專利名稱：用于腸易激綜合征診斷的新基因組生物標(biāo)記的制作方法
用于腸易激綜合征診斷的新基因組生物標(biāo)記與相關(guān)申請的交叉參考本申請要求于2009年11月25日提交的美國申請?zhí)?1/264，634的優(yōu)先權(quán)，為了所有目的將該美國申請的教導(dǎo)內(nèi)容整體引入本文作為參考。
背景技術(shù)：
腸易激綜合征(IBS)是所有胃腸道病癥中最常見的，影響全部群體的10-20%且在所有消化系統(tǒng)病患者中占50%以上。然而，研究表明，受IBS困擾的患者中僅約10%-50%實際上尋求醫(yī)學(xué)幫助。具有IBS的患者呈現(xiàn)不一樣的癥狀，例如主要與排便有關(guān)的腹痛、腹瀉、便秘、或腹瀉便秘交替、腹脹、腹氣、和大便中過度粘液。超過40%的IBS患者具有嚴(yán)重的癥狀，使得他們不得不休假，簡化其社會生活，避免性交，取消約會，停止旅行，服用藥物，甚至因害怕尷尬而困在家中。在美國估計的IBS健康護理費用是每年$8百萬(Talley等人，Gastroenterol. ,109:1736-1741 (1995))。IBS的確切病理生理學(xué)并未得到充分理解。然而，存在對內(nèi)臟痛覺感受的提高敏感性，稱為外周敏化。這種敏化涉及初級傳入神經(jīng)元的傳導(dǎo)過程的閾值降低和放大量的增加，可歸因于多種介質(zhì)，包括單胺類(例如兒茶酚胺和吲哚胺)、P物質(zhì)以及多種細(xì)胞因子和前列腺素類例如E型前列腺素(參見例如,Mayer等人,Gastroenterol. , 107:271-293 (1994))。在IBS的病因?qū)W中還牽涉腸運動機能障礙，這導(dǎo)致腔內(nèi)內(nèi)容物和/或氣體的處理異常(參見例如，Kellow 等人，Gastroenterol. , 92:1885-1893 (1987) ;Levitt 等人,Ann. Int. Med.，124:422-424 (1996))。心理學(xué)因素也可以促成IBS癥狀，表現(xiàn)出，即使不是失常所觸發(fā)的，也與失常(包括抑郁與焦慮)結(jié)合在一起(參見例如，Drossman等人，Gastroenterol. Int.,8:47-90 (1995))。IBS的原因并未得到充分理解。腸壁襯有肌肉層，肌肉層收縮和舒張，將食物從胃通過腸道移動到直腸。通常，這些肌肉以協(xié)調(diào)的節(jié)奏收縮和舒張。在IBS患者中，這些收縮比正常的一般更強且持續(xù)更久。因此，在某些情況下，食物被迫更快速地通過腸，引起氣體、氣脹和腹瀉。在其他情況下，出現(xiàn)相反情況食物通過減慢并且大便變硬且干燥，引起便秘。IBS的確切病理生理學(xué)有待闡明。雖然腸運動障礙和改變的內(nèi)臟感受被認(rèn)為是癥狀發(fā)病機理的重要貢獻者(Quigley, Scand. J. Gastroenterol. , 38 (Suppl. 237) : 1-8(2003) ;Mayer 等人，Gastroenterol.，122:2032-2048 (2002))，但這種病狀目前一般被視為腦-腸軸的病癥。近來，也已提出腸道感染和腸炎癥的作用。研究已記載在細(xì)菌學(xué)確認(rèn)的胃腸炎后IBS發(fā)作，而其它研究已提供在IBS中低度粘膜炎癥(Spiller等人，Gut,47:804-811 (2000) ；DunIop 等人，Gastroenterol. ,125:1651-1659 (2003) !Cumberland等人，Epidemiol. Infect.，130:453-460 (2003))和免疫激活(Gwee 等人，Gut，52:523-526
