專利名稱：靶向人前列腺特異性膜抗原的j591微抗體和雙抗體的制作方法
靶向人前列腺特異性膜抗原的J591微抗體和雙抗體關(guān)于聯(lián)邦政府資助的研究的聲明本發(fā)明是以政府資助在由國(guó)家癌癥研究所(NCI)給予的合約編號(hào)HHSN261200900051C下進(jìn)行的。政府擁有本發(fā)明的一定權(quán)利。優(yōu)先權(quán)要求本申請(qǐng)要求享有2009年12月2日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/266，134的權(quán)益，在此將其主題引入作為參考，如其在本文中被完整描述。背景抗體工程的進(jìn)展已能開發(fā)具有不同藥物動(dòng)力學(xué)和結(jié)合性質(zhì)的特征的多種抗體片 段(Wu et al 2005、Wu et al 2008、Wu et al 2009)。微抗體是特征在于分子量( 80kD)比全長(zhǎng)抗體小同時(shí)保持對(duì)抗原的二價(jià)結(jié)合特性的抗體形式(Hu et all996)。由于其較小的尺寸，微抗體的特征在于從系統(tǒng)的更快清除和靶向腫瘤組織時(shí)的增強(qiáng)滲透。在強(qiáng)靶向結(jié)合迅速清除的能力下，微抗體是可用于診斷成像的優(yōu)化抗體形式(Wu et al 2005)。自從發(fā)現(xiàn)了抗腫瘤相關(guān)祀標(biāo)(tumor associated target)CEA的第一個(gè)微抗體，已開發(fā)了許多用于臨床前診斷成像的抗不同癌靶標(biāo)的微抗體，包括乳腺癌中的人表皮生長(zhǎng)因子受體-2 (HER2)、非何杰金氏淋巴瘤中的B-淋巴細(xì)胞抗原⑶20和前列腺癌中的前列腺干細(xì)胞抗原(PSCA)(Hu et al 1996、Leyton et al 2008>01afsen et al 2004>01afsen et al 2009)。例如，已在臨床中評(píng)價(jià)123I標(biāo)記的CEA微抗體以用于通過SPECT使結(jié)直腸癌患者成像，并且已用111In-DOTA標(biāo)記的微抗體進(jìn)行了類似的研究(Wong et al 2004)。新成像劑的開發(fā)對(duì)于用現(xiàn)有技術(shù)成像不佳的特定癌癥如前列腺癌的診斷、控制和治療是尤為至關(guān)重要的。需要開發(fā)全部癌癥類型的成像劑從而能夠靶向、分期和監(jiān)測(cè)疾病。現(xiàn)有的前列腺癌診斷成像的方法仍相對(duì)不準(zhǔn)確。對(duì)于2006年評(píng)估的234，460例新病例和27，350例死亡，需要能夠準(zhǔn)確診斷、分期和監(jiān)測(cè)前列腺癌癥的成像劑(Olson et al2007)。前列腺特異性膜抗原(PSMA)——與前列腺癌有關(guān)的細(xì)胞表面生物標(biāo)記(Slovin2005)，是具有谷氨酸羧肽酶活性的單通道II型跨膜蛋白，雖然對(duì)PSMA的功能性作用并不十分了解(Olson et al 2007)。PSMA的表達(dá)在前列腺之外的正常組織，包括腦、小腸、肝、近端腎小管和唾液腺中相對(duì)有限(Olson et al 2007)。前列腺癌中的PSMA表達(dá)隨腫瘤的侵占性而增加，并在高級(jí)腫瘤、轉(zhuǎn)移性損傷和不依賴于雄激素的疾病中最高(Olson et al 2007)。因此，PSMA是癌癥生物標(biāo)記——成像劑靶向的良好侯選物。PSMA表達(dá)也在多種非前列腺實(shí)體腫瘤的新血管系統(tǒng)中上調(diào)，該非前列腺實(shí)體腫瘤包括肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、腎癌、肝癌和胰腺癌以及肉瘤和黑素瘤(Olson etal 2007)。已開發(fā)了靶向PSMA的全長(zhǎng)抗體，其中一些處于臨床前和臨床發(fā)展的不同階段(Olson et al 2007)。PSMA 最初由鼠抗體(mAb)7Ell 限定，該鼠抗體(mAb)7Ell 識(shí)別 PSMA的胞內(nèi)表位(Olson et al 2007)。后來7EllmAb發(fā)展為FDA批準(zhǔn)的SPECT成像劑，稱為Prostascint,用于在軟組織中檢測(cè)和成像前列腺癌(Olson et al 2007)。但是，由于7E11識(shí)別胞內(nèi)表位，Prostascint是相對(duì)弱的成像劑,其被限于檢測(cè)壞死的腫瘤組織(Olson etal 2007)。Prostascint具有全長(zhǎng)抗體的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì),在注射與成像之間也需要長(zhǎng)的時(shí)間(Olson et al 2007)。此外,Prostascint是引起強(qiáng)免疫應(yīng)答的鼠抗體,阻撓多次給藥(Olson et al 2007)。另一種祀向PSMA的全長(zhǎng)抗體-J591,被發(fā)現(xiàn),并隨后去免疫(deimmunize),去
免疫的形式稱為huJ591 (Liu et al 1997,Bander et al 2003)。去免疫的huJ591是抗人PSMA抗體，其識(shí)別和結(jié)合PSMA的胞外表位(Bander et al 2003)。huJ591抗體正被開發(fā)為針對(duì)前列腺癌的潛在放射免疫治療劑。在I期試驗(yàn)中，用發(fā)射Y的同位素銦111和镥177標(biāo)記的DOTA結(jié)合的huJ591抗體證實(shí)了優(yōu)良地靶向轉(zhuǎn)移部位、無免疫原性，并且良好地耐受多次給藥(Bander et al 2003、Milowsky et al 2004、Bander et al 2005、Olson et al2007)。除前列腺癌外，mIn-D0TAhuJ591的I期研究證實(shí)了特異性靶向晚期實(shí)體腫瘤的腫瘤新血管系統(tǒng)(Milowsky et al 2007)。概述 在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了結(jié)合PSMA的微抗體(minibody)。根據(jù)該實(shí)施方式，微抗體由核苷酸序列編碼，該核苷酸序列自N端至C端包含能夠結(jié)合前列腺特異性膜抗原(PSMA)的scFv序列、人工鉸合(鉸鏈)序列和人IgGlCH3序列。微抗體單體還可包含N端信號(hào)序列，從而在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)能分泌微抗體。本文所述微抗體scFv包含通過連接序列連接至輕鏈可變區(qū)(VL)的重鏈可變區(qū)(VH)0 一方面，scFv為VHVL方向，以使VH在VL的上游。具有這種scFv的微抗體單體可具有包含SEQIDN0:1或SEQIDN0:2的核苷酸序列。另一方面，scFv為VLVH方向，以使VL在VH的上游。微抗體單體可由細(xì)胞表達(dá)。在這種實(shí)施方式中，由細(xì)胞表達(dá)的CysDB單體可包含氨基酸序列 SEQIDN0:10 或 SEQIDN0:11。在另一實(shí)施方式中，提供了結(jié)合PSMA的cys-雙抗體(diabody) (CysDB)0根據(jù)該實(shí)施方式，CysDB單體由核苷酸序列編碼，該核苷酸序列自N端至C端包含能夠結(jié)合PSMA的scFv序列和半胱氨酸尾。CysDB還可包括N端信號(hào)序列，從而在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)能分泌微抗體。本文所述的CysDB scFv包含通過連接序列連接至輕鏈可變區(qū)(VL)的重鏈可變區(qū)(VH)0 一方面，scFv為VHVL方向，以使VH在VL的上游。具有這種scFv的CysDB單體可具有包含SEQIDN0:6或SEQIDN0:7的核苷酸序列。另一方面，scFv為VLVH方向，以使VL在VH的上游。具有這種scFv的CysDB單體可具有包含SEQIDN0:8或SEQIDN0:9的核苷酸序列。CysDB可由細(xì)胞表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，由細(xì)胞表達(dá)的CysDB可包含氨基酸序列SEQIDN0:12、SEQIDN0:13、SEQIDN0:14 或 SEQIDN0:15。在另一實(shí)施方式中，提供了診斷個(gè)體中與PSMA表達(dá)有關(guān)的癌癥的方法。該方法包括向患有或疑患與PSMA表達(dá)有關(guān)的癌癥的個(gè)體給予結(jié)合于(綴合于)診斷劑的抗PSMA微抗體或cys-雙抗體；使個(gè)體暴露于成像方法以在體內(nèi)顯現(xiàn)被標(biāo)記的微抗體或cys-雙抗體；和當(dāng)標(biāo)記的微抗體或cys-雙抗體定位于腫瘤部位時(shí)，確定個(gè)體患有與PSMA表達(dá)有關(guān)的癌癥。在另一實(shí)施方式中，提供了治療個(gè)體中與PSMA表達(dá)有關(guān)的癌癥的方法。該方法包括向個(gè)體給予治療有效量的藥物組合物，該組合物包含抗PSMA微抗體或抗PSMA cys-雙抗體。一方面，抗PSMA微抗體或抗PSMA cys-雙抗體結(jié)合至治療劑。個(gè)體中與PSMA表達(dá)有關(guān)的癌癥可以是肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、腎癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌或黑素瘤。可用于上述方法的微抗體可以是本文所述任何適當(dāng)?shù)奈⒖贵w，或可包含SEQIDN0:10或SEQIDN0:11?？捎糜谏鲜龇椒ǖ腸ys-雙抗體可以是本文所述任何適當(dāng)?shù)奈⒖贵w，或可包含 SEQIDN0:12、SEQIDN0:13、SEQIDN0:14 或 SEQIDN0:15。附圖簡(jiǎn)述圖IA是J591微抗體的示意圖。該圖顯示了以VHVL方向結(jié)合目標(biāo)PSMA的微抗體。圖IB是VHVL方向J591微抗體的表達(dá)構(gòu)建物的示意圖。SP=信號(hào)肽，VH-重鏈可 變區(qū)，VL-輕鏈可變區(qū)，L-18氨基酸連接體，H. /E人工鉸鏈/延伸，CH3來自人IgGl。圖2 是去免疫(第 3行；SEQ ID NO: 5 ；SEQ ID NO: 19)、鼠(第 2行；SEQID NO:4 ；SEQID NO: 18)和人復(fù)合(第I行；SEQ ID NO:3 ；SEQ ID NO: 17) J591V區(qū)氨基酸序列之間的比較。沿HC行(第I行)突出的殘基表示HC與鼠V區(qū)之間的差異。沿去免疫行(第3行)突出的殘基表示最初去免疫過程導(dǎo)致的去免疫V區(qū)與鼠V區(qū)之間的差異。兩個(gè)星表示通過去免疫被引入的兩個(gè)脯氨酸。圖3是J591人復(fù)合VHVL微抗體核苷酸序列(SEQ ID NO: I)和經(jīng)翻譯的相應(yīng)氨基酸序列(SEQ ID NO: 10)。圖4是J5912P VHVL微抗體核苷酸序列(SEQ ID NO: 2)和經(jīng)翻譯的相應(yīng)氨基酸序列(SEQ ID NO:11)。圖5是cys-雙抗體(CysDB)的示意圖(A)、VLVH方向CysDB的表達(dá)構(gòu)建物的示意圖(B)和VHVL方向CysDB的表達(dá)構(gòu)建物的示意圖(C)。SS=信號(hào)序列，VH=重鏈可變區(qū)，VL=輕鏈可變區(qū)，L連接體(可以是5或8個(gè)氨基酸)，GGS=半胱氨酸尾部(Gly-Gly-Cys)。圖6是J591cys_雙抗體(CysDB)VH-5-VL核苷酸序列(SEQ ID N0:6)和經(jīng)翻譯的相應(yīng)氨基酸序列(SEQ ID NO: 12)。圖7是J591cys_雙抗體(CysDB)VH-8_VL核苷酸序列(SEQ ID N0:7)和經(jīng)翻譯的相應(yīng)氨基酸序列(SEQ ID NO: 13)。圖8是J591cys_雙抗體(CysDB)VL-5-VH核苷酸序列(SEQ ID N0:8)和經(jīng)翻譯的相應(yīng)氨基酸序列(SEQ ID NO: 14)。圖9是J591cys_雙抗體(CysDB)VL-8-VH核苷酸序列(SEQ ID N0:9)和經(jīng)翻譯的相應(yīng)氨基酸序列(SEQ ID NO: 15)。

