卜，該P(yáng)CR反應(yīng)包含通用探針(UPl或UP2)，該探針包含與該模板寡核苷酸的一部分雜交的熒光劑-猝滅劑對(duì)。在PCR反應(yīng)期間，DNA聚合酶(如Taq)的5’一>3’核酸外切酶活性切割探針，導(dǎo)致分子的熒光劑末端脫離其猝滅劑末端。作為這種熒光劑探針和猝滅劑探針之間分離的結(jié)果，反應(yīng)中熒光強(qiáng)度將增強(qiáng)，并且可以在下列步驟中檢測(cè)?？梢允褂冒瑑煞N不同顏色熒光劑的兩條通用探針(UPl和UP2)進(jìn)行這種分析，在檢測(cè)期間可以區(qū)別這兩種不同顏色。例如，LDRl-I可以識(shí)別靶標(biāo)序列如可疑的非整倍性染色體，而LDR2-1識(shí)別參照序列如假定的二倍體染色體，從而允許對(duì)非整倍性的檢測(cè)。在此處所述的連接檢測(cè)反應(yīng)中使用的連接探針一旦連接于靶標(biāo)多核苷酸，就可被保護(hù)免于核酸外切酶處理。例如，加入保護(hù)基團(tuán)、化學(xué)封閉單元或硫代磷酸修飾可保護(hù)雜交的連接探針免于被能夠消化未結(jié)合的探針和/或未結(jié)合的靶標(biāo)多核苷酸(例如，基因組DNA)的某種核酸外切酶所消化。硫代磷酸修飾可保護(hù)連接的探針免于3'至5'核酸外切酶exoIII的活性的處理。類似地，硫代磷酸修飾可保護(hù)連接的探針免于5'至3'核酸外切酶exoT7的活性的處理。在一些情況下，可以使用3'至5'核酸外切酶exoT和5'至3'核酸外切酶Recjf。提供針對(duì)exoT活性的保護(hù)的公開硫代磷酸在Putney等.(1981)PNAS78(12):7350_54。對(duì)于RecJf，也見Tosch等，(2007)J.ofPhysicsConferenceSeries61(2007)1241-1245；doi:10.1088/1742-6596/61/1/245，國(guó)際納米科學(xué)與技術(shù)會(huì)議(ICN&T2006)οexoT和RecJF都消化ssDNA，并且被硫代磷酸所阻斷。硫代磷酸修飾可位于探針中的通用PCR引物序列的末端或通用PCR引物序列的上游尾部。在一些實(shí)施方案中，探針包含不同線性寡核苷酸的混合物，其中在每條探針與靶標(biāo)多核苷酸雜交后，一條線性寡核苷酸的5’區(qū)域能夠與另一線性寡核苷酸的3’區(qū)域連接。在一些實(shí)施方案中，兩條相同的(或基本相同的)寡核苷酸可以以一種方式各自結(jié)合于革巴標(biāo)多核苷酸的相近或相鄰區(qū)域，這種方式使得一條這樣的探針的5’末端然后可與另一條這樣的探針的3’末端連接。每條探針與靶標(biāo)多核苷酸雜交后都發(fā)生這樣的連接。在其它實(shí)施方案中，所述方法包括捕獲期望的序列，而隨后不進(jìn)行分離。在一些情況下，超過一條線性探針識(shí)別期望的序列并與之結(jié)合。探針結(jié)合后，可進(jìn)行連接反應(yīng)以使一條或多條探針相互連接。在一些情況下，由于連接而捕獲期望的序列，這可允許在隨后的步驟中通過PCR檢測(cè)連接的探針(被稱為連接酶檢測(cè)反應(yīng)-PCR或LDR-PCR)，而未連接的探針無(wú)法被PCR檢測(cè)到。在一些情況下，多個(gè)探針可結(jié)合遺傳靶標(biāo)并進(jìn)行連接，這增強(qiáng)了通過LDR-PCR檢測(cè)遺傳靶標(biāo)的靈敏度。可以設(shè)計(jì)連接探針(例如，MIP探針)以滿足某種標(biāo)準(zhǔn)而使樣品與樣品之間的測(cè)試表現(xiàn)差異最小化或者在其他方面優(yōu)化該測(cè)試。連接探針的設(shè)計(jì)中使用的一些標(biāo)準(zhǔn)包括(I)靶標(biāo)序列不包含任何已知SNP(例如，dbSNP中的所有SNP)；2)靶標(biāo)序列位于基因組DNA的保守區(qū)域內(nèi)靶標(biāo)序列；(3)靶標(biāo)序列不與任何已知CNV區(qū)域(例如，在UCSC基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的CNV蹤跡中存在的所有CNV)重疊；4)靶標(biāo)序列位于種間保守(例如，通過UCSC基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的保守追蹤評(píng)價(jià)的)的靶標(biāo)多核苷酸(例如，基因組DNA、RNA)的區(qū)域內(nèi)。