專利名稱：：包含整合型蛋白酶裂解位點-結合結構域的經過修飾的梭菌毒素的制作方法包含整合型蛋白酶裂解位點-結合結構域的經過修飾的梭國母■素本申請要求2009年12月16日提交的美國臨時專利申請第61/286，954號的權益，所述申請的全文以引用的方式并入本文。梭菌毒素(諸如肉毒桿菌神經毒素(Botulinumneurotoxin；BoNT)BoNT/A>BoNT/B、BoNT/Cl、BoNT/D、BoNT/E、BoNTA^PBoNT/G以及破傷風神經毒素(Tetanusneurotoxin；TeNT))抑制神經傳遞的能力已在多種治療和美容應用中得到應用，參見例如WilliamJ.Lipham,COSMETICANDCLINICALAPPLICATIONSOFBOTULINUMTOXIN(Slack,Inc.,2004)。可作為藥物組合物商購得到的梭菌毒素包括BoNT/A制劑，如BOTOX(Allergan,Inc.，Irvine，CA)、DYSPORT'/RELOXlNR(BeaufourIpsen,PortonDown，England)、NEURONOX(Medy-Tox,Inc.，Ochang-myeon,SouthKorea)、BTX-A(Lanzhou、InstituteBiologicalProducts，China)和XEOMIN(MerzPharmaceuticals,GmbH.，Frankfurt,Germany)；以及BoNT/B制劑，如MY0BL0CTM/NEUR0BL0C(ElanPharmaceuticals,SanFrancisco,CA)。作為實例,BOTOX當前已在一個或多個國家獲得批準用于以下適應癥遲緩不能、成人痙攣狀態(tài)、肛裂、背痛、眼瞼痙攣、磨牙癥、頸肌張力障礙、特發(fā)性震顫、眉間紋或過動性面部皺紋、頭痛、半面痙攣、膀胱過動癥、多汗癥、青少年大腦性癱瘓、多發(fā)性硬化癥、肌陣攣性病癥、鼻唇紋、痙攣性發(fā)音困難、斜視和VII神經病癥。梭菌毒素治療通過干擾用于分泌神經遞質至突觸間隙中的胞外分泌過程來抑制神經遞質釋放。制藥工業(yè)非常希望將梭菌毒素療法的使用擴展至其當前肌肉松弛性應用以夕卜，以治療基于感覺神經的疾病，如各種慢性疼痛、神經性炎癥和泌尿生殖器病癥，以及非基于神經元的病癥，如胰腺炎。當前用于擴展基于梭菌毒素的療法的一種方法涉及修飾梭菌毒素，以使得經過修飾的毒素對非梭菌毒素靶細胞具有改變的細胞靶向能力。此再靶向能力通過將梭菌毒素的天然存在的靶向結構域置換為對存在于非梭菌毒素靶細胞中的非梭菌毒素受體顯示選擇性結合活性的靶向結構域來達到。對靶向結構域的所述修飾產生能夠選擇性結合存在于非梭菌毒素靶細胞上的非梭菌毒素受體(靶受體)的修飾毒素(再靶向)。對非梭菌毒素靶細胞具有靶向活性的再靶向梭菌毒素可結合存在于非梭菌毒素靶細胞上的受體，移位至細胞質中，且對非梭菌毒素靶細胞的SNARE復合物發(fā)揮其蛋白水解作用。對非梭菌毒素靶細胞具有靶向活性的再靶向梭菌毒素的非限制性實例描述于以下文獻中例如KeithA.Foster等，ClostridialToxinDerivativesAbleToModifyPeripheralSensoryAfferentFunctions,美國專利5，989，545(I"9年11月23日)；CliffordC.Shone等，RecombinantToxinFragments,美國專利6,461,617(2002年10月8日)；ConradP.Quinn等，MethodsandCompoundsfortheTreatmentofMucusHypersecretion,美國專利6，632，440(2003年10月14曰)；LanceE.Steward等，MethodsAndCompositionsForTheTreatmentOfPancreatitis,美國專利6，843，998(2005年I月18日)；StephanDonovan,ClostridialToxinDerivativesandMethodsForTreatingPain，美國專利公布2002/0037833(2002年3月28日)；KeithA.Foster等，InhibitionofSecretionfromNon-neuralCells，美國專利公布2003/0180289(2003年9月25日)；J.OliverDolly等，ActivatableRecombinantNeurotoxins,W02001/014570(2001年3月I日)；KeithA.Foster等，Re-targetedToxinConjugates,國際專利公布WO2005/023309(2005年3月17日)；和LanceE.Steward等，MultivalentClostridialToxinDerivativesandMethodsofTheirUse,美國專利申請No.11/376，696(2006年3月15日)。與梭菌毒素相關的再靶向治療作用的能力已極大擴展了能夠使用梭菌毒素療法的醫(yī)學應用的數量。作為非限制性實例，再靶向感覺神經元的修飾梭菌毒素適用于治療各種慢性疼痛，如痛覺過敏和異常性疼痛、神經性疼痛和炎癥性疼痛,參見例如Foster，同上，(1999)JPDonovan,同上，(2OO2)JPStephanDonovan,MethodForTreatingNeurogenicInflammationPainwithBotulinumToxinandSubstancePComponents,美國專利7，022，329(2006年4月4日)。作為另一非限制性實例，再靶向胰腺細胞的修飾梭菌毒素適用于治療胰腺炎，參見例如Steward，同上，(2005)。、開發(fā)再靶向梭菌毒素期間揭示的一個意外發(fā)現涉及靶向部分的安置或呈現形式。如下文所進一步論述，將天然存在的梭菌毒素組織化成三個主要結構域，其按線性氨基至羧基單一多肽順序包含酶促結構域(氨基區(qū)位置)、移位結構域(中部區(qū)位置)和結合結構域(羧基區(qū)位置)(圖2)。此天然存在的順序可稱為靶向部分的羧基呈現形式，因為結合細胞表面受體所必需的結構域位于梭菌毒素的羧基區(qū)位置。然而，已證實可通過重排三個主要結構域的線性氨基至羧基單一多肽順序并將靶向部分定位于梭菌毒素的氨基區(qū)位置(稱為氨基呈現形式)以及中部區(qū)位置(稱為中心呈現形式)對梭菌毒素進行修飾(圖2)。雖然已證明梭菌毒素結構域的此重排和靶向部分的定位是成功的，但對于適當受體結合需要游離氨基端的一類靶向部分來說仍然存在問題。與適當受體結合需要游離氨基端的靶向部分相關的問題起源于天然存在抑或經過修飾的梭菌毒素實際上加工成雙鏈形式以便獲得完全活性。天然存在的梭菌毒素各自翻譯成約150kDa的單鏈多肽，其隨后通過天然存在的蛋白酶在二硫環(huán)內進行蛋白水解切斷而裂解(圖I)。此裂解發(fā)生于形成二硫橋鍵的兩個半胱氨酸殘基之間產生的離散雙鏈環(huán)區(qū)內。此翻譯后加工產生包含約50kDa輕鏈(LC)、包含酶促結構域和約IOOkDa重鏈(HC)、包含移位和細胞結合結構域的雙鏈分子，所述LC和HC由單個二硫鍵和非共價相互作用保持在一起(圖I)。重組產生的梭菌毒素通常將天然存在的雙鏈環(huán)蛋白酶裂解位點取代為外源蛋白酶裂解位點(圖2)。參見例如Dolly,J.0.等，ActivatableClostridialToxins，美國專利No.7，419，676(2008年9月2日)，其以引用的方式并入本文。盡管再靶向梭菌毒素的總體分子量因靶向部分的大小而不同，但活化過程和其對外源裂解位點的依賴性基本上與重組產生的梭菌毒素相同。參見例如Steward，L.E.等，ActivatableClostridialToxins，美國專利申請No.12/192，900(2008年8月15日)；Steward,L.E.等，ModifiedClostridialToxinswithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityForNon-ClostridialToxinTargetCells,美國專利申請No.11/776，075(2007年7月11曰)；Steward,L.E.等，ModifiedClostridialToxinswithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityforClostridialToxinTargetCells，美國專利申請No.11/776，052(2007年7月11日)，每一文獻以引用的方式并入本文。一般來說，使用外源蛋白酶將單鏈多肽轉化成其雙鏈形成的活化過程可用于加工具有組織化成氨基呈現形式、中心呈現形式或羧基呈現形式排列的靶向部分的再靶向梭菌毒素。這是因為對于大部分靶向部分來說，所述部分的氨基端不參與受體結合。因而，多種蛋白酶裂解位點可用于產生梭菌毒素或再靶向梭菌毒素的活性雙鏈形式。然而，受體結合需要游離氨基端的靶向部分為此一般情況的例外，因為在此情況下，所述部分的氨基端對于適當受體結合來說必不可少。因此，不能使用可切斷鍵不位于蛋白酶裂解位點的羧基端的蛋白酶裂解位點，因為所述位點在靶向部分的氨基端留下裂解位點的殘余部分。因此，即使所述再靶向毒素將被加工成雙鏈形式，所述毒素也將會因為靶向部分不能結合其同源受體而無活性，因為裂解位點殘余部分會遮蔽靶向部分中對于受體結合功能來說必不可少的氨基端氨基酸。舉例來說，再靶向梭菌毒素按氨基至羧基線性順序包含酶促結構域、人鼻病毒3C蛋白酶裂解位點、結合結構域和移位結構域(中心呈現形式排列)。人鼻病毒3C蛋白酶裂解位點包含共有序列P5-P4-L-F-QI-G-P-P3'-P4，-P5,(SEQIDNO:I)，其中P5優(yōu)選是D或￡;4為63、￥、1^、1^、3或1';且？3’、？4’和P5’可為任何氨基酸。Q-G可切斷鍵裂解后，裂、解位點的GP殘余部分變成含于結合結構域內的靶向部分的氨基端。一般來說，此殘余部分不干擾靶向部分與其同源受體的結合。一個例外為適當受體結合需要游離氨基端的靶向部分。在此情況下，人鼻病毒3C蛋白酶裂解位點的GP殘余部分會遮蔽靶向部分中適當結合所必需的游離氨基端，由此使經過修飾的梭菌毒素因不能結合其受體和內化至細胞中而無活性。迄今為止，僅發(fā)現兩種蛋白酶，因子Xa和腸激酶，適用于活化具有適當受體結合需要游離氨基端的靶向部分的再靶向梭菌毒素。因子Xa裂解位AP5-I(E/D)GRI-P1,-P2,-P3,-P4,-P5,(SEQIDNO:2)(其中P5、PpP2,、P3,、P4,和P5,可為任何氨基酸)為在P1精氨酸的羧基側裂解的位點特異性蛋白酶裂解位點。類似地，腸激酶裂解位點DDDDKI-Pr-P2I-Py-P4I-P5,(SEQIDNO:3)(其中P1,、P2,、P3,、P4,和P5,可為任何氨基酸)為在P1賴氨酸的羧基側裂解的位點特異性蛋白酶裂解位點。任一位點處的蛋白水解產生氨基端完整的靶向部分，因為其不留下裂解位點殘余部分。盡管其它蛋白酶可在其裂解位點的羧基端裂解，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、V8蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、CNBr、Arg-C、Glu-C、Lys-C和Tyr_C，但所述位點本身為非特異性的。因此，所述蛋白酶不適用，因為其將裂解再靶向毒素的其它區(qū)，由此使毒素失活。然而，存在與因子Xa和腸激酶相關的若干問題。關于因子Xa，此蛋白酶僅可以從血源性來源純化的產品形式獲得，當前并不存在重組產生的因子Xa可購得。因此，因子Xa因對血源性試劑的健康顧慮和使用所述產品的高成本而不適于制造藥物。類似地，腸激酶具有使得制造藥物困難和成本高的若干缺點。首先，腸激酶缺乏現行藥品生產管理規(guī)范(currentGoodManufacturePractices；cGMP)批準且試圖獲得所述批準為耗時且耗費大的過程。