圖10是A、B、C形式的pcDNA 3. I/my C-His (-)的載體圖譜。來自InvitrogenCorp.的這種表達(dá)載體的特征在于用于哺乳動(dòng)物表達(dá)的CMV啟動(dòng)子和用于選擇的新霉素抗性。圖11是確定CHO-Kl細(xì)胞表達(dá)J591微抗體的代表性免疫印跡分析。第I泳道相應(yīng)于分子量標(biāo)記樣本，第2泳道相應(yīng)于空白載體樣本,第3泳道相應(yīng)于陽性對(duì)照微抗體樣本，第4泳道相應(yīng)于J591HC VLVH樣本，第5泳道相應(yīng)于J591HCVHVL樣本，第6泳道相應(yīng)于J5912P VLVH樣本，第7泳道相應(yīng)于J5912P VHVL樣本。圖12A-D是表示J591微抗體的流式細(xì)胞計(jì)量分析的圖。柱狀圖將細(xì)胞計(jì)數(shù)相對(duì)于PE信號(hào)(FL2-H)作圖。圖12A顯示了表示J591HC VLVH微抗體的流式細(xì)胞計(jì)量分析的圖，圖12B顯示了表示J591HC VHVL微抗體的流式細(xì)胞計(jì)量分析的圖，圖12C顯示了表示J5912P VLVH微抗體的流式細(xì)胞計(jì)量分析的圖，圖12D顯示了表示J591 2P VHVL微抗體的流式細(xì)胞計(jì)量分析的圖。圖13是純化的J591微抗體的SDS-PAGE分析。純化的J591微抗體蛋白在非還原條件(第I列)和還原條件(第2列)下被裝載于SDS-PAGE凝膠上。凝膠用GelCode Blue(Pierce, Thermo Scientific)染色。微抗體以1/5稀釋，以裝載于凝膠上。圖14是純化的J591微抗體的尺寸排阻層析(SEC)分析。該圖將220nm UV吸光度(mAU)相對(duì)于時(shí)間(min)作圖。4 y g J591微抗體被裝載于TSK-GEL SuperSW3000柱上。使蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品也在柱上單獨(dú)運(yùn)行以提供參照。聚集體相對(duì)于微抗體蛋白(在此被標(biāo)記為單體)的百分比通過計(jì)算曲線下的面積確定。

圖15通過ELISA示例了 J591微抗體蛋白結(jié)合PSMA。以I ii g/ml的純化重組PSMA蛋白包被96孔ELISA板。將純化的J591微抗體蛋白(1，籲)以2 y g/ml的初始濃度引入，并由第三稀釋液連續(xù)稀釋10倍。對(duì)陰性對(duì)照微抗體(2，■)進(jìn)行同樣的稀釋。樣本各稀釋重復(fù)三次進(jìn)行，誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。最初溫育后，用結(jié)合堿性磷酸酶的山羊抗人IgG (Fe特異的)抗體檢測(cè)結(jié)合的微抗體，并將其用PNPP溶液顯像。在405nm下檢測(cè)吸光度。圖16A-D是表示流式細(xì)胞計(jì)量分析的圖，示例了 J591微抗體結(jié)合PSMA+細(xì)胞系。所有柱狀圖將細(xì)胞計(jì)數(shù)相對(duì)于PE信號(hào)(FL2-H)作圖。對(duì)J591微抗體蛋白和陰性對(duì)照微抗體(I)均以20 ii g/ml測(cè)試其結(jié)合PSMA+細(xì)胞系LNCaP (A和B)和CWR22rvl (C和D)。細(xì)胞隨后用二級(jí)抗人IgG (Fe特異的)-PE結(jié)合的抗體染色。I X IO5個(gè)細(xì)胞/點(diǎn)和以5，000事件/點(diǎn)進(jìn)行分析。(A) J591微抗體(2)結(jié)合LNCaP細(xì)胞(B) J591-D0TA微抗體(2)結(jié)合LNCaP細(xì)胞(C) J591微抗體(2)結(jié)合CWR細(xì)胞(D) J591-D0TA微抗體(2)結(jié)合CWR細(xì)胞。圖17是顯示J591微抗體在LNCaP細(xì)胞中內(nèi)化的代表性圖像。將LNCaP細(xì)胞在12孔板中聚-d-賴氨酸包被的蓋玻片上鋪平。生長(zhǎng)2天后，將細(xì)胞在4°C下預(yù)冷30分鐘，然后用一級(jí)抗體或微抗體在4°C下溫育30分鐘。在最初溫育后的所示時(shí)間點(diǎn)，將細(xì)胞固定，透化，并用二級(jí)抗人IgG-Alexa 488染色。同時(shí)將蓋玻片置于載玻片上，并在封固介質(zhì)中用DAPI復(fù)染。用63X油浸沒透鏡在Leica SP2-1P-FCS共焦顯微鏡上觀察載玻片。圖18是顯示J591微抗體在CWR22rvl細(xì)胞中內(nèi)化的代表性圖像。將CWR22rvl細(xì)胞在12孔板中聚-d-賴氨酸包被的蓋玻片上鋪平。生長(zhǎng)2天后，將細(xì)胞在4°C下預(yù)冷30分鐘，然后用一級(jí)抗體或微抗體在4°C下溫育30分鐘。在最初溫育后的所示時(shí)間點(diǎn)，將細(xì)胞固定，透化，并用二級(jí)抗人IgG-Alexa 488染色。同時(shí)將蓋玻片置于載玻片上，并在封固介質(zhì)中用DAPI復(fù)染。用63X油浸沒透鏡在Leica SP2-1P-FCS共焦顯微鏡上觀察載玻片。圖19是示例131I標(biāo)記的J591微抗體和111In-DOTA標(biāo)記的J591微抗體的細(xì)胞相關(guān)放射活性的獲取和保留的圖。細(xì)胞相關(guān)放射活性在結(jié)合CWR22rvl細(xì)胞時(shí)隨時(shí)間的獲取和保留。細(xì)胞膜、細(xì)胞溶胞產(chǎn)物(內(nèi)化)和所有(膜+內(nèi)化)部分的放射活性表示為每分鐘的計(jì)數(shù)(cpm)。在實(shí)驗(yàn)前一天將CWR22rvl細(xì)胞接種于24孔板中，5X105個(gè)細(xì)胞/孔。將細(xì)胞在4°C下預(yù)冷，然后用過量(A) 131I標(biāo)記的J591微抗體或(B) 111In-DOTA標(biāo)記的J591微抗體溫育。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，去除含有放射標(biāo)記微抗體的上清液，用酸性甘氨酸緩沖液清除細(xì)胞以得到膜部分，并溶解細(xì)胞。各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行三次。Y-條表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖20是比較131I標(biāo)記的J591微抗體與111In-DOTA標(biāo)記的J591微抗體的細(xì)胞相關(guān)放射活性的圖?？偧?xì)胞相關(guān)放射活性(膜+內(nèi)化)表示為初始細(xì)胞相關(guān)放射活性在結(jié)合CWR22rvl細(xì)胞時(shí)隨時(shí)間的百分比。該圖顯示了 131I標(biāo)記的J591微抗體(下線)和111In-DOTA標(biāo)記的J591微抗體(上線)。圖21示例了具有CWR22rvl和PC3異種移植體、注射64Cu_D0TA-J591微抗體的小鼠的代表性連續(xù)微PET/CT圖像。在注射后連續(xù)多次掃描代表性小鼠。CWR22rvl腫瘤表示為(+)腫瘤，PC3腫瘤表示為(-)腫瘤。(A)注射后4小時(shí)的CT掃描。顯示了冠狀平面和橫斷面。(B)注射后4小時(shí)的PET/CT覆蓋圖像。顯示了冠狀平面和橫斷面。(C)注射后4小時(shí)的代表性小鼠冠狀PET/CT覆蓋3D投影(D)注射后43小時(shí)代表性小鼠冠狀PET/CT覆蓋3D投影。圖22是示例64Cu-D0TA_J591微抗體在注射后19小時(shí)和43小時(shí)的生物分布的條形圖。圖中繪制了 64Cu-DOTA-J591微抗體在異種移植腫瘤和所選目標(biāo)正常組織中的生物分 布。生物分布被圖示為注射劑量除以重量(克數(shù))的％ (%ID/g)。各數(shù)據(jù)點(diǎn)表示一組小鼠在注射后19 hrs (n=8)和43hrs (n=4)的平均％ID/g。誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖23示例了具有CWR22rvl和PC3異種移植體、注射124I_J591微抗體的小鼠的代表性連續(xù)微PET圖像。在注射后連續(xù)多次掃描代表性小鼠。CWR22rvl腫瘤表示為(+)腫瘤，PC3腫瘤表示為(-)腫瘤。(A)注射后4小時(shí)的CT掃描。顯示了冠狀平面和橫斷面。(B)注射后4小時(shí)的PET/CT覆蓋圖像。顯示了冠狀平面和橫斷面。(C)注射后4、20和44小時(shí)的冠狀PET/CT覆蓋圖像。圖24是示例124I_J591微抗體在注射后19小時(shí)和44小時(shí)的生物分布的條形圖。圖中繪制了 124I_J591微抗體在異種移植腫瘤和所選目標(biāo)正常組織中的生物分布。生物分布表示為注射劑量除以重量(克數(shù))的％ (%ID/g)。各數(shù)據(jù)點(diǎn)表示一組小鼠(在第19小時(shí)n=4，在第44小時(shí)n=2)在注射后19hrs和44hrs的平均％ID/g。誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖25是示例下列微抗體變體在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的CHO-Kl細(xì)胞中的表達(dá)水平的條形圖(DJ591HC VLVH微抗體(J591VLVH Mb)、(2)J591HC VHVL微抗體(J59IVHVL Mb)、(3)J5912PVLVH 微抗體(J591VLVH#Mb)和(4) J5912P VHVL 微抗體(J591VHVL#Mb)。huJ591HC VHVL呈現(xiàn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的最高表達(dá)(6. 7 u g/mL)。圖26是顯示在注射64Cu-D0TA-J591微抗體后4小時(shí)、20小時(shí)和43小時(shí)的生物分布比(即，陽性腫瘤與組織的比)的條形圖。生物分布比包括陽性腫瘤(Pos)相對(duì)于肝(Liv)、腎(Kid)和軟組織(Soft)的比。誤差條表示平均標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。圖27是顯示在注射124I-J591微抗體后4小時(shí)、20小時(shí)和43小時(shí)的生物分布比(即，陽性腫瘤與組織的比)的條形圖。生物分布比包括陽性腫瘤(Pos)相對(duì)于肝(Liv)、腎(Kid)和軟組織(Soft)的比。誤差條表示平均標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。詳細(xì)描述本公開涉及靶向前列腺特異性膜抗原(PSMA)的抗體或功能性抗體片段。PSMA抗體或其功能性抗體片段可結(jié)合至物質(zhì)如診斷劑、治療劑或納米顆粒，形成抗PSMA結(jié)合體。還公開了包括PSMA抗體、功能性PSMA抗體片段或抗PSMA偶聯(lián)物用于診斷、顯現(xiàn)、監(jiān)測(cè)或治療與PSMA過表達(dá)有關(guān)的癌癥或其他狀況的方法。PSMA抗體及其功能性片段
