專利名稱：改變植物形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和生理學(xué)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及改變植物形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和生理學(xué)性質(zhì)或特征的方法，例如一種或多種發(fā)育過(guò)程和/或環(huán)境適應(yīng)過(guò)程，包括而不限于改變起始或刺激或增強(qiáng)根的生長(zhǎng)、 和/或不定根形成、和/或側(cè)根形成、和/或根的向地性、和/或枝條生長(zhǎng)、和/或頂端優(yōu)勢(shì)、 和/或分枝、和/或衰老時(shí)間、和/或開(kāi)花時(shí)間、和/或花朵形成、和/或種子發(fā)育、和/或種子產(chǎn)量，所述方法包含在植物中，在可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子序列(例如細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子或器官特異性啟動(dòng)子序列)控制之下表達(dá)細(xì)胞分裂素降解控制蛋白質(zhì)，特別是細(xì)胞分裂素氧化酶。本發(fā)明所改變的特征優(yōu)選為細(xì)胞分裂素介導(dǎo)和/或生長(zhǎng)素介導(dǎo)的特征。本發(fā)明延伸到用于施行本發(fā)明方法的遺傳構(gòu)建體，以及隨之產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物，與同基因相應(yīng)物相比，該植物具有改變的形態(tài)學(xué)和/或生物化學(xué)和/或生理學(xué)性質(zhì)。
背景技術(shù)：
根是高等植物的重要器官。其主要功能是將植物固定在土壤中，并攝取水分和養(yǎng)分(N-營(yíng)養(yǎng)、礦物質(zhì)等)。因此，根的生長(zhǎng)對(duì)地面上器官的生長(zhǎng)和產(chǎn)量具有直接或間接的影響，特別是在養(yǎng)分受限的條件下。根也與產(chǎn)生植物次生產(chǎn)物有關(guān)，例如防御化合物和植物激
ο在許多重要作物中，根也是儲(chǔ)存器官。在歐洲，糖用甜菜是最重要的產(chǎn)糖植物O 億6千萬(wàn)噸/年；占世界產(chǎn)量的38%)。樹(shù)薯(木薯)、薯蕷和甘薯(batate)是重要的淀粉生產(chǎn)者(每種大約1億5千萬(wàn)噸/年)。其淀粉含量可高達(dá)馬鈴薯的兩倍。在許多植物(例如胡蘿卜、蘿卜)、草本植物(例如姜、kukuma)和藥用植物(例如人參)中，根也是用于消耗的器官。此外，在根中發(fā)現(xiàn)的一些次生植物產(chǎn)物具有化學(xué)和制藥工業(yè)的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。例如薯蕷，其包含用于合成類固醇激素的基本分子。另一個(gè)例子是紫草素，由紫草(Lithospermum erythrorhizon)發(fā)根培養(yǎng)的根制備。紫草素用于抗炎癥、抗腫瘤以及傷口愈合特性。此外，改善作物根的生長(zhǎng)還會(huì)增強(qiáng)與雜草植物的競(jìng)爭(zhēng)性，并提高水的可及性和攝取而改善在干旱地區(qū)的生長(zhǎng)。改善根的生長(zhǎng)也與生態(tài)目的有關(guān)，例如生物除污以及預(yù)防/阻止土壤侵蝕。根的構(gòu)造是尚有大量利用傳統(tǒng)繁殖未探索過(guò)的領(lǐng)域，因?yàn)殡y以在田間評(píng)價(jià)這種性狀。由于生物技術(shù)不依賴于大規(guī)模的田間篩選，因而可對(duì)改善該性狀具有重要影響。生物技術(shù)方法還需要對(duì)決定植物具體特征的分子元件的基本了解。如今，這些知識(shí)還只是零碎的，因此生物技術(shù)至今不能實(shí)現(xiàn)在此領(lǐng)域的突破。完善確定的的根生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)劑是植物生長(zhǎng)素。對(duì)生長(zhǎng)的植物施加吲哚-3-乙酸 (IAA)可促進(jìn)側(cè)根發(fā)育及側(cè)根伸長(zhǎng)(Torrey，Am J Bot 37 =257-264,1950 ；Blakely 等人， Bot Gaz 143 :341-352，1982 ;Muday 禾口 Haworth， Plant Physiol Biochem 32:193—203， 1994)。處于IAA濃度范圍下的根開(kāi)始增加許多側(cè)根(Kerk等人，Plant Physiol, 122
7925-932，2000)。此外，響應(yīng)特定濃度的外源植物生長(zhǎng)素而生成側(cè)根的根隨后置于較高濃度的IAA中，在現(xiàn)有的根之間形成許多額外的側(cè)根(Kerk等人，Plant Physiol, 122 :925-932, 2000)。相反，在包含植物生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑(包括NPA)的瓊脂上生長(zhǎng)的根的側(cè)根數(shù)目下降(Muday 和 Haworth，Plant Physiol Biochem 32:193-203,1994)。已經(jīng)分離了包含內(nèi)源性IAA水平升高的鼠耳芥屬(Arabidopsis)突變體(Boerjan 等人，Plant Cell 7 :1405_141，1995 ;Celenza等人，Gene Dev 9 :2131_2142，1995 ;King等 A, Plant Cell 7 :2023_2037，1995 ;Lehman 等人，Cell 85:183-194,1996)。目前已知它們是位于染色體2上單座位的等位基因。這些突變體的幼苗具有過(guò)量的不定根和側(cè)根，與上述施加外源植物生長(zhǎng)素的效果相一致。植物生長(zhǎng)素對(duì)形成不定根和側(cè)根的刺激效應(yīng)提示在轉(zhuǎn)基因植物中過(guò)量產(chǎn)生植物生長(zhǎng)素是促進(jìn)生根的有效策略。然而，這樣是否會(huì)產(chǎn)生具有改善特性的商用產(chǎn)品尚有疑問(wèn)。 除了對(duì)形成不定根和側(cè)根的刺激效應(yīng)以外，植物生長(zhǎng)素的過(guò)量生成引發(fā)其它效應(yīng)，例如葉子數(shù)目減少、葉子形態(tài)異常(狹窄、卷曲的葉子)、花序發(fā)育不全、頂端優(yōu)勢(shì)增強(qiáng)、莖上形成不定根，從農(nóng)學(xué)觀點(diǎn)來(lái)看，其中大部分不合需要(Klee等人，Genes Devel 1 =86-96,1987 ； Kares等人，Plant Mol Biol 15 :225_236，1990)。因此，有賴提高植物生長(zhǎng)素合成的方法的主要問(wèn)題在于容留問(wèn)題，即將植物生長(zhǎng)素的效應(yīng)局限于根。不可能利用組織特異性啟動(dòng)子克服這種容留問(wèn)題植物生長(zhǎng)素在植物中轉(zhuǎn)運(yùn)，因而其作用不局限于合成位點(diǎn)。另一問(wèn)題在于，植物生長(zhǎng)素是否總是提高根的總生物量。對(duì)于瓊脂中生長(zhǎng)的植物，已經(jīng)注意到逐步提高濃度刺激側(cè)根形成，但同時(shí)抑制這些根的長(zhǎng)出(Kerk等人，Plant Physiol, 122 =925-932, 2000)。通過(guò)本專利權(quán)利要求的實(shí)施方案，可解決上述有關(guān)容留植物生長(zhǎng)素效應(yīng)以及維持根的長(zhǎng)出的問(wèn)題。發(fā)明概述本發(fā)明涉及遺傳構(gòu)建體，其包含編碼鼠耳芥(Arbidopsis thaliana)的具有細(xì)胞分裂素氧化酶活性的蛋白質(zhì)的基因。該基因在調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。該啟動(dòng)子可由內(nèi)源性組織特異性或環(huán)境特異性因子調(diào)節(jié)，或者另外地，可應(yīng)用特定的化學(xué)制劑進(jìn)行誘導(dǎo)。本發(fā)明還涉及包含該遺傳構(gòu)建體的細(xì)胞或者植物。本發(fā)明還涉及在根或根的某些組織或細(xì)胞類型特異性的啟動(dòng)子控制下表達(dá)細(xì)胞分裂素氧化酶基因來(lái)改變根的構(gòu)造以及生物量的方法。發(fā)明詳述為了繞過(guò)上述關(guān)于提高植物生長(zhǎng)素生物合成的問(wèn)題，決定遵循另一方法。我們推論，與提高植物生長(zhǎng)素水平相比，下調(diào)植物生長(zhǎng)素的生物拮抗劑可能對(duì)根的生長(zhǎng)引起類似以至更大的影響。激素的作用以及相互作用極其復(fù)雜，但我們假定細(xì)胞分裂素能夠?qū)Ω纳L(zhǎng)起到植物生長(zhǎng)素拮抗劑的作用。植物組織培養(yǎng)的激素研究已經(jīng)顯示，植物生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比值比其中每種激素的絕對(duì)水平對(duì)于器官發(fā)生更為重要，這實(shí)際上表明這些激素起拮抗劑作用，至少在某些生物進(jìn)程中如此。此外，外源施用細(xì)胞分裂素抑制側(cè)根形成。 有趣的是，細(xì)胞分裂素處理對(duì)根的伸長(zhǎng)還有負(fù)面影響，這提示細(xì)胞分裂素控制根的分支以及根的長(zhǎng)出。總之，目前的文獻(xiàn)資料表明，提高細(xì)胞分裂素的水平負(fù)面影響根的生長(zhǎng)，但對(duì)該過(guò)程的機(jī)制并不了解。植物中細(xì)胞分裂素合成的位置處于根尖以及枝條的幼稚組織。細(xì)胞分裂素的內(nèi)生濃度在nM范圍內(nèi)。然而，由于難于量化，需要提取的相當(dāng)大的組織數(shù)量，以及并不知道實(shí)際的局部濃度。也不知道細(xì)胞分裂素的亞細(xì)胞區(qū)域化。一般認(rèn)為自由的堿基和核糖核苷定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，而糖苷定位于液泡。還存在化學(xué)結(jié)構(gòu)略微差異的不同細(xì)胞分裂素。因此，不知道外源細(xì)胞分裂素的效應(yīng)是否應(yīng)歸于細(xì)胞分裂素的總濃度的提高，還是更應(yīng)歸于其它形式的植物產(chǎn)生的細(xì)胞分裂素(結(jié)構(gòu)、細(xì)胞或亞細(xì)胞定位不同)競(jìng)爭(zhēng)受體、轉(zhuǎn)位分子、運(yùn)輸器、修飾酶......為了檢驗(yàn)根中細(xì)胞分裂素水平實(shí)際上超出最適于根生長(zhǎng)水平的假設(shè)，從鼠耳芥中克隆了編碼細(xì)胞分裂素氧化酶(即細(xì)胞分裂素代謝酶)的新基因(記為AtCKX)，然后在強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子下于轉(zhuǎn)基因煙草和鼠耳芥屬中表達(dá)。顯示AtCKX mRNA表達(dá)以及細(xì)胞分裂素氧化酶活性提高的轉(zhuǎn)化子還顯示根的形成和生長(zhǎng)增強(qiáng)。也觀察到對(duì)枝條生長(zhǎng)的負(fù)效應(yīng)。后者與這些植物中細(xì)胞分裂素氧化酶基因的組成型表達(dá)一致，說(shuō)明細(xì)胞分裂素氧化酶基因的局限性表達(dá)對(duì)一般植物生長(zhǎng)特性的重要性。利用細(xì)胞_、組織-或器官-特異性啟動(dòng)子能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞分裂素氧化酶活性的保留，因?yàn)槿缫陨辖忉?，?xì)胞分裂素的降解過(guò)程限于表達(dá)CKX 蛋白質(zhì)的組織或細(xì)胞，這與依賴激素合成的過(guò)程不同。觀察到的細(xì)胞分裂素氧化酶表達(dá)對(duì)枝條生長(zhǎng)的負(fù)效應(yīng)表明細(xì)胞分裂素氧化酶是設(shè)計(jì)或篩選生長(zhǎng)促進(jìn)化學(xué)劑的令人關(guān)注的靶標(biāo)。這種化學(xué)劑應(yīng)抑制細(xì)胞分裂素氧化酶活性，最好不被轉(zhuǎn)運(yùn)到根，并應(yīng)在土壤中快速降解，以便施用這些化學(xué)劑不會(huì)抑制根的生長(zhǎng)。 細(xì)胞分裂素還延遲葉的衰老，這意味著正效應(yīng)包括光合組織的生長(zhǎng)和維持。另外，細(xì)胞分裂素延遲衰老、增強(qiáng)葉子的綠化(葉綠素含量)并減弱枝條的頂端優(yōu)勢(shì)的結(jié)果表明基于抑制植物地上部分中CKX活性的策略(例如反義、核糖酶以及共抑制技術(shù))能夠?qū)е卵舆t衰老、 增強(qiáng)葉子綠化并增加分枝。類似地，觀察到的細(xì)胞分裂素氧化酶表達(dá)對(duì)根生長(zhǎng)的正效應(yīng)表明細(xì)胞分裂素氧化酶是設(shè)計(jì)或篩選除草劑的令人關(guān)注的靶標(biāo)。這種除草劑應(yīng)抑制細(xì)胞分裂素氧化酶活性，最好不被轉(zhuǎn)運(yùn)到枝條，以及應(yīng)在能穿過(guò)土壤給予根的溶劑中可溶并相對(duì)穩(wěn)定。細(xì)胞分裂素氧化酶過(guò)量表達(dá)對(duì)植物發(fā)育和構(gòu)造的這些效應(yīng)迄今未知，因而本發(fā)明及其實(shí)施方案是意想不到的。觀察到的對(duì)枝條生長(zhǎng)的負(fù)效應(yīng)表明操縱細(xì)胞分裂素氧化酶還可用于獲得矮化表型。矮化表型對(duì)經(jīng)濟(jì)作物例如谷類和果木特別有用。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案涉及細(xì)胞分裂素氧化酶表達(dá)對(duì)植物生長(zhǎng)和構(gòu)造(特別是根的生長(zhǎng)和構(gòu)造)的正效應(yīng)。鼠耳芥屬中細(xì)胞分裂素氧化酶基因家族包含至少六個(gè)成員(見(jiàn)如下實(shí)施例)，本發(fā)明人已經(jīng)表明，其中一些基因在轉(zhuǎn)基因植物中實(shí)現(xiàn)的效應(yīng)存在量的差異。鑒于有證據(jù)表明許多綠色植物(Hare和van Staden，Physiol Plant 91: 128-136，1994 Jones 和 khreiber，Plant Growth Reg 23 :123-134,1997)以及其它生物 (Armstrong, in Cytokinins Chemistry, Activity and Function. Eds Mok and Mok, CRC Press, ppl39-154,1994)中存在細(xì)胞分裂素氧化酶活性，可以預(yù)料，能夠從其它生物中分離所述鼠耳芥屬細(xì)胞分裂素氧化酶的功能性同系物。因此，在本發(fā)明中發(fā)揮功能的細(xì)胞分裂素氧化酶的序列不必與此處所述相同。通常本發(fā)明可特別用于谷類作物和單子葉作物， 也可以利用來(lái)自諸如小麥或玉米的細(xì)胞分裂素氧化酶基因(Morris等人，1999 ；Rinaldi和 Comandini, 1999)?？梢韵氲骄哂屑?xì)胞分裂素氧化酶活性或者任何其它細(xì)胞分裂素代謝活性的其它基因(參見(jiàn)ZaiimalOV^等人，Biochemistry and Molecular Biology of Plant Hormones, Hooykaas, Hall and Libbenga(Eds. ), Elsevier Science,ppl41_160,1997)也可以用于本發(fā)明目的。類似地，編碼可增加內(nèi)源性細(xì)胞分裂素代謝活性的蛋白質(zhì)的基因也可以用于本發(fā)明目的。原則上，還可以通過(guò)干擾在細(xì)胞分裂素下游行使功能的基因(例如參與細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的受體或者蛋白質(zhì))來(lái)獲得類似表型。為了本發(fā)明目的，應(yīng)當(dāng)理解術(shù)語(yǔ)"根的生長(zhǎng)"包含單子葉和雙子葉植物中組成根系的不同部分在其不同發(fā)育階段中生長(zhǎng)的所有方面。應(yīng)當(dāng)理解，增強(qiáng)根的生長(zhǎng)能夠起因于增強(qiáng)其一個(gè)或多個(gè)部分的生長(zhǎng)，包括初生根、側(cè)根、不定根等，其均屬于本發(fā)明范圍之內(nèi)。根據(jù)第一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明涉及刺激根生長(zhǎng)和/或增強(qiáng)側(cè)根和/或不定根形成和/或改變根的向地性的方法，其包含在植物或植物部分中表達(dá)植物細(xì)胞分裂素氧化酶或者表達(dá)可降低活性細(xì)胞分裂素水平的另一蛋白質(zhì)。在本發(fā)明上下文中，應(yīng)當(dāng)理解術(shù)語(yǔ)〃表達(dá)〃和/或〃過(guò)量表達(dá)〃可互換使用，兩者均涉及"增強(qiáng)和/或異位表達(dá)"植物細(xì)胞分裂素氧化酶或者可減低植物中活性細(xì)胞分裂素水平的其它任何蛋白質(zhì)。應(yīng)當(dāng)清楚，此處意在增強(qiáng)植物細(xì)胞分裂素氧化酶表達(dá)，以及" 從頭(de novo)“表達(dá)植物細(xì)胞分裂素氧化酶或者所述其它蛋白質(zhì)。另外，所述其它蛋白質(zhì)增強(qiáng)植物細(xì)胞分裂素氧化酶的細(xì)胞分裂素代謝活性。還應(yīng)理解在本發(fā)明上下文中，表述"側(cè)根和/或不定根"意味著"側(cè)根和不定根"，也意味著"側(cè)根或不定根"?？梢栽鰪?qiáng)側(cè)根形成或者不定根形成，以及兩種類型的非初生根形成，但并不一定。根據(jù)另外的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及刺激根生長(zhǎng)和/或增強(qiáng)側(cè)根或不定根形成和/ 或改變根的向地性和/或增加產(chǎn)量和/或增強(qiáng)早期活力和/或改變根/枝比率和/或提高倒伏抗性和/或增加耐旱性和/或促進(jìn)外植體體外繁殖的方法，其包含在植物或植物部分中表達(dá)植物細(xì)胞分裂素氧化酶或者表達(dá)可降低活性細(xì)胞分裂素水平的另一蛋白質(zhì)。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明涉及通過(guò)在植物或植物部分(優(yōu)選根部)過(guò)量表達(dá)細(xì)胞分裂素氧化酶(優(yōu)選本發(fā)明的細(xì)胞分裂素氧化酶)或者可降低活性細(xì)胞分裂素水平的另一蛋白質(zhì)來(lái)刺激根生長(zhǎng)使根塊(root mass)增大的方法。由過(guò)量表達(dá)促生長(zhǎng)序列而提高根部生物量產(chǎn)生對(duì)產(chǎn)量具有直接效應(yīng)，對(duì)根細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因根細(xì)胞或所述轉(zhuǎn)基因根細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物所生成化合物的產(chǎn)生具有間接效應(yīng)。根培養(yǎng)物中生成的一個(gè)引人關(guān)注的化合物的例子是紫草素，能夠利用所述方法方便地增加其產(chǎn)量。根據(jù)更具體的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及刺激根生長(zhǎng)或增強(qiáng)側(cè)根和不定根形成或改變根的向地性的方法，其包含表達(dá)編碼植物細(xì)胞分裂素氧化酶的核酸，其選自(a)包含任何 SEQ ID NO 27、1、3、5、7、9、11、25、26、沘_31、33 或 34，或其互補(bǔ)序列所示的DNA序列的核酸，(b)包含對(duì)應(yīng)于任何 SEQ ID NO 27、1、3、5、7、9、11、25、26、28_31，33 或 34，或其互補(bǔ)序列的RNA序列的核酸，(c)與任何 SEQ ID NO 27、1、3、5、7、9、11、25、26、沘_31、33 或 34，或其互補(bǔ)序列特
異性雜交的核酸，(d)編碼包含任何SEQ ID NO 2、4、6、8、10、12、32或35，或其互補(bǔ)序列所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸，(e)任何(a)-(d)定義的核酸，其特征在于所述核酸是DNA、基因組DNA、cDNA、合成DNA或RNA (其中T替換為U)，(f)通過(guò)遺傳密碼可簡(jiǎn)并為任何SEQ ID NO 27、1、3、5、7、9、11、25、26、28_31、33或 34中所示的核酸的核酸，或者簡(jiǎn)并為任何(a)-(e)中定義的核酸的核酸，(g)由于生物之間密碼子使用的差異，不同于編碼任何SEQ ID NO 2、4、6、8、10、 12、32或35中所示的蛋白質(zhì)的核酸的核酸，或者不同于任何(a)-(e)中定義的核酸的核酸，(h)編碼SEQ ID NO 2、4、6、8、10、12或35中所示蛋白質(zhì)的核酸，或者(a)-(e)中定義的核酸，其由于等位基因之間的差異而不同，⑴編碼任何SEQ ID NO 2、4、6、8、10、12或35中所示的蛋白質(zhì)的核酸，(j)任何(a)-(i)中定義的核酸的、具有細(xì)胞分裂素氧化酶生物活性的功能性片段，以及(k)編碼植物細(xì)胞分裂素氧化酶的核酸，或者包含在植物或植物部分中表達(dá)編碼(優(yōu)選在根中)可降低活性細(xì)胞分裂素水平的蛋白質(zhì)的核酸。本發(fā)明中，已經(jīng)分離了編碼新的鼠耳芥細(xì)胞分裂素氧化酶的核酸，本發(fā)明人首次另人驚奇地表明，細(xì)胞分裂素氧化酶在轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物部分中的表達(dá)引起上述根相關(guān)性特征。細(xì)胞分裂素氧化酶的表達(dá)優(yōu)選于根中進(jìn)行，優(yōu)選位于根特異性啟動(dòng)子的控制之下。SEQ ID NO 36提供了這種根特異性啟動(dòng)子的一個(gè)例子。應(yīng)當(dāng)清楚，雖然本發(fā)明在實(shí)施例部分通過(guò)幾種新的AtCKX基因和蛋白質(zhì)得到支持，本發(fā)明構(gòu)思還涉及利用從其它植物中(優(yōu)選在所述其它植物的根中)分離并表達(dá)的其它細(xì)胞分裂素氧化酶，以在植物中獲得與實(shí)施例部分所述類似的效應(yīng)。因此，本發(fā)明更一般涉及利用編碼植物細(xì)胞分裂素氧化酶的核酸或者編碼可降低活性細(xì)胞分裂素水平的蛋白質(zhì)的核酸在植物或植物部分中來(lái)刺激根的生長(zhǎng)或增強(qiáng)側(cè)根或不定根形成或改變根的向地性。優(yōu)選使用的細(xì)胞分裂素氧化酶由以上定義的編碼細(xì)胞分裂素氧化酶的核酸編碼，以及由以下定義的本發(fā)明的新核酸編碼。本發(fā)明涉及分離的編碼具有細(xì)胞分裂素氧化酶活性的新植物蛋白質(zhì)的核酸，其選自(a)包含任何SEQ ID NO四、3、5、9、26、27、31、33或34、或其互補(bǔ)序列所示的DNA