此外，為了優(yōu)化探針的通用的和一致的表現(xiàn)，一些標(biāo)準(zhǔn)可以應(yīng)用于靶標(biāo)序列的挑選。可以挑選靶標(biāo)序列而使它們?cè)谌祟惢蚪M中是獨(dú)特的?？梢蕴暨x靶標(biāo)序列而使MIP探針的兩個(gè)末端包含G/C核苷酸從而使它們的長(zhǎng)度近似為40個(gè)核苷酸，從而使組合的導(dǎo)引臂(homerarm)具有相似的解鏈溫度(例如，使用Primer3軟件的默認(rèn)參數(shù)，在67度±2度之內(nèi))，并且使單個(gè)導(dǎo)引臂具有相似的解鏈溫度(例如，使用Primer3軟件的默認(rèn)參數(shù)，在50度±2度之內(nèi))。(與基因組DNA互補(bǔ)的探針的5’和3’末端分別被稱為導(dǎo)引臂H2和H1。)也可以篩選MIP和目標(biāo)，去掉形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的MIP和目標(biāo)，因?yàn)樗鼈兛赡軣o(wú)法很好地結(jié)合于它們的相對(duì)物。此外，MIP可以互相比較以降低溶液中MIP探針間反應(yīng)的可能性。一些用于避免二級(jí)結(jié)構(gòu)的通用原則可見于Hyman等(2010),AppliedandEnvironmentalMicrobiology76:3904_3910?？梢酝ㄟ^建立dG得分的分布并去除異常值來(lái)幫助篩選二級(jí)結(jié)構(gòu)。此處提供的方法包括用于同時(shí)評(píng)價(jià)例如染色體13、18和21上的多個(gè)異常的方法。對(duì)于該研究，染色體可以被用作彼此的參照，因此，可能不需要另外的參照樣品或參照探針(例如針對(duì)染色體I的)。包含遺傳靶標(biāo)的樣品可包含完整染色體、染色體片段或非染色體片段形式的基因組DNA。在一些情況下，基因組DNA片段的平均長(zhǎng)度可小于約100、200、300、400、500或800個(gè)堿基對(duì)，或小于約1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200個(gè)核苷酸，或小于約1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100千堿基。在一些情況下，片段的長(zhǎng)度范圍為10-500、10-1000或100-150個(gè)堿基(或核苷酸)，在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選100-150個(gè)堿基。在胎兒基因組DNA相比于母體DNA富集的一些情況下，片段大小可能平均約為300個(gè)堿基對(duì)或100或150個(gè)堿基對(duì)。在一些情況下，樣品包含至少一個(gè)基因組當(dāng)量。在其它情況下，樣品包含少于一個(gè)基因組當(dāng)量，但是包括足夠的基因組DNA用以確定胎兒或母體樣品中目標(biāo)和參照序列的比例。在其它情況下，樣品包含約一半基因組當(dāng)量。所使用的術(shù)語(yǔ)“基因組當(dāng)量”是指基于計(jì)算的基因組大小和DNA重量計(jì)算的樣品DNA的分布，其中單倍體基因組重約3.3pg，二倍體正常細(xì)胞(46條染色體)的基因組內(nèi)容物重約6.6pg，對(duì)應(yīng)于兩個(gè)基因組當(dāng)量(GE)(“基因組的當(dāng)量”和“基因組當(dāng)量”在此處可互換使用)。實(shí)踐中，DNA樣品大小可能有一些變化。另外由于隨機(jī)片段分布，給定的基因組當(dāng)量可能不包含恰好僅僅對(duì)應(yīng)于一個(gè)完整二倍體基因組的DNA片段。