根據(jù)本文所述實(shí)施方式，本文提供了 PSMA抗體或功能性PSMA抗體片段。PSMA抗體或功能性抗體片段是包含免疫球蛋白或免疫球蛋白相關(guān)分子的一個(gè)或多個(gè)部分的分子，其特異性結(jié)合PSMA或與PSMA具有免疫反應(yīng)性。術(shù)語修飾抗體包括但不限于遺傳改造形式或其他修飾形式的免疫球蛋白，如胞內(nèi)抗體(intrabody)、嵌合抗體、全人抗體、人源化抗體和雜合抗體(例如，雙特異性抗體、雙抗體、三抗體和四抗體)。術(shù)語功能性抗體片段包含抗體的一個(gè)或多個(gè)單獨(dú)或與其他分子組合的抗原結(jié)合片段，包括但不限于Fab’、F(ab’)2、Fab、Fv、rIgG、scFv 片段、單區(qū)(single domain)片段、肽抗體(peptibodies)、微抗體和 cys-雙抗體。術(shù)語scFv指單鏈Fv抗體,其中傳統(tǒng)二鏈抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)已結(jié)合形成一條鏈。在一個(gè)實(shí)施方式中，修飾抗體或功能性抗體片段是抗PSMA微抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗PSMA抗體是J591微抗體?？筆SMA微抗體具有抗PSMA抗體片段，該抗PSMA抗體片段具有優(yōu)化的如下文所述體內(nèi)成像和生物分布藥效學(xué)性質(zhì)。“微抗體”是同型二聚體， 其中各單體是單鏈可變片段(scFv),其通過連接體如ana鉸鏈序列連接于人IgGlCH3結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，鉸鏈序列是人IgGl鉸鏈序列(EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP ;SEQ IDNO: 16)。在另一實(shí)施方式中，鉸鏈序列是人工鉸鏈序列。人工鉸鏈序列可包含人IgGl鉸鏈部分和GlySer連接序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，人工鉸鏈序列包含人IgGl鉸鏈的大約前14或15個(gè)殘基，然后是長(zhǎng)度為8、9或10個(gè)氨基酸的GlySer連接序列。在另一實(shí)施方式中，人工鉸鏈序列包含IgGl鉸鏈的大約前15個(gè)殘基，然后是長(zhǎng)度為10個(gè)氨基酸的GlySer連接序列。scFv可具有VHVL或VLVH方向，其中VHVL方向意為scFv的重鏈可變區(qū)(VH)在輕鏈可變區(qū)(VL)的上游，VLVH方向意為scFv的VL在VH的上游。如本文所用，“上游”意為朝向氨基酸的N端或核苷酸序列的5’端。VH和VL通過氨基酸連接序列彼此連接。氨基酸連接體可以是任意適當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)度。在一個(gè)實(shí)施方式中，連接體富含Gly-Ser，且長(zhǎng)度為大約15-20個(gè)氨基酸。在另一實(shí)施方式中，連接體富含Cly-Ser，且長(zhǎng)度為18個(gè)氨基酸。根據(jù)本文所述實(shí)施方式，抗PSMA微抗體各單體可由自N端至C端包含下列組分的核苷酸序列編碼(a)能夠結(jié)合PSMA的scFv序列，(b)人工鉸鏈序列，和(c)人IgG CH3序列。微抗體可由本文所述細(xì)胞、細(xì)胞系或其他適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系統(tǒng)表達(dá)。因此，信號(hào)序列可被融合至scFv的N端,從而能夠在細(xì)胞或細(xì)胞系中表達(dá)時(shí)分泌微抗體。在一些實(shí)施方式中，核苷酸序列是SEQ ID N0:1或SEQ ID NO: 2。當(dāng)由細(xì)胞或細(xì)胞系表達(dá)時(shí)，核苷酸被轉(zhuǎn)錄和翻譯為氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，表達(dá)的氨基酸序列是SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11。在另一實(shí)施方式中，提供的修飾抗體或功能性抗體片段是抗PSMA cys-雙抗體(CysDB)0 “雙抗體”包含第一多肽鏈和與第二多肽鏈，所述第一多肽鏈包含重鏈可變區(qū)(VH)，該重鏈可變區(qū)通過肽連接體連接而連接于第一多肽鏈上的輕鏈可變區(qū)(VL)(VH-VL),該肽連接體太短而不能使第一多肽鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)；所述第二多肽鏈包含輕鏈可變區(qū)(VL)，該輕鏈可變區(qū)通過肽連接體連接而連接于第二多肽鏈上的重鏈可變區(qū)VH(VL-VH)，該肽連接體太短而不能使第二多肽鏈的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)。短連接體促使第一與第二多肽鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域之間進(jìn)行鏈配對(duì)，并促進(jìn)具有兩個(gè)功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)的二聚分子組裝。因此，肽連接體可以是促進(jìn)這種組裝的任意適合長(zhǎng)度，例如，長(zhǎng)度為5至10個(gè)氨基酸。如下進(jìn)一步描述，一些cys-雙抗體可包含長(zhǎng)度為5或8個(gè)氨基酸的肽連接體?？筆SMA CysDB是同型二聚體抗體形式，其由兩個(gè)相同的單體形成，該單體包含分子量大約為55kDa的單鏈Fv (scFv)片段。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗PSMA是J591CysDB。如上述抗PSMA微抗體，本文所述抗PSMA CysDBs具有藥效學(xué)性質(zhì)優(yōu)化的抗PSMA抗體片段，其可用于體內(nèi)成像和生物分布。根據(jù)本文所述實(shí)施方式，CysDB各單體可由自N端至C端包含下列組分的核苷酸序列編碼Ca)能夠結(jié)合PSMA的scFv序列和(b)半胱氨酸尾部。CysDBs可由本文所述細(xì)胞或細(xì)胞系表達(dá)。因此，信號(hào)序列可被融合至scFv的N端，從而在細(xì)胞或細(xì)胞系中表達(dá)時(shí)能分泌微抗體。在一些實(shí)施方式中，核苷酸序列是SEQ IDNO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO:9。當(dāng)由細(xì)胞或細(xì)胞系表達(dá)時(shí)，核苷酸被轉(zhuǎn)錄和翻譯為氨基酸序列。在一些實(shí)施方式中，表達(dá)的氨基酸序列是SEQID NO: 12,SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 15。根據(jù)一些實(shí)施方式，CysDB scFv序列類似于微抗體scFv序列,上述scFv。因此， scFv可具有VHVL或VLVH方向，其中VHVL方向意為scFv的重鏈可變區(qū)(VH)在輕鏈可變區(qū)(VL)的上游，VLVH方向意為scFv的VL在VH的上游。抗體可變區(qū)如上所述通過GlySer連接體被連接在一起。半胱氨酸尾部(Gly-Gly-Cys)被添加在C端。該半胱氨酸尾部使雙抗體復(fù)合形成共價(jià)半胱氨酸鍵，并為功能性部分如放射標(biāo)記的位點(diǎn)特異性結(jié)合的可用硫殘基提供選擇。多種CysDBs已被成功地從抗不同目標(biāo)的不同親本抗體改造，包括CEA、Her2(曲妥珠單抗(trastuzumab)/ 赫賽汀(Herceptm ;)、PSCA 和 CD20 (利妥昔單抗(rituximab)/ 美羅華(Rituxan ))。CysDB形式的不同變化已經(jīng)用四種特定形式評(píng)價(jià)，證明關(guān)于結(jié)合和表達(dá)水平的最大前景。對(duì)于各個(gè)單獨(dú)的抗體，重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)以不同方式結(jié)合。因此，不同連接體長(zhǎng)度的應(yīng)用允許確保二硫鍵形成的構(gòu)象靈活性和運(yùn)動(dòng)范圍。在一些實(shí)施方式中，兩種連接體長(zhǎng)度變體具有5氨基酸連接體或8氨基酸連接體?？衫脙蓚€(gè)方向(VL-連接體-VH-Cys尾部和VH-連接體-VL-Cys尾部)開發(fā)各連接體長(zhǎng)度的變體，以確保實(shí)現(xiàn)適當(dāng)?shù)恼郫B和穩(wěn)定性。根據(jù)一些實(shí)施方式，可用于本文所述方法的四種CysDB變體已被構(gòu)建VH5VL、VH8VL、VL5VH和VL8VH (參見圖6_9)。雖然各CysDB變體已被成功表達(dá)，但結(jié)果可能取決于所用親本抗體而變化。生成全部四種變體和測(cè)試全部四種變體的表達(dá)和結(jié)合確保鑒定到各新型CysDB蛋白質(zhì)生成的最佳形式。評(píng)價(jià)變體組對(duì)于確保生成二硫橋可用的高品質(zhì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)是重要的。因此，改造CysDB試劑實(shí)際上涉及利用兩種不同的連接體長(zhǎng)度，而非一種——如在微抗體中；和兩種可變區(qū)方向，VH/VL和VL/VH。在一些實(shí)施方式中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(例如，CHO-Kl細(xì)胞系)可被用作表達(dá)系統(tǒng)以生成本文所述微抗體、cys-雙抗體或其他抗體片段。