序列的核酸，(b)包含對(duì)應(yīng)于任何SEQ ID NO四、3、5、9、26、27、31、33或34、或其互補(bǔ)序列的 RNA序列的核酸，(c)與任何SEQ ID NO 29、3、5、9J6、27、31、33或34，或其互補(bǔ)序列所示的核酸特
異性雜交的核酸，(d)編碼編碼具有包含SEQ ID NO 32所示的多肽的氨基酸序列、并且與SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列至少70 %、優(yōu)選至少75 %、80 %或85 %、更優(yōu)選至少90 %或95 %、最優(yōu)選至少99%相似性的蛋白質(zhì)的核酸，(e)編碼具有與SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列至少35%、優(yōu)選37%、40%、45%、 47%或 50%、更優(yōu)選 55%、60%、65%、70%、75%或 80%、最優(yōu)選 85%、90%或 95%相似性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸，(f)編碼具有與SEQ ID NO 10或35所示的氨基酸序列至少35%、優(yōu)選37%、40%、 45%、47%或50%、更優(yōu)選55%、60%、65%、70%、75%或80%、最優(yōu)選85%、90%或95%相似性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸，(g)編碼包含任何SEQ ID NO 4、6、10、32或35中所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸，(h)通過(guò)遺傳密碼可簡(jiǎn)并為任何SEQ ID NO 29、3、5、9、沈、27、33或；34中所示核酸的核酸，或者簡(jiǎn)并為任何(a)-(g)中定義的核酸的核酸，(i)由于生物之間密碼子使用的差異，不同于編碼任何SEQ ID N04、6、10或35中所示蛋白質(zhì)的核酸的核酸，或者不同于任何(a)-(g)中定義的核酸的核酸，(j)編碼SEQ ID NO 4、6、10或35中所示的蛋白質(zhì)的核酸，或者(a)-(g)中定義的核酸，其由于等位基因之間的差異而不同，(k)編碼任何SEQ ID NO四、3、5、9、26、27、31、33或；34中所示的核酸編碼的細(xì)胞分裂素氧化酶的免疫活性片段的核酸，或者任何(a)-(j)中定義的核酸的免疫活性片段的編碼核酸，(1)編碼任何SEQ ID NO四、3、5、9、26、27、31、33或；34中所示核酸編碼的細(xì)胞分裂素氧化酶的功能性片段的核酸，或者任何(a)-(j)中定義的核酸的功能性片段的編碼核酸，其中所述片段具有細(xì)胞分裂素氧化酶的生物活性，以及(m)編碼SEQ ID NO 4、6、10或35中定義的蛋白質(zhì)的核酸，只要所述核酸不是按下列Genbank登錄號(hào)保藏的核酸AC005917、AB024035和 AC023754本發(fā)明還涉及本發(fā)明分離的核酸，它們是DNA、cDNA、基因組DNA或合成的DNA、或 RNA (其中T替換為U)。本發(fā)明還涉及與本發(fā)明的核酸特異性雜交或特異性擴(kuò)增的至少15個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的核酸分子。根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸的載體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述載體是表達(dá)載體，其中該核酸與使該序列在原核和/或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)的一種或多種控制序列有效連接。應(yīng)當(dāng)理解，為了在單子葉植物中表達(dá)本發(fā)明的細(xì)胞分裂素氧化酶基因，應(yīng)該使用對(duì)應(yīng)于cDNA序列的核酸序列以避免單子葉植物中內(nèi)含子的錯(cuò)誤剪接。在單子葉植物中表達(dá)的優(yōu)選cDNA序列具有SEQ ID N025-30和34所示的核酸序列。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的任何核酸分子或載體的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞選自細(xì)菌、昆蟲(chóng)、真菌、植物或動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及由本發(fā)明核酸編碼的分離的多肽、或其同系物或衍生物、或其免疫活性或功能性片段。本發(fā)明優(yōu)選的多肽包含任何SEQ ID NO 2、4、6、8、10、12、 32和35所示氨基酸序列、或其同系物或衍生物、或其免疫活性和/或功能性片段。在另一更優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有SEQ ID NO 2、4、6、8、10、12或35所示的氨基酸序列的多肽、或其同系物或衍生物、或其免疫活性和/或功能性片段。其優(yōu)選的功能性片段是缺乏其信號(hào)肽的片段。
根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明涉及產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包含在使該多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，并從培養(yǎng)物中回收生成的多肽。本發(fā)明還涉及特異性識(shí)別本發(fā)明多肽或其特異性表位的抗體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞或植物組織的方法，其包含在所述植物、植物細(xì)胞或植物組織中引入可表達(dá)形式的本發(fā)明的核酸分子或者本發(fā)明的載體。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生改變的植物、植物細(xì)胞或植物組織的方法，其包含將本發(fā)明的多肽直接引入所述植物的細(xì)胞、組織或器官中。根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明涉及實(shí)現(xiàn)本發(fā)明多肽表達(dá)的方法，其包含在植物細(xì)胞的基因組中穩(wěn)定引入與一個(gè)或多個(gè)控制序列有效連接的本發(fā)明的核酸分子或者本發(fā)明的載體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及上述方法，其另外包含由所述植物細(xì)胞再生為植物。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸序列的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，該序列與使其在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)的調(diào)控成分有效聯(lián)接，或可利用以上闡述的方法獲得。根據(jù)另一優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明涉及此處上述的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中本發(fā)明的核酸穩(wěn)定整合到該植物細(xì)胞的基因組中。本發(fā)明另外涉及包含此處所述植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物或植物組織，也涉及所述轉(zhuǎn)基因植物可收獲的部分，優(yōu)選地選自種子、葉子、果實(shí)、莖培養(yǎng)物、根、塊莖、根莖和鱗莖。本發(fā)明還涉及來(lái)源于任何所述轉(zhuǎn)基因植物或植物部分的后代。根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明涉及刺激根生長(zhǎng)的方法，其包含在植物或植物部分中表達(dá)本發(fā)明的核酸或者表達(dá)可降低活性細(xì)胞分裂素水平的另一蛋白質(zhì)。植物細(xì)胞或組織培養(yǎng)即人工產(chǎn)生的植物細(xì)胞或植物組織培養(yǎng)物，其在特定的培養(yǎng)基(液體或固體)中生長(zhǎng)，以提供這些植物細(xì)胞或組織生長(zhǎng)和/或產(chǎn)生某些化合物所必需的各種條件。植物細(xì)胞和/或組織培養(yǎng)能用于快速繁殖植物以及產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，僅舉幾個(gè)例子。某些外植體或者在所述的某些培養(yǎng)條件下難以形成根，在所述培養(yǎng)的植物細(xì)胞或組織中表達(dá)細(xì)胞分裂素氧化酶基因能夠用于增強(qiáng)根形成。植物細(xì)胞和/或組織培養(yǎng)還能用于工業(yè)生產(chǎn)有價(jià)值的化合物?？赡苌a(chǎn)的化合物有藥物、殺蟲(chóng)劑、顏料、化妝品、香料、食品添加劑等。該產(chǎn)品的一個(gè)例子是紫草素，由植物紫草(Lithospermum erythrorhizon)的根產(chǎn)生。植物組織培養(yǎng)的例子有毛根培養(yǎng)物，其是人工制備的毛根塊。紫草的根難以大量收集，通過(guò)制備毛根培養(yǎng)物，能夠比常規(guī)速度更快地工業(yè)上制備終產(chǎn)品紫草素。如此處所公開(kāi)，表達(dá)細(xì)胞分裂素氧化酶增強(qiáng)了根的生長(zhǎng)和發(fā)育，因此能夠方便地用于所述植物細(xì)胞以及組織培養(yǎng)過(guò)程中。因此，本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供了刺激根的生長(zhǎng)和發(fā)育的方法，其包含在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或包含該轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的組織培養(yǎng)中表達(dá)植物細(xì)胞分裂素氧化酶、 優(yōu)選本發(fā)明的細(xì)胞分裂素氧化酶的編碼核酸。本發(fā)明另外涉及增強(qiáng)側(cè)根或不定根形成的方法，其包含在植物或植物部分中表達(dá)本發(fā)明的核酸或者表達(dá)可降低活性細(xì)胞分裂素水平的另一蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及改變根向地性的方法，其包含在植物或植物部分中改變本發(fā)明核酸的表達(dá)或者表達(dá)可降低活性細(xì)胞分裂素水平的另一蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及增強(qiáng)早期活力和/或改變根/枝條比率和/或提高倒伏抗性和/或增加耐旱性和/或促進(jìn)外植體體外繁殖的方法，其包含在植物或植物部分中表達(dá)本發(fā)明的核酸或者表達(dá)可降低活性細(xì)胞分裂素水平的另一蛋白質(zhì)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及增加根的大小或者根分生組織大小的方法，其包含在植物或植物部分、優(yōu)選根中表達(dá)本發(fā)明的核酸或者表達(dá)可降低活性細(xì)胞分裂素水平的另一蛋白質(zhì)。