專利名稱：利用est-ssr分子標記構建荔枝核心種質的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及荔枝核心種質的構建方法。
背景技術：
荔枝Hitchi chinensis Sonn.)為無患子科{Sapindaceae)荔枝屬 Hitchf)植物，原產于我國南部，是重要的熱帶亞熱帶水果，也是世界最古老的栽培果樹之一，分布于東、西半球的熱帶和亞熱帶的廣闊地區(qū)，我國荔枝主要分布在北緯18° M° 30'的熱帶亞熱帶地區(qū)，主要栽培省份是廣東、廣西、福建、海南、臺灣、云南，此外，在四川、貴州、浙江的一些特殊小氣候區(qū)也有少量種植(張展薇等，1997)。吳淑嫻等(1996)年對各地的荔枝種質資源進行了統(tǒng)計認為我國已發(fā)現的荔枝種質達222份，現已增加至300多份(陳潔珍等 2003)。其中，廣東荔枝栽培面積最大，品種資源豐富，栽培品種也較多，目前，我國荔枝種質資源保存主要是利用種質資源圃。1988年建立的廣州荔枝圃到目前為止保存了包括廣東、 廣西、福建、四川、云南等地的野生、半野生和栽培品種等130多份種質，是世界上最大的荔枝種質基因庫。荔枝現存資源保存方式單一，各地幾乎僅采用建立資源圃進行田間種植保存，而且資源的重復保存現象較嚴重；其保護力度也遠遠不夠，荔枝的遺傳多樣性遭到嚴重的破壞(王艷瓊2008)。此外，由于荔枝是多年生木本植物，樹體大，作為資源保存，占地面積大， 隨著近年來遺傳資源數量的增加也給種質資源的保存、研究與利用帶來了很大的困難。Frankel (1984)最早提出核心種質(Core collection)即是以最小的資源份數和遺傳重復最大限度地代表該物種的遺傳多樣性。核心種質的構建能有效解決資源的重復保存，且由于資源數量大給育種工作者帶來的困難也能隨之解決。傳統(tǒng)的核心種質的是用農藝學和形態(tài)學數據來構建的，但這些表型數據不能準確的反應群體固有的遺傳變異及材料間的遺傳關系(Gu et al，2005)，與表型數據相比，DNA 分子標記數據能直接反映出DNA序列水平上的變化，是構建核心種質的有效特征數據(李銀霞等2007)。目前，核心種質已成為國際遺傳資源研究的熱點，在水稻等許多一年生作物上得至丨J 廣泛應用(Chandra 2002 ；Amalraj 2006 Juneja 2006 ；Ronfort 2006 ；Upadhyaya 2007)，在園藝作物花卉郁金香(Raamsdonk 2000)、梅花(明軍2005)和蠟梅(趙冰2007) 等上也有報道，在果樹上，僅在蘋果(Hokanson 1998)、果梅(高志紅等2008)、柚類(劉勇 2006)和桃(李銀霞等2007)上有少量報道?，F階段，缺乏荔枝核心種質與分子指紋的構建方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供荔枝核心種質與分子指紋的構建方法。本發(fā)明所采取的技術方案是 荔枝核心種質的構建方法，包括以下步驟1)選取荔枝的嫩葉，按品種提取其基因組DNA，得到荔枝的基因組DNA樣品；
2)根據荔枝的EST序列，搜索荔枝的EST-SSR，設計EST-SSR引物；
3)使用EST-SSR引物進行PCR，擴增荔枝的基因組DNA；
4)對PCR產物進行電泳分析，得到其等位基因的存在數據；
5)對獲得的數據進行分析處理，構建核心種質。優(yōu)選的，PCR的擴增程序為:94°c,4min ；94°C，Imin ；50°C, Imin ；72°C，2min ；35 個循環(huán)；72°C，10min ；4°C，完成擴增。本發(fā)明方法中，EST-SSR標記的引物形成和實驗操作過程簡單，易操作，擴增譜帶清晰，結果穩(wěn)定，適合于分析荔枝資源之間的遺傳多樣性，在此基礎上構建的核心種質幾乎代表了原種質全部的遺傳多樣性，有很好的代表性，對荔枝種質管理、新種質收集及種質繁殖更新具有現實意義，更重要的是促進了荔枝種質資源利用的深入，從而提高荔枝種質資源的利用效率。