但是，由于本文所述微抗體、cys-雙抗體和其他抗體片段是非糖基化的，不需要細(xì)胞系或表達(dá)——哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，因此無需翻譯后修飾。因此，多種哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)可根據(jù)本公開實(shí)施方式用于生成PSMA抗體片段(例如，抗PSMA微抗體和cys-雙抗體)，包括但不限于哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)(例如，CHO-Kl細(xì)胞)、細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)(例如，大腸桿菌(E. Coli)、枯草芽孢桿菌(B. subtilis))酵母菌表達(dá)系統(tǒng)(例如，畢赤酵母(Pichia),釀酒酵母(S. cerevisiae))或任何其他已知表達(dá)系統(tǒng)。如下文實(shí)施例詳細(xì)描述，在CHO-Kl細(xì)胞中制成和表達(dá)了區(qū)別在于svFv區(qū)的四種微抗體變體。通過ELISA和流式細(xì)胞術(shù)證明了特異性結(jié)合PSMA。其中一種高表達(dá)和PSMA結(jié)合的變體(J591HC VHVL)被選擇用于蛋白質(zhì)生成、純化和進(jìn)一步評(píng)價(jià)。J591HC VHVL微抗體的蛋白質(zhì)生成成功按比例增加，以生成足以用于下文所述內(nèi)化和微PET成像實(shí)驗(yàn)的量。J591微抗體的共焦顯微鏡研究顯示在CWR22rvl和LNCaP細(xì)胞中的胞內(nèi)染色隨時(shí)間增加，類似于完整huJ59 ImAb，這表明J591微抗體進(jìn)行了迅速內(nèi)化。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)J591微抗體的內(nèi)化，利用兩種放射標(biāo)記策略用1-131放射性碘標(biāo)記和DOTA結(jié)合以用于In-Ill放射性金屬標(biāo)記。111In-DOTA J591微抗體顯示細(xì)胞相關(guān)放射活性經(jīng)過3小時(shí)時(shí)間增加260%。相反，mI_J591微抗體的初始細(xì)胞結(jié)合隨后為達(dá)到初始活性80%的顯著喪失。J591微抗體在結(jié)合PSMA+細(xì)胞系CWR22rvl和LNCaP后迅速內(nèi)化。對(duì)于mI標(biāo)記的J591微抗體，總細(xì)胞相關(guān)放射活性隨時(shí)間減少，表明標(biāo)記的損失有可能歸因于131I_J591微抗體的脫鹵和/或迅速代謝和從細(xì)胞釋放。相反，mIn-D0TA-J591微抗體的總細(xì)胞相關(guān)放射活性隨時(shí)間顯著增加( 2. 5倍)，這與俘獲在溶酶體中的殘留標(biāo)記一致。基于總細(xì)胞相關(guān)放射活性隨時(shí)間的維持，殘留111In-DOTA放射標(biāo)記策略呈現(xiàn)為內(nèi)化PSMA抗原的適當(dāng)體內(nèi) 成像方法?？筆SMA衍生物和偶聯(lián)物在一些實(shí)施方式中，PSMA抗體或功能性抗體片段可包括經(jīng)修飾的抗體衍生物。例如，抗體衍生物包括但不限于，通過糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、已知保護(hù)/封閉基團(tuán)衍生化、蛋白質(zhì)水解切割和連接細(xì)胞配體或其他蛋白質(zhì)修飾的抗體。多種化學(xué)修飾中任一種可通過已知技術(shù)進(jìn)行，包括但不限于，特異性化學(xué)切割、乙?；?、甲?；鸵旅顾卮x合成。此外，衍生物可含有一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸。在其他實(shí)施方式中，PSMA抗體或功能性抗體片段可結(jié)合(偶聯(lián))至另一種物質(zhì)，形式抗PSMA偶聯(lián)物。本文所述抗PSMA偶聯(lián)物可通過已知的連接抗體與脂質(zhì)、碳水化合物、蛋白質(zhì)或其他原子和分子的方法制備。一方面，抗PSMA偶聯(lián)物利用適當(dāng)?shù)倪B接體或鍵通過位點(diǎn)特異性結(jié)合形成。位點(diǎn)特異性結(jié)合更可能保持抗體或功能性抗體片段的結(jié)合活性。物質(zhì)可通過二硫鍵形成結(jié)合或連接在還原性抗體組分或抗體片段的鉸鏈區(qū)。例如，在scFv片段C端引入半胱氨酸殘基，如在上述雙抗體中引入的半胱氨酸殘基，允許與多種試劑在遠(yuǎn)離抗原結(jié)合位點(diǎn)的位點(diǎn)進(jìn)行位點(diǎn)特異性巰基反應(yīng)性偶聯(lián)?；蛘撸糜谛纬煽筆SMA偶聯(lián)物的其他連接體或鍵可包括但不限于，共價(jià)鍵、非共價(jià)鍵、硫連接體、腙連接體、肼連接體、酯連接體、酰胺基連接體和氨基連接體、亞氨基連接體、縮氨硫脲連接體、縮氨基脲連接體、廂連接體以及碳-碳連接體。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗PSMA偶聯(lián)物可包含結(jié)合于診斷劑的PSMA抗體或功能性PSMA抗體片段?！霸\斷劑”是可用于診斷、檢測(cè)或顯現(xiàn)疾病的原子、分子或化合物。根據(jù)本文所述實(shí)施方式，診斷劑可包括但不限于，放射性物質(zhì)(例如，放射性同位素、放射性核素、放射標(biāo)記或放射性示蹤劑)、染料、造影劑、熒光化合物或分子、生物發(fā)光化合物或分子、酶和增強(qiáng)劑(例如，順磁離子)。此外，應(yīng)當(dāng)注意的是，一些納米顆粒，例如量子點(diǎn)和金屬納米顆粒(下文所述)也可適用作檢測(cè)劑。根據(jù)本公開的實(shí)施方式，可被用作診斷劑的放射性物質(zhì)包括但不限于18F、32P、33P、45Ti、47Sc、52Fe、59Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、75Sc、77As、86Y、90Y。89Sr、89Zr、94Tc、94Tc、99mTc、"Mo, 105Pd, 105Rh, 111Ag, 111In, 1231 , 1241 , 1251 , 131 1 , 142Pr, 143Pr, 149Pm, 153Sm, 154^1581Gd, 161Tb, 166Dy,166Ho,169Er,175Lu,177Lu,186Re,188Re,189Re,194Ir,198Au,199Au,211At,211Pb,212Bi,212Pb,213Bi,223Ra 和225Ac0根據(jù)本公開的實(shí)施方式可被用作診斷劑的順磁離子包括但不限于，過渡金屬離子和鑭系金屬離子(例如具有原子數(shù)6至9、21-29、42、43、44或57-71的金屬)。這些金屬包括Cr、V、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb 和 Lu 離子。當(dāng)診斷劑是放射性金屬或順磁離子時(shí)，該劑可與具有長(zhǎng)尾部的試劑發(fā)生反應(yīng)，該試劑的一個(gè)或多個(gè)螯合基團(tuán)連接于長(zhǎng)尾部以結(jié)合這些離子。長(zhǎng)尾部可以是聚合物，如聚賴氨酸、多糖或具有可結(jié)合螯合基團(tuán)以結(jié)合離子的側(cè)基的其他衍生鏈或可衍生鏈?？筛鶕?jù)本公開應(yīng)用的螯合基團(tuán)的實(shí)例包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、DOTA, NOTA, NETA、卩卜啉、多胺、冠醚、二硫縮氨基脲、多肟及類似基團(tuán)。通常使螯合物通過能與分子形成鍵并且免疫反應(yīng)性損失最小和聚集和/或內(nèi)部交聯(lián)最少的基團(tuán)連接于PSMA抗體或功能性抗體片段。同樣的螯合物當(dāng)與非放射性金屬如錳、鐵和釓絡(luò)合時(shí)，在 與本文所述抗體和載體一起使用時(shí)可用于MRI。大環(huán)螯合物如N0TA、D0TA和TETA可分別與多種金屬和放射性金屬一起應(yīng)用，該放射性金屬包括但不限于鎵、釔和銅的放射性核素?？蓱?yīng)用其他環(huán)形螯合物如大環(huán)聚醚，其令人感興趣的在于穩(wěn)定結(jié)合核素如用于RAIT的223Ra。在某些實(shí)施方式中，螯合部分可用于使PET成像劑如Al-18F復(fù)合物連接到目標(biāo)分子以用于PET分析。根據(jù)本公開的實(shí)施方式可被用作診斷劑的造影劑包括但不限于泛影酸鋇、乙碘油、檸檬酸鎵、碘卡酸、碘西他酸、碘達(dá)胺、膽影酸、碘沙酸、碘古酰胺(iogulamide)、異己基、碘帕醇、碘番酸、碘普西酸(ioprocemic acid)、碘西法酸、碘絲酸、碘砜葡胺、碘琥酸(iosemetic acid)、碘酞硫(iotasul)、碘得酸、碘拉酸、碘出酸、碘克沙酸(ioxaglicacid)、輕泛影酸(ioxotrizoic acid)、胺碘苯丙酸、甲基葡胺、甲泛葡胺、甲泛影鹽(metrizoate)、丙碘酮、氯化銘或其組合。根據(jù)本公開的實(shí)施方式可被用作診斷劑的生物發(fā)光和熒光化合物或分子和染料包括但不限于熒光素、異硫氰酸熒光素(FITC)、Oregon Green. TM.、若丹明、德克薩斯紅、異硫氰酸四若丹明(TRITC)、Cy3、Cy5等)、熒光標(biāo)記物(例如、綠色熒光蛋白(GFP)、藻紅蛋白等)、由腫瘤相關(guān)蛋白酶激活的自動(dòng)猝滅的熒光化合物、酶(例如、熒光素酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等)、納米顆粒、生物素、地高辛或其組合。根據(jù)本公開的實(shí)施方式可被用作診斷劑的酶包括但不限于辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、3 -半乳糖苷酶、3 -葡萄糖醛酸酶或3 -內(nèi)酰胺酶。這種酶可與色原、熒光化合物或發(fā)光化合物聯(lián)合用于生成可檢測(cè)信號(hào)。在另一實(shí)施方式中，抗PSMA偶聯(lián)物可包含結(jié)合(偶聯(lián))于治療劑的PSMA抗體或功能性PSMA抗體片段。本文所用“治療劑”是可用于治療與PSMA相關(guān)的癌癥或其他狀況的原子、分子或化合物。治療劑的實(shí)例包括但不限于藥物、化療劑、治療性抗體和抗體片段、毒素、放射性同位素、酶(例如，在腫瘤部位將前體藥物分解為細(xì)胞毒性劑的酶)、核酸酶、激素、免疫調(diào)節(jié)劑、反義寡核苷酸、螯合劑、硼化合物、光活性劑和染料?；焺┍举|(zhì)上通常具有細(xì)胞毒性或細(xì)胞抑制性，并可包括烷化劑、抗代謝物、抗腫瘤抗生素、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、有絲分裂抑制劑激素治療、靶向治療劑和免疫治療劑。