根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明涉及增加枝條分生組織大小的方法，其包含優(yōu)選在枝條中下調(diào)本發(fā)明核酸的表達(dá)。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明涉及延遲葉片老化的方法，其包含在葉片中、優(yōu)選開(kāi)始老化的葉片中下調(diào)本發(fā)明的任何細(xì)胞分裂素氧化酶的表達(dá)。本發(fā)明還涉及改變?nèi)~片老化的方法，其包含在開(kāi)始老 化的葉片中表達(dá)一種細(xì)胞分裂素氧化酶。本發(fā)明還涉及增加葉片厚度的方法，其包含在植物或植物部分、優(yōu)選葉片中表達(dá)本發(fā)明的核酸或者表達(dá)可降低活性細(xì)胞分裂素水平的另一蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及降低導(dǎo)管大小的方法，其包含在植物或植物部分、優(yōu)選導(dǎo)管中表達(dá)本發(fā)明的核酸或者表達(dá)可降低活性細(xì)胞分裂素水平的另一蛋白質(zhì)。本發(fā)明另外涉及增加導(dǎo)管大小的方法，其包含下調(diào)本發(fā)明核酸在植物或植物部分中的表達(dá)。根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明涉及提高幼苗直立性(standability)的方法，其包含表達(dá)本發(fā)明的核酸，或者包含表達(dá)可降低幼苗中活性細(xì)胞分裂素水平的另一蛋白質(zhì)。此外，本發(fā)明涉及上述任何方法，所述方法導(dǎo)致產(chǎn)量增加。本發(fā)明另外涉及本發(fā)明的任何方法，其中所述核酸的表達(dá)處于強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子控制之下。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的任何方法，其中所述核酸的表達(dá)處于優(yōu)選在根中表達(dá)的啟動(dòng)子控制之下。表5包括了根特異性啟動(dòng)子的不完全清單。用于本發(fā)明方法的優(yōu)選啟動(dòng)子為根clavata同源性(root clavata homolog)啟動(dòng)子，具有SEQ ID NO 36所示的序列。根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明涉及改變細(xì)胞命運(yùn)和/或改變植物發(fā)育和/或改變植物形態(tài)學(xué)和/或改變植物生物化學(xué)和/或改變植物生理學(xué)和/或改變細(xì)胞周期前進(jìn)速度的方法，其包含改變本發(fā)明核酸在植物特定的細(xì)胞、組織或器官中的表達(dá)。本發(fā)明還涉及獲得增強(qiáng)生長(zhǎng)、和/或提高產(chǎn)量和/或改變植物細(xì)胞、組織和/或器官老化、和/或增加植物側(cè)生器官形成頻率的方法，其包含異位表達(dá)本發(fā)明的核酸。本發(fā)明還涉及在不利的生長(zhǎng)條件和/或壓力下促進(jìn)和延長(zhǎng)細(xì)胞中細(xì)胞分裂活性的方法，其包含異位表達(dá)本發(fā)明的核酸序列。根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明涉及識(shí)別并獲得與本發(fā)明多肽相互作用的蛋白質(zhì)的方法，其包含利用本發(fā)明多肽的篩選試驗(yàn)。在更優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及識(shí)別并獲得與本發(fā)明多肽相互作用的蛋白質(zhì)的方法，其包含雙雜交篩選試驗(yàn)，其中利用本發(fā)明多肽為誘餌(bait)及cDNA文庫(kù)為捕獲物 (prey)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及調(diào)節(jié)本發(fā)明多肽與通過(guò)上述方法獲得的互相作用蛋白質(zhì)之間相互作用的方法。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及識(shí)別并獲得與本發(fā)明多肽相互作用的化合物的方法，其包含步驟a)提供雙雜交系統(tǒng)，其中本發(fā)明多肽以及通過(guò)上述方法獲得的互相作用蛋白質(zhì)，b)所述化合物與a)中定義的表達(dá)的多肽形成的復(fù)合物相互作用，以及，
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c)對(duì)所述化合物與所述多肽或a)中定義的表達(dá)多肽形成的復(fù)合物的相互作用進(jìn)行(實(shí)時(shí))測(cè)量。本發(fā)明進(jìn)一步涉及識(shí)別與本發(fā)明多肽特異性結(jié)合的化合物、或化合物的混合物的方法，包含a)在適于復(fù)合物形成的條件下，將本發(fā)明多肽與所述化合物或化合物的混合物結(jié)合，以及，b)檢測(cè)復(fù)合物形成，其中復(fù)合物存在可識(shí)別特異性結(jié)合所述多肽的化合物或混合物。本發(fā)明還涉及上述方法，其中所述化合物或混合物抑制本發(fā)明所述多肽的活性， 并能用于合理設(shè)計(jì)化學(xué)劑。根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明涉及上述方法識(shí)別的化合物或混合物作為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑或除草劑的用途。本發(fā)明還涉及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑或除草劑組合物的生產(chǎn)方法，其包含上述化合物篩選法步驟，以及將該步驟獲得的化合物配制成適當(dāng)形式以應(yīng)用到農(nóng)業(yè)或植物細(xì)胞或組織培養(yǎng)中。本發(fā)明還涉及增加分枝的方法，其包含在植物或植物部分中、優(yōu)選莖或腋芽中表達(dá)本發(fā)明的核酸。本發(fā)明還涉及提高倒伏抗性的方法，其包含在植物或植物部分中、優(yōu)選莖或腋芽中表達(dá)本發(fā)明的核酸。本發(fā)明還涉及設(shè)計(jì)或篩選促生長(zhǎng)的化學(xué)劑或除草劑的方法，其包含利用本發(fā)明的核酸或本發(fā)明的載體。根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明涉及將本發(fā)明的核酸分子、本發(fā)明的載體、或本發(fā)明的
多肽用于提高產(chǎn)量。本發(fā)明還涉及將本發(fā)明的核酸分子、本發(fā)明的載體、或本發(fā)明的多肽用于刺激根生長(zhǎng)。本發(fā)明還涉及將本發(fā)明的核酸分子、本發(fā)明的載體、或本發(fā)明的多肽用于增強(qiáng)側(cè)根或不定根形成。本發(fā)明還涉及將本發(fā)明的核酸分子、本發(fā)明的載體、或本發(fā)明的多肽用于改變根的向地性。本發(fā)明另外涉及將本發(fā)明的核酸分子、本發(fā)明的載體、或本發(fā)明的多肽用于增強(qiáng)早期活力和/或改變根/枝條比率和/或提高倒伏抗性和/或增強(qiáng)耐旱性和/或促進(jìn)外植體的體外繁殖。本發(fā)明還涉及將本發(fā)明的核酸分子本發(fā)明的重組載體或本發(fā)明的多肽用于改變植物發(fā)育和/或改變植物形態(tài)學(xué)和/或改變植物生物化學(xué)和/或改變植物生理學(xué)。根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明涉及診斷組合物，其至少包含本發(fā)明的核酸分子、本發(fā)明的載體、本發(fā)明的多肽或本發(fā)明的抗體。本發(fā)明另一實(shí)施方案涉及在與接穗嫁接過(guò)程中利用轉(zhuǎn)基因根狀莖(其根的生長(zhǎng)和發(fā)育由于表達(dá)細(xì)胞分裂素氧化酶而增強(qiáng))來(lái)產(chǎn)生農(nóng)業(yè)或園藝特性得到改善的植物或樹(shù)。 接穗可能是轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因的。此實(shí)施方案的具體特征是由根系賦予的特定性狀，包括
15增強(qiáng)植物/樹(shù)木在土壤中的固定和/或提高水的攝取而導(dǎo)致例如耐旱性增強(qiáng)、和/或提高從土壤中攝取養(yǎng)分和/或增強(qiáng)植物的有機(jī)物轉(zhuǎn)運(yùn)、和/或增加物質(zhì)分泌到土壤中(例如植物含鐵細(xì)胞)、和/或改善呼吸作用和/或提高抗病性和/或增加產(chǎn)量。利用AtCKX轉(zhuǎn)化的根狀莖進(jìn)行嫁接的好處，除增強(qiáng)根系之外，還如此處所公開(kāi)，在于延遲接枝上葉片的老化 (參見(jiàn)

圖12A)。此特定實(shí)施方案優(yōu)選的植物或樹(shù)木包括利用自身根生長(zhǎng)不良、且嫁接栽培的植物或樹(shù)木，例如具有商業(yè)利益的各種葡萄、柑橘、杏、扁桃、李子、桃、蘋(píng)果、梨、櫻桃、胡桃、無(wú)花果、榛子和枇杷。如上所述，在某些生物過(guò)程中植物生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素作為拮抗劑。例如，細(xì)胞分裂素/植物生長(zhǎng)素的比率調(diào)節(jié)根和枝條的產(chǎn)生，高濃度的植物生長(zhǎng)素引起生根，高濃度的細(xì)胞分裂素引起枝條生長(zhǎng)。如本發(fā)明所公開(kāi)，在煙草和鼠耳芥屬中表達(dá)細(xì)胞分裂素氧化酶引起根的發(fā)育增強(qiáng)，與植物生長(zhǎng)素效應(yīng)增強(qiáng)相一致。果實(shí)發(fā)育中也涉及植物生長(zhǎng)素。植物生長(zhǎng)素處理雌花部導(dǎo)致某些植物品種發(fā)育單性果實(shí)。通過(guò)增強(qiáng)雌性生殖器官中植物生長(zhǎng)素的生物合成，幾種園藝作物植物已經(jīng)遺傳工程改造為單性果實(shí)發(fā)育(W00105985)。因此，根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)植物單性性狀的方法，該方法包含在植物或植物部分中、 優(yōu)選在雌性生殖器官例如胎座、胚珠及其衍生組織中下調(diào)一種或多種細(xì)胞分裂素氧化酶、 或者可降低活性細(xì)胞分裂素水平的另一蛋白質(zhì)的表達(dá)。金魚(yú)草(Antirrhinum majus)DefH9 啟動(dòng)子區(qū)或其同系物之一(其在胎座和胚珠提供特異性高效表達(dá))能夠用于此目的。定義及實(shí)施方案詳述本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，除明確描述以外，此處所述本發(fā)明可能變更和修改。 應(yīng)當(dāng)理解此處所述本發(fā)明包括所有這些變更和修改。本發(fā)明還包括本說(shuō)明書(shū)中涉及或表明的所有這類步驟、特征、組合物和化合物，單個(gè)或全體，以及任一或更多所述步驟或特征的任意或所有組合。本發(fā)明適用于任何植物，特別是單子葉植物和雙子葉植物，包括飼料或豆科飼料、觀賞植物、糧食作物、樹(shù)木、或灌木，選自金合歡屬(Acacia spp.)，槭樹(shù)屬(Acer spp.)，稱猴桃屬(Actinidia spp.)，七葉樹(shù)屬(Aesculus spp.)，新西蘭貝殼杉(Agathis australis), Albizia amara, Alsophila tricolor,須芒草屬(Andropogon spp.)