多重化此處所述且本領(lǐng)域已知的擴(kuò)增方法(例如，PCR)可以被多重化，即在每個(gè)反應(yīng)體積中用多種引物和探針運(yùn)行。在一些此處提供的方法和組合物的實(shí)施方案中，在給定的樣品體積中有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200、500、1000、5000、10，000,20,000,30,000,40,000,50,000,60,000,70,000,100,000,2,000，000、3，000，000,4,000，000,5,000，000,6,000，000,7,000，000,8,000，000,9,000，000或10,000,000條或更多的不同的探針。在一些實(shí)施方案中，在給定的樣品體積中有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200、500、1000、5000、10，000,20,000、30，000,40,000,50,000,60,000,70,000,100,000,2,000，000,3,000，000,4,000，000、5，000，000,6,000，000,7,000，000,8,000，000,9,000，000或10，000，000條或更多的引物。在一些實(shí)施方案中，使用多種探針(或引物組)，并且這些探針(或引物組)在一個(gè)或多個(gè)方面不同。探針可結(jié)合相同的靶標(biāo)多核苷酸；或不同的靶標(biāo)多核苷酸(例如，不同的染色體；或者相同的染色體，但是所述染色體內(nèi)的不同區(qū)域)。例如，可使用針對(duì)不同目標(biāo)的超過1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20種探針。在一些情況下，可使用針對(duì)不同目標(biāo)的超過20、30、40、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000、500000、1000000種或更多種探針。在其它情況下，探針中存在不同類型的切割位點(diǎn)。在一些情況下，所述多種探針包括許多不同類型的探針(例如，連接探針、MIP、鎖扣探針、PCR引物組、通用引物、通用探針及其任意組合)。在一些情況下，所述許多不同類型的探針的區(qū)別在于每條探針偶聯(lián)于不同的信號(hào)試劑(例如，綠色熒光團(tuán)、紅色熒光團(tuán)，等等)。在一些情況下，探針的不同在于它們包含不同的引物結(jié)合位點(diǎn)。在其它情況下，相同組的通用引物可用于結(jié)合所述多種探針中的所有或大部分探針。在反應(yīng)體積如小滴中的多重化允許檢測(cè)靶標(biāo)和參照序列間的DNA比例相對(duì)于二倍體序列所預(yù)期的I:I比例的微小改變。多重化允許針對(duì)任意組的靶標(biāo)和參照序列計(jì)數(shù)大量的序列，盡管樣品中GE/mL很低(例如，1000GE/mL)，如在母體血漿中。完整的靶標(biāo)和參照染色體是大分子，并且具有可以被特異性引物組識(shí)別和擴(kuò)增的多個(gè)保守且獨(dú)特的區(qū)域。在血漿中，循環(huán)DNA可作為小片段存在(約300bp)。通過設(shè)計(jì)產(chǎn)生小產(chǎn)物(例如，100個(gè)堿基對(duì))的多重化引物，可以有效地?cái)U(kuò)增目標(biāo)或參照序列的小片段(例如，300個(gè)堿基對(duì))。多重化可增加分離在反應(yīng)體積如小滴中的靶標(biāo)被多重化引物之一識(shí)別的可能性。多重化也可增加發(fā)生擴(kuò)增的可能性，并可使得在單重試驗(yàn)中被計(jì)數(shù)為陰性的靶標(biāo)序列被測(cè)定為陽(yáng)性。對(duì)于參照序列同樣如此。在一些實(shí)施方案中，多重化的程度可以包括針對(duì)靶標(biāo)序列的超過一個(gè)弓丨物組，如至少2、3、4、5、10、15、20或25個(gè)引物組，每個(gè)針對(duì)特定的靶標(biāo)序列。