專(zhuān)利名稱(chēng)：一種乙醇脫氫酶基因及編碼的多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物次生物質(zhì)代謝技術(shù)領(lǐng)域。具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及一種涉及產(chǎn)麻黃堿的轉(zhuǎn)基因重組異常漢遜酵母乙醇脫氫酶基因的克隆及編碼的多肽技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，簡(jiǎn)稱(chēng)ADH)是廣泛分布的含鋅金屬酶，NAD+、 NADP+或PQQ為輔酶。ADH廣泛分布于大自然中，在人和哺乳動(dòng)物的肝臟、植物組織以及微生物細(xì)胞中都有發(fā)現(xiàn)。ADH具有廣泛的底物特異性，是許多有機(jī)體中的主要短鏈醇代謝的關(guān)鍵酶，它的生理作用在于可逆的催化氧化短鏈醇、芳香醇等為相應(yīng)的羧基化合物。在微生物體內(nèi)，ADH是主要的短鏈醇代謝的關(guān)鍵酶，可逆的催化氧化短鏈醇、芳香醇等為相應(yīng)的羧基化合物，在不同的微生物中，其生理作用有所不同，微生物來(lái)源的ADH 中，酵母和一些嗜溫細(xì)菌ADH的報(bào)道較多，不同微生物來(lái)源的ADH分子量、催化特性等有所不同。乙醇脫氫酶參與酵母維生素A代謝、酪氨酸代謝、脂肪酸代謝和葡萄糖代謝多個(gè)代謝過(guò)程。隨著生物技術(shù)和酶工業(yè)的發(fā)展，ADH的研究已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)，正被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)分析、工業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)研究等方面。此外在產(chǎn)麻黃堿重組酵母CGMCC. No. 1499中利用SSH 技術(shù)分離的乙醇脫氫酶作為重組菌中高表達(dá)基因，對(duì)重組菌生物合成麻黃堿的研究和開(kāi)發(fā)具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于采用SSH技術(shù)分離獲得多條重組酵母菌合成麻黃堿時(shí)差異表達(dá)基因片段，其中高表達(dá)的乙醇脫氫酶基因參與酵母麻黃堿生物合成代謝途徑的調(diào)控。因此，本發(fā)明旨在提供一種在產(chǎn)麻黃堿的轉(zhuǎn)基因重組異常漢遜酵母中高表達(dá)的乙醇脫氫酶基因序列和編碼多肽序列，以應(yīng)用于麻黃堿次生代謝途徑的研究，為麻黃堿代謝途徑基因在異常漢遜酵母中的整合、表達(dá)以及調(diào)控研究奠定基礎(chǔ)，也為乙醇脫氫酶基因的相關(guān)研究領(lǐng)域提供新的基因資源。本發(fā)明的技術(shù)方案通過(guò)利用產(chǎn)麻黃堿的轉(zhuǎn)基因重組酵母是新疆大學(xué)利用離子束介導(dǎo)野生藍(lán)麻黃基因組DNA在異常漢遜酵母中的隨機(jī)轉(zhuǎn)化獲得重組酵母菌，相關(guān)方法和重組菌種已獲國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利授權(quán)(專(zhuān)利號(hào)ZL 200610011402.7)。以出發(fā)菌株異常漢遜酵母2. 340和重組酵母CGMCC No. 1499為研究材料，采用抑制差減雜交技術(shù)(suppression subtraction hybridization, SSH)獲得重組酵母生物合成麻黃堿時(shí)差異表達(dá)乙醇脫氫酶基因片段，獲得乙醇脫氫酶基因片段長(zhǎng)36;3bp，通過(guò)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心序列相似性搜索程序(NCBIBlast)的核酸序列分析，表明與數(shù)據(jù)庫(kù)中已登記的乙醇脫氫酶同源性最高為77%，由此證明從產(chǎn)麻黃堿重組酵母中分離的乙醇脫氫酶基因是一個(gè)新的乙醇脫氫酶基因。具體的，本發(fā)明提供了一種乙醇脫氫酶基因具有如SEQ ID NO. 1所示的堿基序列，