，落花生屬(Arachis spp·)，模榔(Areca catechu)，Astelia fragrans，Astragalus cider, Baikiaea pluri juga, W M (Betula spp. )， I 胃 M (Brassica spp. )， 7^ 1 (Bruguiera gymnorrhiza)， Burkea africana,I5P (Butea frondosa)， Cadaba farinosa, (Calliandra spp, ), Bf ^ (Camellia sinensis), ^ A^l (Canna indica), M 1 M (Capsicum spp.)，決明屬(Cassia spp. )，Centroema pubescens, 7^ 瓜屬(Chaenomeles spp.)，肉桂(Cinnamomum cassia)，小果叻口啡(Coffea arabica)， Colophospermum mopane, ^7Jn S^ (Coronillia varia), Cotoneaster serotina, ill 植屬(Crataegus spp.)，香瓜屬(Cucumis spp.)，豐白木屬(Cupressus spp. ), Cyathea dealbata,溫梓(Cydonia oblonga)，臼本柳杉(Cryptomeria japonica)，香茅屬 (Cymbopogon spp. ), Cynthea dealbata, Im^ (Cydonia oblonga) ,Dalbergia monetaria, 大葉骨碎補(bǔ)(Davallia divaricata)，角絲鼓藻屬(Desmodium spp.)，粗糙蛘殼蕨 (Dicksonia squarosa), Diheteropogon amplectens, Dioclea spp，f廉扁 屬(Dolichos spp.), Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidal is, Ehrartia spp. ’務(wù)子(Eleusine coracana) ,Eragrestis spp·，束Ij桐屬(Erythrina spp. ) , ) (Eucalyptus spp. ),Eucleaschimperi，Eulaliavillosa，養(yǎng)麥屬(Fagopyrum spp·)，費(fèi)約果(Fei joa sellowiana), 草莓屬(Fragaria spp.)，千斤拔屬(Flemingia spp)，F(xiàn)reycinetia banksii，Geranium thunbergii，銀杏(Ginkgo biloba)， Glycine javanica， Gliricidia spp,陸地棉 (Gossypium hirsutum)，銀禪屬(Grevillea spp.)，Guibourtia coleosperma，巖黃蔑屬 (Hedysarum spp.)，牛鞭草(Hemarthia altissima)，扭黃茅(Heteropogon contortus)， 大麥(Hordeum vulgare), Hyparrhenia rufa，小連S (Hypericum erectum)，Hyperthelia dissoluta, Indigo incarnata, ^^M (Iris spp.), Leptarrhena pyrolifolia, ^Ι^^Μ (Lespediza spp.)，Lettuca spp.，Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesii，百脈根屬(Lotus spp.)，Macrotyloma axillare，蘋(píng)果屬(Malus spp.)， Manihot esculenta，紫苜猜(Medicago sativa)，水杉(Metasequoia glyptostroboides), 大蕉(Musa sap i en turn)，煙草屬(Nicotiana spp.)，馬戶食豆屬(Onobrychis spp.)， Ornithopus spp.，禾§屬(Oryza spp.)，Peltophorum africanum，各良尾草屬(Pennisetum spp.)，Persea gratissima，碧冬前屬(Petunia spp.)，菜豆屬(Phaseolus spp.)，模榔竹(Phoenix canariensis)，Phormium cookianum，石楠屬(Photinia spp.)，白云杉 (Picea glauca)，松屬(Pinus spp·)，豌豆(Pisum sativum)，新西蘭羅漢松(Podocarpus totara), Pogonarthria fleckii, Pogonarthria squarrosa,(Populus spp.),iKS 樹(shù)(Prosopis cineraria)，花方萁松(Pseudotsuga menziesii)，Pterolobium stellatum， 西洋梨(Pyrus communis),櫟屬(Quercus spp.)，Rhaphiolepsis umbel lata,美味棒花掠(Rhopalostylis sapida), Rhus natalensis，歐洲醋栗(Ribes grossularia)， 荼薦子屬(Ribes spp.)，洋槐(Robinia pseudoacacia)，薔薇屬(Rosa spp.)，懸鉤子屬(Rubus spp·)，柳屬(Salix spp.), Schyzachyrium sanguineum，金松(Sciadopitys verticillata)，北美紅杉(Sequoia sempervirens)，巨杉(Sequoiadendron giganteum)， 兩色蜀黍(Sorghum bicolor)，菠菜屬(Spinacia spp.)， Sporobolus fimbriatus， Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis，葫戸荼屬(Tadehagi spp)，落習(xí)習(xí)杉 (Taxodium distichum)，阿拉伯黃背草(Themeda triandra)，車(chē)軸草屬(Trifolium spp.)， 小麥屬(Triticum spp.)，異葉鐵杉(Tsuga heterophylla)，越桔屬(Vaccinium spp.)，里予豌豆屬(Vicia spp.)，葡萄(Vitis vinifera)，錐穗沃森花(Watsonia pyramidata)，馬蹄蓮(Zantedeschia aethiopica)，玉蜀黍(Zea mays)，覓屬(amaranth)，卓月鮮薊、戸輿、蓮椰菜、抱子甘藍(lán)、甘藍(lán)、油菜、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘藍(lán)、綠葉菜、亞麻、散葉甘藍(lán)、小扁豆、含油種子油菜、秋葵、洋蔥、馬鈴薯、稻、大豆、稻草、糖用甜菜、糖甘蔗、向日葵、番茄、南瓜和茶等，或上述任何特定名稱植物的種子，或任何上述物種的組織、細(xì)胞或器官培養(yǎng)物。貫穿本說(shuō)明書(shū)，除非上下文需要，否則單詞"包含"應(yīng)當(dāng)理解為表示包含所述整體或步驟、或整體或步驟群，而不排除任何其它的整體或步驟、或整體或步驟群。此處所用術(shù)語(yǔ)"來(lái)源于"應(yīng)當(dāng)用來(lái)表明來(lái)源于指定種類的特定整體或整體群，但并不一定直接從該指定來(lái)源獲得。此處所用術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)"、“肽"或"寡肽"是指任意長(zhǎng)度的多聚體形式的氨基酸。所述術(shù)語(yǔ)還包括已知的氨基酸修飾，例如二硫鍵形成、半胱氨酰化、氧化、谷胱甘肽酰化、甲基化、乙?；?、法尼基化、生物素化、硬脂?；?、甲酰化、硫辛酸加成、磷酸化、硫酸化、 泛素化、肉豆蔻?；?、棕櫚?；?、香葉基香葉基化(geranylgeranylation)、環(huán)化(例如形成焦谷氨酸)、氧化、脫酰胺化、脫水化、糖基化(例如戊糖、氨基己醣、N-乙酰氨基己醣、脫氧己糖、己糖、唾液酸等.)和酰基化，以及非天然存在的氨基酸殘基，L-氨基酸殘基和D-氨
基酸殘基。本發(fā)明蛋白質(zhì)的"同系物"是肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶，就其是同系物而言，其包含相對(duì)于所述蛋白質(zhì)的氨基酸替換、缺失和/或添加，而不改變其一種或多種功能特性， 特別是不降低其產(chǎn)物的活性。例如，所述蛋白質(zhì)的同系物會(huì)包含所述蛋白質(zhì)的生物活性的氨基酸序列變體。所述蛋白質(zhì)中的氨基酸能夠替換為其它具有類似特性(例如疏水性、親水性、疏水性矩(hydrophobic moment)、抗原性、傾向性形成或破壞α -螺旋結(jié)構(gòu)或β-片層結(jié)構(gòu)等)的氨基酸，以產(chǎn)生上述同系物。表1給出氨基酸的物理和化學(xué)性質(zhì)概述。本發(fā)明蛋白質(zhì)的替換變體為其中所述蛋白質(zhì)氨基酸序列中至少一個(gè)殘基已經(jīng)去除，并在其位置插入一個(gè)不同的殘基。氨基酸替換一般為單個(gè)殘基，但可能取決于該多肽處的功能限制而成簇；插入通常為大約1-10個(gè)氨基酸殘基數(shù)目，而缺失介于大約1-20個(gè)殘基。優(yōu)選地，氨基酸替換將包含保守氨基酸的替換，例如上文所述。表1.天然存在的氨基酸的特性
帶電性/疏水性例鏈基團(tuán)氨基酸非極性脂肪族ala, ile, leu, val疏水脂肪族，含硫met芳香族phe, trp亞氨基pro極性不帶電脂肪族giy酰胺asn, gin芳香族Tyr羥基ser, thr巰基cys正電滅性arg, his, Iys負(fù)電酸性asp, glu 本發(fā)明蛋白質(zhì)插入的氨基酸序列變體為其中在所述蛋白質(zhì)的預(yù)定位點(diǎn)引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。插入可包含氨基端和/或羧基端融合，以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸的內(nèi)部序列插入。氨基酸序列內(nèi)部插入通常小于氨基端或羧基端融合，其數(shù)目大約為1-10個(gè)殘基。氨基端或羧基端融合蛋白質(zhì)或肽的例子包括雙雜交系統(tǒng)、噬菌體外殼蛋白、(組氨酸)6-標(biāo)簽、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、蛋白質(zhì)A、麥芽糖-結(jié)合蛋白質(zhì)、二氫葉酸還原酶、Tag 100 表位(EETARFQPGYRS)、c-myc 表位(EQKLISEEDL) >FLAG “表位(DYKDDDK)、IacZ,CMP (鈣調(diào)蛋白-結(jié)合肽)、HA表位(YPYDVPDYA)、蛋白質(zhì)C表位(EDQVDPRLIDGK)以及VSV 表位(YTDIEMNRLGK)中使用的轉(zhuǎn)錄活化子的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或活化結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明蛋白質(zhì)的缺失變體特征在于從所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列中去除一個(gè)或多