在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本公開的實(shí)施方式可被用作診斷劑的化療劑包括但不限于13-順式-維甲酸、2-氯脫氧腺苷、5-阿扎胞苷、5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、放線菌素-D、阿霉素、阿德斯白細(xì)胞、阿侖珠單抗(alemtuzumab)、阿利維甲酸(alitretinoin)、全反式維甲酸、a干擾素、六甲蜜胺、氨甲蝶呤(amethopterin)、阿米福汀(amifostine)、阿那格雷(anagrelide)、阿那曲唑(anastrozole)、阿糖胞苷(arabinosylcytosine)、三氧化二砷、苯胺吖啶、氨基喜樹堿、氨基格魯米特、天冬酰胺酶、氮雜胞苷、卡介苗(BCG)、苯達(dá)莫司汀(bendamustine)、貝伐單抗(bevacizumab)、稽薩羅丁(bexarotene)、比卡魯胺(bicalutamide)、硼替佐米(bortezomib)、博萊霉素、白消安、四氫葉酸I丐、嗜橙菌因子、卡培他濱(capecitabine)、卡奈替尼(canertinib)、卡波鉬(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、西妥昔單抗(cetuximab)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、順鉬、克拉屈濱(cladribine)、可的松、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、達(dá)貝泊汀a (darbepoetin alfa)、達(dá)沙替尼((1&83七[11；[13)、道諾霉素、地西他濱((16(3；^313；[116)、地尼白介素(denileukin diftitox)、地塞米松、dexasone、右雷佐生(dexrazoxane)、放線菌素D、柔紅霉素(daunorubicin)、氨烯咪胺、多西他奇(docetaxel)、亞德里亞霉素、脫氧氟尿苷、恩尿啼卩定(eniluracil)、表柔比星(epirubicin)、依泊汀a (epoetin alfa)、厄洛替尼(erlotinib)、依維莫司(everolimus)、依西美坦(exemestane)、雌氮芥、依托泊式、非格司亭(filgrastim)、氟 甲睪酮(fluoxymesterone)、氟維司群(fulvestrant)、黃酮卩比醇(fIavopiridol)、氟尿苷(floxuridine)、氟達(dá)拉濱(fludarabine)、氟尿啼卩定、氟他胺(flutamide)、吉非替尼(gefitinib)、吉西他濱(gemcitabine)、奧吉妥珠單抗(gemtuzumab ozogamicin)、戈舍瑞林(goserelin)、粒細(xì)胞集落剌激因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落剌激因子、六甲基三聚氰胺、氫化可的松羥基脲、替伊莫單抗(ibritumomab)、干擾素a、白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-11、異維甲酸、伊沙匹隆(ixabepilone)、伊達(dá)比星(idarubicin)、甲磺酸伊馬替尼(imatinibmesylate)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、依立替康(irinotecan)、拉帕替尼(Iapatinib)、來那度胺(lenal idomide)、來曲唑(Ietrozole )、亞葉酸、亮脯利特(leuprol ide)、脂質(zhì)體Ara-C、洛莫司汀(lomustine)、氮芥、甲地孕酮(megestrol )、美法侖(melphalan)、巰基_呤、美司鈉(mesna)、氨甲噪呤(methotrexate)、甲基潑尼松龍(methylprednisolone)、絲裂霉素C、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(111；[丨01311丨1'0116)、奈拉濱(11613以13；[116)、尼魯米特、奧曲肽(octreotide)、奧普瑞白介素(oprelvekin)、奧沙利鉬(oxaliplatin)、紫杉醇、帕米膦酸鈉(pamidronate)、培美曲塞(pemetrexed)、帕尼單抗(panitumumab)、PEG干擾素、培加帕酶(pegaspargase)、聚乙二醇非格司亭(pegfilgrastim)、PEG-L-天冬酰胺酶、噴司他丁(pentostatin)、光輝霉素、潑尼松龍、潑尼松、甲基節(jié)肼(procarbazine)、雷洛昔芬(raloxifene)、利妥昔單抗、羅米司亭(romiplostim)、雷替曲塞(ralitrexed)、沙帕他濱(8&口8(3；[七&13；[116)、沙莫司亭(8&作以11108七;[111)、沙鉬(satraplatin)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、司莫司汀(semustine)、鏈脲霉素(streptozocin)、它莫西芬(tamoxifen)、替加氟(tegafur)、替加氟-尿啼唳、坦西莫司(temsirolimus)、替莫唑胺(temozoIamide)、替尼泊式(teniposide)、薩立多胺(thalidomide)、硫鳥票呤、噻替派(七11；
，但 124I_J591 微抗體呈現(xiàn)迅速的背景清除，導(dǎo)致較高的對(duì)比度圖像。兩種放射性標(biāo)記的微抗體在第19小時(shí)類似的腫瘤攝取是預(yù)料之外的，并且暗示了較慢的體內(nèi)內(nèi)化。因此，1-124放射性標(biāo)記的J591微抗體是有效檢測(cè)PSMA陽性細(xì)胞的示蹤劑。治療癌癥的方法在一些實(shí)施方式中，提供了治療與PSMA過表達(dá)有關(guān)的癌癥或其他病癥的方法。這種方法包括向個(gè)體給予治療有效量的包含上述PSMA抗體或功能性PSMA抗體片段的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，PSMA抗體或功能性PSMA抗體片段是微抗體或CysDB，衍生自J591抗體，如本文所述那些J591微抗體和J591CysDBs。病癥的“治療”或“醫(yī)療”可指預(yù)防病癥，減緩發(fā)病或病癥發(fā)展速度，減少發(fā)生病癥的危險(xiǎn)，預(yù)防或延緩與癌癥有關(guān)的癥狀發(fā)生，減少或終止與癌癥有關(guān)的癥狀，廣生病癥的完全或部分消退或其一些組合?！爸委熡行Я俊被颉爸委熜杂行┝俊笔腔衔镌趥€(gè)體中產(chǎn)生期望治療效果如預(yù)防或治療目標(biāo)病癥或減輕與病癥有關(guān)的癥狀的量。精確的治療有效量是組合物在給定個(gè)體中在治療效力方面產(chǎn)生最大有效效果的量。該量將取決于多種因素而改變，包括但不限于治療性化合物的特性(包括活性、藥物動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)和生物利用度)、個(gè)體生理?xiàng)l件(包括年齡、性別、疾病類型和階段、總體身體狀況、對(duì)給定劑量的應(yīng)答和藥物類型)、制劑中藥學(xué)可接受的載體或多種載體的性質(zhì)和給藥途徑。臨床和藥理學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)法一即通過監(jiān)測(cè)個(gè)體對(duì)化合物給予的應(yīng)答和由此調(diào)整劑量一 確定治療有效量。對(duì)于另外的指導(dǎo)，參見Remington:The Science and Practice ofPharmacy 第 21 版，Univ. of Sciences inPhiladelphia (USIP), Lippincott Williams &Wilkins,Philadelphia, PA, 2005。在一個(gè)實(shí)施方式中，藥物組合物可包含治療性抗PSMA偶聯(lián)物，其中該偶聯(lián)物包含結(jié)合至一種或多種上述治療劑的PSMA抗體或功能性PSMA抗體片段。在一個(gè)實(shí)施方式中，PSMA抗體或功能性PSMA抗體片段是微抗體或CysDB，衍生自J591抗體，如本文所述那些J591微抗體和J591CysDBs。例如，本文所述J591微抗體或cys-雙抗體可用于放射免疫治療法，其中一個(gè)或多個(gè)3B J591微抗體用適當(dāng)?shù)?發(fā)射放射標(biāo)記如釔-90進(jìn)行放射標(biāo)記。放射標(biāo)記的3B J591微抗體或多個(gè)微抗體可用于向表達(dá)PSMA的局部癌組織輸送細(xì)胞損傷和死亡。進(jìn)一步，對(duì)放射標(biāo)記的J591微抗體和雙抗體的應(yīng)用有可能呈現(xiàn)相對(duì)于放射標(biāo)記的全長(zhǎng)親本huJ591抗體改善的腫瘤滲透。治療性抗PSMA偶聯(lián)物可與本文所述一種或多種另外的物質(zhì)結(jié)合或締合，如診斷性抗PSMA偶聯(lián)物(上文所述)、未結(jié)合的診斷劑、造影液、載體脂質(zhì)或納米顆粒。在一些實(shí)施方式中，藥物組合物還可包含藥學(xué)可接受的載體。藥學(xué)可接受的載體可以是涉及從一個(gè)組織、器官或身體部分向另一個(gè)組織、器官或身體部分?jǐn)y帶或運(yùn)輸目標(biāo)化合物的藥學(xué)可接受的物質(zhì)、組合物或介質(zhì)。例如，載體可以是液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或封裝材料或其一些組合。載體各組分必須是“藥學(xué)可接受的“，因?yàn)槠浔仨毰c制劑中的其他成分相容。其還必須適于接觸其可能碰到的任何組織、器官或身體部分，意思是其必須不攜帶過度超過其治療效益的毒性、刺激、過敏反應(yīng)、免疫原性或任何其他并發(fā)癥的危險(xiǎn)。本文所述藥物組合物可通過任何適當(dāng)?shù)慕o藥途徑給予。給藥途徑可指本領(lǐng)域中已知的任何給藥途徑，包括但不限于氣溶膠、腸內(nèi)、鼻腔、眼部、口腔、胃腸外、直腸、經(jīng)皮(例如、局部霜?jiǎng)┗蚋鄤?、貼劑)或陰道。“經(jīng)皮”給予可用局部霜?jiǎng)┗蚋鄤┗蚪柚诮?jīng)皮貼劑實(shí)現(xiàn)。“胃腸外”指一般與注射相關(guān)的給藥途徑，包括眶下、輸注、動(dòng)脈內(nèi)、囊內(nèi)、心臟內(nèi)、皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)、脊柱內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、子宮內(nèi)、靜脈內(nèi)、蛛網(wǎng)膜下、囊下、皮下、經(jīng)粘膜或經(jīng)氣管途徑。下列實(shí)施例意欲為示例本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方式。因此，所述具體實(shí)施方式