第二，眾所周知此蛋白酶難以重組產生，因為腸激酶為含有四個二硫鍵的26.3kDa大分子。因此，難以使用更加成本有效的基于細菌的表達系統，因為所述系統缺乏產生二硫鍵的能力。然而，使用基于真核生物的表達系統也具有若干缺點。一個缺點為絕大部分重組產生的腸激酶隔離于包涵體中，致使難以純化足量的此蛋白酶。取決于所使用的真核細胞，另一缺點為在制造過程中可能需要額外純化步驟以得到GMP批準。另一缺點為因子Xa和腸激酶均裂解底物中預定靶位點以外的位置，尤其當在高濃度下使用時。因此，所述問題對使用因子Xa或腸激酶用于商業(yè)生產包含具有游離氨基端的靶向部分的雙鏈再靶向梭菌毒素造成明顯障礙，因為其為成本高、低效且費力的過程，顯著增加制造作為生物藥物的所述再靶向梭菌毒素的總體成本。本說明書公開不依賴于因子Xa或腸激酶來將毒素加工成其雙鏈形式的包含具有游離氨基端的靶向部分的修飾梭菌毒素。此舉通過將新的蛋白酶裂解位點與靶向部分整合以使得裂解后產生受體結合所必需的適當氨基端來完成。因此，本發(fā)明的方面提供包含整合型蛋白酶裂解位點-結合結構域的修飾梭菌毒素。設想可通過并入蛋白酶裂解位點結合結構域來修飾包含適當受體結合需要游離氨基端的結合結構域的任何梭菌毒素。所述梭菌毒素描述于以下文獻中例如Steward，L.E.等，MultivalentClostridialToxins,美國專利申請No.12/210,770(2008年9月15日)；Steward,L.E.等，ActivatableClostridialToxins,美國專利申請、No.12/192,900(2008年8月15日)；Steward，L.E.等，ModifiedClostridialToxinswithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityForNon-ClostridialToxinTargetCells，美國專利申請No.11/776，075(2007年7月11日)；Steward,L.E.等，ModifiedClostridialToxinswithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityforClostridialToxinTargetCells,美國專利申請No.11/776，052(2007年7月11日)；Foster，K.A.等，FusionProteins,美國專利申請No.11/792，210(2007年5月31日)；Foster,K.A.等,Non-CytotoxicProteinConjugates,美國專利申請No.11/791,979(2007年5月31日)；Steward,L.E.等，ActivatableClostridialToxins,美國專利公布No.2008/0032931(2008年2月7日)；Foster,K.A.等，Non-CytotoxicProteinConjugates,美國專利公布No.2008/0187960(2008年8月7日)；Steward，L.E.等，DegradableClostridialToxins,美國專利公布No.2008/0213830(2008年9月4日)；Steward，L.E.等，ModifiedClostridialToxinsWithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityForClostridialToxinTargetCells,美國專利公布No.2008/0241881(2008年10月2日)；和Dolly,J.0.等,ActivatableClostridialToxins，美國專利No.7,419,676(2008年9月2日)，每一文獻的全文以引用的方式并入本文。本發(fā)明的其它方面提供編碼包含整合型蛋白酶裂解位點-結合結構域的修飾梭菌毒素的多核苷酸分子。