3全長(zhǎng)為ΙΜ^ρ，其編碼由序列表中SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列中375個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。同時(shí)，本發(fā)明提供了一種乙醇脫氫酶基因的獲得方法，所述的乙醇脫氫酶基因ADH 是來(lái)源于產(chǎn)麻黃堿的轉(zhuǎn)基因重組酵母CGMCC No. 1499，通過(guò)SSH和cDNA3'和5'末端快速擴(kuò)增(RACE)獲得。具體包括如下步驟1、采用低能氬離子(Ar+)注入介導(dǎo)野生藍(lán)麻黃(Ephedra glauca L.)基因組DNA 在異常漢遜酵母(Hansenula anomala)中隨機(jī)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的酵母菌通過(guò)目標(biāo)性狀的篩選， 獲得生物合成麻黃堿重組酵母菌株CGMCC No. 1499。2、將步驟1中所獲得轉(zhuǎn)基因酵母菌和出發(fā)菌株進(jìn)行培養(yǎng)，并分別提取其總RNA，以轉(zhuǎn)基因酵母為實(shí)驗(yàn)組，出發(fā)菌株為驅(qū)動(dòng)組，進(jìn)行抑制差減雜交實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因酵母與出發(fā)菌株之間的差減文庫(kù)。PCR鑒定重組子進(jìn)行測(cè)序，獲得一段36;3bp的基因片段。測(cè)序結(jié)果用BLASTn程序在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列相似性搜索，確定該基因片段為乙醇脫氫酶基因。3、將步驟2獲得乙醇脫氫酶基因片段分別設(shè)計(jì)cDNA 3'和5' RACE的嵌套式引物各一對(duì)。提取重組酵母CGMCC No. 1499總RNA，利用已設(shè)計(jì)的3 ‘和5 ‘ RACE引物，對(duì)乙醇脫氫酶的3'和5'末端進(jìn)行擴(kuò)增。將3'和5' RACE擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行回收，連接T-載體， 檢測(cè)重組子后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序獲得乙醇脫氫酶基因3'和5'端序列信息。將獲的乙醇脫氫酶基因片段用GeneTool軟件進(jìn)行拼接，得到完整的基因核苷酸序列SEQ ID NO. 1。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一種乙醇脫氫酶，該乙醇脫氫酶蛋白質(zhì)的基因所編碼具有如SEQ ID NO. 1所示的堿基序列和SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列，其來(lái)源于產(chǎn)麻黃堿的轉(zhuǎn)基因重組異常漢遜酵母(Hansenula anomala) CGMCC No. 1499。根據(jù)本發(fā)明所述的乙醇脫氫酶基因全長(zhǎng)為ΙΜ^ρ，該序列編碼375個(gè)氨基酸。通過(guò)NCBI Blast的核酸序列分析，表明與數(shù)據(jù)庫(kù)中已登記的比對(duì)得分最高的4種酵母菌乙醇脫氫酶同源性最高為77%，參見(jiàn)附圖1。由此證明從產(chǎn)麻黃堿重組酵母中分離的乙醇脫氫酶基因是一個(gè)新的乙醇脫氫酶基因。編碼產(chǎn)物即本發(fā)明乙醇脫氫酶的氨基酸序列如序列表中 SEQ ID N0. 2 所示。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知，本發(fā)明乙醇脫氫酶基因也可以是編碼由SEQ IDN0.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的衍生物，可以是SEQ ID N0. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、 缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基且具有相同的乙醇脫氫酶活性的序列2衍生蛋白質(zhì)，包括在蛋白質(zhì)C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸。相應(yīng)地，本發(fā)明乙醇脫氫酶基因也可以是編碼這些本發(fā)明乙醇脫氫酶衍生物或類(lèi)似物的氨基酸序列。通過(guò)實(shí)施本發(fā)明具體的發(fā)明內(nèi)容，可以達(dá)到以下效果1.本發(fā)明提供了一種在產(chǎn)麻黃堿的轉(zhuǎn)基因重組異常漢遜酵母中高表達(dá)的乙醇脫氫酶基因序列和編碼多肽序列，該乙醇脫氫酶基因具有如SEQ ID NO. 1所示的堿基序列，全長(zhǎng)為ΙΜ^ρ，其編碼由序列表中SEQID N0. 2所示的氨基酸序列中375個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。2.本發(fā)明提供的一種在產(chǎn)麻黃堿的轉(zhuǎn)基因重組異常漢遜酵母中高表達(dá)的乙醇脫氫酶基因及其乙醇脫氫酶應(yīng)用于麻黃堿次生代謝途徑的研究，為麻黃堿代謝途徑基因在異常漢遜酵母中的整合、表達(dá)以及調(diào)控研究奠定基礎(chǔ)，也為乙醇脫氫酶基因的相關(guān)研究領(lǐng)域
4提供新的基因資源。