不被解釋為限制本發(fā)明的范圍。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可進(jìn)行多種等同形式、改變和修正而沒有脫離本發(fā)明的范圍，并且要理解的是，這種等同實(shí)施方式將在此被包含在內(nèi)。進(jìn)一步，在本公開引用的所有參考文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考，如同本文對(duì)其進(jìn)行了完整敘述。實(shí)施例I :生成J591微抗體J591微抗體構(gòu)建物。第三代J591微抗體是整合全長(zhǎng)親本huJ591抗體的修飾可變區(qū)的改造抗體片段。該微抗體形式是同型二聚體，其中各單體是連接人IgGlCH3區(qū)的單鏈可變片段(scFv)(圖1A)。scFv可具有VHVL或VLVH方向。如圖IB所示，具有VHVL方向的scFv的J591微抗體表達(dá)構(gòu)建物具有重鏈可變(VH)區(qū)，其通過18氨基酸連接體(L)序列連接輕鏈可變(VL)區(qū)。在VLVH方向，在圖IB中VL和VH將轉(zhuǎn)換，以使VL區(qū)在VH區(qū)的上游。合成四種J591微抗體序列，用于下文所述表達(dá)研究如下構(gòu)建的微抗體序列 I) VHVL 方向的 J591 人復(fù)合體(HC) (J591HC VHVL ;SEQ ID N0:1)；2) VLVH 方向的 J591 人復(fù)合體(HC) (J591HC VLVH)；3)乂111^方向、2個(gè)脯氨酸置換(2 )的邗91 (J5912P VHVL ;SEQ ID NO:2) -M4)^11方向、2個(gè)脯氨酸置換(2 )的了591 (J5912P VLVH)。圖3顯示J591HC VHVL微抗體的序列(SEQ ID NO: 1)，圖4顯示J5912PVHVL微抗體的序列(SEQ ID NO: 2)。18個(gè)氨基酸的連接體(L)具有特定的序列——富含GlySer殘基(參見圖I，序列參見圖3和4)。scFv通過人工鉸鏈序列連接于人IgGlCH3區(qū)，該人工鉸鏈序列其中前15個(gè)殘基是人IgGl鉸鏈部的殘基，然后是10個(gè)氨基酸GlySer連接序列(參見圖1，序列參見圖3和4)。該特定鉸鏈序列也已被成功整合到之前的微抗體中。微抗體(VH-VL-CH3或VL-VH-CH3方向)由于CH3區(qū)之間的締合和鉸合區(qū)中二硫鍵的形成而以穩(wěn)定的二聚體存在。為能分泌微抗體，K輕鏈信號(hào)序列引導(dǎo)表達(dá)構(gòu)建體，并使其融合在重鏈可變區(qū)N端(參見圖1B，序列參見圖3和4)。通過在親本huJ591重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)中進(jìn)行氨基酸置換改造J591微抗體組。全長(zhǎng)親本huJ591可變區(qū)的序列分析確定了異常多的構(gòu)象限制性脯氨酸殘基，其被確認(rèn)為減少蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的靈活性。去免疫J591 (SEQ ID NO:5 ；SEQ ID NO: 19)與原鼠J591(SEQ ID NO:4 ；SEQ ID NO: 18)之間的序列比對(duì)比較表明，去免疫過程引入另外的脯氨酸殘基(參見圖2)。經(jīng)序列和蛋白建模分析后，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行兩種改變，以提高靈活性和折疊能力。第一，將輕鏈可變區(qū)的兩個(gè)脯氨酸殘基(P42Q和P100A)變?yōu)槭笮蛄兄邪l(fā)現(xiàn)的殘基(參見圖2，下文被稱為2P)。第二，利用人復(fù)合(HC)抗體技術(shù)(Antitope)計(jì)算兩可變區(qū)的置換，該人復(fù)合(HC)抗體技術(shù)通過避免潛在表位而非破壞表位使序列去免疫(參見圖2，下文被稱為HC)。J591微抗體的表達(dá)。生成上述四種微抗體序列中每一種的表達(dá)載體。將四種微抗體序列的每一種克隆到用于哺乳動(dòng)物表達(dá)的pcDNA3. l/myc-His(_) A版載體(Invitrogen,Inc.)中相應(yīng)的Xbal/Hindlll位點(diǎn)。pcDNA3. I表達(dá)載體的特征在于哺乳動(dòng)物表達(dá)的CMV啟動(dòng)子和哺乳動(dòng)物(新霉素)和細(xì)菌(氨芐青霉素)的選擇標(biāo)記物(參見圖10)。將四種J591微抗體表達(dá)載體暫時(shí)轉(zhuǎn)染到CHO-Kl細(xì)胞中，以確認(rèn)J591微抗體的表達(dá)。轉(zhuǎn)染利用Lipofectamine試劑以6孔板形式進(jìn)行。72小時(shí)轉(zhuǎn)染后,收集和過濾上清液，以去除任何細(xì)胞。為確定J591微抗體由CHO-Kl細(xì)胞表達(dá)，用取自瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的上清液樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析?？蛰d體轉(zhuǎn)染的上清液被包含作為陰性對(duì)照，不同微抗體轉(zhuǎn)染的上清液被用作陽性對(duì)照。將轉(zhuǎn)染上清液進(jìn)行SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用結(jié)合堿性磷酸酶(AP)的抗人IgG (Fe-特異性)抗體探測(cè)該膜，并通過用AP底物BCIP/NBT溫育而使其顯影。圖11是確定J591微抗體表達(dá)的多個(gè)實(shí)驗(yàn)的代表性印跡。在非還原條件下，J591微抗體以大約90kD的預(yù)期分子量運(yùn)行(圖11)。表示單體形式的較小帶也在大約40kD被檢測(cè)到。進(jìn)行定量ELISA以分析瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的J591微抗體表達(dá)。ELISA是夾心分析，其將山羊抗人IgG (Fe特異性)用作捕捉抗體和將AP結(jié)合的山羊抗人IgG (Fe特異性)用作檢測(cè)抗體。之前生成的微抗體的純化蛋白質(zhì)被用作標(biāo)準(zhǔn)品。連續(xù)稀釋J591微抗體上清液，找到適于標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍的稀釋點(diǎn)。利用程序SoftMax Pro插入根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線未知的濃度。分析多個(gè)轉(zhuǎn)染的上清液，并且平均值展示在圖25中。J591HC VHVL微抗體呈現(xiàn)第 三代微抗體中的最高表達(dá)(6. 7ug/ml)。J591微抗體的結(jié)合能力。為確定J591微抗體結(jié)合細(xì)胞PSMA的能力，通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析上述瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的上清液。如圖12A-12D所示，測(cè)試各J591微抗體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的上清液的結(jié)合PSMA陽性(PSMA+)的LNCaP細(xì)胞(2)，并與PSMA陰性的陰性對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行比較。所有上清液被標(biāo)準(zhǔn)化至2. lug/ml的J591微抗體濃度。隨后細(xì)胞用二級(jí)抗人IgG (Fe特異性)_PE結(jié)合的抗體染色。陰性對(duì)照細(xì)胞僅用二級(jí)抗人IgG (Fe特異性)抗體染色(I)。I X IO5個(gè)細(xì)胞/點(diǎn)，且以10，000事件/點(diǎn)進(jìn)行分析。用J591微抗體染色的各細(xì)胞群證實(shí)了信號(hào)相對(duì)于陰性對(duì)照細(xì)胞顯著增加(參見圖12)。J591微抗體上清液沒有顯著染色陰性對(duì)照PC3細(xì)胞(PSMA陰性)(數(shù)據(jù)未顯示)。全部四種微抗體顯示對(duì)LNCaP細(xì)胞的相當(dāng)結(jié)合親和力(參見圖12)。實(shí)施例2 :穩(wěn)定的細(xì)胞系群基于上述表達(dá)和結(jié)合數(shù)據(jù)，將J591人復(fù)合VHVL(HC VHVL)微抗體選作主要候選以推進(jìn)至較大規(guī)模r低毫克量)蛋白質(zhì)生產(chǎn)，用于下文所述的后續(xù)體內(nèi)成像研究。雖然下文所述實(shí)施例對(duì)J591HC VHVL微抗體特異，但要注意的是，本文所述任何J591微抗體或cys-雙抗體均可被純化和用于類似研究。用新霉素作為選擇標(biāo)記物將J591HC VHVL微抗體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到CHO-Kl細(xì)胞中。選擇高表達(dá)克隆后，以大約36mg/L (經(jīng)過4天培養(yǎng))選擇表達(dá)J591微抗體的克隆用于大規(guī)模生產(chǎn)。蛋白質(zhì)生產(chǎn)運(yùn)行。為生成至少IOmg最終純化的蛋白質(zhì),將穩(wěn)定的細(xì)胞系擴(kuò)大至400ml生產(chǎn)運(yùn)行(在2%FBS介質(zhì))。將細(xì)胞接種到8個(gè)T175燒瓶中，并持續(xù)生產(chǎn)運(yùn)行7天。蛋白質(zhì)純化。在生產(chǎn)運(yùn)行結(jié)束時(shí)，收集上清液，將其旋轉(zhuǎn)以去除任何細(xì)胞，并用0. 2um過濾裝置過濾。用蛋白L親和層析從上清液純化J591微抗體。裝載后，將柱用PBS(pH=7. 2)洗漆,并用IgG洗脫緩沖液(Pierce, Thermo Scientific)將微抗體從柱洗脫。立即用IM Tris緩沖液(pH=8)中和洗脫部分。將最終的洗過部分濃縮，并緩沖交換到最終的PBS 制劑(pH=7. 2)中。純化的蛋白質(zhì)分析。純化后，利用280A下的UV吸光度計(jì)算J591微抗體蛋白的最終濃度。吸光系數(shù)為I. 76 (吸光單位為A280下每mg/ml)。最終的蛋白質(zhì)濃度為I. 06mg/ml o為分析J591微抗體的純度，蛋白質(zhì)通過SDS-PAGE在非還原和還原條件下運(yùn)行。在非還原的條件下，微抗體被檢測(cè)到在大約85kDa (圖13)。相對(duì)小的拖尾(smear)存在于85kDa帶,其可表示少量降解。大約40kDa小帶表示微抗體單體。在還原條件下,微抗體被檢測(cè)到為約40kDa的單體形式(圖13)。為檢測(cè)裝配微抗體復(fù)合物的純度，通過尺寸排阻層析分析蛋白質(zhì)。通過SEC分析4微克純化蛋白(圖14)。主峰相應(yīng)于微抗體同型二聚體。在早期時(shí)間點(diǎn)洗脫的兩個(gè)小峰表示較大的聚集蛋白。峰下面積的分析顯示85%的蛋白質(zhì)產(chǎn)物相對(duì)于15%的聚集體以適當(dāng)?shù)奈⒖贵w同型二聚體存在。