在一些實(shí)施方案中，多重化的程度可以包括針對(duì)參照序列的超過一個(gè)參照引物組，如至少2、3、4、5、10、15、20或25個(gè)引物組，每個(gè)針對(duì)特定的參照序列。在一些實(shí)施方案中，多重化的程度可以包括針對(duì)靶標(biāo)序列的超過一個(gè)引物組和針對(duì)參照序列的超過一個(gè)參照引物組，如針對(duì)特定的靶標(biāo)或參照序列的至少2、3、4、5、10、15、20或25個(gè)引物組。在一些實(shí)施方案中，針對(duì)靶標(biāo)序列的引物組的數(shù)目與針對(duì)參照序列的引物組的數(shù)目不相同。在一些實(shí)施方案中，多重化的程度可以是針對(duì)每個(gè)靶標(biāo)和參照序列少于500、250、200、150或100個(gè)引物組?？梢詫袠?biāo)和參照序列多重化組合到一個(gè)反應(yīng)體積中?？梢曰诠庾V上可區(qū)分的探針(例如2種不同染料標(biāo)記的探針，如Taqman或持鎖核酸探針(UniversalProbeLibrary,Roche))來(lái)區(qū)分不同引物對(duì)擴(kuò)增的序列。在這種方法中，將所有的探針組合到一個(gè)反應(yīng)體積中并基于每條探針發(fā)射的顏色的差異進(jìn)行區(qū)分。例如，針對(duì)一種多核苷酸(例如，測(cè)試染色體，染色體21)的探針可與具有第一種顏色的染料偶聯(lián)，而反應(yīng)中針對(duì)第二種多核苷酸(例如，參照染色體，染色體I)的探針可以與具有第二種顏色的染料偶聯(lián)。然后顏色的比例反映了測(cè)試與參照染色體間的比例。在一些情況下，一組探針(例如，針對(duì)測(cè)試染色體例如染色體21的一組探針)可針對(duì)靶標(biāo)多核苷酸的不同區(qū)域，而該組中的每條探針具有相同的通用引物結(jié)合位點(diǎn)。在一些情況下，每條探針具有相同的探針結(jié)合位點(diǎn)。在一些情況下，反應(yīng)中兩條或更多的探針可具有不同的探針結(jié)合位點(diǎn)。在一些情況下，加至這種反應(yīng)中的探針偶聯(lián)于相同的信號(hào)試劑(例如相同顏色的熒光團(tuán))。在一些情況下，不同的信號(hào)試劑(例如，兩種不同的顏色)偶聯(lián)于一條或更多條探針。備選地，反應(yīng)體積(例如小滴)組可以被分成兩個(gè)樣品組，一組擴(kuò)增靶標(biāo)序列，另一組擴(kuò)增參照序列。然后各自獨(dú)立地測(cè)定靶標(biāo)和參照基因。這允許使用一種熒光探針如SYBRGreen0在一些情況下，這需要將樣品分成兩份并可能要將每個(gè)多重組中的引物數(shù)加倍以獲得相等的靈敏度。在一些情況下，將樣品分成兩份，將針對(duì)測(cè)試染色體的多種連接探針加入樣品的一半中，并將針對(duì)參照染色體的多種連接探針加入樣品的另一半中。在這種例子中，連接探針然后可與偶聯(lián)至相同信號(hào)試劑(例如相同顏色光譜的熒光團(tuán))的通用探針雜交。也可以在早期步驟中使用針對(duì)靶標(biāo)的探針，而不是用引物對(duì)，以完成本公開文本提供的多重化?？梢允褂玫氖纠蕴结樖蔷哂刑貏e被設(shè)計(jì)為與靶標(biāo)多核苷酸內(nèi)相鄰或鄰近序列雜交的兩個(gè)末端的線性寡核苷酸。這種探針的非限制性示例是鎖扣探針，它是線性寡核苷酸具有特別被設(shè)計(jì)為與相鄰的靶標(biāo)序列雜交的兩個(gè)末端。一旦雜交，兩個(gè)末端可以通過連接結(jié)合，而鎖扣探針變?yōu)榄h(huán)化的。鎖扣探針在例如Lizardi等(1998)NatGenetics19:225-232;美國(guó)專利5，871，921;6，235，472;和5，866，337中公開。在一些情況下，探針(例如寡核苷酸)結(jié)合于基因組DNA的相鄰序列，然后末端可通過連接酶反應(yīng)直接連接。