個(gè)氨基酸。本發(fā)明蛋白質(zhì)的氨基酸變體可以容易地利用本領(lǐng)域公知的肽合成方法(例如固相肽合成等)、或者通過(guò)重組DNA操作進(jìn)行制造。產(chǎn)生變體蛋白質(zhì)(表示為替換、插入或缺失變體)的DNA序列操作為本領(lǐng)域所公知。例如，在已知序列DNA的預(yù)定位點(diǎn)產(chǎn)生替換突變的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，諸如利用M13誘變、T7-Gen體外誘變?cè)噭┖?USB， Cleveland, OH) Λ QuickChange Site Directed(Stratagene, San Diego, CA) Λ PCR-介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變或者其它定點(diǎn)誘變方法。在本發(fā)明中，利用本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序(諸如DNAstar/MegAlign程序)結(jié)合 Clustal方法，計(jì)算DNA序列和/或蛋白質(zhì)之間的"同一性"和/或"相似性"百分率。本發(fā)明蛋白質(zhì)的"衍生物"為肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)以及酶，其包含所述多肽至少大約5個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基，但保持所述蛋白質(zhì)的生物活性?！把苌?可以進(jìn)一步包含另外的天然存在的、改變的糖基化、?；蛘吲c天然存在形式的所述多肽的氨基酸序列相比為非天然存在的氨基酸殘基。另外或者再有，與所述多肽的天然存在形式的氨基酸序列相比，衍生物可以包含一個(gè)或多個(gè)非氨基酸取代，例如報(bào)告分子或者其它配基，與氨基酸序列共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合，例如其結(jié)合一個(gè)報(bào)告分子以便于檢測(cè)。具有"免疫活性"意味著分子或其特定片段(例如特異性表位或半抗原)通過(guò)結(jié)合抗體而被識(shí)別。利用例如Geysen等人(19%)描述的肽掃描技術(shù)可確定特異性表位 (Geysen，H. Μ.，Rodda，S. J.禾口 Mason，Τ. J. (1986). A priori delineation of a peptide which mimics a discontinuous antigenic determinant. Mol. Immunol. 23，709-715.)。術(shù)語(yǔ)"序列的片段"或"序列的一部分"意思是所涉及的原始序列的截短序列。 截短序列(核酸或蛋白質(zhì)序列)長(zhǎng)度可以變化很大；最小長(zhǎng)度序列為足以提供至少與所涉及的原始序列具有類似的功能和/或活性的序列(例如"功能片段")，而最大長(zhǎng)度并不關(guān)鍵。在某些應(yīng)用中，最大長(zhǎng)度通?；旧喜淮笥谔峁┧谕脑夹蛄械幕钚院?或功能所需要的長(zhǎng)度。典型地，截短的氨基酸序列介于大約5-60個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。然而更典型地， 序列最大為大約50個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，優(yōu)選最大為大約60個(gè)氨基酸。通常希望選擇至少約10、 12或15個(gè)氨基酸、直至最大約20或25個(gè)氨基酸的序列。功能片段還可以包括那些包含對(duì)本發(fā)明蛋白質(zhì)特異性的表位的片段。優(yōu)選的功能片段長(zhǎng)度至少為，例如5、10、25、100、150或200個(gè)氨基酸。因而應(yīng)當(dāng)理解，功能片段也可以是、或者不是免疫活性片段。在本發(fā)明上下文中包含上文明確的細(xì)胞分裂素氧化酶的同系物、衍生物、和/或免疫活性和/或功能片段。本發(fā)明預(yù)期使用的、特別優(yōu)選的細(xì)胞分裂素氧化酶蛋白質(zhì)的同系物、衍生物和/或免疫活性和/或功能片段來(lái)源于植物，更具體而言來(lái)源于鼠耳芥，再具體而言，所述細(xì)胞分裂素氧化酶是鼠耳芥(At)CKX、或者能夠任其中被表達(dá)。本發(fā)明顯然包括AtCKX蛋白質(zhì)的功能同系物或衍生物和/或免疫活性片段的應(yīng)用，并不受限于利用編碼所述AtCKX蛋白質(zhì)的核苷酸序列的應(yīng)用?？梢栽谏锵到y(tǒng)例如細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生任何所述蛋白質(zhì)、多肽、肽及其片段。另外，
19可以化學(xué)方法制備任何所述蛋白質(zhì)、多肽、肽及其片段，例如通過(guò)固相肽合成。所述蛋白質(zhì)或其片段可以是融合蛋白質(zhì)的一部分，例如雙雜交試驗(yàn)中就是這樣，其能夠鑒定與本發(fā)明細(xì)胞分裂素氧化酶相互作用的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)或其片段另外用于例如調(diào)節(jié)本發(fā)明細(xì)胞分裂素氧化酶與利用本發(fā)明方法獲得的蛋白質(zhì)配偶體之間的相互作用。化學(xué)合成肽特別用于例如作為抗原來(lái)源以生產(chǎn)抗血清和/或抗體?！翱贵w"包括單克隆、多克隆、合成或重鏈camel抗體以及抗體片段，例如Fab、Fv或scFv片段?？梢岳美鏛iddle和Cryer (1991)所述技術(shù)制備單克隆抗體， 其包含小鼠骨髓瘤細(xì)胞與來(lái)源于免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞融合。此外，可以利用例如Harlow和 Lane (1988)所述方法獲得分子或其片段的抗體或其片段。至于針對(duì)小肽(例如本發(fā)明蛋白質(zhì)的片段)的抗體，通常在免疫動(dòng)物以前，將該肽與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)。這樣的蛋白質(zhì)載體包括匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白以及破傷風(fēng)類毒素。載體蛋白質(zhì)增強(qiáng)動(dòng)物的免疫反應(yīng)，并為T(mén)細(xì)胞受體結(jié)合部位提供表位。術(shù)語(yǔ)"抗體"進(jìn)一步包括其衍生物，例如標(biāo)記的抗體?？贵w標(biāo)記物包括堿性磷酸酶、PKH2、PKH26, PKH67、熒光素(FITC)、 Hoechst 33258、R-藻紅蛋白(PE)、羅丹明(TRITC)、Quantum Red,Texas Red、Cy3、生物素、 瓊脂糖、過(guò)氧化物酶以及金球(gold spheres)。依賴蛋白質(zhì)抗體的分子生物學(xué)工具包括蛋白質(zhì)凝膠印跡分析、篩選表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行基因鑒定、蛋白質(zhì)定量方法(包括ELISA和RIA)、 蛋白質(zhì)的免疫親和純化、蛋白質(zhì)的免測(cè)沉淀(例如參見(jiàn)實(shí)施例6)以及免疫定位?？贵w、特別是肽抗體的其它用途包括研究蛋白水解加工(Loffler等人，1994，Woulfe等人，1994)、 確定蛋白質(zhì)活性部位(Lerner 1982)、研究前體和翻譯后加工(Baron和Baltimore 1982， Lerner等人，1981, Semier等人，1982)、鑒定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用涉及的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域 (Murakami等人，1992)以及研究基因表達(dá)中外顯子的使用(Tamura等人，1991)。本發(fā)明包括特異性識(shí)別上文明確的細(xì)胞分裂素氧化酶或同系物、衍生物或其片段的抗體。該細(xì)胞分裂素氧化酶優(yōu)選植物細(xì)胞分裂素氧化酶，更具體而言，是鼠耳芥細(xì)胞分裂素氧化酶(AtCKX)之一。此處所用術(shù)語(yǔ)〃基因〃、“多核苷酸〃、“核酸〃、“核酸序列〃、“核苷酸序列"或"核酸分子"是指多聚體形式的任意長(zhǎng)度核苷酸，或?yàn)楹颂呛塑账峄蛎撗鹾颂呛塑账峄騼烧叩慕M合。所述術(shù)語(yǔ)另外包括雙鏈及單鏈DNA和RNA。所述術(shù)語(yǔ)還包括已知的核苷酸修飾，例如甲基化、環(huán)化和‘戴帽’以及一個(gè)或多個(gè)天然存在的核苷酸替換為類似物，例如次黃苷。核苷酸修飾包括加成吖啶、胺、生物素、瀑布藍(lán)(cascade blue)、膽固醇、
Cy3 、Cy5 、Cy5.5 Dabcyl、地高辛配基、二硝基苯基、Edans、6-FAM、熒光素、3'-甘油基、HEX、IRD-700、IRD-800、JOE、磷酸補(bǔ)骨脂素、羅丹明、R0X、硫醇(SH)、隔離物、TAMRA, ΤΕΤ、AMCA-S 、SE、BODIPY 、Marina Blue 、Pacific Blue , Oregon Green 、 Rhodamine Green 、Rhodamine Red 、Rhodol Green 和 Texas Red 。多核苷酸主鏈修飾包括膦酸甲酯、2' -OMe-膦酸甲酯RNA、硫代磷酸酯、RNA、2' -OMeRNA。堿基修飾包括2-氨基-dA、2-氨基嘌呤、3' -(ddA)、3' dA(蛹蟲(chóng)草菌素)、7_脫氮-dA、8-Br-dA、 8-oxo-dA、N6-Me-dA、無(wú)堿基位點(diǎn)(dSpacer)、生物素 dT、2 ' -OMe-SMe-C,2 ‘ -OMe-丙炔基-C、3 ‘ -(5-Me-dC)、3 ‘ - (ddC)、5-Br-dC、5-I-dC、5-Me-dC、5-F_dC、羧基 _dT、可轉(zhuǎn)換 dA、可轉(zhuǎn)換 dC、可轉(zhuǎn)換 dG、可轉(zhuǎn)換 dT、可轉(zhuǎn)換 dU、7_ 脫氮-dG、8-Br-dG、8-oxo-dG、06-Me_dG、