圖1所示為獲得乙醇脫氫酶ADH與其它4種酵母同源比對(duì)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。圖2所示為利用抑制差減雜交技術(shù)獲得的差異基因表達(dá)片段電泳結(jié)果圖，圖中，M 為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000，1為乙醇脫氫酶片段。圖3所示為獲得的乙醇脫氫酶基因片段設(shè)計(jì)RACE實(shí)驗(yàn)引物示意圖。圖4所示為利用抑制差減雜交技術(shù)獲得的差異基因表達(dá)片段電泳結(jié)果圖，圖中，M 為λ-EcoTH I digest DNA Marker，1為從出發(fā)菌株內(nèi)擴(kuò)增出的乙醇脫氫酶片段，2為從轉(zhuǎn)基因酵母內(nèi)擴(kuò)增出的乙醇脫氫酶片段。
具體實(shí)施例方式下面，舉實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實(shí)施例。本發(fā)明中涉及到的主要原輔材料和設(shè)備有主要試劑Takara公司 daq DNA 聚合酶，RNAiso Reagent, 3' -Full RACECore Set Ver 2.0 和 5' -Full RACE Kit，Clontech 公司 PCR-klectTMcDNASubtraction Kit 和 SMARTtmPCR cDNA Synthesis Kit，Axygen 公司膠回收試劑盒，Promega 公司 pGEM_T 克隆載體，主要儀器IBB Device 1多功能離子注入機(jī)，Sigma 3-18K離心機(jī)，UV-7M分光光度計(jì)，TC-512PCR 儀。本發(fā)明中選用的所有試劑和儀器都為本領(lǐng)域熟知選用的，但不限制本發(fā)明的實(shí)施，其他本領(lǐng)域熟知的一些試劑和設(shè)備都可適用于本發(fā)明以下實(shí)施方式的實(shí)施。實(shí)施例一1、采用低能氬離子(Ar+)注入介導(dǎo)野生藍(lán)麻黃(Ephedra glauca L.)基因組DNA 在異常漢遜酵母(Hansenula anomala)中隨機(jī)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的酵母菌通過(guò)目標(biāo)性狀的篩選， 獲得生物合成麻黃堿重組酵母菌株CGMCC No. 1499。2、將步驟1中所獲得轉(zhuǎn)基因酵母菌和出發(fā)菌株進(jìn)行培養(yǎng)，并分別提取其總RNA，以轉(zhuǎn)基因酵母為實(shí)驗(yàn)組，出發(fā)菌株為驅(qū)動(dòng)組，進(jìn)行抑制差減雜交實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因酵母與出發(fā)菌株之間的差減文庫(kù)。PCR鑒定重組子進(jìn)行測(cè)序，獲得一段363bp的基因片段。測(cè)序結(jié)果用BLASTn程序在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列相似性搜索，確定該基因片段為乙醇脫氫酶基因。3、將步驟2獲得乙醇脫氫酶基因片段分別設(shè)計(jì)cDNA 3'和5' RACE的嵌套式引物各一對(duì)。提取重組酵母CGMCC No. 1499總RNA，利用已設(shè)計(jì)的3 ‘和5 ‘ RACE引物，對(duì)乙醇脫氫酶的3'和5'末端進(jìn)行擴(kuò)增。將3'和5' RACE擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行回收，連接T-載體， 檢測(cè)重組子后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序獲得乙醇脫氫酶基因3'和5'端序列信息。將獲的乙醇脫氫酶基因片段用GeneTool軟件進(jìn)行拼接，得到完整的基因核苷酸序列SEQ ID NO. 1。實(shí)施例二1、菌株培養(yǎng)和總RNA的提取將出發(fā)菌株和轉(zhuǎn)基因酵母菌CGMCC No. 1499分別從斜面分別轉(zhuǎn)接入液體培養(yǎng)基，置搖床230r/min、28°C 30°C培養(yǎng)72h，離心分別收集菌體。采用Takara RNAiso Reagent對(duì)酵母總RNA進(jìn)行提取，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性，并用紫外分光光度計(jì)估計(jì)其純度及濃度。2、采用抑制差減雜交技術(shù)(SSH)獲得重組酵母菌中乙醇脫氫酶基因片段以轉(zhuǎn)基因酵母為實(shí)驗(yàn)組，出發(fā)菌株為驅(qū)動(dòng)組，采用Clontech公司的PCR-%Iect cDNA Subtraction Kit和SMARTtmPCR cDNA Synthesis Kit進(jìn)行抑制差減雜交實(shí)驗(yàn)。根據(jù)紫外分光光度計(jì)測(cè)定值所計(jì)算的RNA濃度，分別將提取的轉(zhuǎn)基因酵母和出發(fā)菌株總RNA用 RNA-free water稀釋成1 μ g/μ L，按試劑盒說(shuō)明書(shū)分別合成轉(zhuǎn)基因酵母和出發(fā)菌株單鏈 cDNA。