圖1是三種相似系數下抽取不同樣品數保留的等位基因數。圖2是三種系數下構建的核心種質與原種質的主坐標圖。圖3是9個EST-SSR標記的多態(tài)性類型分類簡圖。圖4 6分別是使用EST-SSR標記EST-21、EST-29、EST_30對96份荔枝種質資源進行PCR產物的電泳分析圖。
具體實施例方式下面結合實施例，進一步說明本發(fā)明。1材料與方法 1.1植物材料
本實驗所采用的96個荔枝品種均取自廣東省農科院果樹研究所的國家荔枝資源圃， 取樣時，挑選枝條生長健壯，且葉片無病蟲害的嫩葉，放入保鮮袋，然后用冰盒盛放，取完后迅速帶回實驗室，放在_80°C的超低溫冰箱儲藏備用。1.2 方法
1. 2. 1 DNA的提取
采用改進的SDS法(陳亮等，1997)(陳亮，陳大明，高其康等.茶樹基因組DNA提純與鑒定，茶葉科學，1997，17 (2) 172-176)提取基因組DNA0用PERKIN ELMER PTP6型紫外分光光度計測定其在230nm，260nm, 280nm處的紫外吸收光譜，根據OD26tl值算出樣品中DNA的濃度，并結合0. 8%瓊脂糖凝膠電泳判斷DNA的質量和濃度。為了最終實驗的方便和統(tǒng)一， 將每種樣品的DNA稀釋成大約IOng/ μ L，_20°C保存?zhèn)溆谩?.2.2引物的設計與退火溫度的確定
從荔枝cDNA文庫測序所得的EST序列，應用SSRIT (simple sequence repeat identification tool)軟件在線(http://www. gramene. org/db/markers/ssrtool)搜索 EST-SSR，應用引物設計軟件I^rimer Premier 5. 0設計引物，由上海生物工程技術服務有限公司合成。參考不同引物的Tm值，采用梯度PCR確定相應的退火溫度。選用10個品種的基因組DNA對能擴出目的條帶的引物進行多態(tài)性篩選，選擇多態(tài)性高、重現性好的引物作為以后全部96份資源擴增的核心引物。1. 2. 3 PCR擴增與電泳檢測
本實驗采用 25 μ 1 反應體系CldH2O 17.5“1，8吐€61~(含]\%2+)2.5“1，(1^138 0. 5μ 1, Taq DNA聚合酶0. 5 μ 1，primer各1 μ 1，模板DNA 2 μ 1.優(yōu)化的荔枝SSR-PCR的擴增反應程序:94°C,4min ；94°C, Imin ；50°C, Imin ；72°C，2min ；35cycles ；72°C, IOmin ；4°C，完成擴增。PCR產物，先在2. 5%的瓊脂糖凝膠電泳上進行檢測，然后再在8%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，銀染檢測。最后用數碼相機拍照，保存。1. 2. 4數據的統(tǒng)計、處理和分析
數據的統(tǒng)計SSR是一種共顯性標記，根據其擴增產物在電泳膠上出現譜帶的位置和頻率，將不同材料某位點存在的等位基因記為1，不存在的記為0。數據的處理和分析所有記錄的數據均錄入計算機，然后利用NTSYS 2. IOe生物學軟件進行相似性數據分析，相似系數采用Dice、SM和Jaccard系數進行UPGMA聚類。1. 2. 5核心種質的構建
利用相似系數Dice、SM和Jaccard估測遺傳距離，用NTSYSpc-2. IOe軟件進行 UPGMA聚類分析，根據Hu等(2000)的多次聚類方法(Hu J, Zhu J，Xu H M. Methods of constructing core collections by stepwise clustering with three sampling strategies based on the genotypic values of crops. Theoretical and Applied Genetics, 2000，101:沈4力68)，利用張春雨等(2009)提出的位點優(yōu)先取樣策略(張春雨，陳學森，張艷敏等.采用分子標記構建新疆野蘋果核心種質的方法.中國農業(yè)科學[J]，2009， 42(2) :597-604)構建核心種質。1. 2. 6核心種質的評價與確認
