專(zhuān)利名稱(chēng)：一種豬成熟脂肪細(xì)胞快速去分化為前體脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種豬成熟脂肪細(xì)胞快速去分化為前體脂肪細(xì) 胞的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
脂肪組織成熟脂肪細(xì)胞去分化為前體脂肪細(xì)胞，是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種獲得純 凈、同質(zhì)的前體脂肪細(xì)胞的方法。前體脂肪細(xì)胞在研究與肥胖相關(guān)疾病的致病機(jī)理及治療 方法等方面是一個(gè)理想的體外模型，而豬是目前研究人類(lèi)肥胖、糖尿病及其并發(fā)癥等疾病 的最佳模式動(dòng)物，因此，從豬的脂肪組織獲得成熟脂肪細(xì)胞并去分化為前體脂肪細(xì)胞具有 極其重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種豬成熟脂肪細(xì)胞快速去分化為前體脂肪 細(xì)胞的培養(yǎng)方法。一種豬成熟脂肪細(xì)胞快速去分化為前體脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟a.豬成熟脂肪細(xì)胞的分離無(wú)菌條件下采集1-30日齡仔豬頸、背部皮下脂肪組織，把剪下的脂肪組織放在玻 璃皿中，用含有雙抗的PBS緩沖液清洗2次。然后將脂肪組織轉(zhuǎn)入到另一個(gè)干凈的玻璃皿 中，并用眼科手術(shù)剪將脂肪組織剪成約Imm3的小塊，之后將脂肪組織碎塊轉(zhuǎn)入一個(gè)體積為 30ml的小玻璃瓶中，向小玻璃瓶中加入10-15ml 1% I型膠原酶消化液，蓋好蓋子后將瓶 口用封口膜封好后帶出細(xì)胞間，在37°C水浴鍋中振蕩消化；消化完后用酒精棉球?qū)⒉Ａ坎潦酶蓛舨爰?xì)胞間，在無(wú)菌操作臺(tái)上加入等體 積的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，中和膠原酶的消化反應(yīng)，然后將細(xì)胞消化液經(jīng)兩層200目不銹 鋼細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾到IOOmL燒杯中，過(guò)濾完后將濾液轉(zhuǎn)入到IOmL離心管中；在低速離心機(jī)中， 以800-900r/min離心3-5min，小心取出IOmL離心管，離心管中最上層可見(jiàn)的白色的細(xì)胞團(tuán) 即為成熟脂肪細(xì)胞；用槍將白色的細(xì)胞團(tuán)小心吸至一新的IOml離心管，之后加入5ml左右的PBS，并用 槍反復(fù)吹打，之后800r/min離心3-5min ；重復(fù)3次，直至得到的細(xì)胞懸液純白色為止；b.天花板培養(yǎng)法去分化豬成熟脂肪細(xì)胞將分離的成熟脂肪細(xì)胞接種入25cm2的培養(yǎng)瓶中，然后在瓶?jī)?nèi)裝滿含15% 25% 胎牛血清的DMEM/F12生長(zhǎng)培養(yǎng)基；蓋緊瓶蓋，輕輕搖勻，然后顛倒，靜置于37°C，5%的C02 和95%的空氣的培養(yǎng)箱中； 培養(yǎng)至第八天時(shí)，倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞3次，然后正置培養(yǎng)瓶， 加入6-8ml含15% 25%胎牛血清的DMEM/F12生長(zhǎng)培養(yǎng)基，之后每四天更換一次培養(yǎng)基， 大約12天便可達(dá)到融合；