20S6-DNP-dG、4-甲基-吲哚、5-硝基吲哚、2' -OMe-次黃苷、2' -dl、06-苯基-dl、4_甲基-吲哚、2'-脫氧水粉蕈素、5-硝基吲哚、2-氨基嘌呤、dP(嘌呤類似物)、dK(嘧啶類似物)、3_硝基吡咯、2-硫代-dT、4-硫代-dT、生物素-dT、羧基-dT、04-Me-dT、04-三唑dT、 2' -OMe-丙炔基-U、5-Br-dU、2' -dU、5-F-dU、5-I_dU、04-三唑 dU。所述術(shù)語(yǔ)還包含肽核酸(PNA)，一種DNA類似物，其中主鏈?zhǔn)羌匐?pseudop印tide)，其由N-(2-氨乙基)-甘氨酸單元而非糖組成。PNA類似DNA的特性，結(jié)合核酸互補(bǔ)鏈。PNA的中性主鏈導(dǎo)致比通常獲得的結(jié)合更牢、特異性更強(qiáng)。此外，PNA獨(dú)特的化學(xué)、物理和生物學(xué)特性已經(jīng)用于產(chǎn)生強(qiáng)大的生物分子工具、反義和反基因因子、分子探針以及生物傳感器。本發(fā)明還方便地提供了至少約15個(gè)本發(fā)明核酸的連續(xù)核苷酸的核酸序列，并優(yōu)選15-50個(gè)核苷酸。這些序列可以方便地用作探針，特異性與上文定義的本發(fā)明序列雜交，或者用作引物，特異性擴(kuò)增或復(fù)制上文定義的本發(fā)明序列，等等?？砂凑毡绢I(lǐng)域公知的技術(shù)(例如重組或合成方法)產(chǎn)生這樣的核酸序列。它們也可用于診斷試劑盒等以檢測(cè)本發(fā)明核酸的存在。該檢測(cè)一般包括探針在雜交條件下與樣品接觸，檢測(cè)探針與樣品中任意核酸之間形成的任何雙鏈或三鏈?？衫弥亟M或合成方法方便地產(chǎn)生本發(fā)明的核酸序列，例如利用PCR克隆原理， 其中一般包括制備一對(duì)引物，其可能為欲克隆基因區(qū)域的約15-50個(gè)核苷酸，將引物與細(xì)胞的mRNA、cDNA或基因組DNA接觸，在使所要求區(qū)域擴(kuò)增的條件下進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，分離擴(kuò)增區(qū)域或片段，并回收擴(kuò)增的DNA。此處所述的這種技術(shù)一般為本領(lǐng)域所公知，例如 Sambrook 等人所述(Molecular Cloning :a Laboratory Manual，1989)?！熬幋a序列"或"開(kāi)放閱讀框架"或"0RF"定義為在適當(dāng)?shù)目刂菩蛄谢蛘{(diào)節(jié)序列的控制下，即所述編碼序列或ORF以表達(dá)形式存在時(shí)，能夠轉(zhuǎn)錄為mRNA和/或翻譯為多肽的核苷酸序列。所述ORF編碼序列以5'翻譯起始密碼子和3'翻譯終止密碼子為界。編碼序列或ORF可包括但不限于RNA、mRNA、cDNA、重組核苷酸序列、合成制備的核苷酸序列或基因組DNA。所述編碼序列或ORF可被插入的核酸序列破壞。基本上編碼相同蛋白質(zhì)但分離自不同來(lái)源的基因和編碼序列可以由基本上不同的核酸序列組成。相反，基本不同的核酸序列可以用來(lái)表達(dá)基本相同的蛋白質(zhì)。所述核酸序列是由，例如給定基因存在不同的等位基因、遺傳密碼的簡(jiǎn)并性或密碼子使用上的差異而造成。因而，如表2所示，氨基酸例如甲硫氨酸和色氨酸由單個(gè)密碼子編碼，而其它氨基酸例如精氨酸、亮氨酸和絲氨酸，各由多達(dá)6個(gè)不同的密碼子翻譯而成。根癌土壤桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)(一種細(xì)菌)、鼠耳芥(A. thaliana)、紫苜蓿(M. sativa)(兩種雙子葉植物)和稻(Oryza sativa)(—種單子葉植物)偏性密碼子使用的差異如表3所示。選一個(gè)例子，密碼子GGC (甘氨酸)在根癌土壤桿菌中為最常用密碼子(36. 2%。)，在稻中為第二常用密碼子，而在鼠耳芥和紫苜蓿中的使用頻率則低得多(分別為9%。和8. 4%。)。 編碼甘氨酸的四種可能的密碼子中(參見(jiàn)表2、，根癌土壤桿菌和稻最偏性使用所述GGC密碼子。然而，鼠耳芥使用GGA(和GGU)密碼子，而紫苜蓿為GGU(和GGA)密碼子。本發(fā)明確定的DNA序列可被插入序列破壞?！安迦胄蛄?是指破壞包含所述發(fā)明 DNA序列的編碼序列、或者破壞包含所述發(fā)明DNA序列的DNA序列的可表達(dá)形式的任何核酸序列。去除插入序列可恢復(fù)所述編碼序列或所述可表達(dá)形式。插入序列的例子包括內(nèi)含子以及可移動(dòng)的DNA序列，例如轉(zhuǎn)座子?！翱梢苿?dòng)的DNA序列"是指能夠由于重組事件而移動(dòng)的任何DNA序列。
表2.遺傳密碼的簡(jiǎn)并性
氨基酸三字母代碼單字母代碼可能的密碼子丙氨酸AlaAGCAGCCGCGGCU精氨酸ArgRAGAAGGCGACGCCGGCGU天門(mén)冬酰胺AsnNAACAAU天冬氨酸AspDGACGAU半胱氨酸CysCUGCUGU谷氨酸GluEGAAGAG谷氨酰胺GlnQCAACAG甘氨酸GlyGGGAGGCGGGGGU組氨酸HisHCACCAU異亮氨酸IleIAUAAUCAUU亮氨酸LeuLUUAUUGCUACUCCUGCUU賴氨酸LysKAAAAAG甲硫氨酸MetMAUG笨丙氨酸PheFUUCUUU脯氨酸ProPCCACCCCCGCCU絲氨酸SerSAGCAGUUCAUCCUCGUCU蘇氨酸ThrTACAACCACGACU色氨酸TrpWUGG酪氨酸TyrYUACUAU纈氨酸ValVGUAGUCGUGGUU可能的"終止π密碼子UAAUAGUGA表3.不同生物中指定密碼子的使用按每千個(gè)密碼子的頻率給出(http://www.kazusa. or. ip/codon)
權(quán)利要求
1.編碼植物細(xì)胞分裂素氧化酶或者編碼可降低活性細(xì)胞分裂素水平的蛋白質(zhì)的核酸的用途，用于植物或植物部分中刺激根的生長(zhǎng)或增強(qiáng)側(cè)根或不定根形成或改變根的向地性。
2.刺激根生長(zhǎng)或增強(qiáng)側(cè)根和不定根形成或改變根的向地性的方法，其包含表達(dá)編碼植物細(xì)胞分裂素氧化酶的核酸，選自(a)包含由任何SEQID NO 27、1、3、5、7、9、11、25、26、沘至31、33或；34，或其互補(bǔ)序列所示的DNA序列的核酸，(b)包含相應(yīng)于任何SEQID NO 27、1、3、5、7、9、11、25、26、沘至31、33或；34，或其互補(bǔ)序列的RNA序列的核酸，(c)與任何SEQID NO 27、1、3、5、7、9、11、25、洸、沘至31、33或34，或其互補(bǔ)序列特異性雜交的核酸，(d)編碼包含任何SEQID NO 2、4、6、8、10、12、32或35，或其互補(bǔ)序列所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸，(e)任何(a)-(d)定義的核酸，其特征在于所述核酸是DNA、基因組DNA、cDNA、合成DNA 或其中T替換為U的RNA，(f)通過(guò)遺傳密碼可簡(jiǎn)并為任何SEQID NO 27、1、3、5、7、9、11、25、洸、28-31、33或34 中所示的核酸的核酸或者簡(jiǎn)并為任何(a)-(e)中定義的核酸的核酸，(g)由于生物之間密碼子使用的差異不同于編碼任何SEQID N02、4、6、8、10、12、32或 35中所示的蛋白質(zhì)的核酸的核酸，或者不同于任何(a)-(e)中定義的核酸的核酸，(h)編碼SEQID NO 2、4、6、8、10、12或35中所示的蛋白質(zhì)的核酸，或者(a)-(e)中定義的核酸，其由于等位基因之間的差異而不同，(i)編碼任何SEQID NO 2、4、6、8、10、12或35中所示的蛋白質(zhì)的核酸，(j)任何(a)-(i)中定義的核酸的、具有細(xì)胞分裂素氧化酶生物活性的功能性片段，以及(k)編碼植物細(xì)胞分裂素氧化酶的核酸，或者包含在植物或植物部分中、優(yōu)選在根中表達(dá)編碼可降低活性細(xì)胞分裂素水平的蛋白質(zhì)的核酸。
3.編碼具有細(xì)胞分裂素氧化酶活性的新植物蛋白質(zhì)的分離的核酸，選自(a)包含任何SEQID NO四、3、5、9、26、27、31、33或；34，或其互補(bǔ)序列所示的DNA序列的核酸，(b)包含相應(yīng)于任何SEQID NO四、3、5、9、26、27、31、33或；34，或其互補(bǔ)序列的RNA序列的核酸，(c)與任何SEQID NO四、3、5、9、26、27、31、33或34，或其互補(bǔ)序列所示的核酸特異性雜交的核酸，(d)編碼具有包含SEQID NO 32所示的多肽的氨基酸序列、并且與SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列至少70%相似性的蛋白質(zhì)的核酸，(e)編碼具有與SEQID NO 6所示的氨基酸序列至少47%相似性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸，(f)編號(hào)具有與SEQID NO 10或35所示的氨基酸序列至少47%相似性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸，(g)編碼包含任何SEQID NO 4、6、10、32或35中所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸，(h)通過(guò)遺傳密碼可簡(jiǎn)并為任何SEQID NO 29、3、5、9、沈、27、33或34中所示核酸的核酸或者簡(jiǎn)并為任何(a)-(g)中定義的核酸的核酸，(i)由于生物之間密碼子使用的差異而不同于編碼任何SEQID NO 4、6、10或35中所示蛋白質(zhì)的核酸的核酸，或者不同于任何(a)-(g)中定義的核酸的核酸，(j)編碼SEQ ID NO 4、6、10或35中所示蛋白質(zhì)的核酸，或者(a)-(g)中定義的核酸， 其由于等位基因之間的差異而不同，(k)編碼任何SEQ ID NO四、3、5、9、26、27、31、33或34中所示核酸編碼的細(xì)胞分裂素氧化酶的免疫活性片段的核酸，或者編碼任何(a)-(j)中定義的核酸的免疫活性片段的核酸，(1)編碼任何SEQ ID NO四、3、5、9、26、27、31、33或34中所示核酸編碼的細(xì)胞分裂素氧化酶的功能性片段的核酸，或者編碼任何(a)-(j)中定義的核酸的功能性片段的核酸， 其中所述片段具有細(xì)胞分裂素氧化酶的生物活性，以及(m)編碼SEQ ID NO 4、6、10或35中定義的蛋白質(zhì)的核酸，只要所述核酸不是按下列Genbank登錄號(hào)保存的核酸AC005917、AB024035和 AC023754o
4.權(quán)利要求3的分離的核酸，它們是DNA、cDNA、基因組DNA或合成的DNA、或其中T替換為U的RNA。
5.至少15個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的核酸分子，其與權(quán)利要求3或4的核酸特異性雜交。
6.至少15個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的核酸分子，其特異性擴(kuò)增權(quán)利要求3或4的核酸。
7.包含權(quán)利要求3或4的核酸的載體。
8.權(quán)利要求7的載體，其為表達(dá)載體，其中該核酸與使所述核酸在原核和/或真核宿主細(xì)胞中表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)控制序列有效連接。
9.包含根據(jù)權(quán)利要求3或4的核酸或者權(quán)利要求7或8的載體的宿主細(xì)胞。
10.權(quán)利要求9的宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞是細(xì)菌、昆蟲(chóng)、真菌、植物或動(dòng)物細(xì)胞。
11.權(quán)利要求3或4的核酸編碼的分離的多肽，或其同系物或衍生物或其免疫活性或功能性片段。
12.權(quán)利要求11的多肽，其具有任何SEQID NO 2、4、6、8、10、12、32和35、或其同系物或衍生物、或其免疫活性和/或功能性片段所示氨基酸序列。
13.產(chǎn)生權(quán)利要求11或12的多肽的方法，其包含在使該多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求9或10的宿主細(xì)胞，并從培養(yǎng)物中回收生成的多肽。
14.特異性識(shí)別權(quán)利要求11或12的多肽或其特異性表位的抗體。
15.產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞或植物組織的方法，其包含在所述植物、植物細(xì)胞或植物組織中引入可表達(dá)形式的權(quán)利要求3或4的核酸或者權(quán)利要求7或8的載體。
16.產(chǎn)生改變的植物、植物細(xì)胞或植物組織的方法，其包含將權(quán)利要求11或12的多肽直接引入所述植物的細(xì)胞、組織或器官中。
17.實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求11或12的多肽表達(dá)的方法，其包含在植物細(xì)胞的基因組中穩(wěn)定引入與一個(gè)或多個(gè)控制序列有效連接的權(quán)利要求3或4的核酸或者權(quán)利要求7或8的載體。
18.權(quán)利要求16或17的方法，其另外包含由所述植物細(xì)胞再生為植物。