實(shí)施例3 J591微抗體結(jié)合PSMA+細(xì)胞并被PSMA+細(xì)胞內(nèi)化通過Catalent專有GPEx技術(shù)利用無血清CHO-S細(xì)胞的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)生成高表達(dá)穩(wěn) 定細(xì)胞庫。利用離子交換層析，以足夠高純度從細(xì)胞上清液純化J591微抗體，用于下游實(shí)驗(yàn)。通過SDS-PAGE和SEC分析確定產(chǎn)物高純度(>85%純度)。純化的蛋白質(zhì)不具有任何顯著的生物負(fù)載(0 cfu/ml)，和具有相對(duì)低的內(nèi)毒素水平(8至16EU/mg)。此生產(chǎn)運(yùn)行批次的總產(chǎn)量為65mg J591微抗體蛋白。功能性ELISA。為確定J591微抗體蛋白結(jié)合純化的PSMA的能力，利用純化的重組PSMA進(jìn)行間接ELISA。實(shí)驗(yàn)中包括陰性對(duì)照微抗體。在2 u g/ml的初始濃度下，J591微抗體以飽和狀態(tài)結(jié)合重組PSMA (參見圖15)。隨后連續(xù)稀釋J591微抗體顯示出濃度依賴性結(jié)合(參見圖15)。如預(yù)期，陰性對(duì)照微抗體不結(jié)合PSMA (參見圖15)。流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)。在ELISA中成功結(jié)合重組PSMA后，通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)測(cè)試J591微抗體蛋白結(jié)合PSMA+細(xì)胞的能力。全長(zhǎng)hJ591抗體被包含在實(shí)驗(yàn)中作為陽性對(duì)照(數(shù)據(jù)未顯示)，并且陰性對(duì)照微抗體也被包含在內(nèi)。在本實(shí)驗(yàn)中，PSMA+細(xì)胞是LNCaP和CWR22rvl細(xì)胞，PSMA-細(xì)胞系是PC3。J591微抗體相比起同等濃度的陰性對(duì)照微抗體明顯結(jié)合LNCaP (參見圖16A)和CWR22rvl (參見圖16C)。已知LNCaP細(xì)胞具有高于CWRs的PSMA表達(dá)，其可解釋細(xì)胞群的較高PE信號(hào)(參見圖16，上排相對(duì)于下排)。如預(yù)期，J591微抗體不顯著結(jié)合PC3細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)。在此流式細(xì)胞計(jì)量分析前，使J591微抗體蛋白結(jié)合雙功能性螯合劑1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N，N’，N"，N"，-四乙酸(D0TA)，準(zhǔn)備用于下游放射性金屬標(biāo)記。利用水溶性N-羥基琥珀酰亞胺方法(Lewis et al 2001)實(shí)施結(jié)合。DOTA結(jié)合后，透析蛋白質(zhì)偶聯(lián)物以改變緩沖液和去除過量的D0TA。為在結(jié)合后檢驗(yàn)結(jié)合能力，通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)測(cè)試J591-D0TA微抗體與PSMA的結(jié)合。相比起未結(jié)合的J591微抗體，J591-D0TA微抗體呈現(xiàn)免疫反應(yīng)性略微降低，如細(xì)胞群的PE信號(hào)的略微改變所示(參見圖16B和16D)。已知雙功能螯合劑與抗體的過度結(jié)合是免疫反應(yīng)性降低的原因(Kukis et al 1995)。結(jié)合條件可被優(yōu)化以防止過度結(jié)合和造成的結(jié)合損失。但是，J591-D0TA微抗體結(jié)合的略微改變被認(rèn)為是可接受的，并且蛋白推進(jìn)至放射標(biāo)記。未標(biāo)記微抗體的內(nèi)化。利用免疫熒光共焦顯微鏡來檢測(cè)J591微抗體至PSMA+細(xì)胞的內(nèi)化。用于本實(shí)驗(yàn)的兩種PSMA+細(xì)胞系，LNCaP和CWR22rvl細(xì)胞系，之前已被用于細(xì)胞結(jié)合研究，并且還用于隨后的放射標(biāo)記內(nèi)化研究。PC3細(xì)胞被用作PSMA-陰性對(duì)照細(xì)胞系。全長(zhǎng)親本J591抗體被包含在實(shí)驗(yàn)中作為陽性對(duì)照。陰性對(duì)照微抗體也被包含在內(nèi)以進(jìn)一步證明PSMA+細(xì)胞中攝取J591微抗體的特異性。由于原始全長(zhǎng)J591抗體在LNCaP細(xì)胞上的之前的內(nèi)化研究顯示到180分鐘時(shí)的強(qiáng)內(nèi)化(Liu et all998)，在一級(jí)抗體溫育后t=0和t=180分鐘將細(xì)胞染色以測(cè)定內(nèi)化。通過結(jié)合Alexa 488熒光團(tuán)的二級(jí)抗人IgG抗體檢測(cè)抗體和微抗體的定位。細(xì)胞用DAPI復(fù)染，以使核染色。J591全長(zhǎng)抗體顯示在t=0時(shí)對(duì)質(zhì)膜非常鮮明和清楚的染色(參見圖17)。在37°C下溫育180分鐘后，J591全長(zhǎng)抗體內(nèi)化到LNCaP細(xì)胞中，如Alexa 488染色在整個(gè)細(xì)胞的分散所示。J591微抗體還顯示t=0時(shí)清楚的質(zhì)膜染色和到t = 180分鐘時(shí)的強(qiáng)內(nèi)化(圖17)。J591微抗體在t=0時(shí)的染色明顯不如J591全長(zhǎng)清楚，可能表明較小尺寸的微抗體在LNCaP細(xì)胞中更迅速的內(nèi)化。陰性對(duì)照微抗體在t=0時(shí)不能結(jié)合LNCaP細(xì)胞。J591全長(zhǎng)抗體和微抗體不能結(jié)合PSMA-PC3細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)。全長(zhǎng)J591抗體至CWR22rvl細(xì)胞的內(nèi)化顯示與LNCaP細(xì)胞所見非常類似的染色圖 譜。染色在t=0時(shí)對(duì)質(zhì)膜非常鮮明和清楚，并且到t=180分鐘時(shí)變得非常分散(參見圖18)。J591微抗體也被內(nèi)化到CWR22rvl中。染色在t=0時(shí)在質(zhì)膜中清楚，到t=180分鐘時(shí)變得更加分散(圖18)。如預(yù)期，陰性對(duì)照微抗體不結(jié)合CWR22rvl細(xì)胞(圖18)。實(shí)施例4 :放射標(biāo)記的PSMA特異性微抗體用碘-131放射標(biāo)記 J591 微抗體。利用 Pierce Thermo Scientific 的 Iodogen法(如Olafsen et al 2006所述)用大約50 u Ci的mI放射性標(biāo)記純化的J591微抗體蛋白(50 y g)。該試劑能發(fā)生化學(xué)氧化反應(yīng)，以使131I連接于J591微抗體的可用的酪氨酸殘基。表2是J591微抗體放射標(biāo)記結(jié)果的概括，包括放射標(biāo)記效力、純化后結(jié)合放射活性百分比和比活性。利用瞬時(shí)薄層色譜法(ITLC)測(cè)定結(jié)合蛋白質(zhì)的放射活性相對(duì)于未結(jié)合的百分比，確定放射標(biāo)記效力為約51%。(參見下表2)。通過利用劑量校準(zhǔn)器測(cè)量放射標(biāo)記蛋白質(zhì)的總活性和基于標(biāo)記效力計(jì)算比活性，確定比活性為0. 46uCi/ug (表2)。為去除多余的未結(jié)合1311，利用旋轉(zhuǎn)柱(spin column)進(jìn)一步純化放射標(biāo)記的蛋白質(zhì)。純化后結(jié)合J591微抗體的放射活性百分比在純化后顯著增加至大約96% (表2)。DOTA結(jié)合和用銦-111放射性金屬標(biāo)記J591。用111In放射標(biāo)記之前結(jié)合有雙功能性金屬螯合劑DOTA的J591微抗體。將100 u g D0TA-J591微抗體用200 u Ci111In-氯化物在0. IM無金屬乙酸銨(pH 6.0)中于43°C下溫育50分鐘。通過添加IOmM DTPA至ImM的最終濃度來終止反應(yīng)。測(cè)定放射標(biāo)記效力為大約60%，比活性為I. I ii Ci/ii g (參見表2)。利用旋轉(zhuǎn)柱進(jìn)一步純化放射標(biāo)記的蛋白質(zhì)以去除過量的未結(jié)合mIn。類似于mI_J591微抗體，純化后結(jié)合J591微抗體的放射活性百分比顯著增加至大約94% (表2)。表2.用131I和111In放射標(biāo)記J591微抗體。
放射標(biāo)記純化后的結(jié)合比活性 __效力(％)__放射活性(％)__(uCi/ug)__51%__96.2%__0.46
111In-DOTA 60%__94.2%__1.1經(jīng)放射標(biāo)記的J591微抗體的內(nèi)化和保留。測(cè)試131I標(biāo)記和111In-DOTA標(biāo)記的J591微抗體在PSMA+CWR22rvl細(xì)胞中細(xì)胞相關(guān)放射活性的攝取和保留。將CWR22rvl細(xì)胞選作這些體外實(shí)驗(yàn)的唯一 PSMA+細(xì)胞系，因?yàn)槠鋵⒈挥糜谖ET成像實(shí)驗(yàn)。鑒于文獻(xiàn)和同事的實(shí)驗(yàn)知識(shí)，CWR22rvl異種移植模型具有比LNCaP模型高的腫瘤發(fā)生率(take rate)和比LNCaP模型快的體外和腫瘤生長(zhǎng)速率。對(duì)于131I標(biāo)記的J591微抗體的攝取和保留，與膜有關(guān)的放射活性量在前30分鐘內(nèi)迅速減少，而內(nèi)化放射活性在此時(shí)間框內(nèi)迅速增加(參見圖19A)。這些數(shù)據(jù)一起表明mI-J591微抗體的內(nèi)化。雖然內(nèi)化131I J591的量隨時(shí)間增加，但總細(xì)胞相關(guān)放射活性到180分鐘時(shí)相對(duì)于 2900cpm的最初起始點(diǎn)顯著降低(參見圖19A)。與之形成鮮明對(duì)比的是，111In-DOTA標(biāo)記的J591微抗體的攝取和保留顯示總細(xì)胞相關(guān)放射活性隨時(shí)間相對(duì)大的增加(參見圖19B)。類似于131I標(biāo)記的J591微抗體，膜相關(guān) 的放射活性隨內(nèi)化放射活性增加而顯著減少，表明具有活性的內(nèi)化(參見圖19B)。很大程度上歸功于內(nèi)化放射活性隨時(shí)間的增加，總細(xì)胞相關(guān)放射活性到180分鐘時(shí)從 7’ 500cpm的起始點(diǎn)增至大約20，OOOcpm (圖19B)。為比較兩種放射標(biāo)記J591微抗體，通過以各個(gè)放射標(biāo)記分別在t=0時(shí)的初始細(xì)胞相關(guān)放射活性的百分比的形式表示數(shù)據(jù)而標(biāo)準(zhǔn)化總細(xì)胞相關(guān)放射活性(參見圖20)。