編碼本說明書中所公開的修飾梭菌毒素的多核苷酸分子可進一步包含表達載體。本發(fā)明的其它方面提供包含本說明書中所公開的修飾梭菌毒素的雙鏈形式的組合物。包含本說明書中所公開的修飾梭菌毒素的雙鏈形式的組合物可為藥物組合物。所述藥物組合物除本說明書中所公開的修飾梭菌毒素外，還可包含藥用載體、藥用組分或兩者。附圖簡述圖I示出天然存在的梭菌毒素的結構域組織。單鏈形式描繪包含酶促結構域、移位結構域和H。結合結構域的氨基至羧基線性組織。位于移位和酶促結構域之間的雙鏈環(huán)區(qū)由雙重SS括號描繪。此區(qū)包含內源性雙鏈環(huán)蛋白酶裂解位點，其在被天然存在的蛋白酶(如內源性梭菌毒素蛋白酶或環(huán)境中產生的天然存在的蛋白酶)蛋白水解裂解后使毒素的單鏈形式轉化為雙鏈形式。圖2示出以結合結構域的羧基呈現形式、結合結構域的中心呈現形式和結合結構域的氨基呈現形式排列的梭菌毒素的結構域組織。位于移位和酶促結構域之間的雙鏈環(huán)區(qū)由雙重SS括號描繪。此區(qū)包含內源性蛋白酶裂解位點，其在由其同源蛋白酶裂解后使毒素的單鏈形式轉化為雙鏈形式。圖3示出中樞和周邊神經元中神經遞質釋放和梭菌毒素中毒的當前范例的示意圖。圖3A示出中樞和周邊神經元的神經遞質釋放機制的示意圖。釋放過程可描述為包括兩個步驟1)囊泡對接，其中含有神經遞質分子的囊泡上的囊泡結合型SNARE蛋白與位于質膜上的膜結合型SNARE蛋白締合；和2)神經遞質釋放，其中囊泡與質膜融合且神經遞質分子分泌至胞外。圖3B示出中樞和周邊神經元中破傷風毒素和肉毒桿菌毒素的中毒機制的示意圖。此中毒過程可描述為包括四個步驟1)受體結合，其中梭菌毒素結合于梭菌毒、素受體系統且啟動中毒過程；2)復合物內化，其中毒素結合后，含有毒素/受體系統復合物的囊泡內吞至細胞中；3)輕鏈移位，其中認為發(fā)生多個事件，包括例如囊泡的內部pH值改變、形成包含梭菌毒素重鏈的Hn結構域的通道孔、梭菌毒素輕鏈與重鏈分離和活性輕鏈釋放；和4)酶促標靶修飾，其中梭菌毒素的活性輕鏈蛋白水解裂解其標靶SNARE底物，如SNAP-25、VAMP或突觸融合蛋白(Syntaxin)，由此阻止囊泡對接和神經遞質釋放。由肉毒芽抱梭菌(Clostridiumbotulinum)、破傷風芽抱梭菌(Clostridiumtetani)、巴氏梭菌(Clostridiumbaratii)和丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)產生的梭菌毒素在人和其它哺乳動物的治療性和美容性治療中使用最廣泛。肉毒芽孢梭菌的菌株產生七種抗原性不同的肉毒桿菌毒素(BoNT)類型，其已通過研究人類(BoNT/A、/B、/E和/F)、動物(BoNT/Cl和/D)中的肉毒桿菌中毒爆發(fā)得到鑒別或從土壤分離(BoNT/G)。BoNT彼此具有約35%氨基酸一致性且共享相同的功能性結構域組織和總體結構架構。本領域的技術人員已認識到，在梭菌毒素的各類型內，可存在氨基酸序列以及編碼這些蛋白質的核酸稍有不同的亞型。舉例來說，當前存在四種BoNT/A亞型BoNT/Al、BoNT/A2、BoNT/A3和BoNT/A4，其中特定亞型當與另一BoNT/A亞型相比較時顯示約89%氨基酸一致性。雖然所有七種BoNT血清型都具有類似的結構和藥理學性質，但各自還顯示異源的細菌學特征。相比之下，破傷風毒素(TeNT)由破傷風芽孢梭菌的均一族群產生。兩個其它梭菌物種巴氏梭菌和丁酸梭菌產生毒素BaNT和BuNT，其分另類似于BoNT/F和BoNT/E。各成熟雙鏈分子包含三個功能上不同的結構域1)位于LC中的酶促結構域，其包括含有特異性靶向神經遞質釋放機構核心組分的鋅依賴性內肽酶活性的金屬蛋白酶區(qū)；2)含于HC的氨基端部分(Hn)中的移位結構域，其促進LC從細胞內囊泡釋放至靶細胞的細胞質中；3)存在于HC的羧基端部分(H。)中的結合結構域，其確定毒素對位于靶細胞表面上的受體復合物的結合活性和結合特異性。H。