c.去分化脂肪細(xì)胞的傳代培養(yǎng)待細(xì)胞達(dá)到90% -95%融合后，倒掉培養(yǎng)基，用PBS清洗兩次，然后加入2ml溫育 過(guò)的含0. 02% EDTA的0. 25%的胰酶消化液，孵育片刻，顯微鏡下觀察到95% -99%的細(xì)胞 均變圓，然后加入含15% 25%胎牛血清的DMEM/F12生長(zhǎng)培養(yǎng)基l_2ml終止消化，然后用 彎頭吸管吹打瓶底，將細(xì)胞全部吹落下來(lái)，之后1500rpm離心5min，棄掉上清，在離心管中 加入含15% 25%胎牛血清的DMEM/F12生長(zhǎng)培養(yǎng)基900μ1，，然后1 3傳代；大約2_3 天細(xì)胞長(zhǎng)滿后，便又可進(jìn)行傳代。所述的培養(yǎng)方法，剪碎的脂肪組織在37°C水浴鍋中振蕩消化的時(shí)間是45-60min。所述的培養(yǎng)方法，成熟脂肪細(xì)胞接種密度為1-2. 5X104CellS/Cm2。所述的培養(yǎng)方法，成熟脂肪細(xì)胞去分化時(shí)，培養(yǎng)基用含四季青胎牛血清體積百分 比為15 25%的DMEM/F12生長(zhǎng)培養(yǎng)基；培養(yǎng)瓶正置以后用含hyclone胎牛血清體積百分 比為15 25%的DMEM/F12生長(zhǎng)培養(yǎng)基。所述的培養(yǎng)方法，傳代培養(yǎng)用含hyclone血清體積百分比為15 25%的DMEM/ F12生長(zhǎng)培養(yǎng)基。本發(fā)明提供的方法能夠廉價(jià)、迅速而高效的獲得大量去分化的脂肪細(xì)胞，所使用 的培養(yǎng)基價(jià)格低廉，去分化的代價(jià)較低可以大范圍的推廣使用。


圖1.天花板培養(yǎng)法流程圖2.培養(yǎng)Id后的細(xì)胞照片；
圖3.培養(yǎng)2d后的細(xì)胞照片；
圖4.培養(yǎng)3d后的細(xì)胞照片；
圖5.培養(yǎng)4d后的細(xì)胞照片；
圖6.培養(yǎng)5d后的細(xì)胞照片；
圖7.培養(yǎng)6d后的細(xì)胞照片；
圖8.培養(yǎng)7d后的細(xì)胞照片；
圖9.培養(yǎng)8d后的細(xì)胞照片；
圖10培養(yǎng)9d后的細(xì)胞照片；
圖11培養(yǎng)IOd后的細(xì)胞照片；
圖12培養(yǎng)Ild后的細(xì)胞照片；
圖13培養(yǎng)12d后的細(xì)胞照片；
圖14胰酶消化完的細(xì)胞狀態(tài)；
圖1513傳代培養(yǎng)剛接種的細(xì)胞照片
圖16傳代培養(yǎng)第一代的細(xì)胞；
圖17傳代培養(yǎng)第二代的細(xì)胞；
圖18傳代培養(yǎng)第三代的細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
一種豬成熟脂肪細(xì)胞快速去分化為前體脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)方法。包括以下操作步 驟a.豬成熟脂肪細(xì)胞的分離無(wú)菌條件下采集1-30日齡仔豬頸、背部皮下脂肪組織，把剪下的脂肪組織放在玻 璃皿中，用含有雙抗的PBS緩沖液清洗2次。然后將脂肪組織轉(zhuǎn)入到另一個(gè)干凈的玻璃皿 中，并用眼科手術(shù)剪將脂肪組織剪成約Imm3的小塊，之后將脂肪組織碎塊轉(zhuǎn)入到一個(gè)30ml 的小玻璃瓶中，向小玻璃瓶中加入10-15ml 1% I型膠原酶消化液，蓋好蓋子后將瓶口用封 口膜封好后帶出細(xì)胞間，在37°C水浴鍋中振蕩消化45-60min(具體時(shí)間與豬的年齡和組織 塊大小有關(guān)系)。消化完后用酒精棉球?qū)⒉Ａ坎潦酶蓛舨爰?xì)胞間，在無(wú)菌操作臺(tái)上加入等體 積的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，中和膠原酶的消化反應(yīng)，然后將細(xì)胞消化液經(jīng)兩層200目不銹 鋼細(xì)胞篩過(guò)濾到IOOmL燒杯中，過(guò)濾完后將濾液轉(zhuǎn)入到IOmL離心管中。在低速離心機(jī)中， 以800-900r/min離心3-5min，小心取出IOmL離心管，離心管中最上層可見(jiàn)的白色的細(xì)胞團(tuán) 即為成熟脂肪細(xì)胞。然后，用槍將白色的細(xì)胞團(tuán)小心吸至一新的IOml離心管，之后加入5ml左右的 PBS,并用槍反復(fù)吹打，之后800r/min離心3-5min。如此重復(fù)3次，直至得到的細(xì)胞懸液純 白色為止。b.天花板培養(yǎng)法去分化豬成熟脂肪細(xì)胞將分離的成熟脂肪細(xì)胞(大約l-2.5X104CellS/Cm2)加入25cm2的培養(yǎng)瓶中，然 后在瓶?jī)?nèi)裝滿含20%血清(四季青胎牛血清)的DMEM/F12生長(zhǎng)培養(yǎng)基。