在其它情況下，在兩個(gè)末端之間有一個(gè)或更多個(gè)堿基的缺口。在這種情況下，可以進(jìn)行延伸或缺口填補(bǔ)反應(yīng)。對(duì)于缺口填補(bǔ)反應(yīng)，本領(lǐng)域已知的任何方法都可以實(shí)現(xiàn)。例如，可以將核苷酸的混合物(dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP)以及聚合酶、連接酶和其它反應(yīng)成分加入到反應(yīng)混合物中，在約60°C孵育約10分鐘，隨后在37°C孵育約I分鐘。在與靶標(biāo)多核苷酸結(jié)合并連接后，連接探針(例如，分子倒置探針、鎖扣探針等)可變?yōu)榄h(huán)化的。在一些情況下，探針是此處所述的結(jié)合遺傳靶標(biāo)的寡核苷酸探針。在一些情況下，探針是結(jié)合參照靶標(biāo)的寡核苷酸探針。參照靶標(biāo)的示例是染色體I或其它不太可能與胎兒非整倍性有關(guān)的染色體。在一些情況下，寡核苷酸或參照寡核苷酸包含可被酶切割的位點(diǎn)。例如，寡核苷酸可以是包含一系列一個(gè)或多個(gè)尿嘧啶殘基，例如至少1、2、3、4、5、6、7、10、15或20個(gè)尿嘧啶殘基的DNA寡核苷酸，并且可被酶如尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)切割。在其它情況下，寡核苷酸可以包含一個(gè)或多個(gè)限制性位點(diǎn)。寡核苷酸可包含一個(gè)或多個(gè)相同的限制性位點(diǎn)或一個(gè)或多個(gè)不同的限制性位點(diǎn)。限制性位點(diǎn)的示例是文獻(xiàn)中公知的。通常，可使用可被限制性酶切割的位點(diǎn)。限制性酶可以是可以在特定位點(diǎn)切割的任何限制性酶(或核酸內(nèi)切酶)。在一些情況下，限制性酶是平端切割酶；在其它情況下，限制性酶在非對(duì)稱位點(diǎn)切割以產(chǎn)生突出端。此處提供了限制性酶的非限制性示例。寡核苷酸探針可進(jìn)一步包含與正向和反向引物例如通用引物雜交的位點(diǎn)。此處所用的通用引物包括識(shí)別并雜交至待擴(kuò)增區(qū)域兩側(cè)的序列的一對(duì)或更多對(duì)5'和3'引物。待擴(kuò)增區(qū)域可以位于遺傳靶標(biāo)如被懷疑胎兒非整倍性的染色體中，這樣的染色體的非限制性示例包括染色體21、染色體13、染色體18和X染色體。在一些情況下，待擴(kuò)增區(qū)域在假定的二倍體染色體的遺傳靶標(biāo)內(nèi)。在一些情況下，待擴(kuò)增區(qū)域不在遺傳靶標(biāo)內(nèi)，而在針對(duì)遺傳靶標(biāo)的探針如分子倒置探針內(nèi)。引物對(duì)可針對(duì)遺傳靶標(biāo)，或者它們可以是通用引物識(shí)別眾多擴(kuò)增靶標(biāo)側(cè)翼的序列。例如，針對(duì)遺傳靶標(biāo)的探針可包含一個(gè)或更多個(gè)識(shí)別并結(jié)合于遺傳靶標(biāo)中特定序列的區(qū)段，并且探針可額外地包含一組全體探針共有的通用序列。因此，一對(duì)通用引物可用于擴(kuò)增該組內(nèi)的任意探針。在一些情況下，通用引物對(duì)僅在分子倒置探針倒置時(shí)才產(chǎn)生可檢測(cè)的PCR產(chǎn)物?？梢酝ㄟ^切割環(huán)狀分子倒置探針內(nèi)的位點(diǎn)，誘導(dǎo)分子倒置探針的倒置，這種切割導(dǎo)致了引物相對(duì)于其引物對(duì)的方向的倒置。在一些情況下，通用引物對(duì)僅在擴(kuò)增連接反應(yīng)的產(chǎn)物時(shí)，比如在連接檢測(cè)反應(yīng)中，才產(chǎn)生可檢測(cè)的PCR產(chǎn)物。寡核苷酸探針也可包含與連接至標(biāo)記物如染料或熒光染料的探針(例如，TaqMan探針)互補(bǔ)的序列。在一些情況下，TaqMan探針結(jié)合于一種類型的染料(例如，F(xiàn)AM、VIC、TAMRA,R0X)。