將轉(zhuǎn)基因酵母和出發(fā)菌株單鏈cDNA分別合成為雙鏈cDNA，平行做3個(gè)樣品(實(shí)驗(yàn)組和驅(qū)動(dòng)組，另外多做一個(gè)樣品)，在進(jìn)行到15個(gè)循環(huán)時(shí)，取出實(shí)驗(yàn)組和驅(qū)動(dòng)組PCR樣品存放在4°C，并從另外的樣品中取出15 μ L留作檢測(cè)，以后每隔3個(gè)循環(huán)取樣一次，直到M 個(gè)循環(huán)結(jié)束。對(duì)取出的樣品進(jìn)行的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確定最佳循環(huán)數(shù)。將實(shí)驗(yàn)組和驅(qū)動(dòng)組樣品重新放入PCR儀中，補(bǔ)充循環(huán)次數(shù)到最佳循環(huán)數(shù)，實(shí)驗(yàn)所得最佳循環(huán)數(shù)為18。 循環(huán)結(jié)束后，加入2μ L 0. 5Μ EDTA終止反應(yīng)。將獲得的雙鏈cDNA用氯仿-異戊醇04 1)純化2次，4M醋酸銨溶液和300 μ L 95%的乙醇沉淀雙鏈cDNA，80%的乙醇洗滌干燥后用于Rsa I酶切。雙鏈cDNA的Rsa I 37°C水浴酶切1. 后，用的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行酶切效率的檢測(cè)。檢測(cè)后對(duì)酶切樣品進(jìn)行苯酚-氯仿-異戊醇05 24 1)純化，80%的乙醇洗滌沉淀后干燥進(jìn)行接頭連接 (只對(duì)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行接頭的連接)。分別吸取轉(zhuǎn)基因酵母雙鏈cDNA Rsa I酶切純化產(chǎn)物各 2 μ L，分別加入不同的接頭"Γ4 DNA LigaSel6°C水浴過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物加入IyL EDTA/ Glycogen終止反應(yīng)，并72°C水浴5min失活連接酶。向帶有不同接頭經(jīng)Rsa I酶切轉(zhuǎn)基因酵母雙鏈cDNA中加入1. 5 μ L驅(qū)動(dòng)組cDNA (經(jīng)Rsa I酶切)，PCR儀中68°C 8h進(jìn)行第一次雜交，將第一次雜交的兩個(gè)樣品混合，并立即加入從PCR儀中取出的新變性的驅(qū)動(dòng)組cDNA， 離心混勻，68°C過(guò)夜進(jìn)行第二次雜交，雜交結(jié)束后加入400 μ L dilutionbuffer，混勻后，于 PCR儀中68°C加熱7min備用。將經(jīng)過(guò)差減雜交的稀釋cDNA進(jìn)行第一次PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后將第一次PCR產(chǎn)物稀釋10倍，作為第二次PCR的模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，取8 μ L進(jìn)行2. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶呈現(xiàn)彌散狀。按Axygen回收試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)SSH-PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物溶解于10 μ L的無(wú)菌水中，再按!Iomega公司的pGEM_T Easy載體說(shuō)明書(shū)將回收產(chǎn)物與T-載體16°C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。對(duì)篩選獲得的白斑用堿法提取其質(zhì)粒DNA進(jìn)行重組子的PCR鑒定，反應(yīng)結(jié)束后，取5 μ L進(jìn)行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，參見(jiàn)附圖2。將獲得基因片段測(cè)序并將序列信息進(jìn)行Blast同源比對(duì)，分別用BLASTn和BLASTx 程序?qū)y(cè)序結(jié)果片段的堿基序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列相似性搜索，并根據(jù)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，通過(guò)NCBI Blast的核酸序列分析，表明與數(shù)據(jù)庫(kù)中已登記的比對(duì)得分最高的4種酵母菌乙醇脫氫酶同源性最高為77%，參見(jiàn)附圖1。由此證明從產(chǎn)麻黃堿重組酵母中分離的乙醇脫氫酶基因是一個(gè)新的乙醇脫氫酶基因，初步確定該基因片段為乙醇脫氫酶基因。