蓋緊瓶蓋，輕輕搖 勻，然后顛倒，靜置于37°C，5 %的C02和95 %的空氣的培養(yǎng)箱中。1 時(shí)成熟脂肪細(xì)胞已經(jīng)貼在了培養(yǎng)瓶的內(nèi)表面，并可觀察到多室的成熟脂肪細(xì) 胞，說(shuō)明成熟脂肪細(xì)胞已經(jīng)開(kāi)始去分化。大約4天后，就可見(jiàn)無(wú)脂滴的成纖維細(xì)胞；到第六 天時(shí)，成纖維細(xì)胞大量增多，多室脂肪細(xì)胞脂滴逐漸減少；第七天時(shí)，倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng) 基，用PBS清洗細(xì)胞3次，然后正置培養(yǎng)瓶，加入6-8ml含20%血清(hyclone公司)的DMEM/ F12生長(zhǎng)培養(yǎng)基，之后每四天更換一次培養(yǎng)基，大約12天便可達(dá)到融合。c.去分化脂肪細(xì)胞的傳代培養(yǎng)細(xì)胞有90%細(xì)胞融合后，倒掉培養(yǎng)基，用PBS清洗兩次，然后加入2ml含0. 02% EDTA的0. 25%的胰酶消化液，孵育片刻，顯微鏡下觀察到95-99%的細(xì)胞均變圓，輕輕的吸 掉胰酶，然后加入含20%血清(hyclone公司)的DMEM/F12生長(zhǎng)培養(yǎng)基Hml，用彎頭吸管 吹打瓶底，將細(xì)胞全部吹落下來(lái)，然后按1 3傳代。大約2-3天細(xì)胞長(zhǎng)滿后，便又可傳代。第一次之后的傳代，采用更簡(jiǎn)便的方法，不需要傳代。即顯微鏡下觀察到 95% -99%的細(xì)胞均變圓后，輕輕的吸掉胰酶，然后加入含15% 25%胎牛血清的DMEM/ F12生長(zhǎng)培養(yǎng)基900μ1，用彎頭吸管吹打瓶底，將細(xì)胞全部吹落下來(lái)，之后1 3傳代，每個(gè) 皿中加300 μ 1 ；大約2-3天細(xì)胞長(zhǎng)滿后，便又可進(jìn)行傳代。采用本發(fā)明的方法，第一天細(xì)胞就開(kāi)始大量的去分化，從單室大脂滴細(xì)胞變成多 室的小脂滴細(xì)胞，并且在12天時(shí)就可以傳代培養(yǎng)。這種去分化的速度，在國(guó)內(nèi)外都處于領(lǐng) 先地位。應(yīng)當(dāng)理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)上述說(shuō)明加以改進(jìn)或變換，而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種豬成熟脂肪細(xì)胞快速去分化為前體脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以 下步驟a.豬成熟脂肪細(xì)胞的分離無(wú)菌條件下采集1-30日齡仔豬頸、背部皮下脂肪組織，把剪下的脂肪組織放在玻璃皿 中，用含有雙抗的PBS緩沖液清洗2次。然后將脂肪組織轉(zhuǎn)入到另一個(gè)干凈的玻璃皿中，并 用眼科手術(shù)剪將脂肪組織剪成約Imm3的小塊，之后將脂肪組織碎塊轉(zhuǎn)入一個(gè)體積為30ml 的小玻璃瓶中，向小玻璃瓶中加入10-15ml 1% I型膠原酶消化液，蓋好蓋子后將瓶口用封 口膜封好后帶出細(xì)胞間，在37°C水浴鍋中振蕩消化；消化時(shí)間到了后用酒精棉球?qū)⒉Ａ坎潦酶蓛舨爰?xì)胞間，在無(wú)菌操作臺(tái)上加入等 體積的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，中和膠原酶的消化反應(yīng)，然后將細(xì)胞消化液經(jīng)兩層200目不 銹鋼細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾到IOOmL燒杯中，過(guò)濾完后將濾液轉(zhuǎn)入到IOmL離心管中；在低速離心機(jī) 中，以800-900r/min離心3_5min，小心取出IOmL離心管，離心管中最上層可見(jiàn)的白色的細(xì) 胞團(tuán)即為成熟脂肪細(xì)胞；用槍將白色的細(xì)胞團(tuán)小心吸至一新的IOml離心管，之后加入5ml左右的PBS并用槍反 復(fù)吹打，以純化成熟脂肪細(xì)胞，之后800r/min離心3-5min ；重復(fù)3次，直至得到的細(xì)胞懸液 純白色為止；b.