在其他情況下，在寡核苷酸上有超過一個(gè)TaqMan探針位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)能夠結(jié)合不同的TaqMan探針(例如,具有不同類型染料的TaqMan探針)。也可能有多個(gè)TaqMan探針位點(diǎn)，它們具有與此處所述的寡核苷酸探針相同的序列。通常，TaqMan探針可能僅僅結(jié)合于此處所述的寡核苷酸探針上的位點(diǎn)，而不結(jié)合于基因組DNA，但在一些情況下，TaqMan探針可能結(jié)合基因組DNA。使用此處所述的寡核苷酸的優(yōu)點(diǎn)在于，相比使用常規(guī)PCR技術(shù)，如使用引物組的技術(shù)，信號(hào)與背景噪音比改善了超過1、2、5、10、15、20、30、40、50、75或100倍。一個(gè)原因在于，對(duì)于針對(duì)特定靶標(biāo)如染色體的所有寡核苷酸探針可能僅需要一種探針。例如，可能有大量的寡核苷酸探針(例如，超過50種)，其中每種結(jié)合于染色體上不同的位點(diǎn)，但是其中每種也包含通用的或相同的TaqMan位點(diǎn)，因此當(dāng)結(jié)合至特定熒光染料的TaqMan探針與探針退火時(shí)將在相同的波長(zhǎng)發(fā)突光。此處提供的方法包括具有以下步驟的方法允許一條或多條寡核苷酸探針與基因組DNA雜交的變性和退火步驟。任選的缺口填補(bǔ)反應(yīng)(如果探針的5’和3’末端不直接針對(duì)基因組DNA的相鄰序列)，隨后是環(huán)化探針的連接酶反應(yīng)。該方法可進(jìn)一步包括核酸外切酶處理步驟，其中用核酸外切酶如核酸外切酶I和/或III處理所述樣品，該酶消化線性探針(即，沒有成功雜交的探針)以及ssDNA和dsDNA(例如，基因組DNA)，隨后是倒置步驟。該方法可進(jìn)一步包括擴(kuò)增步驟，其中將PCR試劑例如Taq聚合酶、通用引物、熒光探針(例如TaqMan探針)和其它PCR反應(yīng)組分加入樣品中以擴(kuò)增寡核苷酸探針上的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)。該方法可進(jìn)一步包括分配步驟，其中將樣品乳化為單分散的油包水小滴，例如超過I,000、10，000,20,000,50,000、100，000,200,000,500,000個(gè)或更多的小滴(此處也被稱為反應(yīng)體積)，隨后是熱循環(huán)，以及在對(duì)應(yīng)于所用熒光探針的波長(zhǎng)處檢測(cè)每個(gè)小滴的熒光。在一些情況下，每個(gè)小滴中存在平均約1、2、3、4或5個(gè)拷貝的DNA。在一些情況下，每個(gè)小滴中存在平均約O.001,0.005,0.01,0.05,0.1,0.5、1、2、3、4或5條寡核苷酸探針。此處所述的方法可在高度多重化深度時(shí)進(jìn)行。當(dāng)高度多重化深度與ddPCR計(jì)數(shù)結(jié)合時(shí)，它可以提供大量的靶標(biāo)計(jì)數(shù)以實(shí)現(xiàn)相對(duì)染色體劑量的高分辨率。這種多重化方法可與使用父本遺傳的SNP、Y染色體靶標(biāo)或胎兒特異性甲基化標(biāo)記物的ddPCR胎兒載量定量相結(jié)合以防止假陰性?？蓪?duì)一份提取的樣品單獨(dú)進(jìn)行胎兒載量測(cè)定，或者可在試驗(yàn)的倒置步驟后通過兩種正交試驗(yàn)(通用MIPPCR+胎兒特異性定量測(cè)定)的多重化進(jìn)行胎兒載量測(cè)定。在一些情況下，連接與通用PCR方法聯(lián)用以實(shí)現(xiàn)多重化。例子包括但不限于分子倒置探針(MIP)策略(見Hardenbol等，(2003)NatureBiotechnology,21(6):673-78)；美國(guó)專利申請(qǐng)發(fā)明者本杰明·辛德森,瑟奇·薩克森諾夫,菲利普·貝爾格萊德,凱文·奈斯,邁克爾·盧塞羅,比利·科爾斯頓申請(qǐng)人:伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司