通過P0PGENE 1.32來計算等位基因數(A)、Nei，s基因多樣度(He)、香農信息指數 (Ho)，用SPSS 13. 0軟件進行t檢驗和計算核心種質相對于原種質的保留率來確認其代表性，然后采用柱坐標軸分析法來確認核心種質。2結果與分析
2. 1 EST-SSR的特點與多態(tài)性
從3391條荔枝EST序列中，篩選出305條含有SSR，比例為8. 99%，而陳海梅(2005)在小麥上得到比例為1.34%，說明荔枝的EST序列中含有豐富的SSR。根據以上SSR序列共設計了 100對EST-SSR引物對，有62對在荔枝上有擴增產物，有30對引物能96個荔枝樣品上擴出清晰，多態(tài)性高的條帶，共擴出284條帶，不同引物的擴增條帶在3 18條，平均9. 47， 其中有282條為多態(tài)性帶，多態(tài)率高達99. 30 %。2. 2遺傳多樣性分析
用EST-SSR標記對96份荔枝資源進行擴增，其遺傳多樣性見表1.從表看出，每對引物的Nei，s基因多樣度范圍0. 186 0. 396，香農信息指數范圍0. 318 0. 558，由此說明96 份荔枝資源有豐富的遺傳多樣性。表1 EST-SRR標記下96份荔枝資源的遺傳多樣性
權利要求
1.荔枝核心種質的構建方法，包括以下步驟1)選取荔枝的嫩葉，按品種提取其基因組DNA，得到荔枝的基因組DNA樣品；2)根據荔枝的EST序列，搜索荔枝的EST-SSR，設計EST-SSR引物；3)使用EST-SSR引物進行PCR，擴增荔枝的基因組DNA；4)對PCR產物進行電泳分析，得到其等位基因的存在數據；5)對獲得的數據進行分析處理，構建核心種質。
2.根據權利要求1所述的荔枝核心種質的構建方法，其特征在于PCR的擴增程序為 94°C，4min ；94°C, Imin ；50°C, Imin ；72°C，2min ；35 個循環(huán)；72°C, IOmin ；4°C，完成擴增。
3.根據權利要求1所述的荔枝核心種質的構建方法，其特征在于使用的EST-SSR引物為 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :47、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :59、 SEQ ID NO :60。
全文摘要
本發(fā)明公開了荔枝核心種質的構建方法，包括以下步驟選取荔枝的嫩葉，按品種提取其基因組DNA，得到荔枝的基因組DNA樣品；根據荔枝的EST序列，搜索荔枝的EST-SSR，設計EST-SSR引物；使用EST-SSR引物進行PCR，擴增基因組DNA；對PCR產物進行電泳分析，得到其等位基因的存在數據；對獲得的數據進行分析處理，構建核心種質。本發(fā)明方法EST-SSR標記的引物形成和實驗操作過程簡單，易操作，擴增譜帶清晰，結果穩(wěn)定，適合于分析荔枝資源之間的遺傳多樣性，在此基礎上構建的核心種質幾乎代表了原種質全部的遺傳多樣性，有很好的代表性，對荔枝種質管理、新種質收集及種質繁殖更新具有現實意義，更重要的是促進了荔枝種質資源利用的深入，從而提高荔枝種質資源的利用效率。
文檔編號C12N15/10GK102174510SQ20111000182
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月6日 優(yōu)先權日2011年1月6日
發(fā)明者向旭, 孫清明, 李志強, 歐良喜, 蔡長河, 袁沛元, 邱燕萍, 陳潔珍 申請人:廣東省農業(yè)科學院果樹研究所