19.包含權(quán)力要求3或4的核酸的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，該核酸與允許其在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)的調(diào)控元件有效聯(lián)接，或者利用權(quán)力要求16或17的方法獲得的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。
20.權(quán)利要求18的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中權(quán)利要求3或4所述核酸穩(wěn)定整合到所述植物的基因組中。
21.包含權(quán)利要求19或20的植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物或植物組織。
22.權(quán)利要求21的植物的可收獲部分。
23.權(quán)利要求22的植物的可收獲部分，其選自種子、葉子、果實(shí)、莖培養(yǎng)物、根莖、根、塊莖和鱗莖。
24.來(lái)源于權(quán)利要求21-23中任一項(xiàng)的任何植物或植物部分的后代。
25.刺激根生長(zhǎng)的方法，其包含在植物或植物部分中表達(dá)權(quán)利要求3或4的核酸或權(quán)利要求2中定義的核酸或者包含表達(dá)可降低活性細(xì)胞分裂素水平的另一蛋白質(zhì)。
26.增強(qiáng)側(cè)根或不定根形成的方法，其包含在植物或植物部分中表達(dá)權(quán)利要求3或4的核酸或權(quán)利要求2中定義的核酸或者包含表達(dá)可降低活性細(xì)胞分裂素水平的另一蛋白質(zhì)。
27.改變根的向地性的方法，其包含在植物或植物部分中表達(dá)權(quán)利要求3或4的核酸或權(quán)利要求2中定義的核酸或者包含表達(dá)可降低活性細(xì)胞分裂素水平的另一蛋白質(zhì)。
28.權(quán)利要求25-27中任一項(xiàng)的方法，所述方法導(dǎo)致產(chǎn)量增加。
29.權(quán)利要求25-28中任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸的表達(dá)處于強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子控制之下。
30.權(quán)利要求25-28中任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸的表達(dá)處于優(yōu)選在根中表達(dá)的啟動(dòng)子控制之下。
31.鑒定并獲得與權(quán)利要求11或12的多肽相互作用的蛋白質(zhì)的方法，其包含利用權(quán)力要求11或12的多肽的篩選試驗(yàn)。
32.權(quán)利要求31的方法，其包含雙雜交篩選試驗(yàn)，其中利用權(quán)力要求11或12的多肽為誘餌、cDNA文庫(kù)為捕獲物。
33.調(diào)節(jié)權(quán)利要求11或12的多肽與通過(guò)權(quán)利要求31或32的方法獲得的相互作用蛋白質(zhì)之間相互作用的方法。
34.鑒定并獲得與權(quán)利要求11或12的多肽相互作用的化合物的方法，其包含步驟a)提供雙雜交系統(tǒng)，其中表達(dá)權(quán)利要求11或12的多肽以及通過(guò)權(quán)利要求31或32方法獲得的相互作用蛋白質(zhì)配偶體，b)所述化合物與(a)中定義的表達(dá)的多肽形成的復(fù)合物相互作用，以及，c)對(duì)所述化合物與所述多肽或(a)中定義的表達(dá)多肽形成的復(fù)合物的相互作用進(jìn)行測(cè)量。
35.鑒定與權(quán)利要求11或12的多肽特異性結(jié)合的化合物或化合物的混合物的方法，包含a)在適于使復(fù)合物形成的條件下將權(quán)利要求11或12的多肽與所述化合物或化合物的混合物結(jié)合，以及，b)檢測(cè)復(fù)合物形成，其中復(fù)合物的存在可識(shí)別特異性結(jié)合所述多肽的化合物或混合物。
36.權(quán)利要求31-35中任一項(xiàng)的方法，其中所述化合物或混合物抑制權(quán)利要求11或12 所述多肽的活性，并能用于合理設(shè)計(jì)化學(xué)劑。
37.通過(guò)權(quán)利要求31-35中任一項(xiàng)的方法鑒定的化合物或混合物用作植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑或除草劑的用途。
38.生產(chǎn)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑或除草劑組合物的方法，其包含權(quán)利要求31-35中任一項(xiàng)方法的步驟，以及將所述步驟獲得的化合物配制成適當(dāng)形式以應(yīng)用到農(nóng)業(yè)或植物細(xì)胞或組織培養(yǎng)中。
39.設(shè)計(jì)或篩選促生長(zhǎng)化學(xué)劑或除草劑的方法，其包含利用權(quán)利要求3或4的核酸或權(quán)利要求2中定義的核酸或權(quán)利要求7或8的載體。
40.權(quán)利要求3或4的核酸分子或權(quán)利要求2中定義的核酸、權(quán)利要求7或8的載體、 權(quán)利要求11或12的多肽用于提高產(chǎn)量的用途。
41.權(quán)利要求3或4的核酸分子或權(quán)利要求2中定義的核酸、權(quán)利要求7或8的載體、 權(quán)利要求11或12的多肽用于刺激根生長(zhǎng)的用途。
42.權(quán)利要求3或4的核酸分子或權(quán)利要求2中定義的核酸、權(quán)利要求7或8的載體、 權(quán)利要求11或12的多肽用于增強(qiáng)側(cè)根和不定根形成的用途。
43.權(quán)利要求3或4的核酸分子或權(quán)利要求2中定義的核酸、權(quán)利要求7或8的載體、 權(quán)利要求11或12的多肽用于改變根的向地性的用途。
44.診斷組合物，其至少包含權(quán)利要求3-6中任一項(xiàng)的核酸分子、權(quán)利要求7或8的載體、權(quán)利要求11或12的多肽或權(quán)利要求14的抗體。
45.增加根分生組織大小的方法，其包含在植物或植物部分、優(yōu)選根中表達(dá)權(quán)利要求3 或4的核酸或權(quán)利要求2中定義的核酸，或者包含表達(dá)編碼可降低活性細(xì)胞分裂素水平的蛋白質(zhì)的核酸。
46.增加根大小的方法，其包含在植物或植物部分、優(yōu)選根中表達(dá)權(quán)利要求3或4的核酸或權(quán)利要求2中定義的核酸，或者包含表達(dá)編碼可降低活性細(xì)胞分裂素水平的蛋白質(zhì)的另一個(gè)核酸。
47.增加枝條分生組織大小的方法，其包含優(yōu)選在枝條中下調(diào)權(quán)利要求3或4的核酸、 或者權(quán)利要求2中定義的核酸的表達(dá)。
48.延遲葉子老化的方法，其包含在葉子中、優(yōu)選在開(kāi)始老化的葉子中下調(diào)權(quán)利要求3 或4的核酸或者權(quán)利要求2中定義的核酸的表達(dá)。
49.改變?nèi)~子老化的方法，其包含在開(kāi)始老化葉子中表達(dá)權(quán)利要求3或4的核酸或者權(quán)利要求2中定義的核酸。
50.提高葉子厚度的方法，其包含在植物或植物部分中表達(dá)權(quán)利要求3或4的核酸或權(quán)利要求2中定義的核酸，或者包含表達(dá)編碼可降低活性細(xì)胞分裂素水平的蛋白質(zhì)的核酸。
51.減少導(dǎo)管大小的方法，其包含在植物或植物部分中表達(dá)權(quán)利要求3或4的核酸或權(quán)利要求2中定義的核酸，或者包含表達(dá)編碼可降低活性細(xì)胞分裂素水平的蛋白質(zhì)的核酸。
52.增加導(dǎo)管大小的方法，其包含在植物或植物部分中下調(diào)權(quán)利要求3或4的核酸或者權(quán)利要求2中定義的核酸的表達(dá)。
53.誘導(dǎo)單性結(jié)實(shí)的方法，其包含在植物或植物部分、優(yōu)選胎座、胚珠及其衍生組織中表達(dá)權(quán)利要求3或4的核酸或權(quán)利要求2中定義的核酸，或者包含表達(dá)編碼可降低活性細(xì)胞分裂素水平的蛋白質(zhì)的核酸。
54.提高幼苗直立性的方法，其包含在幼苗、優(yōu)選幼苗的根中表達(dá)權(quán)利要求3或4的核酸、或權(quán)利要求2中定義的核酸，或者包含表達(dá)編碼可降低活性細(xì)胞分裂素水平的蛋白質(zhì)的核酸。
55.增加分枝的方法，其包含在植物或植物部分中表達(dá)權(quán)利要求3或4的核酸或者權(quán)利要求2中定義的核酸。
56.提高抗倒伏性的方法，其包含在植物或植物部分、優(yōu)選莖或腋芽中表達(dá)權(quán)利要求3 或4的核酸或者權(quán)利要求2中定義的核酸。
57.在與接穗嫁接過(guò)程中的轉(zhuǎn)基因根狀莖的用途，用于提高由于在所述根狀莖中表達(dá)植物細(xì)胞分裂素氧化酶而致根生長(zhǎng)增強(qiáng)的所得植物或樹(shù)的根相關(guān)性特征。
58.權(quán)利要求57的用途，其中所述植物細(xì)胞分裂素氧化酶由權(quán)利要求3或4的核酸或者權(quán)利要求2中定義的核酸編碼。
59.轉(zhuǎn)基因植物，其包含表達(dá)權(quán)利要求57或58的植物細(xì)胞分裂素氧化酶的轉(zhuǎn)基因根狀莖，并另外包含接穗。
60.權(quán)利要求59的植物的可收獲部分。
61.刺激根生長(zhǎng)和發(fā)育的方法，其包含在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或組織培養(yǎng)中表達(dá)編碼植物細(xì)胞分裂素氧化酶的核酸。
62.權(quán)利要求61的方法，其中所述核酸是至少權(quán)利要求3的或權(quán)利要求2中定義的核酸之一。
全文摘要
本發(fā)明涉及刺激根生長(zhǎng)和/或增強(qiáng)側(cè)根或不定根形成和/或改變根的向地性的方法，其包在植物或植物部分中含表達(dá)植物細(xì)胞分裂素氧化酶或者表達(dá)可降低活性細(xì)胞分裂素水平的另一種蛋白質(zhì)。本發(fā)明也涉及新的植物細(xì)胞分裂素氧化酶蛋白質(zhì)、編碼細(xì)胞分裂素氧化酶蛋白質(zhì)的核酸序列、以及包含該序列的載體、宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和植物。本發(fā)明還涉及所述序列在改善與根有關(guān)的特性(包括提高產(chǎn)量和/或增強(qiáng)早期活力和/或改變根/枝條比率和/或提高抗倒伏和/或增強(qiáng)耐旱和/或促進(jìn)外植體的體外繁殖和/或改變細(xì)胞命運(yùn)和/或植物發(fā)育和/或植物形態(tài)學(xué)和/或植物生物化學(xué)和/或植物生理學(xué))上的用途。本發(fā)明還涉及所述序列在上述方法中的用途。本發(fā)明還涉及鑒定和獲得與細(xì)胞分裂素氧化酶蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)和化合物的方法。本發(fā)明還涉及所述化合物作為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑或除草劑的用途。
文檔編號(hào)C12N15/09GK102174541SQ20111000202
公開(kāi)日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2001年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月16日
發(fā)明者托馬斯·施穆林, 托馬斯·維爾納 申請(qǐng)人:托馬斯·施穆林, 托馬斯·維爾納