實(shí)施例三1、乙醇脫氫酶基因RACE實(shí)驗(yàn)引物設(shè)計(jì)

利用獲得乙醇脫氫酶基因片段分別設(shè)計(jì)cDNA 3'和5'末端快速擴(kuò)增(RACE)的嵌套式引物各一對(duì)，參見(jiàn)附圖3。2、在重組酵母菌中進(jìn)行乙醇脫氫酶基因的克隆。將轉(zhuǎn)基因酵母菌置搖床230r/minJ8°C 30°C培養(yǎng)72h，離心收集菌體。采用 Takara RNAiso Reagent對(duì)酵母總RNA進(jìn)行提取，利用已設(shè)計(jì)的3 ‘和5 ‘ RACE引物，采用 Takara公司的 3' -Full RACE Core Set Ver 2.0 和 5' -Full RACE Kit 試劑盒對(duì)乙醇脫氫酶的3'和5'末端進(jìn)行擴(kuò)增。3、乙醇脫氫酶基因3' RACE實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)基因酵母總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行OuterPCR反應(yīng)，1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)無(wú)特異性條帶，將Outer PCR反應(yīng)液稀釋50倍進(jìn)行Inner PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后3'端第二輪PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行電泳分析，得到400bp左右大小條帶， 將3' RACE擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物分別與pGEM-T fesy載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)大腸桿菌XLlO-Gold感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，PCR鑒定重組子，測(cè)序獲得乙醇脫氫酶基因 3'端序列信息。4、乙醇脫氫酶基因5' RACE實(shí)驗(yàn)使用Alkaline Phosphatase (CIAP)對(duì)iTotal RNA中裸露的5'磷酸基團(tuán)進(jìn)行去磷酸化反應(yīng)。去磷酸反應(yīng)后加入3M CH3COONa (pH5. 2)和RNase Free dH20充分混勻，用酚 /氯仿/異戊醇05 24 1)進(jìn)行純化，異丙醇進(jìn)行沉淀，70%冷乙醇(RNase Free dH20 配制)漂洗沉淀，棄上清后干燥。干燥后加入7 μ L的RNase Free dH20溶解沉淀，得到 CIAP-treated RNA。去磷酸化總 RNA 用 TobaccoAcid Pyrophosphatase (TAP)去掉 mRNA 的 5'帽子結(jié)構(gòu)，保留一個(gè)磷酸基團(tuán)。處理后的CIAP/TAP-treated RNA與5' RACE Adaptor 進(jìn)行連接，并用苯酚/氯仿/異戊醇05 24 1)進(jìn)行純化，獲得Ligated RNA。隨后對(duì) Ligated RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，Ligated RNA和Random 9 mers的混合物于70°C變性10分鐘后，冰上放置2min，再加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的其余試劑進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行Outer PCR反應(yīng)，1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)無(wú)特異性條帶，將Outer PCR反應(yīng)液稀釋50倍進(jìn)行^mer PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后5 ‘端第二輪 PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行電泳分析，得到600bp左右大小條帶，將5' RACE擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行膠回收， 回收產(chǎn)物分別與pGEM-T Easy載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)大腸桿菌XLlO-Gold感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，PCR鑒定重組子，測(cè)序獲得乙醇脫氫酶基因5'端序列信息。5、乙醇脫氫酶基因的拼接。