結構域包含兩個大小大致相等的不同結構特征，其指定功能且稱為HeN和H。。子結構域。表I給出示例性梭菌毒素中存在的各結構域的大致邊界區(qū)。權利要求1.一種單鏈修飾梭菌毒素，其包含a)能夠執(zhí)行梭菌毒素中毒過程的酶促靶向修飾步驟的梭菌毒素酶促結構域；b)能夠執(zhí)行梭菌毒素中毒過程的移位步驟的梭菌毒素移位結構域；和c)包含蛋白酶裂解位點中包括可切斷鍵的P1位點的P部分和結合結構域的整合型蛋白酶裂解位點-結合結構域，所述蛋白酶裂解位點的所述P部分的所述P1位點毗鄰所述結合結構域的氨基端，由此產生整合型蛋白酶裂解位點；其中所述整合型蛋白酶裂解位點-結合結構域的裂解使所述單鏈修飾梭菌毒素轉化成雙鏈形式，并且產生具有能夠結合其同源受體的氨基端的結合結構域。2.如權利要求I所述的經過修飾的梭菌毒素，其中所述經過修飾的梭菌毒素包含以下線性氨基至羧基單一多肽順序1)所述梭菌毒素酶促結構域、所述梭菌毒素移位結構域和所述整合型蛋白酶裂解位點-結合結構域，2)所述梭菌毒素酶促結構域、所述整合型蛋白酶裂解位點-結合結構域和所述梭菌毒素移位結構域，3)所述整合型蛋白酶裂解位點-結合結構域、所述梭菌毒素移位結構域和所述梭菌毒素酶促結構域，4)所述整合型蛋白酶裂解位點-結合結構域、所述梭菌毒素酶促結構域和所述梭菌毒素移位結構域，或5)所述梭菌毒素移位結構域、整合型蛋白酶裂解位點-結合結構域和所述梭菌毒素酶促結構域。3.如權利要求I所述的經過修飾的梭菌毒素，其中所述梭菌毒素移位結構域為BoNT/A移位結構域、BoNT/B移位結構域、BoNT/Cl移位結構域、BoNT/D移位結構域、BoNT/E移位結構域、BoNT/F移位結構域、BoNT/G移位結構域、TeNT移位結構域、BaNT移位結構域或BuNT移位結構域。4.如權利要求I所述的經過修飾的梭菌毒素，其中所述梭菌毒素酶促結構域為BoNT/A酶促結構域、BoNT/B酶促結構域、BoNT/Cl酶促結構域、BoNT/D酶促結構域、BoNT/E酶促結構域、BoNT/F酶促結構域、BoNT/G酶促結構域、TeNT酶促結構域、BaNT酶促結構域或BuNT酶促結構域。5.如權利要求I所述的經過修飾的梭菌毒素，其中所述整合型蛋白酶裂解位點-結合結構域為SEQIDNO4至SEQIDNO:118中的任何一個。6.如權利要求I所述的經過修飾的梭菌毒素，其中蛋白酶裂解位點中包括所述可切斷鍵的所述Pji點的所述P部分為SEQIDNO12USEQIDNO:127或SEQIDNO:130。7.如權利要求I所述的經過修飾的梭菌毒素，其中所述結合結構域為阿片樣肽。8.如權利要求7所述的經過修飾的梭菌毒素，其中所述阿片樣肽為腦啡肽、BAM22肽、內嗎啡肽、內啡肽、強啡肽、痛敏肽或強啡肽B。9.如權利要求I所述的經過修飾的梭菌毒素，其中所述結合結構域為PAR配體。10.如權利要求9所述的經過修飾的梭菌毒素，其中所述PAR配體為PARI、PAR2、PAR3或PAR4。11.一種藥物組合物，其包含如權利要求I所述的單鏈修飾梭菌毒素的雙鏈形式和藥學上可接受的載體、藥學上可接受的組分或藥學上可接受的載體與藥學上可接受的組分兩者。12.—種多核苷酸分子，其編碼如權利要求I所述的經過修飾的梭菌毒素。13.如權利要求12所述的多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子進一步包含表達載體。14.一種產生經過修飾的梭菌毒素的方法，所述方法包括以下步驟a)將根據權利要求13所述的多核苷酸分子引入細胞中；和b)表達所述多核苷酸分子。全文摘要本說明書公開經過修飾的梭菌毒素、包含整合型蛋白酶裂解位點-結合結構域的組合物、編碼此類經過修飾的梭菌毒素的多核苷酸分子和包含此類經過修飾的梭菌毒素的雙鏈形式的組合物。文檔編號C12N9/64GK102753681SQ201080063213公開日2012年10月24日申請日期2010年12月14日優(yōu)先權日2009年12月16日發(fā)明者L·E·斯圖爾德,L·Q·勒,S·甘沙尼,劉漪申請人:阿勒根公司