天花板培養(yǎng)法去分化豬成熟脂肪細(xì)胞將分離的成熟脂肪細(xì)胞接種入25cm2的培養(yǎng)瓶中，然后在瓶?jī)?nèi)灌滿含15% 25%胎 牛血清的DMEM/F12生長(zhǎng)培養(yǎng)基；蓋緊瓶蓋，輕輕搖勻，然后顛倒，靜置于37°C，5%的(X)2和 95%的空氣的培養(yǎng)箱中；培養(yǎng)至第七天時(shí)，倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞3次，然后正置培養(yǎng)瓶，加入 6-8ml含15% 25%胎牛血清的DMEM/F12生長(zhǎng)培養(yǎng)基，之后每四天更換一次培養(yǎng)基，大約 12天便可達(dá)到融合；c.去分化脂肪細(xì)胞的傳代培養(yǎng)待細(xì)胞達(dá)到90% -95%融合后，倒掉培養(yǎng)基，用PBS清洗兩次，然后加入2ml溫育過(guò)的 含0. 02% EDTA的0. 25%的胰酶消化液，孵育片刻，顯微鏡下觀察到95% -99%的細(xì)胞均變 圓，然后加入含15% 25%胎牛血清的DMEM/F12生長(zhǎng)培養(yǎng)基l_2ml終止消化，然后用彎頭 吸管吹打瓶底，將細(xì)胞全部吹落下來(lái)，之后1500r/min離心5min，棄掉上清，在離心管中加 入含15% 25%胎牛血清的DMEM/F12生長(zhǎng)培養(yǎng)基900μ 1，然后1 3傳代；大約2_3天 細(xì)胞長(zhǎng)滿后，便又可進(jìn)行傳代。
2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，剪碎的脂肪組織在37°C水浴鍋中振蕩 消化的時(shí)間是45-60min。
3.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，成熟脂肪細(xì)胞接種密度為 1-2. 5X104cells/cm2。
4.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，成熟脂肪細(xì)胞去分化時(shí)，培養(yǎng)基用含 四季青胎牛血清體積百分比為15% 25%的DMEM/F12生長(zhǎng)培養(yǎng)基；培養(yǎng)瓶正置以后用含 hyclone胎牛血清體積百分比為15% 25%的DMEM/F12生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
5.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，傳代培養(yǎng)用含hyclone血清體積百分比 為15% 25%的DMEM/F12生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種豬成熟脂肪細(xì)胞快速去分化為前體脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟a.豬成熟脂肪細(xì)胞的分離；b.天花板培養(yǎng)法去分化豬成熟脂肪細(xì)胞；c.去分化脂肪細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。本發(fā)明提供的方法能夠廉價(jià)、快速而高效的獲得大量去分化的脂肪細(xì)胞，所使用的培養(yǎng)基價(jià)格低廉，去分化的代價(jià)較低，可以大范圍的推廣使用。
文檔編號(hào)C12N5/077GK102140437SQ201110002340
公開(kāi)日2011年8月3日 申請(qǐng)日期2011年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月7日
發(fā)明者宋子儀, 張國(guó)華, 李新建, 楊公社, 楊浩, 趙麗麗, 鄭雪莉, 高倩 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)