將獲的乙醇脫氫酶基因片段用GeneTool軟件進(jìn)行拼接，得到完整的基因核苷酸序列，見(jiàn)SEQ ID N0. 1，該基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列，見(jiàn)SEQ ID N0. 2。實(shí)施例四1、菌株液體培養(yǎng)和麻黃堿含量測(cè)定將出發(fā)菌株和轉(zhuǎn)基因酵母菌CGMCC No. 1499分別從斜面分別轉(zhuǎn)接入液體培養(yǎng)基， 置搖床230r/min、28°C 30°C培養(yǎng)72h，離心分別收集菌體以及發(fā)酵液。采用反向高效液相對(duì)轉(zhuǎn)基因酵母菌發(fā)酵液當(dāng)中的1-麻黃堿含量進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果為11.87mg/L，出發(fā)菌株發(fā)酵液中不含ι-麻黃堿。2、采用抑制差減雜交技術(shù)(SSH)獲得重組酵母菌中乙醇脫氫酶基因片段采用Takara RNAiso Reagent對(duì)出發(fā)菌株和轉(zhuǎn)基因酵母酵母總RNA進(jìn)行提取，以轉(zhuǎn)基因酵母總RNA為實(shí)驗(yàn)組，出發(fā)菌株總RNA為驅(qū)動(dòng)組，采用Clontech公司的 PCR-Select cDNA Subtraction Kit 和 SMARTtmPCR cDNA Synthesis Kit 進(jìn)行抑制差減雜交實(shí)驗(yàn)。根據(jù)紫外分光光度計(jì)測(cè)定值所計(jì)算的RNA濃度，分別將提取的轉(zhuǎn)基因酵母和出發(fā)菌株總 RNA 用 RNA-free water 稀釋成 1 μ g/ μ L。按試劑盒說(shuō)明書(shū)分別合成轉(zhuǎn)基因酵母和出發(fā)菌株單鏈cDNA。將轉(zhuǎn)基因酵母和出發(fā)菌株單鏈cDNA分別合成為雙鏈cDNA，實(shí)驗(yàn)所得最佳循環(huán)數(shù)為18。將獲得的雙鏈cDNA進(jìn)行純化，用Rsa I進(jìn)行酶切，酶切后對(duì)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行接頭的連接，向帶有不同接頭經(jīng)Rsa I酶切轉(zhuǎn)基因酵母雙鏈cDNA中加入過(guò)量驅(qū)動(dòng)組cDNA(經(jīng)RsaI酶切)進(jìn)行第一次雜交，第一次雜交后混合帶有不同接頭的兩個(gè)樣品，并立即加入過(guò)量的新變性驅(qū)動(dòng)組cDNA，進(jìn)行第二次雜交。將經(jīng)過(guò)差減雜交的稀釋cDNA進(jìn)行兩次的抑制PCR反應(yīng)，最后將第二次抑制PCR的產(chǎn)物回收，并與PGEM-T Easy載體連接，構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因重組酵母菌的質(zhì)粒差減文庫(kù)。由于兩次雜交均加入的是過(guò)量驅(qū)動(dòng)組cDNA，因此雜交過(guò)后只有轉(zhuǎn)基因酵母中特異表達(dá)基因和高表達(dá)基因才可以最大程度的形成帶有不同接頭的雙鏈cDNA，在隨后的抑制 PCR中得以指數(shù)級(jí)的富集。將獲得基因片段測(cè)序并將序列信息進(jìn)行Blast同源比對(duì)，分別用BLASTn和BLASTx 程序?qū)y(cè)序結(jié)果片段的堿基序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列相似性搜索，并根據(jù)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，初步確定該基因片段為乙醇脫氫酶基因。3、乙醇脫氫酶基因片段的鑒定將出發(fā)菌株和轉(zhuǎn)基因酵母菌CGMCC No. 1499分別從斜面分別轉(zhuǎn)接入液體培養(yǎng)基， 置搖床230r/min、28°C 30°C培養(yǎng)72h，離心分別收集菌體，采用TakaraRNAiso Reagent對(duì)出發(fā)菌株和轉(zhuǎn)基因酵母酵母總RNA進(jìn)行提取，并用ployA引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后， 用利用該片段設(shè)計(jì)的特異性引物adh3-Fl和&(&5-1 1進(jìn)行？0 反應(yīng)，參見(jiàn)附圖3，1.0(%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果，參見(jiàn)附圖4，結(jié)果顯示出發(fā)菌株和轉(zhuǎn)基因菌株均擴(kuò)增出相同大小的片段，表明該片段為出發(fā)菌株內(nèi)源基因，但在轉(zhuǎn)基因酵母分泌表達(dá)麻黃堿時(shí)高表達(dá)。
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權(quán)利要求