到t =180分鐘時(shí)，111In-DOTA標(biāo)記的J591微抗體增至初始細(xì)胞相關(guān)放射活性的 250%，而131I標(biāo)記的J591微抗體降至初始的 80% (圖20)。如文獻(xiàn)(Vaidyanathan et al 2009)中的其他組所示，非殘留mI標(biāo)記策略導(dǎo)致細(xì)胞相關(guān)放射活性隨時(shí)間總體減少。這些數(shù)據(jù)明確表明，殘留111In-DOTA放射標(biāo)記的細(xì)胞相關(guān)放射活性隨時(shí)間保留和積累。純化的J591HC VHVL微抗體(或上述任何微抗體)可用于在微PET成像和生物分布研究中證明在體內(nèi)靶向人PSMA的能力。在一個(gè)實(shí)施方式中，純化的J591HC VHVL微抗體蛋白可首先在成像研究的準(zhǔn)備中被再次檢驗(yàn)以確定其體外結(jié)合PSMA的能力。在確定結(jié)合后，然后可將J591HC VHVL微抗體結(jié)合于雙功能性螯合劑D0TA，并用適于微PET的發(fā)射正電子的放射性金屬如銅64進(jìn)行放射標(biāo)記。在進(jìn)行微PET成像前，可分析放射標(biāo)記的微抗體以確保高放射標(biāo)記效力和免疫反應(yīng)性。在一些實(shí)施方式中，放射標(biāo)記的微抗體可靜脈內(nèi)注入移植有PSMA陽性或PSMA陰性腫瘤的異種移植小鼠。在注射后的特定時(shí)間點(diǎn)，可通過PET連續(xù)掃描各動(dòng)物。在最后一次掃描后，可通過CT掃描動(dòng)物，用于解剖參考。然后可分析各動(dòng)物的PET和CT圖像，從而評(píng)價(jià)腫瘤靶向和特異性。實(shí)施例5 124I-J591和64Cu-DOTA結(jié)合的J591微抗體的體內(nèi)結(jié)合和生物分布用碘-124放射標(biāo)記 J591 微抗體。利用 Pierce Thermo Scientific 的 Iodogen法(如Olafsen et al 2006所述)用大約I. 3mCi124I放射標(biāo)記純化的J591微抗體蛋白(總量為300 u g)。該方法涉及化學(xué)氧化反應(yīng)以將124I放射性同位素連接于J591微抗體可用的酪氨酸殘基。下文表3是J591微抗體放射標(biāo)記結(jié)果的概括，包括放射標(biāo)記效力、純化后結(jié)合的放射活性百分比、比活性和免疫反應(yīng)性。標(biāo)記反應(yīng)后，利用瞬時(shí)薄層色譜(ITLC)確定放射標(biāo)記效力為大約62% (結(jié)合蛋白質(zhì)的放射活性相對(duì)于未結(jié)合的百分比)(參見表3)。利用S印hadex G-25旋轉(zhuǎn)柱部分地純化放射標(biāo)記的J591微抗體，并通過ITLC對(duì)其進(jìn)行重新評(píng)價(jià)，從而確定結(jié)合放射活性的百分比。放射標(biāo)記蛋白質(zhì)的比活性為Z.eyCi/yg (表3)，如通過用劑量校準(zhǔn)器測(cè)量蛋白質(zhì)總放射活性所確定。為從反應(yīng)去除多余的未結(jié)合1241，用旋轉(zhuǎn)柱進(jìn)一步純化放射標(biāo)記的蛋白質(zhì)。純化后結(jié)合J591微抗體的放射活性百分比顯著增加至大約98% (表3)。通過測(cè)試與CWR22rvl相對(duì)于PC3細(xì)胞的結(jié)合來確定124I_J591微抗體的免疫反應(yīng)性為48% (表3)。雖然該免疫反應(yīng)性低于預(yù)期，但基于之前的微抗體結(jié)合性能，做出推進(jìn)124I J591微抗體至成像和生物分布實(shí)驗(yàn)的決定。進(jìn)一步的放射標(biāo)記條件(pH、時(shí)間、溫度等)的優(yōu)化和得到較高蛋白質(zhì)純度可潛在地提高免疫反應(yīng)性。表3.用124I和64Cu對(duì)J591微抗體進(jìn)行放射標(biāo)記。
權(quán)利要求
1.微抗體，由核苷酸序列編碼，所述核苷酸序列自N端至C端包含 scFv序列,所述scFv序列能夠結(jié)合前列腺特異性膜抗原(PSMA),所述scFv包含通過連接序列連接到輕鏈可變區(qū)(VL)的重鏈可變區(qū)(VH)； 人工鉸鏈序列；和 人IgG CH3序列。
2.權(quán)利要求I所述的微抗體，進(jìn)一步包含N端信號(hào)序列，從而在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)能分泌所述微抗體。
3.權(quán)利要求I所述的微抗體，其中所述scFv為VHV方向，以使所述VH在所述VL的上游。
4.權(quán)利要求3所述的微抗體，其中所述核苷酸序列包含SEQID NO: I或SEQ IDN0:2。
5.權(quán)利要求I所述的微抗體，其中所述scFv為VLVH方向，以使所述VL在所述VH的上游。
6.權(quán)利要求I所述的微抗體，其中所述核苷酸序列在由細(xì)胞表達(dá)時(shí)生成氨基酸序列，并且其中所述氨基酸序列包含SEQIDNO: 10或SEQIDNO: 11。
7.cys-雙抗體(CysDB)，由核苷酸序列編碼，所述核苷酸序列自N端至C端包含 scFv序列,所述scFv序列能夠結(jié)合PSMA,所述scFv包含通過連接序列連接到輕鏈可變區(qū)(VL)的重鏈可變區(qū)(VH);和 半胱氨酸尾部。
8.權(quán)利要求7所述的CysDB，進(jìn)一步包含N端信號(hào)序列，從而在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)能分泌CysDB0
9.權(quán)利要求7所述的CysDB，其中所述scFv為VHVL方向，以使所述VH在所述VL的上游。
10.權(quán)利要求9所述的CysDB，其中所述核苷酸序列包含SEQIDN0:6或SEQIDN0:7。
11.權(quán)利要求7所述的CysDB，其中所述scFv為VLVH方向，以使所述VL在所述VH的上游。
12.權(quán)利要求11所述的CysDB，其中所述核苷酸序列包含SEQIDN0:8或SEQIDN0:9。
13.權(quán)利要求7所述的CysDB，其中所述連接序列的長(zhǎng)度為5或8個(gè)氨基酸。
14.權(quán)利要求7所述的CysDB，其中所述核苷酸序列在由細(xì)胞表達(dá)時(shí)生成氨基酸序列，并且其中所述氨基酸序列包含 SEQIDN0:12、SEQIDN0:13、SEQIDN0:14 或 SEQIDN0:15。
15.診斷個(gè)體中與PSMA表達(dá)有關(guān)的癌癥的方法，所述方法包括 將抗PSMA微抗體或抗PSMA cys-雙抗體給予患有或疑患與PSMA表達(dá)有關(guān)的癌癥的個(gè)體，所述PSMA微抗體或抗PSMA cys-雙抗體與診斷劑結(jié)合并能夠結(jié)合PSMA ； 使所述個(gè)體暴露于成像方法以體內(nèi)顯現(xiàn)標(biāo)記的微抗體或cys-雙抗體；和當(dāng)所述標(biāo)記的微抗體或cys-雙抗體定位到腫瘤部位時(shí),確定所述個(gè)體患有與PSMA表達(dá)有關(guān)的癌癥。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述微抗體包含SEQIDN0:10或SEQIDN0:11。
17.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述cys-雙抗體包含SEQIDN0:12、SEQIDN0:13、SEQIDN0:14 或 SEQIDN0:15。
18.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述抗PSMA微抗體或抗PSMAcys-雙抗體靶向?qū)嶓w腫瘤的新血管系統(tǒng)。
19.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述個(gè)體中與PSMA表達(dá)有關(guān)的癌癥是前列腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、腎癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌或黑素瘤。
20.治療個(gè)體中與PSMA表達(dá)有關(guān)的癌癥的方法，所述方法包括 向所述個(gè)體給予治療有效量的藥物組合物，所述組合物包含抗PSMA微抗體或抗PSMAcys-雙抗體。
21.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述微抗體包含SEQIDNO:10或SEQIDNO: 11。
22.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述cys-雙抗體包含SEQIDNO:12、SEQIDNO: 13、SEQIDNO:14 或 SEQIDN0:15。
23.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述抗PSMA微抗體或抗PSMAcys-雙抗體與治療劑彡口口
24.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述治療劑選自化療劑、治療性抗體和抗體片段、毒素、放射性同位素、酶、核酸酶、激素、免疫調(diào)節(jié)劑、反義寡核苷酸、螯合劑、硼化合物、光活性劑和染料。
25.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述抗PSMA微抗體或抗PSMAcys-雙抗體靶向?qū)嶓w腫瘤的新血管系統(tǒng)。
26.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述個(gè)體中與PSMA表達(dá)有關(guān)的癌癥是前列腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、腎癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌或黑素瘤。
全文摘要
在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了結(jié)合PSMA的微抗體單體。微抗體單體由核苷酸序列編碼，該核苷酸序列自N端至C端包含可結(jié)合PSMA的scFv序列、人工鉸鏈序列和人IgG CH3序列。在另一實(shí)施方式中，提供了結(jié)合PSMA的CysDB單體。CysDB單體可由核苷酸序列編碼，該核苷酸序列自N端至C端包含可結(jié)合PSMA的scFv序列和半胱氨酸尾部。在其他實(shí)施方式中，提供了診斷或治療個(gè)體中與PSMA表達(dá)有關(guān)的癌癥的方法。
文檔編號(hào)C12P21/04GK102753194SQ201080062988
公開日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2010年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月2日
發(fā)明者A·李普曼, D·何, T·奧拉夫森 申請(qǐng)人:伊麥吉納博公司