(2003)；Pimentel 等人，Am. J. Gastroenterol. ,95:3503-3506 (2000))的跡象。腸菌群也被涉及，并且近期研究證實益生生物雙歧桿菌(Bifidobacterium)通過調(diào)節(jié)免疫活性在治療該病癥中的功效(O，Mahony 等人，Gastroenterol. , 128:541-551 (2005))。下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA)是人的核心內(nèi)分泌應(yīng)激系統(tǒng)(De Wied等人，F(xiàn)ront. Neuroendocrinol.，14:251-302 (1993)),并且提供在腦和腸免疫系統(tǒng)之間的重要連接。響應(yīng)身體和心理應(yīng)激物兩者都可以發(fā)生該軸的激活(Dinan, Br. J. Psychiatry,164:365-371 (1994))，這兩者都已牽涉IBS的病理生理學(xué)(Cumberland等人，Epidemiol.Infect. ,130:453-460 (2003))。具有IBS的患者已被報道，在兒童期中具有增加比率的性和身體濫用，以及在成人期中更高比率的緊張生活事件(Gaynes等人，Baillieres Clin.Gastroenterol.，13:437-452 (1999))。此類社會心理創(chuàng)傷或不良的認(rèn)知應(yīng)對策略將顯著影響癥狀嚴(yán)重性、日常功能和健康后果。
雖然IBS的病因?qū)W并未完全表征，但醫(yī)學(xué)界已出現(xiàn)了共同的定義和標(biāo)準(zhǔn)，稱為羅馬II標(biāo)準(zhǔn)(Rome II criteria),以幫助基于病史來診斷IBS。羅馬II標(biāo)準(zhǔn)要求在I年的時期中3個月的連續(xù)或復(fù)發(fā)性腹痛或不適，該腹痛或不適通過排便得到緩解和/或與大便頻率或稠度的變化以及下述中的兩種或更多種相關(guān)改變的大便頻率、改變的大便形狀、改變的大便通過、粘液的通過、或氣脹和腹脹。再一個必要條件是缺乏可以引起這些癥狀的任何結(jié)構(gòu)的或生物化學(xué)的病癥。因此，羅馬II標(biāo)準(zhǔn)僅在存在大量病史時可以使用，并且僅在不存在可以用于解釋這些癥狀的異常腸解剖學(xué)或代謝過程時是可靠的。類似地，近來由醫(yī)學(xué)界發(fā)展的羅馬III標(biāo)準(zhǔn)僅可以在有特定的一組癥狀的呈現(xiàn)、詳細(xì)病史和體格檢查時使用。文獻充分表明，由于IBS與其他疾病或病癥在癥狀上的相似性，將患者診斷為具有IBS可能是困難的。事實上，因為IBS的癥狀與多種其他腸道病的癥狀相似或等同，所以在作出正確診斷前可能花費數(shù)年。例如，具有炎性腸病(IBD)但顯示出諸如氣脹、腹瀉、便秘和腹痛等輕度體征與癥狀的患者可能難以與具有IBS的患者區(qū)分。因此，在IBS和IBD之間的癥狀相似性致使快速和準(zhǔn)確診斷變得困難。區(qū)別性診斷IBS和IBD的困難使得這些疾病的早期和有效治療受到阻礙。不幸的是，目前尚沒有可以用于確定地區(qū)分IBS與其他呈現(xiàn)相似癥狀的腸疾病或病癥的快速和準(zhǔn)確的診斷方法。本發(fā)明滿足了此需要并且還提供相關(guān)優(yōu)點。發(fā)明概述本發(fā)明提供方法、系統(tǒng)和代碼，其可以用于準(zhǔn)確地分類來自個體的樣品是否與腸易激綜合征(IBS)或其亞型有關(guān)。作為非限制性例子，本發(fā)明可以使用統(tǒng)計學(xué)算法和/或經(jīng)驗數(shù)據(jù)，用于將來自個體的樣品分類為IBS樣品。本發(fā)明還可以使用統(tǒng)計學(xué)算法和/或經(jīng)驗數(shù)據(jù)的組合，用于排除呈現(xiàn)IBS樣癥狀的一種或多種疾病或病癥和歸入(rule in) IBS。