1.一種乙醇脫氫酶基因，其特征在于，所述的乙醇脫氫酶基因具有如SEQ IDN0. 1所示的堿基序列，全長(zhǎng)為1245bp，其編碼由序列表中SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列中375個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
2.一種如權(quán)利要求1所述的乙醇脫氫酶基因的獲得方法，所述的乙醇脫氫酶基因ADH 是來(lái)源于產(chǎn)麻黃堿的轉(zhuǎn)基因重組酵母CGMCC No. 1499，通過(guò)SSi^PcDNA 3'和5'末端快速擴(kuò)增(RACE)獲得，其特征在于，具體包括如下步驟(1)采用低能氬離子(Ar+)注入介導(dǎo)野生藍(lán)麻黃(Ephedraglauca L.)基因組DNA在異常漢遜酵母(Hansenula anomala)中隨機(jī)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的酵母菌通過(guò)目標(biāo)性狀的篩選，獲得生物合成麻黃堿重組酵母菌株CGMCC No. 1499 ；(2)將步驟1中所獲得轉(zhuǎn)基因酵母菌和出發(fā)菌株進(jìn)行培養(yǎng)，并分別提取其總RNA，以轉(zhuǎn)基因酵母為實(shí)驗(yàn)組，出發(fā)菌株為驅(qū)動(dòng)組，進(jìn)行抑制差減雜交實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因酵母與出發(fā)菌株之間的差減文庫(kù)；PCR鑒定重組子進(jìn)行測(cè)序，獲得一段36;3bp的基因片段；測(cè)序結(jié)果用 BLASTn程序在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列相似性搜索，確定該基因片段為乙醇脫氫酶基因；(3)將步驟2獲得乙醇脫氫酶基因片段分別設(shè)計(jì)cDNA3'和5' RACE的嵌套式引物各一對(duì)；提取重組酵母CGMCC No. 1499總RNA，利用已設(shè)計(jì)的3'和5' RACE引物，對(duì)乙醇脫氫酶的3'和5'末端進(jìn)行擴(kuò)增；將3'和5' RACE擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行回收，連接T-載體，檢測(cè)重組子后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序獲得乙醇脫氫酶基因3'和5'端序列信息；將獲的乙醇脫氫酶基因片段用GeneTool軟件進(jìn)行拼接，得到完整的基因核苷酸序列SEQ ID NO. 1。
3.—種乙醇脫氫酶，其特征在于，該乙醇脫氫酶蛋白質(zhì)是由權(quán)利要求1所述的基因所編碼，具有如SEQ ID NO. 1所示的堿基序列和SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列，其來(lái)源于產(chǎn)麻黃堿的轉(zhuǎn)基因重組異常漢遜酵母(Hansenula anomala) CGMCC No. 1499。
4.如權(quán)利要求1所述的一種乙醇脫氫酶基因，其特征在于，所述的乙醇脫氫酶基因編碼由SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的衍生物，如SEQID NO. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基且具有相同的乙醇脫氫酶活性的序列2 衍生蛋白質(zhì)，包括在蛋白質(zhì)C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種乙醇脫氫酶基因及編碼的多肽。所述的乙醇脫氫酶基因的堿基序列，全長(zhǎng)為1245bp，其氨基酸序列中375個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。本發(fā)明以利用低能氬離子(Ar+)注入介導(dǎo)藍(lán)麻黃基因組DNA在異常漢遜酵母(Hansenula anomala)2.340中的隨機(jī)轉(zhuǎn)化所獲得的產(chǎn)麻黃堿的轉(zhuǎn)基因重組異常漢遜酵母CGMCC No.1499為材料，從中分離出的一種可逆催化氧化短鏈醇、芳香醇等為相應(yīng)的羧基化合物的新乙醇脫氫酶基因，擴(kuò)大了乙醇脫氫酶基因的資源，同時(shí)為轉(zhuǎn)基因重組酵母生物合成麻黃堿的代謝途徑研究和利用該基因構(gòu)建基因工程菌提供了依據(jù)，具有廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102154334SQ20111000339
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月10日
發(fā)明者呂杰, 毛培宏, 金湘 , 馬媛 申請(qǐng)人:新疆大學(xué)