因此，本發(fā)明提供了 IBS的準(zhǔn)確診斷預(yù)測、IBS亞型的分類、和可以用于指導(dǎo)治療決定的預(yù)后信息。在一個方面，本發(fā)明提供用于在有需要的受試者中診斷腸易激綜合征(IBS)的方法，該方法包括(a)從得自受試者的生物學(xué)樣品中分離和/或擴增RNA ； (b)在適于將檢測試劑轉(zhuǎn)化成包含檢測試劑和IBS RNA生物標(biāo)記的復(fù)合物的條件下，使分離和/或擴增的RNA與檢測試劑接觸；(c)檢測復(fù)合物的水平；和((1)確定復(fù)合物的水平更緊密地類似于與IBS相關(guān)的第一參考水平還是類似于與不存在IBS相關(guān)的第二參考水平，從而在受試者中診斷IBS或其亞型，其中生物標(biāo)記是來自基因的RNA，所述基因選自表4中的基因，例如(XDC147。在另一個實施方案中，基因選自表6中的基因。在一個更優(yōu)選的實施方案中，基因選自表7中的基因。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于監(jiān)控受試者中腸易激綜合征(IBS)的進展或消退的方法，所述方法包括(a)從在第一時間點取自受試者的第一生物學(xué)樣品，確定第一生物標(biāo)記譜；(b)從在第二時間點取自受試者的第二生物學(xué)樣品，確定第二生物標(biāo)記譜；和(c)比較所述第一和所述第二生物標(biāo)記譜，以(i )確定哪個生物標(biāo)記譜最類似或最不類似于與IBS相關(guān)的第一參考譜，(ii)確定哪個生物標(biāo)記譜最不類似或最類似于與不存在IBS相關(guān)的第二參考譜，或(iii)確定前述相似性中的至少2個，其中所述生物標(biāo)記譜包含表4中的至少2種生物標(biāo)記的表達信息，從而監(jiān)控所述受試者中IBS的進展或消退。在另一個實施方案中，生物標(biāo)記譜包含表 6中的至少2種生物標(biāo)記的表達信息。在一個更優(yōu)選的實施方案中，生物標(biāo)記譜包含表7中的至少2種生物標(biāo)記的表達信息。在另外一個方面，本發(fā)明提供了用于向有需要的受試者分配IBS治療的方法，該方法包括Ca)從得自受試者的生物學(xué)樣品中分離和/或擴增RNA ； (b)在適于將檢測試劑轉(zhuǎn)化成包含檢測試劑和IBS RNA生物標(biāo)記的復(fù)合物的條件下，使分離和/或擴增的RNA與檢測試劑接觸；(c)檢測復(fù)合物的水平；(d)確定復(fù)合物的水平更緊密地類似于與IBS相關(guān)的第一參考水平還是與不存在IBS相關(guān)的第二參考水平；和(e)如果所述水平更緊密地類似于與IBS相關(guān)的所述第一參考水平，那么分配IBS治療，其中IBS RNA生物標(biāo)記選自表4中的基因。在另一個實施方案中，基因選自表6中的基因。在一個更優(yōu)選的實施方案中，基因選自表7中的基因。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法進一步包括將樣品分類為IBS-便秘型(IBS-C)、IBS-腹瀉型(IBS-D)、IBS-混合型(IBS-M)、IBS-交替型(IBS-A)、或感染后 IBS(IBS-PI)樣品。在其他實施方案中，該方法進一步包括將非IBS樣品分類為正常、炎性腸病(IBD)、或非IBD樣品。在一些實施方案中，用于診斷IBS、監(jiān)控IBS的進展或消退和/或分配IBS治療的方法包括檢測表2、表4、表6和表7中的至少2、3、4、5種或更多種生物標(biāo)記。在其他實施方案中，該方法進一步包括檢測選自下述的生物標(biāo)記細(xì)胞因子、生長因子、抗嗜中性粒細(xì)胞抗體、抗釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)抗體、抗微生物抗體、抗組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tTG)抗體、脂質(zhì)運載蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、脂質(zhì)運載蛋白和MMP的復(fù)合物、組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)、球蛋白(例如α -球蛋白)、肌動蛋白切割蛋白(actin-severingprotein)、SlOO蛋白、血纖肽、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、速激肽、生長素釋放肽、神經(jīng)降壓肽、促皮質(zhì)素釋放激素(CRH)、彈性蛋白酶、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、乳鐵蛋白(Iactoferrin)、抗乳鐵蛋白抗體、鈣防衛(wèi)蛋白、血紅蛋白、N0D2/CARD15、血清素重攝取轉(zhuǎn)運蛋白(SERT)、色氨酸羥化酶-1、5-羥色胺(5-HT )、乳酮糖、及其組合。在一些其他實施方案中，本發(fā)明的方法進一步包括確定癥狀譜，其中通過鑒定所述個體中至少一種癥狀的存在或嚴(yán)重性，確定所述癥狀譜；和使用基于所述診斷標(biāo)記譜和所述癥狀譜的算法，將所述樣品分類為IBS樣品或非IBS樣品。這些及其他目的、方面和實施方案將在下面的詳述和附圖中更顯而易見。附圖簡述圖I描述在經(jīng)由RMA算法加工后8個訓(xùn)練樣品的基因表達數(shù)據(jù)的盒須圖。樣品HGl和2對應(yīng)于IBS-C樣品，HG3、4和5對應(yīng)于IBS-D，并且HG6、7和8對應(yīng)于健康對照樣品。圖2描述基于ANOVA分析的頭5種差異表達基因的基因圖。圖3描述使用陣列上的所有探針組執(zhí)行的無監(jiān)督分層聚類分析的聚類結(jié)果。
圖4描述使用陣列上的所有未掩蔽的探針組執(zhí)行的無監(jiān)督分層聚類分析的聚類結(jié)果的熱圖。來自IBS患者和健康志愿者的轉(zhuǎn)錄物的總體表達分析。得自3個IBS-D、2個IBS-C和3個健康志愿者的總RNA在含有超過35，000種人基因的Affymetrix陣列上進行分析。3個正常和5個IBS樣品的無監(jiān)督分層聚類分析。紅色指示相對于所有實驗的平均表達值升高的基因。綠色指示相對于該平均表達值降低的基因。圖5描述基于所有未掩蔽的探針組的基因表達譜顯現(xiàn)樣品的分離的多維量表圖。圖6描述主成分分析結(jié)果。左圖(A)顯示多少百分比的總變異可以由最前面的主成分來解釋。右圖(B)顯示通過頭2種主成分的樣品分離。圖7A-C描述在每對組別之間，具體地，在(A)IBS-C和IBS-D組，(B)IBS-C和對照組，以及(C) IBS-D和對照組之間，比較的火山圖。圖8描述在來自IBS-M、IBS-C、IBS-D和對照(HV)受試者的樣品中F0XD3、PI4K2A、ACSS2、ASIP和0R2L8基因的差異基因表達的qRT-PCR驗證結(jié)果。圖9A-C描述在來自IBS-M、IBS_C、IBS-D和對照(HV)受試者的樣品中所選的候選生物標(biāo)記的差異基因表達的qRT-PCR驗證結(jié)果。

圖10A-C描述在來自IBS-M、IBS-C、IBS-D和對照(HV)受試者的樣品中36種所選差異表達基因(DEGs)的表達的實時定量PCR驗證結(jié)果。圖11描述在來自IBS-M、IBS-C、IBS-D和對照(HV)受試者的樣品中5種靶基因(SERT、TPH1、MA0-A、TLR4 和 TLR7)的實時定量 PCR 結(jié)果。來自于2007年8月14日提交的美國專利
發(fā)明者H·宮, S·辛格, N·霍 申請人:雀巢產(chǎn)品技術(shù)援助有限公司